JP3920741B2 - Substance detection reagent and detection method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液展開法を用いる物質の検出に関し、より詳しくは、半定量的な測定が可能な、物質の検出試薬（試験片）及び検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査などの分野において、特定の検出対象物質が被験試料中に存在するか否かを判定するための方法の一つとして免疫学的抗原抗体反応を利用した方法が広範に使用されている。例えば、妊娠により尿中に特定のホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）が排出されるため、これを測定することにより妊娠を判定する方法や、血液中に出現する特定の癌のマーカー蛋白質の測定による鑑別診断等がある。
【０００３】
ところで免疫学的抗原抗体反応を利用した方法には、一般に、高感度で精度の高い定量法、及び、操作が簡単で短時間で結果が得られる定性法の2種類があり、必要に応じて適宜使い分けられている。主な定量法としては、標識として酵素を用いた酵素免疫測定法（以下EIAと略記する）などがあり、また主な定性法としては微粒子を用いた粒子凝集法及び凝集阻止法ならびに有色微粒子を用いた着色法が知られている。着色法のなかではフロースルー法及びイムノクロマトグラフ法（以下イムノクロマト法と略記する）が最も一般的に知られており、これらの方法を利用した診断試薬が多数市販され、臨床検査に使用されている。
【０００４】
イムノクロマト法は、検出対象物質を含む試料及び反応微粒子（抗体を微粒子に結合させた複合体）が、抗体固定化部位を有する膜上をペーパークロマト法と同様の現象によって展開し、膜上の抗体固定化部位に展開流が到達したときに反応微粒子と膜上に固定化された抗体とが検出対象物質をサンドイッチ状に挟んだ複合体を形成し、このとき微粒子の色調が膜上に認められ、検出対象物質の存在が肉眼で確認できるという原理に基づいている。
【０００５】
尚、ここに例示した方法は抗体により検出対象物質（目的物）をサンドイッチして検出することから、その原理をサンドイッチ法と呼ぶ。ここで微粒子に結合させる物質を、目的物に対する抗体ではなく目的物そのものにすることにより、試料中の目的物と微粒子に結合した目的物が膜上の抗体に競争して結合する方法もあり、これはその競争の原理から競合法と呼ばれている。
【０００６】
サンドイッチ法と競合法にはそれぞれ一長一短があり、たとえば競合法は一般的にサンドイッチ法に比べて感度が低いため、あまり実用化の例を見ない。また、サンドイッチ法は競合法に比べれば感度は高いが、競合法には起こらないプロゾーンという現象が起きるため、結果の解釈を誤ることがある。すなわち、その原理から試料に検出対象物質が大量に含まれる場合はプロゾーンが出現し、あたかも検出対象物質が試料中に存在しないかのような結果を得るのである。そこでこの点についても検討が進められたが、プロゾーン領域を狭めることには成功したものの、結局無くすまでには至っていない。従って、試料中の検出対象物質がある範囲を超えた場合には、やはり試料中に検出対象物質が存在するにも関わらず、あたかも検出対象物質が存在しないかのような偽陰性の結果が得られることには変わりない。
【０００７】
また、イムノクロマト法に基づく検出試薬は、診断試薬として広範に利用されているが、これらの診断試薬は通常いずれもある一定レベルの検出対象物質が含まれるか否かの定性目的で使用されている場合がほとんどであり、このままで定量的な判定を行うことは困難であった。
【０００８】
従来の方法では、予め濃度の異なる抗体をメンブレンに塗布し、どの量の抗体と反応するかを確認することによって定量性をもたせる試みがなされている（特開平7-325085、特開平11−326326）が、この場合定量したいステップに応じて塗布する抗体量の数（ライン数又はスポット数）を必要とするため、より細かな読み取りを行いたい場合は非常に多くのライン又はスポットが必要となり、実際の小さなデバイス又はメンブレン上では限界がある。また、2種類以上の標識抗体を用意することによって出現するパターンを光学的に比較して定量性を持たせる（特開2001−083153）方法もあるが、得られる結果は定性法とそれほど変わらない。更に、通常の定性法に準じたイムノクロマトなどを行い、その色調を電子的又は光学的に測定する方法もあるが、このための専用装置が必要となるため、そもそも簡便性という性質が損なわれる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、試料中に含まれる検出対象物質を正確、簡便、迅速に、かつ半定量的に測定する検出試薬及び検出方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アフィニティークロマトグラフィーの原理を利用し、これまでのイムノクロマト法にさらに工夫を重ねることにより、半定量的に検出対象物質を測定できる方法及びキットを開発した。
【００１１】
すなわち、上記に述べたとおりイムノクロマト法では、検出対象である目的物を、目的物に対する抗体と、微粒子に結合させた同抗体とでサンドイッチするサンドイッチ法のみ、または目的物と同じ物質を微粒子に結合させて目的物と競合させる競合法のみのどちらか一方を行うことが一般的である。これらは先に述べたとおり各々に欠点があり、またこれらどちらか一方を行うだけでは定性反応の域を脱することが難しい。
【００１２】
そこでサンドイッチ法と競合法を同時に行わせることはそれぞれの短所を補って非常に判りやすい結果を得ることが出来ると考え、この両者を組み合わせることを発案した。
【００１３】
しかしながら単純にこれらの反応を組み合わせると、微粒子に結合させるものが目的物と同じ物質及び目的物に対する抗体となり、これらが各々目的物を介して（または介さずに）膜上に存在する目的物に対する抗体と結合すれば、その結果の解釈が非常に困難となる。
【００１４】
そこでまず始めに競合反応として、これまで多く行われてきたように微粒子に目的物と同じ物質を結合させたものを膜上で移動させるのではなく、微粒子には目的物に対する抗体を結合させたものを膜上で移動させ、さらに、膜上には目的物と同じ物質そのもの、及び目的物に対する抗体を別々に固定する方法を考案した。そして、この方法によって従来の方法と同様の競合反応を行わせることが出来ることを確認した。
【００１５】
このようにサンドイッチ法と競合法を同時に行わせることにより、従来の競合法の欠点であった測定範囲を広げ、かつサンドイッチ法で認められる偽陰性のリスクを回避することが出来た。さらに検出される色調を組み合わせることで、特定の機械を必要とすることも無く半定量的な測定を行うことに成功した。
【００１６】
以上の知見に基づき、本発明は完成された。従って、本発明は以下のものを提供する。
【００１７】
（１）標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質、
前記の標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と試料とを含む展開液を展開するための展開担体、ならびに、
前記展開担体上に設けられた、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定された第１の検出領域、及び、検出対象物質競合物質が固定された第２の検出領域を含む、検出対象物質の検出試薬。
【００１８】
（２）検出対象物質がアレルギー原因物質である（１）に記載の検出試薬。
【００１９】
（３）検出対象物質に特異的に結合する物質が検出対象物質に対する抗体である（１）または（２）に記載の検出試薬。
【００２０】
（４）検出対象物質が糖であり、該検出対象物質に特異的に結合する物質がレクチンである（１）に記載の検出試薬。
【００２１】
（５）標識物質が有色微粒子である（１）〜（４）のいずれかに記載の検出試薬。
【００２２】
（６）展開担体がニトロセルロース膜又はナイロン膜である（１）〜（５）のいずれかに記載の検出試薬。
【００２３】
（７）第１の検出領域における検出対象物質に特異的に結合する物質の固定量、及び、第２の検出領域における検出対象物質競合物質の固定量が、検出対象物質を含む展開液が展開されたときに第１及び第２の検出領域で生じる信号の強度の組合せによって、検出対象物質の濃度を判定するのに適したものである（１）〜（６）のいずれかに記載の検出試薬。
【００２４】
（８）標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と試料とを含む展開液を、展開担体上の第１の検出領域及び第２の検出領域を通して展開させ、第１及び第２の検出領域における信号に基づき物質を検出することを含む検出対象物質の検出方法であって、
第１の検出領域には検出対象物質に特異的に結合する物質が固定され、
第２の検出領域には検出対象物質競合物質が固定されている、前記検出方法。
【００２５】
（９）検出対象物質がアレルギー原因物質である（８）に記載の検出方法。
【００２６】
（１０）検出対象物質に特異的に結合する物質が検出対象物質に対する抗体である（８）または（９）に記載の検出方法。
【００２７】
（１１）検出対象物質が糖であり、該検出対象物質に特異的に結合する物質がレクチンである（８）に記載の検出方法。
【００２８】
（１２）標識物質が有色微粒子である（８）〜（１１）のいずれかに記載の検出方法。
【００２９】
（１３）展開担体がニトロセルロース膜又はナイロン膜である（８）〜（１２）のいずれかに記載の検出方法。
【００３０】
（１４）検出対象物質を含む展開液が展開されたときに、検出領域で生じる信号の強度の組合せによって、検出対象物質の濃度を判定することをさらに含む（８）〜（１３）のいずれかに記載の検出方法。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下本発明の実施の形態について説明する。
【００３２】
＜１＞検出試薬
本発明の検出試薬は、(a)標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質、(b)前記(a)の物質と試料とを含む展開液を展開するための展開担体、ならびに、(c)前記(b)の展開担体上に設けられた、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定された第１の検出領域、及び、検出対象物質競合物質が固定された第２の検出領域を含む、検出対象物質の検出試薬である。
【００３３】
検出対象物質は、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質などを例示することができる。本発明において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、ＤＮＡとDNA結合蛋白質との結合などが挙げられる。従って、検出対象物質が抗原性を有する場合、検出対象物質に特異的に結合する物質としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を例示することができる。また、検出対象物質が糖の場合、検出対象物質に特異的に結合する物質としてはレクチンタンパク質を例示することもできる。
【００３４】
検出対象物質の例としては、アレルギー原因物質が挙げられる。アレルギー原因物質の例としては、食物アレルギーの原因物質が挙げられ、食物アレルギーの原因物質を含む食物としては卵、乳、小麦、そば、落花生を例示することができる。
【００３５】
