JP3935279B2

JP3935279B2 - Bacteriophage-derived lysing protein parasitic on tobacco blight fungus, DNA encoding the protein, and transformant having the DNA

Info

Publication number: JP3935279B2
Application number: JP32586698A
Authority: JP
Inventors: 英徳小澤; 博田中; 哲治山田
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2007-06-20
Anticipated expiration: 2018-10-30
Also published as: JP2000135091A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナス科青枯病（タバコ立枯病）の病原菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）を溶菌するバクテリオファージ由来のタンパク質（酵素）、これをコードする遺伝子、ベクターおよび形質転換体に関する。特に、本発明は、ナス科青枯病（タバコ立枯病）に対して抵抗性を付与することができるタンパク質（酵素）並びにこれをコードする遺伝子に関し、このような溶菌遺伝子を使用して農業上有用な形質転換植物を作成することができる。
【０００２】
【従来の技術】
細菌溶菌酵素として知られているリゾチームは、細菌細胞壁のムコペプチドに存在するＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの間のβ１→４結合を加水分解する酵素である。リゾチームとしては、卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム、バクテリオファージ由来の各種リゾチーム等が知られており、幾つかでは塩基配列が解析されている。
【０００３】
例えば、卵白リゾチームは生化学的にも（Comp.Biochem.Physiol.92:523-527 (1989)、J.Phytopathology 141:159-164 (1994)）、分子生物学的にも（Appl.Microbiol.Biotechnol.39:537-540 (1993)）詳細な研究がなされている。また、バクテリオファージ由来のリゾチームとしては、大腸菌E.coliのＴ４ファージについて詳細な研究がなされている（J.Biol.Biochem. 243:391-397 (1968)、Biochimica et Biophysica, 662: 131-167 (1981)、 FEBS Letters 139:97-100 (1982)、Eur.J.Biochem. 133:717-722 (1983)、J.Virol. 54:460-466 (1985)、Mol.Gen.Genet. 202:363-367 (1986)、Biochem.Biophys.Research Communi.145:190-195 (1987)、The New Biologist 1:171-179 (1989)、J.Mol.Biol.222:67-87 (1991)）。
【０００４】
卵白リゾチーム（Plant Science 87:55-67 (1992)、Plant Science 106:55-62 (1995)）、ヒトリゾチーム（Agric.Biol.Chem. 50:713-723 (1986)、Plant Cell Report 16:674-679 (1997)）、Ｔ４リゾチーム（Plant J.3: 587-598 (1993)）の遺伝子で形質転換した植物も多数報告されている。また、ヒトラクトフェリンｃＤＮＡで形質転換した組み換えタバコはナス科青枯病（タバコ立枯病）に対して抵抗性を増強したという報告がある（Phytopathology 88:730-734 (1988)）。
【０００５】
現在までに多数のバクテリオファージ由来の細菌溶菌酵素が報告されている（J.Biol.Chem. 244:1968-1975 (1969)、J.Biochem. 89:275-284 (1981)、Current Microbiology 13:299-301 (1986)、Nucleic Acids Research 14: 10001-10008 (1986)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 955-958 (1987)、J.Bacteriology 178:1099-1104 (1996)）。しかしながら、タバコ立枯病菌に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌酵素については本発明者が知る限りこれまでには報告されていない。
【０００６】
また、ハエ由来の抗菌物質ザルコトキシンＩＡはレタス軟腐病菌、斑点細菌病、タバコ野火病菌、モモせん孔細菌病、ハクサイ軟腐病菌等に対して有効ではあるが、青枯病菌（タバコ立枯病菌）には無効である（植物防疫 50:19-22 (1996)、Plant Cell Physiol.39:57-63 (1998)）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質を精製することである。
本発明の別の目的は、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質の遺伝子をバクテリオファージのゲノムＤＮＡから単離することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、本発明による上記遺伝子を利用してナス科青枯病菌（タバコ立枯病菌）に対する抵抗性を向上させた形質転換体（特には、タバコ植物）を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、タバコ立枯病菌に寄生して溶菌しながら増殖するバクテリオファージに着眼し、そのバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質を精製し、そのゲノムＤＮＡから当該溶菌タンパク質をコードする遺伝子をクローニングして塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明の第１の側面によれば、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約７１ｋＤａで、Ｎ末端アミノ酸配列：Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp を有する溶菌タンパク質が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によれば、上記溶菌タンパク質は、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収し；
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収することにより得ることができる。
【００１２】
本発明の一態様によれば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列：この配列中に１から複数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列；またはこの配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、溶菌タンパク質が提供される。
【００１３】
本発明の第２の側面によれば、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収する工程；および
上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収する工程；
を含む、本発明の溶菌タンパク質の製造方法が提供される。
【００１４】
本発明の第３の側面によれば、上記した本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
【００１５】
本発明の一態様によれば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、上記塩基配列中に１〜複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列、または上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
【００１６】
本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を有している。
【００１７】
本発明の第４の側面によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターにおいて、好ましくはベクターは発現ベクターである。
【００１８】
本発明の第５の側面によれば、宿主生物に本発明の組み換えベクターを導入して得られる形質転換体が提供される。
本発明の形質転換体において、宿主生物は好ましくはナス科植物であり、特に好ましくはタバコ植物である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の形態または実施方法に関してさらに詳細に説明する。
本発明の第一の側面によれば、タバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）に寄生するバクテリオファージが産生する溶菌タンパク質が提供される。
本発明のタンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の溶菌タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組み換えＤＮＡから発現させた組み換えタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２０】
本発明のタンパク質は典型的には、配列表の配列番号２に記載の６８７個のアミノ酸配列を有する。しかし、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。即ち、本発明のタンパク質は典型的には、クローニングされた遺伝子の塩基配列からの推測に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２１】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組み換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組み換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質は全て本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明のタンパク質は、例えば後述の実施例に従って、バクテリオファージが寄生したタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の懸濁液を硫酸アンモニウム沈殿に付して０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分を回収し；上記で得られた画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに付し、タンパク質の溶出に対応するピークを示すフラクションを回収することにより得ることができる。次いで、回収された各々のフラクションについて、溶菌活性の有無を測定することによって所望の溶菌タンパク質を含むフラクションを同定することができる。
【００２３】
本発明で使用するバクテリオファージはタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラムに寄生して溶菌酵素を産生するものであればその種類は限定されない。そのようなバクテリオファージの具体例としては、特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載されたもの（Ｐ４２８２と命名され、本明細書の以下の実施例においても使用した）が挙げられる。土壌からのバクテリオファージＰ４２８２の分離方法については、特公平４−４８７６２号公報に記載されている通りである（微生物学実験法：微生物研究法懇談会編、昭和５０年１２月講談社サイエンティフィック刊）。なお、これらの公報に記載の内容は全て本明細書中に引用される。
【００２４】
本発明で使用するタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）の種類も特に限定されるものではないが、一例としては、特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載された受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７００（１９８３年１２月１４日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託）を有する菌株が挙げられ、本明細書の以下の実施例でもこの菌株を使用した。なお、本菌株はその受託証においてはシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）と表示されているが、本明細書中ではタバコ立枯病菌ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）と表示されている。
【００２５】
あるいはまた、本発明による遺伝子を大腸菌や酵母あるいは昆虫やある種の動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入、発現させることにより、本発明の溶菌タンパク質を大量に得ることもできる。
【００２６】
本明細書中に開示された本発明によるタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどの遺伝子工学的手法を用いて、他の起源などから同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することは当業者の通常の知識の範囲内のことであり、そのようにして単離された遺伝子によりコードされるタンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本発明はまた、本発明の溶菌タンパク質をコードする遺伝子をも提供する。遺伝子の種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノミックＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
