JP3938239B2

JP3938239B2 - Demyelinating disease detection method

Info

Publication number: JP3938239B2
Application number: JP01737198A
Authority: JP
Inventors: 守京ヶ島; 昌星高
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1998-01-29
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 2007-06-27
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: JPH11211726A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の検出方法及び該方法に使用するための診断用キットに関する。より詳細には、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の再燃時の早期診断、脱髄疾患のそれと紛らわしい各種神経疾患に対する鑑別診断等に使用できる検出方法及び該方法に使用するための診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
脱髄疾患は、神経の軸索を取り巻き、軸索の絶縁体として興奮伝導を促進する機能を有する髄鞘が傷害される神経疾患であり、これに属するものとしては多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等が挙げられる。これらの脱髄疾患の多くは緩解、再燃を繰り返すが、再燃時を早期に予想するための診断方法としてはこれまで有力なものがないのが実状であった。またこれらの疾患はいずれも他の神経疾患との鑑別診断が容易でなく、そのような鑑別診断に有用な方法が求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の脱髄疾患の再燃時の早期診断、脱髄疾患とそれと紛らわしい各種神経疾患との間の鑑別診断等に使用できる検出方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らが上記疾患の動物モデルとされる、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)を用いて鋭意検討したところ、血液等の検体中のトロンビン−アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）のレベルが脱髄疾患の臨床症状発現に先立ち上昇し、検体中のＴＡＴのレベルを測定することにより脱髄疾患を早期に診断することができることが見出された。また、ＴＡＴのレベルは脱髄疾患の病状の回復とともに低下し、従ってＴＡＴのレベルを測定することにより脱髄疾患の病勢を診断することができることも見い出された。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
【０００５】
従って本発明は、体液中のトロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルを測定することを特徴とする脱髄疾患の検出方法を提供するものである。
【０００６】
上記本発明の方法の好ましい態様においては、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体レベルの測定を免疫学的測定法により行い、例えばトロンビン−アンチトロンビンIII複合体、トロンビン及びアンチトロンビンIIIの少なくとも一つと特異的に反応する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を使用して行う。従って免疫学的測定は、例えば、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体に対する抗体を使用して、あるいはトロンビンに対する抗体とアンチトロンビンIIIに対する抗体とを組み合わせて使用して行うことができる。
【０００７】
また本発明の別の形態として、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体、トロンビン及びアンチトロンビンIIIの少なくとも一つと特異的に反応する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を含む脱髄疾患診断用の診断キットが提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の検出方法の診断対象となる脱髄疾患は、神経の軸索を取り巻き、軸索の絶縁体として興奮伝導を促進する機能を有する髄鞘が障害される神経疾患である。髄鞘が障害される状態を脱髄と称し、脱髄は髄鞘が選択的に障害され軸索が正常に保たれる一次性脱髄と、軸索の障害に続発して髄鞘が障害される二次性脱髄とに分類され、さらに一次性脱髄は原因不明の特発性脱髄と、パポバウイルス感染、アルコール中毒等に伴う栄養障害等を原因とすることが知られている症候性脱髄に分けられる。本発明の方法はこれらのいずれの種類の脱髄により起こる脱髄疾患も診断対象とし得る。
【０００９】
代表的な脱髄疾患としては、自己免疫を原因とすると考えられている多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ＡＤＥＭの一亜型と考えられる脊髄神経根神経障害(myeloradiculoneuropathy)、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー等の白質ジストロフィー等が挙げられ、いずれも本発明の検出方法の適用対象となり得る。本発明は、これらのうち特にＭＳ及びＡＤＥＭの診断に有用である。
【００１０】
本発明の検出方法においては、対象となるヒト患者を含む脊椎動物から採取した体液中のＴＡＴのレベル（濃度）を測定する。使用できる体液としては、血液、その分画である血漿及び血清、脳脊髄液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の検出方法において測定対象となるＴＡＴは、トロンビンとアンチトロンビンIII（ＡＴIII）との複合体であり、公知の生体物質である。この血中レベルは血中で急速に消失するトロンビンのレベルに代えて測定することができ、トロンビン形成、即ち血液凝固活性、血栓形成傾向等の指標として使用できるものとして知られていたものである。
【００１２】
ＴＡＴの測定方法は特に限定されるものではないが、通常は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により測定することが好ましく、免疫学的測定法によればＴＡＴを高感度で特異的に定量できる。そのような免疫学的測定法の原理自体は公知のものでよく、レーザーイムノアッセイ等の非標識イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等の標識イムノアッセイのいずれによっても行うことができる。感度、測定の容易さ等の点から通常は標識イムノアッセイにより測定するのが好ましい。標識イムノアッセイの方法も特に制限されるものではなく、例えば液相中での抗原抗体反応を利用する液相法、固相に結合した第一の抗体と標識された第二の抗体を使用するいわゆるサンドイッチ法、固相に検体中のＴＡＴを吸着させ、これを抗体で測定する方法等いずれも使用できる。