前記検出試薬は、物質間の親和力を利用したアフィニティークロマトグラフ法を応用したものである。また、検出対象物質に特異的に結合する物質がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合は、イムノクロマトグラフ法と定義することができる。従って、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定された第１の検出領域、及び、検出対象物質競合物質が固定された第２の検出領域が設けられ、第１の検出領域及び第２の検出領域に達する展開液に、標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質が含まれる他は、本発明の検出試薬は、通常のアフィニティークロマトグラフ法に用いられる検出試薬と同様でよい。
【００３６】
以下に、本発明の検出試薬を構成する要素及び本発明の検出試薬の使用法について詳述する。
【００３７】
（１）標識
検出対象物質に特異的に結合する物質の標識は、アフィニティークロマト法において通常に用いられる方法によって行うことができる。標識に用いられる標識物質としては、通常には、微粒子が用いられる。尚、以下の記載において、微粒子により標識されかつ検出対象物質検出対象物質に特異的に結合する物質を「反応微粒子」ということがある。
【００３８】
微粒子は、検出対象物質の存在を肉眼で判定するための標識であり、肉眼判定を容易にするためには有色であることが好ましい。材質としては、例えばポリスチレンラテックス等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子からなる均質な球状粒子、又は金コロイド等の金属コロイド粒子等、水不溶性素材が上げられる。尚、金属コロイド粒子は、その本質的な色があるため着色する必要は無い。また、無色であるものは、色素を用いて適宜着色すればよい。微粒子の粒径は、展開担体の孔径よりも小さくなければならないが、概ね0.01から5μmの範囲で使用でき、0.05から2μm程度が特に望ましい。
【００３９】
（２）展開担体
本発明に用いられる展開担体は、検出対象物質と抗検出対象物質抗体との結合を介して上記微粒子を間接的に補足するためのものであり、反応性物質を固定化することが出来、更にクロマトグラフィー担体として水溶液中で微粒子を展開することが出来るものであればよい。展開担体の形状は、通常には、膜である。材質としては、有孔の三次元構造膜、例えばナイロン膜、ニトロセルロース膜等が挙げられ、合成又は天然高分子膜のいずれでもよい。また、膜の孔径は反応微粒子が目詰まりを起こさず通過できるサイズであればよいが、0.2〜8μmの範囲であることが、特に望ましい。
【００４０】
（３）検出対象物質競合物質及び検出対象物質に特異的に結合する物質
本発明の検出試薬において、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定される第１の検出領域では、展開が行われたときに、検出対象物質と、固定化されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質との結合、及び、検出対象物質と、標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質との結合により、検出対象物質がサンドイッチされる。従って、本発明において、固定化されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と、標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質とは、検出対象物質における結合部位が異なる。このような結合部位が異なる、検出対象物質に特異的に結合する物質の組み合わせの選択は、当業者であれば、通常のサンドイッチ法の原理に基づき、容易に行うことができる。
【００４１】
本発明の検出試薬において、検出対象物質競合物質が固定される第２の領域では、展開が行われたときに、検出対象物質に特異的に結合する物質に対して、試料中の検出対象物質と、固定化された検出対象物質競合物質が競合する。従って、本発明においては、「検出対象物質競合物質」とは、検出対象物質に特異的に結合する物質への結合に関して、検出対象物質と競合する物質であればよいものであり、検出対象物質と同じ物質そのものだけでなく、検出対象物質と競合する限り、検出対象物質の部分に相当する物質や検出対象物質に類似する物質も包含する。例えば、検出対象物質が蛋白質であれば、その蛋白質に特異的に結合する物質が結合する該蛋白質由来のペプチドも検出対象物質に包含される。
【００４２】
検出対象物質競合物質及び検出対象物質に特異的に結合する物質を展開担体に固定する方法、ならびに標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質を標識物質に固定する方法は、物理吸着法、化学結合法、その他のいずれでもよい。すなわち、検出対象物質、検出対象物質に特異的に結合する物質、および標識された検出対象物質に特異的に結合する物質が、展開が行われる条件で展開担体または標識物質より脱離せず、さらに、固定化された検出対象物質競合物質と、標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質との結合、または、固定化された検出対象物質と特異的に結合する物質もしくは標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と、検出対象物質との結合を妨げないのであれば、どのような固定化手段を用いてもよい。
【００４３】
尚、以下の記載において、検出対象物質競合物質及び測定対象物質に特異的に結合する物質を固定化した膜を「反応性物質固定化膜」ということがある。
【００４４】
第１の検出領域における検出対象物質に特異的に結合する物質の固定量、及び、第２の検出領域における検出対象物質競合物質の固定量は、検出試薬に適用される試料に含まれ得る測定対象物質の量に応じて適宜選択される。これらの固定量は、検出対象物質を含む展開液が展開されたときに第１及び第２の検出領域で生じる信号の強度の組合せによって、検出対象物質の濃度を判定するのに適したものであることが好ましい。
【００４５】
固定化部位すなわち検出領域の、展開担体上における配置及び形状は、試料と、標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質とを含む展開液が両検出領域を通過する限り特に限定されない。展開液が、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定される第１の検出領域を通過した後に、検出対象物質競合物質が固定される第２の領域を通過するように、両検出領域を配置してもよいし、逆に、第２の検出領域を通過した後に、第１の検出領域を通過するようにしてもよい。また、展開液が、第１の検出領域及び第２の検出領域を、展開液の流れに対して並列に配置し、他方の検出領域を通過しない展開液が両検出領域を通過するようにしてもよい。検出領域の形状は、製造の容易さの点からは、展開液の流れ方向に対して垂直方向の線（ライン）状とされるのが通常である。
【００４６】
（４）測定試薬の任意の構成要素
標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質を含む展開液が展開されるような構成は、通常の、アフィニティークロマト法に用いられる試薬において採用されるものと同様でよい。例えば、標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質（コンジュゲート）を、展開液が展開されたときにコンジュゲートが移動するように保持する部材（コンジュゲートパッド）を設けることが挙げられる。コンジュゲートパッドは、コンジュゲートの性質に応じ適宜作製することができる。例えば、コンジュゲートが反応微粒子の場合には、以下のようにしてコンジュゲートパッドを作製できる。コロイド化学的安定性及び反応性物質の特異結合活性を保持させるため0.05〜3%(w/w)程度のウシ血清アルブミン、0.05〜10%(w/w)程度のポリエチレングリコール等の水溶性高分子、その他の安定剤及び防腐剤を含有した緩衝液に懸濁し、冷所で保管する。また使用にあたっては保管していた反応微粒子をコロイド化学的安定性を保持するために0.05〜10%(w/w)程度のポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、0.05〜10%(w/w)程度の界面活性剤及び0.05〜10%(w/w)程度の糖類などに懸濁し、グラスファイバーなどに染み込ませ乾燥させ、短冊状にする。
【００４７】
また、反応時のpHを調整するための緩衝液を含んで乾燥され、初めに測定対象物資を含む試料を吸収した時点でpHを調節するためのサンプルパッド及び展開液が検出領域を通過したあとで余分な水分を吸収するための吸収パッドなどのパッド類を設けてもよい。
【００４８】
サンプルパッド及びコンジュゲートパッドの配置については、いずれを上流（展開液の流れの方向に関して上流、以下同じ）に配置してもよい。
【００４９】
サンプルパッドをコンジュゲートパッドの上流に配置した場合には、サンプルパッドに適用された試料自体が展開液となって、または、試料に追加して適用した展開液が試料を含む展開液となって展開し、コンジュゲートパッドを通過することにより、試料とコンジュゲートとを含む展開液となる。サンプルパッドへの試料及び／または展開液の適用は、試料及び／または展開液のパッドへの滴下や、パッドの試料及び／または展開液への浸漬により行うことができる。
【００５０】
サンプルパッドをコンジュゲートパッドの下流に配置した場合には、コンジュゲートパッドの上流に展開液適用部を設ける。この場合、サンプルパッドに試料を滴下し、展開液適用部に展開液を適用することにより、展開液がまずコンジュゲートパッドを通過し、コンジュゲートを含む展開液となり、ついでサンプルパッドを通過することにより、試料とコンジュゲートとを含む展開液となる。
【００５１】
試料が液体であって微量のものでない場合には、試料自体を展開液として用いることができるので、サンプルパッドを上流に配置する方が、構成が単純となって有利である。
【００５２】
サンプルパッドを試料等に浸漬する態様においては、コンジュゲートパッドが試料等に誤って浸漬され、コンジュゲートが試料等に拡散してしまうことを防ぐため、サンプルパッドの下流部からコンジュゲートパッドにかけての部分を非液体透過性の材料で覆うことが好ましい。非液体透過性材料は、試料等の浸漬が外部から目視で確認できるように透明であることが好ましい。
【００５３】
展開担体の検出領域の下流には、コンジュゲート自体を捕捉する物質を固定した参照領域を設けることもできる。後述するように、試料中に含まれる検出対象物質の量に依存して、第１及び第２の検出領域のいずれにも又は一方に可視シグナルが生じないことがあるが、参照領域を設けておくことで、両検出領域のいずれにも又は一方に可視シグナルが生じないときでも反応の終了を確認することができる。
【００５４】
本発明の検出試薬は、二つの検出領域を設けることの他は、従来の方法と同様にして製造することができる。例えば、検出対象物質に特異的に結合する物質及び検出対象物質競合物質をそれぞれライン状に固定した展開担体、コンジュゲートパッド、サンプルパッド、及び、吸収パッドを作製し、これらを組み合わせて台紙などの支持体に貼り付け大きな短冊とし、それを端から細く切断し、スティック状にすることにより、検出試薬を作製することができる。この場合、台紙など支持体を吸収パッドの位置よりも延長させておくことができ、この延長部分は、スティック状にしたときに検出試薬のハンドル部として用いることができる。
【００５５】
（５）使用方法
上述のように、本発明の検出試薬は、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定された第１の検出領域、及び、検出対象物質競合物質が固定された第２の検出領域が設けられ、第１の検出領域及び第２の検出領域に達する展開液に、標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質が含まれる他は、本発明の検出試薬は、通常のアフィニティークロマトグラフ法に用いられる検出試薬と同様であり、従って、二つの検出領域においてシグナルを観察することの他は、その構成に応じて通常のアフィニティークロマトグラフ法に用いられる検出試薬と同様に使用できる。
