JP3922345B2

JP3922345B2 - Bioactive peptide

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Publication number: JP3922345B2
Application number: JP2001347339A
Authority: JP
Inventors: 京子武部; 洋平平井
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 2001-11-13
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2007-05-30
Anticipated expiration: 2021-11-13
Also published as: JP2003146998A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生理活性ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、毛成長促進作用を有するエピモルフィンに結合してその生理活性を制御することができるオリゴペプチド、並びに該オリゴペプチドを有効成分として含む医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
上皮組織の正常な形態形成は上皮組織の周りに存在する間充織細胞由来の因子による制御を受けていることが示唆されており、また、上皮組織の形態形成異常に起因する疾患の多くが間充織細胞の異常を原因としていることから、間充織細胞が上皮組織の形態形成を制御するメカニズムの解明に興味がもたれている。しかしながら、上皮組織の形態形成の制御に関与する物質群は複雑な系の中で時間的及び空間的な制御を受けて発現されており、それらの物質を単離して機能を解析することは極めて困難であること、また、上皮組織の形態形成を単純化したモデル実験系の構築も難しいことなどの理由から、この分野の研究には今日まで大きな進展が見られていない。上皮組織の形態形成に起因する疾患の発症機序の解明やそれらの疾患の治療方法の確立などのために、上皮組織における形態形成の制御メカニズムの解析が切望されていた。
【０００３】
このような状況下にあって、上皮組織の形態形成の制御に関与するエピモルフィン (epimorphin) が分離・精製された（特開平6-25295 号公報）。この物質は277 ないし 289個のアミノ酸からなる蛋白質をコア・蛋白質とする生理活性物質であり、主として間充織細胞により生合成されていることが明らかにされた。また、エピモルフィンは、上皮細胞に作用して上皮組織の形態形成を促進する作用を有していること、並びにエピモルフィンが機能しない場合には正常な組織形成が行われないことも明らかにされた。
【０００４】
エピモルフィンの構造については、エピモルフィン分子が構造上大きく４個のフラグメントに分けられることが見いだされている（欧州特許公開第0698666 号）。すなわち、エピモルフィンの全長を構成するポリペプチドは、Ｎ末端側より、コイルドコイル領域(1)、機能ドメイン(2)、コイルドコイル領域(3)、及びＣ末端の疎水性領域に分けることができる。これらのフラグメントのうち、機能ドメイン（ヒト・エピモルフィンではＮ末端より104 番目から187 番目のアミノ酸により特定される領域）については、この領域が細胞接着に関与しており、エピモルフィンの生理活性の発現に密接にかかわっていることが示唆されている（上掲欧州特許公開）。
【０００５】
エピモルフィンが正常な形態形成を促進する作用を有することから、この物質は、形態形成の異常に起因する疾患などの予防や治療のための医薬や、又は育毛剤などの医薬の有効成分として有用であることが期待される。しかしながら、哺乳類動物から得られた天然型エピモルフィンは生理食塩水などの水性媒体に難溶であり、医薬として実用に供することが困難であった。このため、天然型エピモルフィンの形態形成促進作用を実質的に保持しつつ、溶解性に優れたエピモルフィン誘導体を創製する試みがなされている。例えば、Ｃ末端部の疎水性領域を除去した改変体（フラグメント123）などが知られている（特開平6-25295 号公報）。
エピモルフィンの部分構造を有するポリペプチドが上皮細胞に作用して上皮組織の形態形成を促進することが知られている（国際公開WO98/22505号）。このポリペプチドは生理食塩水などの水性媒体に溶解可能なポリペプチドであり、上記刊行物には、該ポリペプチドが毛成長促進作用を有することが教示されている。
【０００６】
上記したようにエピモルフィンについての研究は種々行なわれているが、エピモルフィンに結合してその活性を制御する物質についてはこれまでの所、報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、エピモルフィンに結合してその活性を制御することができる物質を提供することにある。また、本発明の別の課題は、エピモルフィンに結合してその活性を制御する物質を有効成分として含む医薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、少なくともアミノ酸配列Leu-Leu-Thr-Ser-Serを含むオリゴペプチドがエピモルフィンと結合して、その生理活性を制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明によれば、少なくともアミノ酸配列Leu-Leu-Thr-Ser-Serを含み、エピモルフィン結合能を有し、２０以下のアミノ酸残基から成る、エピモルフィン活性制御オリゴペプチドが提供される。本発明の好ましい態様によれば、下記（１）から（３）の何れかのアミノ酸配列から成るエピモルフィン活性制御オリゴペプチドが提供される。
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala （１）
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys （２）
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser （３）
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のオリゴペプチド又は生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む医薬が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のオリゴペプチドは、少なくともアミノ酸配列Leu-Leu-Thr-Ser-Serを含み、エピモルフィン結合能を有し、２０以下のアミノ酸残基から成るものである。アミノ酸残基の数は、エピモルフィン結合能を有する限り、５から２０の範囲内の任意の数とすることができる。アミノ酸残基の数は好ましくは５から１５であり、より好ましくは５から１２であり、さらに好ましくは５から１０であり、特に好ましくは５、６または７である。
【００１１】
６以上のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドの場合、アミノ酸配列Leu-Leu-Thr-Ser-SerのＮ末端側および／またはＣ末端側に、合計のアミノ酸残基数が６から２０の範囲内になるように、１〜１４個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列が付加される。付加されるアミノ酸配列は、得られるオリゴペプチドがエピモルフィン結合能を有する限りは特に限定されず、任意のアミノ酸配列を選択することができる。
【００１２】
本発明の特に好ましい態様によれば、以下の（１）から（３）の何れかのアミノ酸配列から成るエピモルフィン活性制御オリゴペプチドが提供される。
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala （１）（配列番号１）
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys （２）（配列番号２）
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser （３）（配列番号３）
【００１３】
上記した本発明のオリゴペプチドが、エピモルフィンと結合能を有することは、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認可能である。
具体的には、エピモルフィンまたはその断片と本発明のオリゴペプチドとを好適な条件下で接触させることにより両者を結合させ、次いで、結合により生成した複合体を検出することにより両者の結合の程度を確認することができる。検出のためには、エピモルフィンまたはその断片、あるいは本発明のオリゴペプチドの何れかを標識しておくことが好ましい。エピモルフィンまたはその断片と本発明のオリゴペプチドとの結合反応後に、非特異的に結合した成分を除去し、結合体に存在する該標識を検出することにより、結合の程度を測定することができる。
【００１４】
また、上記したオリゴペプチドが、エピモルフィンと結合してその生理活性を制御することができることも、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認可能である。なお、本明細書において、生理活性を制御すると言う場合、それは、生理活性を抑制する場合と増大する場合の何れをも包含する意味を有する。
このような方法の具体例としては、以下の方法が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】
（１）C3HやC57BL/6マウスは生後45日から95日前後まで約50日間休止期が続くことが知られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が容易である。このマウスを使用し、被験物質の投与により、成長期への移行が促進されるか否か評価することにより、育毛活性を評価することが可能である。
【００１６】
（２）上皮性の新生毛包に存在する抗原（例えば、約２２０ｋＤａの抗原が挙げられる）を特異的に認識するモノクローナル抗体（例えば、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８５７８を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体）またはその断片を用いて育毛活性を評価することができる。より具体的には、生体由来の皮膚組織を被験物質の存在下で培養し、該皮膚組織片を回収し、上記のモノクローナル抗体またはその断片と反応させ、皮膚組織片と反応した該モノクローナル抗体またはその断片を検出または測定することにより、上皮性の新生毛包に存在する抗原の発現量を測定し、育毛活性を評価することができる。
【００１７】
