JP3936063B2

JP3936063B2 - Method for identifying condition of diabetic patient and diagnostic kit using this method

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Publication number: JP3936063B2
Application number: JP10194998A
Authority: JP
Inventors: 修一宮浦; 佐和子竹下; 剛石丸
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-03-30
Publication date: 2007-06-27
Anticipated expiration: 2018-03-30
Also published as: JPH10332690A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病性腎症の病態の把握に係わる方法，及びこの方法を用いる診断用キットに関する技術分野の発明である。より詳細には、糖尿病性腎症へ移行する過程における、尿検体中のヘパラン硫酸の量的及び／又は質的な変化を検出することによって、糖尿病患者の状態を把握する方法，及びこの方法を用いるキットに関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、数々の合併症を惹き起こすことが知られており、これらの合併症の中でも致命的なものの一つに、重篤な腎不全を惹き起こす「糖尿病性腎症」を挙げることができる。
健常な腎臓においては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸糖鎖における陰性荷電が、血中のタンパク質等に対する「チャージバリア」としての機能を果たしており、これによりタンパク質等の糸球体への沈着や尿への漏洩が防御されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1303,1979 ）。
【０００３】
しかしながら、糖尿病性腎症では糸球体基底膜が傷害を受けて「チャージバリア」としての役割を果たさなくなることが多い。この糖尿病性腎症の診断法として、従来はこの「チャージバリア」を通り抜けて尿中に漏洩したアルブミンを検量し、その検量値を健常人の正常値と対比して糖尿病性早期腎症を特定する方法が用いられてきた。
【０００４】
また、ヘパラン硫酸を測定する方法としては、抗ヘパラン硫酸抗体ＪＭ４０３を用いる方法が知られていたが、この抗ヘパラン硫酸抗体は、ヘパラン硫酸の他にヒアルロン酸にも特異性を有することが知られており(Kidney International,41(1992)pp115-123)、ヘパラン硫酸の定量において正確性を欠くために、ヘパラン硫酸のみの特異的な定量方法としては実用的ではなく、糖尿病性腎症診断への利用は不可能であった。
【０００５】
糖尿病患者は糖尿病性腎症を罹患する確率が高く、尿中アルブミン量によって▲１▼糖尿病（高血糖値／クレアチニン補正（ＣＲ）尿中アルブミン量１２mg/gＣＲ未満：以下ＤＭ１とも記載する）、▲２▼糖尿病性早期腎症（高血糖値／クレアチニン補正尿中アルブミン量１２mg/gＣＲ以上，２００mg/gＣＲ未満：以下ＤＭ２とも記載する）、▲３▼糖尿病性腎症（高血糖値／クレアチニン補正尿中アルブミン量２００mg/gＣＲ以上：以下ＤＭ３とも記載する）とに分類されている。
【０００６】
ＤＭ１の段階では腎臓の異常は検出されず、ＤＭ２の段階では腎臓に軽度の異常を有するが適切な治療によってＤＭ１の状態へ病状が回復する症例も見られる。しかしながらＤＭ３の段階では腎臓に重篤な傷害を有し、適切な治療を施したとしても病状の回復はほとんど見られない。
このように、糖尿病性腎症が本格的に発症した際の予後は極めて不良であるため、この糖尿病性腎症への移行を可能な限り早期に診断することが必要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来糖尿病性腎症の診断の指標として用いられている尿検体中のアルブミン量は健常人においても変動し、このアルブミン量のみをもって、糖尿病（ＤＭ１）から糖尿病性早期腎症（ＤＭ２）、さらに糖尿病性腎症（ＤＭ３）に移行しつつある糖尿病患者の病態を正確に把握することは困難である。
【０００８】
また、この尿検体中のアルブンミン量の変化から糖尿病性早期腎症又は糖尿病性腎症と確定的診断が下された時点で適切な治療を開始したとしても、糖尿病性腎症がＤＭ３の段階まで進行してしてしまっている場合が大部分であり、治療効果が現れず、重篤な腎症、更に腎不全へと進行する症例が多い。
【０００９】
そこで本発明が解決すべき課題は、尿検体中のアルブミン量による分類では糖尿病性早期腎症ではないが、糖尿病性早期腎症に移行しつつある糖尿病患者、又は糖尿病早期腎症であって、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定する手段を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上述した課題に対して、糖尿病性腎症における腎臓の糸球体の構造変化に先んじて、基底膜に存在するヘパラン硫酸の代謝異常が起こることに着目し、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、糖尿病性腎症患者の尿においては、この腎症が進行するに従ってヘパラン硫酸が量的及び／又は質的に変化することを見出し、この変化を検出することにより上記の課題を解決することが可能であることを見出した。
【００１１】
従って、本発明者は、糖尿病患者の尿検体中のヘパラン硫酸の量的変化及び／又は質的変化、特に、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基の変化を検出して、その糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を特定する方法、及びこの検出方法を行うための診断キットを提供し、さらにはこの特定方法を行う際の技術的基軸となるヘパラン硫酸の定量方法、及びこの定量方法を行うための定量キットを提供する。
【００１２】
上記の本発明における技術的な基軸となるヘパラン硫酸の定量方法では、尿検体等の検体中のヘパラン硫酸の量的変化及び／又は質的変化の特定手段として、この検体におけるヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体による抗原抗体反応を用いる定量手段を用いることが好ましい。
【００１３】
この定量方法では、特に尿検体や血液検体等の検体におけるヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体との抗原抗体反応を用いるため操作が容易であり、熟練した技術者でなくとも多くの検体を一度にスクリーニングすることが可能である。また、多数の検体であっても測定値の数値化が可能であるため、このヘパラン硫酸の定量法を用いることで、正確にヘパラン硫酸を定量することができる。
【００１４】
なお、本発明において「尿検体」とは、尿又は原尿あるいはそれらから血球成分等を除去する処理によって得た液体成分を意味するが、本発明においては採取したままの尿を尿検体として用いることが好ましい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
Ａ．本発明に係わる糖尿病患者の状態の特定方法について：
本発明は、糖尿病患者の検体中のヘパラン硫酸の量的変化及び／又は質的変化を特定して，その糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出し、糖尿病患者の状態を特定する方法である（以下、本発明特定方法という）。
【００１６】
本発明特定方法において、その量的変化及び／又は質的変化を特定する対象となるヘパラン硫酸は、ほ乳類では肺，肝臓，腎臓，脳，脾臓，大動脈等でタンパク質と結合したプロテオグリカンの状態（本明細書中において、「ヘパラン硫酸プロテオグリカン」とも記載する）で細胞膜や基底膜に存在する硫酸化多糖である。その基本糖鎖構造はヘパリンと共通のＤ−グルコサミンとヘキスロン酸（Ｄ−グルクロン酸及びＬ−イズロン酸）のくり返し構造をもち、Ｄ−グルコサミンのＮ位の硫酸基、６位の硫酸基及び／又はヘキスロン酸の２位の硫酸基の置換体であるが、ヘパリンと比して、硫酸基，Ｌ−イズロン酸，Ｎ−硫酸化グルコサミン含量が低く、抗血液凝固活性は極めて低い。
【００１７】
なお、本発明において「ヘパラン硫酸の量的及び／又は質的変化」とは、例えば、ヘパラン硫酸の構成糖のいずれかの残基が、何らかの修飾を受けた、特定のヘパラン硫酸の量の変化、分子量の変化、硫酸基量の変化、又は特定部位に硫酸基を有するヘパラン硫酸の量の変化等が挙げられる。
【００１８】
上述したように、健常な腎臓においては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸糖鎖における陰性荷電が、血中のタンパク質等に対する「チャージバリア」としての機能を果たしており、これによりタンパク質等の糸球体への沈着や尿への漏洩が防御されている。
【００１９】
そして、尿検体中の通常の形態のヘパラン硫酸の量は、糖尿病患者が糖尿病性腎症へと移行するにつれて減少する傾向が強い。本発明では、この通常の形態のヘパラン硫酸の尿検体中における増減を指標として、所望する糖尿病患者の状態の特定を行うことができる。
【００２０】
本発明においては、尿検体中のヘパラン硫酸を、後述する本発明に係わる定量方法により定量することで、糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出することができる。
【００２１】
すなわち、本発明により、上述のＤＭ１の糖尿病患者がＤＭ２の糖尿病性早期腎症へ、さらにはＤＭ３の糖尿病性腎症へと移行していく中間段階、言い換えれば従来の尿検体中アルブミン量によって規定される糖尿病性腎症の病態分類（ＤＭ１〜ＤＭ３）間における移行段階、すなわち「糖尿病性腎症への移行段階」を検出することができる。
【００２２】
すなわち、本発明において、尿検体から定量される通常の形態のヘパラン硫酸の量が、通常の値よりも少なくなれば、その糖尿病患者は糖尿病性腎症へと移行しつつあることを示しており、このことにより糖尿病患者の状態を特定することができる。
【００２３】
例えば、尿検体中におけるヘパラン硫酸の境界値を設定して、この設定値よりもヘパラン硫酸の検出量が少なければ「その糖尿病患者が糖尿病性腎症への移行段階にある」として、逆にこの値がその設定値よりも多ければ「糖尿病性腎症への移行段階にはない」とすることにより、糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出することが可能であり、所望する糖尿病患者の状態の特定方法が提供される。
【００２４】
さらに、糖尿病性腎症への進行に際しては、糸球体基底膜に存在するヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基が、特に減少する傾向が強い（Diabetologia.38,161-172(1995))。よって、本発明特定方法において用いる抗ヘパラン硫酸抗体（後述する）は、少なくともこのヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とする抗体を用いることが好ましい。
【００２５】
特に、この抗ヘパラン硫酸抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とするモノクローナル抗体を選択することが特に好ましい。
このようなモノクローナル抗体としては、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４、同ＨｅｐＳＳ−１（共に生化学工業株式会社製）等を挙げることができる。
【００２６】
例えば、これらの抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４等のような、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸基を含むグルコサミン残基を抗原決定基とするモノクローナル抗体をヘパラン硫酸の定量手段の一つとして用いる場合には、この境界値は３ＥＵ/mg ＣＲ以上，４０ＥＵ/mg ＣＲ以下、好ましくは５ＥＵ/mg ＣＲ以上，３０ＥＵ/mg ＣＲ以下に設定することが好ましい（ここに記載したＥＵの意味は、実施例において記載する）。
【００２７】
さらに、本発明特定方法は単独で糖尿病患者の状態を特定する手段として用いることも可能であるが、例えば既存の尿検体中のアルブミン値等の他の指標と組み合わせて用いることで、一層その信頼性を向上させることが可能である。
【００２８】
Ｂ．本発明に係わる定量方法について：
本発明特定方法を行う上においては、尿検体や血液検体等の検体中のヘパラン硫酸を的確に定量する定量方法の確立が技術的に重要である〔なお、本発明における「定量」は、例えば、ヘパラン硫酸の構成糖のいずれかの残基が、何らかの修飾を受けた特定のヘパラン硫酸の量等を測定、特定することを意味するものである〕。
【００２９】
本発明は、かかる検体中のヘパラン硫酸の定量方法をも提供するものである（以下、本発明定量方法ということもある。また「ヘパラン硫酸の検出」という場合には、特に断らない限り検体中のヘパラン硫酸を定量することを技術的概念として包含する。）。
【００３０】
この検体中の通常の形態のヘパラン硫酸の検出手段としては、例えばヘパラン硫酸分解酵素による分解及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を組み合わせた二糖分析法、ＨＰＬＣによる分析及びゲルろ過による分析、又はヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体による抗原抗体反応をその原理として用いる方法が挙げられる。
これらの方法のうち、ヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体による抗原抗体反応をその原理として用いる方法が好ましいが、検体中のヘパラン硫酸の検出が技術上可能である限りにおいて特に限定されるものではない。
【００３１】
抗原抗体反応をその原理として用いる方法としては、例えば、▲１▼固相担体（後述する）に固着させた抗ヘパラン硫酸抗体と、標識されたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸との間の抗原抗体反応をその原理として用いる方法や、▲２▼固相担体に固着させたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体との間の抗原抗体反応をその原理として用いる方法、さらには▲３▼ヘパラン硫酸を固着させた、微粒子状固相担体（後述する）に検体を接触させ、さらに抗ヘパラン硫酸抗体をこの微粒子状固相担体に接触させて、微粒子状固相担体同士を凝集させることにより、検体中のヘパラン硫酸を検出する方法等が挙げられ、かつ好ましい。
【００３２】
これらの抗原抗体反応をその原理として用いる検出方法において用い得る、各々の要素〔例えば、固相担体（微粒子状固相担体を含む），標識されたヘパラン硫酸，抗ヘパラン硫酸抗体等〕は、具体的な検出方法の態様に応じて適宜選択することが可能であり、特に限定されるものではないが、ここに各々の要素における代表的な態様を具体的に例示する。
【００３３】
抗ヘパラン硫酸抗体又はヘパラン硫酸を固着させる固相担体としては、例えばマイクロプレート，ビーズ，チューブ，メンブレン，ゲル，微粒子状固相担体〔例えば、ゼラチン粒子，カオリン粒子，合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕等が挙げられ、これらの固相担体の中でも、マイクロプレート，ビーズ，チューブ又は微粒子状固相担体を用いることが好ましい。特に正確な定量性とその実施に際しての簡便性等を考慮すると、マイクロプレートを固相担体として用いることが好ましい。
【００３４】
例えば、抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートを用いた抗原抗体反応を用いるヘパラン硫酸の検出方法としては、「1)抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートに、検体と標識されたヘパラン硫酸とを同時に加え、検体中のヘパラン硫酸と標識されたヘパラン硫酸との、競合的な抗ヘパラン硫酸抗体への結合を利用して、検体中のヘパラン硫酸を検出する競合的抗原抗体反応、又は2)抗ヘパラン硫酸抗体を固着させたマイクロプレートに検体を接触させ、この検体中のヘパラン硫酸をマイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に結合させた後、標識されたヘパラン硫酸をマイクロプレートに接触させて、マイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に結合している検体に由来するヘパラン硫酸に対して、マイクロプレート上の抗ヘパラン硫酸抗体に、標識させたヘパラン硫酸を、阻害的に結合させて、検体中のヘパラン硫酸を検出する阻害的抗原抗体反応」等をその原理として利用した検出方法を挙げることができる。
【００３５】
ここに挙げた抗ヘパラン硫酸抗体を、固着させたマイクロプレートを用いる態様の検出方法は、多数の検体の同時検出を容易にするため、極めて好ましい検出態様として挙げることができる。
【００３６】
マイクロプレート等の固相担体への抗ヘパラン硫酸抗体の固着方法としては、物理的吸着法，共有結合法，包括法等の一般的に用いる方法に従い、抗ヘパラン硫酸抗体を固相担体に固着させることができる。一般的には、その操作の簡便性により物理的吸着法によって抗ヘパラン硫酸抗体を固相担体に固着させることが好ましいが、この物理的吸着法に採り得る固着方法が限定されるものではない。
【００３７】
さらに、ヘパラン硫酸を固着させたマイクロプレート等の固相担体を用いる方法も、代表的な検出態様の一つとして挙げることができる。
例えば、ヘパラン硫酸を固着させたマイクロプレートに検体を添加して、このマイクロプレートに固着させたヘパラン硫酸及び検体中のヘパラン硫酸を抗ヘパラン硫酸抗体に対して競合的に反応させた後、マイクロプレートに固着させたヘパラン硫酸と反応して、このヘパラン硫酸に結合した抗ヘパラン硫酸抗体を、標識した二次抗体（抗ヘパラン硫酸抗体に特異性を有する）等を用いて検出して、検体中のヘパラン硫酸を検出する方法等の、競合的又は阻害的抗原抗体反応を利用した方法を挙げることができる。
【００３８】
これらの一連の検出方法において用い得る、標識されたヘパラン硫酸は、標識物質をヘパラン硫酸に結合させたものである。この標識物質として例えば、特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンと糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ，フィコエリトリン，ユーロピウム，フィコシアニン，ローダミン，テキサスレッド，ウンベリフェロン，トリカラー，シアニン，７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；アルカリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，ペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン，ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、２，４−ジニトロアニリン等のハプテン；¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈ等の