【００５６】
以下、展開担体（膜）上に、サンプルパッド、反応微粒子を含むコンジュゲートパッド、検出対象物質に特異的に結合する物質及び検出対象物質競合物質を固定化した部位、ならびに、吸収パッドをこの順に設けた構成を有する検出試薬を例として、使用法を説明する。
【００５７】
検出試薬のサンプルパッド側を検出対象物質を含む試料に浸漬する。このとき、反応微粒子を含むコンジュゲートパッドまで浸漬しないように注意する。理由は、コンジュゲートパッドに含まれる反応微粒子が拡散してしまうことを防ぐためである。
【００５８】
試料溶液が十分にサンプルパッドに染み込み、液が上昇を始めたら検出試薬を取り出し、検出試薬を静置し一定時間放置する。試料中の検出対象物質はまず初めに反応微粒子と結合し、結合しなかったものも併せて一緒に膜上を毛細管現象により移動する。ここで膜上に検出対象物質に特異的に結合する物質（以下、第一の反応性物質と略記することがある）、続いて検出対象物質（以下、第二の反応性物質と略記することがある）の順に固定化部位が配置されている場合、まず反応微粒子と結合した測定対象物質は第一の反応性物質に捕捉され可視シグナルが生じる。また測定対象物質と結合しなかった反応微粒子は第二の反応性物質に捕捉され可視シグナルが生じる。より詳細に説明すると、例えば試料中に測定対象物質が存在しない場合は、反応微粒子と測定対象物質の複合体が生じないため、第一の反応性物質の固定化部位で可視シグナルを生じず、第二の反応性物質の固定化部位のみに可視シグナルが生じる。また、試料中に適度に測定対象物質が存在する場合は、第一の反応性物質の固定化部位及び第二の反応性物質の固定化部位の両方で可視シグナルが生じる。さらに、試料中に過度に測定対象物質が存在する場合は、第一の反応性物質には反応微粒子と結合していないフリーの測定対象物質が確率的に先に結合してしまうので、第一の反応性物質の固定化部位には反応微粒子による可視シグナルが生じず、また反応微粒子はすべて測定対象物質と結合するために第二の反応性物質とも反応しないので、第二の反応性物質の固定化部位にも可視シグナルが生じない。このとき、第一の反応性物質及び第二の反応性物質の固定量を調整することにより、ある一定の濃度の試料に対して第一の反応性物質及び第二の反応性物質の固定化部位に生じる可視シグナルの濃さを調整しておけば、両固定化部位の可視シグナル比較により半定量的測定を行うことができる。例えば、第一の反応性物質及び第二の反応性物質の固定化部位の可視シグナルの濃さが同等のときは0.1mg/mlで、また可視シグナルが両方とも検出されなくなる濃度が10mg/mlであるように調製してあれば、第一の反応性物質の固定化部位の可視シグナルが第二の反応性物質の固定化部位の可視シグナルよりも薄い場合には、試料中の測定対象物質の濃度は0.1mg/ml以下であり、また第一の反応性物質の固定化部位と第二の反応性物質の固定化部位の可視シグナルが同等であれば試料中の測定対象物質の濃度は0.1mg/ml程度であり、また第一の反応性物質の固定化部位の可視シグナルが第二の反応性物質の固定化部位の可視シグナルよりも濃い場合には試料中の測定対象物質の濃度は0.1〜10mg/mlの間であり、両方の可視シグナルが検出されない場合は10mg/mlよりも濃いと判断できる。さらに、数種の既知濃度の試料により得たパターンと比較すれば、これらの間の更に細かい可視シグナルのパターンを読み取ることも可能となり、より詳細な濃度の判定を行うことができる。
【００５９】
＜２＞検出方法
本発明の検出方法は、標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と試料とを含む展開液を、展開担体上の第１の検出領域及び第２の検出領域を通して展開させ、第１及び第２の検出領域における信号に基づき物質を検出することを含み、第１の検出領域には検出対象物質に特異的に結合する物質が固定され、第２の検出領域には検出対象物質競合物質が固定されている検出方法である。
【００６０】
検出対象物質、検出対象物質に特異的に結合する物質、標識物質、展開担体等は、本発明の検出試薬に関し説明したのと同様である。
【００６１】
展開液の展開は、展開液を二つの検出領域を通して展開させること、及び、検出領域に達する展開液に標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質を含ませることの他は、通常のアフィニティークロマト法と同様にして行うことができる。展開液に標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質とを含ませること、及び、展開液を二つの検出領域を通して展開させることは、上述の本発明の検出試薬を用いることにより行うことができる。
【００６２】
第１及び第２の検出領域における信号は、用いる標識物質に応じた方法により測定できる。例えば、標識物質として微粒子を用いた場合には目視により測定できる。
【００６３】
本発明の検出方法は、検出対象物質を含む展開液が展開されたときに、検出領域で生じる信号の強度の組合せによって、検出対象物質の濃度を判定することをさらに含んでもよい。これにより、半定量的な測定が可能になる。
【００６４】
＜３＞アレルギー原因物質の検出試薬及び検出方法
以下、測定対象物質がアレルギー原因物質である場合を例として説明する。
【００６５】
本試薬は膜と微粒子とを含み、微粒子と膜の一部には抗アレルギー原因物質抗体が固定化され、膜の別の部位にはアレルギー原因物質そのものまたは該抗アレルギー原因物質抗体が結合し得るアレルギー原因物質由来の主要ペプチドもしくはムコイドが固定化されている。
【００６６】
膜、微粒子及びサンプルパッド、吸収パッドについては前記＜１＞と同様である。
【００６７】
本発明のアレルギー原因物質測定試薬及びこれを用いた測定方法について説明する。また、アレルギー原因物質としては牛乳由来のβ−ラクトグロブリン（βLG）を例として説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６８】
（１）抗βLG抗体固定化微粒子を含むコンジュゲートパッド
反応性物質として抗βLG抗体を有色微粒子に固定化し、抗βLG抗体固定化微粒子懸濁液を作製する。抗βLG抗体はポリクローナル及びモノクローナルのいずれでもよく、既知の方法により作製することもできるが、また市販品を用いることも可能である。これをグラスファイバー上に適宜染み込ませ、乾燥させて抗βLG抗体固定化微粒子を含むコンジュゲートパッドとする。
【００６９】
（２）反応性物質固定化膜
反応性物質として抗βLG抗体及びβLGを固定した膜を調製する。抗βLG抗体は前記抗βLG抗体固定化微粒子を含むコンジュゲートパッドと同様の方法による。またβLGも牛乳から既知の方法により精製することも出来るが、また市販品を用いることも可能である。これらをメンブレンフィルター等の膜に点着、噴霧または印刷等の手法で固定し、抗βLG抗体及びβLG固定化膜を調製する。固定する量は、最終の測定試薬の感度等により適宜調整できるが、線状に固定する場合には１ｃｍ当たり0.5〜10μgの間が、特に望ましい。
【００７０】
（３）測定試薬
前記抗βLG抗体固定化微粒子を含むコンジュゲートパッド及び反応性物質固定化膜は前記＜１＞に記載したサンプルパッド及び吸収パッドを併せて台紙に貼り付け短冊状にしたのち、端から５mmの幅でカットすることにより測定試薬とする。
【００７１】
（４）βLG測定試薬の使用法
前記βLG測定試薬を用いてβLGの測定を以下のように実施する。
前記βLG測定試薬のサンプルパッド側を測定対象物質を含む試料に浸漬する。このとき、反応微粒子を含むコンジュゲートパッドまで浸漬しないように注意する。理由は、コンジュゲートパッドに含まれる反応微粒子が拡散してしまうことを防ぐためである。
【００７２】
試料溶液が上昇を始めたらスティックを取り出し、硬い実験台の上など吸収性のないものの上にスティックを静置し一定時間放置し、観察されるラインのパターンにより試料中に含まれるβLGの濃度を判定する。尚、本測定試薬で使用される検体は、βLGが含まれることが予想される液体、及び固体からの抽出液である。
【００７３】
（５）反応原理
前記βLG測定試薬の使用における反応原理を以下に示す。試料中のβLGはまず初めに抗βLG抗体固定化微粒子（反応微粒子）と結合し、結合しなかったものも併せて一緒に膜上を毛細管現象により移動する。ここで膜上で試料が反応する順序として抗βLG抗体、続いてβLGの順に固定化部位が配置されている場合、まず反応微粒子と結合したβLGは固定化された抗βLG抗体に捕捉され可視シグナルが生じる。またβLGと結合しなかった反応微粒子は固定化されたβLGに捕捉され可視シグナルが生じる。より詳細に説明すると、例えば試料中にβLGが存在しない場合は反応微粒子とβLGの複合体が生じないため、抗βLG抗体固定化部位で可視シグナルが生じず、βLG固定化部位のみに可視シグナルが生じる。また、試料中に適度にβLGが存在する場合は、抗βLG抗体固定化部位及びβLG固定化部位の両方で可視シグナルが生じる。さらに、試料中に過度にβLGが存在する場合は、膜上の抗βLG抗体には反応微粒子と結合していないフリーのβLGが確率的に先に結合してしまうので、抗βLG抗体固定化部位には反応微粒子による可視シグナルが生じず、また反応微粒子はすべて試料中のβLGと予め結合するために膜上のβLGまたはβLG由来のペプチドと反応しないので、βLG固定化部位にも可視シグナルが生じない。このとき、抗βLG抗体及びβLGの固定量を調整することにより、ある一定の濃度の試料に対して抗βLG抗体及びβLGの固定化部位に生じる可視シグナルの濃さを調整しておけば、両固定化部位の可視シグナルの比較により半定量的測定を行うことができる。例えば、抗βLG抗体及びβLGの固定化部位の可視シグナルの濃さが同等のときは0.1mg/mlで、また可視シグナルが両者とも検出されなくなる濃度が10mg/mlであるように調整してあれば、抗βLG抗体固定化部位の可視シグナルがβLG固定化部位の可視シグナルよりも薄い場合には、試料中のβLGの濃度は0.1mg/ml以下であり、また抗βLG抗体固定化部位とβLG固定化部位の可視シグナルが同等であれば試料中のβLGの濃度は0.1mg/ml程度であり、また抗βLG抗体固定化部位の可視シグナルがβLG固定化部位の可視シグナルよりも濃い場合には試料中のβLGの濃度は0.1〜10mg/mlの間であり、両方の可視シグナルが検出されない場合は10mg/mlよりも濃いと判断できる。さらに、数種の既知濃度の試料により得たパターンと比較すれば、これらの間の更に細かい可視シグナルのパターンを読み取ることも可能となり、より詳細な濃度の判定を行うことができる。
【００７４】
なお、上記の原理は、βLGの代わりに抗βLGが結合するβLG由来のペプチドを用いても同様であることは明らかである。
【００７５】
本発明の検出試薬及び検出方法は、その場で食品に含まれるアレルギー原因物質の迅速な測定が必要な場合に特に有利である。例えば、仮に牛乳のアレルギーを持つ患者が食事後アレルギーの発作を起こし、その原因に心当たりの無い場合、摂取した食品を本測定試薬を用いて測定することで、牛乳が予期せず混入している食品をスクリーニングすることが出来る。
【００７６】
本発明によるアレルギー原因物質の測定の実際を、たとえばオレンジジュースに混入した牛乳を想定して説明する。この時、摂取したオレンジジュースに上記（３）の態様の測定試薬のサンプルパッドの一部を浸漬し、液が上昇を始めたことを確認した時点で測定試薬を取り出し机の上などの固いもののうえに静置する。そこで一定時間放置することにより、可視シグナルのパターン（着色パターン）を観察することで牛乳の混入があったかどうか、またあったとすればどの程度の混入があったのかを判定する。
【００７７】
