JP3924356B2

JP3924356B2 - Diagnostic agent for autoimmune diseases

Info

Publication number: JP3924356B2
Application number: JP21891597A
Authority: JP
Inventors: 昌弘山村; 忠雄谷本; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: JPH1096730A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は疾患診断剤、とりわけ、モノクローナル抗体を用いる自己免疫疾患診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫系は、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし免疫系は、時には自己の成分を異物すなわち、自己抗原として認識し、それに反応し得る自己抗体を産生したり、それに反応し得る自己反応性Ｔ細胞を生成する場合がある。これを自己免疫と呼んでいる。一方、人類が罹患する数多くの疾患の中で、ある種の疾患の発症はこの自己免疫の成立と密接に関与していると指摘されているものがあり、これらを総称して自己免疫疾患と呼んでいる。自己免疫疾患の中には老化に伴い発症率が増すものもあり、高齢化の進む現代に於いては、自己免疫疾患を早期に発見して確実に治療することの重要性が社会的にも増してきている。
【０００３】
しかしながら自己免疫疾患は、原因や発症機序が解明され診断方法や治療方法が確立された他の多くの疾患と比較すると、その原因や発症機序については今なお不明な点が多く、自己抗体の検出に基づく診断結果が必ずしも発症と一致しない場合もある。例えば、自己免疫疾患の一病態である慢性関節リウマチの患者の７０乃至８０％において自己のＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体が検出される一方、健常者においても同じく自己抗体が検出される例も多くある。また、例えば、自己免疫疾患の別の一病態である全身性エリテマトーデスの患者の８０乃至１００％において自己の細胞核に対する自己抗体が検出される一方、健常者においても同じく自己抗体が検出される例も多くある。
【０００４】
これらのことから、自己免疫疾患の診断においては、自己抗体とは別の指標に基づいた診断結果を組み合わせて総合的に判断しなければ的確な診断ができないというのが現状であり、結果として、その診断は甚だ煩雑なものとなっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の第一の課題は、自己免疫疾患を正確かつ迅速に診断することのできる診断剤を提供することにある。
【０００６】
この発明の第二の課題は、斯かる診断剤を用いる自己免疫疾患の診断方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１、２、３及び４に示すアミノ酸配列それぞれの一部又は全部を含む蛋白質であって、かつ、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する蛋白質に、特異的なモノクローナル抗体を用いる自己免疫疾患診断剤により解決するものである。
【０００８】
この発明は、前記第二の課題を、斯かる自己免疫疾患診断剤を被験者から採取した生物学的試料に接触せしめ、その免疫反応に基づき自己免疫疾患に対する罹患の有無を診断する自己免疫疾患診断方法により解決するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質（以下、単に「当該蛋白質」ということもある。）をコリネバクテリウム死菌体とリポ多糖で予処理したマウスの肝臓より単離し、その蛋白質をコードするＤＮＡのクローニングに成功した。このマウス由来のＤＮＡとの相同性に基づいてヒト肝細胞を検索したところ、ヒト由来のＤＮＡのクローニングに成功し、その発現産物たる蛋白質には同じく免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生の誘導能が確認された。このヒト由来のＤＮＡは、配列表における配列番号６に示す塩基配列を有し、そこに併記したアミノ酸配列をコードしてなるものであった。これら知見は同じ出願人による特願平７−２６２０６２号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に開示されている。次にヒト細胞を検索したところ、ある種の細胞株が、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を産生していることを見出し、その蛋白質を単離して性質・性状を調べた。その結果この蛋白質は、先にクローニングされたヒト由来のＤＮＡの発現産物たる蛋白質のアミノ酸配列を有してなるものであることが結論された。なお、この蛋白質の部分アミノ酸配列は、例えば、配列表における配列番号１乃至４に記載されている。この知見は、同じ出願人による特願平８−６７４３４号明細書（特開平９−２８９８９６号公報）に開示されている。また本発明者らは、ヒト由来のＤＮＡを大腸菌に導入した形質転換体を用いて当該蛋白質を製造・精製し、この精製蛋白質でマウスを免疫し、そこから採取した脾細胞とマウス骨髄由来細胞株とを融合させて、ハイブリドーマを得た。このハイブリドーマより得たモノクローナル抗体は、当該蛋白質に特異的に反応することが確認された。この知見は、同じ出願人による特願平７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号公報）に開示されている。
【００１０】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質が、ある種の疾患、とりわけ、自己免疫疾患の患者から採取した生物学的試料に高値で含まれているという知見に基づくものである。すなわち、自己免疫疾患、例えば、慢性関節リウマチの患者から採取した生物学的試料には、当該蛋白質が健常者や他の疾患患者の場合より高値で含まれており、しかもその試料中に含まれる当該蛋白質の量と自己免疫疾患への罹患の有無との間には相関関係があることが判明した。この発明は、斯かる生物学的試料に含まれる当該蛋白質が、その蛋白質に特異的なモノクローナル抗体に顕著な免疫反応を示し、その免疫反応に基づき自己免疫疾患に対する罹患の有無を診断できるという知見に基づくものである。
【００１１】
この発明で用いるモノクローナル抗体は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質に特異的に反応するものであればよく、その取得方法やクラスは問わない。当該蛋白質は、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１、２、３及び４に示すアミノ酸配列を含んでなり、全体としては、通常、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）を有している。
【００１２】
この発明で用いるモノクローナル抗体は、当該蛋白質又はその抗原性フラグメントを抗原として用いることにより得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイブリドーマを作製し、これよりこの発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、これを生体内外で培養することにより得ることができる。
【００１３】
抗原となり得る当該蛋白質乃至ポリペプチドは、例えば、同じ出願人により特願平７−２６２０６２号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に開示されたように、例えば、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を培養することにより得ることができ、それらは、通常、完全精製又は部分精製した状態で使用される。抗原性フラグメントを得るには、これら完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列に基づきペプチド合成すればよい。
【００１４】
免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとともに哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、一定期間飼育する。哺乳動物に特に限定はなく、所期の抗体産生細胞が得られるかぎり、種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後述する無限増殖可能な哺乳類由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択される。用いる哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至５回に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞を得る。
【００１５】
つぎに、斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的のハイブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能な哺乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３−ＮＳ１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ１８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ９）及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）などのマウス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が用いられ、一例を挙げると、融合促進剤を含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、この状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダルベコ培地を始めとする通常一般のものを用い得るが、ウシ血清などの血清類は除いておくのが望ましい。
【００１６】
目的のハイブリドーマを選択するには、まず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至３週間培養してハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物中に分泌された抗体につき、当該蛋白質との反応性を試験する。試験には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗体を検出するための慣用の方法が用いられ、例えば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュアル』、１９９１年、講談社サイエンティフィク発行、第１０５乃至１５２頁にはそのための方法が種々詳述されている。当該蛋白質に特異的な抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法などにより、直ちにクローニングされ、単一クローン化され、この発明に用いるハイブリドーマを得る。この発明において、斯かるハイブリドーマは、１種類以上、通常は２種類以上選択され、単一クローン化された後、以下の方法によりそれぞれからモノクローナル抗体が調製されて使用される。
【００１７】
この発明で用いるモノクローナル抗体は、斯かるハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の方法が用いられ、例えば、生体外の培養培地で培養するときには、その培養物から、一方、ヒト以外の温血動物に移植して生体内で培養するときには、その腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取する。同じ出願人による特願平７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号公報）で開示されたハイブリドーマ『Ｈ−１』及び『Ｈ−２』はモノクローナル抗体の産生能が高く、しかも、生体内外における培養が容易であるという特徴がある。培養物又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて液状又は固状とする。
【００１８】
この発明の自己免疫疾患診断剤は、上記のごときモノクローナル抗体を用いるものであり、通常、標識イムノアッセイに組み込んで用いられる。個々の標識イムノアッセイとしては、標識物質として酵素を用いるエンザイム・イムノアッセイ、標識物質として放射性物質を用いるラジオ・イムノアッセイ及び標識物質として蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイを挙げることができる。これら標識イムノアッセイは現在では種々の変法が開発されて慣用となっており、いずれの方法も適宜にこの発明に適用することができる。例えば、エンザイム・イムノアッセイに関しては、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、１９８９年、東京化学同人発行、１９６乃至３４８頁等にはそのための方法が種々詳述されている。