【００１３】
免疫学的測定法に使用する抗体も各種のものから選択でき、例えば、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、即ちトロンビンやＡＴIIIには反応しないが、ＴＡＴにのみ特異的に反応する抗体、トロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応し、かつＴＡＴ中のトロンビンあるいはＡＴIIIに特異的に反応する抗体等いずれのものを使用してもよい。例えばＴＡＴに特異的に結合する抗体を用いれば、直接ＴＡＴのみを捕捉することができる。またトロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応し、かつＴＡＴ中のトロンビンあるいはＡＴIIIに特異的に反応する抗体を使用した場合は、トロンビンあるいはＡＴIII及びＴＡＴの両方を捕捉し、さらにＴＡＴを形成する他方の結合相手に特異的に反応する抗体（即ち、抗ＡＴIII抗体あるいは抗トロンビン抗体）で結果としてＴＡＴのみを捕捉することができる。抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。
【００１４】
標識イムノアッセイに使用される標識も公知のものから任意に選択することができ、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等を使用することができる。
【００１５】
前述の通り血中のＴＡＴレベルはこれまでにも凝固活性、血栓形成傾向等の指標として測定されており、ＴＡＴを特異的に高感度で測定するための各種免疫学的方法の変法（特表平７−５０８１０３号、日本特許第２５６９３８３号、特開平３−４８１５８号等）、及びトロンビン、ＡＴIII、ＴＡＴ等に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（特開平７−５９５９０号、特開平８−１２００００号、特開平９−２３４０６８号等）等が提案され、またＴＡＴの安定化方法（日本特許第２６４５７７４号等）等の周辺技術も各種提案されている。ＴＡＴレベルの測定自体は当業者に周知の技術やこれらの文献に記載された技術、材料を用いて行うことができる。
【００１６】
以下、固相に結合される第一抗体と、標識された第二抗体または標識され得る第二抗体とを用いたいわゆるサンドイッチ法（特公平６−４１９５２号等参照）によるＴＡＴの測定についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
上記サンドイッチ法に使用する第一抗体及び第二抗体は、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、トロンビンあるいはＡＴIIIのいずれかに特異的に反応する抗体等から選択することができる。
【００１８】
この方法では、例えば、ＴＡＴを含む検体を固相に固定された第一抗体と接触させ、次いで標識物質で標識された第二抗体と接触させることにより検体中のＴＡＴと第一抗体と標識物質で直接標識された第二抗体とを反応させて第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相からなる複合体を形成させる。そして前記複合体から遊離の第二抗体を分離し、前記複合体中または分離された第二抗体の標識物質を検出することにより検体中のＴＡＴを測定する。
【００１９】
また、形成された第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相の前記複合体に、第二抗体に特異的に結合する標識された抗イムノグロブリン抗体を接触させることにより前記複合体と標識抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させ、その標識物質を検出することにより検体中のＴＡＴを測定することもできる。第二抗体を直接標識する方法に比べ、入手の容易な標識された抗イムノグロブリン抗体を使用する方法がより簡便である。なお、この方法で使用する抗イムノグロブリン抗体は、第二抗体を製造するために使用した動物と同種の動物のイムノグロブリンを認識する抗体である。
【００２０】
上記のようなサンドイッチ法において、第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体の複合体形成順序は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である（「蛋白核酸酵素」別冊 No.31、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 参照）。
【００２１】
また第一抗体を固定する固相としては、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が挙げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が好ましい。
【００２２】
これらの固相に第一抗体を固定する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等、固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を使用することができる。操作が簡便なことから物理的吸着（いわゆるコーティング）が特に好ましい。
【００２３】
また、第一抗体を固定した固相の表面には、第一抗体が結合していない表面部分が残存している場合があり、その部分に検体中のＴＡＴや他の分子種が結合すると正確な測定結果が得られない場合がある。従って、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して第一抗体が結合していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ウシ等から採取した血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白等が挙げられ、またブロッキング物質として市販されている材料を使用することもできる。
【００２４】
また、固相に固定された第一抗体に検体中のＴＡＴを結合させた後に、固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等が挙げられる。
【００２５】
第二抗体または該抗体に免疫学的親和性を有する抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される標識物質としては、前記の通り、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、放射性同位体（¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈ等) 、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）等が挙げられるが、通常タンパク質を標識するのに使用することが可能なものであれば特に限定されない。尚、ここで標識物質とは、ビオチン等のようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００２６】