【００２８】
本発明の遺伝子は典型的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のみに限定されるわけではなく、本発明の溶菌タンパク質をコードする全ての遺伝子を包含する。
【００２９】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや、ＰＣＲという遺伝子工学の基本的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、そのような遺伝子も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーションの条件は特に限定されず、目的の相同遺伝子とプローブとの相同性の度合いなどにより当業者ならば適宜選択することができるが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、６×ＳＳＣ［０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］、５×デンハルト（Denhardt's）溶液［１０００ｍＬ中に１ｇフィコール、１ｇポリビニルピロリドン、１ｇＢＳＡ］、０．５％ＳＤＳ、２５℃〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）；あるいは０〜５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、２５〜６８℃（例えば３７℃、４２℃または６８℃）などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。ホルムアミド濃度、デンハルト溶液濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子は全て本発明の範囲の中に含まれる。
【００３１】
上記のようなハイブリダイゼーションを使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも７０％以上、さ好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００３２】
本発明によれば、本発明の遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。
組み換えべクターは、簡便には当業界において入手可能な組み換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。
用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322などが例示されるがこれらに限定されない。
【００３３】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、pQE-30、pQE-60、pMAL-C2、pMAL-p2、pSE420などが好ましく、酵母用発現べクターとしてpYES2（サッカロマイセス属）、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてpBacPAK8/9、pBK283、pVL1392、pBlueBac4.5などが好ましい。
【００３４】
プラスミドなどのベクターに本発明の遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、「Sambrook,J.ら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition)、Cold Spring Harbor Laboratory,1.53(1989)」に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組み換えベクター（例えば、組み換えプラスミド）は、以下に記載するような方法で宿主細胞に導入することができる。
【００３５】
本発明の組み換えベクターを宿主細胞に導入（形質転換または形質移入）する方法としては、従来公知の方法を用いて行うことができ、例えば、「Sambrook,J.ら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition),Cold Spring Harbor Laboratory,1.74(1989)」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３６】
あるいはまた、例えば、宿主細胞が細菌（E.coil, Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168,111(1979)]やコンピテント法[J.Mol.Biol.,56,209(1971)]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1927(1978)]やリチウム法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法[Science,227,129(1985)]、エレクトロポレーション法[Nature,319,791(1986)]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology,52,456(1973)]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol.Cell.Biol.,3,2156-2165(1983)]によってそれぞれ形質転換することができる。
【００３７】
形質転換体を作成する際に使用する宿主細胞としては、本発明の組み換えべクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組み換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）などの原核細胞、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）などの単細胞性宿主を含む下等真核性細胞、カイコなどの高等真核性細胞などが挙げられる。
【００３８】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌(M15、JM109、BL21等）、酵母（INVSc1（サッカロマイセス属）、GS115、KM71（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（BmN4、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。さらに、植物細胞に関しては、細胞培養が可能であれば特に限定されないが、例えば、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ由来の細胞などが例示される。
【００３９】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００４０】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００４１】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAAなど）が例示される。
【００４２】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coilではブラスミドpQE30、pETまたはpCALもしくはそれらの人工的修飾物（pQE30、pETまたはpCALを適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント）が、酵母ではプラスミドpYES2もしくはpPIC9Kが、また昆虫細胞ではプラスミドpBacPAK8/9等があげられる。
【００４３】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４４】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質の耐性遺伝子などが例示される。例えば、タバコを形質転換するために使用するのに好適な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等をコードする抗生物質耐性遺伝子が挙げられ、これらの選択マーカーを利用することによって形質転換されたタバコ個体を容易に選抜することができる。
【００４５】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望の溶菌タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００４６】
本発明の遺伝子の最も重要な用途は、これを植物に導入することにより、その植物に溶菌活性を付与することである。例えば、タバコやトマト等のナス科植物に本発明の遺伝子を導入することにより、青枯病（タバコ立枯病）等に対する病害抵抗性能を付与することができる。即ち、本発明の好ましい態様によれば、バクテリオファージ由来の溶菌酵素をコードする遺伝子を植物内で転写および翻訳することができる組み換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換された形質転換植物、特に好ましくは形質転換タバコ植物が提供される。
【００４７】
本発明の形質転換された植物内で溶菌タンパク質を発現させるためのプロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが考えられるが、他のプロモーターを使用して本発明の遺伝子を発現させることもできることも明らかであり、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター以外の、構成発現または誘導発現可能な全てのプロモーターを使用することも本発明の範囲内に含まれる。特に、傷害応答性プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼプロモーターなど）は本発明の溶菌遺伝子の発現に有用である。
【００４８】
また、植物の形質転換用ベクターで使用するための各種の転写終結配列（ターミネーター）が知られている。例えば、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びＣａＭＶポリアデニル化ターミネーターは組み換えタバコ植物内での異種遺伝子の発現のために用いることができ、本発明の溶菌遺伝子の発現のために有用である。
【００４９】
外来ＤＮＡで安定的に植物を形質転換する方法としては多数の方法が報告されていて、既に公知である。その中の一つとして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いる系がある。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、Ｔ−ＤＮＡという配列を有するプラスミドを有し、かつ天然の双子葉植物（タバコを含む）の染色体に効率的な転移、組み込まれ、感染した植物に腫瘍を形成させるグラム陰性菌である。異種ＤＮＡを植物の染色体に組み込むベクター系は、植物遺伝子工学の分野では詳細に研究されており、有効なベクターが開発されている。このアグロバクテリウム法は当該技術分野では広く用いられており、本発明の実施においても使用することができる。しかしながら、本発明においては、アグロバクテリウム法以外の方法、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等によっても植物を形質転換することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００５０】
【実施例】
実施例１：バクテリオファージ由来の溶菌遺伝子の単離
（ａ）タバコ立枯病菌に寄生するバクテリオファージの溶菌酵素の精製
タバコ立枯病菌Ｍ４Ｓ株に寄生し、これを溶菌しながら増殖するバクテリオファージＰ４２８２（特公平４−４８７６２号公報および特公平６−１７２９１号公報に記載されたもの）を供試して溶菌酵素の単離および精製を行った。ＣＰＧ液体培地（１％グルコース、１％ポリペプトン、０．１％カザミノ酸）にＭ４Ｓ菌（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７００）を接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。遠心集菌後、少量のＣＰＧ液体培地に懸濁して、４０００ｍｌのＣＰＧ液体培地の入ったジャーファメンターに３×１０⁸細胞／ｍｌになるように接種した。さらに接種の１及び８分後に、Ｐ４２８２ファージ液をそれぞれ１５×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌずつ添加し、２８℃、１００ｒｐｍで２．５時間培養した。
【００５１】
次に、Ｐ４２８２が寄生したＭ４Ｓ菌を遠心集菌後、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ硫酸マグネシウム）に懸濁し、終濃度５０μｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ、０．２％クロロホルムを添加して４℃で一晩静置した。遠心後、上清に硫酸アンモニウムを加え４０％飽和度として４℃で１時間以上攪拌した。４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心することにより４０％飽和度の硫酸アンモニウム画分を沈殿物として得た。上清は硫酸アンモニウムの濃度を４０％飽和度から８０％飽和度まで増大させた。同様に遠心して４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分を得、上清は破棄した。各沈殿は少量の緩衝液Ａに溶解し、セファデックスＧ−１００（ファルマシア）カラムに供して脱塩した。０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、および４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分について以下に記載する溶菌活性測定を行った結果、０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分に活性が認められた（図１を参照）。
【００５２】