本発明のオリゴペプチドは、各種の官能基で修飾された修飾オリゴペプチドでもよい。修飾オリゴペプチドにおける「修飾」という用語は、化学的修飾及び生物学的修飾を含めて最も広義に解釈しなければならない。修飾の例としては、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リン酸化、あるいはビオチン化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１８】
好ましい修飾オリゴペプチドとしては、ビオチン化されたオリゴペプチドを挙げることができ、より好ましくは修飾オリゴペプチドとして、スペーサーを介して又はスペーサーを介さずにビオチンがN-末端に結合したオリゴペプチドを挙げることができる。上記の修飾オリゴペプチドにおいて、ビオチンには所望の生理活性を損なわない限りにおいて適宜の化学的修飾が施されていてもよい。適宜の長さのスペーサーを介してビオチンをオリゴペプチドのN-末端に導入するためには、例えば、NHS-Biotin又はNHS-LC-Biotin(いずれピアース社から入手できる)などを用いることができる。
【００１９】
また、別の修飾オリゴペプチドとしては、オリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒドリル基により二量化したオリゴペプチドを挙げることができる。二量化したオリゴペプチドとしては、同一のオリゴペプチドを架橋することにより得られるホモ二量体オリゴペプチドでもよいし、異なる２種類のオリゴペプチドを架橋することにより得られるヘテロ二量体オリゴペプチドでもよい。
ホモ二量体又はヘテロ二量体オリゴペプチドは、上記した本発明の何れかのオリゴペプチドを架橋剤を用いて架橋することにより得ることができる。
【００２０】
本発明で用いる架橋剤として好ましくは、オリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒドリル基を活性化して、他のオリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒドリル基と共有結合を形成することができる、二官能性架橋剤を挙げることができる。
【００２１】
本発明で用いることができる二官能性架橋剤の具体例としては、ビスマレイミド化合物が挙げられ、例えば、水酸基などの置換基を有していてもよい低級アルキル基（例えば、炭素数１から１０、より好ましくは炭素数１から８のアルキル基）の両末端にマレイミド基のＮ原子が結合している化合物を挙げることができる。ビスマレイミド化合物の具体例としては、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、１，６−ビスマレイミドヘキサン、ビスマレイミドエタン、及び１，４−ビスマレイミドブタンなどが挙げられる。
【００２２】
さらに、上記した本発明の何れかのオリゴペプチド（改変オリゴペプチドや修飾オリゴペプチドを含む）中のシステイン残基に架橋剤が結合している、単量体オリゴペプチドも本発明の範囲内である。
【００２３】
さらに、上記オリゴペプチドの二量体のみならず、三量体以上の多量体も本発明の範囲に包含される。例えば、S-S結合により二量化したオリゴペプチドがさらに別のオリゴペプチドとS-S結合などにより架橋することにより形成した三量体以上の多量体も本発明の範囲に包含される。
【００２４】
上記した各種のオリゴペプチドは遊離形態であってもよいが、酸付加塩又は塩基付加塩として提供されてもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；又は、p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩；アンモニウム塩；メチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機アンモニウム塩を挙げることができる。グリシンなどのアミノ酸と塩を形成する場合もあり、また、分子内で対イオンを形成することもある。
【００２５】
さらに、これらのオリゴペプチド又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合がある。上記オリゴペプチドは複数の不斉炭素を有している。各不斉炭素の立体は特に限定されないが、アミノ酸残基はL-アミノ酸であることが望ましい。これらの不斉炭素に基づく光学活性体、ジアステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２６】
本発明のオリゴペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。ペプチド合成におけるアミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤については種々の成書があり、それらを参照することができる。固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及び脱離方法については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）、グリーン（T. W. Greene）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc.）（1981年）などを参照することができる。
【００２７】
また、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、上記オリゴペプチドをコードするDNA 配列を含む組み換えベクターを製造した後、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のオリゴペプチドを分離・精製することができる。もっとも、上記オリゴペプチドの製造方法はこれらの化学的方法及び生物学的方法に限定されることはない。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修飾オリゴペプチドの製造方法は当業者に周知されており、いかなる方法を用いてもよい。
【００２８】
本発明のオリゴペプチドは、エピモルフィンの機能解明の実験系においてエピモルフィンの活性を制御するための試薬として用いることができる。さらに、本発明のオリゴペプチドは、医薬の有効成分として有用である。本明細書における医薬という用語は、ヒトを含む哺乳類の病気の予防又は治療のほか、医薬部外品として分類される場合がある毛成長促進剤などを含めて最も広義に用いる。
【００２９】
本発明のオリゴペプチドは特に、発毛制御剤として使用することができ、より具体的には、毛成長促進剤または毛成長抑制剤として使用することができる。
本明細書において用いられる「毛成長促進剤」という用語は、育毛促進、発毛促進、及び脱毛予防などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
本明細書において用いられる「毛成長抑制剤」という用語は、育毛抑制、発毛抑制、及び脱毛促進などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００３０】
本発明の医薬の投与対象、薬効、並びに本発明の医薬による治療の対象疾患のその他の具体例を以下に列挙する。
（１）本発明のオリゴペプチドは、血管再生作用、再生促進作用、心臓血管再生作用、血管内皮細胞誘導作用などを示し、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病、重症狭心症、動脈硬化症などの治療及び予防に有用である（Exp Cell Res 1996 Jan 10, 222(1):189-98）
（２）本発明のオリゴペプチドは、膵臓上皮の形態形成に関与し、糖尿病などの治療および予防に有用である（J Cell Biol 2001, Mar 5;152(5):911-22）。
（３）本発明のオリゴペプチドは、肝臓の形成（再生）に関与し、肝代謝障害の治療および予防に有用である（Biochem Biophys Res Commun 1998 Sep 18; 250(2):486-90）。
（４）本発明のオリゴペプチドは、骨や歯の形成に関与し、歯周病、骨折、骨腫瘍、骨欠損、骨粗しょう症の治療および予防に有用である（Arch Oral Biol 1995 Feb;40(2):161-4）。
（５）本発明のオリゴペプチドは、肺分岐の形態形成や肺線維症に関与し、肺疾患の治療および予防に有用である（Biochem Biophys Res Commun 1997 May 19; 234(2):522-5；及びAm J Respir Cell Mol Biol 2000 Aug;23(2):168-74）。
（６）本発明のオリゴペプチドは、腸ひだの形成に関与し、腸疾患の治療および予防に有用である（Am J Physiol 1998 Jul; 275(1 Pt1):G114-24）。
（７）本発明のオリゴペプチドは、筋肉の構造に維持に関与し、例えば、筋ジストロフィー症の治療および予防に有用である（Histochem J 1998 Dec;30(12):903-8）。
（８）本発明のオリゴペプチドは、胆嚢上皮の形成に関与し、胆嚢疾患の治療および予防に有用である（Cell Tissue Res 2000 May; 300(2):331-44）
（９）本発明のオリゴペプチドは、乳上皮の形態形成に関与し、乳疾患の治療および予防に有用である（J Cell Biol 2001 May 14; 153(4):785-94）
【００３１】
本発明の医薬としては、上記のオリゴペプチド又は生理学的に許容されるその塩から選ばれる１又は２種以上の物質をそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて上記物質の１又は２種以上を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。上記のオリゴペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含む毛成長促進剤または毛成長抑制剤は、クリーム剤、噴霧剤、塗布用の溶液剤、又は貼付剤などとして外用剤として適用できるが、注射剤として患部に直接投与してもよく、毛成長促進剤または毛成長抑制剤としての使用目的に好適な形態の製剤として提供することが可能である。
【００３２】
例えば、シャンプーやリンスに有効成分である上記のオリゴペプチドを配合してもよく、上記のオリゴペプチドをリポソームなどに封入して製剤を調製してもよい。このような形態の組成物も本発明の医薬に包含される。皮膚のケラチン層を通して有効成分であるオリゴペプチドを効率的に経皮吸収させるために、適宜の界面活性剤や脂溶性物質などをクリーム剤などに配合することも好適である。上記の毛成長促進剤の投与量は使用目的、製剤形態、有効成分の種類などに応じて適宜選択可能であるが、例えば、成人一日当たり有効成分の投与量としては、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲内である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。
