JP3908836B2

JP3908836B2 - Antibody having granulocyte colony stimulating factor-inducing activity and pharmaceuticals thereof

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Publication number: JP3908836B2
Application number: JP26659197A
Authority: JP
Inventors: 良子青木; 大祐平野; 元直中村; 義介西
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: JPH11106400A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の誘導活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、G-CSFの誘導活性を有する抗体及びその一部、該抗体または該抗体フラグメントを含んでなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、分子量は約18000から22000で、ヒトの場合１７４個（まれに１７８個）、マウスで１７８個のアミノ酸で構成されている。血液成分の白血球の一種である好中球の分化増殖を誘導する糖タンパクである。
【０００３】
G-CSFは、成熟好中球の生存の延長や機能の亢進作用を有するが、エリスロポエチンによる赤芽球、インターロイキン３による芽球コロニーの形成も増強する。このようなG-CSFを産生する細胞としては、マクロファージ、ストローマ細胞、単球、Tリンパ球、繊維芽細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。
【０００４】
G-CSFを薬剤として投与することは、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の治療に効果を示す。しかし、投与時においては、血中安定性が低いために頻回投与を必要とし、しかも投与は静脈投与に限られているために患者、医師の双方に苦痛と負担を強いられてきた。さらに、G-CSFを薬剤として投与すると、副作用として骨痛を起こすことが報告されている。また、G-CSFを産生する細胞としてのマクロファージやストローマ細胞を直接投与することは、細胞であるために種々のタンパクや様々な物質を含んでいるために思わぬ副作用を起こす可能性があるため、そのような治療は行われていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記の如く、G-CSF自体を投与することによって好中球を分化増殖させる方法では、副作用として骨痛を惹起することばかりでなく、頻回投与が必要であり、患者及び医師にも苦痛と負担を強いられてきたため、他の治療方法の開発が強く要望されているが、未だ確立されていない。
【０００６】
そこで、本発明者らは、G-CSF自体を投与するのではなく、G-CSFを産生させ、好中球を分化増殖させることを考えた。本発明は、G-CSFを産生させる抗体を提供することを課題とする。本発明は、そのような臨床上でG-CSFの誘導剤の誘導に関わる分子の分離及び精製のための試薬として、また医薬品として極めて有用なG-CSF誘導抗体を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、まず、マクロファージ自体を免疫して抗体を取得し、得られた抗体の中からG-CSFを誘導する抗体の単離を行うこととした。以下、具体的に説明する。
【０００８】
本発明者らは、まず、マウスマクロファージ細胞株を免疫原としてMRL/lprマウス（自己免疫疾患マウス）に投与し、モノクローナル抗体の単離を行った。次いで、本発明者らは、得られたモノクローナル抗体を、免疫原細胞であるマウスマクロファージ細胞株に作用させ、該抗体の免疫原細胞に与える影響を検討した。この結果、本発明者らは、得られた抗体の一つが免疫原細胞株であるマウスマクロファージ細胞株から濃度依存的にG-CSFを産生させる特性を有することを見い出した（以下、この抗体を「3-4H7抗体」と称する）。
【０００９】
即ち、本発明は、マウスマクロファージ細胞株から濃度依存的にG-CSFを産生させる特性を有する抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含んでなる医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、
（１） G-CSF誘導活性を有する抗体又はその一部、例えば、
（２）抗体がモノクローナル抗体である（１）記載の抗体又はその一部、
（３）モノクローナル抗体が国際寄託番号FERM BP-6103であるハイブリドーマが産生する抗体である、（２）記載の抗体もしくはその一部。に関する。
【００１０】
また、本発明は、
（４）（２）又は（３）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、例えば、
（５）国際寄託番号FERM BP-6103であるハイブリドーマ、に関する。
【００１１】
さらに本発明は、
（６）（２）又は（３）記載のモノクローナル抗体を含んでなる医薬組成物、例えば、
（７）（２）又は（３）記載のモノクローナル抗体を含んでなる感染症の予防または治療のための医薬組成物、又は、
（８）（２）又は（３）記載のモノクローナル抗体を含んでなる好中球減少症の予防または治療のための医薬組成物、に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
本発明における「モノクロ−ナル抗体」は、マクロファージ細胞株に反応性を有するモノクローナル抗体であり、具体的には、G-CSFを産生させる作用を有するモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、マクロファージ細胞株に実質的に結合するという特性を有する。本発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。また、本発明のモノクローナル抗体には、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなるいずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適には、IgGまたはIgMイムノグロブリンクラスモノクローナル抗体である。
【００１３】
なお、マクロファージ細胞株は、例えば、自然発生の白血病細胞から調製したり、白血病ウイルスによる形質転換から調整することが可能である。
本発明の抗体は常法（例えば、文献「続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、日本生化学会編：東京化学同人発行、等」に記載の方法）に従って取得することができる。
例えば、本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、マクロファージ細胞株の全部または一部を抗原として、それに対して特異的親和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによって製造される。その操作は免疫抗原としてマクロファージ細胞株の全部または一部を使用する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
【００１４】
免疫抗原は、例えばマクロファージ細胞株そのものを用いるか、マクロファージ細胞株の膜画分若くは溶解抽出液の全部または一部を有する（ポリ）ペプチドの溶液又は例えば完全フロインドアジュバンドとを混和して調製される。免疫の対象として用いられる動物しては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、これらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内、または腹腔内に1乃至数回注射することにより行われる。