次いで、この画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（YMC-Pack Diol-300、500×8.0 mm）に供した。溶媒は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭＮａＣｌを用い、流速は０．７ｍｌ／分で行った。タンパク質の溶出に対応するピークを示す全部で６個のフラクションを分取した後（図２を参照）、各々のフラクションについて下記に記載する溶菌活性測定を行った結果、第４フラクションに活性が認められた（図１中の抽出タンパク質の結果を参照）。
【００５３】
溶菌活性はＭ４Ｓ菌体の濁度減少を光学的に測定した。具体的には改変Ｍ９培地（リン酸水素二ナトリウム０．６ｇ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ、塩化ナトリウム０．０５ｇ、塩化アンモニウム０．１ｇ、２５％グルコース１２ｍｌ、１Ｍ硫酸マグネシウム１ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩０．５ｍｌ、１００ｍＭ塩化カルシウム１ｍｌ、蒸留水９８５．５ｍｌ）で培養したＭ４Ｓ菌を集菌後、クロロホルムで飽和した緩衝液Ｂ（６０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に懸濁し、クロロホルムを除去するために緩衝液Ｂで３回遠心洗浄した。菌体を緩衝液Ｂで懸濁して吸光度０．５〜０．６（波長６００ｎｍ）に調整した。菌液１ｍｌと上記酵素液５０μｌを混合して吸光度を測定後、３７℃に１０分間静置して、再度、吸光度を測定して濁度減少を算出した。
【００５４】
活性が認められたゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの第４フラクションを含む精製の各段階の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した（Nature 227: 680-685 (1970)）。泳動後、タンパク質バンドをＰＶＤＦ膜（アトー）上にエレクトロブロットし、次いで０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０、５０％メタノール、１０％酢酸で染色した。得られた結果を図３に示す。第４フラクションは約７１ｋＤａにバンドを示した。このバンドを切り取り、気相プロテインシークエンサーでＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp（配列番号３）の１３残基のアミノ酸が同定された。
【００５５】
（ｂ）サザンハイブリダイゼーションによる溶菌酵素をコードする遺伝子の単離決定した溶菌酵素のＮ末端アミノ酸配列の情報を利用してプローブを作製してファージＰ４２８２ＤＮＡから溶菌遺伝子を単離した。具体的には、溶菌酵素のアミノ酸配列と既知のコドン表とを比較してaaracncart tyathga（配列番号４、配列表フリーテキスト：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを示す）およびgaraaygcna aracnca（配列番号５、配列表フリーテキスト：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを示す）の２種類のプローブを合成した。プローブは５’末端を非放射性のビオチンで標識した。
公知の手法により抽出したファージＰ４２８２ゲノムＤＮＡ（約３９ｋｂｐ）をＳａｌＩ＋ＳｃａＩ、ＳａｌＩ＋ＳｃａＩ＋ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩの各制限酵素でそれぞれ消化して、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、ＤＮＡバンドをナイロン膜（Hybond-N+、アマーシャム）に転写後、上記した配列番号４および５の２種類のプローブを用いてそれぞれ３７℃でサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションには、PolarPlex サザン＆ノーザンキット（日本ミリポアリミテッド）を用い、メーカー指定のプロトコールに従った。即ち、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの組成のハイブリダイゼーション液を使用して３７℃で１時間プレハイブリダイゼーションした後、プローブを２０ｎｇ／ｍｌになるように添加して３７℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ナイロン膜の洗浄は、２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））、０．１％ＳＤＳで室温で１０分間３回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ３７℃で１５分間２回行った。Ｘ線フィルムへは約２０分間露光した。その結果を図４に示す。Ｐ４２８２ＤＮＡ全体の制限酵素地図と比較したところ、２種類のプローブとそれぞれハイブリダイズしたＤＮＡ断片は、ＳｃａＩ−ＢａｍＨＩの３．６ｋｂ断片であることが判明した。
【００５６】
（ｃ）溶菌遺伝子の塩基配列の決定
サザンハイブリダイゼーションで検出されたＳｃａＩ−ＢａｍＨＩの３．６ｋｂのバンドを数種の制限酵素で適当に消化後、得られたＤＮＡ断片を市販の大腸菌用プラスミドベクターpBluescript II SK-（東洋紡）にクローニングして、これをＤＮＡシークエンサーに供して塩基配列を決定した。その結果、配列番号１に示す全塩基配列が決定された。溶菌遺伝子のオープンリーディングフレームは全長２０６１ｂｐで６８７アミノ酸をコードしていることが判明し、その推定分子量は約７０．２ｋＤａであった。上記の（ａ）で解析されたＮ末端の１３アミノ酸配列と塩基配列から推定されるＮ末端アミノ酸配列とは完全に一致し、またＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果（約７１ｋＤａ）と推定分子量（７０．２ｋＤａ）は非常に近い値であったことから、単離された溶菌遺伝子は溶菌タンパク質をコードしていることが判明した。また、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡによるホモロジー検索の結果、全体的に相同性の高いタンパク質は見出されなかった。
【００５７】
実施例２：大腸菌（E.coli）による溶菌酵素の生成
（ａ）溶菌遺伝子のＰＣＲ法による増幅
全長の溶菌遺伝子を発現ベクターに挿入して、大腸菌（E.coli）を形質転換することにより溶菌酵素を生成させた。具体的には以下の通り行った。
先ず、配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、gaccaccatg gaattgctgc（配列番号６）およびtcaggatccc ccttatggtt（配列番号７）の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ＰＣＲ反応は、TaKaRa Ex Taq^TM（宝酒造）を用いた。鋳型ＤＮＡとしてファージＰ４２８２ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌをＰＣＲ反応液（０．０５Ｕ／μｌのTaKaRa Ex Taq^TM、１０×Ex Taq^TMBuffer、終濃度各０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ混合物４８μｌ）に添加し、次いで配列番号６および７の一対の合成プライマー（終濃度０．１μＭ）を各０．５μｌずつ加え、ＰＣＲ反応を行った。
【００５８】
反応は，９５℃で２分間を１サイクル；９５℃で３０秒、５５℃で１分間そして７２℃で１分間を３０サイクル；７２℃で１０分間を１サイクル行った。ＰＣＲ反応により増幅された遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動の結果、予想された長さ（２．０６ｋｂ）と一致していた。この遺伝子断片をGENECLEAN II キット（フナコシ）で精製した。
【００５９】
（ｂ）発現ベクターへの溶菌遺伝子の挿入と大腸菌（E.coli）の形質転換
ＰＣＲ反応により増幅した遺伝子断片をNcoI、BamHIで消化し、これを市販の発現ベクターpTrc99A（ファルマシア）のNcoI、BamHIサイトに挿入した。ライゲーションにはＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用い、１６℃で一晩行った。この反応液１０μｌを大腸菌ＮＭ５２２株（ファルマシア）コンピテントセル１００μｌに加えて形質転換した。具体的には、３０分間氷上に静置した後、４２℃で４５秒間熱処理を行い、再度氷上に２分間静置した。この菌液に０．９ｍｌのＳＯＣ培地（２％ Bacto-Tryptone、０．５％ Yeast Extract、０．０５％ＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃で１時間激しく振盪培養した後、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ Bacto-Tryptone、１％ Yeast Extract、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）にプレーティングした。出現したコロニーを幾つか拾い、２ｍｌのＬＢ液体培地で培養してアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出して、目的の溶菌遺伝子を有するプラスミドを含むコロニーを選抜した。
【００６０】
（ｃ）形質転換した大腸菌により生成された溶菌酵素による立枯病菌溶菌活性
上記（ｂ）で選抜した溶菌遺伝子を有する形質転換大腸菌を、５０ｐｐｍアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、２５℃で５〜６時間培養した。これに終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、２５℃で３時間誘導培養した。菌体を遠心集菌し、１０ｍｌショ糖緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％ショ糖）に懸濁した。氷上に１０分間静置した後、遠心して得られた菌体を５ｍｌの５ｍＭ塩化マグネシウムに再懸濁した。さらに氷上で１０分間静置した後、再度遠心集菌した。得られた沈殿を５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して、菌体を氷中で超音波破砕（３０秒、４回）した。これを遠心して可溶性タンパク質画分の上清を得た。立枯病菌に対する溶菌活性測定は実施例１（ａ）と同様に行った。その結果、表１に示すように立枯病菌溶菌活性が認められた。
【００６１】
表１：形質転換大腸菌が生産する溶菌酵素による立枯病菌溶菌活性
処理区濁度減少活性（Ｕ／分・ｍｇタンパク質）
プラスミドベクター(非誘導時) ０．２１５±０．３７２
プラスミドベクター(誘導時) ０．９１４±０．８８７
溶菌遺伝子挿入ベクター(非誘導時) ６．３１２±２．０７２
溶菌遺伝子挿入ベクター ( 誘導時 ) ２５．６６９±２．３０１
【００６２】
実施例３：タバコ立枯病菌のファージにおけるＰ４２８２溶菌遺伝子の相同性
ファージＰ４２８２の溶菌遺伝子が他の立枯病菌ファージに保存されているかどうかを検討するために、溶菌遺伝子をプローブとして全国のタバコ畑から分離したファージＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション法で解析した。
（ａ）プローブの作製
実施例２（ａ）に準じてＰＣＲ反応で増幅した溶菌遺伝子断片（２．０６ｋｂｐ）をPolarPlexビオチンラベルサブキット（日本ミリポアリミテッド）に従い、ビオチン標識した。即ち、溶菌遺伝子断片１μｇを熱変性し、ラベリングミックス（終濃度２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．６）、２．５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ビオチンランダムプライマー６０ＯＤ／ｍｌ）、０．１ｍＭｄＮＴＰミックス、５Ｕ Klenowポリメラーゼを加え、３７℃で２０時間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止した後、エタノール沈殿を行い、ビオチン標識プローブを約９００ｎｇ得た。
【００６３】
（ｂ）サザンハイブリダイゼーション
全国のタバコ畑の土壌から公知の手法により立枯病菌ファージを単離した。単離および供試したファージは、ｓｐ７（京都府竹野郡丹波町）、ｓｐ１１（佐賀県唐津市）、ｓｐ２７（岡山県浅口郡）、ｓｐ６２（広島県神石郡）、ｓｐ６３（山口県阿武郡）、ｓｐ７２（高知県中村市）、ｓｐ７５（島根県安来市）、新潟（新潟県長岡市）、青森（青森県南郷村）、平良（沖縄県平良市）および大越（福島県田村郡大越）の１１株であった。なおＰ４２８２株は栃木県小山市で採取されたものである。
【００６４】
それぞれのファージから公知の方法でＤＮＡを抽出し、EcoRIで消化した。プローブにはファージＰ４２８２のビオチン標識溶菌遺伝子を用い、温度以外は実施例１（ｂ）と同じハイブリダイゼーション条件を使用してそれぞれのファージ中の相同遺伝子の同定を行った。即ち、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの組成のハイブリダイゼーション液を使用して６８℃で１時間プレハイブリダイゼーションした後、プローブを２０ｎｇ／ｍｌになるように添加して６８℃で一晩ハイブリダイゼーションした。得られた結果を図５に示す。図５から分かるように、新潟、青森、平良、福島県大越の各ファージＤＮＡとは非常に強いシグナルが、そしてｓｐ６３ＤＮＡとは弱いシグナルが検出された。他のファージＤＮＡとはハイブリダイゼーションのシグナルが検出されなかった。以上の結果から、Ｐ４２８２の溶菌遺伝子と相同性のある塩基配列を有する立枯病菌ファージが全国に分布して存在していることが判明した。
【００６５】
【発明の効果】
本発明により提供されるバクテリオファージ由来のタンパク質は、タバコ立枯病菌を溶菌させる活性を有するので、植物にタバコ立枯病に対する抵抗性を付与することができ農業上有用である。本発明により提供される上記タンパク質をコードする遺伝子は、当該タンパク質を発現させるために使用することができ、当該タンパク質の大量生産のために有用である。また、本発明の遺伝子を植物（特には、タバコ植物）内に形質転換することによって、タバコ立枯病に対する抵抗性が向上した形質転換植物、特に形質転換タバコ植物を作成することができる。
【００６６】
【配列表】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【００７０】