【００３３】
【実施例】
実施例１：ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
ファージディスプレイライブラリー（Ｐｈ．Ｏ．−Ｃ７Ｃ^TM（ニューイングランド・バイオラボ社））から可溶性で活性をもつエピモルフィン（フラグメントＨ１２）（Hirai et al, 2001, J.Cell.Biol., 153, 785-794）に結合するものをスクリーニングした。スクリーニング操作はライブラリーに添付のマニュアルに従って行い、組み換えエピモルフィンＨ１２に結合するペプチドをパニング法により取得した。
【００３４】
（１）パニング（panning）操作
（一日目）
１００μｇ／ｍｌの組み換えエピモルフィンＨ１２（Hirai et al, 2001, J.Cell.Biol., 153, 785-794）を含むＰＢＳ溶液を調製した。この溶液１．５ｍｌを２４ウエルプレートに添加し、表面が完全に湿潤するまで繰り返し回転した。湿潤容器内で穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。
【００３５】
（二日目）
１０ｍｌのＬＢ培地に大腸菌ＥＲ２７３８を接種した。溶出したファージが同日に増幅する場合は、２５０ｍｌの三角フラスコ中の２０ｍｌのＬＢにＥＲ２７３８を接種した。両方の培養物を激しく振とうしながら３７℃でインキュベートした。各プレートからコーティング溶液を除去し、きれいなペーパータオル上にたたいて、残りの溶液を除去した。
【００３６】
各プレートにブロッキング緩衝液を満たし、４℃で１時間以上インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、各プレートをＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）Tween20）で６回洗浄した。プレートの底と側面を回転させてコートし、溶液を捨て、きれいなペーパータオル上にたたいた。
【００３７】
２×１０¹¹ファージ（ライブラリー原液１０μｌ）を１ｍｌのＴＢＳＴで希釈し、コートしたプレート上にピペットで載せ、室温で６０分間穏やかに振とうした。未結合のファージを捨て、プレートをきれいなペーパータオル上にたたいた。プレートを上記と同様にＴＢＳＴで１０回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌの組み換えエピモルフィンＨ１２を含むＰＢＳ溶液１ｍｌを用いて結合したファージを溶出した。プレートを室温で１０〜６０分間穏やかに振とうした。溶出液をマイクロ遠心チューブにピペットで入れた。
【００３８】
２０ｍｌのＥＲ２７３８培養液（対数初期）に溶出液を添加し、激しく振とうしながら４．５時間３７℃でインキュベートした。培養液を遠心チューブに移し、４℃で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を新しいチューブに移し、再度遠心した。上清の上部８０％を新しいチューブにピペットで移し、１／６量のＰＥＧ／ＮａＣｌを添加した。ファージを４℃で一晩かけて沈殿させた。
【００３９】
（三日目）
ＰＥＧ沈殿物を４℃で１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を捨て、再度簡潔に遠心し、残った上清をピペットで除去した。ペレットを１ｍｌのＴＢＳに懸濁し、上清をマイクロ遠心チューブに移し、４℃で５分間遠心し、残りの細胞をペレットにした。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、１／６量のＰＥＧ／ＮａＣｌで再度沈殿させ、氷上で６０分間インキュベートした。４℃で１０分間遠心した。上清を捨て、再度簡潔に遠心し、マイクロピペットで残りの上清を除去した。
【００４０】
ペレットを０．０２％のＮａＮ₃を含むＴＢＳ（２００μｌ）に懸濁し、１分間遠心して、残りの不溶物をペレットにした。上清（即ち、増幅した溶出物）を新しいチューブに移した。増幅した溶出物の力価をＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ上で測定し、４℃で保存した。
【００４１】
上記の「一日目」に記載した操作に従い、２回目のパニング（panning）のためにプレートをコートした。
【００４２】
（四日目及び五日目）
青色のプラークを計数し、ファージ力価を測定した。この値を使用して、２×１０¹¹ｐｆｕに対応する投入値を計算した。投入ファージとして２×１０¹¹ｐｆｕの最初に増幅した溶出物を使用し、洗浄工程におけるTween濃度を０．５％（ｖ／ｖ）に増大して、上記の二日目及び三日目に記載した操作に従って２回目のパニングを行った。二回目の増幅溶出物の力価をＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上で測定した。
上記の「一日目」に記載した操作に従い、３回目のパニング（panning）のためにプレートをコートした。
【００４３】
（六日目）
投入ファージとして２×１０¹¹ｐｆｕの２回目に増幅した溶出物を使用し、洗浄工程において０．５％Tweenを使用して、上記の二日目及び三日目に記載した操作に従って３回目のパニングを行った。未増幅の３回目の溶出物の力価をＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上で測定した。３回目の溶出物の増幅は不要である。この力価測定から得たプラークを用いて配列決定した。
【００４４】
（２）結合クローンの同定
ＥＲ２７３８を一晩培養した培養物をＬＢ中に１：１００に希釈した。１ｍｌの希釈培養物を培養チューブに分配した。滅菌した木製の棒又はピペットチップを使用して、青色のプラークを刺し、希釈した培養物を含むチューブに移した。各プラークのＤＮＡ配列を決定した結果、全てLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaであった。
上記の結果から、組み換えエピモルフィンＨ１２に結合するペプチドに結合するペプチドとして、Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaが同定された。
【００４５】
実施例２：エピモルフィン配列中における Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala の結合領域の同定
Ｎ末端をビオチン化したLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaを合成し（合成は株式会社ベックスに委託）、１ｍｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドを含むＰＢＳ溶液を調製した。
【００４６】
エピモルフィンのアミノ酸配列１−３６（配列番号４）、３７−７０（配列番号５）、７１−９６（配列番号６）および９７−１１３（配列番号７）を有するペプチドを合成し、各ペプチドを１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ溶液（即ち、全部で４種の溶液）を調製した。
【００４７】
９６ウエルのＥＬＩＳＡ用プレート（イムノプレートマキシソープ；Nunc社製）に上記のエピモルフィンの部分ペプチドの溶液を５０μｌずつ注入し、一晩室温にてインキュベートし、吸着させた。各ウエルをＴＢＳで十分に洗浄後、５％スキムミルクを含むＴＢＳにて１時間ブロッキングした。
【００４８】
Ｎ末端をビオチン化したLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-AlaのＰＢＳ溶液をＳＴＢＳを用いて１／１００に希釈し、５０μｌをブロッキング済みのウエルに注入し、１時間インキュベートした。ウエルをＴＢＳで十分に洗浄後、ＨＲＰ（ホールラディッシュ・ペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン（アマシャム製）をＳＴＢＳで１／５００に希釈したものを添加し、１時間インキュベートした。ＴＢＳで十分に洗浄後、ＨＲＰの活性を常法により検出した。その結果、ペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaは、エピモルフィンのアミノ酸配列１−３６に結合することが判明した。
【００４９】
また、同様にして、このペプチドのＣ末端のアミノ酸１個または２個を欠失させたLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-LysおよびLeu-Leu-Thr-Ser-Serも、エピモルフィンのアミノ酸配列１−３６に結合することを確認した。
【００５０】
実施例３：アミノ酸配列 Leu-Leu-Thr-Ser-Ser を含むオリゴペプチドの発毛への影響
（１）新生毛包に特異的なモノクローナル抗体の作製
Ｂ５７ＢＬマウスの成長期（４８から５０日目）の皮膚から毛を切り取り、８M尿素、２％ＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ中で３７℃で一晩インキュベートし、タンパク質を抽出した。また、Ｂ５７ＢＬマウスのヒゲの毛包（毛球部に色素がついているもの；成長期）を実体顕微鏡で採取し、ＰＢＳ中にホモジナイズした。上記2種類の試料（タンパク質量として０．５ｍｇ）を混合し、等量のコンプリートアジュバンドと混合してミセルを作製した。
【００５１】
上記で得たミセル（０．２ｍｇ）をラット（Wister）の皮下（３箇所）に分けて投与して免疫した。初回免疫の１ヵ月後に上記と同様に追加免疫を行なった。さらに2週間後に上記と同様に２回目の追加免疫を行なった。２回目の追加免疫の３日後に、免疫ラットから脾臓を取り出し、メッシュにて血球成分を回収した。この血球成分の中には抗体産生細胞が含まれている。上記で回収した血球成分（全量）とマウスミエローマＰ３Ｕ１（ダルベッコ／ハムF１２混合培地）とをポリエチレングリコール１５００を用いて混合し、ダルベッコ／ハムF１２混合培地中に懸濁し（１０⁷細胞／ｍｌ）、９６ウエルプレートに各ウエル１００μｌずつ播いた。翌日、等量（１００μｌ）のＨＡＴ培地（シグマ社）を各ウエルに添加した。２日後に各ウエルから１５０μｌずつを吸引廃棄し、１５０μｌの新培地を各ウエルに添加した。９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ₂インキュベーター内に静置した。
【００５２】