このような目的に使用できる検出試薬としては、βLGの標準品を用いてその濃度による有色微粒子の着色パターンを観察すると、1mg/ml〜１ng/mlの範囲で、濃度に応じた有色微粒子による異なる着色パターンを検出することができるものが挙げられる。
【００７８】
試料中に含まれるβLGの濃度を測定することが必要な場合には、試料を何段階か希釈して、そこで確認されるパターンを標準品によって確認したパターンと比較する。たとえば、通常の牛乳を試料とした場合には、10倍に希釈した牛乳を測定したときに観察された有色微粒子による着色パターンが、標準品の100μg/mlを測定した場合とほぼ同様のパターンを示し、また1,000倍に希釈した牛乳を測定した場合は、標準品の1μg/mlを測定した場合とほぼ同様のパターンを示し、さらには100,000倍に希釈した牛乳を測定した場合は、標準品の0.01μg/mlを測定した場合とほぼ同様のパターンを示す。
【００７９】
試料としてたとえばオレンジジュースを用いて牛乳を希釈した場合でも、試料に含まれるβLGのおおよその濃度を確認することができる。従って、たとえば市販のオレンジジュースなどに何らかの理由で牛乳成分が含まれている場合は、本測定試薬を用いることにより、その濃度を測定することができる。
【００８０】
尚、ここには例として牛乳中のβLGについて記載したが、発明はこれに限られるものではない。
【００８１】
【実施例】
次に実施例を示して、本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【００８２】
【実施例１】
測定試薬の作製
（１）抗βLG抗体
公知の方法により、抗βLGのポリクローナル抗体を作製した。すなわち市販βLG（ナカライ社製）を2mg/mlとなるようにPBSにて溶解し、フロイントの完全アジュバントと混合し、家兎に免疫した。その後、一定の期間を置いてフロイントの不完全アジュバントと混合した市販βLGを家兎に免疫し、4ヵ月後に家兎血清のβLGに対する力価が十分上昇したことを確認して採血を行った。さらに得られた抗血清を市販のプロテインAセファロースカラム（ファルマシア社製）にかけることによって、IgG画分を精製した。
【００８３】
（２）反応微粒子の調製
公知の方法により、コロイド金に前記（１）で作製したIgGを物理的に吸着させることにより、反応微粒子を得た。
【００８４】
（３）測定試薬の作製
A）反応性物質固定化膜の調製
上記（１）で作製したIgGおよび市販のβLG（ナカライ社製）を、各々精製水にて希釈し、IgG及びβLGについて1μg/cmとなるように、市販のニトロセルロース膜（ミリポア社製）に線着して固定した。十分に乾燥させ、のち非特異的な吸着を避けるためにブロッキングバッファー（0.05% ポリビニルピロリドン）にてブロッキングを行い、反応性物質固定化膜を得た。
【００８５】
B）反応微粒子を含むコンジュゲートパッドの作製
上記（２）で作製した反応微粒子を、1%シュクロース溶液にて希釈し、グラスフィルター（ワットマン社製）に浸漬したのち、十分に乾燥させ、コンジュゲートパッドを作製した。
【００８６】
C）緩衝液等を含むサンプルパッドの作製
反応をスムースに行わせるために、0.5%のTween20（和光純薬社製）を含むpＨ7.5となるように作製したPBSを市販の濾紙（S&S社製）に含ませ、十分に乾燥させ、サンプルパッドを作製した。
【００８７】
D）測定試薬の組み立て
上記A)、B)およびC)の膜およびパッド類と、さらには膜を展開した液を吸収するための吸収パッド（ワットマン社製）を粘着性の両面テープを貼り付けたプラスチックの台紙に順序よく貼り付け、短冊とした。この短冊を端から0.5ｃｍの幅となるようにカットして、イムノクロマト法による測定試薬とした。測定試薬の構造を図１に示す。なお、図１においては台紙は省略されている。
【００８８】
【比較例１】
比較試験用測定試薬（サンドイッチ法）の作製
実施例１において、βLGの線着をしなかったことの他は、実施例１と同様にして測定試薬を作製した。
【００８９】
【比較例２】
比較試験用測定試薬（競合法）の作製
実施例１において、IgGの線着をしなかったことの他は、実施例１と同様にして測定試薬を作製した。
【００９０】
【試験例１】
実施例１の測定試薬を用い、精製された市販のβLGを標準品として測定を行った場合に、濃度に応じた異なる有色微粒子の着色パターンが得られることを確認した。
【００９１】
（１）標準品
市販のβLG（ナカライ社製）を使用した。
【００９２】
（２）試験方法
実施例１の測定試薬を用い、濃度１mg/ml〜1ng/mlまで10n倍ずつに希釈した標準品について測定を行った。すなわち、各試料に実施例１の測定試薬のサンプルパッドを浸漬し、試料溶液が上昇を始めたら測定試薬を取り出し、水平に静置し、１０分放置した後、反応性物質固定化膜上に検出される有色微粒子による可視シグナルを観察した。
【００９３】
（３）結果
本試験の結果は図２に示すとおりである。図２は、標準品の各濃度における検出試薬の着色パターンの結果である。図中、サンドイッチ反応ラインは、抗βLG抗体固定化部位、競合反応ラインは、βLG固定化部位である。
【００９４】
標準品を用いて、各濃度による有色微粒子の着色パターンを観察した結果、1mg/ml〜１ng/mlの範囲で、濃度に応じた有色微粒子による異なる着色パターンを検出することができた。
【００９５】
【試験例２】
実施例１の測定試薬、比較例１の測定試薬（サンドイッチ法）及び比較例２の測定試薬（競合法）を用いて、検出結果（着色パターン）の比較を行った。
【００９６】
（１）標準品
市販のβLG（ナカライ社製）を使用した。
【００９７】
（２）試験方法
濃度１mg/ml〜1ng/mlまで10n倍ずつに希釈した標準品について、各々の試薬を用いて測定を行った。すなわち、各試料に各測定試薬のサンプルパッドを浸漬し、試料溶液が上昇を始めたら測定試薬を取り出し、水平に静置し、１０分放置した後、反応性物質固定化膜上に検出される有色微粒子による可視シグナルを観察した。
【００９８】
（３）結果
本試験の結果は図３及び表１に示す。図中、サンドイッチ反応ラインは、抗βLG抗体固定化部位、競合反応ラインは、βLG固定化部位である。
【００９９】
図３は、本発明の方法（実施例１）、サンドイッチ法（比較例１）、及び競合法（比較例２）による測定試薬の着色パターンの結果を示す。また、表１は図３の結果における判定結果を、陽性〔＋〕、陰性〔−〕、どちらとも判定できない〔±〕に区別して判定した結果である。
【０１００】
実施例１の測定試薬においては、濃度１mg/ml〜1ng/ml の範囲で、濃度に応じた有色微粒子による異なる着色パターンを検出することができた。しかしながら、比較例１の測定試薬（サンドイッチ法）では1ng/ml以上の範囲で可視シグナルが出現し+と判定できたものの、1mg/mL以上の濃さになると可視シグナルが出現せず、偽陰性の判定となった。また、比較例２の測定試薬（競合法）では可視シグナルが出現したのは1μg/mL以上であり、特に偽陰性は生じなかったものの、感度が不十分であった。
【０１０１】
【表１】
【実施例３】
実施例１の測定試薬を用い、牛乳中に含まれるβLG濃度の測定を行った。
【０１０３】
（１）標準品
市販のβLG（ナカライ社製）を使用した。
【０１０４】
（２）試料
試料として市販の牛乳（森永乳業社製）を用いた。
【０１０５】
（３）試験方法
試料の牛乳を水を用いて10倍、1,000倍および100,000倍に希釈し、実施例１の測定試薬を用いて測定を行った。すなわち、各試料にサンプルパッドを浸漬し、試料溶液が上昇を始めたら測定試薬を取り出し、水平に静置し、１０分放置した後、反応性物質固定化膜上に検出される有色微粒子による可視シグナルを観察した。また、濃度１mg/ml〜1ng/mlまで10n倍ずつに希釈した標準品についても同時に測定を行った。
【０１０６】
（４）結果
試料のパターンと種々の濃度のβLG標準品のパターンを比較することにより、牛乳を10倍希釈した試料のβLG濃度は約0.1mg/mlよりやや多く、また牛乳を1,000倍希釈した試料のβLG濃度は約1μg/mlよりやや多く、さらに100,000倍希釈した試料のβLG濃度は約0.01μg/mlよりやや多いと測定された。
【０１０７】
牛乳には通常約0.3%のβLGが含まれていることが知られている（社団法人 日本生化学会編、生化学ハンドブックI、1580頁、株式会社東京化学同人）。このことからも、今回の測定が正しく行われていることが確認された。
【０１０８】
【試験例４】
実施例１の測定試薬を用い、オレンジジュースを用いて牛乳を希釈した場合に、βLGの濃度が測定できるかどうかを確認した。
【０１０９】
（１）標準品
市販のβLG（ナカライ社製）を使用した。
【０１１０】
（２）試料
試料として市販の牛乳（森永乳業社製）を用いた。
【０１１１】
（３）試験方法
ａ）標準品を濃度１mg/ml〜1ng/mlまで市販のオレンジジュース（森永乳業社製）にて10n倍ずつに希釈して標準品の試料を調製し、実施例１の測定試薬を用いて測定を行った。すなわち、各試料にサンプルパッドを浸漬し、試料溶液が上昇を始めたら測定試薬を取り出し、水平に静置し、１０分放置した後、反応性物質固定化膜上に検出される有色微粒子による可視シグナルを観察した。
【０１１２】
ｂ）試料の牛乳を10倍、1,000倍および100,000倍となるようにオレンジジュースにて希釈し（含まれるβLGの濃度は各々300μg/ml、3μg/mlおよび0.03μg/mlとなる）、実施例１の測定試薬を用いて測定を行った。すなわち、各試料にサンプルパッドを浸漬し、試料溶液が上昇を始めたら測定試薬を取り出し、水平に静置し、１０分放置した後、反応性物質固定化膜上に検出される有色微粒子による可視シグナルを観察した。
【０１１３】
（４）結果
標準品のパターンと試料のパターンを比較した結果、たとえば10倍に希釈した牛乳（βLG含量＝約300μg/ml）を測定したときに観察された有色微粒子による着色パターンは、標準品の100μg/mlを測定した場合よりやや多いことを示唆するパターンを示し、また1,000倍に希釈した牛乳（βLG含量＝約3μg/ml）を測定した場合は、標準品の1μg/mlを測定した場合よりやや多いことを示唆するパターンを示し、さらには100,000倍の牛乳（βLG含量＝約0.03μg/ml）を測定した場合は、標準品の0.01μg/mlを測定した場合よりやや多いことを示唆するパターンを示した。従って、たとえば市販のオレンジジュースなどに牛乳成分が含まれている場合は、本測定試薬を用いることにより、含まれているか否かが判定できることは勿論、さらにその含まれている濃度を測定することができることが確認できた。
【０１１４】
【発明の効果】
本発明により、検出対象物質を簡便に短時間で半定量的に測定するための測定試薬及び測定方法が提供される。本発明の測定試薬及び測定方法は、サンドイッチ法や競合法単独では達成が困難であった広い測定可能な濃度範囲を得ることができ、サンドイッチ反応でしばしば問題となる偽陰性を生じにくく、プロゾーンの出現を回避することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１の測定試薬の構造を示す。なお、台紙は省略されている。
【図２】 試験例１における測定試薬の着色パターンを示す。
【図３】 試験例２における測定試薬の着色パターンを示す。
【符号の説明】
１ 膜
２ 抗βLG抗体固定化部位
３ βLG固定化部位
４ サンプルパッド
５ コンジュゲートパッド
６ 吸収パッド[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to detection of a substance using a solution development method, and more particularly to a substance detection reagent (test piece) and a detection method capable of semi-quantitative measurement.