【００１９】
これらのうちで、一般にサンドイッチ法と総称される、固相化抗体と遊離抗体を用いた方法は、検出感度、再現性、操作の簡便性の点で優れている。サンドイッチ法を適用してこの発明の自己免疫疾患診断剤を得るには、まず、２種類の互いに異なるハイブリドーマに由来するが、いずれも当該蛋白質に特異的なモノクローナル抗体が上記のようにして準備される。当該第一のモノクローナル抗体は、適宜の不溶性支持体に常法により結合せしめられ固相化抗体とされる。一方、当該第二のモノクローナル抗体は遊離抗体として用いられ、酵素、放射性物質又は蛍光物質のいずれかで常法によって標識され標識抗体とされる。このとき、当該第二のモノクローナル抗体は、標識物質によりそれ自体が標識されていてもよいし、標識物質により特異的に認識されるべく標識されていてもよい。斯かる固相化抗体と被検試料を混合の後、洗浄液により洗浄し、さらにここに標識抗体を添加し混合の後同じく洗浄し、その標識に基づき検出すれば被検試料中の当該蛋白質を検出することができる。さらに、適宜既知濃度に希釈した標準抗原たる当該蛋白質溶液を同じく処理して検量線を作成しておけば、被検試料中の当該蛋白質含量を測定することができる。同じ出願人による特願平７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号公報）で開示されたモノクローナル抗体『Ｈ−１ｍＡｂ』及び『Ｈ−２ｍＡｂ』は、そのいずれか一方を固相化抗体とし、残る一方を標識抗体としてこのサンドイッチ法を適用する場合、当該蛋白質を感度よく、定量的に、しかも再現性よく検出できるという特徴がある。なお、ここで被検試料と固相化抗体又は標識抗体との混合の順序はいずれでもよく、いずれの場合にも良好な結果を与える。またこの発明の診断剤は、当該モノクローナル抗体の他、当該モノクローナル抗体を用いて当該蛋白質の検出を実施するに必要な試薬類、例えば、洗浄液、標識の検出のための試薬、標準抗原溶液及び／又は希釈液のそれぞれを、適宜の容器に適量封入して自己免疫疾患診断用キットとしてもよい。
【００２０】
この発明の診断剤は以上のように構成されているので、当該蛋白質に特異的に反応し、顕著な免疫反応を呈し、その免疫反応に基づき、被験者から採取した生物学的試料中のごく微量の当該蛋白質をも精度よく検出し、その含量を測定することができる。しかも、この発明の診断剤は、一度に多くの試料を分析できる上に、分析に要する時間と労力が少なくて済み、しかも分析が高精度であるという特徴がある。従って、この発明の診断剤は、自己免疫疾患に対する罹患の有無を正確かつ迅速に行うのに極めて有用である。
【００２１】
以下、この発明による診断方法について説明すると、適用した標識イムノアッセイの種類にもよるが、上述したサンドイッチ法の場合には、通常、まず上述の固相化抗体と生物学的試料を接触させるべくインキュベートする。界面活性剤を含む緩衝液等の洗浄液により洗浄した後、上述の標識抗体を加えさらにインキュベートする。同じく洗浄液により洗浄の後、標識抗体をその標識に基づいて検出する。一方これとは別途に、予め、標準抗原として適宜の濃度に希釈した当該蛋白質溶液にこの発明の診断剤を適用して検量線を作成しておく。この検量線に、先の標識抗体の検出結果を内挿又は外挿すれば、生物学的試料中の当該蛋白質含量が求められる。斯くして求められた測定結果に基づき、自己免疫疾患に対する罹患の有無を診断する。疾患の種類や、用いる生物学的試料の種類にもよるが、例えば、慢性関節リウマチや成人スチル病などの自己免疫疾患においては、生物学的試料として関節液や血清を用いた場合、通常、当該蛋白質含量が１００乃至２００ｐｇ／ｍｌを越えた患者が当該疾患に罹患していると診断される。
【００２２】
生物学的試料としては、罹患時に当該蛋白質を正常時よりも多く含むものであればよく、通常、関節液、血清、尿、唾液、リンパ液、組織、汗及び糞便が用いられる。これらは必要に応じて、その可溶性画分を分離して用いてもよい。自己免疫疾患の種類にもよるが、例えば、慢性関節リウマチや成人スチル病の場合には関節液又は血清を用いるのが望ましい。
【００２３】
この発明の対象となる疾患は、自己免疫の関連する、いわゆる、自己免疫疾患全般を包含する。斯かる疾患の具体例としては、例えば、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、成人スチル病、膠原病、多発性動脈炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性進行性硬化症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、円盤状エリテマトーデス、強皮症、混合結合組織病、慢性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、グッド・パスチャー症候群、潰瘍性大腸炎、ループス腎炎、自己免疫性胃炎、自己免疫性肝炎、血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、アレルギー性疾患等が挙げられる。成人スチル病や慢性関節リウマチに対しては格別の診断確度を発揮する。
【００２４】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云うまでもない。
【００２５】
【実施例１】
〈自己免疫疾患診断剤〉
【００２６】
【実施例１−１】
〈抗原としての当該蛋白質の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを８μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭｄＮＴＰミックスを１μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを１μｌ、特願平７−２６２０６２号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に記載された方法にしたがって、ファージＤＮＡクローンから調製した配列表における配列番号６に示す塩基配列を含む組換えＤＮＡを１ｎｇ、５′−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣ−３′で表される塩基配列のセンスプライマー及び５′−ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣ−３′で表わされる塩基配列のアンチセンスプライマーの適量を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、この混合物を９４℃で１分間、４３℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを３回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。ここで用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、それぞれ配列表の配列番号６に併記したアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成したものである。センスプライマーの塩基配列は、配列表の配列番号６に併記したアミノ酸配列におけるＮ末端部分をコードする塩基配列の５′末端側上流に介在配列なく蛋白質合成の開始コドンが付加され、さらにその上流にＥｃｏＲＩ切断部位が付加された配列を有している。アンチセンスプライマーの塩基配列は、同じく配列番号６に併記したアミノ酸配列におけるＣ末端部分をコードする塩基配列の３′末端側下流に介在配列なく終止コドンが付加され、さらにその下流にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が付加された配列に完全に相補的な配列を有している。
【００２７】
ストラタジーン製『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）クローニング・キット』を用い、添付の説明書に従って操作し、このＰＣＲ産物とプラスミドベクター『ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）』を連結して組換えＤＮＡとし、これをコンピテントセル法によりストラタジーン製大腸菌株『ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ´Ｋａｎ』に導入して形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを単離した。ジデオキシ法により分析したところ、この組換えＤＮＡは、配列表の配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡを含んでなり、その５′末端のすぐ上流に介在配列なく蛋白質合成の開始コドンが付加され、さらにその上流にＥｃｏＲＩ切断部位が付加されていた。また、その３′末端のすぐ下流には介在配列なく終止コドンが付加され、さらにその下流にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位が付加されていた。この組換えＤＮＡのコードするアミノ酸配列は、配列表における配列番号６に併記したアミノ酸配列のＮ末端に蛋白質合成の開始コドンによりコードされたメチオニンが付加された配列を有するものであった。
【００２８】
そこで、常法にしたがって残りの組換えＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡライゲーション・キット・バージョン２』を使用して、得られたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片０．１μｇと予め同じ制限酵素で切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』１０ｎｇを１６℃で３０分間反応させて連結して複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』を得た。コンピテントセル法により、この組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』で大腸菌Ｙ１０９０株（ＡＴＣＣ３７１９７）を形質転換し、得られた形質転換体『ＫＧＦＨＨ２』を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、その一部に通常のＳＤＳ−アルカリ法を適用して組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』を抽出した。ジデオキシ法により分析したところ、組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』においては、配列表における配列番号６に示す塩基配列を含む『ＫＧＦＨＨ２ｃＤＮＡ』がＴａｃプロモータの下流に連結されていた。
【００２９】
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）を無菌的に調製し、先に作製した形質転換体『ＫＧＦＨＨ２』を接種し、振盪下、３７℃で１８時間種培養した。２０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮な同一培地を１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃に冷却後、上記で得た種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、同じ温度で８時間通気撹拌培養した。培養物を遠心分離して菌体を採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、超音波破砕後、遠心分離により菌体破砕物を除去し、上清を採取した。
【００３０】
この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを４０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し、遠心分離後、上清を採取した。この上清を１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解し、この溶液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）により平衡化しておいたファルマシア製疎水クロマトグラフィー用ゲル『フェニル・セファロース』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、１．５Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．６）を通液した。
【００３１】
つぎに、硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍ付近で溶出した画分を合一し、膜濃縮後、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で１８時間透析し、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ５ＰＷ』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）を通液し、塩化ナトリウム濃度０．０５Ｍ付近で溶出した画分を採取した。