通常、初回免疫から約1〜2週間毎に1〜4度免疫を行い、さらに約1〜4週間後に最終免疫を行って、最終免疫より約3〜5日後に免疫感作された動物から抗体産生細胞が採取される。
本発明のモノクローナル抗体には、「国際寄託番号 FERM BP-6103」のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（3-4H7抗体）もしくはその一部または該抗体と実質的に同一の性状を有する抗体が含まれる。「3-4H7抗体」は、細胞からのG-CSF産生誘導能を有する。
【００１５】
また、本発明は、「国際寄託番号 FERM BP-6103」のハイブリドーマに関する。
本発明のハイブリドーマは、公知の方法で調製することが可能である。公知の方法としては、例えば、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製には、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature，Vol．256，pp．495-497，1975）及びそれに準じる修飾方法が挙げられる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培養することにより調製される。
培養は、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または哺乳動物の腹水から取得することができる。
【００１６】
細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ「P3/X63-AG8」、「P3/NSI/1-Ag4-1」、「P3/X63-Ag8.U1」、「SP2/0-Ag14」、「PAI」、「FO」または「BW5147」、ラット由来ミエローマ「210RCY3-Ag1.2.3」、ヒト由来ミエローマ「U-266AR1」、「GM1500-6TG-A1-2」、「UC729-6」、「CEM-AGR」、「D1R11」又は「CEM-T15」などを挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生する融合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えば、フローサイトメトリー、RIAやELISA等の酵素抗体法によって測定することにより行うことができる。
モノクローナル抗体の精製、単離は、上述のような方法によって取得される本発明のモノクローナル抗体を含有する血清、腹水あるいはハイブリドーマ培養上清をイオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインA若くはプロテインGカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付すること、または、カプロイン酸を添加することにより行うことができる。
【００１７】
本発明の「モノクローナル抗体」は、上述の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得られたものであってもよい。また、通常「モノクローナル抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノクローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包含するものである。ファージディスプレイでつくられるモノクローナル抗体、さらに、例えばヒトイムノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Fc領域）をヒトモノクローナル抗体のFc領域と組み換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（CDR：complementarity-determining residue）以外、全領域をヒトモノクローナル抗体の対応領域と組換えたヒト化モノクローナル抗体も本発明の「モノクローナル抗体」に包含される。
【００１８】
本発明において「抗体の一部」とは、少なくとも一つの可変領域を含有する抗体フラグメントの意であり、前述の本発明における抗体、好ましくはモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFv、F(ab')2、Fab'あるいはFabを指す。ここで、「F(ab')2」及び「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をタンパク質分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、IgGをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）からなるL鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）とからなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な2つの抗体フラグメントを製造することができる。これら2つの相同な抗体フラグメントをそれぞれFab'という。また、IgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記2つのFab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
【００１９】
モノクローナル抗体の細胞への結合活性は、例えば、抗体により染色したマクロファージ細胞株をフローサイトメトリーやELISA法などを用いて解析するなどの方法により検出することができる。
【００２０】
G-CSFの産生誘導活性を検出するためのマクロファージ細胞株は、レポーター遺伝子を導入したベクターを宿主細胞（マクロファージ細胞株）に導入することにより達成される。
レポーター遺伝子をプラスミドベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター等のベクターに導入し、細胞を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、宿主細胞に形質移入（トランスフェクト）することによりレポーター遺伝子を安定に保持した形質転換細胞を作製する。
【００２１】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主細胞内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主細胞内で増殖できるものであればよい。常法的に用いられるベクターとしてpUC119、λgt10、λgt11、ピッカジーンエンハンサーベクター２、pMC1 neo Poly A等が例示される。
【００２２】
プラスミドにG-CSF遺伝子の5'制御領域を組み込む方法としては、例えば、「Maniatis,T.ら,モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second edition）、Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53(1989)」に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにG-CSF遺伝子の5'制御領域を組み込む方法としては、Hyunh,T.V.らの方法（Hyunh,T.V.,DNA Cloning,a practical approach,1,49(1985)）などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、E.coli HB101，DH5またはMC1061/P3等）及び／または真核細胞（J774.1、PU5-1.8、RAW264.7、ST2）真核細胞の各種の適当な宿主細胞に導入する。
