JP3928399B2

JP3928399B2 - Polypeptide micronization method

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Publication number: JP3928399B2
Application number: JP2001314078A
Authority: JP
Inventors: 昭博松本; 孝広森田
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: JP2002293798A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチドの微粒子化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生理活性を有するポリペプチドが、ヒトまたは動物の種々の疾患に対する治療、予防に広く利用されている。
【０００３】
これらポリペプチドは、生体内での半減期が短いこと、経口投与により消化管から吸収させるのが困難なことなどから、従来、注射による多回投与が行われている。しかしながら、投与法の煩雑さ、患者への負担などの問題から、より簡便な投与方法が検討されている。
【０００４】
このような方法の一例として、経肺投与があげられる。しかしながら、経肺投与においては、ポリペプチドを肺胞内までに到達させるために、ポリペプチドを微粒子化する必要がある。
【０００５】
また、生体内分解性ポリマー中にポリペプチドを封入してマイクロスフェアとし、これを注射により生体内に埋め込み、ポリペプチドを長期にわたり生体内にデリバリーする検討も盛んに行われている。
【０００６】
このようなマイクロスフェアの製法としては、生体内分解性ポリマーを溶解させた塩化メチレン等の有機溶媒中に、ポリペプチドの水溶液を乳化してＷ／Ｏエマルションを調製し、これを水中に乳化してマイクロスフェアを得る方法が知られているが、この方法においては、ポリペプチドが変性を受け活性を失ってしまうという問題があり、一部のポリペプチドにしか適応できない。
【０００７】
この問題を回避するために、生体内分解性ポリマーを溶解させた有機溶媒中に、ポリペプチドを粉末のまま分散して油相とし、これを用いてマイクロスフェアを調製することも検討されているが、この方法においては、ポリペプチドの粒子径が大きいと、高い包含率が得られない上、溶出初期における多量放出（初期バースト現象）が生じるため、エアロゾル製剤同様、ポリペプチドを微粒子化する必要があった。
【０００８】
ポリペプチドの微粒子化方法としては、これまでに次の方法が知られている。
【０００９】
（Ｉ）ゼラチン等の水溶性高分子物質とポリペプチドを含む水溶液をスプレードライヤーにより微粒子化する方法（特開平４−３６２３３）。
【００１０】
（ＩＩ）ポリペプチドと水溶性高分子物質を含む水溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物をジェットミルにより微粉砕する方法（特開平８−２２５４５４）。
【００１１】
（ＩＩＩ）ポリペプチド水溶液をアセトン中に添加し、ポリペプチド微粒子を晶析させる方法（ジャーナル・オブ・マイクロエンカプスレーション［ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ］，１４（２）巻，２２５−２４１頁，１９９７年）。
【００１２】
（ＩＶ）界面活性剤とポリペプチドとを水中で混合し、これを急速乾燥する方法（特開平９−３１５９９７）。
【００１３】
（Ｖ）ポリペプチド水溶液に、水混和性有機溶媒もしくは揮発性塩類を添加し凍結乾燥する方法（特開平１１−３２２６３１）。
【００１４】
（ＶＩ）ポリペプチドとポリエチレングリコールの混合水溶液を凍結乾燥し、有機溶媒にてポリエチレングリコールを溶解する方法（特開平１１−３０２１５６）。
【００１５】
しかしながら、いずれの方法においても、ポリペプチドが活性を失ってしまう、回収率が低い、再分散性が悪い、調製所要時間が長い、などのいずれかの問題点があり、これらの問題点を全て解決した方法は、未だ見出されていなかった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便迅速で回収率が高く、変性を伴わずにポリペプチドを微粒子化する方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
ポリペプチドと相分離誘起剤を含有する水溶液を凍結させると、その過程において両者の間で相分離が起こり、ポリペプチド水溶液の微小液滴が相分離誘起剤の水溶液中に分散した状態の凍結物が得られる。この凍結物にポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加すると、相分離誘起剤および氷は有機溶媒中に溶解し、結果、ポリペプチド微粒子が分散液として得られることを、本発明者らは見出した。
【００１８】
本発明方法によれば、簡便迅速に高い回収率でポリペプチドの微粒子が得られる上、得られた微粒子は、高い活性を保持しており、再分散性にも優れているという特徴を有する。
【００１９】
すなわち、本発明は、ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液の凍結物に、ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加し、凍結物中の相分離誘起剤および氷を溶解することを特徴とするポリペプチド微粒子分散液の製法に関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、まずポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液（以下、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液と称す）を調製する。
【００２１】
ポリペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることができる種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該ポリペプチドは、その分子量がモノマーとして、例えば１０００〜２０００００のものが用いられ、特に好ましくは５０００〜７００００のものが汎用される。これらポリペプチドには、生化学の分野で高次構造を有すると云われるタンパク質に分類される高分子も含まれる。本発明で用いられるポリペプチドの種類は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、ある一定の水溶性を有するものが好ましく、その溶解度は水に対して、２０℃で約０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ以上である。
【００２２】
ポリペプチドの具体例としては、例えばホルモン類、酵素類、サイトカイン類、成長因子類などが挙げられる。より具体的には、例えば以下のポリペプチドが挙げられる。
【００２３】
ホルモン類としては、例えば成長ホルモン（ＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、インスリン、グルカゴン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、カルシトニンなどが挙げられる。
【００２４】
酵素類としては、例えば組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）、第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２５】
サイトカイン類としては、例えばインターフェロン類（ＩＦＮ−α，−β，−γなど）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１など）、カケクチン、オンコスタチン、コロニー刺激因子類（Ｇ−，Ｍ−，ＧＭ−ＣＳＦなど）、トロンボポエチン（ＴＰＯ），エリスロポエチン（ＥＰＯ）などが挙げられる。
【００２６】
成長因子類としては、例えば神経成長因子（ＮＧＦ−１，ＮＧＦ−２など）、神経栄養因子（ＮＴＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ−３など）、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ）、骨形成原成長因子（ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４など）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ）、軟骨誘導因子などが挙げられる。
【００２７】
これらのポリペプチドは糖鎖を有していてもよく、またその糖鎖構造が異なっていてもよい。さらに、これらはムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントなども含む。
【００２８】
本発明で用いられるポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組換え技術によって得られたものいずれでもよい。
【００２９】
また、本発明で用いられるポリペプチドとしては、金属塩であってもよく、かかる金属塩における金属としては、例えばアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）、亜鉛（II価）、鉄（II価、III価）、銅（II価）、スズ（II価、IV価）、アルミニウム（II価、III価）などが挙げられ、本明細書では、これら金属塩になっているものも含めて、ポリペプチドと称する。
【００３０】
本発明において用いられる相分離誘起剤としては、ポリペプチドおよび相分離誘起剤を高濃度で水に溶解させると（例えば、ポリペプチド２００ｍｇ／ｍｌ以上、相分離誘起剤５０ｍｇ／ｍｌ以上）、ポリペプチドに富んだ相と相分離誘起剤に富んだ相との相分離を誘起するようなものであれば特に限定されず、例えば、非ペプチド性水溶性高分子があげられる。
【００３１】
非ペプチド性の水溶性高分子としては、平均分子量４００〜２０００００、好ましくは６０００〜７００００のものが好適に使用でき、このような非ペプチド性水溶性高分子の具体例としては、ポリオキシエチレン類、セルロース誘導体、ポリビニル誘導体、シクロデキストリン誘導体などがあげられる。
【００３２】
ポリオキシエチレン類としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどがあげられる。
【００３３】
セルロース誘導体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどがあげられる。
【００３４】
ポリビニル誘導体としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどがあげられる。
【００３５】
シクロデキストリン誘導体としては、ジメチル−β−シクロデキストリンなどがあげられる。
【００３６】
中でもとりわけ好ましい相分離誘起剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンがあげられ、最も好ましくは、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールとしては、平均分子量４００〜２０００００の範囲内が好ましく、６０００〜７００００の範囲内が特に好ましい。
【００３７】
相分離誘起剤は、１種のみならず、２種以上を組合わせて用いてもよい。
【００３８】
ポリペプチドおよび相分離誘起剤を含有する水溶液の調製方法は、水にポリペプチド、相分離誘起剤の両者を一度に溶解させてもよいし、一方を溶解させたのちもう一方を溶解させてもよく、またポリペプチド水溶液と相分離誘起剤水溶液とを混合してもよい。要は、最終的にポリペプチドと相分離誘起剤が水に溶解していればよく、調製法はとくに制限されない。
【００３９】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液におけるポリペプチド濃度は、ポリペプチドが溶解する範囲内であれば特に限定されないが、あえて例示するとすれば、０．０１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００４０】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液における相分離誘起剤の濃度は、相分離誘起剤が溶解する範囲内であれば特に限定されないが、好ましい相分離誘起剤の濃度をあえて例示するとすれば、０．０２５〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２５〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００４１】
次いで、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させ、得られた凍結物に、ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加し、相分離誘起剤および氷を溶解させることにより、目的のポリペプチド微粒子が分散液として得られる。
【００４２】
ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させるにあたっては、水溶液の温度が急激に降下するような条件よりも、徐々に降下するような条件が好ましい。このような条件は、設定温度が−８０〜−２０℃の通常用いられる冷凍庫もしくは凍結乾燥機を用いて凍結させれば容易に達せられるが、より具体的にこのような条件を明示するとすれば、初期降温速度（冷却開始後１分当たりの水溶液の降下温度）が約２〜４０℃／分、好ましくは約１０〜３０℃／分である。
【００４３】
本発明方法の凍結過程においては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の水から最初に凝固を開始するため、非氷晶の部分においてポリペプチドおよび相分離誘起剤濃度の濃縮が起こり、その結果、ポリペプチドに富んだ相と相分離誘起剤に富んだ相との相分離が起こる。
【００４４】
この相分離現象は、相分離誘起剤に富んだ相の中にポリペプチドに富んだ相が微小液滴を形成する場合と、ポリペプチドに富んだ相の中に相分離誘起剤に富んだ相が微小液滴を形成する場合があり、どちらの相分離形態になるかは、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の相分離誘起剤／ポリペプチドの濃度比率（以下、濃度比率と称す）によって決定される。この濃度比率が、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類により決定されるある一定値（以下、転相比率と称す）以上であれば、相分離誘起剤に富んだ相の中にポリペプチドに富んだ相が微小液滴を形成することとなる。
【００４５】
一般に、濃度比率を転相比率以上にすると、より粒子径の小さな球形の微粒子が得られる。一方、濃度比率が転相比率以下の場合は、粒子は得られるものの、形状は不定形であり、粒子径もやや大きい。したがって、より粒子径の小さな微粒子、例えば、平均粒子径が１０μｍ以下の微粒子を得るには、濃度比率を転相比率以上にすることが好ましい。
【００４６】
転相比率は、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類によって変動するが、適宜、種々の濃度比率のポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を用いて微粒子を調製し、その粒子径およびその形状を調べることにより、容易に決定することができる。
【００４７】
相分離誘起剤として、平均分子量６０００以上のポリエチレングリコールを用いた場合には、転相比率がポリペプチドの分子量によってある程度推測できる。すなわち、ポリペプチドの分子量（Ｍ）と転相比率（Ｔ）との間には近似的に次の関係式
Ｔ＝１０^2.7／Ｍ^0.68
が成り立ち、上記の式において、用いるポリペプチドの分子量を代入することにより、転相比率を求めることができる。
【００４８】
上記の如く、転相比率はポリペプチド、相分離誘起剤の種類等により変動するが、平均粒子径が１０μｍ以下の微粒子が得られるような濃度比率をあえて例示するとすれば、０．２５以上、好ましくは０．５以上、より好ましくは１以上である。
【００４９】
本発明においては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液を凍結させた段階で、ポリペプチド相が相分離誘起剤相中に分散した状態となっているため、凍結物中の氷および相分離誘起剤のみを溶解することにより、ポリペプチドが微粒子として得られる。凍結物中の氷および相分離誘起剤を溶解するため、該凍結物にポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒を添加する。該有機溶媒の添加により、凍結物中の氷は、（ａ）直接有機溶媒中に溶解する場合、および（ｂ）融解して水となった後、有機溶媒中に混和する場合、が起こりうるが、本発明において氷の溶解とは、（ａ）の場合のみならず、即座に水が有機溶媒中に混和するかぎり、（ｂ）の場合も含まれる。
【００５０】
ポリペプチド非溶解性の水混和性有機溶媒としては、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液の凍結物に添加した際、ポリペプチドは溶解せず、氷および相分離誘起剤は溶解するようなものであれば特に制限されない。このような有機溶媒としては、例えば、水と完全に混和し、２０℃におけるポリペプチドの溶解度が１ｍｇ／ｍｌ以下であり、１００ｍｇ／ｍｌの相分離剤水溶液に５倍量の当該有機溶媒を添加しても相分離誘起剤が析出しないようなものであればよく、ポリペプチド、相分離誘起剤の種類に応じて適宜選択すればよい。このような有機溶媒の具体例をあえて例示するとすれば、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどの低級価アルコール類、アセトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類などの他、アセトニトリル、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどがあげられ、これらの内、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオールなどが好ましく、特に好ましくは、アセトンである。これら有機溶媒は２種以上混合して用いてもよい。
【００５１】
水混和性有機溶媒の添加量は、最終的に凍結物中の氷が水混和性有機溶媒中に溶解して形成される含水有機溶媒の含水率が、ポリペプチドを再溶解しえない含水率となるのに十分な量とする必要がある。このような量は、ポリペプチド、相分離誘起剤、水混和性有機溶媒の種類などにもよるが、通常、ポリペプチド−相分離誘起剤水溶液中の水の１〜１００倍量とすればよく、好ましくは、２〜２０倍量である。
【００５２】
本発明においては、水混和性有機溶媒の添加により、相分離誘起剤および氷を溶解させるが、有機溶媒添加後、攪拌することにより、速やかに溶解を完了することが出来る。また、攪拌下に有機溶媒を添加してもよい。攪拌は、マグネティックスターラー、プロペラ、タッチミキサー、超音波などの既知の攪拌手段を用いて行うことが出来る。
【００５３】
得られたポリペプチド微粒子分散液は、必要であれば、透析、遠心分離・洗浄、濾過・洗浄等の既知の手段を用い、分散媒の交換あるいは分散液中に溶解している相分離誘起剤および水の除去を行うこともできる。また、濾取あるいは遠心分離等の手段を用いて分散液より分散媒（水および相分離誘起剤が溶解している水混和性有機溶媒）を除去し、乾燥させることによって微粒子を粉体として取出すことも可能である。
【００５４】
得られたポリペプチド微粒子は、噴霧製剤、マイクロスフェア製剤等にすることができる。
【００５５】