【００３２】
その後、この画分を膜濃縮し、予め燐酸食塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）により平衡化しておいたファルマシア製ゲル濾過クロマトグラフィー用ゲル『スーパー・デックス７５』のカラムに負荷し、新鮮なＰＢＳを通液して溶出した分子量１８，５００ダルトン付近の画分を採取したところ、精製蛋白質を約５．２ｍｇ含む水溶液が得られた。全精製工程を通じての収率は約１０％であった。
【００３３】
同じ出願人による特願平７−２６２０６２号明細書（特開平８−１９３０９８号公報）に記載した方法に準じて分析したところ、精製蛋白質は次のような理化学的性質を有していた。すなわち、非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、分子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドを示す一方、クロマトフォーカシングすると、４．９±１．０に等電点を示した。また、そのＮ末端は、配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端にメチオニンが結合したアミノ酸配列を有していた。
【００３４】
同じ出願人による特願平８−６７４３４号明細書（特開平９−２８９８９６号公報）に記載した方法に準じてペプチド・マッピングをおこない、精製蛋白質由来の『ペプチド断片１』乃至『ペプチド断片３』のアミノ酸配列を分析した。ペプチド断片２のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合した配列を有していた。ペプチド断片１のアミノ酸配列は同じく配列番号２に示す配列を、ペプチド断片３のアミノ酸配列は同じく配列番号３及び４に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３５】
【実施例１−２】
〈ハイブリドーマの調製〉
１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に実施例１−１の方法により得た精製蛋白質を完全フロイントアジュバントとともに２０μｇ／匹の割合で注射接種した。その後、２週間おきに同一量を２回接種し、最後の接種から１週間後に同一量をさらに静脈注射し、３日後に脾臓を摘出し、分散して脾細胞を得た。
【００３６】
この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）を３７℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度３×１０⁴個／ｍｌ及び１×１０⁴個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに２００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１週間インキュベートした。
【００３７】
各ウェルにおける培養上清中に分泌された抗体につき、実施例１−１の方法により得た精製蛋白質との反応性をエンザイムイムノアッセイにより調べ、同精製蛋白質に反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマに常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、２つのハイブリドーマのクローン『Ｈ−１』及び『Ｈ−２』を得た。
【００３８】
【実施例１−３】
〈モノクローナル抗体の調製〉
実施例１−２の方法により得たハイブリドーマＨ−１及びＨ−２を、それぞれ細胞密度約１×１０⁶ 個／ｍｌになるように５％（ｖ／ｖ）ウシ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させ、培養規模を拡大しながら、５％ＣＯ₂ インキュベータ中、３７℃で培養した。所期の細胞密度に達した時点でハイブリドーマＨ−１及びＨ−２それぞれを、予めプリスタンを０．５ｍｌ／匹腹腔内注射しておいた８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１×１０⁷個／匹注射接種し、通常の方法で１週間飼育した。
【００３９】
それぞれのマウスから腹水を採取し、ＰＢＳで３倍希釈した後、硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加え、４℃で２４時間静置し、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱を２０ｍＭ燐酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ６．７）に対して４℃で一晩透析した後、予め新鮮な同一水溶液で平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラムに負荷し、濃度が２０ｍＭから３００ｍＭに直線的に上昇する燐酸二水素カリウム水溶液（ｐＨ６．７）を通液したところ、モノクローナル抗体を含む水溶液が得られた。収量はいずれも、マウス１匹当たり、約５ｍｇであった。常法にしたがって分析したところ、ハイブリドーマＨ−１から得たモノクローナル抗体『Ｈー１ｍＡｂ』はＩｇＧ₁のクラスに属していた。また、ハイブリドーマＨ−２から得たモノクローナル抗体『Ｈ−２ｍＡｂ』はＩｇＭのクラスに属していた。
【００４０】
この実施例１−３で調製したモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂ又はＨ−２ｍＡｂを用いて常法に従いウエスタン・ブロッティングを行った。発色は、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の抗マウスＩｇ抗体によった。被検試料には、実施例１−１の方法により調製した精製蛋白質及び組換え型ヒトインターロイキン１２を用いた。分子量マーカには、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）を用いた。その結果、いずれのモノクローナル抗体も精製蛋白質と特異的に免疫反応を呈し、ヒトインターロイキン１２には全く反応しなかった。このことは、この実施例１−３で調製したモノクローナル抗体が、いずれも当該蛋白質に特異的に免疫反応を呈することを裏付けている。
【００４１】
【実施例１−４】
〈自己免疫疾患診断剤〉
この発明の自己免疫疾患診断剤の１例として、この実施例１−４では、実施例１−３の方法により調製した２つのモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂ及びＨ−２ｍＡｂを用いてサンドイッチ法の一変法であるアビジン・ビオチン法により蛋白質を検出する自己免疫疾患診断剤を作製した。すなわち、常法にしたがって、実施例１−３の方法により調製したモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂをＰＢＳに２０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注した。マイクロプレートを室温下で３時間インキュベートした後、抗体溶液を除き、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置した。その後、マイクロプレートから当該ＰＢＳを除き、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄して固相化抗体とした。別途、実施例１−３の方法により調製した別のモノクローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂを常法によりビオチン標識した標識抗体とした。以上の様にして、固相化抗体と標識抗体を組み合わせてなる自己免疫疾患診断剤を得た。
【００４２】
上記固相化抗体に、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにより適宜の濃度に希釈した、実施例１−１の方法で調製した精製蛋白質溶液を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪下、室温下で２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、上記標識抗体を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しながら室温下で２時間反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼとストレプトアビジンとの複合体を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しながら室温下でさらに２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、標識抗体に結合している西洋ワサビパーオキシダーゼの活性をｏ−フェニレンジアミンを基質に波長４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】

【００４４】
表１の結果から明らかなように、この実施例１−４の自己免疫疾患診断剤は、少なくとも約１００乃至５，０００ｐｇ／ｍｌの当該蛋白質を精度良く定量的に検出し得る。この結果から検量線を作成し、当該蛋白質含量未知の生物学的試料にこの診断剤を同様にして適用し、結果として得られた吸光度をこの検量線に内挿又は外挿すれば、斯かる生物学的試料中の当該蛋白質含量を測定することができる。したがって、この診断剤は、自己免疫疾患の診断に極めて有用である。なお、この診断剤を用いた当該蛋白質の検出にあたっての一連の操作に用いる試薬類の１種又は２種以上、すなわち、この実施例１−４で得た固相化抗体及び標識抗体の他、洗浄液、標準抗原としての当該精製蛋白質溶液、希釈液、西洋ワサビパーオキシダーゼ、ストレプトアビジン及び／又はｏ−フェニレンジアミンのそれぞれを適宜の容器に適量封入し、パッケージしてキット化することも容易である。
【００４５】
【実施例２】
〈自己免疫疾患診断剤〉
実施例１−３の方法により調製したモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂを適量取り、ＰＢＳに１０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌ／ウエルずつ分注し、室温下で３時間インキュベートした。ウエルから溶液を除去し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを２００μｌ／ウエルずつ加え、４℃で一晩静置し、当該ＰＢＳを除去して固相化抗体を得た。別途、実施例１−３の方法により調製した別のモノクローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂを、佐内豊が『実験医学』、第６巻、９２５乃至９３１頁（１９８８年）に報告している過沃素酸酸化法により西洋ワサビパーオキシダーゼで標識し、予めＰＢＳで平衡化させておいたファルマシア製『セファクリルＳ−３００ＨＲ』を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製して標識抗体を得た。以上の様にして固相化抗体と標識抗体を組み合わせてなる自己免疫疾患診断剤を得た。
【００４６】
この自己免疫疾患診断剤の固相抗体に適宜の濃度に希釈した、実施例１−１の方法で調製した精製蛋白質を結合させ、洗浄の後、標識抗体をさらに結合させ洗浄して遊離の標識抗体を除去した。結合している標識抗体の西洋ワサビパーオキシダーゼの活性をｏ−フェニレンジアミンを基質に波長４９２ｎｍにおける吸光度として測定したところ、実施例１−４の場合と同様に、この自己免疫疾患診断剤は少なくとも約１００乃至５，０００ｐｇ／ｍｌの蛋白質を精度良く定量的に検出し得ることが確認された。したがって、この診断剤は、自己免疫疾患の診断に極めて有用である。なお、この診断剤を用いた当該蛋白質の検出にあたっての一連の操作に用いる試薬類の１種又は２種以上、すなわち、この実施例２で得た固相化抗体及び標識抗体の他、洗浄液、標準抗原としての当該精製蛋白質溶液、希釈液及び／又はｏ−フェニレンジアミンのそれぞれを適宜の容器に適量封入し、パッケージしてキット化することも容易である。
【００４７】
【実施例３】
〈自己免疫疾患診断剤〉
実施例１−３の方法で調製したモノクローナル抗体Ｈ−１ｍＡｂを適量とり、ＰＢＳに１０μｇ／ｍｌになるように溶解した。溶液に住友ベークライト製ラジオイムノアッセイ用ポリスチレンビーズを約５個／ｍｌの割合で加え、室温下で２時間静置してポリスチレンビーズにモノクローナル抗体を結合させた後、ポリスチレンビーズを１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで繰り返し洗浄してラジオイムノアッセイ用の固相化抗体を得た。別途、実施例１−３の方法で調製した別のモノクローナル抗体Ｈ−２ｍＡｂをボルトン−ハンター法により放射性同位元素¹²⁵Ｉで標識して標識抗体を得た。以上のようにして、固相化抗体及び標識抗体を組み合わせてなる自己免疫疾患診断剤を得た。
【００４８】