アイソトープなどを用いることが可能であり、特に限定されるものではないが、上記の特異的結合対の一方の物質を標識物質として選択することが好ましく、特に、ビオチンとアビジン類からなる特異的結合対の一方の物質を選択することが好ましい。
【００３９】
また、これらの標識物質のヘパラン硫酸との結合方法は、常法に従うことが可能である。
例えば、ヘパラン硫酸をビオチンで標識する方法としては、例えば、ヘパラン硫酸溶液にＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液等で溶解したＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びビオチン−ヒドラジド溶液を添加して反応させる方法を挙げることができる。なおこの結合方法においては、未反応のビオチンは、例えば透析，エタノール分画又は限外濾過等の常法によって除去することが可能であり、容易にビオチン−ヒドラジド標識したヘパラン硫酸を得ることができる点で好ましい。
【００４０】
さらに上記の標識物質が結合したヘパラン硫酸の標識物質の定量方法自体は、各々の標識物質の検出方法として既に確立している方法を用いて行うことができる。
例えば、ビオチンにより標識したヘパラン硫酸を検出する方法としては、ビオチンに対して親和性の高いアビジン類（標識済み：例えばペルオキシダーゼに代表される検出が容易な特定の酵素で標識することが好ましい）とヘパラン硫酸に結合したビオチンを反応させることにより、間接的にヘパラン硫酸を検出する方法が挙げられる。
【００４１】
なお、上記のペルオキシダーゼをストレプトアビジン等のアビジン類の標識物質として用いる場合には、このペルオキシダーゼにより発色させる基質としては、通常この用途に用いられるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の発色物質と、ペルオキシダーゼの基質として、過酸化水素水等を使用することが好ましい。
【００４２】
また、上述した抗ヘパラン硫酸抗体を検出するために用いる、抗ヘパラン硫酸抗体に特異性を有する二次抗体は、特に限定はされないが、抗ヘパラン硫酸抗体がウサギ由来であればウサギ免疫グロブリンに対する抗体、マウス由来であればマウス免疫グロブリンに対する抗体等が挙げられ、一次抗体である抗ヘパラン硫酸抗体に由来及びその種類に応じて適宜選択される。二次抗体を標識する物質としては、前述のヘパラン硫酸を標識するための物質として例示した物質群が挙げられるが、その中でも酵素類を用いるのが一般的である。これらの二次抗体を標識する物質及びこの標識物質を検出するための方法は、必要に応じて適宜選択することができる。
抗ヘパラン硫酸抗体−標識二次抗体の特に好ましい組み合わせを例示すると、マウスＩｇＭ抗体である１０Ｅ４とペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体との組み合わせ等を挙げることができる。
【００４３】
本発明に係わる検出方法においては、これらのマイクロプレートのような容器状固相担体、その他、個々が目視できる程度の大きさの固相担体を用いる態様以外の形態も用い得る。このような態様の代表的な例として、上述の微粒子状固相担体の抗原抗体反応に基づく凝集反応を指標にする方法が挙げられる。
【００４４】
例えば、合成ポリマー粒子であるラテックス粒子等の微粒子状固相担体を用い、ヘパラン硫酸を固着させた微粒子状固相担体に検体を接触させ、さらに抗ヘパラン硫酸抗体を、この微粒子状固相担体に接触させることによって起こる、抗ヘパラン硫酸抗体を介したラテックス粒子同士の凝集反応について、検体との接触によりこの凝集反応が、この検体中のヘパラン硫酸により阻害される度合いを検出することにより、検体中のヘパラン硫酸を検出することが可能である。
【００４５】
また、上記の一連の抗原抗体反応を利用した検出方法において用いられる抗体は、ヘパラン硫酸を認識し得る抗ヘパラン硫酸抗体である限り、モノクローナル抗体であっても，ポリクローナル抗体であっても、所望する検体中のヘパラン硫酸の定量をすることは可能であるが、ヘパラン硫酸に特異性を有し、かつヒアルロン酸には交叉性を示さない抗体を用いることが好ましい。また、より精度の高い結果を得るためにはヘパラン硫酸中の特定の抗原決定基に対して特異性（その抗体が特定の抗原決定基を認識して抗原抗体反応を惹起し得ること）を有するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００４６】
モノクローナル抗体は、ヘパラン硫酸を免疫原とした免疫細胞のハイブリドーマから所望する抗体産生クローンを選択する通常公知の方法を採用して製造することができる。
このようにして、本発明に係わる定量方法が提供される。
【００４７】
Ｃ．本発明に係わるキットについて
上述した本発明定量方法を実施するためのキットは、検体中のヘパラン硫酸を定量することが可能なキットである。
【００４８】
この本発明定量方法を実施するためのキットは、上述した本発明定量方法を簡便に実施するためのキットであれば特に限定はされない。具体的には、このキットは、少なくとも抗ヘパラン硫酸抗体と、標識したヘパラン硫酸又は固相へ固着したヘパラン硫酸（以下、これらのヘパラン硫酸を、「競合ヘパラン硫酸」と指称する）を含むキットとしての形態をとるが、抗ヘパラン硫酸抗体を固着させた固相担体を含むキットの態様が最も好ましい態様である。
【００４９】
さらに、本発明定量方法を実施するためのキットは、最も好ましくは、上記の要素に加えて、▲１▼競合ヘパラン硫酸として標識物質によりヘパラン硫酸を標識した標識ヘパラン硫酸を含む試薬及び▲２▼この標識ヘパラン硫酸に結合した標識物質を検出するための試薬を含むキットである。
【００５０】
なお、このキット中の標識ヘパラン硫酸を含めて、試薬中のヘパラン硫酸は、一定量であり、かつ試薬系中に均一に存在することが好ましいことは勿論である。
また、この態様のキットにおける標識ヘパラン硫酸における標識物質の種類と、それに応じた検出物質の種類については、上述の本発明定量方法における説明に従い選択することができる。
【００５１】
また、このような本発明定量方法を実施するためのキットには、通常の定量キットに含まれる緩衝液，蒸留水又は超純水等を必要に応じ本発明の所期の効果を損なわない限りにおいて、その構成要素とすることができる。
このような形態の本発明定量方法を実施するためのキットは、別に本発明特定方法を実施するためのキットとしての形態をとることもできる。
【００５２】
すなわち、上述した本発明定量方法を実施するためのキットは、糖尿病性腎症の移行段階を検出して、糖尿病患者の状態を特定するための診断キット（以下、本発明診断キットともいう）としての形態も採り得る。
本発明診断キットは、予め健常人（糖尿病性腎症に罹患していない糖尿病患者を含む）の尿検体中のヘパラン硫酸を定量して得た正常値と、糖尿病性腎症に移行しつつある可能性のある糖尿病患者の尿検体中のヘパラン硫酸とを定量して比較することにより、その糖尿病患者の尿検体におけるヘパラン硫酸ついての変化を特定し、その糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出し、糖尿病患者の状態を特定し得るキットである。
【００５３】
よって、この糖尿病性腎症の移行段階を検出して、糖尿病患者の状態を特定するための本発明診断キットに含まれ得る要素は、原則として上記の本発明定量キットと同一であるが、検体として尿を用いるために特に必要な、例えば、尿の前処理試薬等の要素を含ませることが好ましいことは勿論である。
【００５４】
この本発明診断キットにより、本発明特定方法を、簡易かつ正確に実施することが可能になり、糖尿病性腎症への移行段階を容易に検出し、これにより得られる情報に基づき、糖尿病患者の状態を特定して、適切な治療を行うことが可能になる。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を実施例等を用いてより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこの実施例等により限定されるべきものではない。
【００５６】
抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の抗原決定基の解析
ヘパラン硫酸分子中の硫酸基の変化に伴う、抗ヘパラン硫酸モノクローナル抗体１０Ｅ４の反応性の変化を検討することで、同１０Ｅ４の抗原決定基の解析を行った。
すなわち、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４を固着させたプレートに、▲１▼；各種の濃度の牛腎臓由来のヘパラン硫酸〔生化学工業株式会社、Lot.No.S94Z02 ：HS（BK）〕、▲２▼；▲１▼のヘパラン硫酸を完全に脱硫酸化した上記牛腎臓由来ヘパラン硫酸修飾物（CDSNAc-HS）、▲３▼；▲２▼のCDSNAc-HSのN位に硫酸基を再び導入したヘパラン硫酸修飾物（CDSNS-HS）、及び、▲４▼；▲１▼のN位の硫酸基のみを完全に脱硫酸化した上記牛腎臓由来のヘパラン硫酸（NDSNAc-HS）を添加した。同時にビオチン標識ヘパラン硫酸を添加し、プレートに固着させた抗ヘパラン硫酸抗体10E4と競合的抗原抗体反応により反応させた。
【００５７】
抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４と反応しなかったヘパラン硫酸、各ヘパラン硫酸修飾物及びビオチン標識ヘパラン硫酸を洗浄して除去した。続いて、ビオチンの検出を、後述するように、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて行った。ペルオキシダーゼの酵素活性は、後述するように、発色基質として過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を用い、最終的に450nmの吸光度を指標として定量した（図１）。図１において、縦軸は吸光度（O.D.）を、横軸はヘパラン硫酸量及び各修飾ヘパラン硫酸量を示す。
【００５８】
この結果より、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の反応性は、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基中のＮ−硫酸基の有無に依存することが判明した。
すなわち、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の抗原決定基は、少なくともヘパラン硫酸のグルコサミン残基中のＮ−硫酸基を含む構造であることが明らかになった。
また、ヘパラン硫酸と同様の方法で製造したビオチン標識ヒアルロン酸に対する抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の反応性を調べた結果、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４は、ヒアルロン酸に対する交叉反応性を示さないことも明らかになった。
【００５９】
検量線の作成
（１）ビオチン標識ヘパラン硫酸の調製
ヘパラン硫酸（生化学工業株式会社）を0.1M 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH5.5）に溶解して、10mg/mL のヘパラン硫酸溶液1.0 mLを調製した。
このヘパラン硫酸溶液に、ジメチルスルホキシド（DMSO）で20mMに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（ＰＩＥＲＣＥ社製）を25μL 添加した。続いて、0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）で100mg/mLに調製したＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）12.5μLをこれに添加し、よく撹拌した後、常温で16-24時間撹拌反応を行った。反応終了後、この反応物を分子量3,500 cutoffの透析膜において、透析液としてPBS（−）等を用い、微量透析装置（ＢＩＯ−ＴＥＣＫ社製）で、十分に遊離のビオチンを除去した。透析終了後、ビオチン標識ヘパラン硫酸を5mg/mL の濃度に調製し、凍結保存した。
【００６０】
（２）抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートの調製
抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４（生化学工業株式会社）をリン酸緩衝生理食塩水〔pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、ＰＢＳ（-）とも記載する〕で、20μg/mLに希釈し、この溶液50μLずつをヌンクイムノプレート（商品名：マキシソープ、ヌンク社製）の各ウェルに加え、4℃で14〜18時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをＰＢＳ（-）で2回洗浄し、ウエルの抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４でコーティングされていない部分をブロッキングするためのブロッキング物質として，3％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業株式会社販売）を含むＰＢＳ（−）溶液を加え、室温で2時間静置した。静置後、このプレートを洗浄液（0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-））で3回洗浄して、所望する抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートを得た。
【００６１】
（３）検量線の作成
上記洗浄後、（２）において調製した抗ヘパラン硫酸抗体コーティングプレートの各ウエルに、0.05％Ｔｗｅｅｎ２０及び1％ＢＳＡを含むＰＢＳ（-）（以下、反応液という）を100μL ずつ加えた。続いて、各濃度のヘパラン硫酸標準液（牛腎臓由来、生化学工業株式会社製）（25〜800μg/mLの各濃度）10μL をこのプレートの各ウエルに添加した。更に各ウエルに反応液で至適濃度に希釈した，上記（１）において調製したビオチン標識ヘパラン硫酸を100μL 加え、37℃で60分間静置して抗原抗体反応を行った（ヘパラン硫酸標準液の溶媒としては、反応液を用いた）。
【００６２】
この反応終了後、前記洗浄液で各ウエルを3回洗浄した後、反応液で1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＨＲＰ標識ストレプトアビジン：ＶＥＣＴＯＲ社製）を各ウェルに100μL加え、これを37℃で30分間静置して反応させた。
【００６３】
反応終了後、このプレートを前記洗浄液で3回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（モス社製）を100μL 加え、37℃で15分間反応させ、発色させた。プレートに1N-HClを100μL 加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダー（SK-601、生化学工業株式会社販売）で測定して、検量線を作成した（図２）。
【００６４】
なお、ヘパラン硫酸は多様性に富むため、独自の定義として牛腎臓由来のヘパラン硫酸（生化学工業株式会社、Lot.No．S94Z02）1μg を1EU と定義し、ヘパラン硫酸の力価をこの牛腎臓由来ヘパラン硫酸当量で表示する。
【００６５】
また、抗ヘパラン硫酸抗体の代わりにマウスＩｇＭをプレートに固着させた場合、反応が全く認められず、この反応は、非特異的反応ではなく、抗ヘパラン硫酸抗体（１０Ｅ４）に特異的な反応であることが示された（図２：control）。
【００６６】
検体中のヘパラン硫酸の定量による糖尿病患者の糖尿病性腎症の移行段階の検出
健常人（２７例）及び糖尿病患者（６８例）から採取した尿を検体として、この尿検体中に存在するヘパラン硫酸の定量を上記の方法で行った。
【００６７】
すなわち、糖尿病患者を尿中アルブミン濃度（クレアチニン補正値：ＡＣＲ；mg/g・ＣＲ）によりＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３の３群に分類した。ＤＭ１はＡＣＲ＜１２であり、ＡＣＲに関しては健常人と同レベルの糖尿病患者群である。ＤＭ２は１２≦ＡＣＲ＜２００であり、糖尿病性早期腎症患者群である。ＤＭ３は２００≦ＡＣＲであり、糖尿病性腎症患者群である。
【００６８】
図３は、尿検体中のヘパラン硫酸のレベルを各群間で比較したものであるが、尿検体中においては糖尿病患者（ＤＭ１）と健常人との間においても明らかにヘパラン硫酸レベルの差が認められた（糖尿病患者の尿検体中ヘパラン硫酸レベルは健常人に比べて明らか低い）。
【００６９】
またさらに、健常人（８３例）、ＤＭ１（４０例）、ＤＭ２（４１例）及びＤＭ３（４３例）の尿を検体として採取し、この検体中のアルブミン濃度（クレアチニン補正値：ＡＣＲ；mg/gＣＲ）及びヘパラン硫酸濃度（クレアチニン補正値：mg/gＣＲ）をプロットした際の分布領域を解析した（図４）。健常人とＤＭ１患者の尿検体中アルブミン濃度は同レベルである。また、ＤＭ１患者の尿検体中ヘパラン硫酸濃度は健常人と同じレベルからその１０分の１程度の低レベルまでと、分布が広い。糖尿病性腎症の病態の進行に従い、尿検体中ヘパラン硫酸濃度が低下する傾向は、ＤＭ１の段階ですでに認められると考えられる。そして、尿検体中ヘパラン硫酸濃度が低いＤＭ１患者は、糖尿病性早期腎症（ＤＭ２）へ病態が進行する危険度が高いと考えられる。
【００７０】
そこで、仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類し、境界値以上を陰性及び境界値未満を陽性とすると、糖尿病性腎症の進行に伴い陽性の割合が増加した（図５）。よって、このように５ＥＵ/mg ＣＲを境界値とすることは、本発明定量方法を用いて定量した尿検体中のヘパラン硫酸を基に本発明検出方法を実施する上で好ましいことが示唆された。
【００７１】
さらに、糖尿病性腎症の発症と関連する糖尿病の罹病期間に関して分類すると、罹病期間に伴い陽性の割合が増加した（図６）。
糖尿病の罹病期間が５〜１０年で糖尿病性早期腎症、１５年程度で糖尿病性腎症と診断される患者が増加する傾向が一般的に見られることと，この第６図の結果を照らし合わせて検討すると、この結果は本発明定量方法を技術的基軸とする本発明特定方法により糖尿病性腎症の病態の進行段階を把握し、糖尿病患者の状態を特定することが可能であることを示しており、本発明定量方法及び本発明特定方法の有用性を裏付けるものである。
【００７２】
本発明に係わるキット
本発明キットの構成及び使用法の一例を以下に記載する。
本実施例におけるキットは、次の１〜８の要素からなる。
１．抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４を固着させたイムノプレート（ブロッキング剤でブロッキング済み）：１枚
２．標準ヘパラン硫酸溶液（25、50、100、200、400、800EU/mL、各0.1mL）：１バイアルずつ
３．ビオチン標識ヘパラン硫酸溶液（至適濃度、15mL）：１バイアル
４．ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（1μg/mL、15mL）：１バイアル