成長期のＢ５７ＢＬマウスのヒゲの毛包を８Ｍ尿素中に超音波粉砕機を用いて溶解した。この溶液にニトロセルロースメンブレンを５分間浸し、ＰＢＳで十分に洗浄したものをBioradドットブロッターに装着したものを用いて、上記の９６ウエルプレートの各ウエルから回収したハイブリドーマ上清を一次スクリーニングした。先ず、上記で作製したBioradドットブロッターに装着したニトロセルロースメンブレンを、５％スキムミルクを溶解したトリスバッファー（ＴＢＳＴ）でブロッキングした後、９６ウエルの各ウエルにハイブリドーマ上清を１００μｌを添加した。１時間インキュベートした後、トリスバッファーで洗浄し、二次抗体であるホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（ＴＢＳＴに１μｇ／ｍｌで溶解したもの）を添加した。発色基質であるＥＣＬ試薬（アマシャムファルマシア）を添加して、発色の有無により成長期のヒゲの毛包と反応する抗体（全部で５０種類）を選出した（一次スクリーニング）。
【００５３】
上記の一次スクリーニングで選出した抗体（５０種類）について、成長期ヒゲ毛包の凍結切片（１０μｍ）を用いて特異的に反応にするものを選出した（二次スクリーニング）。具体的には、スライドガラス上に成長期ヒゲ毛包の凍結切片を置き、一次スクリーニングで選出されたハイブリドーマ上清を添加し、二次抗体で発色させた。具体的には、クライオスダト（ブライト社）で作成した成長期ヒゲ毛包の凍結切片を−２０℃メタノールで処理し、ＴＢＳＴで１時間ブロッキングを行った後、ハイブリドーマ上清を１時間反応させた。トリスバッファーで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ（ＴＢＳＴに１００μｇ／ｍｌで溶解したもの）を反応させた。トリスバッファーで洗浄後、カバーガラスをかけて、蛍光顕微鏡にて観察を行った。
【００５４】
二次スクリーニングの結果、全部で８種類の抗体を選出した。これらの抗体は表皮とは反応せず、毛包に特異的に反応するものであった。これら８種類の抗体を限界希釈法でクローニングした。
【００５５】
これら８種類の抗体について、成長期ヒゲ毛包又は休止期ヒゲ毛包をサンプルとしたウエスタンブロットで反応性を調べ、さらに毛包が形成されている１４日齢マウス胎児皮膚の切片試料を用いて反応性を調べた。その結果、成長期ヒゲ毛包及び形成途中毛包（新生毛包）と特異的に反応し、休止期ヒゲ毛包とは反応しないモノクローナル抗体としてｍＡｂ２７を取得した。モノクローナル抗体ｍＡｂ２７を産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８５７８として平成１３年１１月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００５６】
（２）エピモルフィン結合性オリゴぺプチドの毛成長促進作用の評価
１２日目のＩＣＲマウス胎児の上アゴ皮膚組織を実体顕微鏡で採取し、左と右に分けて５頭分を回収した。回収した５頭分の皮膚を左（コントロール用）と右（被験オリゴペプチド用）を別々に５個ずつ一枚のヌクレポアメンブレン（孔径８μｍ、直径１３ｍｍ）の上に載せ、実体顕微鏡で観察して外側が上になるようにした。１％ＢＳＡを含むダルベッコＭＥＭ／ハムＦ１２培地５００μｌを２４ウエルディッシュの２ウエルに添加し、片方には被験オリゴペプチド溶液（溶媒はＰＢＳ）を最終濃度２０μＭとなるように添加し、他方には溶媒（ＰＢＳ）を対照として同量入れた。被験オリゴペプチドとしては、Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala、Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys、及びLeu-Leu-Thr-Ser-Serを使用した。
【００５７】
皮膚組織を載せたメンブレン１枚ずつを上記のウエル中の溶液に浮かべ、３７℃で６日間培養した。メンブレンから５個の組織片をＳＤＳサンプルバッファ（ＳＤＳ０．０２ｇ／ｍｌ、グリセロール０．２ｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）１００μｌ中に回収し、超音波粉砕器により溶解した。対照も同様に処理した。上記処理で得た溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド４〜２０％）にて電気泳動後（３５ｍＡ、１．５時間）、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、５％スキムミルクを含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）中で１時間インキュベートした。上記で取得したｍＡｂ２７（ＴＢＳＴ中１０μｇ／ｍｌ）と１時間反応後、ＴＢＳにて十分に洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（アマシャム社）をＴＢＳＴで１／１０００に希釈したものを二次抗体として反応させ、十分に洗浄後、ＥＣＬキット（アマシャム社）を用いてｍＡｂ２７の反応の強さを調べた。
【００５８】
得られた結果を図１および図２に示す。
図１における各レーンの被験オリゴペプチドは以下の通りである。
左：Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala
右：対照
【００５９】
図１の結果から分かるように、左のレーンのバンドは右のレーンのバンドより弱い。この結果は、被験したオリゴペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaは、内在性のエピモルフィンの活性を抑制することにより、ｍＡｂ２７の抗原の発現を阻害し、発毛を阻害する活性を有することを示す。
【００６０】
図２における各レーンの被験オリゴペプチドは以下の通りである。
左から１番目：Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys
左から２番目：対照
左から３番目：Leu-Leu-Thr-Ser-Ser
左から４番目：対照
【００６１】
図２の結果から分かるように、オリゴペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-LysおよびLeu-Leu-Thr-Ser-Serを用いたレーンのバンドはそれぞれ対照のレーンのバンドより強い。これらの結果は、被験したオリゴペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-LysおよびLeu-Leu-Thr-Ser-Serは、内在性のエピモルフィンの活性を増大することにより、ｍＡｂ２７の抗原の発現を誘発させ、発毛を促進する活性を有することを示す。
【００６２】
【発明の効果】
本発明のオリゴペプチドは、エピモルフィン結合能を有し、エピモルフィンの活性を制御することができる。即ち、本発明のオリゴペプチドは、エピモルフィンの機能解明の実験系においてエピモルフィンの活性を制御するための試薬として用いることができる。さらに、本発明のオリゴペプチドは、毛成長促進剤や除毛剤などの医薬の有効成分としても有用である。
【００６３】
【配列表】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

【００７０】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、オリゴペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Alaを用いた発毛活性検定の結果を示す。
【図２】図２は、オリゴペプチドLeu-Leu-Thr-Ser-Ser-LysおよびLeu-Leu-Thr-Ser-Serを用いた発毛活性検定の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bioactive peptide. More specifically, the present invention relates to an oligopeptide capable of binding to epimorphin having a hair growth promoting action and controlling its physiological activity, and a pharmaceutical comprising the oligopeptide as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
It has been suggested that normal morphogenesis of epithelial tissue is controlled by factors derived from mesenchymal cells that exist around epithelial tissue, and many diseases caused by abnormal morphogenesis of epithelial tissue Since it is caused by an abnormality of mesenchymal cells, there is an interest in elucidating the mechanism by which mesenchymal cells control epithelial tissue morphogenesis. However, substances involved in the control of epithelial tissue morphogenesis are expressed in complex systems under temporal and spatial control, and it is extremely difficult to isolate these substances and analyze their functions. Due to the difficulty and the difficulty of building a model experiment system that simplifies the morphogenesis of epithelial tissue, no significant progress has been made in this field of research to date. In order to elucidate the pathogenesis of diseases caused by morphogenesis of epithelial tissues and to establish treatment methods for those diseases, analysis of the morphogenesis control mechanisms in epithelial tissues has been eagerly desired.