この自己免疫疾患診断剤の固相化抗体に適宜の濃度に希釈した、実施例１−１の方法で調製した精製蛋白質を結合させ、洗浄の後、標識抗体をさらに結合させ洗浄して遊離の標識抗体を除去した。結合している標識抗体の放射活性を測定したところ、この自己免疫疾患診断剤は少なくとも約５０乃至１，０００ｐｇ／ｍｌの蛋白質を精度良く定量的に検出し得ることが確認された。したがって、この診断剤は、自己免疫疾患の診断に極めて有用である。なお、この診断剤を用いた当該蛋白質の検出にあたっての一連の操作に用いる試薬類の１種又は２種以上、すなわち、この実施例で得た固相化抗体及び標識抗体の他、洗浄液、標準抗原としての当該精製蛋白質溶液及び希釈液のそれぞれを適宜の容器に適量封入し、パッケージしてキット化することも容易である。
【００４９】
以下、この発明による自己免疫疾患診断剤を用いた診断方法の実施例について述べる。
【００５０】
【実施例４−１】
〈自己免疫疾患の診断〉
関節の痛み及び／又は腫張による歩行困難を主訴して病院内科に来院した患者のうち、問診、触診、Ｘ線所見並びに関節液及び血清中のリウマチ因子及びＣ反応性蛋白質についての検査結果に基づいて、慢性関節リウマチ（ＲＡ）及び関節症（ＯＡ）と診断された患者計８８名を対象として、この発明による自己免疫疾患診断剤を用いた診断を試行した。診断剤は実施例１−４で得た自己免疫疾患診断剤を用いた。生物学的試料として、先の検査時に採取し、保存しておいた関節液又は血清を用いた。関節液を検査した患者数は、慢性関節リウマチが３２名及び関節症が２８名であった。血清を検査した患者数は、慢性関節リウマチが１６名及び関節症が１２名であった。採取した関節液および血清を実施例１−４で示した方法に準じて処理し、それぞれの生物学的試料中の当該蛋白質含量を測定した。結果を図１に示す。
【００５１】
図１に示す結果から明らかなように、一部の例外はあるものの、代表的な自己免疫疾患である慢性関節リウマチ（ＲＡ）の患者から採取した生物学的試料は、類似する症状を示すが自己免疫疾患ではない関節症（ＯＡ）の場合と比較して全般的に当該蛋白質の含量が高い。そこで、関節症における当該蛋白質のレベルの最高値である１５０ｐｇ／ｍｌを自己免疫疾患に対する罹患の有無を判断する基準にとり、本発明の診断剤のみによって診断したと仮定したときの確度を計算した。すなわち、先に自己免疫疾患である慢性関節リウマチと診断され、この発明の診断剤によってその生物学的試料が検査された患者のうちで、上記基準以上の当該蛋白質レベルを示した患者数の占める百分率を求め確度とした。その結果、生物学的試料として関節液を用いた場合の確度は約７０％、血清を用いた場合の確度は約３０％であった。
【００５２】
この確度は、生物学的試料を用いた、従来公知の自己免疫疾患の診断方法と比べて高いものであり、生物学的試料として関節液を用いる本発明の方法により、ほぼ誤りのない診断が可能なことを示している。さらに上記の結果は、本発明の方法が自己免疫疾患を的確かつ迅速に診断するのに有効であるのみならず、従来公知の、例えば、リウマチ因子に関する検査結果等と組合わせることにより、慢性関節リウマチを極めて確度よく診断できることを示している。一方、生物学的試料として血清を用いる場合の確度は、関節液の場合ほどではないものの、それ自体かなり高いと言えるものであり、また、血清の採取は比較的容易に行えることから、従来公知の検査方法の１種又は２種以上と組み合わせることにより、ほぼ誤りのない診断を極めて迅速に達成することができることを示している。なお、実施例２乃至３で得た自己免疫疾患診断剤も、いずれもこの実施例４−１における診断の場合と同様、確度よく用い得るものである。
【００５３】
【実施例４−２】
〈自己免疫疾患の診断〉
全身的な関節の痛み及び／又は腫張を主訴して病院内科に来院した成人の患者のうち、問診、触診、検温、Ｘ線所見並びに血清中のフェリチン含量についての検査結果に基づいて、成人スチル病と診断された患者計６名を対象として、この発明による自己免疫疾患診断剤を用いた診断を試行した。診断剤は実施例２で得た自己免疫疾患診断剤を用いた。先の検査時に採取し、保存しておいた血清を生物学的試料とし、実施例２に記載の方法に準じて処理し、それぞれの当該蛋白質含量を測定した。当該蛋白質含量が検出限界を超える値を示した試料については、適宜希釈した後に同様に処理して測定した。一方、この実施例４−２においては、別途、アール・アンド・ディー・システムズ製のヒトＩＬ−１βイムノアッセイ・キット及び、ヒトＴＮＦ−αイムノアッセイ・キットを用いて、添付のプロトコールにしたがって操作し、試料中のＩＬ−１β及びＴＮＦ−α含量を測定した。また、対照として、健常な成人３０名のボランティアから採取した血清を、患者の場合と同様に処理し、当該蛋白質、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの含量を測定した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
表２に示す結果から明らかなように、自己免疫疾患の一病態である成人スチル病患者の血清は、健常者に比べて著しく高い当該蛋白質の含量を示す。これに対し、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αの血清中の含量は、成人スチル病患者と健常者との間に有意差は認められなかった。このことは、生物学的試料における当該蛋白質の含量の上昇と、自己免疫疾患への罹患との間に相関性があることを示すものであり、したがって、この発明による診断剤及び診断方法によれば自己免疫疾患を確度よく診断できることを示している。例えば、健常者の血清中の当該蛋白質の最高値を超える値である１，０００ｐｇ／ｍｌを基準に取り、実施例４−１の場合に準じて、本発明の診断剤のみによって診断したと仮定して確度を求めると、この実施例４−２における診断の確度は１００％となる。
【００５６】
この確度は、従来公知の生物学的試料を用いた診断方法の場合と比較して著しく高く、本発明の方法により全く誤りのない自己免疫疾患の診断が可能なことを示すものである。さらに、この発明の診断方法による結果と、従来公知の、例えば、血清フェリチンに関する検査結果等とを組合わせることにより、極めて確度よく成人スチル病を診断することができる。なお、実施例１−４又は３で得た自己免疫疾患診断剤も、いずれもこの実施例４−２における診断の場合と同様、確度よく用い得るものである。
【００５７】
【発明の効果】
叙上のように、この発明の自己免疫疾患診断剤は、自己免疫疾患患者由来の生物学的試料に、特異性高くしかも感度よく反応し、定量的な結果を迅速に与える。またモノクローナル抗体を用いていることにより、再現性ある結果を得ることができる。このことにより、この発明の診断剤は、自己免疫疾患を正確かつ迅速に診断することができる。
【００５８】
この発明は、斯くも顕著な効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であるといえる。
【００５９】
【配列表】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の自己免疫疾患診断剤による診断結果の一例を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a disease diagnostic agent, particularly an autoimmune disease diagnostic agent using a monoclonal antibody.
[0002]
[Prior art]
The immune system exists as a defense mechanism of a living body against invasion of harmful foreign substances from the outside world. However, the immune system sometimes recognizes its own components as foreign substances, ie, self-antigens, and produces autoantibodies that can react to them or generate autoreactive T cells that can react to them. This is called autoimmunity. On the other hand, among many diseases affecting human beings, there are some that have been pointed out that the onset of certain diseases is closely related to the establishment of this autoimmunity. I'm calling. Some autoimmune diseases have an increased incidence with aging, and in today's aging society, the importance of early detection and treatment of autoimmune diseases is socially important. It is increasing.
[0003]
However, compared with many other diseases whose causes and pathogenesis have been elucidated and diagnoses and treatment methods have been established, there are still many unclear points about the cause and pathogenesis of autoimmune diseases. In some cases, the diagnosis result based on the detection of the above does not necessarily coincide with the onset. For example, autoantibodies against the Fc part of autologous IgG are detected in 70 to 80% of patients with rheumatoid arthritis, which is a pathological condition of autoimmune disease, while autoantibodies are also detected in healthy subjects. is there. In addition, for example, autoantibodies against own cell nuclei are detected in 80 to 100% of patients with systemic lupus erythematosus, which is another disease state of autoimmune diseases, while autoantibodies are also detected in normal subjects. There are many.
[0004]
From these, in the diagnosis of autoimmune diseases, the current situation is that an accurate diagnosis cannot be made unless a comprehensive judgment is made by combining diagnosis results based on indices different from autoantibodies. The diagnosis is very complicated.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such circumstances, a first object of the present invention is to provide a diagnostic agent capable of accurately and quickly diagnosing an autoimmune disease.
[0006]
A second object of the present invention is to provide a method for diagnosing an autoimmune disease using such a diagnostic agent.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
This invention is a protein comprising a part or all of each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 in the sequence listing as a partial amino acid sequence, and the immunocompetent cell In this case, the problem is solved by an autoimmune disease diagnostic agent using a monoclonal antibody specific for a protein that induces production of interferon-γ (hereinafter abbreviated as “IFN-γ”).