前記の抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素で標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）等から適宜選択することができる。
【００２７】
標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、第二抗体またはイムノグロブリン抗体がペルオキシダーゼ等の酵素で標識されている場合、前記の抗原抗体反応後、酵素の基質（ペルオキシダーゼの場合、過酸化水素水及びオルトフェレンジアミン、テトラメチルベンジジン等の発色基質（クロモゲン））を加え、酵素反応による生成物の発色の程度を吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、抗体がビオチンで標識されている場合、抗原抗体反応後、例えばペルオキシダーゼ等の酵素で標識されたビオチン結合性物質（例えば、ストレプトアビジン）を添加し、このビオチン結合性物質とビオチンを介して酵素を抗体に結合させ、その後、上記と同様に酵素活性を測定することができる。標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、抗原抗体反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００２８】
本発明の検出方法のＴＡＴレベル測定においては、検体中のＴＡＴの濃度は、予め既知濃度のＴＡＴ標準液を用いてＴＡＴ濃度と標識物質の検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを比較することにより定量することができる。
【００２９】
上記のような測定方法においてはＴＡＴを含む検体は予め精製されている必要はない。
【００３０】
上記のような測定方法により、前記のようなヒト体液中のＴＡＴレベルを測定してその変化を観察すると、以下の実施例において具体的に明らかにするように、多発性硬化症のような脱髄疾患を発症あるいは再燃した場合、その臨床症状発現に先立ってＴＡＴレベルが上昇し、臨床症状発現前約２〜１５日程度の時点において正常のレベルの約３〜５０倍程度、より特定すれば約５〜２０倍程度になる。従って本発明の検出方法によれば脱髄疾患を臨床症状発現前に早期に診断することができる。また、臨床症状発現後のＴＡＴのレベルは脱髄疾患の病状の回復とともに低下し、従ってＴＡＴのレベルにより脱髄疾患の病勢を診断することもできる。
【００３１】
尚、いかなる理論にも拘束されるものではないが、脱髄疾患においてＴＡＴレベルの顕著な上昇が認められるのは、血管内皮の異常と血液凝固系の活性化が該疾患の病態に深く関与しているためと考えられる。
【００３２】
さらに本発明の別の形態として、上記の本発明の検出方法を上記に説明したような免疫学的測定法により実施するための診断用キットが提供される。
【００３３】
本発明の診断用キットは、ＴＡＴ、トロンビン及びＡＴIIIの少なくとも一つを特異的に認識する抗体から選択される少なくとも一種の抗体を構成成分として含むＴＡＴの免疫学的測定用の試薬からなるものである。
【００３４】
上記に説明したようなサンドイッチ法によりＴＡＴを検出する場合には、上記のような抗体から選択される、固相に結合される第一抗体と、標識物質で標識されているかまたは標識され得る第二抗体とを構成成分として含む。このようなキットにおいて第一抗体を予め固相に固定したものを使用すれば、診断過程において固相に抗体を固定する操作を省くことができる。
【００３５】
このような本発明の診断用キットを用いて、例えば、固相に固定した第一抗体にＴＡＴを含む検体を接触させ、次いでペルオキシダーゼ等により標識された第二抗体と接触させることによって、第二抗体−（ＴＡＴ）−第一抗体−固相からなる複合体を形成させ、その複合体に含まれる標識物質（例えばペルオキシダーゼ）を検出することにより、検体中のＴＡＴ濃度を測定することができる。
【００３６】
前記キットには、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度のＴＡＴ標準品、標識物質の検出試薬、第二抗体を標識する試薬、第二抗体を検出する試薬（標識された抗イムノグロブリン抗体等）等を必要に応じて加えることができる。また、これらの成分の他に、前記のようなブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を含むものとしてもよい。
【００３７】
また、これらの成分は、それぞれ別の容器に収容しておき、使用時に上記処方に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００３８】
本発明の診断用キットを用いてヒトの体液中のＴＡＴを測定すると、健常人においてはそのレベルは低値であるが、脱髄疾患に罹患した患者においてはその臨床症状が発現する前に高いレベルを示し、脱髄疾患の早期の診断、特に再燃時の早期の診断を簡便に行うことができる。また、脱髄疾患とそれと紛らわしい各種神経疾患との間の鑑別診断等を簡便に行うことが可能となる。さらにＴＡＴレベルは脱髄疾患の病勢の指標ともなり得るので、前記キットは脱髄疾患の病勢の評価を簡便に行うのにも有用である。
【００３９】
上記のキットの具体例として、例えば下記の構成成分を含む診断用キットが挙げられる。
【００４０】
▲１▼ 標識抗トロンビン抗体原液（ペルオキシダーゼで標識した、トロンビン及びＴＡＴの双方を認識できる抗トロンビン抗体原液）１００μｌ
▲２▼ 希釈用溶液（終濃度がそれぞれ５％及び０．０１％となるように牛血清アルブミン及びチメロサールを含む）１０ｍｌ入りバイアル１本
▲３▼ 抗ＴＡＴ抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート１枚
▲４▼ 洗浄液原末用ＰＢＳ錠剤（１００ｍｌの蒸留水に溶解した場合１００ｍｌのＰＢＳが得られるもの）１個
【００４１】
▲５▼ クエン酸燐酸緩衝液原末用錠剤（６０ｍｌの蒸留水に溶解した場合６０ｍｌの０．１Ｍのクエン酸燐酸緩衝液、ｐＨ５が得られるもの）１個
▲６▼ オルトフェニレンジアミン末１０ｍｇ入りバイアル１本
▲７▼ ＴＡＴ標準血漿末（ＴＡＴを１００μｇ／Ｌ含む３００μｌの血漿を凍結乾燥したもの）バイアル１本
▲８▼ 複数の健常人から集めた正常対照血漿末（血漿３００μｌ相当）入りバイアル１本
【００４２】
上記のキットを使用した実際の患者検体のＴＡＴレベルの測定は、例えば以下のように行うことができる。
【００４３】