５．テトラメチルベンジジン溶液（1.25mM ＴＭＢ、2.21mM 過酸化水素、1%ＤＭＳＯ、0.08M 酢酸緩衝液、pH4.9、15mL）：１バイアル
６．反応液（1％ＢＳＡ、0.05% Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-）、40mL）：１バイアル
７．洗浄液（0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（-）（500mL））：１バイアル
８．反応停止液（1N HCl（15mL））：１バイアル
【００７３】
この本発明キットの使用に際しては、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４固着済みイムノプレートの各ウェルを予め洗浄液で洗浄し、各ウェルに反応液を100μL ずつ分注した。
この、糖尿病腎症の移行段階の検出用キットにおいては、各濃度のヘパラン硫酸標準液又は糖尿病患者の検体尿を１０μL ずつ添加し、さらに各ウエルにビオチン標識ヘパラン硫酸液を１００μL ずつ添加して、３７℃で６０分間静置した。
【００７４】
その後、この検出用キットにおいて、洗浄液で各ウェルを3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン液を各ウェルに100μL 加え、これを37℃で30分間静置して反応させた。
静置後、各ウェルを洗浄液で3回洗浄し、その後各ウェルにテトラメチルベンチジン溶液100μL を添加し、37℃で15分間反応させ、発色させた。
【００７５】
発色後、各ウェルに反応停止液を100μL 加えて反応を停止させ、ペルオキシダーゼによるＴＭＢとH₂O₂との反応生成着物の着色波長である450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダー（SK601、生化学工業株式会社販売）で定量した。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によれば、糖尿病性腎症に移行しつつある糖尿病患者を可能な限り早期に特定する手段、すなわち検体中のヘパラン硫酸を的確に定量する定量方法、この定量方法を技術的基軸として、糖尿病患者の糖尿病性腎症への移行段階を検出し得る糖尿病患者の状態の特定方法、及びこれらの方法を実施するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘパラン硫酸と各種修飾体における、抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４の認識率を示した図面である。
【図２】ヘパラン硫酸標準液を用いて作成した検量線である。
【図３】尿検体中のヘパラン硫酸のレベルを、尿検体中のアルブミン濃度を指標にした各群間での比較を表す図面である。
【図４】尿検体中のアルブミン濃度とヘパラン硫酸濃度を対比し、その分布領域を示す図面である。
【図５】仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類して、糖尿病性腎症の症状との相関を検討した図面である。
【図６】仮に５ＥＵ/mg ＣＲを境界値として、この境界値未満又は同境界値以上で分類して、糖尿病性腎症の発症と関連する罹病期間との相関を検討した図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is an invention in the technical field relating to a method for grasping the pathological condition of diabetic nephropathy and a diagnostic kit using this method. More specifically, a method for grasping the state of a diabetic patient by detecting quantitative and / or qualitative changes in heparan sulfate in a urine sample during the transition to diabetic nephropathy, and this method The invention relates to a kit to be used.
[0002]
[Prior art]
Diabetes is known to cause a number of complications, and one of these fatal complications is “diabetic nephropathy” that causes severe renal failure. .
In healthy kidneys, the negative charge in the heparan sulfate sugar chain of heparan sulfate proteoglycan present in the glomerular basement membrane serves as a “charge barrier” for proteins in the blood, thereby causing glomeruli such as proteins. It is protected against deposition and leakage into the urine (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1303, 1979).
[0003]
However, in diabetic nephropathy, the glomerular basement membrane is often damaged and no longer serves as a “charge barrier”. Conventionally, as a diagnostic method for diabetic nephropathy, albumin leaked through the `` charge barrier '' and leaked into the urine was calibrated, and the calibrated value was compared with the normal value of healthy individuals to identify diabetic early nephropathy. A method has been used.
[0004]
Further, as a method for measuring heparan sulfate, a method using anti-heparan sulfate antibody JM403 has been known. However, it is known that this anti-heparan sulfate antibody has specificity to hyaluronic acid in addition to heparan sulfate. (Kidney International, 41 (1992) pp 115-123), because of the lack of accuracy in the determination of heparan sulfate, it is not practical as a specific method for determining heparan sulfate alone. The use was impossible.
[0005]
Diabetic patients have a high probability of suffering from diabetic nephropathy, and (1) diabetes (high blood glucose level / creatinine correction (CR) urinary albumin amount less than 12 mg / gCR: hereinafter also referred to as DM1), ▲ 2 ▼ early diabetic nephropathy (high blood glucose level / creatinine corrected urinary albumin level 12 mg / gCR or more, less than 200 mg / gCR: hereinafter also referred to as DM2), 3) diabetic nephropathy (high blood glucose level / creatinine corrected urine) Medium albumin amount 200 mg / g CR or more: hereinafter also referred to as DM3).
[0006]
In the DM1 stage, kidney abnormalities are not detected, and in the DM2 stage, there are cases where the kidneys have mild abnormalities but the disease is restored to the DM1 state by appropriate treatment. However, at the stage of DM3, the kidney has serious damage, and even if appropriate treatment is performed, there is almost no recovery from the disease state.
Thus, since the prognosis when diabetic nephropathy develops in earnest is extremely poor, it is necessary to diagnose the transition to diabetic nephropathy as early as possible.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the amount of albumin in a urine sample, which has been conventionally used as an index for diagnosis of diabetic nephropathy, varies even in healthy individuals, and from this amount of albumin alone, diabetes (DM1) to diabetic early nephropathy (DM2), Furthermore, it is difficult to accurately grasp the pathology of diabetic patients who are shifting to diabetic nephropathy (DM3).
[0008]
In addition, even if appropriate treatment is started at the time when a definitive diagnosis of diabetic early nephropathy or diabetic nephropathy is made from the change in the amount of albunmin in the urine sample, diabetic nephropathy is in the DM3 stage. Most cases have progressed, the therapeutic effect does not appear, and there are many cases that progress to severe nephropathy and further renal failure.
[0009]
Therefore, the problem to be solved by the present invention is not diabetic early nephropathy in the classification based on the amount of albumin in the urine sample, but is a diabetic patient who is shifting to diabetic early nephropathy, or early diabetic nephropathy, It is an object of the present invention to provide a means for identifying a diabetic patient who is shifting to diabetic nephropathy as early as possible.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor focused on the metabolic abnormality of heparan sulfate existing in the basement membrane prior to the structural change of the glomeruli of the kidney in diabetic nephropathy. We conducted an intensive study. As a result, in the urine of diabetic nephropathy patients, heparan sulfate is quantitatively and / or qualitatively changed as the nephropathy progresses, and the above problem is solved by detecting this change. I found that it was possible.
[0011]
Therefore, the present inventor detects quantitative and / or qualitative changes in heparan sulfate in urine samples of diabetic patients, in particular, changes in glucosamine residues containing the N-sulfate group of heparan sulfate. Provided is a method for identifying a transition stage of a patient to diabetic nephropathy, a diagnostic kit for performing this detection method, and a method for quantifying heparan sulfate as a technical basis for performing this identification method, and A quantification kit for performing this quantification method is provided.
[0012]
In the above-described method for quantifying heparan sulfate, which is the technical basis of the present invention, heparan sulfate and anti-heparan in this sample are used as means for specifying quantitative and / or qualitative changes in heparan sulfate in a sample such as a urine sample. It is preferable to use a quantitative means using an antigen-antibody reaction with a sulfate antibody.
[0013]
This quantification method is easy to operate because it uses an antigen-antibody reaction between heparan sulfate and anti-heparan sulfate antibodies, particularly in samples such as urine samples and blood samples, and many samples can be screened at once even without skilled technicians. Is possible. In addition, since it is possible to quantify the measured value even for a large number of specimens, heparan sulfate can be accurately quantified by using this heparan sulfate quantification method.
[0014]
In the present invention, the “urine sample” means urine or raw urine or a liquid component obtained by removing blood cell components from the urine, but in the present invention, urine as collected is used as a urine sample. It is preferable.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
A.About the method for identifying the condition of a diabetic patient according to the present invention:
The present invention identifies quantitative and / or qualitative changes in heparan sulfate in a specimen of a diabetic patient, detects the transition stage of the diabetic patient to diabetic nephropathy, and identifies the state of the diabetic patient It is a method (hereinafter referred to as the present invention specifying method)
[0016]