噴霧製剤は、分散液から粉体として取出したポリペプチド微粒子単独で、もしくは、微粒子の分散性向上のため界面活性剤を添加して調製される。界面活性剤としては、例えば、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイルアルコール、硬化ヒマシ油誘導体などがあげられ、その配合量はポリペプチド重量に対し、０．００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲であり、好ましくは０．０５〜２％（ｗ／ｗ）である。
【００５６】
また、必要に応じ、安定化剤、賦形剤などが添加されていてもよい。安定化剤としては、人血清アルブミン、ゼラチンなどがあげられ、その配合量はポリペプチド重量の０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）が好ましい。賦形剤としては、ラクトース、マルトース、ソルビトース、トレハロース、キシロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトースなどの糖もしくは糖アルコールがあげられ、その配合量は、ポリペプチド重量に対して０．０１〜２００％（ｗ／ｗ）の範囲内であり、好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）である。
【００５７】
さらには、本来生体に存在する浸透圧維持に必要な鉱物イオン、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、クロルイオンなどが適宜配合されていてもよく、また、生体に対する刺激性を抑えるために、肺胞由来の界面活性剤も必要に応じ配合されていてもよい。
【００５８】
このように調製された噴霧製剤用ポリペプチド組成物は、そのまま、あるいは圧縮空気、圧縮炭酸ガスなどを噴霧ガスとして、またあるいは適当なプロペラント中に分散して、口腔内または鼻腔内を経由して咽頭部あるいは肺内に吸入させる。使用可能なプロペラントとしては、クロロフルオロカーボン（フロン１１、１２、１１４など）、水素を含有したクロルフルオロカーボン（フロン１２３、１２４、１４１ｂなど）、塩素を含まないフルオロカーボン（フロン１２５、１３４ａなど）などがあげられる。
【００５９】
マイクロスフェア製剤とする場合には、次の方法で調製することが可能である。
【００６０】
（Ａ）噴霧乾燥法
ポリペプチド微粒子を分散させた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を、スプレーノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥機）の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に噴霧液滴内の有機溶媒を蒸発させる（特開平１−１５５９４２、特開平８−１５１３２１、特開平９−２２１４１７、ドラッグ・デベロップメント・アンド・インダストリアル・ファーマシー［ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ］，２４（８）巻，７０３〜７２７頁，１９９８年（以下、単に文献１と称す）など）
（Ｂ）相分離法（コアセルベーション法）
ポリペプチド微粒子を分散させた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、コアセルベーション剤を攪拌下徐々に加え、マイクロスフェアを析出固化させる（特開昭６０−６７４１７、特開平８−１５１３２１、特開平９−２２１４１７、前記文献１など）
（Ｃ）液中乾燥法
揮発性で水非混和性の有機溶媒に生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液にポリペプチド微粒子を分散させ、これを水相中に分散してＯ／Ｗエマルションを調製し、該有機溶媒を留去するか（特開昭４９−１２０２４、特開昭６３−９１３２５、特開平８−１５１３２１、前記文献１など）、もしくは、２種以上の生体内分解性ポリマーを、それぞれ同一または相違なる揮発性で水に混和しない有機溶媒に溶解し、一方にポリペプチド微粒子を分散させた後、両者を混合してＯ／Ｏエマルションを調製する。次いでこれを水相中に分散してＯ／Ｏ／Ｗエマルションを調製し、該有機溶媒を留去する（特開平６−２１１６４８）。
【００６１】
（Ｄ）水混和性有機溶媒を用いたマイクロスフェア調製法
ポリペプチド微粒子、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）を含むポリマー溶液を、溶媒Ａと混和する前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｂ）と溶媒Ａと混和しない前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｃ）を含む均一混合液中に添加して乳化することによりポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去することによってもマイクロスフェアを調製することができる（特願２００１−１２４４５７）。
【００６２】
（Ｄ）の方法によりマイクロスフェアを調製するにあたっては、まず、ポリペプチド微粒子、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）を含むポリマー溶液を調製する。
【００６３】
ポリマー溶液中のポリペプチド微粒子量は、０．００１〜９０重量％、好ましくは、０．０１〜５０重量％である。
【００６４】
生体内分解性ポリマーとしては、製剤分野で一般に使用される生体内分解性ポリマーをいずれも使用することができ、好ましくは、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体である。ポリマー溶液中の生体内分解性ポリマー濃度は、通常１〜８０重量％、好ましくは、２０〜６０重量％である。
【００６５】
水と混和する生体内分解性ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ）としては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに要する量が２５ｇ未満であり、水と完全に混和する性質のものであれば特に限定されず、例えば、アセトン、テトラヒドロフランが好ましく、アセトンが最も好ましい。これら溶媒は、１種のみならず、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６６】
次いで、調製したポリマー溶液を、溶媒Ａと混和する生体内分解性ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｂ）と溶媒Ａと混和しない生体内分解性ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｃ）を含む均一混合液中に添加して乳化することにより、ポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製する。
【００６７】
溶媒Ｂとしては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに２５ｇ以上要し、溶媒Ａと完全に混和するようなものであれば特に制限はなく、具体例としては、水、エタノールが好ましく、とりわけ水が好ましい。
【００６８】
また、溶媒Ｃとしては、生体内分解性ポリマー１ｇを完全に溶解するのに２５ｇ以上要し、溶媒Ｃ１００重量部に混和する溶媒Ａが２５重量部以下であり、溶媒Ｂと完全に混和して均一な混合液を形成するようなものであれば特に制限はなく、具体例としては、グリセリンがあげられる。
【００６９】
均一混合液における溶媒Ｂと溶媒Ｃとの重量比は、１０：９０〜５０：５０の範囲内が好ましく、２０：８０〜４０：６０の範囲内が最も好ましい。
【００７０】
また、該均一混合液には、乳化安定剤を含んでいてもよく、乳化安定化剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
【００７１】
溶媒Ａは、溶媒Ｂと溶媒Ｃを含む均一混合液と部分的に混和するが、混和する速度が制限されているため、薬物、生体内分解性ポリマー及び溶媒Ａを含むポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを形成することができる。そして、エマルション形成と同時に、もしくはエマルション形成と平行して、溶媒Ａが、ポリマー溶液から均一混合液へ徐々に除去され、マイクロスフェア形成も開始される。
【００７２】
ポリマー溶液と均一混合液との重量比は、好ましくは１：２〜１：２００の範囲内、とりわけ好ましくは１：３〜１：７５の範囲内である。
【００７３】
ポリマー溶液の均一混合液への乳化は、プロペラ式攪拌機、タービン型乳化機、高圧乳化機、超音波分散装置、スタティックミキサーなどの既知の乳化装置による攪拌下、ポリマー溶液を均一混合液中に添加することにより容易に実施可能である。乳化に要する時間は、用いる乳化装置、液量などによって異なるが、１〜１０分間程度である。乳化は、膜乳化、噴霧などの方法によっても好適に実施することが出来る。
【００７４】
乳化後、得られたエマルションを適当な方法で流動させ、分散相より残りの溶媒Ａを除去する。これにより、分散相の溶媒Ａが連続相へ除去され、分散相の生体内分解性ポリマーが完全に固化し、マイクロスフェアが得られる。
【００７５】
流動の方法は、循環または攪拌によって行うことができる。循環は、ポンプを用いて、エマルションの下部よりエマルションの一部を吸引し、パイプを通してこれをエマルションの上部に戻すことにより行うことが出来る。攪拌は、攪拌翼、マグネチックスターラーなどの通常の攪拌手段により行うことができる。
【００７６】
また、乳化後、一旦形成されたエマルションの連続相を増量すれば、分散相からの溶媒Ａの除去を促進でき、加えて、増量により、乳化中に連続相へ除去された溶媒Ａを希釈できるため、連続相中の溶媒Ａが形成段階のマイクロスフェアに悪影響を及ぼすことも防止できる。
【００７７】
更に、乳化後、エマルションの分散相から残った溶媒Ａを除去する際、加温、減圧等を行えば、溶媒Ａの除去を更に促進することができる。
【００７８】
得られたマイクロスフェアは遠心分離または濾過などの方法により分取し、蒸留水にて洗浄を行い、風乾または真空乾燥などにより溶媒を完全に除去すればよい。
【００７９】
上記（Ａ）〜（Ｄ）など、各方法により得られたマイクロスフェアは、そのまま埋込剤として生体に投与することができる。また、種々の製剤を製造する際の原料としても用いることができる。そのような製剤としては、例えば注射剤、経口投与剤、経皮投与剤、坐剤、経鼻投与剤、口腔投与剤および眼内投与剤などがあげられる。
【００８０】
以下、実施例により、更に本発明を詳細に説明する。
【００８１】
【実施例】
実施例１
（１）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、分子量６７０００、シグマ製）濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００（ポリエチレングリコール６０００、平均分子量７５００、和光純薬製）濃度０〜７０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡの濃度比率が０〜７）をそれぞれ１ｍｌずつ調製した。
【００８２】
（２）これら水溶液を−２０℃で凍結させた後、−２０℃で予め冷却しておいたアセトン５ｍｌを添加し、室温においてタッチミキサーを用いて攪拌を行い、ＰＥＧ６０００および氷をアセトン中に溶解させ、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、アセトン２ｍｌを添加しＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００８３】
（３）レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−１１００、島津製作所製）を用い、（２）で得られた分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）中の微粒子の平均粒子径を測定し、結果を図１に示した。ＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液の濃度比率（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡ）が０．２５以上において、平均粒子径が約１０μｍ以下の微粒子が得られた。
【００８４】
（４）（２）で得られたＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を除去後、１晩減圧乾燥を行いＢＳＡ微粒子を乾燥粉末として回収した。
【００８５】
（５）（４）で得られたＢＳＡ微粒子（濃度比率３）の電子顕微鏡写真を図２に示す。図２より、本発明により得られたＢＳＡ微粒子は、球形であることがわかる。
【００８６】
（６）（４）で得られたＢＳＡ微粒子（濃度比率３）をアセトンに分散したところ、速やかに再分散した。再分散したＢＳＡ微粒子の平均粒子径は２．８５μｍであり、減圧乾燥前、すなわち（２）で得られた微粒子分散液時（２．０９μｍ）とほぼ同程度であった。また、粒度分布も減圧乾燥前後でほとんど変化なかった（図３）。
【００８７】
実施例２
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ１０００（ポリエチレングリコール１０００、分子量９５０〜１０５０、日本油脂製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ１０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．５０μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ１０００および水除去済）を得た。
【００８８】
実施例３
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール２０００、分子量１８００〜２２００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ２０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．０６μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ２０００および水除去済）を得た。
【００８９】
実施例４
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール４０００、分子量２７００〜３４００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ４０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．５８μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ４０００および水除去済）を得た。
【００９０】
実施例５
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール２００００、平均分子量１９０００、片山化学製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ２００００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．３３μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ２００００および水除去済）を得た。
【００９１】
実施例６
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ７００００（ポリエチレングリコール７００００、平均分子量７００００、和光純薬製）濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ７００００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．３０μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ７００００および水除去済）を得た。
【００９２】
実施例７
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、アセトンに代えてメタノールを用いた以外は実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．９６μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００９３】
実施例８
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、アセトンに代えてエタノールを用いた以外は実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．７２μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。
【００９４】
実施例９
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレン（平均重合度約１６０）−ポリオキシプロピレン（平均重合度約３０）共重合物、分子量５９００〜１２５００、旭電化工業製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．１５μｍのＢＳＡ微粒子分散液（プルロニックＦ６８および水除去済）を得た。
【００９５】
実施例１０
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＨＰＣ−ＳＬ（ヒドロキシプロピルセルロース、日本曹達製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径３．６９μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ＨＰＣ−ＳＬおよび水除去済）を得た。
【００９６】
実施例１１
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、コリドンＫ３０（ポリビニルピロリドン、平均分子量４００００、ＢＡＳＦ製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．７２μｍのＢＳＡ微粒子分散液（コリドンＫ３０および水除去済）を得た。
【００９７】
実施例１２
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ジメチル−β−シクロデキストリン（ナカライテスク製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径９．２４μｍのＢＳＡ微粒子分散液（ジメチル−β−シクロデキストリンおよび水除去済）を得た。
【００９８】
実施例１３
ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、和光純薬製）濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径４．７７μｍのＢＳＡ微粒子分散液（Ｔｗｅｅｎ２０および水除去済）を得た。
【００９９】
実施例１４
ＨＲＰ（わさびペルオキシダーゼ、分子量約４００００、和光純薬製）濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度１００ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率１０）を１ｍｌ調製し、実施例１（２）と同様の操作を行い、平均粒子径２．４２μｍのＨＲＰ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、室温下、３時間減圧乾燥を行い、ＨＲＰ微粒子を乾燥粉末として回収した。
【０１００】
スミロン「ペルオキシダーゼ用発色キットＯ」（住友ベークライト製）を用いて、ＨＲＰ微粒子の活性を測定したところ、ほぼ１００％活性が保持されていた。
【０１０１】
実施例１５