[0002]
[Prior art]
In fields such as clinical examinations, a method using an immunological antigen-antibody reaction is widely used as one of methods for determining whether or not a specific detection target substance is present in a test sample. For example, since a specific hormone (human chorionic gonadotropin) is excreted in urine due to pregnancy, a method to determine pregnancy by measuring this, or measurement of a marker protein for a specific cancer that appears in blood There is a differential diagnosis by.
[0003]
By the way, in general, there are two types of methods using immunological antigen-antibody reaction: a highly sensitive and accurate quantitative method, and a qualitative method that is easy to operate and obtains results in a short time. They are properly used. The main quantification methods include enzyme immunoassay using enzyme as a label (hereinafter abbreviated as EIA), and the main qualitative methods include particle agglutination and aggregation prevention methods using fine particles and colored fine particles. The coloring method used is known. Among the coloring methods, the flow-through method and the immunochromatographic method (hereinafter abbreviated as immunochromatographic method) are the most commonly known, and many diagnostic reagents using these methods are commercially available and used for clinical tests. .
[0004]
In immunochromatography, a sample containing a substance to be detected and reaction microparticles (a complex in which antibodies are bound to microparticles) are developed on a membrane having an antibody-immobilized site by the same phenomenon as in paper chromatography, and the antibodies on the membrane When the development flow reaches the immobilization site, the reaction microparticles and the antibody immobilized on the membrane form a complex sandwiching the detection target substance, and the color of the microparticles is recognized on the membrane. This is based on the principle that the presence of the substance to be detected can be confirmed with the naked eye.
[0005]
Since the method exemplified here sandwiches and detects the detection target substance (target product) with an antibody, the principle is called a sandwich method. Here, there is also a method in which the target substance in the sample and the target substance bound to the microparticle are competitively bound to the antibody on the membrane by making the substance to be bound to the microparticles not the antibody against the target substance but the target object itself, This is called the competition law because of the principle of competition.
[0006]
The sandwich method and the competitive method each have advantages and disadvantages. For example, the competitive method is generally less sensitive than the sandwich method, and thus there are few examples of practical use. In addition, the sandwich method is more sensitive than the competitive method, but the prozone phenomenon that does not occur in the competitive method occurs, so the result may be misinterpreted. That is, when the detection target substance is contained in a large amount in the sample, the prozone appears from the principle, and the result is as if the detection target substance does not exist in the sample. Therefore, although this point was also studied, although it succeeded in narrowing the prozone area, it has not yet been eliminated. Therefore, when the detection target substance in the sample exceeds a certain range, a false negative result is obtained as if the detection target substance does not exist even though the detection target substance exists in the sample. It will not change.
[0007]
In addition, detection reagents based on immunochromatography are widely used as diagnostic reagents, but these diagnostic reagents are usually used for qualitative purposes whether or not a certain level of detection target substance is included. In most cases, it is difficult to make a quantitative determination as it is.
[0008]
In the conventional method, an attempt has been made to give quantitativeness by applying antibodies having different concentrations to the membrane in advance and confirming which amount of the antibody reacts (JP-A-7-325085, JP-A-11-326326). However, in this case, the number of antibodies to be applied (number of lines or spots) is required depending on the step to be quantified. Therefore, if more detailed reading is desired, a very large number of lines or spots are required. There are limitations on actual small devices or membranes. In addition, there is a method of optically comparing patterns that appear by preparing two or more types of labeled antibodies to make them quantitative (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-083153), but the results obtained are not so different from the qualitative methods. . Furthermore, there is a method of measuring the color tone electronically or optically by performing immunochromatography or the like according to a normal qualitative method, but since a dedicated device for this is required, the property of simplicity is impaired in the first place.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and provides a detection reagent and a detection method for measuring a substance to be detected contained in a sample accurately, simply, rapidly and semi-quantitatively.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the present inventors have used the principle of affinity chromatography and further refined the conventional immunochromatography method to semi-quantitatively select the detection target substance. A method and kit have been developed that can be measured.
[0011]
That is, as described above, in the immunochromatography method, only the sandwich method in which the target substance to be detected is sandwiched between the antibody against the target substance and the same antibody bound to the microparticles, or the same substance as the target substance is bound to the microparticles. In general, only one of the competitive methods for competing with the target object is performed. Each of these has drawbacks as described above, and it is difficult to escape from the qualitative reaction zone only by performing one of these.
[0012]
Therefore, we thought that if the sandwich method and the competitive method were performed simultaneously, it was possible to obtain a very easy-to-understand result by compensating for the respective disadvantages.
[0013]
However, when these reactions are simply combined, what binds to the microparticles becomes the same substance as the target substance and an antibody against the target substance, and each of these targets against the target object existing on the membrane via (or without) the target substance. If it binds to an antibody, the results will be very difficult to interpret.
[0014]
Therefore, first, as a competitive reaction, an antibody against the target substance was bound to the microparticle instead of moving the same substance as the target substance to the microparticle on the membrane as has been done so far. A method has been devised in which a substance is moved on the membrane, and the same substance itself as the target substance and an antibody against the target object are separately immobilized on the film. And it confirmed that the same competitive reaction as the conventional method could be performed by this method.
[0015]
Thus, by allowing the sandwich method and the competitive method to be performed simultaneously, the measurement range, which was a drawback of the conventional competitive method, was expanded, and the risk of false negatives recognized by the sandwich method could be avoided. Furthermore, by combining the detected color tones, we succeeded in semi-quantitative measurement without requiring a specific machine.
[0016]
Based on the above findings, the present invention has been completed. Accordingly, the present invention provides the following.
[0017]
(1) a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to a substance to be detected;
A developing carrier for developing a developing solution containing a substance labeled with the labeling substance and specifically binding to the detection target substance, and a sample; and
A detection target including a first detection region provided on the development carrier, to which a substance that specifically binds to a detection target substance is fixed, and a second detection region to which a detection target substance competitor is fixed Substance detection reagent.
[0018]
(2) The detection reagent according to (1), wherein the detection target substance is an allergy-causing substance.
[0019]
(3) The detection reagent according to (1) or (2), wherein the substance that specifically binds to the detection target substance is an antibody against the detection target substance.
[0020]
(4) The detection reagent according to (1), wherein the detection target substance is sugar and the substance that specifically binds to the detection target substance is lectin.
[0021]
(5) The detection reagent according to any one of (1) to (4), wherein the labeling substance is colored fine particles.
[0022]
(6) The detection reagent according to any one of (1) to (5), wherein the developing carrier is a nitrocellulose membrane or a nylon membrane.
[0023]
(7) The developing solution containing the detection target substance develops the fixed amount of the substance that specifically binds to the detection target substance in the first detection region and the fixed amount of the detection target substance competitive substance in the second detection region. The detection according to any one of (1) to (6), which is suitable for determining the concentration of the detection target substance based on a combination of signal intensities generated in the first and second detection regions when reagent.
[0024]
(8) A developing solution containing a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the detection target substance and the sample is developed through the first detection region and the second detection region on the development carrier, A method for detecting a substance to be detected, comprising detecting a substance based on a signal in a second detection region,
A substance that specifically binds to the detection target substance is fixed to the first detection region,
The detection method, wherein a detection target substance-competitive substance is fixed in the second detection region.
[0025]
(9) The detection method according to (8), wherein the detection target substance is an allergy-causing substance.
[0026]
(10) The detection method according to (8) or (9), wherein the substance that specifically binds to the detection target substance is an antibody against the detection target substance.
[0027]
(11) The detection method according to (8), wherein the detection target substance is sugar and the substance that specifically binds to the detection target substance is lectin.
[0028]
(12) The detection method according to any one of (8) to (11), wherein the labeling substance is colored fine particles.
[0029]
(13) The detection method according to any one of (8) to (12), wherein the development carrier is a nitrocellulose membrane or a nylon membrane.
[0030]
(14) The method according to any one of (8) to (13), further including determining the concentration of the detection target substance based on a combination of signal intensities generated in the detection region when the developing solution containing the detection target substance is developed. The detection method according to.
[0031]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below.
[0032]
<1> Detection reagent
The detection reagent of the present invention comprises (a) a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the substance to be detected, and (b) a developing carrier for developing a developing solution containing the substance (a) and a sample. And (c) a first detection region provided on the development carrier of (b), to which a substance that specifically binds to a detection target substance is fixed, and a detection target substance competitive substance are fixed It is a detection reagent for a detection target substance including a second detection region.
[0033]
The substance to be detected is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the substance is present, and includes proteins, peptides, sugars (especially sugar parts of glycoproteins, sugar parts of glycolipids, etc.), complex carbohydrates, etc. It can be illustrated. In the present invention, “specifically binds” means binding based on the affinity of a biomolecule. Examples of such binding based on affinity include antigen-antibody binding, sugar-lectin binding, hormone-receptor binding, enzyme-inhibitor binding, DNA-DNA binding protein binding, etc. Can be mentioned. Therefore, when the detection target substance has antigenicity, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be exemplified as a substance that specifically binds to the detection target substance. In addition, when the detection target substance is sugar, a lectin protein can be exemplified as a substance that specifically binds to the detection target substance.
[0034]
An example of the substance to be detected is an allergen causing substance. Examples of allergic substances include food allergy causative substances, and examples of foods containing food allergy causative substances include eggs, milk, wheat, buckwheat, and peanuts.
[0035]
The detection reagent is an application of affinity chromatography using the affinity between substances. In addition, when the substance that specifically binds to the detection target substance is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, it can be defined as an immunochromatographic method. Accordingly, a first detection region to which a substance that specifically binds to the detection target substance is fixed, and a second detection region to which the detection target substance competitive substance is fixed are provided, and the first detection region and the second detection region are provided. The detection reagent of the present invention is a detection reagent used in a normal affinity chromatography method, except that the developing solution reaching the detection region includes a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the detection target substance. It may be the same.