In the method for identifying the present invention, the heparan sulfate to be used for identifying the quantitative change and / or qualitative change is the state of proteoglycan bound to protein in the lung, liver, kidney, brain, spleen, aorta, etc. In the specification, it is also referred to as “heparan sulfate proteoglycan”) and is a sulfated polysaccharide present in the cell membrane and basement membrane. The basic sugar chain structure has a repetitive structure of D-glucosamine and hexuronic acid (D-glucuronic acid and L-iduronic acid) common to heparin, the N-position sulfate group, the 6-position sulfate group and / or D-glucosamine. Alternatively, although it is a substitution product of the sulfate group at the 2-position of hexuronic acid, the content of sulfate group, L-iduronic acid, and N-sulfated glucosamine is low and anticoagulant activity is extremely low compared to heparin.
[0017]
In the present invention, “quantitative and / or qualitative change of heparan sulfate” means, for example, a change in the amount of a specific heparan sulfate in which any residue of a constituent sugar of heparan sulfate has undergone some modification. , Change in molecular weight, change in the amount of sulfate group, change in the amount of heparan sulfate having a sulfate group at a specific site, and the like.
[0018]
As described above, in a healthy kidney, the negative charge in the heparan sulfate sugar chain of heparan sulfate proteoglycan present in the glomerular basement membrane functions as a “charge barrier” for proteins in the blood. Deposition on glomeruli such as proteins and leakage into urine are protected.
[0019]
And the amount of normal form heparan sulfate in urine samples tends to decrease as diabetic patients move to diabetic nephropathy. In the present invention, the desired state of the diabetic patient can be specified using the increase / decrease in the urine specimen of this normal form of heparan sulfate as an index.
[0020]
In the present invention, the stage of transition to diabetic nephropathy in a diabetic patient can be detected by quantifying heparan sulfate in a urine sample by the quantification method according to the present invention described later.
[0021]
That is, according to the present invention, the above-mentioned DM1 diabetic patient is defined by the intermediate stage of transition to DM2 diabetic nephropathy and further to DM3 diabetic nephropathy, in other words, by the amount of albumin in the conventional urine sample. It is possible to detect a transition stage between diabetic nephropathy pathological classifications (DM1 to DM3), that is, “transition stage to diabetic nephropathy”.
[0022]
That is, in the present invention, if the amount of normal form heparan sulfate quantified from the urine sample is less than the normal value, it indicates that the diabetic patient is shifting to diabetic nephropathy. This makes it possible to specify the condition of a diabetic patient.
[0023]
For example, if a boundary value of heparan sulfate in a urine sample is set, and if the detected amount of heparan sulfate is less than this set value, `` the diabetic patient is in the transition stage to diabetic nephropathy '', conversely If the value is higher than the set value, it is possible to detect the transition stage to diabetic nephropathy in a diabetic patient by “not in the transition stage to diabetic nephropathy”. A method for identifying a patient condition is provided.
[0024]
Furthermore, during the progression to diabetic nephropathy, the glucosamine residue containing the N-sulfate group of heparan sulfate present in the glomerular basement membrane has a particularly strong tendency to decrease (Diabetologia. 38, 161-172 (1995)). Therefore, the anti-heparan sulfate antibody (described later) used in the method of the present invention is preferably an antibody having at least a glucosamine residue containing the N-sulfate group of this heparan sulfate as an antigenic determinant.
[0025]
In particular, when a monoclonal antibody is used as the anti-heparan sulfate antibody, it is particularly preferable to select a monoclonal antibody having a glucosamine residue containing the N-sulfate group of heparan sulfate as an antigenic determinant.
Examples of such monoclonal antibodies include anti-heparan sulfate antibody 10E4 and HepSS-1 (both manufactured by Seikagaku Corporation).
[0026]
For example, in the case where a monoclonal antibody having a glucosamine residue containing an N-sulfate group of heparan sulfate, such as these anti-heparan sulfate antibodies 10E4, as an antigenic determinant is used as one of the quantification means of heparan sulfate, The boundary value is preferably set to 3 EU / mg CR or more, 40 EU / mg CR or less, preferably 5 EU / mg CR or more, and 30 EU / mg CR or less (meaning of EU described here is described in Examples). .
[0027]
Furthermore, the identification method of the present invention can be used alone as a means for identifying the state of a diabetic patient. However, by using it in combination with other indicators such as albumin level in an existing urine sample, the reliability can be further increased. It is possible to improve the property.
[0028]
B.About the quantitative method according to the present invention:
In carrying out the method for identifying the present invention, it is technically important to establish a quantitative method for accurately quantifying heparan sulfate in a sample such as a urine sample or a blood sample. This means that any residue of the constituent sugars of heparan sulfate measures and specifies the amount of specific heparan sulfate that has undergone some modification.
[0029]
The present invention also provides a method for quantifying heparan sulfate in such a sample (hereinafter sometimes referred to as “quantitative method of the present invention.” In the case of “detection of heparan sulfate”, unless otherwise specified, The technical concept is to quantify the amount of heparan sulfate.)
[0030]
As a means for detecting the normal form of heparan sulfate in this specimen, for example, a disaccharide analysis method combining decomposition by heparan sulfate decomposing enzyme and analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), analysis by HPLC and analysis by gel filtration, Or the method of using the antigen antibody reaction by a heparan sulfate and an anti- heparan sulfate antibody as the principle is mentioned.
Among these methods, a method using an antigen-antibody reaction by heparan sulfate and an anti-heparan sulfate antibody as its principle is preferable, but is not particularly limited as long as it is technically possible to detect heparan sulfate in a specimen.
[0031]
As a method using the antigen-antibody reaction as its principle, for example, (1) an antigen between an anti-heparan sulfate antibody fixed on a solid phase carrier (described later), labeled heparan sulfate and heparan sulfate in a sample is used. Method using antibody reaction as its principle, (2) Method using as its principle an antigen-antibody reaction between heparan sulfate immobilized on a solid support and heparan sulfate in a sample and anti-heparan sulfate antibody, and 3) A sample is brought into contact with a particulate solid phase carrier (to be described later) to which heparan sulfate is fixed, and an anti-heparan sulfate antibody is further brought into contact with the particulate solid phase carrier to aggregate the particulate solid carriers. Therefore, a method for detecting heparan sulfate in a sample is preferable and preferable.
[0032]
Each element [for example, solid phase carrier (including fine particle solid phase carrier), labeled heparan sulfate, anti-heparan sulfate antibody, etc.] that can be used in the detection method using these antigen-antibody reactions as its principle is specifically described. It is possible to select appropriately according to the mode of the specific detection method, and it is not particularly limited, but here, typical modes of each element are specifically exemplified.
[0033]
Examples of the solid phase carrier to which the anti-heparan sulfate antibody or heparan sulfate is fixed include, for example, a microplate, a bead, a tube, a membrane, a gel, a particulate solid phase carrier [for example, gelatin particles, kaolin particles, synthetic polymer particles (latex particles, etc.) Among these solid phase carriers, microplates, beads, tubes, or particulate solid phase carriers are preferably used. In consideration of accurate quantification and convenience in carrying out the measurement, it is preferable to use a microplate as a solid phase carrier.
[0034]