（１）ＢＳＡ２００ｍｇを水１４ｍｌに溶解し、これに１０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００水溶液６ｍｌを添加・混合した後、−２０℃で凍結した。−２０℃で予め冷却しておいたアセトン１００ｍｌを添加し、室温においてマグネチックスターラーを用いて攪拌を行い、ＰＥＧ６０００および水（氷）をアセトン中に溶解させ、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、さらにアセトン４０ｍｌを添加して遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去して１晩減圧乾燥し、平均粒子径４．１５μｍのＢＳＡ微粒子１９５．１ｍｇを乾燥粉末として得た。
【０１０２】
（２）得られたＢＳＡ微粒子２５ｍｇを塩化メチレン１３５０ｍｇに分散させた後、ＰＬＧＡ５０２０（乳酸−グリコール酸コポリマー、平均分子量２００００、乳酸／グリコール酸のモル比が５０／５０、和光純薬製）４７５ｍｇを添加・溶解させた。これを、１５℃の０．２５％（ｗ／ｗ）メチルセルロース（メトローズＳＭ−４０００、信越化学製）水溶液４ｍｌ中に添加し、ポリトロンホモジナイザー（キネマティカ・アーゲー・リタウ製、８０００ｒｐｍ、３分間）を用いて乳化した。得られたエマルションを１５℃、４００ｍｌの水中に添加し、プロペラ式攪拌機（スリーワンモーターＢＬ６００、ヘイドン製、４００ｒｐｍ）で攪拌しながら、３時間かけて３０℃まで昇温して液中乾燥を行い、マイクロスフェアを形成させた。得られたマイクロスフェア分散液を、目開き１５０μｍのフィルターで濾過し、さらに目開き２０μｍのフィルターでマイクロスフェアを濾取し、これを凍結乾燥した。
【０１０３】
（３）得られたマイクロスフェアのＢＳＡ取込率を、ミクロＢＣＡタンパク定量キット（ＰＩＥＲＣＥ製）にて測定したところ、仕込量の８４．９％のＢＳＡがマイクロスフェア中に包含された。
【０１０４】
（４）マイクロスフェア１０ｍｇを栓付き試験管に入れ、ＰＢＳ（９．６ｍＭリン酸化生理食塩水）１０ｍｌを添加し、回転培養器（タイテック製、２５ｒｐｍ、３７℃）を用いて溶出試験を行った。経時的に試験管を回転培養器から取出し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行って上清９ｍｌを採取し、新たにＰＢＳ９ｍｌを添加して溶出試験を継続した。採取した上清中のＢＳＡ量をミクロＢＣＡタンパク定量キットにて測定し、マイクロスフェアより放出されたＢＳＡ量を求めた。結果を図４に示した。
【０１０５】
実施例１６
実施例１５（１）で得られたＢＳＡ微粒子２５ｍｇをアセトン８００ｍｇに分散させた後、ＰＬＧＡ５０２０（乳酸−グリコール酸コポリマー、平均分子量２００００、乳酸／グリコール酸のモル比が５０／５０、和光純薬製）４７５ｍｇを添加・溶解させ、ポリマー溶液を調製した。これを、ポリビニルアルコール（１．０重量％）を含有させたグリセリン−水混合液（グリセリンと水の重量比が７０：３０）４ｇ中に添加し、プロペラ式攪拌機（スリーワンモーターＢＬ６００、ヘイドン製、１５００ｒｐｍ、３分間）を用いて乳化し、ポリマー溶液を分散相、グリセリン−水混合液を連続相とするエマルションを得た。このエマルションをグリセリン−水混合液（グリセリンと水の重量比が７０：３０）１４ｇ中に添加し、マグネチックスターラーにて２．５時間攪拌し、さらに水１０ｍｌを添加して０．５時間攪拌し、アセトンをエマルションの分散相から除去し、マイクロスフェアの分散液を得た。この分散液を１５０μｍのフィルターで濾過し、さらに２０μｍのフィルターでマイクロスフェアを濾取した後、凍結乾燥を行い、マイクロスフェアを回収した。
【０１０６】
得られたマイクロスフェアのＢＳＡ取込率を、実施例１５（３）と同様の方法で測定したところ、仕込量の７９．１％のＢＳＡがマイクロスフェア中に包含された。
【０１０７】
比較例
（１）ＢＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ６０００濃度３０ｍｇ／ｍｌの水溶液（濃度比率３）を１ｍｌ調製した。−２０℃で予め冷却しておいたアセトン５ｍｌを添加し、室温においてタッチミキサーを用い攪拌し、ＢＳＡ微粒子分散液を得た。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を除去した後、アセトン２ｍｌを添加しＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を得た。得られた微粒子の平均粒子径は、２．５８μｍであった。
【０１０８】
（２）（１）で得られたＢＳＡ微粒子分散液（ＰＥＧ６０００および水除去済）を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を除去後、１晩減圧乾燥を行いＢＳＡ微粒子を乾燥粉末として得た。
【０１０９】
（３）得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真を図５に示す。図５より、凍結処理を行わないと、球形微粒子が得られないことがわかる。
【０１１０】
さらに、得られたＢＳＡ微粒子のアセトンへの分散を試みたが、全く分散しなかった。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便迅速に、失活を伴うことなくポリペプチドを微粒子化することができ、得られたポリペプチド微粒子は、非常に高純度であり、再分散性も良好である。
【０１１２】
また、本発明方法は、微粒子回収時にほとんどロスが生じることはないので、回収率はほぼ１００％である。
【０１１３】
さらに、本発明により得られたポリペプチド微粒子を用いれば、長期間にわたりポリペプチドを一定の速度で放出でき、かつ初期バースト率の非常に低い高含量マイクロスフェア製剤が容易に得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＳＡ−ＰＥＧ６０００水溶液の濃度比率（ＰＥＧ６０００／ＢＳＡ）と、得られたＢＳＡ微粒子粒子径との関係を示すグラフ。
【図２】本発明方法（実施例１）により得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真。
【図３】本発明方法により得られたＢＳＡ微粒子分散液、およびそれから粉末として取り出したＢＳＡ微粒子を再分散させた分散液におけるＢＳＡ微粒子の粒度分布を示すグラフ。
【図４】本発明方法により得られたＢＳＡ微粒子を用いて調製したマイクロスフェア（実施例１５）の溶出試験結果を示すグラフ。
【図５】比較対照方法（比較例１）により得られたＢＳＡ微粒子の電子顕微鏡写真。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for micronizing a polypeptide.
[0002]
[Prior art]
In recent years, polypeptides having physiological activity have been widely used for the treatment and prevention of various diseases in humans or animals.
[0003]
These polypeptides have been conventionally administered multiple times by injection because of their short half-life in vivo and difficulty in absorption from the digestive tract by oral administration. However, simpler administration methods have been studied due to problems such as complicated administration methods and burdens on patients.
[0004]
An example of such a method is transpulmonary administration. However, in pulmonary administration, it is necessary to make the polypeptide fine particles in order to reach the polypeptide into the alveoli.
[0005]
In addition, studies have been actively conducted in which a polypeptide is encapsulated in a biodegradable polymer to form a microsphere, which is embedded in the living body by injection, and the polypeptide is delivered into the living body over a long period of time.
[0006]
As a method for producing such a microsphere, an aqueous solution of a polypeptide is emulsified in an organic solvent such as methylene chloride in which a biodegradable polymer is dissolved to prepare a W / O emulsion, and this is emulsified in water. A method for obtaining microspheres is known, but in this method, there is a problem that the polypeptide loses its activity due to denaturation, and it can be applied only to some polypeptides.
[0007]
In order to avoid this problem, it has also been studied to prepare a microsphere by using a polypeptide dispersed in an organic solvent in which a biodegradable polymer is dissolved to form an oil phase. However, in this method, if the particle size of the polypeptide is large, a high inclusion rate cannot be obtained, and a large amount of release (initial burst phenomenon) occurs at the early stage of elution, so it is necessary to make the polypeptide into fine particles as in the case of the aerosol preparation. was there.
[0008]
The following methods are known so far as methods for micronizing a polypeptide.
[0009]
(I) A method in which an aqueous solution containing a water-soluble polymer substance such as gelatin and a polypeptide is made into fine particles by a spray dryer (Japanese Patent Laid-Open No. 4-36233).
[0010]
(II) A method in which an aqueous solution containing a polypeptide and a water-soluble polymer substance is freeze-dried, and the resulting freeze-dried product is finely pulverized by a jet mill (Japanese Patent Laid-Open No. 8-225454).
[0011]
(III) Method of adding polypeptide aqueous solution to acetone to crystallize polypeptide fine particles (Journal of Microencapsulation, 14 (2), 225-241, 1997) .
[0012]
(IV) A method in which a surfactant and a polypeptide are mixed in water and rapidly dried (JP-A-9-315997).
[0013]
(V) A method in which a water-miscible organic solvent or volatile salt is added to an aqueous polypeptide solution and freeze-dried (Japanese Patent Laid-Open No. 11-326331).
[0014]
(VI) A method of freeze-drying a mixed aqueous solution of a polypeptide and polyethylene glycol and dissolving polyethylene glycol in an organic solvent (Japanese Patent Laid-Open No. 11-302156).
[0015]
However, in any of the methods, the polypeptide loses its activity, has a low recovery rate, poor redispersibility, and requires a long preparation time. No solution has yet been found.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for making a polypeptide into microparticles without denaturation, which is simple and rapid, has a high recovery rate, and is not a problem.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
When an aqueous solution containing a polypeptide and a phase separation inducer is frozen, phase separation occurs between the two in the process, and a frozen product in which microdroplets of the polypeptide aqueous solution are dispersed in the aqueous solution of the phase separation inducer Is obtained. When the polypeptide-insoluble water-miscible organic solvent is added to the frozen product, the phase separation inducer and ice are dissolved in the organic solvent, and as a result, the polypeptide microparticles are obtained as a dispersion. Found.
[0018]
According to the method of the present invention, polypeptide microparticles can be obtained simply and quickly at a high recovery rate, and the obtained microparticles have the characteristics of maintaining high activity and excellent redispersibility.
[0019]
That is, the present invention adds a water-miscible organic solvent that is insoluble in a polypeptide to a frozen product of an aqueous solution containing a polypeptide and a phase separation inducer, and dissolves the phase separation inducer and ice in the frozen product. The present invention relates to a method for producing a polypeptide fine particle dispersion.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, first, an aqueous solution containing a polypeptide and a phase separation inducer (hereinafter referred to as a polypeptide-phase separation inducer aqueous solution) is prepared.
[0021]
Polypeptides include various peptides or proteins that have physiological activity useful for mammals and can be used clinically. The polypeptide has a molecular weight of, for example, 1,000 to 200,000 as a monomer, particularly preferably 5000 to 70000. These polypeptides also include macromolecules classified as proteins that are said to have a higher order structure in the field of biochemistry. The type of polypeptide used in the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved, but preferably has a certain water solubility, and its solubility in water is about 0.00 at 20 ° C. 01 mg / ml or more, preferably about 1 mg / ml or more.
[0022]
Specific examples of the polypeptide include hormones, enzymes, cytokines, growth factors and the like. More specifically, for example, the following polypeptides can be mentioned.
[0023]
Examples of hormones include growth hormone (GH), growth hormone releasing factor (GRF), insulin, glucagon, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), thyroid stimulating hormone (TSH), follicle stimulating hormone (FSH), Examples include luteinizing hormone (LH), human chorionic gonadotropin (hCG), and calcitonin.