[0036]
Below, the element which comprises the detection reagent of this invention, and the usage method of the detection reagent of this invention are explained in full detail.
[0037]
(1) Sign
The labeling of the substance that specifically binds to the detection target substance can be performed by a method usually used in affinity chromatography. As a labeling substance used for labeling, usually fine particles are used. In the following description, a substance that is labeled with a fine particle and specifically binds to a detection target substance is sometimes referred to as a “reaction fine particle”.
[0038]
The fine particles are labels for determining the presence of the detection target substance with the naked eye, and are preferably colored in order to facilitate the naked eye determination. Examples of the material include water-insoluble materials such as synthetic spherical polymers such as polystyrene latex, homogeneous spherical particles made of natural polymers such as gelatin, or metal colloid particles such as gold colloid. The colloidal metal particles do not need to be colored because of their essential color. Moreover, what is colorless should just be colored suitably using a pigment | dye. The particle diameter of the fine particles must be smaller than the pore diameter of the developing carrier, but can be used in the range of about 0.01 to 5 μm, and about 0.05 to 2 μm is particularly desirable.
[0039]
(2) Deployment carrier
The developing carrier used in the present invention is for indirectly capturing the fine particles through the binding between the detection target substance and the anti-detection target substance antibody, and can immobilize the reactive substance. Any chromatography carrier that can develop fine particles in an aqueous solution may be used. The shape of the development carrier is usually a membrane. Examples of the material include a porous three-dimensional structure film such as a nylon film and a nitrocellulose film, and may be either a synthetic or natural polymer film. The pore diameter of the membrane may be any size that allows the reaction fine particles to pass through without clogging, but is particularly preferably in the range of 0.2 to 8 μm.
[0040]
(3) Substances that specifically bind to detection target substance competitors and detection target substances
In the detection reagent of the present invention, in the first detection region where a substance that specifically binds to the detection target substance is immobilized, when the development is performed, the detection target substance is immobilized and specific to the detection target substance. The detection target substance is sandwiched by the binding of the target binding substance and the binding of the detection target substance and the substance that is labeled and specifically binds to the detection target substance. Therefore, in the present invention, the substance that is immobilized and specifically binds to the detection target substance is different from the substance that is labeled and specifically binds to the detection target substance in the binding site of the detection target substance. A person skilled in the art can easily select a combination of substances having different binding sites and specifically binding to the detection target substance based on the principle of a normal sandwich method.
[0041]
In the detection reagent of the present invention, in the second region where the detection target substance-competitive substance is fixed, the detection target substance in the sample is compared with the substance that specifically binds to the detection target substance when the development is performed. And the immobilized detection target substance competitor compete with each other. Therefore, in the present invention, the “detection target substance competitor” may be any substance that competes with the detection target substance for binding to the substance that specifically binds to the detection target substance. In addition to the same substance itself, as long as it competes with the detection target substance, a substance corresponding to the detection target substance part or a substance similar to the detection target substance is also included. For example, if the substance to be detected is a protein, the peptide derived from the protein to which a substance that specifically binds to the protein binds is also included in the substance to be detected.
[0042]
The method of immobilizing the detection target substance competitor and the substance that specifically binds to the detection target substance on the developing carrier, and the method of immobilizing the labeled substance that specifically binds to the detection target substance to the labeling substance are the physical adsorption method. , Chemical bonding method, or any other method. That is, the detection target substance, the substance that specifically binds to the detection target substance, and the substance that specifically binds to the labeled detection target substance do not desorb from the development carrier or the labeling substance under the conditions under which the development is performed. , Binding of immobilized competitor substance to be detected and labeled substance that specifically binds to the substance to be detected, or substance that specifically binds to the immobilized substance to be detected or labeled and detected Any immobilization means may be used as long as the binding between the substance that specifically binds to the target substance and the detection target substance is not hindered.
[0043]
In the following description, a membrane on which a substance that specifically binds to a substance to be detected and a substance to be measured is immobilized may be referred to as a “reactive substance-immobilized film”.
[0044]
The fixed amount of the substance that specifically binds to the detection target substance in the first detection region and the fixed amount of the detection target substance competitive substance in the second detection region can be included in the sample applied to the detection reagent. It is appropriately selected according to the amount of the target substance. These fixed amounts are suitable for determining the concentration of the detection target substance based on a combination of the signal intensities generated in the first and second detection regions when the developing solution containing the detection target substance is developed. Preferably there is.
[0045]
The arrangement and shape of the immobilization site, that is, the detection region on the development carrier are not particularly limited as long as the development solution containing the sample and the substance that is labeled and specifically binds to the detection target substance passes through both detection regions. Both detection regions so that the developing solution passes through the second region to which the detection target substance competitor substance is fixed after passing through the first detection region to which the substance that specifically binds to the detection target substance is fixed. May be arranged, or conversely, after passing through the second detection region, it may be passed through the first detection region. Further, the developing solution is arranged such that the first detection region and the second detection region are arranged in parallel with the flow of the developing solution, and the developing solution that does not pass through the other detection region passes through both detection regions. Also good. The shape of the detection region is usually a line (line) perpendicular to the flow direction of the developing liquid from the viewpoint of ease of manufacture.
[0046]
(4) Arbitrary components of measurement reagent
A configuration in which a developing solution containing a substance that is labeled and specifically binds to the substance to be detected is developed may be the same as that employed in a normal reagent used for affinity chromatography. For example, a member (conjugate pad) that holds a labeled substance (conjugate) that specifically binds to the detection target substance so that the conjugate moves when the developing solution is developed can be mentioned. . The conjugate pad can be appropriately prepared according to the nature of the conjugate. For example, when the conjugate is a reactive fine particle, a conjugate pad can be prepared as follows. High water solubility such as bovine serum albumin of about 0.05 to 3% (w / w), polyethylene glycol of about 0.05 to 10% (w / w), etc. to maintain colloidal chemical stability and specific binding activity of reactive substances Suspend in a buffer containing molecules, other stabilizers and preservatives and store in a cool place. In addition, in order to maintain the colloidal chemical stability of the reaction fine particles stored in use, 0.05 to 10% (w / w) water-soluble polymer such as polyethylene glycol, 0.05 to 10% (w / w) Suspend in a surface active agent and about 0.05 to 10% (w / w) of saccharide, soak in glass fiber, etc. and dry to form a strip.
[0047]
In addition, after the sample containing the buffer for adjusting the pH during the reaction is dried and the sample containing the material to be measured is first absorbed, the sample pad for adjusting the pH and the developing solution pass through the detection region. Pads such as an absorption pad for absorbing excess moisture may be provided.
[0048]
About arrangement | positioning of a sample pad and a conjugate pad, you may arrange | position any upstream (upstream regarding the direction of the flow of a developing solution, and the same hereafter).
[0049]
When the sample pad is placed upstream of the conjugate pad, the sample itself applied to the sample pad becomes the developing solution, or the developing solution applied in addition to the sample becomes the developing solution containing the sample. By developing and passing through the conjugate pad, a developing solution containing the sample and the conjugate is obtained. The sample and / or the developing solution can be applied to the sample pad by dropping the sample and / or the developing solution onto the pad or immersing the pad in the sample and / or the developing solution.
[0050]
When the sample pad is disposed downstream of the conjugate pad, a developing solution application unit is provided upstream of the conjugate pad. In this case, by dropping the sample on the sample pad and applying the developing solution to the developing solution application section, the developing solution first passes through the conjugate pad, becomes a developing solution containing the conjugate, and then passes through the sample pad. Thus, a developing solution containing the sample and the conjugate is obtained.
[0051]
If the sample is a liquid and not a trace amount, the sample itself can be used as a developing solution. Therefore, it is advantageous to arrange the sample pad upstream because the configuration is simple.
[0052]
In an embodiment where the sample pad is immersed in the sample, etc., in order to prevent the conjugate pad from being accidentally immersed in the sample and the conjugate from diffusing into the sample, the sample pad is placed from the downstream part of the sample pad to the conjugate pad. The part is preferably covered with a non-liquid permeable material. The non-liquid permeable material is preferably transparent so that immersion of the sample or the like can be visually confirmed from the outside.
[0053]
A reference region to which a substance that captures the conjugate itself is fixed can be provided downstream of the detection region of the development carrier. As will be described later, depending on the amount of the detection target substance contained in the sample, a visible signal may not be generated in either or both of the first and second detection regions, but a reference region is provided. Thus, the completion of the reaction can be confirmed even when no visible signal is generated in either or both of the detection regions.
[0054]
The detection reagent of the present invention can be produced in the same manner as in the conventional method except that two detection regions are provided. For example, a development carrier, a conjugate pad, a sample pad, and an absorption pad in which a substance that specifically binds to a detection target substance and a detection target substance competitor are respectively fixed in a line are prepared, and these are combined to form a mount, etc. A detection reagent can be produced by sticking it to a support to form a large strip, cutting it thinly from the end, and making it into a stick shape. In this case, a support such as a mount can be extended beyond the position of the absorption pad, and this extended portion can be used as a handle portion of the detection reagent when the stick is formed.
[0055]
(5) How to use
As described above, the detection reagent of the present invention is provided with the first detection region to which the substance that specifically binds to the detection target substance is fixed, and the second detection region to which the detection target substance competitive substance is fixed. The detection reagent of the present invention is an ordinary solution except that the developing solution reaching the first detection region and the second detection region contains a substance that is labeled with the labeling substance and specifically binds to the detection target substance. It is the same as the detection reagent used in the affinity chromatography method. Therefore, it can be used in the same manner as the detection reagent used in the usual affinity chromatography method according to its configuration, except that the signal is observed in the two detection regions. it can.
[0056]
Hereinafter, a sample pad, a conjugate pad containing reactive microparticles, a site that specifically binds a substance to be detected and a substance to be detected and a competitor substance to be immobilized, and an absorption pad are arranged in this order on the development carrier (membrane). The method of use will be described using the detection reagent having the provided configuration as an example.
[0057]
The sample pad side of the detection reagent is immersed in a sample containing the detection target substance. At this time, care should be taken not to immerse the conjugate pad containing the reactive fine particles. The reason is to prevent the reaction fine particles contained in the conjugate pad from diffusing.