For example, as a method for detecting heparan sulfate using an antigen-antibody reaction using a microplate to which an anti-heparan sulfate antibody is immobilized, the following are described: “1) Heparan sulfate labeled with a specimen on a microplate to which an anti-heparan sulfate antibody is immobilized. A competitive antigen-antibody reaction that detects heparan sulfate in a sample using binding of heparan sulfate in a sample and labeled heparan sulfate to a competitive anti-heparan sulfate antibody, or 2 ) Contact the sample with the microplate to which the anti-heparan sulfate antibody is fixed, bind the heparan sulfate in this sample to the anti-heparan sulfate antibody on the microplate, and then contact the labeled heparan sulfate with the microplate. On the microplate against heparan sulfate derived from the specimen bound to the anti-heparan sulfate antibody on the microplate As a principle of the detection method, an inhibitory antigen-antibody reaction in which labeled heparan sulfate is bound to the anti-heparan sulfate antibody in an inhibitory manner to detect heparan sulfate in a specimen can be used.
[0035]
The detection method of the embodiment using the microplate to which the anti-heparan sulfate antibody mentioned here is fixed can be mentioned as a very preferable detection embodiment in order to facilitate simultaneous detection of a large number of specimens.
[0036]
As a method for fixing an anti-heparan sulfate antibody to a solid phase carrier such as a microplate, the anti-heparan sulfate antibody is fixed to a solid phase carrier according to a commonly used method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, or a comprehensive method. be able to. In general, it is preferable to fix the anti-heparan sulfate antibody to the solid phase carrier by a physical adsorption method due to the simplicity of the operation, but the fixing method that can be adopted in this physical adsorption method is not limited.
[0037]
Furthermore, a method using a solid phase carrier such as a microplate to which heparan sulfate is fixed can be mentioned as one of typical detection modes.
For example, after adding a specimen to a microplate to which heparan sulfate is fixed, the heparan sulfate fixed to the microplate and the heparan sulfate in the specimen are reacted competitively with the anti-heparan sulfate antibody. The anti-heparan sulfate antibody that reacts with the heparan sulfate adhering to the heparan sulfate and detects the anti-heparan sulfate antibody bound to the heparan sulfate using a labeled secondary antibody (having specificity for the anti-heparan sulfate antibody). Examples include a method using a competitive or inhibitory antigen-antibody reaction, such as a method for detecting heparan sulfate.
[0038]
Labeled heparan sulfate that can be used in a series of these detection methods is obtained by binding a labeling substance to heparan sulfate. As this labeling substance, for example, one substance of a specific binding pair (for example, avidin such as biotin and streptavidin, or lectin and sugar chain); FITC, phycoerythrin, europium, phycocyanin, rhodamine, Texas red, umbelliferone, Fluorescent substances such as tricolor, cyanine, 7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (AMCA); enzymes such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, peroxidase, glucose oxidase; dinitrofluorobenzene, AMP (adenosine monophosphate) Acid), haptens such as 2,4-dinitroaniline;¹²⁵I,¹³¹I,^ThreeH etc.
It is possible to use an isotope and the like, and although not particularly limited, it is preferable to select one substance of the above specific binding pair as a labeling substance, and in particular, specific binding consisting of biotin and avidins. It is preferred to select one material of the pair.
[0039]
In addition, the method for binding these labeling substances to heparan sulfate can follow conventional methods.
For example, as a method of labeling heparan sulfate with biotin, for example, EDC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) dissolved in heparan sulfate solution with MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer or the like And a method of reacting by adding a biotin-hydrazide solution. In this binding method, unreacted biotin can be removed by a conventional method such as dialysis, ethanol fractionation or ultrafiltration, and biotin-hydrazide-labeled heparan sulfate can be easily obtained. This is preferable.
[0040]
Further, the method for quantifying the labeling substance of heparan sulfate to which the labeling substance is bound can be performed using a method already established as a method for detecting each labeling substance.
For example, as a method for detecting heparan sulfate labeled with biotin, avidin having a high affinity for biotin (labeled: preferably labeled with a specific enzyme that is easy to detect typified by peroxidase, for example) A method of indirectly detecting heparan sulfate by reacting biotin bound to heparan sulfate is mentioned.
[0041]
When the above peroxidase is used as a labeling substance for avidins such as streptavidin, the substrate to be colored by this peroxidase is usually a coloring substance such as tetramethylbenzidine (TMB) used for this purpose, and a peroxidase. It is preferable to use hydrogen peroxide water or the like as the substrate.
[0042]
In addition, the secondary antibody having specificity for the anti-heparan sulfate antibody used for detecting the above-described anti-heparan sulfate antibody is not particularly limited, but if the anti-heparan sulfate antibody is derived from a rabbit, it is an antibody against rabbit immunoglobulin. In the case of mouse origin, an antibody against mouse immunoglobulin and the like can be mentioned, and it is appropriately selected depending on the origin and type of anti-heparan sulfate antibody which is a primary antibody. Examples of the substance for labeling the secondary antibody include the substance group exemplified as the substance for labeling the above-described heparan sulfate, and among them, enzymes are generally used. A substance for labeling these secondary antibodies and a method for detecting the labeling substance can be appropriately selected as necessary.
As a particularly preferred combination of anti-heparan sulfate antibody-labeled secondary antibody, a combination of mouse IgM antibody 10E4 and peroxidase-labeled anti-mouse IgM antibody can be exemplified.
[0043]
In the detection method according to the present invention, a form other than an embodiment using a container-like solid phase carrier such as these microplates or a solid phase carrier of a size that can be visually observed by each individual can be used. A typical example of such an embodiment is a method using as an index an agglutination reaction based on the antigen-antibody reaction of the particulate solid phase carrier described above.
[0044]
For example, a fine solid phase carrier such as latex particles which are synthetic polymer particles is used, a specimen is brought into contact with the fine solid phase carrier to which heparan sulfate is fixed, and an anti-heparan sulfate antibody is further applied to the fine solid phase carrier. Regarding the agglutination reaction between latex particles via anti-heparan sulfate antibody caused by contact, by detecting the degree to which this agglutination reaction is inhibited by heparan sulfate in the sample by contact with the sample, It is possible to detect heparan sulfate.
[0045]
The antibody used in the detection method utilizing the series of antigen-antibody reactions described above may be any monoclonal antibody or polyclonal antibody as long as it is an anti-heparan sulfate antibody capable of recognizing heparan sulfate. Although it is possible to quantify heparan sulfate in a specimen, it is preferable to use an antibody that has specificity for heparan sulfate and does not exhibit cross-linking properties for hyaluronic acid. In addition, in order to obtain a more accurate result, it has specificity for a specific antigenic determinant in heparan sulfate (the antibody can recognize a specific antigenic determinant and trigger an antigen-antibody reaction). It is preferable to use a monoclonal antibody.
[0046]
A monoclonal antibody can be produced by employing a generally known method for selecting a desired antibody-producing clone from a hybridoma of an immune cell using heparan sulfate as an immunogen.
Thus, the quantitative method according to the present invention is provided.
[0047]
C.About the kit according to the present invention
The kit for carrying out the above-described quantification method of the present invention is a kit capable of quantifying heparan sulfate in a specimen.
[0048]