脱髄疾患の患者で現在緩解期にある患者、あるいは脱髄疾患が疑われる患者の検体（静脈血９容に０．１１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液１容を加え、混和後約３０００ｒｐｍで１０分遠心分離して採取した血漿）５０μｌを抗ＴＡＴ抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れる。別に正常対照血漿末▲８▼に蒸留水３００μｌを加えて作製した溶液の５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れる。同様にＴＡＴ標準血漿末▲７▼に蒸留水３００μｌを加えて作成した溶液、及びこれを希釈用溶液▲２▼を用いて２倍連続希釈して作製した、ＴＡＴ標準血漿末▲７▼の２倍、４倍及び8倍希釈溶液のそれぞれの５０μｌも９６ウェルマイクロタイタープレート▲３▼のウェルに入れ、各プレートを２０〜２５℃で１時間インキュベートし、その後各ウェル中の反応液を全量吸引除去する。そして洗浄液原末用ＰＢＳ錠剤▲４▼を用いて作ったリン酸緩衝溶液を約０．３ｍｌずつ各ウェルに加え、その後吸引する洗浄操作を三回行った後、直ちに標識抗トロンビン抗体原液▲１▼を全量８ｍｌの希釈用溶液▲２▼に加えて泡立てないように混和したものを５０μｌずつ各ウェルに加える。２０〜２５℃で１時間インキュベートした後、クエン酸燐酸緩衝液原末用錠剤▲５▼で作製したクエン酸燐酸緩衝液にオルトフェニレンジアミン末▲６▼を全量入れて完全に溶解した後、市販の過酸化水素水１０μｌを添加し混和したものを５０μｌずつ各ウェルに加える。１０分後に２Ｍの硫酸を各ウェルに２０μｌずつ添加して反応を停止した後、４９２ｎｍで反応液の吸光度を測定する。標準液（▲８▼の希釈液）から求めた値で検量線を作り、これより検体の濃度を読みとる。陰性対照としては、正常対照血漿末▲８▼から得られた値を用いる。検量線は３重測定を行って作成する。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００４５】
実施例
脱髄疾患の代表的疾患とされる多発性硬化症の動物モデルとして確立された、ラット実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE、臨床免疫学イラストレイテッド、pp. 112-117, Brostoff, Scadding, Male, Roitt編、広瀬俊一、狩野庄吾、多田富雄監訳、南江堂 1994)を使用してＴＡＴのレベルを観察した。
【００４６】
ＥＡＥの作成は以下のようにして行った。即ち、疾患を誘発するための感作物質としては、モルモットミエリン塩基性タンパク質（guinea pig myelin basic protein, GPMBP）と結核菌体（Mycobacterium tuberculosis, MTB）含むフロイントの完全アジュバントとを用い、動物としては４週齢のLewisラットを用いた。各ラットの足底に５μｇのGPMBPと２００μｇのMTBを含む上記アジュバントとを注射して感作を行った。
【００４７】
感作日を０日として毎日ラットの症状を観察し、無症状は０、尾の緊張低下を１、下肢の緊張低下を２、下肢の麻痺を３、上肢の麻痺を４、死亡を５として症状を数値化して記録した（臨床スコア）。同時に、クエン酸を抗凝固剤として用い、感作された動物から日を追って採血して血漿を調製し、そのＴＡＴレベルを測定した。
【００４８】
血漿は、静脈血９容に０．１１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液１容を加え、混和後約３０００ｒｐｍで１０分遠心分離して血漿を採取することにより調製した。
【００４９】
ＴＡＴの測定にはヘキストジャパン社から販売されているキット、エンザイグノストTAT microを用い、添付されている説明書に記載された方法に従って行った。概略は以下の通りである。抗トロンビン抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、上記キットに添付されたＴＡＴ標準血漿及びＴＡＴコントロール血漿、並びに検体のそれぞれの５０μｌを入れ、軽く振盪した。付属のカバーシールで各ウェルを覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。その後カバーシール除去し、各ウェルの反応液を吸引した後、添付の洗浄液を各ウェルに約０．３ｍｌずつ加え、再度吸引する洗浄操作を三回繰り返した。その後添付のペルオキシダーゼ標識ＡＴIII抗体液の２００μｌを標識抗体希釈液１バイアルに加えて作製した標識抗体液を１００μｌずつ各ウェルに加えた。再度各ウェルを付属のカバーシールで覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。カバーシールを除去し、各ウェルの反応液を吸引した後、添付の洗浄液を各ウェルに約０．３ｍｌずつ加え、再度吸引する洗浄操作を三回繰り返した。添付の基質緩衝液１０ｍｌを添付のクロモゲン（1,2-フェニレンジアミン塩酸塩）の１バイアル(250μg)に加え溶解して作製したクロモゲン溶液を、各ウェルに１００μｌずつ加えた。再度添付のカバーシールで各ウェルを覆い、遮光して２０〜２５℃の温度で３０分間インキュベートした。カバーシールを取り除き、添付の反応停止液を各ウェルに１００μｌずつ加えた後、精製水をブランクとして４９２ｎｍにおける各反応液の吸光度を測定した。説明書の記載に従って、標準血漿、コントロール血漿を使用して得た値から標準曲線及び精度を求め、説明書に記載されている条件を満たしていることを確認した後、検体についての測定値を求めた。結果を表１及び図１に示す。
【００５０】
【表１】

【００５１】
ＴＡＴレベル値は感作後８日目から明らかに上昇した。この時期は症状の発現が始まった日の平均値９．６日より早かった。また、ＴＡＴレベル値は症状の改善とともに低下した。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の検出方法によれば、脱髄疾患を臨床症状発現前に早期に診断することができ、また他の神経疾患に対する鑑別診断を行うことができる。さらには本発明の検出方法によれば脱髄疾患の病勢を診断することもできる。また本発明の診断キットによれば、上記の脱髄疾患の早期の診断、鑑別診断、病勢の診断を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラットに感作物質を投与して脱髄疾患を誘起した際の感作後経過日数とＴＡＴ（トロンビン−アンチトロンビンIII複合体）レベル測定値及び数値化した症状（臨床スコア）の関係を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a demyelinating disease such as multiple sclerosis and acute disseminated encephalomyelitis, and a diagnostic kit for use in the method. More specifically, a detection method that can be used for early diagnosis at the time of relapse of a demyelinating disease such as multiple sclerosis or acute disseminated encephalomyelitis, a differential diagnosis for various neurological diseases that are confused with that of demyelinating disease, and the like. It relates to a diagnostic kit for use.