[0058]
When the sample solution is sufficiently infiltrated into the sample pad and the liquid starts to rise, the detection reagent is taken out, and the detection reagent is left to stand for a certain period of time. The substance to be detected in the sample first binds to the reaction microparticles, and the unbound substance moves together on the membrane by capillary action. Here, a substance that specifically binds to the detection target substance on the membrane (hereinafter sometimes abbreviated as a first reactive substance), and then a detection target substance (hereinafter abbreviated as a second reactive substance) When the immobilization sites are arranged in the order of (1), the measurement target substance bound to the reactive fine particles is first captured by the first reactive substance and a visible signal is generated. In addition, the reactive fine particles not bound to the measurement target substance are captured by the second reactive substance and a visible signal is generated. More specifically, for example, when the measurement target substance is not present in the sample, a complex of the reaction microparticles and the measurement target substance does not occur, so no visible signal is generated at the first reactive substance immobilization site, A visible signal is generated only at the immobilization site of the second reactive substance. In addition, when the measurement target substance is present in the sample in a moderate amount, a visible signal is generated at both the first reactive substance immobilization site and the second reactive substance immobilization site. Furthermore, when the measurement target substance is excessively present in the sample, the first reactive substance is probabilistically bound to the free measurement target substance that is not bound to the reactive fine particles first. No visible signal is generated by the reactive microparticles at the reactive substance immobilization site, and since all reactive microparticles bind to the measurement target substance and do not react with the second reactive substance, There is no visible signal at the immobilization site. At this time, by immobilizing the fixed amounts of the first reactive substance and the second reactive substance, the first reactive substance and the second reactive substance are immobilized on a sample having a certain concentration. If the intensity of the visible signal generated at the site is adjusted, a semi-quantitative measurement can be performed by comparing the visible signals of both immobilized sites. For example, the concentration of the visible signal at the immobilized site of the first reactive substance and the second reactive substance is 0.1 mg / ml when the concentration is the same, and the concentration at which both visible signals are not detected is 10 mg / ml. If the visible signal at the immobilization site of the first reactive substance is thinner than the visible signal at the immobilization site of the second reactive substance, the measurement target substance in the sample If the visible signal at the immobilized site of the first reactive substance and the immobilized site of the second reactive substance are equivalent, the concentration of the analyte in the sample is If the visible signal at the immobilization site of the first reactive substance is higher than the visible signal at the immobilization site of the second reactive substance, the concentration of the measurement target substance in the sample Is between 0.1 and 10 mg / ml and 10 mg / ml if both visible signals are not detected Remote dark it can be determined. Furthermore, if compared with patterns obtained from samples of several known concentrations, it is possible to read a finer visible signal pattern between them, and more detailed concentration determination can be performed.
[0059]
<2> Detection method
In the detection method of the present invention, a developing solution containing a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to a detection target substance and a sample is developed through the first detection region and the second detection region on the development carrier. Detecting a substance based on signals in the first and second detection areas, a substance that specifically binds to the detection target substance is fixed in the first detection area, and a detection is performed in the second detection area This is a detection method in which the target substance competitor is fixed.
[0060]
The detection target substance, the substance that specifically binds to the detection target substance, the labeling substance, the development carrier, and the like are the same as those described for the detection reagent of the present invention.
[0061]
The development of the developing solution is performed except that the developing solution is developed through the two detection regions, and that the developing solution reaching the detection region includes a substance that is labeled with the labeling substance and specifically binds to the detection target substance. It can be carried out in the same manner as in the usual affinity chromatography method. The above-described detection reagent of the present invention is used to include in the developing solution a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the detection target substance, and that the developing liquid is developed through the two detection regions. Can be performed.
[0062]
Signals in the first and second detection regions can be measured by a method corresponding to the labeling substance used. For example, when fine particles are used as the labeling substance, it can be measured visually.
[0063]
The detection method of the present invention may further include determining the concentration of the detection target substance based on a combination of signal intensities generated in the detection region when the developing solution containing the detection target substance is developed. Thereby, semi-quantitative measurement becomes possible.
[0064]
<3> Reagents and detection methods for allergen-causing substances
Hereinafter, a case where the measurement target substance is an allergy-causing substance will be described as an example.
[0065]
This reagent contains a membrane and fine particles, and the anti-allergic agent antibody is immobilized on a part of the fine particle and the membrane, and the allergic agent itself or the anti-allergic agent antibody can be bound to another part of the membrane. Main peptides or mucoids derived from allergens are immobilized.
[0066]
The film, fine particles, sample pad, and absorption pad are the same as in the above <1>.
[0067]
The allergy-causing substance measurement reagent of the present invention and the measurement method using the same will be described. In addition, as an allergen causing substance, milk-derived β-lactoglobulin (βLG) will be described as an example, but the present invention is not limited thereto.
[0068]
(1) Conjugate pad containing anti-βLG antibody-immobilized microparticles
Anti-βLG antibody is immobilized on colored microparticles as a reactive substance, and anti-βLG antibody-immobilized microparticle suspension is prepared. The anti-βLG antibody may be either polyclonal or monoclonal, and can be prepared by a known method, but a commercially available product can also be used. This is soaked on glass fiber as appropriate and dried to obtain a conjugate pad containing anti-βLG antibody-immobilized microparticles.
[0069]
(2) Reactive substance immobilization membrane
A membrane in which an anti-βLG antibody and βLG are immobilized as reactive substances is prepared. The anti-βLG antibody is obtained by the same method as the conjugate pad containing the anti-βLG antibody-immobilized microparticles. ΒLG can also be purified from milk by known methods, but commercially available products can also be used. These are fixed to a membrane such as a membrane filter by a technique such as spotting, spraying or printing to prepare an anti-βLG antibody and a βLG-immobilized membrane. The amount to be fixed can be appropriately adjusted depending on the sensitivity of the final measurement reagent and the like, but in the case of fixing in a linear form, it is particularly desirable to be between 0.5 and 10 μg per cm.
[0070]
(3) Measuring reagent
The conjugate pad containing the anti-βLG antibody-immobilized fine particles and the reactive substance-immobilized membrane are attached to the mount together with the sample pad and the absorbent pad described in the above <1>, and are formed into a strip shape. Cut the sample to obtain a measuring reagent.
[0071]
(4) How to use βLG measuring reagent
Using the βLG measuring reagent, βLG is measured as follows.
The sample pad side of the βLG measuring reagent is immersed in a sample containing the substance to be measured. At this time, care should be taken not to immerse the conjugate pad containing the reactive fine particles. The reason is to prevent the reaction fine particles contained in the conjugate pad from diffusing.
[0072]
When the sample solution starts to rise, remove the stick, leave the stick on a non-absorbable surface such as a hard laboratory table, and leave it for a certain period of time, and determine the concentration of βLG contained in the sample according to the observed line pattern. judge. Note that the specimen used in this measurement reagent is a liquid that is expected to contain βLG, and an extract from a solid.
[0073]
(5) Reaction principle
The reaction principle in the use of the βLG measuring reagent is shown below. ΒLG in the sample first binds to anti-βLG antibody-immobilized microparticles (reactive microparticles), and those that do not bind together move on the membrane by capillary action. Here, when the immobilized sites are arranged in the order of anti-βLG antibody and then βLG as the order in which the sample reacts on the membrane, βLG bound to the reaction microparticles is first captured by the immobilized anti-βLG antibody and visible signal Occurs. In addition, the reaction fine particles not bound to βLG are captured by immobilized βLG and a visible signal is generated. More specifically, for example, when βLG is not present in the sample, a complex between the reaction microparticles and βLG does not occur. Therefore, no visible signal is generated at the anti-βLG antibody immobilization site, and no visible signal is present only at the βLG immobilization site. Arise. When βLG is present in the sample in a moderate amount, a visible signal is generated at both the anti-βLG antibody immobilization site and the βLG immobilization site. Furthermore, if βLG is excessively present in the sample, the anti-βLG antibody on the membrane will be bound to the free βLG that is not bound to the reactive microparticles first, so the anti-βLG antibody immobilization site No visible signal is generated by the reaction microparticles, and since all the reaction microparticles bind in advance to βLG in the sample and do not react with βLG or βLG-derived peptides on the membrane, a visible signal is also generated at the βLG immobilization site. Absent. At this time, by adjusting the fixed amount of the anti-βLG antibody and βLG, if the density of the visible signal generated at the fixed site of the anti-βLG antibody and βLG is adjusted for a certain concentration of the sample, both Semi-quantitative measurements can be made by comparison of the visible signal at the immobilization site. For example, the concentration of the visible signal at the anti-βLG antibody and βLG immobilization sites should be 0.1 mg / ml when the concentration is the same, and the concentration at which no visible signal is detected is 10 mg / ml. For example, when the visible signal of the anti-βLG antibody immobilization site is thinner than the visible signal of the βLG immobilization site, the concentration of βLG in the sample is 0.1 mg / ml or less, and the anti-βLG antibody immobilization site and βLG If the visible signal at the immobilization site is equivalent, the concentration of βLG in the sample is about 0.1 mg / ml, and if the visible signal at the anti-βLG antibody immobilization site is higher than the visible signal at the βLG immobilization site The concentration of βLG in the sample is between 0.1 and 10 mg / ml, and if both visible signals are not detected, it can be judged that the concentration is higher than 10 mg / ml. Furthermore, if compared with patterns obtained from samples of several known concentrations, it is possible to read a finer visible signal pattern between them, and more detailed concentration determination can be performed.
[0074]
In addition, it is clear that the above principle is the same even when a peptide derived from βLG to which anti-βLG binds is used instead of βLG.
[0075]
The detection reagent and detection method of the present invention are particularly advantageous when it is necessary to quickly measure allergen-causing substances contained in food on the spot. For example, if a patient with milk allergy has a post-meal allergy attack, and the cause is unrecognizable, measuring the ingested food with this measuring reagent results in unexpected milk contamination. Food can be screened.
[0076]
The actual measurement of the allergen-causing substance according to the present invention will be described assuming milk mixed in orange juice, for example. At this time, immerse a part of the sample pad of the measurement reagent of the above aspect (3) in the ingested orange juice, and take out the measurement reagent when it is confirmed that the liquid starts to rise. Leave it on top. Therefore, by leaving it to stand for a certain period of time, it is determined whether or not milk has been mixed by observing the pattern of the visible signal (colored pattern), and if so, how much has been mixed.
[0077]
As a detection reagent that can be used for such a purpose, when a colored pattern of colored fine particles is observed using a standard βLG, it varies depending on the concentration depending on the colored fine particles in the range of 1 mg / ml to 1 ng / ml. The thing which can detect a coloring pattern is mentioned.
[0078]
When it is necessary to measure the concentration of βLG contained in the sample, the sample is diluted in several steps, and the pattern confirmed there is compared with the pattern confirmed by the standard product. For example, when normal milk is used as a sample, the coloring pattern due to colored fine particles observed when measuring 10-fold diluted milk is almost the same as when measuring 100 μg / ml of a standard product. When measuring milk diluted 1,000 times, it shows almost the same pattern as when measuring 1 μg / ml of the standard product, and when measuring milk diluted 100,000 times, The pattern is almost the same as when 0.01 μg / ml is measured.
[0079]
Even when milk is diluted using, for example, orange juice as a sample, the approximate concentration of βLG contained in the sample can be confirmed. Therefore, for example, when a commercially available orange juice or the like contains a milk component for some reason, its concentration can be measured by using this measurement reagent.