The kit for carrying out the quantification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit for simply carrying out the quantification method of the present invention described above. Specifically, this kit includes at least an anti-heparan sulfate antibody and a labeled heparan sulfate or heparan sulfate fixed to a solid phase (hereinafter, these heparan sulfates are referred to as “competitive heparan sulfate”). However, the embodiment of the kit including the solid phase carrier to which the anti-heparan sulfate antibody is fixed is the most preferable embodiment.
[0049]
Furthermore, the kit for carrying out the quantification method of the present invention most preferably includes, in addition to the above-mentioned elements, (1) a reagent containing labeled heparan sulfate labeled with heparan sulfate as a competitive heparan sulfate, and (2) This kit includes a reagent for detecting a labeled substance bound to the labeled heparan sulfate.
[0050]
Of course, it is preferable that the heparan sulfate in the reagent, including the labeled heparan sulfate in this kit, is a constant amount and is present uniformly in the reagent system.
In addition, the type of the labeled substance in the labeled heparan sulfate in the kit of this embodiment and the type of the detection substance corresponding thereto can be selected according to the explanation in the above-described quantification method of the present invention.
[0051]
In addition, the kit for carrying out such a quantification method of the present invention includes a buffer solution, distilled water or ultrapure water contained in a normal quantification kit, as long as the desired effect of the present invention is not impaired as required. In this case, the component can be used.
The kit for carrying out the quantification method of the present invention in such a form can also take the form of a kit for carrying out the specific method of the present invention.
[0052]
That is, the kit for carrying out the above-described quantification method of the present invention is a diagnostic kit for detecting the transition stage of diabetic nephropathy and specifying the state of a diabetic patient (hereinafter also referred to as the present diagnostic kit). The form of can also be taken.
The diagnostic kit of the present invention is shifting to normal values obtained by quantifying heparan sulfate in urine specimens of healthy individuals (including diabetic patients not suffering from diabetic nephropathy) and diabetic nephropathy in advance. Quantifying and comparing heparan sulfate in urine specimens of potential diabetic patients to identify changes in heparan sulfate in urine specimens of the diabetic patients and transitioning the diabetic patients to diabetic nephropathy A kit that can detect the stage and identify the condition of a diabetic patient.
[0053]
Therefore, the elements that can be included in the diagnostic kit of the present invention for detecting the transitional stage of diabetic nephropathy and specifying the state of the diabetic patient are basically the same as those of the above-described quantification kit of the present invention. As a matter of course, it is preferable to include an element such as a urine pretreatment reagent which is particularly necessary for using urine.
[0054]
This diagnostic kit of the present invention makes it possible to easily and accurately carry out the method for identifying the present invention, easily detect the transition stage to diabetic nephropathy, and based on the information obtained thereby, The condition can be identified and appropriate treatment can be performed.
[0055]
【Example】
Hereinafter, although the present invention is explained more concretely using an example etc., the technical scope of the present invention should not be limited by this example etc.
[0056]
Analysis of antigenic determinants of anti-heparan sulfate antibody 10E4
The antigenic determinant of the 10E4 was analyzed by examining the change in the reactivity of the anti-heparan sulfate monoclonal antibody 10E4 accompanying the change in the sulfate group in the heparan sulfate molecule.
That is, on a plate on which anti-heparan sulfate antibody 10E4 is fixed, (1); heparan sulfate derived from bovine kidney at various concentrations [Seikagaku Corporation, Lot. No. S94Z02: HS (BK)], (2) ; (1) heparan sulfate modified from bovine kidney (CDSNAc-HS) obtained by completely desulfating the heparan sulfate of (1); (3); heparan sulfate having a sulfate group introduced again at the N-position of CDSNAc-HS (2); The modified product (CDSNS-HS) and the heparan sulfate (NDSNAc-HS) derived from the above bovine kidney in which only the sulfate group at the N-position of (4); (1) was completely desulfated were added. Simultaneously, biotin-labeled heparan sulfate was added and reacted with the anti-heparan sulfate antibody 10E4 immobilized on the plate by a competitive antigen-antibody reaction.
[0057]
Heparan sulfate that did not react with the anti-heparan sulfate antibody 10E4, each heparan sulfate modified product, and biotin-labeled heparan sulfate were removed by washing. Subsequently, biotin was detected using peroxidase-labeled streptavidin as described later. As described later, the enzyme activity of peroxidase was quantified using a TMB solution containing hydrogen peroxide as a chromogenic substrate and finally using the absorbance at 450 nm as an index (FIG. 1). In FIG. 1, the vertical axis represents the absorbance (O.D.), and the horizontal axis represents the amount of heparan sulfate and the amount of each modified heparan sulfate.
[0058]
From this result, it was found that the reactivity of the anti-heparan sulfate antibody 10E4 depends on the presence or absence of an N-sulfate group in the glucosamine residue of heparan sulfate.
That is, it was revealed that the antigenic determinant of the anti-heparan sulfate antibody 10E4 has a structure containing at least the N-sulfate group in the glucosamine residue of heparan sulfate.
Further, as a result of examining the reactivity of the anti-heparan sulfate antibody 10E4 to biotin-labeled hyaluronic acid produced by the same method as that of heparan sulfate, it was also found that the anti-heparan sulfate antibody 10E4 does not show cross-reactivity to hyaluronic acid. It was.
[0059]
Creating a calibration curve
(1) Preparation of biotin-labeled heparan sulfate
Heparan sulfate (Seikagaku Corporation) was dissolved in 0.1M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 5.5) to prepare 1.0 mL of 10 mg / mL heparan sulfate solution.
To this heparan sulfate solution, 25 μL of biotin-LC-hydrazide (made by PIERCE) prepared to 20 mM with dimethyl sulfoxide (DMSO) was added. Subsequently, 12.5 μL of EDC (manufactured by PIERCE) prepared to 100 mg / mL with 0.1 M MES buffer (pH 5.5) was added thereto and stirred well, followed by stirring at room temperature for 16-24 hours. . After completion of the reaction, this reaction product was sufficiently removed from the biotin with a microdialysis apparatus (manufactured by BIO-TECK) using PBS (-) as a dialysate in a dialysis membrane having a molecular weight of 3,500 cutoff. After completion of dialysis, biotin-labeled heparan sulfate was prepared at a concentration of 5 mg / mL and stored frozen.
[0060]
(2) Preparation of anti-heparan sulfate antibody-coated plate
Anti-heparan sulfate antibody 10E4 (Seikagaku Corporation) was diluted with phosphate buffered saline (pH 7.2 to 7.5, free of divalent ions such as calcium ions; hereinafter also referred to as PBS (−)) at 20 μg / The solution was diluted to mL, and 50 μL each of this solution was added to each well of a NUNQUI immunoplate (trade name: Maxisorp, NUNK) and stored at 4 ° C. for 14 to 18 hours to uniformly coat. This plate was washed twice with PBS (−), and 3% bovine serum albumin (BSA) (available from Seikagaku Corporation) was used as a blocking substance for blocking wells that were not coated with anti-heparan sulfate antibody 10E4. ) -Containing PBS (−) solution was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After standing, this plate was washed 3 times with a washing solution (PBS (-) containing 0.05% Tween 20) to obtain a desired anti-heparan sulfate antibody-coated plate.
[0061]
(3) Creating a calibration curve
After the washing, 100 μL of PBS (−) containing 0.05% Tween 20 and 1% BSA (hereinafter referred to as reaction solution) was added to each well of the anti-heparan sulfate antibody-coated plate prepared in (2). Subsequently, 10 μL of heparan sulfate standard solution (derived from bovine kidney, manufactured by Seikagaku Corporation) (each concentration of 25 to 800 μg / mL) was added to each well of this plate. Furthermore, 100 μL of the biotin-labeled heparan sulfate prepared in (1) above, diluted to the optimal concentration in the reaction solution, was added to each well and left at 37 ° C. for 60 minutes for antigen-antibody reaction (the heparan sulfate standard solution). The reaction solution was used as a solvent).