【００７１】

【００７２】

【００７３】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は溶菌酵素精製の各段階におけるＭ４Ｓ菌体に対する溶菌活性を示す。Ｍ４Ｓは立枯病菌Ｍ４Ｓ菌体から抽出した全タンパク質、Ｍ４ＳとＰ４２８２の混合培養液はＭ４Ｓ菌とファージＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質、硫安０〜４０％はＭ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、硫安４０〜８０％はその４０〜８０％飽和度硫酸アンモニウム画分、抽出タンパク質はゲル濾過高速液体クロマトグラフィーより分画したもの（第４フラクション）である。
【図２】図２は、Ｍ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分をゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに供して得られた各フラクションのピークを示す図である。
【図３】図３は、溶菌酵素精製の各段階における銀染色１３．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像である。レーン１は分子量基準タンパク質（マーカー）、レーン２はＭ４Ｓ菌から抽出した全タンパク質、レーン３はＭ４Ｓ菌とＰ４２８２株を共培養して抽出した全タンパク質の０〜４０％飽和度硫酸アンモニウム画分、レーン４と５はゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの２つのメインピーク、レーン６は非変性ポリアクリルアミドゲルの活性バンドから抽出したものを示す。
【図４】図４は、溶菌酵素のＮ末端アミノ酸配列より合成した２つのオリゴヌクレオチドプローブによるサザンハイブリダイゼーションのＸ線フィルム像である。Ａは配列番号４の合成ＤＮＡ、Ｂは配列番号５の合成ＤＮＡをプローブとして使用して得られた結果であり、レーン１はＰ４２８２ＤＮＡのScaI＋SalI消化断片、レーン２はＰ４２８２ＤＮＡのScaI＋SalI＋BamHI消化断片、レーン３はＰ４２８２ＤＮＡのEcoRI消化断片、レーン４はＰ４２８２ＤＮＡのPstI消化断片、レーン５はＭ４Ｓ菌ＤＮＡのEcoRI消化断片、レーン６はＭ４Ｓ菌ＤＮＡのPstI消化断片を示す。
【図５】図５は、Ｐ４２８２株の溶菌遺伝子をプローブとした各種ファージＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションのＸ線フィルム像である。レーン１〜７は順にファージｓｐ７、ｓｐ１１、ｓｐ６２、ｓｐ２７、ｓｐ６３、ｓｐ７２およびｓｐ７５を泳動したものであり、レーン８〜１１は順に新潟、青森、福島県大越および平良から分離したファージＤＮＡを泳動したものであり、レーン１２はＰ４２８２株のＤＮＡを泳動したものであり、レーン１３はＤＮＡサイズマーカーを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum of the solanaceous bacterial wilt (tobacco wilt) (Ralstonia solanacearumAnd bacteriophage-derived proteins (enzymes), genes encoding the same, vectors and transformants. In particular, the present invention relates to a protein (enzyme) capable of conferring resistance to solanaceous bacterial wilt (tobacco wilt) and a gene encoding the same, and using such a lytic gene for agriculture A useful transgenic plant can be prepared.
[0002]
[Prior art]
Lysozyme, known as a bacterial lytic enzyme, is an enzyme that hydrolyzes the β1 → 4 bond between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine present in the mucopeptide of the bacterial cell wall. As lysozyme, egg white lysozyme, human lysozyme, various lysozymes derived from bacteriophage, etc. are known, and the base sequence of some of them has been analyzed.
[0003]
For example, egg white lysozyme is biochemically (Comp. Biochem. Physiol. 92: 523-527 (1989), J. Phytopathology 141: 159-164 (1994)) or molecular biological (Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 537-540 (1993)) Detailed studies have been made. As bacteriophage-derived lysozyme, Escherichia coliE.coliDetailed studies on T4 phage (J. Biol. Biochem. 243: 391-397 (1968), Biochimica et Biophysica, 662: 131-167 (1981), FEBS Letters 139: 97-100 (1982) , Eur. J. Biochem. 133: 717-722 (1983), J. Virol. 54: 460-466 (1985), Mol. Gen. Genet. 202: 363-367 (1986), Biochem. Biophys. Research Communi .145: 190-195 (1987), The New Biologist 1: 171-179 (1989), J. Mol. Biol. 222: 67-87 (1991)).
[0004]
Egg white lysozyme (Plant Science 87: 55-67 (1992), Plant Science 106: 55-62 (1995)), human lysozyme (Agric. Biol. Chem. 50: 713-723 (1986), Plant Cell Report 16: 674 -679 (1997)), and many plants transformed with the gene of T4 lysozyme (Plant J.3: 587-598 (1993)) have been reported. In addition, it has been reported that recombinant tobacco transformed with human lactoferrin cDNA has enhanced resistance to solanaceous bacterial blight (Phytopathology 88: 730-734 (1988)).
[0005]
To date, numerous bacteriophage-derived bacterial lytic enzymes have been reported (J. Biol. Chem. 244: 1968-1975 (1969), J. Biochem. 89: 275-284 (1981), Current Microbiology 13: 299-301 (1986), Nucleic Acids Research 14: 10001-10008 (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 955-958 (1987), J. Bacteriology 178: 1099-1104 (1996)). However, as far as the present inventor is aware, no report has been made so far on the lytic enzyme produced by the bacteriophage parasitic on the tobacco blight fungus.
[0006]
In addition, the antibacterial substance sarcotoxin IA derived from flies is effective against lettuce soft rot fungus, spotted bacterial disease, tobacco wildfire fungus, peach perforated bacterial disease, Chinese cabbage soft rot fungus, etc. Invalid (Plant Protection 50: 19-22 (1996), Plant Cell Physiol. 39: 57-63 (1998)).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
One of the objects of the present invention is that the tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum) To purify the lytic protein produced by the bacteriophage that parasitize.
Another object of the present invention is to provide the tobacco wilt fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearumThe gene of the lytic protein produced by the bacteriophage that parasitizes is isolated from the genomic DNA of the bacteriophage.
[0008]
Still another object of the present invention is to provide a transformant (especially a tobacco plant) having improved resistance to a solanaceae bacterial wilt fungus (tobacco wilt fungus) using the gene according to the present invention. It is.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors focused on a bacteriophage that proliferates while lysing and infesting tobacco blight, purifying a lytic protein produced by the bacteriophage, and cloning a gene encoding the lytic protein from its genomic DNA Thus, the base sequence was determined to complete the present invention.
[0010]
That is, according to the first aspect of the present invention, the tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearumBacteriophage that is parasitic on the lysate, and has a molecular weight of about 71 kDa as determined by SDS-PAGE, and a lytic protein having the N-terminal amino acid sequence: Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp.
[0011]
According to one aspect of the present invention, the lytic protein is a tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (parasitic bacteriophage).Ralstonia solanacearum) Is subjected to ammonium sulfate precipitation to recover a 0-40% saturated ammonium sulfate fraction;
The above-obtained fraction can be obtained by subjecting it to gel filtration high performance liquid chromatography and collecting a fraction showing a peak corresponding to protein elution.
[0012]
According to one embodiment of the present invention, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing: an amino acid sequence having one to a plurality of amino acid mutations in this sequence; or 70% or more, preferably 80% or more with this sequence More preferably 90% or more, most preferably 95% or more amino acid sequences having homology of more than 90% are provided.
[0013]
According to a second aspect of the present invention, a bacteriophage-parasitic tobacco wilt fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum) Suspension of ammonium sulfate to recover 0-40% saturated ammonium sulfate fraction; and
Subjecting the fraction obtained above to gel filtration high performance liquid chromatography and collecting a fraction showing a peak corresponding to protein elution;
A method for producing the lytic protein of the present invention is provided.
[0014]
According to the third aspect of the present invention, a gene encoding the lytic protein of the present invention described above is provided.
[0015]
According to one aspect of the present invention, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the base sequence having one to a plurality of base substitutions, deletions, insertions and / or additions in the base sequence, or the above A gene encoding the lytic protein of the present invention having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence is provided.
[0016]
The gene of the present invention has a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. is doing.
[0017]
According to the fourth aspect of the present invention, a recombinant vector comprising the gene of the present invention is provided.
In the recombinant vector of the present invention, preferably the vector is an expression vector.
[0018]
According to the fifth aspect of the present invention, there is provided a transformant obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host organism.
In the transformant of the present invention, the host organism is preferably a solanaceous plant, particularly preferably a tobacco plant.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The embodiment of the present invention or the implementation method will be described in more detail below.
According to a first aspect of the present invention, the tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearumLysate proteins produced by bacteriophages that parasitize) are provided.
As long as the protein of the present invention has the characteristics described in the present specification, its origin, production method and the like are not limited. That is, the lytic protein of the present invention may be a naturally occurring protein, a recombinant protein expressed from a recombinant DNA by genetic engineering techniques, or a chemically synthesized protein.
[0020]
The protein of the present invention typically has a 687 amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. However, one or more amino acid mutations may occur in natural proteins due to differences in the varieties of species that produce them, genetic variations due to differences in ecosystems, or the presence of similar isozymes. It is well known that there are mutated proteins. As used herein, the term “amino acid mutation” means substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acids. That is, the protein of the present invention typically has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 on the basis of the base sequence of the cloned gene, but is not limited to only a protein having that sequence. Rather, it is intended to include all homologous proteins as long as they have the properties described herein. The homology is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
[0021]