[0003]
Under such circumstances, epimorphin involved in the control of epithelial tissue morphogenesis was isolated and purified (Japanese Patent Laid-Open No. 6-25295). This substance is a physiologically active substance having a protein consisting of 277 to 289 amino acids as a core protein, and it has been revealed that it is mainly biosynthesized by mesenchymal cells. It has also been clarified that epimorphin acts on epithelial cells to promote epithelial tissue morphogenesis, and that normal tissue formation is not performed when epimorphin does not function. It was.
[0004]
Regarding the structure of epimorphin, it has been found that the epimorphin molecule is structurally divided into four fragments (European Patent Publication No. 0698666). That is, the polypeptide constituting the full length of epimorphin can be divided into a coiled-coil region (1), a functional domain (2), a coiled-coil region (3), and a C-terminal hydrophobic region from the N-terminal side. Among these fragments, the functional domain (region identified by the 104th to 187th amino acids from the N-terminus in human epimorphin) is involved in cell adhesion, and the physiological activity of epimorphin It has been suggested that it is closely related to expression (published in the above European Patent Publication).
[0005]
Since epimorphin has the action of promoting normal morphogenesis, this substance is useful as an active ingredient in medicines for prevention and treatment of diseases caused by abnormal morphogenesis, and medicines such as hair restorers. It is expected that However, natural epimorphin obtained from mammals is hardly soluble in an aqueous medium such as physiological saline, and it has been difficult to put it into practical use as a medicine. For this reason, an attempt has been made to create an epimorphin derivative having excellent solubility while substantially retaining the morphogenesis promoting action of natural epimorphin. For example, a modified body (fragment 123) from which the hydrophobic region at the C-terminal portion has been removed is known (Japanese Patent Laid-Open No. 6-25295).
It is known that a polypeptide having a partial structure of epimorphin acts on epithelial cells to promote morphogenesis of epithelial tissues (International Publication WO98 / 22505). This polypeptide is a polypeptide that can be dissolved in an aqueous medium such as physiological saline, and the above publication teaches that the polypeptide has a hair growth promoting action.
[0006]
As described above, various studies on epimorphin have been conducted, but no substance has been reported so far that binds to epimorphin and controls its activity.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a substance that can bind to epimorphin and control its activity. Another object of the present invention is to provide a medicament containing, as an active ingredient, a substance that binds to epimorphin and controls its activity.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent efforts to solve the above problems, the present inventors have found that an oligopeptide containing at least the amino acid sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser can bind to epimorphin and control its physiological activity. The invention has been completed.
[0009]
That is, according to the present invention, there is provided an epimorphin activity-control oligopeptide comprising at least the amino acid sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser, having epimorphin binding ability and comprising 20 or less amino acid residues. According to a preferred aspect of the present invention, there is provided an epimorphin activity-control oligopeptide consisting of any one of the following amino acid sequences (1) to (3).
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala (1)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys (2)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser (3)
According to another aspect of the present invention, there is provided a medicament comprising the above-described oligopeptide of the present invention or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The oligopeptide of the present invention comprises at least the amino acid sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser, has epimorphin binding ability, and consists of 20 or less amino acid residues. The number of amino acid residues can be any number within the range of 5 to 20 as long as it has epimorphin binding ability. The number of amino acid residues is preferably 5 to 15, more preferably 5 to 12, even more preferably 5 to 10, and particularly preferably 5, 6 or 7.
[0011]
In the case of an oligopeptide having 6 or more amino acid residues, the total number of amino acid residues is within the range of 6 to 20 on the N-terminal side and / or C-terminal side of the amino acid sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser. Thus, an amino acid sequence consisting of 1 to 14 amino acid residues is added. The amino acid sequence to be added is not particularly limited as long as the resulting oligopeptide has an epimorphin binding ability, and any amino acid sequence can be selected.
[0012]
According to a particularly preferred embodiment of the present invention, there is provided an epimorphin activity-control oligopeptide consisting of any one of the following amino acid sequences (1) to (3).
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala (1) (SEQ ID NO: 1)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys (2) (SEQ ID NO: 2)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser (3) (SEQ ID NO: 3)
[0013]
The above-described oligopeptide of the present invention has the ability to bind to epimorphin by the test method described in detail and specifically in the examples of the present specification, or by appropriately modifying or modifying the test method. Thus, it can be easily confirmed by those skilled in the art.
Specifically, epimorphin or a fragment thereof and the oligopeptide of the present invention are brought into contact with each other under suitable conditions to bind both, and then the degree of binding between the two is detected by detecting the complex formed by the binding. Can be confirmed. For detection, it is preferable to label either epimorphin or a fragment thereof or the oligopeptide of the present invention. After the binding reaction between epimorphin or a fragment thereof and the oligopeptide of the present invention, the degree of binding can be measured by removing the non-specifically bound component and detecting the label present in the conjugate. .
[0014]
In addition, the fact that the oligopeptide described above can bind to epimorphin and control its physiological activity also depends on the test method described in detail and specifically in the examples of the present specification or as appropriate for the test method. Those skilled in the art can easily confirm by adding alterations and modifications. In addition, in this specification, when it says that physiological activity is controlled, it has the meaning including both the case where the physiological activity is suppressed and the case where it increases.
Specific examples of such a method include, but are not limited to, the following methods.
[0015]
(1) It is known that C3H and C57BL / 6 mice have a rest period of about 50 days from 45 days to around 95 days after birth. In addition, since the skin color changes between pink in the rest period and gray or black in the growth period, it is easy to determine the hair cycle. Using this mouse, it is possible to evaluate hair growth activity by evaluating whether administration to the test substance promotes the transition to the growth phase.
[0016]
(2) A monoclonal antibody that specifically recognizes an antigen (for example, an antigen of about 220 kDa) present in an epithelial new hair follicle (for example, a monoclonal antibody produced by a hybridoma having the accession number FERM P-18578) Alternatively, the hair growth activity can be evaluated using the fragment. More specifically, the skin tissue derived from a living body is cultured in the presence of a test substance, the skin tissue piece is collected, reacted with the above-described monoclonal antibody or a fragment thereof, and the monoclonal antibody or By detecting or measuring the fragment, the expression level of the antigen present in the epithelial new hair follicle can be measured to evaluate the hair growth activity.