[0002]
[Prior art]
Demyelinating disease is a neurological disease that surrounds nerve axons and damages the myelin sheath that has the function of promoting excitatory conduction as an axon insulator, and includes multiple sclerosis and acute scattering Encephalomyelitis and the like. Many of these demyelinating diseases remit and relapse repeatedly, but there have been no effective diagnostic methods for predicting relapse early. In addition, any of these diseases is not easily differentially diagnosed with other neurological diseases, and a method useful for such differential diagnosis has been demanded.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention provides a detection method that can be used for early diagnosis at the time of relapse of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and acute disseminated encephalomyelitis, differential diagnosis between demyelinating diseases and various confusing neurological diseases, etc. The purpose is to provide.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have conducted extensive studies using rat experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which is an animal model of the above-mentioned disease. The level of thrombin-antithrombin III complex (TAT) in the serum is increased prior to the onset of clinical symptoms of demyelinating disease, and demyelinating disease can be diagnosed early by measuring the level of TAT in the sample. It was found. It has also been found that the level of TAT decreases with the recovery of the demyelinating disease state, and thus the condition of the demyelinating disease can be diagnosed by measuring the level of TAT. The present invention has been completed based on these findings.
[0005]
Accordingly, the present invention provides a method for detecting a demyelinating disease, characterized by measuring the thrombin-antithrombin III complex level in a body fluid.
[0006]
In a preferred embodiment of the above-described method of the present invention, the thrombin-antithrombin III complex level is measured by an immunological assay. For example, it is specific to at least one of thrombin-antithrombin III complex, thrombin and antithrombin III. Using at least one antibody selected from antibodies reacting with Therefore, immunological measurement can be performed using, for example, an antibody against thrombin-antithrombin III complex, or a combination of an antibody against thrombin and an antibody against antithrombin III.
[0007]
In another embodiment of the present invention, a diagnostic kit for diagnosing a demyelinating disease comprising at least one antibody selected from an antibody that specifically reacts with at least one of thrombin-antithrombin III complex, thrombin and antithrombin III Is provided.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The demyelinating disease to be diagnosed by the detection method of the present invention is a neurological disease that surrounds nerve axons and impairs the myelin sheath having a function of promoting excitatory conduction as an axon insulator. The condition in which the myelin is damaged is called demyelination. Demyelination is a primary demyelination in which the myelin is selectively damaged and the axon is kept normal, and the myelin is damaged after the axon is damaged. Symptomatic known to be caused by idiopathic demyelination of unknown cause and malnutrition associated with papovavirus infection, alcoholism, etc. Divided into demyelination. The method of the present invention can target demyelinating diseases caused by any of these types of demyelination.
[0009]
Typical demyelinating diseases include multiple sclerosis (MS), which is considered to be caused by autoimmunity, acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), and spinal nerve root neuropathy considered to be a subtype of ADEM. (myeloradiculoneuropathy), adrenoleukodystrophy, white matter dystrophy such as metachromatic leukodystrophy, etc., and any of them can be applied to the detection method of the present invention. Of these, the present invention is particularly useful for diagnosis of MS and ADEM.
[0010]
In the detection method of the present invention, the level (concentration) of TAT in a body fluid collected from a vertebrate including a target human patient is measured. Examples of the body fluid that can be used include, but are not limited to, blood, plasma and serum that are fractions thereof, cerebrospinal fluid, and the like.
[0011]
TAT to be measured in the detection method of the present invention is a complex of thrombin and antithrombin III (ATIII), which is a known biological substance. This blood level can be measured in place of the level of thrombin that rapidly disappears in the blood, and is known to be used as an indicator of thrombin formation, that is, blood coagulation activity, thrombus formation tendency, etc. .
[0012]
The method for measuring TAT is not particularly limited, but it is usually preferable to measure by an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction. According to the immunological measurement method, TAT is highly sensitive and specific. Can be quantified. The principle of such immunological assay itself may be known, and can be performed by any of unlabeled immunoassay such as laser immunoassay, labeled immunoassay such as radioimmunoassay and enzyme immunoassay. It is usually preferable to measure by a labeled immunoassay from the viewpoint of sensitivity, ease of measurement, and the like. The method of the labeled immunoassay is not particularly limited, for example, a liquid phase method using an antigen-antibody reaction in a liquid phase, a so-called method using a first antibody bound to a solid phase and a labeled second antibody. Any of a sandwich method, a method in which TAT in a specimen is adsorbed on a solid phase, and this is measured with an antibody can be used.
[0013]
The antibody used in the immunoassay can also be selected from various types. For example, an antibody that specifically binds to TAT, that is, an antibody that does not react with thrombin or ATIII but specifically reacts only with TAT, thrombin or Any antibody that specifically reacts with any of ATIII and reacts specifically with thrombin in TAT or ATIII may be used. For example, if an antibody that specifically binds to TAT is used, only TAT can be directly captured. In addition, when an antibody that reacts specifically with either thrombin or ATIII and reacts specifically with thrombin or ATIII in TAT is used, it captures both thrombin or ATIII and TAT, and further forms TAT. As a result, only TAT can be captured by an antibody that specifically reacts with the other binding partner (ie, an anti-ATIII antibody or an antithrombin antibody). As the antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but it is preferable to use a monoclonal antibody.
[0014]
The label used in the label immunoassay can be arbitrarily selected from known ones, and radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, and the like can be used.