In general, substitution between amino acids having similar properties (for example, substitution from one hydrophobic amino acid to another hydrophobic amino acid, substitution from one hydrophilic amino acid to another hydrophilic amino acid, substitution from one acidic amino acid to another When a substitution to an acidic amino acid or a substitution from one basic amino acid to another basic amino acid is introduced, the resulting mutant protein often has the same properties as the original protein. Techniques for producing recombinant proteins having such desired mutations using genetic recombination techniques are well known to those skilled in the art, and all such mutant proteins are within the scope of the present invention.
[0022]
The protein of the present invention, for example, according to the examples described below, is a tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum) Was subjected to ammonium sulfate precipitation to recover a 0-40% saturated ammonium sulfate fraction; the fraction obtained above was subjected to gel filtration high performance liquid chromatography, and the peak corresponding to protein elution It can obtain by collect | recovering the fraction which shows. Next, for each collected fraction, the fraction containing the desired lytic protein can be identified by measuring the presence or absence of lytic activity.
[0023]
The type of bacteriophage used in the present invention is not limited as long as it produces a lytic enzyme by infesting the tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum. Specific examples of such bacteriophages are those described in JP-B-4-48762 and JP-B-6-17291 (named P4282 and used in the following examples of the present specification). Is mentioned. The method for separating bacteriophage P4282 from soil is as described in Japanese Examined Patent Publication No. 4-48762 (Microbiology Experimental Method: Microbiological Research Method Roundtable, December 1975, published by Kodansha Scientific) ). In addition, all the content described in these gazettes is quoted in this specification.
[0024]
Tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum used in the present invention (Ralstonia solanacearum) Is not particularly limited, but as an example, the accession number FERM BP-700 (December 14, 1983) described in Japanese Patent Publication Nos. 4-48762 and 6-17291 Strains deposited with the National Institute of Microbiology and Industrial Technology Institute), and these strains were also used in the following examples of the present specification. In addition, this strain is Pseudomonas solanacearum (Pseudomonas solanacearum), But in this specification the tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum) Is displayed.
[0025]
Alternatively, a large amount of the lytic protein of the present invention can be obtained by introducing and expressing the gene according to the present invention into Escherichia coli, yeast, insects or certain animal cells using expression vectors that can be amplified in the respective hosts. You can also.
[0026]
Utilizing the amino acid sequence of the protein according to the present invention disclosed herein and the gene sequence encoding the same or a part thereof, using genetic engineering techniques such as hybridization or PCR, other origins, etc. It is within the ordinary knowledge of a person skilled in the art to isolate a gene encoding a protein having similar physiological activity from the above, and the protein encoded by the gene isolated in this way is also of the present invention. Included in the range.
[0027]
The present invention also provides a gene encoding the lytic protein of the present invention. The type of gene is not particularly limited, and may be any of naturally-derived DNA, recombinant DNA, and chemically synthesized DNA, and any of genomic DNA clones and cDNA clones.
[0028]
The gene of the present invention typically has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, but this is only a base sequence of the clone obtained in the following Examples, which is merely an example of the present invention. . It is known to those skilled in the art that among natural genes, there are a small number of mutations due to differences in the varieties of species that produce them, differences in ecosystems, and the presence of similar isozymes. It is well known. Therefore, the gene of the present invention is not limited to the gene having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, but includes all genes encoding the lytic protein of the present invention.
[0029]
In particular, if the amino acid sequence of this protein and the DNA sequence encoding it are disclosed by the present invention, using this sequence or a part thereof, using a basic technique of genetic engineering such as hybridization or PCR, A gene encoding a protein having the same physiological activity can be easily isolated from other species. In such a case, such a gene is also included in the scope of the present invention.
[0030]
The hybridization conditions used for screening for homologous genes are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the degree of homology between the target homologous gene and the probe. For example, 6 × SSC [0.9 M NaCl, 0.09 M sodium citrate (pH 7.0)], 5 × Denhardt's solution [1 g Ficoll, 1 g polyvinylpyrrolidone in 1000 mL, 1 g BSA], 0.5% SDS, 25 ° C. to 68 ° C. (eg 37 ° C., 42 ° C. or 68 ° C.); or 0-50% formamide, 6 × SSC, 0.5% SDS, 25-68 ° C. (eg 37 It is conceivable to use hybridization conditions such as 0 ° C, 42 ° C or 68 ° C. It is well known to those skilled in the art that DNA containing a base sequence having a homology higher than a certain homology can be cloned by appropriately setting hybridization conditions such as formamide concentration, Denhardt solution concentration, salt concentration and temperature. All homologous genes thus cloned are included within the scope of the present invention.
[0031]
The homologous gene cloned using the hybridization as described above is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, relative to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. Most preferably, it has a homology of 95% or more.
[0032]
According to the present invention, a recombinant vector comprising the gene of the present invention is provided.
A recombination vector can be conveniently prepared by ligating a desired gene to a recombination vector (for example, plasmid DNA) available in the art by a conventional method.
Specific examples of the vector used include, but are not limited to, plasmids derived from E. coli such as pBluescript, pUC18, pUC19, and pBR322.
[0033]
For the purpose of producing a desired protein, an expression vector is particularly useful. The type of expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene and producing a desired protein in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells. PQE-30, pQE-60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420, etc. are preferred as expression vectors for yeast, and pYES2 (Saccharomyces genus), pPIC3.5K, pPIC9K, pAO815 (above Pichia genus) as expression vectors for yeast As insect expression vectors, pBacPAK8 / 9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5 and the like are preferable.
[0034]
Examples of a method for incorporating the DNA fragment of the gene of the present invention into a vector such as a plasmid include, for example, “Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989)”. The method of description is mentioned. For convenience, a commercially available ligation kit (for example, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can also be used. A recombinant vector (for example, a recombinant plasmid) obtained in this manner can be introduced into a host cell by the method described below.
[0035]
As a method for introducing (transforming or transfecting) the recombinant vector of the present invention into a host cell, a conventionally known method can be used. For example, “Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989) ", calcium chloride method or calcium chloride / rubidium method, electroporation method, electroinjection method, method by chemical treatment such as PEG, gene gun The method using these etc. is mentioned.
[0036]
Alternatively, for example, if the host cell is a bacterium (E.coil,Bacillus subtilisIn the case of Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method [Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)] and competent method [ J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)]Saccharomyces cerevisiaeIn the case of plant cells, for example, by the method of Hinnnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)] or lithium method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] By the leaf disc method [Science, 227, 129 (1985)], electroporation method [Nature, 319, 791 (1986)], in the case of animal cells, for example, Graham's method [Virology, 52,456 (1973)], in the case of insect cells For example, each can be transformed by the method of Summers et al. [Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165 (1983)].
[0037]
The host cell used for producing the transformant is not particularly limited as long as it is compatible with the recombinant vector of the present invention and can be transformed, and is a natural cell commonly used in the technical field of the present invention. Various cells such as cells or artificially established recombinant cells can be used. For example, prokaryotic cells such as bacteria (Escherichia, Bacillus), lower eukaryotic cells including unicellular hosts such as yeast (Saccharomyces, Pichia, etc.), higher eukaryotic cells such as silkworms, etc. Can be mentioned.
[0038]
The host cell is preferably Escherichia coli, yeast or insect cell. Specifically, Escherichia coli (M15, JM109, BL21 etc.), yeast (INVSc1 (Saccharomyces genus), GS115, KM71 (Pichia genus etc.)), insect cell ( BmN4, silkworm larvae, etc.) are exemplified. Examples of animal cells include mouse-derived, Xenopus-derived, rat-derived, hamster-derived, monkey-derived or human-derived cells, or cultured cell lines established from these cells. Furthermore, plant cells are not particularly limited as long as cell culture is possible, and examples thereof include cells derived from tobacco, Arabidopsis, rice, corn, wheat, and the like.