[0024]
Examples of enzymes include tissue plasminogen activator (tPA), urokinase (UK), streptokinase, protein C, metalloproteases, superoxide dismutase (SOD), factor VIII and IX, peroxidase and the like. .
[0025]
Examples of cytokines include interferons (IFN-α, -β, -γ, etc.), interleukins (IL-1, IL-11, etc.), cachectin, oncostatin, and colony stimulating factors (G-, M-). , GM-CSF, etc.), thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO) and the like.
[0026]
Examples of growth factors include nerve growth factor (NGF-1, NGF-2, etc.), neurotrophic factor (NTF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF) -1, IGF-2, IGF-3, etc.), fibroblast growth factor (aFGF, bFGF), osteogenic growth factor (BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, etc.), atrial Examples include natriuretic factor (ANP) and cartilage inducing factor.
[0027]
These polypeptides may have a sugar chain, and their sugar chain structures may be different. In addition, these include muteins, derivatives, analogs and active fragments.
[0028]
The polypeptide used in the present invention may be either naturally derived or obtained by gene recombination techniques.
[0029]
The polypeptide used in the present invention may be a metal salt. Examples of the metal in such a metal salt include alkaline earth metals (for example, calcium and magnesium), zinc (II), iron ( II (valent, III), copper (II), tin (II, IV), aluminum (II, III), etc. In this specification, including these metal salts And referred to as a polypeptide.
[0030]
As the phase separation inducer used in the present invention, when the polypeptide and the phase separation inducer are dissolved in water at a high concentration (for example, polypeptide 200 mg / ml or more, phase separation inducer 50 mg / ml or more), the polypeptide The phase is not particularly limited as long as it induces phase separation between the phase rich in the phase and the phase rich in the phase separation inducer, and examples thereof include non-peptide water-soluble polymers.
[0031]
As the non-peptide water-soluble polymer, those having an average molecular weight of 400 to 200,000, preferably 6000 to 70000 can be suitably used. Specific examples of such non-peptide water-soluble polymers include polyoxyethylenes. , Cellulose derivatives, polyvinyl derivatives, cyclodextrin derivatives and the like.
[0032]
Examples of polyoxyethylenes include polyethylene glycol, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester.
[0033]
Examples of the cellulose derivative include hydroxypropyl cellulose.
[0034]
Examples of the polyvinyl derivative include polyvinyl pyrrolidone and polyvinyl alcohol.
[0035]
Examples of the cyclodextrin derivative include dimethyl-β-cyclodextrin.
[0036]
Among them, particularly preferable phase separation inducers include polyethylene glycol and polyvinyl pyrrolidone, and most preferably polyethylene glycol. The polyethylene glycol is preferably in the range of an average molecular weight of 400 to 200000, particularly preferably in the range of 6000 to 70000.
[0037]
The phase separation inducer may be used alone or in combination of two or more.
[0038]
The method for preparing an aqueous solution containing a polypeptide and a phase separation inducer may be to dissolve both the polypeptide and the phase separation inducer in water at once, or after dissolving one after the other. Alternatively, an aqueous polypeptide solution and an aqueous phase separation inducer solution may be mixed. In short, it is sufficient that the polypeptide and the phase separation inducer are finally dissolved in water, and the preparation method is not particularly limited.
[0039]
The polypeptide concentration in the polypeptide-phase separation inducer aqueous solution is not particularly limited as long as it is within the range in which the polypeptide dissolves, but if exemplified, it is 0.01 to 200 mg / ml, preferably 1 to 100 mg / ml. It is.
[0040]
The concentration of the phase separation inducing agent in the polypeptide-phase separation inducing agent aqueous solution is not particularly limited as long as the phase separation inducing agent is in a range that dissolves. 025 to 200 mg / ml, preferably 0.25 to 100 mg / ml.
[0041]
Next, the polypeptide-phase separation inducer aqueous solution is frozen, and the obtained frozen product is added with a polypeptide-insoluble water-miscible organic solvent to dissolve the phase separation inducer and ice. Polypeptide microparticles are obtained as a dispersion.
[0042]
In freezing the polypeptide-phase separation inducer aqueous solution, conditions under which the temperature of the aqueous solution gradually decreases are preferable to conditions under which the temperature of the aqueous solution decreases rapidly. Such conditions can be easily achieved by freezing using a normally used freezer or freeze dryer having a set temperature of −80 to −20 ° C. However, if such conditions are specified more specifically, The initial temperature drop rate (the temperature at which the aqueous solution drops per minute after the start of cooling) is about 2 to 40 ° C./min, preferably about 10 to 30 ° C./min.
[0043]
In the freezing process of the method of the present invention, since the coagulation is first started from water in the aqueous solution of the polypeptide-phase separation inducer, the concentration of the polypeptide and the phase separation inducer occurs in the non-ice crystal part. Phase separation occurs between the polypeptide-rich phase and the phase-separation inducer-rich phase.
[0044]
This phase separation phenomenon occurs when a phase rich in polypeptide forms a microdroplet in a phase rich in phase separation inducer and in a phase rich in phase separation inducer in a phase rich in polypeptide. May form microdroplets, which phase separation form is determined by the phase separation inducer / polypeptide concentration ratio (hereinafter referred to as the concentration ratio) in the aqueous polypeptide-phase separation inducer solution. It is determined. If this concentration ratio is equal to or greater than a certain value determined by the type of polypeptide and phase separation inducer (hereinafter referred to as phase inversion ratio), the phase rich in phase separation inducer is rich in polypeptide. The phase will form microdroplets.
[0045]
Generally, when the concentration ratio is greater than or equal to the phase inversion ratio, spherical fine particles having a smaller particle diameter can be obtained. On the other hand, when the concentration ratio is equal to or less than the phase inversion ratio, particles are obtained, but the shape is indefinite and the particle diameter is slightly large. Therefore, in order to obtain fine particles having a smaller particle size, for example, fine particles having an average particle size of 10 μm or less, it is preferable that the concentration ratio is not less than the phase inversion ratio.
[0046]
Although the phase inversion ratio varies depending on the type of polypeptide and phase separation inducer, microparticles are appropriately prepared using aqueous solutions of the polypeptide-phase separation inducer having various concentration ratios, and the particle diameter and shape thereof are examined. Therefore, it can be easily determined.
[0047]
When polyethylene glycol having an average molecular weight of 6000 or more is used as the phase separation inducer, the phase inversion ratio can be estimated to some extent from the molecular weight of the polypeptide. That is, the following relational expression is approximately between the molecular weight (M) of the polypeptide and the phase inversion ratio (T).
T = 10^2.7/ M^0.68
Thus, the phase inversion ratio can be obtained by substituting the molecular weight of the polypeptide to be used in the above formula.
[0048]
As described above, the phase inversion ratio varies depending on the type of polypeptide, phase separation inducer, and the like, but if the concentration ratio is such that fine particles having an average particle diameter of 10 μm or less can be obtained, 0.25 or more, Preferably it is 0.5 or more, more preferably 1 or more.
[0049]
In the present invention, since the polypeptide phase is dispersed in the phase separation inducer phase when the polypeptide-phase separation inducer aqueous solution is frozen, ice in the frozen substance and the phase separation inducer By dissolving only the polypeptide, the polypeptide is obtained as fine particles. In order to dissolve the ice and the phase separation inducer in the frozen product, a polypeptide-insoluble water-miscible organic solvent is added to the frozen product. Due to the addition of the organic solvent, ice in the frozen product can occur when (a) it is directly dissolved in the organic solvent, and (b) when it is melted into water and then mixed into the organic solvent. However, the dissolution of ice in the present invention includes not only the case of (a) but also the case of (b) as long as water is immediately mixed in the organic solvent.