[0008]
The present invention is directed to autoimmune disease diagnosis in which the second subject is brought into contact with a biological sample collected from a subject with such an autoimmune disease diagnostic agent, and the presence or absence of an autoimmune disease is diagnosed based on the immune reaction. It is solved by the method.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present inventors have prepared a liver of a mouse in which a protein that induces the production of IFN-γ in an immunocompetent cell (hereinafter sometimes simply referred to as “the protein”) is pretreated with corynebacterium dead cells and lipopolysaccharide. It was isolated and the DNA encoding the protein was successfully cloned. When human hepatocytes were searched based on homology with this mouse-derived DNA, the human-derived DNA was successfully cloned, and the expression product protein was also capable of inducing IFN-γ production in immunocompetent cells. Was confirmed. This human-derived DNA had the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and encoded the amino acid sequence written there. These findings are disclosed in Japanese Patent Application No. 7-262062 (Japanese Patent Laid-Open No. 8-193098) by the same applicant. Next, when human cells were searched, a certain cell line was found to produce a protein that induces IFN-γ production in immunocompetent cells, and the protein was isolated and examined for properties and properties. . As a result, it was concluded that this protein has the amino acid sequence of the protein which is the expression product of the previously cloned human-derived DNA. The partial amino acid sequence of this protein is described, for example, in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing. This finding is based on the specification of Japanese Patent Application No. 8-67434 by the same applicant. (Japanese Patent Laid-Open No. 9-289896) Is disclosed. The present inventors also produced and purified the protein using a transformant obtained by introducing human-derived DNA into Escherichia coli, immunized a mouse with the purified protein, and collected spleen cells and mouse bone marrow-derived cells. The hybridoma was obtained by fusing with the strain. It was confirmed that the monoclonal antibody obtained from this hybridoma specifically reacts with the protein. This finding is disclosed in Japanese Patent Application No. 7-58240 (Japanese Patent Laid-Open No. 8-231598) by the same applicant.
[0010]
This invention is based on the finding that proteins that induce IFN-γ production in immunocompetent cells are contained at high levels in biological samples collected from patients with certain diseases, especially autoimmune diseases. It is. That is, a biological sample collected from a patient with an autoimmune disease, for example, rheumatoid arthritis, contains the protein at a higher level than that of a healthy subject or other diseased patient, and is included in the sample. It was found that there is a correlation between the amount of the protein and the presence or absence of autoimmune disease. The present invention provides the knowledge that the protein contained in such a biological sample exhibits a marked immune response to a monoclonal antibody specific for the protein, and can diagnose the presence or absence of an autoimmune disease based on the immune response. It is based on.
[0011]
The monoclonal antibody used in the present invention may be any antibody as long as it specifically reacts with a protein that induces production of IFN-γ in immunocompetent cells. The protein comprises, as a partial amino acid sequence, the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 in the sequence listing. The amino acid indicated with “Xaa” represents isoleucine or threonine).
[0012]
The monoclonal antibody used in the present invention can be obtained by using the protein or an antigenic fragment thereof as an antigen. Specifically, for example, a hybridoma of an antibody-producing cell collected from a mammal that has been immunized with such an antigen and a cell derived from a mammal capable of infinite growth is prepared. It can be obtained by selecting a hybridoma clone that can be produced and culturing it in vitro or in vivo.
[0013]
The protein or polypeptide that can serve as an antigen is, for example, as shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing as disclosed in Japanese Patent Application No. 7-262062 (Japanese Patent Laid-Open No. 8-193098) by the same applicant. It can be obtained by culturing a transformant introduced with a DNA encoding the amino acid sequence shown or a homologous amino acid sequence thereof, and they are usually used in a completely purified state or partially purified state. In order to obtain an antigenic fragment, these completely purified products or partially purified products may be chemically or enzymatically degraded, or peptides may be synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
[0014]
Immunization may be carried out by a conventional method. For example, the antigen as described above may be injected or injected into a mammal's vein, intradermal, subcutaneous or intraperitoneal cavity together with an appropriate adjuvant and reared for a certain period. The mammal is not particularly limited, and the type, size, and sex are not limited as long as the desired antibody-producing cells can be obtained. Usually, rodents such as rats, mice and hamsters are used, and the optimal one is selected in consideration of compatibility with cells derived from mammals capable of infinite growth described later. Depending on the type and size of the mammal used, the inoculation amount of the antigen is usually about 5 to 500 μg / animal, and this is about 2 to 5 times with an interval of about 1 to 2 weeks. Separately inoculate. Then, 3 to 5 days after the final inoculation, the spleen is removed and dispersed to obtain spleen cells as antibody-producing cells.
[0015]
Next, the antibody-producing cells thus obtained are fused with cells derived from mammals capable of infinite growth to obtain a cell fusion product containing the target hybridoma. Mammalian cells that can grow indefinitely typically include mice such as P3-NS1-Ag4-1 cells (ATCC TIB18), P3-X63-Ag8 cells (ATCC TIB9) and SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC CRL1581). A cell line derived from myeloma or a mutant thereof is used. For cell fusion, for example, conventional methods using fusion promoters such as polyethylene glycol and Sendai virus and electric pulses are used. For example, antibody-producing cells can be infinitely proliferated in a fusion medium containing a fusion promoter. Mammalian cells are suspended at a ratio of about 1: 1 to 1:10 and incubated in this state at about 30 to 40 ° C. for about 1 to 5 minutes. For the fusion medium, for example, MEM medium, RPMI 1640 medium, and Iscov modified Dulbecco medium can be used in general common media, but it is desirable to exclude serum such as bovine serum.
[0016]
To select a target hybridoma, first, the cell fusion product obtained as described above is transferred to a selection medium such as HAT medium and cultured at about 30 to 40 ° C. for about 3 days to 3 weeks. Kill cells. Next, the hybridoma is cultured by a conventional method, and the reactivity of the antibody secreted into the culture with the protein is tested. For the test, conventional methods for detecting antibodies such as enzyme immunoassay, radioimmunoassay, and bioassay are used. For example, “Monoclonal Antibody Experiment Manual” edited by Tomi Yamato and Minato Ando, 1991, Kodansha Scientific Various methods for doing this are described in detail in Fix Issue, pages 105-152. A hybridoma producing an antibody specific to the protein is immediately cloned by a limiting dilution method or the like, and then cloned into a single clone to obtain a hybridoma used in the present invention. In the present invention, one or more kinds, usually two or more kinds of such hybridomas are selected, and after single cloning, a monoclonal antibody is prepared from each by the following method and used.
[0017]
The monoclonal antibody used in the present invention can be obtained by culturing such a hybridoma in vitro or in vivo. For culturing, a conventional method for culturing cells derived from mammals is used. For example, when culturing in an in vitro culture medium, the culture is transplanted into a warm-blooded animal other than a human and live. When cultured in the body, monoclonal antibodies are collected from the ascites and / or blood. Hybridomas “H-1” and “H-2” disclosed in Japanese Patent Application No. 7-58240 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-231598) by the same applicant have high monoclonal antibody production ability, It is characterized by easy culture inside and outside. To collect monoclonal antibodies from culture or ascites or blood, conventional methods in the art for purifying antibodies in general are used. Individual methods include, for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, centrifugation, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, gel electrophoresis and isoelectric focusing. Electrophoresis can be mentioned, and these are applied in combination as necessary. The purified monoclonal antibody is then concentrated and dried to be liquid or solid depending on the application.
[0018]
The autoimmune disease diagnostic agent of the present invention uses the monoclonal antibody as described above, and is usually used by being incorporated into a labeled immunoassay. Examples of the individual label immunoassay include an enzyme immunoassay using an enzyme as a labeling substance, a radio immunoassay using a radioactive substance as a labeling substance, and a fluorescence immunoassay using a fluorescent substance as a labeling substance. These labeling immunoassays have now been developed and used in various ways, and any method can be applied to the present invention as appropriate. For example, regarding enzyme immunoassay, P. Thyssen, translated by Eiji Ishikawa, “Enzyme Immunoassay”, published in 1989, Tokyo Chemical Dojin, pages 196 to 348, and the like, various methods are described in detail.
[0019]
Among these, the method using a solid-phased antibody and a free antibody, generally called a sandwich method, is excellent in terms of detection sensitivity, reproducibility, and ease of operation. In order to obtain the autoimmune disease diagnostic agent of the present invention by applying the sandwich method, first, two types of hybridomas derived from each other are prepared, and in both cases, monoclonal antibodies specific for the protein are prepared as described above. The The first monoclonal antibody is bound to a suitable insoluble support by a conventional method to obtain a solid-phased antibody. On the other hand, the second monoclonal antibody is used as a free antibody, and labeled with an enzyme, radioactive substance or fluorescent substance by a conventional method to form a labeled antibody. At this time, the second monoclonal antibody may itself be labeled with a labeling substance, or may be labeled to be specifically recognized by the labeling substance. After mixing the immobilized antibody and the test sample, wash with a washing solution, add a labeled antibody here, wash it after mixing, and detect the protein in the test sample if detected based on the label. Can be detected. Furthermore, the protein content in the test sample can be measured by preparing a calibration curve by treating the protein solution, which is a standard antigen appropriately diluted to a known concentration, in the same manner. Monoclonal antibodies “H-1 mAb” and “H-2 mAb” disclosed in Japanese Patent Application No. 7-58240 (JP-A-8-231598) by the same applicant are either solid-phased antibodies. When the sandwich method is applied with the remaining one as a labeled antibody, the protein can be detected with high sensitivity, quantitativeness, and reproducibility. Here, the order of mixing the test sample with the immobilized antibody or the labeled antibody may be any, and good results are obtained in any case. In addition to the monoclonal antibody, the diagnostic agent of the present invention includes reagents necessary for carrying out detection of the protein using the monoclonal antibody, such as a washing solution, a reagent for detecting a label, a standard antigen solution, and / or Alternatively, an appropriate amount of each of the diluents may be enclosed in an appropriate container to form an autoimmune disease diagnostic kit.