[0039]
When bacteria, particularly E. coli, are used as host cells, the expression vector generally comprises at least a promoter / operator region, a start codon, a gene encoding a desired lytic protein, a stop codon, a terminator, and a replicable unit.
[0040]
When yeast, plant cells, animal cells or insect cells are used as host cells, the expression vector generally comprises at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding a desired lytic protein, a stop codon, and a terminator. Is preferred. Further, it may appropriately contain DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of a desired gene, a selectable marker region, a replicable unit, and the like.
[0041]
In the vector of the present invention, a suitable initiation codon is exemplified by methionine codon (ATG). Further, examples of the stop codon include common stop codons (eg, TAG, TGA, TAA, etc.).
[0042]
A replicable unit means a DNA having the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a plasmid prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included. Suitable plasmids includeE.coil, Plasmid pQE30, pET or pCAL or their artificial modifications (DNA fragments obtained by treating pQE30, pET or pCAL with appropriate restriction enzymes), plasmid pYES2 or pPIC9K in yeast, and plasmid pBacPAK8 in insect cells / 9 etc.
[0043]
As the enhancer sequence and terminator sequence, those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, respectively, can be used.
[0044]
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples include tetracycline, ampicillin, or antibiotic resistance genes such as kanamycin or neomycin, hygromycin, spectinomycin, or chloramphenicol. For example, suitable selectable markers for use in transforming tobacco include antibiotic resistance genes encoding neomycin phosphotransferase, hygromycin phosphotransferase, chloramphenicol acetyltransferase, and the like. By using the marker, a transformed tobacco individual can be easily selected.
[0045]
An expression vector can be prepared by linking at least the above-mentioned promoter, initiation codon, gene encoding the desired lytic protein, stop codon, and terminator region in a continuous and circular manner to an appropriate replicable unit. it can. At this time, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, other restriction enzyme sites, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase, if desired.
[0046]
The most important use of the gene of the present invention is to impart lytic activity to a plant by introducing it into the plant. For example, by introducing the gene of the present invention into a solanaceous plant such as tobacco or tomato, disease resistance performance against bacterial wilt (tobacco wilt) can be imparted. That is, according to a preferred embodiment of the present invention, a transformed plant stably transformed with a recombinant DNA molecule capable of transcribing and translating a gene encoding a bacteriophage-derived lytic enzyme in a plant, particularly preferably A transformed tobacco plant is provided.
[0047]
As a promoter for expressing the lytic protein in the transformed plant of the present invention, the CaMV35S promoter can be considered, but it is also obvious that the gene of the present invention can be expressed using other promoters, The use of all promoters capable of constitutive expression or inducible expression other than the CaMV35S promoter is also included within the scope of the present invention. In particular, injury-responsive promoters (eg, phenylalanine ammonia lyase promoter) are useful for expression of the lytic gene of the present invention.
[0048]
Various transcription termination sequences (terminators) for use in plant transformation vectors are known. For example, nopaline synthase (NOS), octopine synthase (OCS) and CaMV polyadenylation terminators can be used for the expression of heterologous genes in recombinant tobacco plants and are useful for the expression of the lytic genes of the present invention It is.
[0049]
Numerous methods have been reported as methods for stably transforming plants with foreign DNA, and are already known. One of them is Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens). Agrobacterium tumefaciens has a plasmid having the sequence T-DNA, and is efficiently transferred and integrated into the chromosomes of natural dicotyledonous plants (including tobacco) to form tumors in infected plants. Negative bacteria. Vector systems for incorporating heterologous DNA into plant chromosomes have been studied in detail in the field of plant genetic engineering, and effective vectors have been developed. This Agrobacterium method is widely used in the art and can also be used in the practice of the present invention. However, in the present invention, plants can also be transformed by methods other than the Agrobacterium method, such as electroporation method and particle gun method.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0050]
【Example】
Example 1: Isolation of bacteriophage-derived lytic genes
(A) Purification of bacteriophage lytic enzymes parasitic on tobacco blight
A bacteriophage P4282 (described in Japanese Patent Publication Nos. 4-48762 and 6-17291) that infests the M4S strain of tobacco rot and grows while lysing it is used to test the lytic enzyme. Separation and purification were performed. CPG liquid medium (1% glucose, 1% polypeptone, 0.1% casamino acid) was inoculated with M4S bacteria (Accession No. FERM BP-700) and cultured overnight at 28 ° C. and 120 rpm. After centrifugation, the cells are suspended in a small amount of CPG liquid medium, and 3 × 10 3 in a jar fermenter containing 4000 ml of CPG liquid medium.⁸Inoculated to cells / ml. Furthermore, 1 and 8 minutes after the inoculation, each of P4282 phage solution was 15 × 10 5⁸pfu / ml was added and cultured at 28 ° C. and 100 rpm for 2.5 hours.
[0051]
Next, M4S bacteria parasitized with P4282 were collected by centrifugation and then suspended in buffer A (20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) -hydrochloric acid (pH 7.5), 1 mM magnesium sulfate) to give a final concentration of 50 μg / ml DNase I and 0.2% chloroform were added and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight. After centrifugation, ammonium sulfate was added to the supernatant to obtain 40% saturation, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 1 hour or more. By centrifuging at 8000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., a 40% saturated ammonium sulfate fraction was obtained as a precipitate. The supernatant increased the ammonium sulfate concentration from 40% saturation to 80% saturation. Centrifugation was similarly performed to obtain a 40-80% saturated ammonium sulfate fraction, and the supernatant was discarded. Each precipitate was dissolved in a small amount of buffer A, and desalted by applying to a Sephadex G-100 (Pharmacia) column. As a result of the lysis activity measurement described below for the 0 to 40% saturated ammonium sulfate fraction and the 40 to 80% saturated ammonium sulfate fraction, activity was observed in the 0 to 40% saturated ammonium sulfate fraction (Fig. 1).
[0052]
Then, this fraction was subjected to gel filtration high performance liquid chromatography (YMC-Pack Diol-300, 500 × 8.0 mm). The solvent used was 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 150 mM NaCl, and the flow rate was 0.7 ml / min. A total of 6 fractions showing peaks corresponding to protein elution were collected (see FIG. 2), and the lytic activity measurement described below was performed for each fraction. As a result, activity was found in the 4th fraction. (See extracted protein results in FIG. 1).
[0053]
The lytic activity was measured optically by the decrease in turbidity of M4S cells. Specifically, modified M9 medium (disodium hydrogen phosphate 0.6 g, potassium dihydrogen phosphate 0.3 g, sodium chloride 0.05 g, ammonium chloride 0.1 g, 25% glucose 12 ml, 1 M magnesium sulfate 1 ml, 2 mg / M4S bacteria cultured in 0.5 ml of thiamine hydrochloride, 1 ml of 100 mM calcium chloride, and 985.5 ml of distilled water were collected, and then buffer B (60 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 5 mM) saturated with chloroform. Suspended in ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and centrifuged and washed 3 times with buffer B to remove chloroform. The cells were suspended in buffer B and the absorbance was adjusted to 0.5 to 0.6 (wavelength 600 nm). After mixing 1 ml of the bacterial solution and 50 μl of the enzyme solution and measuring the absorbance, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes, and the absorbance was measured again to calculate the decrease in turbidity.
[0054]
The sample of each stage of purification including the fourth fraction of gel filtration high performance liquid chromatography in which activity was recognized was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Nature 227: 680-685 (1970)). . After electrophoresis, the protein band was electroblotted onto a PVDF membrane (Ato) and then stained with 0.1% Coomassie Brilliant Blue R250, 50% methanol, 10% acetic acid. The obtained results are shown in FIG. The fourth fraction showed a band at about 71 kDa. This band was cut out and the N-terminal amino acid sequence was determined with a gas phase protein sequencer. As a result, 13 amino acids of Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala Lys Thr Gln Phe Ile Asp (SEQ ID NO: 3) were identified.
[0055]
(B) Isolation of a gene encoding a lytic enzyme by Southern hybridization A probe was prepared using information on the determined N-terminal amino acid sequence of the lytic enzyme, and a lytic gene was isolated from phage P4282 DNA. Specifically, the amino acid sequence of the lytic enzyme is compared with a known codon table to compare aaracncart tyathga (SEQ ID NO: 4, sequence table free text: n indicates a, c, g, or t) and garaaygcna aracnca (SEQ ID NO: (5) Sequence Listing Free Text: n represents a, c, g, or t). The probe was labeled with non-radioactive biotin at the 5 'end.