【００２３】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、「Maniatis,T.ら,モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second edition）,Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74(1989)」に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。また、ファージベクターを宿主細胞に導入する方法としてはファージDNAをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主細胞に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
【００２４】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテリアファージDNA）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13などが、酵母由来プラスミドとして、例えば、pSH19、pSH15などが、枯草菌由来プラスミドとして、例えば、pUB110、pTP5、pC194などが例示されるがこれらに制限されない。また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス[pVL1393（インビトロゲン社製）]などが例示されるがこれらに制限されない。
【００２５】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に制限はないが、例えば、大腸菌（pGEX-5X-1）、またはSV-40由来の発現ベクターなどが好ましい。
【００２６】
形質転換体は、所望の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞、または人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。
【００２７】
特に、大腸菌または動物細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（DH5，HB101等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2／0、NS−1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHKおよびCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1およびVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、2倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa等）などが例示される。その他、動物細胞としてはマクロファージ、ストローマ細胞、単球、Tリンパ球、繊維芽細胞、血管内皮細胞、若くはそれらの動物細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。
【００２８】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドンおよび複製可能単位から構成される。宿主細胞として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、所望遺伝子の5’側および3’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG，TGAなど）が例示される。
【００３０】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DNA配列を複製することができる能力をもつDNAをいい、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたDNAフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E．coliではプラスミドpBR322、もしくはその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント）が、酵母では酵母2μプラスミド、もしくは酵母染色体DNAが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149、プラスミドpME18S等があげられる。
【００３１】
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００３２】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００３３】
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
【００３４】
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なDNAフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００３５】
本発明に用いた発現ベクターの宿主細胞への導入[形質転換（形質移入）]は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（E．coli，Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，2110（1972）]、プロトプラスト法[Mol．Gen．Genet．，168，111（1979）]やコンピテント法[J．Mol．Biol．，56，209（1971）]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，1927（1978）]やリチウム法[J．Bacteriol．，153，163（1983）]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology，52，456（1973）]、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法[Mol．Cell．Biol．，3，2156-2165（1983）]によってそれぞれ形質転換することができる。
【００３６】
上記のごとく調整した宿主細胞からの所望タンパクの産生確認試験は、以下のように行えばよい。つまり、上記のごとく調整した宿主細胞には、上記ベクターの所望遺伝子部位にマーカー遺伝子を導入し、宿主細胞からマーカーとなるタンパクを産生させる。本発明抗体が、宿主細胞と結合することにより、産生したタンパクを検出すればよい。
【００３７】
ここで、所望遺伝子部位に用いるレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP）、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）などが挙げられる。
【００３８】
産生したタンパクを検出する方法としては、タンパクがルシフェラーゼの場合は、ルシフェラーゼアッセイ法を、タンパクがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の場合はCATアッセイ法を用いることができる。タンパクがグリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP）等の場合は蛍光測定法を用いることができる。
【００３９】
調製された本発明のモノクローナル抗体は、例えば、血液成分の白血球の一種である好中球が関与する疾患の検出や治療などに利用することが可能である。
【００４０】
本発明の抗体は、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の診断、予防および治療などのために用いることが可能である。本発明の抗体は通常、全身または局所的に、一般的には非経口の形で投与することができる。非経口投与の内でも特に好ましくは静脈内投与である。