[0020]
Since the diagnostic agent of the present invention is configured as described above, it reacts specifically with the protein, exhibits a remarkable immune reaction, and based on the immune reaction, a very small amount in a biological sample collected from the subject This protein can be detected with high accuracy and its content can be measured. Moreover, the diagnostic agent of the present invention is characterized in that many samples can be analyzed at one time, and the time and labor required for the analysis can be reduced, and the analysis is highly accurate. Therefore, the diagnostic agent of the present invention is extremely useful for accurately and rapidly performing the presence or absence of an autoimmune disease.
[0021]
Hereinafter, the diagnostic method according to the present invention will be described. Depending on the type of labeled immunoassay applied, in the case of the above-described sandwich method, usually, the above-described immobilized antibody and the biological sample are first incubated. To do. After washing with a washing solution such as a buffer containing a surfactant, the above labeled antibody is added and further incubated. Similarly, after washing with a washing solution, the labeled antibody is detected based on the label. Separately from this, a calibration curve is prepared in advance by applying the diagnostic agent of the present invention to the protein solution diluted to an appropriate concentration as a standard antigen. By interpolating or extrapolating the detection result of the labeled antibody in the calibration curve, the protein content in the biological sample can be obtained. Based on the measurement result thus obtained, the presence or absence of an autoimmune disease is diagnosed. Depending on the type of disease and the type of biological sample used, for example, in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and adult still disease, when synovial fluid or serum is used as the biological sample, Patients whose protein content exceeds 100 to 200 pg / ml are diagnosed as suffering from the disease.
[0022]
The biological sample may be any sample as long as it contains more of the protein at the time of illness than normal, and joint fluid, serum, urine, saliva, lymph, tissue, sweat and feces are usually used. If necessary, these soluble fractions may be separated and used. Depending on the type of autoimmune disease, for example, in the case of rheumatoid arthritis or adult still disease, it is desirable to use joint fluid or serum.
[0023]
Diseases that are the subject of this invention include all so-called autoimmune diseases related to autoimmunity. Specific examples of such diseases include, for example, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, adult still disease, collagen disease, multiple arteritis, multiple myositis, dermatomyositis, systemic progressive sclerosis, multiple sclerosis Systemic lupus erythematosus, discoid lupus erythematosus, scleroderma, mixed connective tissue disease, chronic thyroiditis, autoimmune hemolytic anemia, Good Pastor syndrome, ulcerative colitis, lupus nephritis, autoimmune gastritis, autoimmunity Examples include hepatitis, thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, and allergic diseases. It provides exceptional diagnostic accuracy for adult still disease and rheumatoid arthritis.
[0024]
Hereinafter, the present invention will be described based on examples. However, in the state of the art, such examples can be variously modified. In view of such a technical level, it goes without saying that the present invention should not be limited only to these embodiments.
[0025]
[Example 1]
<Diagnostic agent for autoimmune diseases>
[0026]
Example 1-1
<Preparation of the protein as an antigen>
In a 0.5 ml reaction tube, 8 μl of 25 mM magnesium chloride, 10 μl of 10 × PCR buffer, 1 μl of 25 mM dNTP mix, 1 μl of 2.5 unit / μl amplitac DNA polymerase, Japanese Patent Application No. 7-262062 ( According to the method described in JP-A-8-193098), 1 ng of recombinant DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing prepared from the phage DNA clone is represented by 5′-ATAGAATTCAAAGTTACTTGGCAAGCTTTGAATC-3 ′. Appropriate amounts of the sense primer having the nucleotide sequence and the antisense primer having the nucleotide sequence represented by 5′-ATAAAGCTCTCTAGTCTTCGTTTTGAAC-3 ′ were added to make 100 μl with sterile distilled water. According to a conventional method, this mixture was incubated at 94 ° C. for 1 minute, 43 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute in this order three times, and then further, 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute. The PCR reaction was performed by repeating 40 cycles of incubation in this order for 1 minute at 72 ° C. for 1 minute. The sense primer and antisense primer used here were chemically synthesized based on the amino acid sequences near the N-terminal and C-terminal in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, respectively. The base sequence of the sense primer has a protein synthesis start codon added without an intervening sequence upstream of the 5 'end of the base sequence encoding the N-terminal portion of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and further upstream of it. It has a sequence with an Eco RI cleavage site added. Similarly, the base sequence of the antisense primer has a stop codon added without any intervening sequence downstream of the 3 ′ end of the base sequence encoding the C-terminal portion of the amino acid sequence also shown in SEQ ID NO: 6, and further a Hind III cleavage site downstream thereof. Has a sequence completely complementary to the sequence to which is added.
[0027]
Using the “pCR-Script SK (+) Cloning Kit” manufactured by Stratagene and operating according to the attached instructions, this PCR product and the plasmid vector “pCR-Script SK (+)” were ligated to give a recombinant DNA, This was introduced into E. coli strain “XL-1 BlueMRF′Kan” manufactured by Stratagene and transformed by the competent cell method. The transformant was inoculated into L-broth medium (pH 7.2) containing 50 μg / ml ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 18 hours. The culture was then centrifuged, and the transformant was collected. -Recombinant DNA was isolated by applying the SDS method. When analyzed by the dideoxy method, this recombinant DNA comprises a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and a start codon for protein synthesis is added immediately upstream of the 5 'end without an intervening sequence, Further, an Eco RI cleavage site was added upstream thereof. In addition, a stop codon was added immediately downstream of the 3 ′ end without any intervening sequence, and a HindIII cleavage site was further added downstream thereof. The amino acid sequence encoded by this recombinant DNA had a sequence in which methionine encoded by the start codon for protein synthesis was added to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
[0028]
Therefore, the remaining recombinant DNA was cleaved with restriction enzymes Eco RI and Hind III according to a conventional method, and then the obtained Eco RI-Hind III was used using a DNA ligation kit “DNA ligation kit version 2” manufactured by Takara Shuzo. Recombinant recombinant DNA “pKGFHH2” was obtained by reacting and ligating 0.1 μg of DNA fragment with 10 ng of Pharmacia plasmid vector “pKK223-3” previously cut with the same restriction enzyme at 16 ° C. for 30 minutes. . E. coli Y1090 strain (ATCC 37197) was transformed with this recombinant DNA “pKGFHH2” by the competent cell method, and the obtained transformant “KGFHH2” was transformed to 50 μm. g L-broth medium (pH 7.2) containing / ml ampicillin was incubated at 37 ° C. for 18 hours with shaking. The transformant was collected by centrifuging the culture, and the recombinant DNA “pKGFHH2” was extracted by applying a normal SDS-alkali method to a part thereof. When analyzed by the dideoxy method, in the recombinant DNA “pKGFHH2”, “KGFHH2 cDNA” containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing was linked downstream of the Tac promoter.
[0029]
An L-broth medium (pH 7.2) containing ampicillin 50 μg / ml was prepared aseptically, inoculated with the previously produced transformant “KGFHH2”, and seed-cultured at 37 ° C. for 18 hours under shaking. Take 18 liters of fresh same medium in a 20 liter jar fermenter, sterilize in the same manner, cool to 37 ° C., inoculate 1% (v / v) of the seed culture obtained above, and stir for 8 hours at the same temperature Cultured. The culture is centrifuged to collect the cells, suspended in a mixture (pH 7.3) containing 150 mM sodium chloride, 16 mM disodium hydrogen phosphate and 4 mM sodium dihydrogen phosphate, disrupted by ultrasonic waves, and centrifuged to centrifuge the cells. The crushed material was removed, and the supernatant was collected.
[0030]
To this supernatant, ammonium sulfate was added to 40% (w / v) under ice-cooling, uniformly dissolved, allowed to stand for a while, centrifuged, and the supernatant was collected. This supernatant was dissolved in 150 mM phosphate buffer (pH 6.6) containing 1.5 M ammonium sulfate, and this solution was previously equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 6.6) containing 1.5 M ammonium sulfate. The column of the hydrophobic chromatography gel “Phenyl Sepharose” was loaded, the column was washed with fresh identical buffer, and then under a concentration gradient of ammonium sulfate descending from 1.5 M to 0 M, 10 mM phosphate buffer (pH 6.6) ).
[0031]
Next, the fractions eluted at an ammonium sulfate concentration of about 1.0 M are combined, concentrated in a membrane, dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 6.5) at 4 ° C. for 18 hours, and preliminarily 10 mM phosphate buffer (pH 6). The concentration of sodium chloride that rises from 0M to 0.2M after loading the column of Tosoh's ion exchange chromatography gel “DEAE 5PW” that has been equilibrated in 5) and washing the column with fresh same buffer. Under a gradient, 10 mM phosphate buffer (pH 6.5) was passed through, and fractions eluted at a sodium chloride concentration of around 0.05 M were collected.