[0050]
Polypeptide-insoluble water-miscible organic solvents are those in which the polypeptide does not dissolve and the ice and phase separation inducer dissolve when added to a frozen product of the polypeptide-phase separation inducer aqueous solution. If there is no particular limitation. As such an organic solvent, for example, the solubility of the polypeptide at 20 ° C. is 1 mg / ml or less, and 5 times the amount of the organic solvent is added to a 100 mg / ml aqueous phase separator solution. Even so long as it does not precipitate the phase separation inducer, it may be appropriately selected according to the type of polypeptide and phase separation inducer. Specific examples of such an organic solvent include, for example, lower alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 2-methyl-2,4-pentanediol, and ketones such as acetone. And ethers such as tetrahydrofuran and dioxane, as well as acetonitrile, pyridine, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like. Among these, acetone, acetonitrile, methanol, ethanol, 2-methyl-2,4-pentanediol and the like Is preferable, and acetone is particularly preferable. Two or more of these organic solvents may be used in combination.
[0051]
The amount of water-miscible organic solvent added is determined by the water content of the water-containing organic solvent that is formed when the ice in the frozen product is finally dissolved in the water-miscible organic solvent. The amount needs to be sufficient. Such amount depends on the type of polypeptide, phase separation inducer, water-miscible organic solvent, etc., but is usually 1 to 100 times the amount of water in the aqueous polypeptide-phase separation inducer solution. The amount is preferably 2 to 20 times.
[0052]
In the present invention, the phase separation inducer and ice are dissolved by the addition of a water-miscible organic solvent, but the dissolution can be completed quickly by stirring after the addition of the organic solvent. Moreover, you may add an organic solvent under stirring. Stirring can be performed using known stirring means such as a magnetic stirrer, propeller, touch mixer, and ultrasonic wave.
[0053]
If necessary, the obtained polypeptide fine particle dispersion may be exchanged with a dispersion medium or dissolved in the dispersion using known means such as dialysis, centrifugation / washing, filtration / washing, etc. It is also possible to remove water. Further, the dispersion medium (water-miscible organic solvent in which water and the phase separation inducing agent are dissolved) is removed from the dispersion using means such as filtration or centrifugation, and the fine particles are taken out as a powder by drying. It is also possible.
[0054]
The resulting polypeptide microparticles can be made into spray formulations, microsphere formulations, and the like.
[0055]
The spray preparation is prepared by polypeptide fine particles taken out as a powder from the dispersion, or by adding a surfactant to improve the dispersibility of the fine particles. Examples of the surfactant include sorbitan trioleate, soybean lecithin, oleyl alcohol, hardened castor oil derivative, and the blending amount is in the range of 0.001 to 5% (w / w) based on the weight of the polypeptide. And preferably 0.05 to 2% (w / w).
[0056]
Moreover, stabilizers, excipients and the like may be added as necessary. Examples of the stabilizer include human serum albumin and gelatin, and the blending amount is preferably 0.01 to 200% (w / w) of the polypeptide weight. Examples of the excipient include sugars or sugar alcohols such as lactose, maltose, sorbitol, trehalose, xylose, mannitol, sorbitol, xylitol, and the blending amount is 0.01 to 200% (w / W), preferably 1 to 50% (w / w).
[0057]
Furthermore, mineral ions originally necessary for maintaining the osmotic pressure present in the living body, for example, calcium ions, magnesium ions, sodium ions, potassium ions, chloro ions, etc., may be blended as appropriate, and also provide stimulating properties to the living body. In order to suppress it, an alveolar-derived surfactant may be blended as necessary.
[0058]
The thus-prepared polypeptide composition for spray preparation is used as it is, or as compressed air, compressed carbon dioxide gas or the like as a spray gas, or dispersed in an appropriate propellant and passed through the oral cavity or nasal cavity. Inhaled into the pharynx or lungs. Propellants that can be used include chlorofluorocarbons (chlorofluorocarbons 11, 12, 114, etc.), chlorofluorocarbons containing hydrogen (fluorocarbons 123, 124, 141b, etc.), fluorocarbons not containing chlorine (fluorocarbons 125, 134a, etc.) can give.
[0059]
In the case of a microsphere preparation, it can be prepared by the following method.
[0060]
(A) Spray drying method
The organic solvent solution of biodegradable polymer in which fine polypeptide particles are dispersed is sprayed into the drying chamber of a spray dryer (spray dryer) using a spray nozzle, and the organic solvent in the spray droplets is evaporated in a very short time. (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-155942, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-151321, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-221417, Drug Development and Industrial Pharmacy, 24 (8), 703-727, 1998. (Hereafter, simply referred to as Document 1))
(B) Phase separation method (coacervation method)
A coacervation agent is gradually added with stirring to an organic solvent solution of a biodegradable polymer in which polypeptide microparticles are dispersed to precipitate and solidify microspheres (Japanese Patent Laid-Open No. 60-67417, Japanese Patent Laid-Open No. 8-151321, (Kaihei 9-22417, the literature 1 etc.)
(C) In-liquid drying method
Polypeptide fine particles are dispersed in a solution in which a biodegradable polymer is dissolved in a volatile, water-immiscible organic solvent, and this is dispersed in an aqueous phase to prepare an O / W emulsion. Evaporate (JP 49-12024, JP 63-91325, JP 8-151321, Reference 1 etc.) or two or more biodegradable polymers are volatilized in the same or different form. It dissolves in an organic solvent that is miscible with water and disperses polypeptide microparticles in one, and then mixes both to prepare an O / O emulsion. Next, this is dispersed in an aqueous phase to prepare an O / O / W emulsion, and the organic solvent is distilled off (JP-A-6-21648).
[0061]
(D) Microsphere preparation method using water-miscible organic solvent
The polymer solution containing the fine polymer polypeptide, biodegradable polymer and a good solvent (solvent A) of the polymer miscible with water is immiscible with the poor solvent (solvent B) of the polymer miscible with the solvent A and the solvent A. An emulsion in which a polymer solution forms a dispersed phase and a homogeneous mixture forms a continuous phase is prepared by adding and emulsifying into a homogeneous mixed solution containing a poor solvent (solvent C) of the polymer, and the solvent A is removed from the dispersed phase. The microspheres can also be prepared by this method (Japanese Patent Application No. 2001-124457).
[0062]
In preparing the microspheres by the method (D), first, a polymer solution containing polypeptide fine particles, a biodegradable polymer and a good solvent (solvent A) of the polymer miscible with water is prepared.
[0063]
The amount of polypeptide fine particles in the polymer solution is 0.001 to 90% by weight, preferably 0.01 to 50% by weight.
[0064]
As the biodegradable polymer, any biodegradable polymer generally used in the pharmaceutical field can be used, and polylactic acid and lactic acid-glycolic acid copolymer are preferable. The biodegradable polymer concentration in the polymer solution is usually 1 to 80% by weight, preferably 20 to 60% by weight.
[0065]
As a good solvent (solvent A) for a biodegradable polymer that is miscible with water, the amount required to completely dissolve 1 g of the biodegradable polymer is less than 25 g, and has a property of being completely miscible with water. If it is, it will not specifically limit, For example, acetone and tetrahydrofuran are preferable and acetone is the most preferable. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
[0066]
Next, the prepared polymer solution is placed in a homogeneous mixed solution containing a biodegradable polymer poor solvent (solvent B) miscible with solvent A and a biodegradable polymer poor solvent (solvent C) immiscible with solvent A. By adding and emulsifying, an emulsion is prepared in which the polymer solution forms a dispersed phase and the uniform mixed solution forms a continuous phase.
[0067]
The solvent B is 25 g or more in order to completely dissolve 1 g of the biodegradable polymer, and is not particularly limited as long as it is completely miscible with the solvent A. Specific examples include water and ethanol. Water is particularly preferable.