Phage P4282 genomic DNA (about 39 kbp) extracted by a known technique was digested with restriction enzymes SalI + ScaI, SalI + ScaI + BamHI, EcoRI and PstI, respectively, and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. Subsequently, the DNA band was transferred to a nylon membrane (Hybond-N +, Amersham), and then Southern hybridization was performed at 37 ° C. using the two types of probes of SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively. For Southern hybridization, PolarPlex Southern & Northern Kit (Nippon Millipore Limited) was used and the protocol specified by the manufacturer was followed. Specifically, after prehybridization at 37 ° C. for 1 hour using a hybridization solution composed of 6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 μg / ml salmon sperm DNA, the probe was adjusted to 20 ng / ml. And then hybridized overnight at 37 ° C. The nylon membrane was washed with 2 × SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate (pH 7.0)), 0.1% SDS three times for 10 minutes at room temperature, 0.1 × SSC, 0 Performed twice for 15 minutes at 1% SDS at 37 ° C. The X-ray film was exposed for about 20 minutes. The result is shown in FIG. Comparison with the restriction enzyme map of the entire P4282 DNA revealed that the DNA fragments hybridized with the two types of probes were 3.6 kb fragments of ScaI-BamHI.
[0056]
(C) Determination of the base sequence of the lytic gene
After appropriately digesting the 3.6 kb band of ScaI-BamHI detected by Southern hybridization with several kinds of restriction enzymes, the obtained DNA fragment was cloned into a commercially available plasmid vector pBluescript II SK- (Toyobo) for Escherichia coli. This was subjected to a DNA sequencer to determine the base sequence. As a result, the entire base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was determined. The open reading frame of the lytic gene was found to encode 687 amino acids with a total length of 2061 bp, and its estimated molecular weight was about 70.2 kDa. The N-terminal 13 amino acid sequence analyzed in (a) above and the N-terminal amino acid sequence deduced from the base sequence are completely identical, and the results of molecular weight measurement by SDS-PAGE (about 71 kDa) and the estimated molecular weight ( Since 70.2 kDa) was a very close value, it was found that the isolated lytic gene encoded a lytic protein. Moreover, as a result of homology search by BLAST and FASTA, proteins with high overall homology were not found.
[0057]
Example 2: E. coli (E.coli) Production of lytic enzymes
(A) Amplification of lytic genes by PCR
Insert the full-length lytic gene into an expression vector,E.coli) To produce a lytic enzyme. Specifically, it was performed as follows.
First, two types of oligonucleotide primers, gaccaccatg gaattgctgc (SEQ ID NO: 6) and tcaggatccc ccttatggtt (SEQ ID NO: 7), were synthesized based on the base sequence described in SEQ ID NO: 1. PCR reaction was performed using TaKaRa Ex Taq^TM(Takara Shuzo) was used. As a template DNA, 1 μl of phage P4282 DNA (10 ng / μl) was added to a PCR reaction solution (0.05 U / μl TaKaRa Ex Taq).^TM10 x Ex Taq^TMThe buffer was added to a final concentration of 0.2 mM each of dNTPs mixture (48 μl), and then a pair of synthetic primers of SEQ ID NOs: 6 and 7 (final concentration 0.1 μM) was added 0.5 μl each to carry out PCR reaction.
[0058]
The reaction was performed at 95 ° C for 2 minutes for 1 cycle; 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles; 72 ° C for 10 minutes for 1 cycle. As a result of agarose gel electrophoresis, the gene fragment amplified by the PCR reaction was consistent with the expected length (2.06 kb). This gene fragment was purified with GENECLEAN II kit (Funakoshi).
[0059]
(B) Insertion of lytic gene into expression vector and E. coli (E.coli) Transformation
The gene fragment amplified by the PCR reaction was digested with NcoI and BamHI, and inserted into the NcoI and BamHI sites of a commercially available expression vector pTrc99A (Pharmacia). Ligation was performed overnight at 16 ° C. using a DNA ligation kit (Takara Shuzo). 10 μl of this reaction solution was added to 100 μl of E. coli NM522 strain (Pharmacia) competent cell for transformation. Specifically, after standing on ice for 30 minutes, heat treatment was performed at 42 ° C. for 45 seconds, and then again standing on ice for 2 minutes. 0.9 ml of SOC medium (2% Bacto-Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.05% NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM magnesium chloride, 20 mM glucose) was added to the bacterial solution, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. After vigorous shaking culture, plating was performed on LB medium (1% Bacto-Tryptone, 1% Yeast Extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar) containing 50 ppm ampicillin. Several emerged colonies were picked up, cultured in 2 ml of LB liquid medium and extracted with an alkaline-SDS method, and a colony containing a plasmid having the target lytic gene was selected.
[0060]
(C) Bacterial lysis activity due to lytic enzyme produced by transformed E. coli
The transformed Escherichia coli having the lytic gene selected in (b) above was inoculated into 50 ml of LB liquid medium containing 50 ppm ampicillin and cultured at 25 ° C. for 5 to 6 hours. To this was added isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) having a final concentration of 0.1 mM, followed by induction culture at 25 ° C. for 3 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 10 ml sucrose buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 20% sucrose). After leaving on ice for 10 minutes, the cells obtained by centrifugation were resuspended in 5 ml of 5 mM magnesium chloride. The mixture was further allowed to stand on ice for 10 minutes, and then centrifuged again. The obtained precipitate was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2), and the cells were sonicated in ice (30 seconds, 4 times). This was centrifuged to obtain a supernatant of a soluble protein fraction. The lytic activity measurement for the bacterial wilt was performed in the same manner as in Example 1 (a). As a result, as shown in Table 1, bactericidal activity was confirmed.
[0061]
Table 1: Lysis activity of bacterial wilt disease by lytic enzymes produced by transformed Escherichia coli
Treatment area Turbidity reduction activity (U / min / mg protein)
Plasmid vector (when not induced) 0.215 ± 0.372
Plasmid vector (during induction) 0.914 ± 0.887
Lysis gene insertion vector (when not induced) 6.312 ± 2.072
Lysis gene insertion vector ( When guiding ) 25.669 ± 2.301
[0062]
Example 3: Homology of P4282 lytic gene in phages of tobacco blight
In order to examine whether or not the lysis gene of phage P4282 is conserved in other blight fungus phages, phage DNA isolated from tobacco fields throughout the country was analyzed by Southern hybridization using the lysis gene as a probe.
(A) Preparation of probe
The lytic gene fragment (2.06 kbp) amplified by PCR reaction according to Example 2 (a) was labeled with biotin according to PolarPlex biotin label subkit (Nihon Millipo Limited). Specifically, 1 μg of the lytic gene fragment was heat denatured and labeled mix (final concentration 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M HEPES (pH 6.6), 2.5 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol. (DTT), biotin random primer 60 OD / ml), 0.1 mM dNTP mix, 5 U Klenow polymerase were added and reacted at 37 ° C. for 20 hours. After stopping the reaction with 0.5 M EDTA, ethanol precipitation was performed to obtain about 900 ng of a biotin-labeled probe.
[0063]
(B) Southern hybridization
Bacteriophage phages were isolated from the soil of tobacco fields nationwide by a known method. The phages isolated and tested were sp7 (Tamba-cho, Takeno-gun, Kyoto), sp11 (Karatsu-shi, Saga), sp27 (Asakuchi-gun, Okayama), sp62 (Kamiishi-gun, Hiroshima), sp63 (Abu-gun, Yamaguchi) , Sp72 (Nakamura City, Kochi Prefecture), sp75 (Yasugi City, Shimane Prefecture), Niigata (Nagaoka City, Niigata Prefecture), Aomori (Nango Village, Aomori Prefecture), Hira (Hira City, Okinawa Prefecture) and Ogoshi (Okoshi, Tamura-gun, Fukushima Prefecture) There were 11 shares. The P4282 strain was collected in Oyama City, Tochigi Prefecture.
[0064]
DNA was extracted from each phage by a known method and digested with EcoRI. The biotin-labeled lytic gene of phage P4282 was used as the probe, and the homologous gene in each phage was identified using the same hybridization conditions as in Example 1 (b) except for temperature. That is, after prehybridizing at 68 ° C. for 1 hour using a hybridization solution composed of 6 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 μg / ml salmon sperm DNA, the probe was adjusted to 20 ng / ml. And then hybridized overnight at 68 ° C. The obtained results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 5, a very strong signal was detected with each of the phage DNAs of Niigata, Aomori, Hira, and Ogoshi, Fukushima Prefecture, and a weak signal was detected with sp63 DNA. No hybridization signal was detected with other phage DNA. From the above results, it was found that phages with blights having a base sequence homologous to the lytic gene of P4282 are distributed and exist throughout the country.
[0065]
【The invention's effect】
Since the protein derived from the bacteriophage provided by the present invention has an activity of lysing tobacco wilt, it can impart resistance to tobacco wilt on plants and is useful in agriculture. The gene encoding the protein provided by the present invention can be used to express the protein and is useful for mass production of the protein. In addition, by transforming the gene of the present invention into a plant (particularly a tobacco plant), a transformed plant, particularly a transformed tobacco plant, having improved resistance to tobacco wilt can be produced.
[0066]
[Sequence Listing]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]