[0032]
Then, this fraction was concentrated in a membrane and loaded onto a column of Pharmacia Gel Filtration Chromatography Gel “Super Dex 75” that had been equilibrated in advance with a phosphate buffer (hereinafter referred to as “PBS”). When a fraction having a molecular weight of about 18,500 daltons eluted by passing fresh PBS was collected, an aqueous solution containing about 5.2 mg of purified protein was obtained. The yield throughout the entire purification process was about 10%.
[0033]
When analyzed according to the method described in Japanese Patent Application No. 7-262062 (Japanese Patent Laid-Open No. 8-193098) by the same applicant, the purified protein had the following physicochemical properties. That is, when subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, a main band capable of inducing IFN-γ is shown at a position corresponding to a molecular weight of 18,500 ± 3,000 daltons, whereas when chromatofocusing, 4.9 ± An isoelectric point is shown at 1.0. Moreover, the N terminal had an amino acid sequence in which methionine was bonded to the N terminal in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
[0034]
Japanese Patent Application No. 8-67434 by the same applicant (Japanese Patent Laid-Open No. 9-289896) Peptide mapping was performed according to the method described in 1), and the amino acid sequences of “peptide fragment 1” to “peptide fragment 3” derived from the purified protein were analyzed. The amino acid sequence of peptide fragment 2 had a sequence in which methionine was bound to the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The amino acid sequence of peptide fragment 1 had the same sequence as shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of peptide fragment 3 had the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
[0035]
Example 1-2
<Preparation of hybridoma>
The purified protein obtained by the method of Example 1-1 was intraperitoneally injected into 10 week-old BALB / c mice. When Both were inoculated at a rate of 20 μg / animal. Thereafter, the same amount was inoculated twice every two weeks, and the same amount was further intravenously injected one week after the last inoculation, and the spleen was removed and dispersed after 3 days to obtain splenocytes.
[0036]
The spleen cells and mouse myeloma-derived SP2 / 0-Ag14 cells (ATCC CRL1581) were added to serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) that had been pre-warmed to 37 ° C., and the cell density was 3 × 10. ^Four Pieces / ml and 1 × 10 ^Four After centrifuging, the precipitate was collected. 1 ml of serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) containing 50% (w / v) polyethylene glycol having an average molecular weight of 1,500 daltons was added dropwise to this precipitate over 1 minute, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 minute. Serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2) was added dropwise until the total volume reached 50 ml, and after centrifugation, the precipitate was collected. This precipitate was suspended in HAT medium, dispensed at 200 μl / well into a 96-well microplate, and incubated at 37 ° C. for 1 week.
[0037]
About the antibody secreted in the culture supernatant in each well, the reactivity with the purified protein obtained by the method of Example 1-1 was examined by enzyme immunoassay, and a hybridoma producing an antibody showing reactivity with the purified protein was obtained. Selected. Subsequently, limiting dilution was repeatedly applied to this hybridoma according to a conventional method to obtain two hybridoma clones “H-1” and “H-2”.
[0038]
Example 1-3
<Preparation of monoclonal antibody>
The hybridomas H-1 and H-2 obtained by the method of Example 1-2 were each obtained at a cell density of about 1 × 10 ⁶ Suspended in RPMI 1640 medium (pH 7.2) supplemented with 5% (v / v) bovine serum so that the number of cells / ml becomes 5% CO ₂ The cells were cultured at 37 ° C. in an incubator. When the desired cell density was reached, each of the hybridomas H-1 and H-2 was injected 1 × into the peritoneal cavity of an 8-week-old BALB / c mouse that had previously been injected intraperitoneally with 0.5 ml of pristane. 10 ⁷ Each animal was inoculated and bred for 1 week in the usual manner.
[0039]
Ascites was collected from each mouse, diluted 3 times with PBS, added with ammonium sulfate to 50% saturation, allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours, centrifuged, and the precipitate was collected. This precipitate was dialyzed overnight at 4 ° C. against a 20 mM potassium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 6.7), and then loaded onto a hydroxyapatite column that had been equilibrated with a fresh same aqueous solution in advance to a concentration of 20 mM to 300 mM. When a linearly rising potassium dihydrogen phosphate aqueous solution (pH 6.7) was passed, an aqueous solution containing a monoclonal antibody was obtained. The yield was about 5 mg per mouse. When analyzed according to a conventional method, the monoclonal antibody “H-1 mAb” obtained from hybridoma H-1 was found to be IgG. ₁ Belonged to the class. The monoclonal antibody “H-2 mAb” obtained from the hybridoma H-2 belonged to the IgM class.
[0040]
Western blotting was performed according to a conventional method using the monoclonal antibody H-1 mAb or H-2 mAb prepared in Example 1-3. The color was developed with a rabbit-derived anti-mouse Ig antibody labeled with horseradish peroxidase. As the test sample, purified protein and recombinant human interleukin 12 prepared by the method of Example 1-1 were used. Molecular weight markers include bovine serum albumin (67,000 daltons), ovalbumin (45,000 daltons), carbonic anhydrase (30,000 daltons), trypsin inhibitor (20,100 daltons) and α-lactalbumin (14 , 400 Dalton). As a result, none of the monoclonal antibodies specifically reacted with the purified protein, and did not react with human interleukin 12. This confirms that all of the monoclonal antibodies prepared in Examples 1-3 exhibit an immune reaction specifically to the protein.
[0041]
Example 1-4
<Diagnostic agent for autoimmune diseases>
As an example of the autoimmune disease diagnostic agent of this invention, in this Example 1-4, a modified sandwich method using two monoclonal antibodies H-1 mAb and H-2 mAb prepared by the method of Example 1-3. The autoimmune disease diagnostic agent which detects a protein by the avidin biotin method which was the above was produced. That is, according to a conventional method, the monoclonal antibody H-1 mAb prepared by the method of Example 1-3 was dissolved in PBS to 20 μg / ml, and dispensed at 100 μl / well into a 96-well microplate. After incubating the microplate at room temperature for 3 hours, the antibody solution was removed, and PBS containing 1% (w / v) bovine serum albumin was added in an amount of 200 μl / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, the PBS was removed from the microplate and washed with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20 to obtain a solid-phased antibody. Separately, another monoclonal antibody H-2 mAb prepared by the method of Example 1-3 was used as a labeled antibody labeled with biotin by a conventional method. As described above, an autoimmune disease diagnostic agent comprising a solid-phased antibody and a labeled antibody was obtained.
[0042]
To the above solid-phased antibody, 100 μl / well of the purified protein solution prepared by the method of Example 1-1, diluted to an appropriate concentration with PBS containing 0.5% (w / v) bovine serum albumin, The reaction was allowed to proceed for 2 hours at room temperature under shaking. After washing with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, the labeled antibody was added in an amount of 100 μl / well and allowed to react at room temperature for 2 hours with shaking. 0.05% (v / v) Tween 20 After washing with PBS containing 100 μl / well of a complex of horseradish peroxidase and streptavidin, the mixture was further reacted at room temperature for 2 hours with shaking. After washing with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, the activity of horseradish peroxidase bound to the labeled antibody was measured as absorbance at a wavelength of 492 nm using o-phenylenediamine as a substrate. The results are shown in Table 1.
[0043]
[Table 1]

[0044]
As is clear from the results in Table 1, the autoimmune disease diagnostic agent of Example 1-4 can accurately and quantitatively detect at least about 100 to 5,000 pg / ml of the protein. A calibration curve is created from the results, the diagnostic agent is similarly applied to a biological sample of unknown protein content, and the resulting absorbance is interpolated or extrapolated to the calibration curve. The protein content in the biological sample can be measured. Therefore, this diagnostic agent is extremely useful for diagnosis of autoimmune diseases. One or more of the reagents used in the series of operations in detecting the protein using the diagnostic agent, that is, in addition to the immobilized antibody and the labeled antibody obtained in Example 1-4, It is also easy to enclose a suitable amount of each of the washing solution, the purified protein solution as a standard antigen, a diluted solution, horseradish peroxidase, streptavidin and / or o-phenylenediamine, and package them into a kit. .
[0045]
[Example 2]
<Diagnostic agent for autoimmune diseases>
An appropriate amount of the monoclonal antibody H-1 mAb prepared by the method of Example 1-3 is taken, dissolved in PBS to 10 μg / ml, dispensed at 100 μl / well into a 96-well microplate, and incubated at room temperature for 3 hours. did. The solution was removed from the well, PBS containing 1% (w / v) bovine serum albumin was added at 200 μl / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C., and the PBS was removed to obtain a solid-phase antibody. Separately, another monoclonal antibody H-2 mAb prepared by the method of Example 1-3 was obtained by periodate oxidation reported by Yutaka Sauchi in “Experimental Medicine”, Vol. 6, pages 925 to 931 (1988). The antibody was labeled with horseradish peroxidase by the method, and purified by gel filtration chromatography using Pharmacia “Sephaacryl S-300HR” which had been equilibrated in advance with PBS to obtain a labeled antibody. As described above, an autoimmune disease diagnostic agent obtained by combining a solid-phase antibody and a labeled antibody was obtained.