[0068]
Further, as solvent C, 25 g or more is required to completely dissolve 1 g of the biodegradable polymer, and the amount of solvent A mixed with 100 parts by weight of solvent C is 25 parts by weight or less. If it forms a uniform liquid mixture, there will be no restriction | limiting in particular, A glycerol is mention | raise | lifted as a specific example.
[0069]
The weight ratio of the solvent B and the solvent C in the homogeneous mixed solution is preferably within the range of 10:90 to 50:50, and most preferably within the range of 20:80 to 40:60.
[0070]
Further, the homogeneous mixed solution may contain an emulsion stabilizer, and as the emulsion stabilizer, for example, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, methylcellulose, and hydroxypropylcellulose are preferable.
[0071]
Solvent A is partially miscible with the homogeneous mixture containing solvent B and solvent C, but because the rate of incorporation is limited, the polymer solution containing the drug, biodegradable polymer and solvent A is in the dispersed phase, An emulsion in which the homogeneous mixture forms a continuous phase can be formed. Then, simultaneously with the emulsion formation or in parallel with the emulsion formation, the solvent A is gradually removed from the polymer solution into a uniform mixed solution, and microsphere formation is also started.
[0072]
The weight ratio of the polymer solution to the homogeneous mixture is preferably in the range from 1: 2 to 1: 200, particularly preferably in the range from 1: 3 to 1:75.
[0073]
Emulsification of a polymer solution into a homogeneous mixed solution is performed by adding the polymer solution to the homogeneous mixed solution while stirring with a known emulsifying device such as a propeller type agitator, a turbine type emulsifier, a high-pressure emulsifier, an ultrasonic dispersion device, or a static mixer. This can be easily implemented. The time required for emulsification varies depending on the emulsifying device used, the amount of liquid, etc., but is about 1 to 10 minutes. Emulsification can also be suitably carried out by methods such as membrane emulsification and spraying.
[0074]
After emulsification, the obtained emulsion is fluidized by an appropriate method, and the remaining solvent A is removed from the dispersed phase. As a result, the solvent A in the dispersed phase is removed to the continuous phase, the biodegradable polymer in the dispersed phase is completely solidified, and microspheres are obtained.
[0075]
The flow method can be performed by circulation or stirring. Circulation can be accomplished by using a pump to draw a portion of the emulsion from the bottom of the emulsion and return it to the top of the emulsion through a pipe. Stirring can be performed by a normal stirring means such as a stirring blade or a magnetic stirrer.
[0076]
Moreover, if the continuous phase of the emulsion once formed is increased after emulsification, the removal of the solvent A from the dispersed phase can be promoted, and in addition, the solvent A removed to the continuous phase during the emulsification can be diluted by the increase. Therefore, it is possible to prevent the solvent A in the continuous phase from adversely affecting the microspheres in the formation stage.
[0077]
Furthermore, when the solvent A remaining from the dispersed phase of the emulsion is removed after emulsification, the removal of the solvent A can be further promoted by heating, depressurization or the like.
[0078]
The obtained microspheres may be collected by a method such as centrifugation or filtration, washed with distilled water, and the solvent may be completely removed by air drying or vacuum drying.
[0079]
The microspheres obtained by each method such as the above (A) to (D) can be directly administered to a living body as an implant. It can also be used as a raw material for producing various preparations. Examples of such preparations include injections, oral administration agents, transdermal administration agents, suppositories, nasal administration agents, buccal administration agents and intraocular administration agents.
[0080]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0081]
【Example】
Example 1
(1) BSA (bovine serum albumin, molecular weight 67000, manufactured by Sigma) concentration 10 mg / ml, PEG 6000 (polyethylene glycol 6000, average molecular weight 7500, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) concentration 0-70 mg / ml BSA-PEG 6000 aqueous solution (PEG 6000 / BSA) The concentration ratio of 0 to 7) was 1 ml each.
[0082]
(2) After freezing these aqueous solutions at −20 ° C., 5 ml of acetone previously cooled at −20 ° C. was added and stirred at room temperature using a touch mixer to dissolve PEG 6000 and ice in acetone. To obtain a BSA fine particle dispersion. After centrifugation (2000 rpm, 5 minutes) and removal of the supernatant, 2 ml of acetone was added to obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed).
[0083]
(3) Using a laser diffraction particle size distribution analyzer (SALD-1100, manufactured by Shimadzu Corporation), the average particle size of the fine particles in the dispersion (PEG 6000 and water removed) obtained in (2) was measured, and the result Is shown in FIG. Fine particles having an average particle diameter of about 10 μm or less were obtained when the concentration ratio (PEG6000 / BSA) of the BSA-PEG6000 aqueous solution was 0.25 or more.
[0084]
(4) The BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed) obtained in (2) is centrifuged (2000 rpm, 5 minutes), the supernatant is removed, and then dried under reduced pressure overnight to obtain BSA fine particles as a dry powder. It was collected.
[0085]
(5) An electron micrograph of the BSA fine particles (concentration ratio 3) obtained in (4) is shown in FIG. FIG. 2 shows that the BSA fine particles obtained by the present invention are spherical.
[0086]
(6) When the BSA fine particles (concentration ratio 3) obtained in (4) were dispersed in acetone, they were quickly redispersed. The average particle size of the redispersed BSA fine particles was 2.85 μm, which was almost the same as that before the drying under reduced pressure, that is, in the fine particle dispersion obtained in (2) (2.09 μm). Also, the particle size distribution hardly changed before and after drying under reduced pressure (FIG. 3).
[0087]
Example 2
1 ml of a BSA-PEG1000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG1000 (polyethylene glycol 1000, molecular weight 950 to 1050, manufactured by NOF Corporation) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) To obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 1000 and water removed) having an average particle size of 4.50 μm.
[0088]
Example 3
1 ml of BSA-PEG2000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG2000 (polyethylene glycol 2000, molecular weight of 1800 to 2200, manufactured by Katayama Chemical) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) To obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 2000 and water removed) having an average particle size of 4.06 μm.
[0089]
Example 4
1 ml of a BSA-PEG 4000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG 4000 (polyethylene glycol 4000, molecular weight 2700-3400, manufactured by Katayama Chemical) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) To obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 4000 and water removed) having an average particle size of 2.58 μm.
[0090]
Example 5
1 ml of a BSA-PEG 20000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG 20000 (polyethylene glycol 20000, average molecular weight 19000, manufactured by Katayama Chemical) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed. And a BSA fine particle dispersion (PEG 20000 and water removed) having an average particle size of 2.33 μm was obtained.
[0091]
Example 6
1 ml of a BSA-PEG 70000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and PEG 70000 (polyethylene glycol 70000, average molecular weight 70000, Wako Pure Chemical Industries) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) To obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 70000 and water removed) having an average particle size of 2.30 μm.
[0092]
Example 7
1 ml of a BSA-PEG6000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG6000 concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed except that methanol was used instead of acetone. A BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed) having a particle size of 2.96 μm was obtained.
[0093]
Example 8
1 ml of BSA-PEG6000 aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG6000 concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed except that ethanol was used instead of acetone. A BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed) having a particle size of 2.72 μm was obtained.
[0094]
Example 9