[0062]
After completion of this reaction, each well was washed three times with the washing solution, and then 100 μL of peroxidase-labeled streptavidin (HRP-labeled streptavidin: manufactured by VECTOR) diluted 1000 times with the reaction solution was added to each well, and this was added at 37 ° C. And left to react for 30 minutes.
[0063]
After completion of the reaction, the plate was washed 3 times with the washing solution, 100 μL of TMB solution (manufactured by Moss) was added as a substrate for peroxidase, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes to develop color. The reaction was stopped by adding 100 μL of 1N-HCl to the plate, and the absorbance at a wavelength of 450 nm (control wavelength: 630 nm) of the colored liquid resulting from the decomposition of TMB was measured with a well reader (SK-601, sold by Seikagaku Corporation). A calibration curve was created (FIG. 2).
[0064]
Since heparan sulfate is rich in variety, 1 μg of heparan sulfate derived from bovine kidney (Seikagaku Corporation, Lot. No. S94Z02) is defined as 1 EU as a unique definition. Expressed in equivalent heparan sulfate equivalents.
[0065]
In addition, when mouse IgM was fixed to the plate instead of anti-heparan sulfate antibody, no reaction was observed, and this reaction was not a non-specific reaction but a reaction specific to anti-heparan sulfate antibody (10E4). It was shown (FIG. 2: control).
[0066]
Detection of transition stage of diabetic nephropathy in diabetic patients by determination of heparan sulfate in samples
Using the urine collected from healthy individuals (27 cases) and diabetic patients (68 cases) as a specimen, the heparan sulfate present in the urine specimen was quantified by the above method.
[0067]
That is, diabetic patients were classified into three groups DM1, DM2, and DM3 according to urinary albumin concentration (creatinine correction value: ACR; mg / g · CR). DM1 has ACR <12, and the ACR is a group of diabetic patients at the same level as healthy people. DM2 is 12 ≦ ACR <200, which is a diabetic early nephropathy patient group. DM3 is 200 ≦ ACR and is a diabetic nephropathy patient group.
[0068]
FIG. 3 is a comparison of heparan sulfate levels in urine samples between groups. In urine samples, there is a clear difference in heparan sulfate levels between diabetic patients (DM1) and healthy individuals. (Heparan sulfate level in urine specimens of diabetic patients is clearly lower than that of healthy individuals).
[0069]
Furthermore, urine samples of healthy subjects (83 cases), DM1 (40 cases), DM2 (41 cases) and DM3 (43 cases) were collected as specimens, and the albumin concentration in these specimens (creatinine correction value: ACR; mg / (gCR) and heparan sulfate concentration (creatinine correction value: mg / gCR) were plotted, and the distribution region was analyzed (FIG. 4). The concentration of albumin in urine specimens of healthy people and DM1 patients is at the same level. Further, the distribution of heparan sulfate in the urine sample of DM1 patients has a wide distribution from the same level as that of a healthy person to a low level of about 1/10. It is considered that the tendency of the heparan sulfate concentration in the urine sample to decrease with the progress of the pathological condition of diabetic nephropathy is already observed at the DM1 stage. And it is thought that the DM1 patient with a low heparan sulfate concentration in the urine sample has a high risk of progression to diabetic early nephropathy (DM2).
[0070]
Therefore, if 5EU / mg CR is defined as a boundary value, and if it is classified as less than or equal to the boundary value, and the boundary value is negative and the boundary value is positive, the rate of positive with the progression of diabetic nephropathy Increased (FIG. 5). Therefore, it was suggested that 5EU / mg CR as a boundary value in this way is preferable in carrying out the detection method of the present invention based on heparan sulfate in the urine specimen quantified using the quantification method of the present invention. .
[0071]
Furthermore, when categorizing the duration of diabetes associated with the onset of diabetic nephropathy, the percentage of positives increased with the duration of disease (FIG. 6).
In light of the results shown in Fig. 6, there is a general trend toward an increase in the number of patients diagnosed with diabetic nephropathy in about 5 to 10 years, and about 15 years for diabetic nephropathy. Considered together, this result shows that it is possible to grasp the progression stage of the pathological condition of diabetic nephropathy and identify the state of diabetic patients by the present invention specifying method based on the quantification method of the present invention. This shows the usefulness of the quantification method of the present invention and the specific method of the present invention.
[0072]
Kit according to the present invention
An example of the composition and usage of the kit of the present invention is described below.
The kit in a present Example consists of the following 1-8 elements.
1. Immunoplate with anti-heparan sulfate antibody 10E4 fixed (blocked with blocking agent): 1 sheet
2. Standard heparan sulfate solution (25, 50, 100, 200, 400, 800 EU / mL, 0.1 mL each): 1 vial
3. Biotin-labeled heparan sulfate solution (optimum concentration, 15 mL): 1 vial
4). Peroxidase-labeled streptavidin solution (1 μg / mL, 15 mL): 1 vial
5). Tetramethylbenzidine solution (1.25 mM TMB, 2.21 mM hydrogen peroxide, 1% DMSO, 0.08 M acetate buffer, pH 4.9, 15 mL): 1 vial
6). Reaction solution (1% BSA, PBS containing 0.05% Tween 20 (−), 40 mL): 1 vial
7). Wash solution (PBS (-) (500 mL) containing 0.05% Tween 20): 1 vial
8). Stop solution (1N HCl (15 mL)): 1 vial
[0073]
When using the kit of the present invention, each well of the immunoplate with anti-heparan sulfate antibody 10E4 immobilized was washed in advance with a washing solution, and 100 μL of the reaction solution was dispensed into each well.
In this kit for detecting the transitional stage of diabetic nephropathy, 10 μL each of heparan sulfate standard solution of each concentration or sample urine of diabetic patients is added, and 100 μL of biotin-labeled heparan sulfate solution is added to each well. It was allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes.
[0074]
Thereafter, in this detection kit, each well was washed three times with a washing solution, and then 100 μL of a peroxidase-labeled streptavidin solution was added to each well, which was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes for reaction.
After standing, each well was washed three times with a washing solution, and then 100 μL of tetramethylbenzidine solution was added to each well and reacted at 37 ° C. for 15 minutes for color development.
[0075]
After color development, 100 μL of reaction stop solution was added to each well to stop the reaction.₂O₂The absorbance at 450 nm (control wavelength: 630 nm), which is the coloring wavelength of the reaction product kimono, was quantified with a well reader (SK601, sold by Seikagaku Corporation).
[0076]
【The invention's effect】
According to the present invention, a means for identifying as early as possible a diabetic patient who is transitioning to diabetic nephropathy, that is, a quantitative method for accurately quantifying heparan sulfate in a specimen, with this quantitative method as a technical basis, Provided are methods for identifying the status of diabetic patients that can detect the transition stage of diabetic patients to diabetic nephropathy, and kits for performing these methods.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the recognition rate of anti-heparan sulfate antibody 10E4 in heparan sulfate and various modifications.
FIG. 2 is a calibration curve prepared using a heparan sulfate standard solution.
FIG. 3 is a drawing showing a comparison of heparan sulfate levels in a urine sample between groups using an albumin concentration in the urine sample as an index.
FIG. 4 is a drawing showing the distribution region of albumin concentration and heparan sulfate concentration in a urine sample in comparison.
FIG. 5 is a drawing in which 5EU / mg CR is assumed to be a boundary value, and the correlation with the symptoms of diabetic nephropathy is examined by classifying it below this boundary value or above the boundary value.
FIG. 6 is a drawing in which 5EU / mg CR is assumed to be a boundary value, and the correlation between the onset of diabetic nephropathy and the duration of morbidity is examined by classifying it below this boundary value or above the boundary value.