[0017]
The oligopeptide of the present invention may be a modified oligopeptide modified with various functional groups. The term “modification” in modified oligopeptides should be interpreted in the broadest sense, including chemical and biological modifications. Examples of modifications include functional group conversion such as alkylation, esterification, halogenation, or amination, oxidation, reduction, addition, or elimination, sugar compounds (monosaccharides, disaccharides, Oligosaccharides or polysaccharides) or lipid compounds and the like, phosphorylation, biotinylation, and the like, but are not limited thereto.
[0018]
Preferred modified oligopeptides may include biotinylated oligopeptides, and more preferably modified oligopeptides include biopeptides linked to the N-terminus with or without a spacer. Can do. In the above modified oligopeptide, biotin may be subjected to appropriate chemical modification as long as the desired physiological activity is not impaired. In order to introduce biotin into the N-terminus of the oligopeptide via a spacer having an appropriate length, for example, NHS-Biotin or NHS-LC-Biotin (which can be obtained from Pierce) can be used.
[0019]
Another modified oligopeptide includes an oligopeptide dimerized with a sulfhydryl group of a cysteine residue in the oligopeptide. The dimerized oligopeptide may be a homodimeric oligopeptide obtained by crosslinking the same oligopeptide or a heterodimeric oligopeptide obtained by crosslinking two different types of oligopeptides. .
A homodimer or heterodimer oligopeptide can be obtained by crosslinking any of the oligopeptides of the present invention described above using a crosslinking agent.
[0020]
The cross-linking agent used in the present invention is preferably a bifunctional compound that can activate a sulfhydryl group of a cysteine residue in an oligopeptide to form a covalent bond with a sulfhydryl group of a cysteine residue in another oligopeptide. A crosslinking agent can be mentioned.
[0021]
Specific examples of the bifunctional crosslinking agent that can be used in the present invention include a bismaleimide compound. For example, a lower alkyl group (for example, having 1 to 10 carbon atoms) optionally having a substituent such as a hydroxyl group. And, more preferably, a compound in which an N atom of a maleimide group is bonded to both ends of an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms. Specific examples of the bismaleimide compound include 1,4-bismalemidyl-2,3-dihydroxybutane, 1,6-bismaleimide hexane, bismaleimide ethane, 1,4-bismaleimide butane, and the like.
[0022]
Furthermore, a monomeric oligopeptide in which a crosslinking agent is bound to a cysteine residue in any of the oligopeptides of the present invention described above (including modified oligopeptides and modified oligopeptides) is also within the scope of the present invention. .
[0023]
Furthermore, not only the above-mentioned oligopeptide dimer but also a trimer or higher multimer is included in the scope of the present invention. For example, a multimer of trimer or higher formed by crosslinking an oligopeptide dimerized by S—S bond with another oligopeptide by S—S bond or the like is also included in the scope of the present invention.
[0024]
The various oligopeptides described above may be in a free form, but may be provided as an acid addition salt or a base addition salt. Examples of the acid addition salt include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate; or p-toluenesulfonate, methanesulfonate, citrate, oxalate, maleate, Mention may be made of organic acid salts such as tartrate. Examples of base addition salts include metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts; ammonium salts; organic ammonium salts such as methylammonium salts and triethylammonium salts. A salt may be formed with an amino acid such as glycine, and a counter ion may be formed within the molecule.
[0025]
Furthermore, these oligopeptides or salts thereof may exist as hydrates or solvates. The oligopeptide has a plurality of asymmetric carbons. The stereotype of each asymmetric carbon is not particularly limited, but the amino acid residue is preferably an L-amino acid. Optically active substances based on these asymmetric carbons, stereoisomers such as diastereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all included in the scope of the present invention.
[0026]
The oligopeptide of the present invention can be synthesized by a chemical method such as a solid phase method and a liquid phase method usually used for peptide synthesis. There are various books on protecting groups such as amino groups and condensing agents in condensation reactions in peptide synthesis, and these can be referred to. In the solid phase method, various commercially available peptide synthesizers can be used. If necessary, the synthesis can be efficiently performed by protecting and deprotecting the functional group. For methods for introducing and removing protecting groups, see, for example, Protective Groups in Organic Synthesis, TW Greene, John Wylie and Sons Incorporated (John Wiley & Sons, Inc. (1981).
[0027]
In addition, a recombinant vector containing a DNA sequence encoding the oligopeptide is produced according to a biological technique such as a normal gene expression procedure, and then a microorganism (transformant) transformed with the vector is prepared. A desired oligopeptide can be separated and purified from the culture in which the transformant is cultured. However, the production method of the oligopeptide is not limited to these chemical methods and biological methods. In addition, methods for producing modified oligopeptides including chemical modification or biological modification are well known to those skilled in the art, and any method may be used.
[0028]
The oligopeptide of the present invention can be used as a reagent for controlling the activity of epimorphin in an experimental system for elucidating the function of epimorphin. Furthermore, the oligopeptide of the present invention is useful as an active ingredient of a medicine. The term pharmaceutical in this specification is used in the broadest sense, including prevention or treatment of diseases in mammals including humans, and hair growth promoters that may be classified as quasi drugs.
[0029]
In particular, the oligopeptide of the present invention can be used as a hair growth regulator, and more specifically as a hair growth promoter or hair growth inhibitor.
As used herein, the term “hair growth promoter” should be interpreted in the broadest sense including hair growth promotion, hair growth promotion, hair loss prevention, etc., and should be interpreted in a limited manner in any sense. Don't be.
As used herein, the term “hair growth inhibitor” should be interpreted in the broadest sense including hair growth inhibition, hair growth inhibition, hair loss promotion, etc., and should be interpreted in a limited manner in any sense. Don't be.
[0030]
Other specific examples of the administration target of the medicament of the present invention, the drug efficacy, and the disease targeted for treatment by the medicament of the present invention are listed below.
(1) The oligopeptide of the present invention exhibits vascular regeneration action, regeneration promotion action, cardiovascular regeneration action, vascular endothelial cell induction action, etc., and chronic obstructive arteriosclerosis, Buerger's disease, severe angina pectoris, arteriosclerosis (Exp Cell Res 1996 Jan 10, 222 (1): 189-98)
(2) The oligopeptide of the present invention is involved in morphogenesis of pancreatic epithelium and is useful for the treatment and prevention of diabetes and the like (J Cell Biol 2001, Mar 5; 152 (5): 911-22).
(3) The oligopeptide of the present invention is involved in the formation (regeneration) of the liver and is useful for the treatment and prevention of liver metabolic disorders (Biochem Biophys Res Commun 1998 Sep 18; 250 (2): 486-90).
(4) The oligopeptide of the present invention is involved in the formation of bones and teeth, and is useful for the treatment and prevention of periodontal disease, fractures, bone tumors, bone defects, and osteoporosis (Arch Oral Biol 1995 Feb; 40 (2): 161-4).
(5) The oligopeptide of the present invention is involved in pulmonary branching morphogenesis and pulmonary fibrosis, and is useful for the treatment and prevention of lung diseases (Biochem Biophys Res Commun 1997 May 19; 234 (2): 522-5 And Am J Respir Cell Mol Biol 2000 Aug; 23 (2): 168-74).
(6) The oligopeptide of the present invention is involved in the formation of intestinal folds and is useful for the treatment and prevention of intestinal diseases (Am J Physiol 1998 Jul; 275 (1 Pt1): G114-24).
(7) The oligopeptide of the present invention is involved in the maintenance of muscle structure and is useful, for example, in the treatment and prevention of muscular dystrophy (Histochem J 1998 Dec; 30 (12): 903-8).