Aqueous solution having a BSA concentration of 10 mg / ml, Pluronic F68 (polyoxyethylene (average polymerization degree of about 160) -polyoxypropylene (average polymerization degree of about 30) copolymer, molecular weight 5900-12500, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) 1 ml of (concentration ratio 3) was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed to obtain a BSA fine particle dispersion (pluronic F68 and water removed) having an average particle size of 4.15 μm.
[0095]
Example 10
1 ml of an aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and an HPC-SL (hydroxypropylcellulose; Nippon Soda Co., Ltd.) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was carried out. A 3.69 μm BSA fine particle dispersion (with HPC-SL and water removed) was obtained.
[0096]
Example 11
1 ml of an aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and Kollidon K30 (polyvinylpyrrolidone, average molecular weight 40000, manufactured by BASF) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was carried out. A BSA fine particle dispersion (corridon K30 and water removed) having a diameter of 2.72 μm was obtained.
[0097]
Example 12
1 ml of an aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a dimethyl-β-cyclodextrin (manufactured by Nacalai Tesque) concentration of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed. A BSA fine particle dispersion (with dimethyl-β-cyclodextrin and water removed) of 24 μm was obtained.
[0098]
Example 13
1 ml of an aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) of 30 mg / ml was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed. A BSA fine particle dispersion (Tween 20 and water removed) having a particle size of 4.77 μm was obtained.
[0099]
Example 14
1 ml of HRP (wasabi peroxidase, molecular weight of about 40000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) concentration 10 mg / ml, PEG 6000 concentration 100 mg / ml aqueous solution (concentration ratio 10) was prepared, and the same operation as in Example 1 (2) was performed. An HRP fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed) having a particle size of 2.42 μm was obtained. Centrifugation (2000 rpm, 5 minutes) was performed and the supernatant was removed, followed by drying under reduced pressure at room temperature for 3 hours to collect HRP fine particles as a dry powder.
[0100]
When the activity of the HRP microparticles was measured using Sumilon “Color Development Kit O for Peroxidase” (manufactured by Sumitomo Bakelite), almost 100% of the activity was retained.
[0101]
Example 15
(1) 200 mg of BSA was dissolved in 14 ml of water, and 6 ml of 10% (w / w) PEG6000 aqueous solution was added to and mixed with it, and then frozen at −20 ° C. 100 ml of acetone cooled in advance at −20 ° C. was added and stirred at room temperature using a magnetic stirrer to dissolve PEG6000 and water (ice) in acetone to obtain a BSA fine particle dispersion. After centrifugation (2000 rpm, 5 minutes) and removing the supernatant, 40 ml of acetone was further added and centrifuged (2000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed and dried under reduced pressure overnight. 195.1 mg of 4.15 μm diameter BSA fine particles were obtained as a dry powder.
[0102]
(2) After 25 mg of the obtained BSA fine particles were dispersed in 1350 mg of methylene chloride, 475 mg of PLGA5020 (lactic acid-glycolic acid copolymer, average molecular weight 20000, lactic acid / glycolic acid molar ratio 50/50, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Added and dissolved. This was added to 4 ml of an aqueous solution of 0.25% (w / w) methylcellulose (Metroses SM-4000, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) at 15 ° C., and a polytron homogenizer (manufactured by Kinematica AG Ritau, 8000 rpm, 3 minutes) was used. And emulsified. The obtained emulsion was added to 15 ° C. and 400 ml of water, and the mixture was heated to 30 ° C. over 3 hours while stirring with a propeller-type stirrer (Three-One Motor BL600, Haydon, 400 rpm). Microspheres were formed. The obtained microsphere dispersion was filtered with a filter having an opening of 150 μm, and the microspheres were further filtered with a filter having an opening of 20 μm, and this was freeze-dried.
[0103]
(3) When the BSA uptake rate of the obtained microsphere was measured with a micro BCA protein quantification kit (manufactured by PIERCE), 84.9% of the charged amount of BSA was included in the microsphere.
[0104]
(4) 10 mg of microspheres were put into a test tube with a stopper, 10 ml of PBS (9.6 mM phosphorylated physiological saline) was added, and an elution test was performed using a rotary incubator (manufactured by Tytech, 25 rpm, 37 ° C.). . The test tube was removed from the rotary incubator over time, centrifuged (2000 rpm, 5 minutes), 9 ml of the supernatant was collected, and 9 ml of PBS was newly added to continue the elution test. The amount of BSA in the collected supernatant was measured with a micro BCA protein quantification kit, and the amount of BSA released from the microsphere was determined. The results are shown in FIG.
[0105]
Example 16
After 25 mg of the BSA fine particles obtained in Example 15 (1) were dispersed in 800 mg of acetone, PLGA5020 (lactic acid-glycolic acid copolymer, average molecular weight 20000, molar ratio of lactic acid / glycolic acid 50/50, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) 475 mg was added and dissolved to prepare a polymer solution. This was added to 4 g of a glycerin-water mixed solution (the weight ratio of glycerin and water is 70:30) containing polyvinyl alcohol (1.0% by weight), and a propeller stirrer (Three-One Motor BL600, manufactured by Haydon, (1500 rpm, 3 minutes) to obtain an emulsion having a polymer solution as a dispersed phase and a glycerin-water mixture as a continuous phase. This emulsion is added to 14 g of a glycerin-water mixture (weight ratio of glycerin and water is 70:30), stirred for 2.5 hours with a magnetic stirrer, and further added with 10 ml of water and stirred for 0.5 hours. Then, acetone was removed from the dispersed phase of the emulsion to obtain a microsphere dispersion. This dispersion was filtered through a 150 μm filter, and the microspheres were further collected through a 20 μm filter, and then freeze-dried to collect the microspheres.
[0106]
When the BSA uptake rate of the obtained microsphere was measured by the same method as in Example 15 (3), 79.1% of the charged amount of BSA was included in the microsphere.
[0107]
Comparative example
(1) 1 ml of an aqueous solution (concentration ratio 3) having a BSA concentration of 10 mg / ml and a PEG6000 concentration of 30 mg / ml was prepared. 5 ml of acetone previously cooled at −20 ° C. was added and stirred at room temperature using a touch mixer to obtain a BSA fine particle dispersion. After centrifugation (2000 rpm, 5 minutes) and removal of the supernatant, 2 ml of acetone was added to obtain a BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed). The average particle diameter of the obtained fine particles was 2.58 μm.
[0108]
(2) The BSA fine particle dispersion (PEG 6000 and water removed) obtained in (1) is centrifuged (2000 rpm, 5 minutes), the supernatant is removed, and then dried under reduced pressure overnight to obtain BSA fine particles as a dry powder. Obtained.
[0109]
(3) An electron micrograph of the obtained BSA fine particles is shown in FIG. FIG. 5 shows that spherical fine particles cannot be obtained unless the freezing treatment is performed.
[0110]
Further, although the obtained BSA fine particles were tried to be dispersed in acetone, they were not dispersed at all.
[0111]
【The invention's effect】
According to the present invention, a polypeptide can be microparticulated simply and rapidly without deactivation, and the resulting polypeptide microparticles are of very high purity and have good redispersibility.
[0112]
Further, in the method of the present invention, there is almost no loss when collecting the fine particles, so the recovery rate is almost 100%.
[0113]
Furthermore, when the polypeptide microparticles obtained by the present invention are used, a high-content microsphere preparation that can release the polypeptide at a constant rate over a long period of time and has a very low initial burst rate can be easily obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between the concentration ratio of a BSA-PEG 6000 aqueous solution (PEG 6000 / BSA) and the BSA fine particle particle size obtained.
FIG. 2 is an electron micrograph of BSA fine particles obtained by the method of the present invention (Example 1).
FIG. 3 is a graph showing the particle size distribution of BSA fine particles in a BSA fine particle dispersion obtained by the method of the present invention and a dispersion obtained by redispersing BSA fine particles taken out as a powder therefrom.
FIG. 4 is a graph showing the dissolution test results of microspheres (Example 15) prepared using BSA microparticles obtained by the method of the present invention.
FIG. 5 is an electron micrograph of BSA fine particles obtained by a comparative control method (Comparative Example 1).