Claims

A method for identifying a condition of a diabetic patient, wherein a quantitative change and / or a qualitative change of heparan sulfate in a urine sample is identified to detect a transition stage of the diabetic patient to diabetic nephropathy.

The method for identifying the state of a diabetic patient according to claim 1, comprising quantifying heparan sulfate having an N-sulfate group in a glucosamine residue as a means for identifying quantitative and / or qualitative changes in heparan sulfate.

3. Identification of the state of a diabetic patient according to claim 1 or 2, wherein the specific principle of quantitative and / or qualitative change of heparan sulfate is an antigen-antibody reaction of anti-heparan sulfate antibody and heparan sulfate in a urine sample. Method.

The method for identifying the state of a diabetic patient according to claim 3, wherein the anti-heparan sulfate antibody is an anti-heparan sulfate antibody that does not show cross-reactivity with hyaluronic acid.

The method for identifying the state of a diabetic patient according to claim 3 or 4, wherein the anti-heparan sulfate antibody is an anti-heparan sulfate antibody having at least a glucosamine residue having an N-sulfate group in heparan sulfate as an antigenic determinant.

6. The specific method according to claim 3, wherein the antigen-antibody reaction is a competitive antigen of labeled heparan sulfate and heparan sulfate in a urine sample against an anti-heparan sulfate antibody immobilized on a solid phase carrier. A method for identifying the state of a diabetic patient, which is an antibody response.

7. The identification method according to claim 6, wherein the detection means by competitive antigen-antibody reaction comprises detecting labeled heparan sulfate bound to the anti-heparan sulfate antibody on the solid phase carrier.

8. The identification method according to claim 6, wherein the labeling substance in the labeled heparan sulfate is one substance of a specific binding pair.

The identification method according to claim 8, wherein one substance of the specific binding pair is biotin.

6. The specific method according to any one of claims 3 to 5, wherein the antigen-antibody reaction is a competitive antigen antibody of heparan sulfate immobilized on a solid phase carrier and heparan sulfate in a urine sample against an anti-heparan sulfate antibody. A method of identifying the condition of a diabetic patient, which is a response.

The method according to claim 10, wherein the detection means by competitive antigen-antibody reaction includes quantification of heparan sulfate in a urine sample by detecting an anti-heparan sulfate antibody bound to heparan sulfate on a solid phase carrier. How to identify the patient's condition.

The specific method according to claim 10, wherein the solid phase carrier is used as a solid phase carrier, and the degree of aggregation of the particulate solid phase carrier during the antigen-antibody reaction is determined as a detection means by competitive antigen-antibody reaction. A method for identifying a condition of a diabetic patient, comprising detecting.

The method for identifying the state of a diabetic patient according to any one of claims 3 to 12, wherein the anti-heparan sulfate antibody is a monoclonal antibody.

The diagnostic kit for performing the method for identifying the state of a diabetic patient according to any one of claims 3 to 9, comprising a solid phase carrier having at least an anti-heparan sulfate antibody fixed thereto.

The diagnostic kit according to claim 14 , wherein the anti-heparan sulfate antibody is an anti-heparan sulfate antibody that does not show cross-reactivity with hyaluronic acid .

The diagnostic kit according to claim 14 or 15, wherein the anti-heparan sulfate antibody is an anti-heparan sulfate antibody having at least a glucosamine residue containing an N-sulfate group in heparan sulfate as an antigenic determinant.

The diagnostic kit according to any one of claims 14 to 16, wherein the anti-heparan sulfate antibody is a monoclonal antibody.

The diagnostic kit for performing the method for identifying the state of a diabetic patient according to any one of claims 3 to 9, comprising labeled heparan sulfate labeled with a labeling substance.

The diagnostic kit according to claim 18, wherein the labeled heparan sulfate is labeled heparan sulfate labeled with one substance of a specific binding pair.

The diagnostic kit according to claim 19, wherein one substance of the specific binding pair is biotin.