(8) The oligopeptide of the present invention is involved in the formation of gallbladder epithelium and is useful for the treatment and prevention of gallbladder disease (Cell Tissue Res 2000 May; 300 (2): 331-44)
(9) The oligopeptide of the present invention is involved in the morphogenesis of the breast epithelium and is useful for the treatment and prevention of breast diseases (J Cell Biol 2001 May 14; 153 (4): 785-94)
[0031]
As the medicament of the present invention, one or two or more substances selected from the above oligopeptides or physiologically acceptable salts thereof may be used as they are, but usually they are pharmaceutically acceptable 1 or It is preferable to produce and administer a pharmaceutical composition containing one or more of the above substances as an active ingredient using two or more kinds of pharmaceutical additives. The hair growth promoter or hair growth inhibitor containing one or more of the above oligopeptides as an active ingredient can be applied as an external preparation such as a cream, a spray, a coating solution, or a patch. It may be administered directly to the affected area as an injection, and can be provided as a preparation in a form suitable for the purpose of use as a hair growth promoter or hair growth inhibitor.
[0032]
For example, the above-mentioned oligopeptide which is an active ingredient may be blended in shampoo or rinse, and the preparation may be prepared by encapsulating the above-mentioned oligopeptide in a liposome or the like. Such a composition is also included in the medicament of the present invention. In order to efficiently percutaneously absorb the oligopeptide, which is an active ingredient, through the keratin layer of the skin, it is also preferable to mix an appropriate surfactant or fat-soluble substance into a cream or the like. The dose of the hair growth promoter can be appropriately selected according to the purpose of use, the form of preparation, the type of active ingredient, and the like. For example, the dose of the active ingredient per day for an adult is 1 μg / kg / day to It is within the range of 10 mg / kg / day, preferably 10 μg / kg / day to 1 mg / kg / day.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to a following example.
[0033]
【Example】
Example 1: Screening of phage display library
Phage display library (Ph.O.-C7C^TM(New England Biolabs) were screened for soluble and active epimorphin (fragment H12) (Hirai et al, 2001, J. Cell. Biol., 153, 785-794). The screening operation was performed according to the manual attached to the library, and peptides that bind to recombinant epimorphin H12 were obtained by the panning method.
[0034]
(1) Panning operation
(first day)
A PBS solution containing 100 μg / ml recombinant epimorphin H12 (Hirai et al, 2001, J. Cell. Biol., 153, 785-794) was prepared. 1.5 ml of this solution was added to a 24-well plate and rotated repeatedly until the surface was completely wet. Incubate overnight at 4 ° C. with gentle agitation in a wet container.
[0035]
(Day 2)
E. coli ER2738 was inoculated into 10 ml of LB medium. If the eluted phage amplified on the same day, ER2738 was inoculated into 20 ml LB in a 250 ml Erlenmeyer flask. Both cultures were incubated at 37 ° C. with vigorous shaking. The coating solution was removed from each plate and tapped on a clean paper towel to remove the remaining solution.
[0036]
Each plate was filled with blocking buffer and incubated at 4 ° C. for over 1 hour. The blocking solution was discarded and each plate was washed 6 times with TBST (TBS + 0.1% (v / v) Tween 20). The bottom and sides of the plate were rotated to coat and the solution was discarded and tapped on a clean paper towel.
[0037]
2 × 10¹¹Phage (10 μl of library stock solution) was diluted with 1 ml TBST, pipetted onto the coated plate and gently shaken for 60 minutes at room temperature. Unbound phage was discarded and the plate was tapped on a clean paper towel. The plate was washed 10 times with TBST as above. Bound phage was eluted using 1 ml of PBS solution containing 1 mg / ml recombinant epimorphin H12. The plate was gently shaken for 10-60 minutes at room temperature. The eluate was pipetted into a microcentrifuge tube.
[0038]
The eluate was added to 20 ml of ER2738 culture (initial logarithm) and incubated at 37 ° C. for 4.5 hours with vigorous shaking. The culture solution was transferred to a centrifuge tube, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was transferred to a new tube and centrifuged again. The top 80% of the supernatant was pipetted into a new tube and 1/6 volume of PEG / NaCl was added. The phage was precipitated overnight at 4 ° C.
[0039]
(third day)
The PEG precipitate was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded, briefly centrifuged again, and the remaining supernatant was removed with a pipette. The pellet was suspended in 1 ml TBS, and the supernatant was transferred to a microcentrifuge tube and centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes to pellet the remaining cells. The supernatant was transferred to a new microcentrifuge tube, precipitated again with 1/6 volume of PEG / NaCl and incubated on ice for 60 minutes. Centrifuge for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded, briefly centrifuged again, and the remaining supernatant was removed with a micropipette.
[0040]
Pellets were 0.02% NaN_ThreeWas suspended in TBS (200 μl) and centrifuged for 1 minute to pellet the remaining insoluble matter. The supernatant (ie amplified eluate) was transferred to a new tube. The titer of the amplified eluate was measured on LB / IPTG / Xgal and stored at 4 ° C.
[0041]
The plate was coated for the second panning according to the procedure described in “Day 1” above.
[0042]
(Day 4 and Day 5)
Blue plaques were counted and the phage titer was determined. Using this value, 2 × 10¹¹The input value corresponding to pfu was calculated. 2 × 10 as input phage¹¹Using the first amplified eluate of pfu, increasing the Tween concentration in the washing step to 0.5% (v / v), and performing the second panning according to the procedure described on the second and third days above Went. The titer of the second amplified eluate was measured on LB / IPTG / Xgal plates.
The plate was coated for the third panning according to the procedure described in “Day 1” above.
[0043]
(6th day)
2 × 10 as input phage¹¹The eluate amplified at the second time of pfu was used and a third panning was performed according to the procedure described above on the second and third days using 0.5% Tween in the washing step. The titer of the unamplified third eluate was measured on LB / IPTG / Xgal plates. A third round of amplification of the eluate is not necessary. Sequencing was performed using plaques obtained from this titration.
[0044]
(2) Identification of binding clones
An overnight culture of ER2738 was diluted 1: 100 in LB. 1 ml of diluted culture was dispensed into culture tubes. Using a sterile wooden stick or pipette tip, the blue plaque was stabbed and transferred to a tube containing the diluted culture. As a result of determining the DNA sequence of each plaque, all were Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala.
From the above results, Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala was identified as a peptide that binds to a peptide that binds to recombinant epimorphin H12.
[0045]
Example 2: in epimorphin sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala Of binding regions
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala in which the N-terminus was biotinylated was synthesized (composition was consigned to VEX Co., Ltd.) to prepare a PBS solution containing 1 mg / ml biotinylated peptide.
[0046]
Peptides having the amino acid sequences 1-36 (SEQ ID NO: 4), 37-70 (SEQ ID NO: 5), 71-96 (SEQ ID NO: 6) and 97-113 (SEQ ID NO: 7) of epimorphin were synthesized, and each peptide was synthesized. A PBS solution containing a concentration of 100 μg / ml (ie a total of 4 solutions) was prepared.
[0047]
50 μl of the above epimorphin partial peptide solution was injected into a 96-well ELISA plate (Immunoplate Maxisorp; manufactured by Nunc), and incubated overnight at room temperature for adsorption. Each well was thoroughly washed with TBS and then blocked with TBS containing 5% skim milk for 1 hour.
[0048]
A PBS solution of Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala with biotinylated N-terminus was diluted 1/100 with STBS, and 50 μl was injected into a blocked well and incubated for 1 hour. After wells were thoroughly washed with TBS, HRP (hole radish peroxidase) -labeled streptavidin (Amersham) diluted to 1/500 with STBS was added and incubated for 1 hour. After thoroughly washing with TBS, the activity of HRP was detected by a conventional method. As a result, it was found that the peptide Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala binds to amino acid sequence 1-36 of epimorphin.
[0049]
Similarly, Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys and Leu-Leu-Thr-Ser-Ser from which one or two amino acids at the C-terminal of this peptide have been deleted are also amino acids of epimorphin. Binding to sequence 1-36 was confirmed.