Claims

(1) Polypeptide and ( 2) Polyethylene glycol, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester; hydroxypropyl cellulose; polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol; and dimethyl- frozen aqueous solution containing a phase separation inducing agent is one or more selected from the group consisting of β- cyclodextrin, to the frozen product, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 2- methyl-2,4-pentanediol, acetone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, pyridine, polypeptide non soluble is one or more selected from the group consisting of dimethylformamide and dimethyl sulfoxide It was added sexual water-miscible organic solvents, preparation of polypeptides fine particle dispersion, which comprises dissolving a phase separation inducing agent and ice frozen formulations.

The method according to claim 1, wherein the polypeptide-insoluble water-miscible organic solvent is one or more selected from the group consisting of acetone, methanol and ethanol .

One or more selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester; hydroxypropylcellulose; polyvinylpyrrolidone; and dimethyl-β-cyclodextrin The method according to claim 2, wherein there are two or more kinds .

The method according to claim 3 , wherein the phase separation inducer is polyethylene glycol.

The method according to claim 4 , wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of 400 to 200,000.

The method according to claim 4 , wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of 6000 to 70000.

The method according to any one of claims 1 to 6 , wherein a concentration ratio of the phase separation inducer / polypeptide in the aqueous solution containing the polypeptide and the phase separation inducer is 0.25 or more.

The method according to claim 6 , wherein the concentration ratio of the phase separation inducer / polypeptide in the aqueous solution containing the polypeptide and the phase separation inducer is 10 ^2.7 / M ^0.68 (M: molecular weight of the polypeptide) or more.

The method according to claim 7 , wherein the polypeptide fine particles are spherical fine particles having an average particle diameter of 10 µm or less.

A method for obtaining polypeptide fine particles by removing a phase separation inducer, water and a water-miscible organic solvent from a polypeptide fine particle dispersion obtained by the method according to claim 1.

A polypeptide microparticle obtained by removing a phase separation inducer, water and a water-miscible organic solvent from a polypeptide microparticle dispersion obtained by the method according to any one of claims 1 to 9, Disperse the biodegradable polymer in a miscible organic solvent in a solution, disperse it in an aqueous phase to prepare an O / W emulsion, and distill off the water-immiscible organic solvent. A microsphere manufacturing method.

The process for producing a macrosphere according to claim 11, wherein the volatile water-immiscible organic solvent is methylene chloride.

A polypeptide microparticle obtained by removing a phase separation inducer, water and a water-miscible organic solvent from a polypeptide microparticle dispersion obtained by the method according to any one of claims 1 to 9 , a biodegradable polymer And a polymer solution containing one or two (solvent A) selected from the group consisting of acetone and tetrahydrofuran , and one or two (solvent B) and glycerin (solvent C) selected from the group consisting of water and ethanol. ) To prepare a emulsion in which the polymer solution forms a dispersed phase and the uniform mixture forms a continuous phase, and the solvent A is removed from the dispersed phase. The manufacturing method.

The method for producing a microsphere according to claim 13, wherein the solvent A is acetone and the solvent B is water.