[0046]
The purified protein prepared by the method of Example 1-1 diluted to an appropriate concentration to the solid phase antibody of this autoimmune disease diagnostic agent was bound, and after washing, the labeled antibody was further bound and washed to release the free label The antibody was removed. The activity of horseradish peroxidase of the labeled antibody bound was measured as absorbance at a wavelength of 492 nm using o-phenylenediamine as a substrate. As in Example 1-4, this autoimmune disease diagnostic agent was at least about It was confirmed that a protein of 100 to 5,000 pg / ml can be detected quantitatively with high accuracy. Therefore, this diagnostic agent is extremely useful for diagnosis of autoimmune diseases. In addition, one or more reagents used in a series of operations in detecting the protein using the diagnostic agent, that is, in addition to the immobilized antibody and the labeled antibody obtained in Example 2, a washing solution, An appropriate amount of each of the purified protein solution, diluent and / or o-phenylenediamine as a standard antigen can be encapsulated in an appropriate container and packaged into a kit.
[0047]
[Example 3]
<Diagnostic agent for autoimmune diseases>
An appropriate amount of the monoclonal antibody H-1 mAb prepared by the method of Example 1-3 was taken and dissolved in PBS to 10 μg / ml. After adding polystyrene beads for radioimmunoassay manufactured by Sumitomo Bakelite at a rate of about 5 / ml to the solution and allowing to stand for 2 hours at room temperature to bind the monoclonal antibody to the polystyrene beads, 1% (v / v) polystyrene beads were added. ) Washed repeatedly with PBS containing bovine serum albumin to obtain an immobilized antibody for radioimmunoassay. Separately, another monoclonal antibody H-2 mAb prepared by the method of Example 1-3 was separated from the radioisotope by the Bolton-Hunter method. ¹²⁵ A labeled antibody was obtained by labeling with I 2. As described above, an autoimmune disease diagnostic agent comprising a combination of an immobilized antibody and a labeled antibody was obtained.
[0048]
The purified protein prepared by the method of Example 1-1, diluted to an appropriate concentration, was immobilized on the solid-phase antibody of this autoimmune disease diagnostic agent. After washing, the labeled antibody was further bound, washed and released. The labeled antibody was removed. When the radioactivity of the bound labeled antibody was measured, it was confirmed that this autoimmune disease diagnostic agent can accurately and quantitatively detect a protein of at least about 50 to 1,000 pg / ml. Therefore, this diagnostic agent is extremely useful for diagnosis of autoimmune diseases. It should be noted that one or more of the reagents used in the series of operations in detecting the protein using the diagnostic agent, that is, the solid phase antibody and the labeled antibody obtained in this example, the washing solution, the standard An appropriate amount of each of the purified protein solution and diluent as an antigen can be enclosed in an appropriate container and packaged into a kit.
[0049]
Examples of diagnostic methods using the autoimmune disease diagnostic agent according to the present invention will be described below.
[0050]
Example 4-1
<Diagnosis of autoimmune disease>
Among the patients who complained of difficulty in walking due to joint pain and / or swelling, and visited the hospital internal medicine, interviews, palpation, X-ray findings and test results on rheumatoid factor and C-reactive protein in joint fluid and serum Based on this, a total of 88 patients diagnosed with rheumatoid arthritis (RA) and arthropathy (OA) were subjected to diagnosis using the autoimmune disease diagnostic agent according to the present invention. As the diagnostic agent, the diagnostic agent for autoimmune disease obtained in Example 1-4 was used. As a biological sample, joint fluid or serum collected at the previous examination and stored was used. The number of patients examined for joint fluid was 32 for rheumatoid arthritis and 28 for arthropathy. The number of patients examined for serum was 16 for rheumatoid arthritis and 12 for arthropathy. The collected joint fluid and serum were treated according to the method shown in Example 1-4, and the protein content in each biological sample was measured. The results are shown in FIG.
[0051]
As is clear from the results shown in FIG. 1, biological samples taken from patients with rheumatoid arthritis (RA), a typical autoimmune disease, with some exceptions, show similar symptoms. The protein content is generally high compared to arthropathy (OA), which is not an autoimmune disease. Therefore, the accuracy when assuming that the diagnosis was made only with the diagnostic agent of the present invention was calculated by taking 150 pg / ml, which is the maximum level of the protein in arthropathy, as a criterion for determining the presence or absence of the autoimmune disease. That is, among patients who have been diagnosed with rheumatoid arthritis, which is an autoimmune disease, and whose biological sample has been examined with the diagnostic agent of the present invention, the number of patients who have shown the protein level above the above-mentioned standard accounts for Percentage was obtained and used as accuracy. As a result, the accuracy when using synovial fluid as a biological sample was about 70%, and the accuracy when using serum was about 30%.
[0052]
This accuracy is higher than that of a conventionally known method for diagnosing autoimmune disease using a biological sample. The method of the present invention using synovial fluid as a biological sample allows a diagnosis with almost no error. It shows what is possible. Furthermore, the above results show that the method of the present invention is effective not only for accurately and rapidly diagnosing autoimmune diseases, but also by combining with the conventionally known test results for rheumatoid factors, etc. This shows that rheumatism can be diagnosed with extremely high accuracy. On the other hand, the accuracy when using serum as a biological sample is not as high as in the case of joint fluid, but it can be said that the accuracy itself is high, and since serum can be collected relatively easily, it has been publicly known. In combination with one or more of the above-mentioned inspection methods, it is shown that an almost error-free diagnosis can be achieved very quickly. In addition, all the autoimmune disease diagnostic agents obtained in Examples 2 to 3 can be used with high accuracy as in the case of the diagnosis in Example 4-1.
[0053]
Example 4-2
<Diagnosis of autoimmune disease>
Among adult patients who visited hospital department with chief complaints of general joint pain and / or swelling, adults based on interviews, palpation, temperature measurements, X-ray findings and test results on ferritin content in serum For a total of 6 patients diagnosed with Still's disease, a diagnosis using the autoimmune disease diagnostic agent according to the present invention was attempted. As the diagnostic agent, the diagnostic agent for autoimmune disease obtained in Example 2 was used. Serum collected and stored at the previous test was used as a biological sample, processed according to the method described in Example 2, and the content of each protein was measured. About the sample which showed the value in which the said protein content exceeded a detection limit, it measured similarly, after processing suitably. On the other hand, in Example 4-2, separately, a human IL-1β immunoassay kit manufactured by R & D Systems and a human TNF-α immunoassay kit were used and operated according to the attached protocol. IL-1β and TNF-α contents in the samples were measured. As a control, serum collected from 30 healthy adult volunteers was treated in the same manner as in the case of patients, and the contents of the protein, IL-1β and TNF-α were measured. The results are shown in Table 2.
[0054]
[Table 2]

[0055]
As is apparent from the results shown in Table 2, the serum of an adult still disease patient, which is a pathological condition of autoimmune disease, shows a significantly higher content of the protein than healthy individuals. In contrast, there was no significant difference in the serum content of IL-1β or TNF-α between adult still disease patients and healthy individuals. This indicates that there is a correlation between the increase in the content of the protein in the biological sample and the morbidity of the autoimmune disease. Therefore, according to the diagnostic agent and diagnostic method according to the present invention. This shows that autoimmune diseases can be diagnosed with good accuracy. For example, it is assumed that 1,000 pg / ml, which is a value exceeding the maximum value of the protein in the serum of a healthy subject, is taken as a reference, and the diagnosis is made only with the diagnostic agent of the present invention according to the case of Example 4-1. When the accuracy is obtained, the accuracy of diagnosis in Example 4-2 is 100%.
[0056]
This accuracy is remarkably higher than that of a conventionally known diagnostic method using a biological sample, indicating that the method of the present invention can diagnose an autoimmune disease without any error. Furthermore, it is possible to diagnose adult still disease with extremely high accuracy by combining the results of the diagnostic method of the present invention with conventionally known test results relating to, for example, serum ferritin. In addition, all the autoimmune disease diagnostic agents obtained in Example 1-4 or 3 can be used with high accuracy as in the case of diagnosis in Example 4-2.
[0057]
【The invention's effect】
As described above, the autoimmune disease diagnostic agent of the present invention reacts with a biological sample derived from an autoimmune disease patient with high specificity and sensitivity, and quickly gives a quantitative result. In addition, reproducible results can be obtained by using monoclonal antibodies. As a result, the diagnostic agent of the present invention can accurately and rapidly diagnose autoimmune diseases.
[0058]
This invention exhibits such a remarkable effect, and it can be said that it is an invention having great significance to contribute to the world.
[0059]
[Sequence Listing]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an example of a diagnosis result by an autoimmune disease diagnostic agent of this invention.

Claims

As a partial amino acid sequence, a monoclonal antibody specific to a protein comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 in the sequence listing and inducing the production of interferon-γ in immunocompetent cells used, diagnostic agent for rheumatoid arthritis or adult still's disease.

Monoclonal antibodies, enzymes, sectional agent diagnosis according to claim 1 which is labeled with a radioactive substance and / or a fluorescent substance.

Monoclonal antibodies, cross-sectional agent diagnosis according to claim 1 or 2 including a solid phase antibodies are held together to an insoluble support and a labeled free antibody.

Cross kit diagnosis including diagnostic agent according to claim 1, 2 or 3.