[0050]
Example 3: Amino acid sequence Leu-Leu-Thr-Ser-Ser Of Oligopeptides Containing Oxygen on Hair Growth
(1) Production of monoclonal antibodies specific for new hair follicles
Hair was cut from the skin of B57BL mice during the growth phase (days 48 to 50) and incubated overnight at 37 ° C. in PBS containing 8 M urea, 2% SDS, 100 mM DTT to extract the protein. In addition, hair follicles of bearded B57BL mice (having a pigment on the hair bulb; growing phase) were collected with a stereomicroscope and homogenized in PBS. The above two types of samples (0.5 mg as protein amount) were mixed and mixed with an equal amount of complete adjuvant to prepare micelles.
[0051]
The micelles (0.2 mg) obtained above were immunized by administration in the subcutaneous (3 places) of rats (Wister). One month after the first immunization, booster immunization was performed in the same manner as described above. Two weeks later, a second boost was performed in the same manner as described above. Three days after the second boost, the spleen was removed from the immunized rat, and blood cell components were collected using a mesh. This blood cell component contains antibody-producing cells. The blood cell components (total amount) collected above and mouse myeloma P3U1 (Dulbecco / Ham F12 mixed medium) are mixed using polyethylene glycol 1500 and suspended in Dulbecco / Ham F12 mixed medium (10⁷Cells / ml) and 100 μl of each well in a 96-well plate. The next day, an equal volume (100 μl) of HAT medium (Sigma) was added to each well. Two days later, 150 μl of each well was aspirated and discarded, and 150 μl of fresh medium was added to each well. A 96-well plate is treated with CO at 37 ° C.₂It left still in the incubator.
[0052]
The hair follicles of growing B57BL mice were dissolved in 8M urea using an ultrasonic grinder. The hybridoma supernatant collected from each well of the 96-well plate was subjected to primary screening using a solution in which a nitrocellulose membrane was immersed in this solution for 5 minutes and washed thoroughly with PBS and mounted on a Biorad dot blotter. First, the nitrocellulose membrane attached to the Biorad dot blotter prepared above was blocked with Tris buffer (TBST) in which 5% skim milk was dissolved, and then 100 μl of the hybridoma supernatant was added to each well of 96 wells. After incubation for 1 hour, the plate was washed with Tris buffer, and a secondary antibody, horseradish peroxidase-labeled anti-rat IgG (dissolved in TBST at 1 μg / ml) was added. An ECL reagent (Amersham Pharmacia), which is a chromogenic substrate, was added to select antibodies (50 types in total) that react with the hair follicles of the growing phase depending on the presence or absence of color development (primary screening).
[0053]
Of the antibodies (50 types) selected in the primary screening described above, those that were specifically reacted were selected using frozen sections (10 μm) of beard hair follicles during growth (secondary screening). Specifically, a frozen section of a beard hair follicle was placed on a slide glass, and the hybridoma supernatant selected in the primary screening was added and developed with a secondary antibody. Specifically, a frozen section of a growing beard hair follicle prepared by Kryosdato (Bright) was treated with -20 ° C methanol, blocked with TBST for 1 hour, and then the hybridoma supernatant was reacted for 1 hour. After washing with Tris buffer, FITC-labeled anti-rat IgG (dissolved in TBST at 100 μg / ml) was reacted. After washing with Tris buffer, it was covered with a cover glass and observed with a fluorescence microscope.
[0054]
As a result of the secondary screening, a total of 8 antibodies were selected. These antibodies did not react with the epidermis but reacted specifically with hair follicles. These 8 types of antibodies were cloned by the limiting dilution method.
[0055]
The reactivity of these 8 kinds of antibodies was examined by Western blot using samples of growing beard hair follicles or resting beard hair follicles, and using 14-day-old mouse fetal skin slice samples in which hair follicles were formed. The reactivity was investigated. As a result, mAb27 was obtained as a monoclonal antibody that reacts specifically with the growth period hair follicle and the formation hair follicle (new hair follicle) and does not react with the rest period hair follicle. The hybridoma producing the monoclonal antibody mAb27 was registered as an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as the accession number FERM P-18578. 6).
[0056]
(2) Evaluation of hair growth promoting action of epimorphin-binding oligopeptide
The upper jaw skin tissue of the ICR mouse fetus on the 12th day was collected with a stereomicroscope, and 5 animals were collected, divided into left and right. The collected five skins were placed on a single Nuclepore membrane (pore size: 8 μm, diameter: 13 mm) separately for the left (for control) and right (for test oligopeptide), and observed with a stereomicroscope. And the outside was on top. Add 500 μl of Dulbecco's MEM / Ham F12 medium containing 1% BSA to 2 wells of a 24-well dish, add the test oligopeptide solution (solvent is PBS) to one side to a final concentration of 20 μM, and the other to the solvent. (PBS) was added in the same amount as a control. Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala, Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys, and Leu-Leu-Thr-Ser-Ser were used as test oligopeptides.
[0057]
One membrane on each skin tissue was floated on the solution in the well and cultured at 37 ° C. for 6 days. Five tissue pieces were collected from the membrane in 100 μl of SDS sample buffer (SDS 0.02 g / ml, glycerol 0.2 g / ml, pH 6.8) and dissolved by an ultrasonic grinder. The control was treated similarly. The solution obtained by the above treatment was subjected to electrophoresis on SDS-PAGE (acrylamide 4 to 20%) (35 mA, 1.5 hours), transferred to a PVDF membrane, and in Tris buffer (TBST) containing 5% skim milk. Incubated for 1 hour. After reacting with mAb27 (10 μg / ml in TBST) obtained above for 1 hour, thoroughly washed with TBS, and a peroxidase-labeled anti-rat IgG (Amersham) diluted to 1/1000 with TBST as a secondary antibody After reacting and thoroughly washing, the strength of mAb27 reaction was examined using an ECL kit (Amersham).
[0058]
The obtained results are shown in FIG. 1 and FIG.
The test oligopeptides in each lane in FIG. 1 are as follows.
Left: Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala
Right: Control
[0059]
As can be seen from the results in FIG. 1, the band in the left lane is weaker than the band in the right lane. This result shows that the tested oligopeptide Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala inhibits the activity of endogenous epimorphin, thereby inhibiting the expression of mAb27 antigen and inhibiting hair growth. It shows having activity.
[0060]
The test oligopeptides in each lane in FIG. 2 are as follows.
First from left: Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys
2nd from left: control
3rd from left: Leu-Leu-Thr-Ser-Ser
4th from left: control
[0061]
As can be seen from the results in FIG. 2, the lane bands using the oligopeptides Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys and Leu-Leu-Thr-Ser-Ser are each stronger than the control lane band. These results indicate that the tested oligopeptides Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys and Leu-Leu-Thr-Ser-Ser increase the activity of endogenous epimorphin, thereby expressing mAb27 antigen. It has the activity to induce hair growth and promote hair growth.
[0062]
【The invention's effect】
The oligopeptide of the present invention has epimorphin binding ability and can control the activity of epimorphin. That is, the oligopeptide of the present invention can be used as a reagent for controlling the activity of epimorphin in an experimental system for elucidating the function of epimorphin. Furthermore, the oligopeptide of the present invention is also useful as an active ingredient of a medicament such as a hair growth promoter and a hair remover.
[0063]
[Sequence Listing]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of a hair growth activity assay using the oligopeptide Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala.
FIG. 2 shows the results of hair growth activity assay using oligopeptides Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys and Leu-Leu-Thr-Ser-Ser.

Claims

An epimorphin activity-control oligopeptide comprising the amino acid sequence of any one of (1) to (3) below.
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys-Ala (1)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser-Lys (2)
Leu-Leu-Thr-Ser-Ser (3)