[0073]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows lytic activity against M4S cells at each stage of purification of lytic enzyme. M4S is the total protein extracted from M4S bacterial body of bacterial wilt, M4S and P4282 mixed culture is the total protein extracted by co-culturing M4S and phage P4282, and ammonium sulfate 0-40% is M4S and P4282 0 to 40% saturated ammonium sulfate fraction of total protein extracted by co-culture, ammonium sulfate 40 to 80% is 40 to 80% saturated ammonium sulfate fraction, and extracted protein is fractionated by gel filtration high performance liquid chromatography (Fourth fraction).
FIG. 2 shows the peak of each fraction obtained by subjecting the 0 to 40% saturated ammonium sulfate fraction of the total protein extracted by co-culture of M4S bacteria and P4282 strain to gel filtration high performance liquid chromatography. FIG.
FIG. 3 is a silver-stained 13.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis image at each stage of lytic enzyme purification. Lane 1 is a molecular weight standard protein (marker), lane 2 is a total protein extracted from M4S bacteria, lane 3 is a 0-40% saturated ammonium sulfate fraction of the total protein extracted by co-culturing M4S bacteria and P4282 strain,

lane

4 and 5 are two main peaks of gel filtration high performance liquid chromatography, and lane 6 is extracted from the active band of a non-denaturing polyacrylamide gel.
FIG. 4 is an X-ray film image of Southern hybridization using two oligonucleotide probes synthesized from the N-terminal amino acid sequence of a lytic enzyme. A is the result obtained by using the synthetic DNA of SEQ ID NO: 4 as a probe, B is the result obtained by using the synthetic DNA of SEQ ID NO: 5 as a probe, lane 1 is a ScaI + SalI digested fragment of P4282 DNA, lane 2 is a ScaI + SalI + BamHI digested fragment of P4282 DNA, lane 3 Represents an EcoRI digested fragment of P4282 DNA, lane 4 represents a PstI digested fragment of P4282 DNA, lane 5 represents an EcoRI digested fragment of M4S bacterial DNA, and lane 6 represents a PstI digested fragment of M4S bacterial DNA.
FIG. 5 is an X-ray film image of Southern hybridization to various phage DNAs using the P4282 strain lytic gene as a probe. Lanes 1 to 7 are phages sp7, sp11, sp62, sp27, sp63, sp72, and sp75, which were sequentially run, and lanes 8 to 11 were run sequentially for phage DNAs separated from Niigata, Aomori, Fukushima Prefecture Ogoshi, and Hira. Lane 12 is obtained by electrophoresis of DNA of P4282 strain, and Lane 13 shows a DNA size marker.

Claims

Bacteriophage parasitic on tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum (Ralstonia solanacearum) is produced, the measured molecular weight of about 71kDa by SDS-PAGE, N-terminal amino acid sequence: Met Gln Leu Leu Gln Asn Ala lys Thr Gln Phe Ile Asp A lytic protein having

Subjecting the suspension of bacteriophage-parasitic tobacco blight fungus Ralstonia solanacearum to ammonium sulfate precipitation to recover 0-40% saturated ammonium sulfate fraction;
The lysed protein according to claim 1, which can be obtained by subjecting the fraction obtained above to gel filtration high performance liquid chromatography and collecting a fraction showing a peak corresponding to protein elution.

Amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; amino acid sequence having a plurality of amino acid mutations from 1 in this sequence; consisting or a sequence and amino acid sequence having at least 90% identity, lytic protein.

The lytic protein according to claim 3 , comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

Subjecting a suspension of Ralstonia solanacearum , which is parasitized with bacteriophage, to ammonium sulfate precipitation to recover a 0-40% saturated ammonium sulfate fraction; and Subjecting to gel filtration high performance liquid chromatography and collecting a fraction showing a peak corresponding to protein elution;
The manufacturing method of the lytic protein of any one of Claim 1 to 4 containing this.

The gene which codes the lytic protein of any one of Claims 1-4.

The base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a base sequence having one to a plurality of base substitutions, deletions, insertions and / or additions in the base sequence, or under stringent conditions with the base sequence The gene according to claim 6 , comprising a base sequence that hybridizes.

The gene according to claim 6 or 7 , comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

The gene according to claim 6 or 7 , comprising a base sequence having 95% or more homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

A recombinant vector comprising the gene according to any one of claims 6 to 9.

The recombinant vector according to claim 10, wherein the vector is an expression vector.

A transformant obtained by introducing the recombinant vector according to claim 10 or 11 into a host organism.

The transformant according to claim 12, wherein the host organism is a solanaceous plant.

The transformant according to claim 12, wherein the host organism is a tobacco plant.