[0015]
As described above, the TAT level in blood has been measured as an index of coagulation activity, thrombus formation tendency, etc., and various immunological methods for measuring TAT specifically with high sensitivity (specially) Table 5-7508103, Japanese Patent 2569383, JP 3-48158, etc., and polyclonal and monoclonal antibodies against thrombin, ATIII, TAT, etc. (JP 7-59590, JP 8-120000), JP-A-9-234068) and the like, and various peripheral technologies such as a TAT stabilization method (Japanese Patent No. 2645774) have been proposed. The measurement of the TAT level itself can be performed using techniques well known to those skilled in the art and techniques and materials described in these documents.
[0016]
Hereinafter, the TAT measurement by the so-called sandwich method (see Japanese Patent Publication No. 6-41952) using the first antibody bound to the solid phase and the labeled second antibody or the second antibody that can be labeled is further detailed. Explained.
[0017]
The first antibody and the second antibody used in the sandwich method can be selected from an antibody that specifically binds to TAT, an antibody that specifically reacts with either thrombin or ATIII, and the like.
[0018]
In this method, for example, a sample containing TAT is contacted with a first antibody immobilized on a solid phase, and then contacted with a second antibody labeled with a labeling substance, whereby TAT, the first antibody, and the labeling substance in the sample are contacted. The second antibody labeled directly with is reacted to form a complex consisting of second antibody- (TAT) -first antibody-solid phase. Then, the free second antibody is separated from the complex, and the TAT in the sample is measured by detecting the labeled substance of the complex or the separated second antibody.
[0019]
Further, the complex of the formed second antibody- (TAT) -first antibody-solid phase is contacted with a labeled anti-immunoglobulin antibody that specifically binds to the second antibody. TAT in a sample can also be measured by forming a complex of labeled anti-immunoglobulin antibody and detecting the labeled substance. Compared with the method of directly labeling the second antibody, the method of using a readily available labeled anti-immunoglobulin antibody is more convenient. The anti-immunoglobulin antibody used in this method is an antibody that recognizes immunoglobulin of the same species as the animal used to produce the second antibody.
[0020]
In the sandwich method as described above, the order of complex formation of the second antibody- (TAT) -first antibody can be so-called forward, reverse, or simultaneous ("protein nucleic acid enzyme" separate volume No. 31, enzyme Immunoassay, published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1987, p13-26).
[0021]
Examples of the solid phase on which the first antibody is immobilized include plates, tubes, beads, membranes and gels. As the material, polystyrene, polypropylene, nylon, polyacrylamide and the like are preferable.
[0022]
As a method for immobilizing the first antibody on these solid phases, a general method for preparing an immobilized enzyme, such as a physical adsorption method, a covalent bond method, a comprehensive method (immobilized enzyme, 1975, issued by Kodansha, 9-75) can be used. Since the operation is simple, physical adsorption (so-called coating) is particularly preferable.
[0023]
In addition, the surface portion of the solid phase on which the first antibody is immobilized may have a surface portion to which the first antibody is not bound, and if TAT or other molecular species in the specimen binds to that portion, the surface portion is not accurate. In some cases, a correct measurement result cannot be obtained. Therefore, it is preferable to add a blocking substance before the specimen is brought into contact with the solid phase so as to cover the portion where the first antibody is not bound. Examples of such blocking substances include serum albumin, casein, milk protein and the like collected from cattle and the like, and commercially available materials as blocking substances can also be used.
[0024]
In addition, it is preferable that after binding TAT in the specimen to the first antibody immobilized on the solid phase, the surface of the solid phase is washed with a washing solution to remove nonspecifically adsorbed substances. Examples of the washing solution include a buffer solution (for example, phosphate buffer solution, phosphate buffered saline (PBS), Tris-HCl buffer solution) to which a surfactant such as a Tween surfactant is added. It is done.
[0025]
As described above, the labeling substance used for labeling the second antibody or the anti-immunoglobulin antibody having immunological affinity for the antibody is an enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, acetylcholinesterase, etc.) as described above. , radioisotope ^{^{^{(125 I, 131 I, 3}}} H , etc.), fluorescent dyes (luminol, fluorescein isothiocyanate (FITC) or the like), chemiluminescent substances, haptens, biotin, avidin (e.g., streptavidin, etc.) and the like However, there is no particular limitation as long as it can be used for labeling a normal protein. Here, the labeling substance is a method that uses a combination of a substance having a specific binding ability (for example, avidin) bound to a detectable label without directly detecting itself such as biotin. The substance used for is also included.
[0026]
The antibody labeling method may be a known method suitable for a labeling substance, for example, a glutaraldehyde method, periodate crosslinking method, maleimide crosslinking method, carbodiimide method, activated ester method, etc. When labeling with an isotope, it can be appropriately selected from the chloramine T method, the lactoperoxidase method (secondary biochemistry experiment course 2 “protein chemistry (below)”, Tokyo Kagaku Dojin, published in 1987), and the like.
[0027]
The detection method of the labeling substance varies depending on the labeling substance to be used. For example, when the second antibody or immunoglobulin antibody is labeled with an enzyme such as peroxidase, the enzyme substrate (in the case of peroxidase) after the antigen-antibody reaction described above And a method of measuring the degree of color development of the product due to the enzymatic reaction by changing the absorbance, etc., by adding a hydrogen peroxide solution and a chromogenic substrate (chromogen) such as orthoferenediamine and tetramethylbenzidine. In addition, when the antibody is labeled with biotin, after the antigen-antibody reaction, a biotin-binding substance (for example, streptavidin) labeled with an enzyme such as peroxidase is added, and the biotin-binding substance and biotin are added. The enzyme can be bound to the antibody, and then the enzyme activity can be measured as described above. When a fluorescent substance or a chemiluminescent substance is used as the labeling substance, a method of measuring fluorescence or luminescence of the solution after the antigen-antibody reaction can be mentioned.