[0080]
Note that although βLG in milk is described here as an example, the invention is not limited to this.
[0081]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0082]
[Example 1]
Preparation of measurement reagent
(1) Anti-βLG antibody
An anti-βLG polyclonal antibody was prepared by a known method. That is, commercially available βLG (manufactured by Nacalai) was dissolved in PBS to 2 mg / ml, mixed with Freund's complete adjuvant, and immunized rabbits. After that, rabbits were immunized with commercial βLG mixed with Freund's incomplete adjuvant for a certain period of time, and blood was collected after confirming that the titer of rabbit serum against βLG was sufficiently increased 4 months later. Further, the obtained antiserum was applied to a commercially available protein A sepharose column (manufactured by Pharmacia) to purify the IgG fraction.
[0083]
(2) Preparation of reactive fine particles
Reaction IgG was obtained by physically adsorbing the IgG prepared in (1) above on colloidal gold by a known method.
[0084]
(3) Preparation of measurement reagent
A) Preparation of reactive substance-immobilized membrane
IgG prepared in (1) above and commercially available βLG (manufactured by Nacalai) are diluted with purified water, and IgG and βLG are diluted to 1 μg / cm on a commercially available nitrocellulose membrane (manufactured by Millipore). I fixed it in line. After sufficiently drying, in order to avoid non-specific adsorption, blocking was performed with a blocking buffer (0.05% polyvinyl pyrrolidone) to obtain a reactive substance-immobilized membrane.
[0085]
B) Preparation of conjugate pad containing reactive fine particles
The reactive fine particles produced in (2) above were diluted with a 1% sucrose solution, immersed in a glass filter (manufactured by Whatman), and then sufficiently dried to produce a conjugate pad.
[0086]
C) Preparation of sample pad containing buffer solution
In order to carry out the reaction smoothly, PBS prepared so as to have a pH of 7.5 containing 0.5% Tween 20 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was contained in a commercially available filter paper (manufactured by S & S) and sufficiently dried. A sample pad was prepared.
[0087]
D) Assembly of measurement reagent
Membranes and pads of A), B) and C) above, and an absorbent pad (made by Whatman) for absorbing the liquid developed on the membrane, in order, on a plastic mount with adhesive double-sided tape attached Pasted into a strip. This strip was cut to a width of 0.5 cm from the end, and used as a measurement reagent by immunochromatography. The structure of the measurement reagent is shown in FIG. In FIG. 1, the mount is omitted.
[0088]
[Comparative Example 1]
Preparation of measurement reagent for comparison test (sandwich method)
In Example 1, a measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that βLG was not attached.
[0089]
[Comparative Example 2]
Preparation of measurement reagent for comparison test (competitive method)
In Example 1, a measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 1 except that IgG was not attached.
[0090]
[Test Example 1]
When the measurement reagent of Example 1 was used and measurement was performed using purified commercially available βLG as a standard product, it was confirmed that colored patterns of different colored fine particles depending on the concentration were obtained.
[0091]
(1) Standard product
Commercially available βLG (manufactured by Nacalai) was used.
[0092]
(2) Test method
Using the measurement reagent of Example 1, concentration from 1 mg / ml to 1 ng /
[0093]
(3) Results
The results of this test are as shown in FIG. FIG. 2 shows the result of the coloring pattern of the detection reagent at each concentration of the standard product. In the figure, the sandwich reaction line is an anti-βLG antibody immobilization site, and the competitive reaction line is a βLG immobilization site.
[0094]
As a result of observing the coloring pattern of the colored fine particles according to each concentration using the standard product, different colored patterns due to the colored fine particles according to the concentration could be detected in the range of 1 mg / ml to 1 ng / ml.
[0095]
[Test Example 2]
The detection results (colored patterns) were compared using the measurement reagent of Example 1, the measurement reagent of Comparative Example 1 (sandwich method), and the measurement reagent of Comparative Example 2 (competitive method).
[0096]
(1) Standard product
Commercially available βLG (manufactured by Nacalai) was used.
[0097]
(2) Test method
Concentration from 1 mg / ml to 1 ng /
[0098]
(3) Results
The results of this test are shown in FIG. In the figure, the sandwich reaction line is an anti-βLG antibody immobilization site, and the competitive reaction line is a βLG immobilization site.
[0099]
FIG. 3 shows the result of the coloring pattern of the measurement reagent by the method of the present invention (Example 1), the sandwich method (Comparative Example 1), and the competitive method (Comparative Example 2). Table 1 shows the results of the determination in the results shown in FIG. 3 while distinguishing between positive [+] and negative [−] and [±] where neither can be determined.
[0100]
In the measurement reagent of Example 1, it was possible to detect different colored patterns due to colored fine particles according to the concentration within the range of the concentration of 1 mg / ml to 1 ng / ml. However, with the measurement reagent of Comparative Example 1 (sandwich method), a visible signal appeared in the range of 1 ng / ml or more, and it was judged as positive, but when the concentration was 1 mg / mL or more, no visible signal appeared and a false negative It became the judgment. Further, in the measurement reagent of Comparative Example 2 (competitive method), a visible signal appeared at 1 μg / mL or more, and although no false negative particularly occurred, the sensitivity was insufficient.
[0101]
[Table 1]
[Example 3]
Using the measurement reagent of Example 1, the βLG concentration contained in milk was measured.
[0103]
(1) Standard product
Commercially available βLG (manufactured by Nacalai) was used.
[0104]
(2) Sample
Commercially available milk (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was used as a sample.
[0105]
(3) Test method
The sample milk was diluted 10-fold, 1,000-fold and 100,000-fold with water, and the measurement was performed using the measurement reagent of Example 1. That is, the sample pad is immersed in each sample, and when the sample solution starts to rise, the measurement reagent is taken out, left to stand horizontally and left for 10 minutes, and then visible by the colored fine particles detected on the reactive substance-immobilized film. A signal was observed. Also, concentrations from 1 mg / ml to 1 ng /
[0106]
(4) Results
By comparing the pattern of the sample with the pattern of βLG standard at various concentrations, the βLG concentration of the sample diluted 10-fold milk is slightly higher than about 0.1 mg / ml, and the βLG concentration of the sample diluted 1,000-fold milk Was slightly higher than about 1 μg / ml, and the βLG concentration of a sample diluted 100,000 times was determined to be slightly higher than about 0.01 μg / ml.
[0107]
It is known that milk generally contains about 0.3% βLG (edited by the Japan Biochemical Society, Biochemistry Handbook I, page 1580, Tokyo Chemical Co., Ltd.). From this, it was confirmed that the current measurement was performed correctly.
[0108]
[Test Example 4]
Using the measurement reagent of Example 1, it was confirmed whether or not the concentration of βLG could be measured when milk was diluted with orange juice.
[0109]
(1) Standard product
Commercially available βLG (manufactured by Nacalai) was used.
[0110]
(2) Sample
Commercially available milk (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was used as a sample.
[0111]
(3) Test method
a) Standard products with a concentration of 1 mg / ml to 1 ng / ml with commercially available orange juice (Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) 10 n A sample of a standard product was prepared by diluting each time and measurement was performed using the measurement reagent of Example 1. That is, the sample pad is immersed in each sample, and when the sample solution starts to rise, the measurement reagent is taken out, left to stand horizontally and left for 10 minutes, and then visible by the colored fine particles detected on the reactive substance-immobilized film. A signal was observed.
[0112]
b) Dilute the sample milk with orange juice to be 10 times, 1,000 times and 100,000 times (concentrations of βLG contained are 300 μg / ml, 3 μg / ml and 0.03 μg / ml, respectively) Measurement was performed using 1 measuring reagent. That is, the sample pad is immersed in each sample, and when the sample solution starts to rise, the measurement reagent is taken out, left to stand horizontally and left for 10 minutes, and then visible by the colored fine particles detected on the reactive substance-immobilized film. A signal was observed.
[0113]
(4) Results
As a result of comparing the pattern of the standard product with the pattern of the sample, for example, the colored pattern due to colored fine particles observed when measuring milk diluted 10 times (βLG content = about 300 μg / ml) is 100 μg / ml of the standard product. Shows a pattern that suggests that it is slightly higher than when measured, and when milk diluted 1000 times (βLG content = approximately 3 μg / ml) is measured, it is slightly higher than when measuring 1 μg / ml of the standard product In addition, when measuring 100,000 times the milk (βLG content = about 0.03μg / ml), the pattern suggesting that it is slightly higher than the standard 0.01μg / ml Indicated. Therefore, for example, when milk components are contained in, for example, commercially available orange juice, it can be determined whether or not it is contained by using this measurement reagent, and further, the concentration contained in it can be measured. I was able to confirm.
[0114]
【The invention's effect】
The present invention provides a measurement reagent and a measurement method for simply and semi-quantitatively measuring a detection target substance in a short time. The measuring reagent and measuring method of the present invention can provide a wide measurable concentration range that was difficult to achieve by the sandwich method or the competitive method alone, and is unlikely to cause false negatives, which are often problematic in sandwich reactions. Can be avoided.
[Brief description of the drawings]
1 shows the structure of a measurement reagent of Example 1. FIG. Note that the mount is omitted.
FIG. 2 shows a coloring pattern of a measurement reagent in Test Example 1.
FIG. 3 shows a coloring pattern of a measurement reagent in Test Example 2.
[Explanation of symbols]
1 Membrane
2 Anti-βLG antibody immobilization site
3 βLG immobilization site
4 Sample pad
5 Conjugate pads
6 Absorption pad
Claims (14)
前記の標識物質により標識されかつ検出対象物質に特異的に結合する物質と試料とを含む展開液を展開するための展開担体、ならびに、
前記展開担体上に設けられた、検出対象物質に特異的に結合する物質が固定された第１の検出領域、及び、検出対象物質競合物質が固定された第２の検出領域を含む、検出対象物質の検出試薬。A substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the substance to be detected;
A developing carrier for developing a developing solution containing a substance labeled with the labeling substance and specifically binding to the detection target substance, and a sample; and
A detection target including a first detection region provided on the development carrier, to which a substance that specifically binds to a detection target substance is fixed, and a second detection region to which a detection target substance competitor is fixed Substance detection reagent.
第１の検出領域には検出対象物質に特異的に結合する物質が固定され、
第２の検出領域には検出対象物質競合物質が固定されている、前記検出方法。A developing solution containing a substance that is labeled with a labeling substance and specifically binds to the substance to be detected and a sample is developed through the first detection area and the second detection area on the development carrier, and the first and second A method for detecting a substance to be detected comprising detecting a substance based on a signal in a detection region,
A substance that specifically binds to the detection target substance is fixed to the first detection region,
The detection method, wherein a detection target substance-competitive substance is fixed in the second detection region.
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