[0028]
In the TAT level measurement of the detection method of the present invention, the concentration of TAT in the sample is prepared in advance using a TAT standard solution of a known concentration, and a calibration curve is created for the relationship between the TAT concentration and the detection result of the labeling substance. It is possible to quantify by comparing the detection result of the sample and the calibration curve.
[0029]
In the measurement method as described above, the specimen containing TAT does not need to be purified in advance.
[0030]
By measuring the TAT level in the human body fluid as described above and observing the change by the measurement method as described above, as shown in the examples below, When a myelopathy develops or relapses, the TAT level increases prior to the onset of clinical symptoms, and is about 3 to 50 times the normal level at about 2 to 15 days before the onset of clinical symptoms. About 5 to 20 times. Therefore, according to the detection method of the present invention, a demyelinating disease can be diagnosed at an early stage before onset of clinical symptoms. Moreover, the level of TAT after the onset of clinical symptoms decreases with the recovery of the pathology of the demyelinating disease, and therefore the disease state of the demyelinating disease can be diagnosed by the level of TAT.
[0031]
While not being bound by any theory, the remarkable increase in TAT levels in demyelinating diseases is due to abnormalities in the vascular endothelium and activation of the blood coagulation system being deeply involved in the pathology of the disease. It is thought that it is because.
[0032]
Furthermore, as another embodiment of the present invention, there is provided a diagnostic kit for carrying out the above-described detection method of the present invention by the immunological assay as described above.
[0033]
The diagnostic kit of the present invention comprises a reagent for immunological measurement of TAT comprising at least one antibody selected from antibodies specifically recognizing at least one of TAT, thrombin and ATIII as a constituent component. is there.
[0034]
When TAT is detected by the sandwich method as described above, a first antibody selected from the above-mentioned antibodies, which is bound to a solid phase, and a label which is or can be labeled with a labeling substance. Two antibodies are included as components. If such a kit is used in which the first antibody is immobilized on a solid phase in advance, the operation of immobilizing the antibody on the solid phase in the diagnostic process can be omitted.
[0035]
By using such a diagnostic kit of the present invention, for example, a first antibody immobilized on a solid phase is contacted with a specimen containing TAT, and then contacted with a second antibody labeled with peroxidase or the like. By forming a complex composed of antibody- (TAT) -first antibody-solid phase and detecting a labeling substance (for example, peroxidase) contained in the complex, the TAT concentration in the specimen can be measured.
[0036]
The kit further includes a TAT standard having a known concentration as a standard for preparing a calibration curve, a detection reagent for a labeling substance, a reagent for labeling a second antibody, a reagent for detecting a second antibody (labeled anti-immunoglobulin) Antibody etc.) can be added as needed. Further, in addition to these components, the above-described blocking substance, washing solution, specimen dilution solution, enzyme reaction stop solution and the like may be included.
[0037]
These components can be stored in separate containers and stored as a kit that can be used in accordance with the above prescription when used.
[0038]
When TAT in human body fluids is measured using the diagnostic kit of the present invention, the level is low in healthy individuals, but high in patients with demyelinating disease before the clinical symptoms appear Level, and early diagnosis of demyelinating disease, particularly early diagnosis at the time of relapse can be easily performed. In addition, it is possible to easily perform a differential diagnosis between a demyelinating disease and various confusing neurological diseases. Furthermore, since the TAT level can also be an indicator of the disease state of a demyelinating disease, the kit is useful for simply evaluating the disease state of a demyelinating disease.
[0039]
Specific examples of the kit include a diagnostic kit containing the following components.
[0040]
(1) Labeled antithrombin antibody stock solution (antithrombin antibody stock solution labeled with peroxidase and capable of recognizing both thrombin and TAT) 100 μl
(2) Dilution solution (containing bovine serum albumin and thimerosal so that the final concentrations are 5% and 0.01%, respectively) One vial containing 10 ml. (3) 96-well microtiter plate coated with anti-TAT antibody One piece (4) PBS tablet for washing liquid bulk powder (one which can obtain 100 ml of PBS when dissolved in 100 ml of distilled water) [0041]
▲ 5 ▼ Tablet for citrate phosphate buffer bulk powder (60ml of 0.1M citrate phosphate buffer, pH5 can be obtained when dissolved in 60ml of distilled water) ▲ 6 ▼ Contains 10mg of orthophenylenediamine powder One vial (7) TAT standard plasma powder (freeze-dried 300 μl of plasma containing 100 μg / L TAT) One vial (8) Normal control plasma powder (corresponding to 300 μl of plasma) collected from multiple healthy subjects 1 [0042]
The measurement of the TAT level of an actual patient sample using the above kit can be performed, for example, as follows.
[0043]
A sample of a patient with demyelinating disease who is currently in remission or suspected of having demyelinating disease (add 9 parts of 0.11 mol / l sodium citrate solution to 9 parts of venous blood and mix at 10 50 μl of plasma collected by centrifugal separation is put into a well of a 96-well microtiter plate (3) coated with anti-TAT antibody. Separately, 50 μl of a solution prepared by adding 300 μl of distilled water to normal control plasma powder (8) is put into a well of a 96-well microtiter plate (3). Similarly, a solution prepared by adding 300 μl of distilled water to TAT standard plasma powder (7), and TAT standard plasma powder (7) -2 prepared by diluting twice with dilution solution (2). 50 μl of each of the 4-fold, 4-fold and 8-fold diluted solutions is also placed in the wells of a 96-well microtiter plate (3), and each plate is incubated at 20 to 25 ° C. for 1 hour. Remove. Then, about 0.3 ml of a phosphate buffer solution prepared using PBS tablets (4) for washing solution bulk powder is added to each well, and then the washing operation of sucking is performed three times, and then immediately, the labeled antithrombin antibody stock solution (1) Add ▼ to a total volume of 8 ml of dilution solution (2) and mix so as not to foam, and add 50 μl to each well. After incubating at 20 to 25 ° C. for 1 hour, the whole amount of orthophenylenediamine powder (6) was completely dissolved in the citrate phosphate buffer prepared in Tablet (5) for citrate phosphate buffer bulk powder, and then commercially available. Add 10 μl of the hydrogen peroxide solution and add 50 μl of each mixture to each well. Ten minutes later, 20 μl of 2M sulfuric acid was added to each well to stop the reaction, and the absorbance of the reaction solution was measured at 492 nm. A calibration curve is made with the value obtained from the standard solution (dilution solution (8)), and the concentration of the sample is read from this. As a negative control, the value obtained from the normal control plasma powder (8) is used. A calibration curve is created by performing triple measurements.
[0044]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0045]
Example Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE, Clinical Immunology Illustrated, pp. 112, established as an animal model of multiple sclerosis, which is regarded as a representative disease of demyelinating disease -117, Brostoff, Scadding, Male, Roitt, Shunichi Hirose, Shogo Kano, Tomio Tada, Nanedo 1994), and observed the level of TAT.
[0046]
EAE was created as follows. That is, as a sensitizer for inducing disease, guinea pig myelin basic protein (GPMBP) and Freund's complete adjuvant including Mycobacterium tuberculosis (MTB) are used as animals. Four week old Lewis rats were used. Sensitization was performed by injecting the above adjuvant containing 5 μg of GPMBP and 200 μg of MTB into the sole of each rat.
[0047]
The sensitization date is 0 days, and the rats' symptoms are observed daily. Asymptomatic is 0, tail tension decrease is 1, lower leg decrease is 2, lower limb paralysis is 3, upper limb paralysis is 4 and death is 5 Symptoms were digitized and recorded (clinical score). At the same time, citric acid was used as an anticoagulant, blood was collected from the sensitized animals on a day-by-day basis to prepare plasma, and its TAT level was measured.
[0048]
Plasma was prepared by adding 1 volume of a 0.11 mol / l sodium citrate solution to 9 volumes of venous blood, mixing, and then centrifuging at about 3000 rpm for 10 minutes to collect the plasma.
[0049]
The TAT was measured using a kit, Enzygnost TAT micro, sold by Hoechst Japan, according to the method described in the attached manual. The outline is as follows. In each well of a 96-well microtiter plate coated with anti-thrombin antibody, 50 μl of each of the TAT standard plasma and TAT control plasma attached to the kit and the specimen were placed and shaken gently. Each well was covered with an attached cover seal and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the cover seal was removed, the reaction solution in each well was aspirated, and the attached washing solution was added to each well in an amount of about 0.3 ml, and the washing operation of aspirating again was repeated three times. Thereafter, 200 μl of the attached peroxidase-labeled ATIII antibody solution was added to 1 vial of labeled antibody dilution solution, and 100 μl of the labeled antibody solution prepared was added to each well. Each well was again covered with the attached cover seal and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. After removing the cover seal and aspirating the reaction solution in each well, the washing operation of adding approximately 0.3 ml of the attached washing solution to each well and aspirating again was repeated three times. A chromogen solution prepared by adding 10 ml of the attached substrate buffer solution to 1 vial (250 μg) of the attached chromogen (1,2-phenylenediamine hydrochloride) and adding 100 μl was added to each well. Each well was again covered with the attached cover seal, and incubated for 30 minutes at a temperature of 20 to 25 ° C. while being protected from light. After removing the cover seal and adding 100 μl of the attached reaction stop solution to each well, the absorbance of each reaction solution at 492 nm was measured using purified water as a blank. Obtain the standard curve and accuracy from the values obtained using standard plasma and control plasma as described in the instructions, confirm that the conditions described in the instructions are satisfied, and then obtain the measured values for the specimen. Asked. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0050]
[Table 1]

[0051]
TAT level values clearly increased from day 8 after sensitization. This time was earlier than the average value of 9.6 days when the onset of symptoms began. Also, the TAT level value decreased with improvement of symptoms.
[0052]
【The invention's effect】
According to the detection method of the present invention, a demyelinating disease can be diagnosed at an early stage before clinical symptoms appear, and a differential diagnosis for other neurological diseases can be performed. Furthermore, according to the detection method of the present invention, the disease state of a demyelinating disease can also be diagnosed. Moreover, according to the diagnostic kit of the present invention, early diagnosis, differential diagnosis, and disease state diagnosis of the above demyelinating disease can be easily performed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the number of days after sensitization and measured TAT (thrombin-antithrombin III complex) levels and quantified symptoms when a sensitizer was administered to rats to induce demyelinating disease (FIG. 1). It is a graph which shows the relationship of a clinical score.

Claims

A method for detecting a demyelinating disease, comprising measuring a thrombin-antithrombin III complex level in a body fluid.

The method according to claim 1, wherein the thrombin-antithrombin III complex level is measured by an immunoassay.

A diagnostic kit for diagnosing a demyelinating disease comprising at least one antibody selected from an antibody that specifically reacts with at least one of thrombin-antithrombin III complex, thrombin and antithrombin III.