【００４１】
投与量は、年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、投与するもの（全長のタンパク質、該タンパク質の一部を置換、欠失、挿入したタンパク質、該タンパク質の抗体の種類）などにより異なるが、成人一人当たり、一回につき10μgから100mgの範囲で、一日一回から複数回非経口投与することができるだろう。投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤などを包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤として混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水などが挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類などが挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）のような補助剤を含んでいてもよい。
これらはバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を例えば凍結乾燥法などによって製造し、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の組成物としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００４２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
[実施例1] モノクローナル抗体の調製
以下に述べる抗体産生ハイブリドーマの調製は、ケーラー（Kohler）らの方法（Blood、第81巻、101-111ペ−ジ、1993年、大森ら）を参照しながら行い、また、モノクロ−ナル抗体の調製は神奈木らの方法（Handbook of Experimental Immunology、第4巻、117.21-117.21ペ−ジ、1986年）を参照しながら行った。
まず、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7を免疫感作抗原として、該抗原をMRL/lprマウスに0日目、7日目、14日目および28日目（それぞれ10⁷個/匹）という間隔及び量で腹腔内投与した。最後の免疫感作から3日後に該マウスの脾臓を採取し、常法によりマウスミエロ−マ細胞PAI（Stocker,J.W.et al. Res.Disclosure,217:155(1982)）と融合させた。得られたハイブリドーマの各々の培養上清を、免疫原であるマクロファージ細胞に添加し、ELISA法でマクロファージ細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
【００４３】
[実施例2] マクロファージ細胞のG-CSF産生確認試験に使用するベクターの調整
実施例1で調製したモノクロ−ナル抗体のマクロファージ細胞に及ぼす効果を以下の方法で解析した。
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いたピッカジーンシステム（Picagene System（和光純薬工業（株）社製））を使用した。
ピッカジーンエンハンサーベクター２（和光純薬工業（株）社製）を用いてXho IサイトからNco Iサイトにかけて、G-CSFプロモーター遺伝子を挿入し、その下流にG-CSF遺伝子の代りにルシフェラーゼ遺伝子を結合させ、さらにSV40の下流のSal IサイトにpMC1Neo Poly Aから切り出したネオマイシン抵抗性遺伝子を挿入したPicaGCSFneoベクターを構築した。その結果を図１に示す。
【００４４】
[実施例3] ベクターのマクロファージへの導入
次に、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7に上記ベクターを以下の方法で導入した。対数増殖期のRAW264.7細胞株を収穫し、10％ウシ胎児血清（FCS；Bio-Whittacker社製）及び非必須アミノ酸（NEAA）を含むイーグル培地で一回洗浄し、同培地中に2×10⁷個／mlの濃度で再懸濁した。上記細胞懸濁液250μl（5×10⁶個）にキャパシタンスエクステンダーを付けたバイオ−ラッドジーンパルサーを用いて、300V、960μFで0.4cm エレクトロポレーションキュベット（electroporation cuvette）中で塩化セシウムで精製したPicaGCSFneoプラスミドDNA10μgを室温にてエレクトロポレーション法を用いて導入した。
【００４５】
[実施例4] クローンの選抜
形質転換して48時間後、得られた細胞をジェネチシン（ネオマイシンの一種）200μg/mlを含む培地でで処理し、コロニーを形成した細胞群を10乃至15日後、選抜した。50個のジェネチシン抵抗性クローンの内43個のクローンがリポポリサッカライド（LPS）で処理し検出可能なルシフェラーゼ活性を示した。そのなかでも、一つのクローンが極めて高いルシフェラーゼ活性を示し、RAW264.7クローン27-3と命名した。
【００４６】
なお、ルシフェラーゼ活性が実際のG-CSFmRNAの発現を反映していることは以下の実験で確認した。
18時間LPS10μg/mlで処理したRAW264.7クローン27-3細胞（1.5×10⁷個）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。全RNAを1％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で電気泳動させ、ナイロンフィルターに移し、³²PラベルマウスG-CSFのcDNAをプローブとしてノーザンブロット解析を行った。コントロールとしてフィルターを³²Pラベルβ-アクチンcDNAでハイブリダイゼーションを行った。
上記実験によって、ルシフェラーゼ活性が実際のG-CSFmRNAの発現を反映していることが確認された。
【００４７】
[実施例5] 抗体のマクロファージ細胞のG-CSF産生作用
G-CSF産生能を有する抗体をルシフェラーゼを指標に選別した。96ウェルマイクロプレートに、1ウェル当り5×10⁴個のマクロファージ細胞株を播き、37℃で24時間培養し、実施例1で選別したマクロファージ細胞に結合する抗体産生ハイブリドーマの培養上清液を添加し、さらに、37℃で18時間培養した。
ルシフェラーゼ測定は、Picagene Luminescence Kit（和光純薬社製）を用いて手引き書に従った。ルシフェラーゼ活性測定は、CT9000ルミノメーター（Dia-Iatron社製）で測定し、Bicinchoninic Acid（BCA）アッセイによりタンパク濃度を測定し、タンパクのμg当たりの相対発光単位（Relative light units(RLU)）で表示した。
【００４８】
G-CSF産生能を有するハイブリドーマクロ−ンを7クローン取得し、その中で最も活性の強いハイブリドーマクロ−ンを「3-4H7」と命名した。なお、このハイブリドーマは通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（寄託番号：FERM BP-6103）。
また、マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイプ同定キット（Amersham社製）を用いてアイソタイプを同定したところ、上記ハイブリドーマクローンからモノクローナル抗体（寄託番号：FERM BP-6103から調製されるものを「3-4H7抗体」と称する）のイムノグロブリンクラスはIgMであった。
さらに、E-G-SEP IgM精製キット（ファルマシア社製）を用いて「3-4H7抗体」を精製し、96ウェルマイクロプレートに1ウェル当り5×10⁴個のマクロファージ細胞株を播き、37℃で24時間培養し、0, 3.75, 7.5, 15, 30, 60μg/mlの濃度で添加し、37℃で18時間培養した。
その結果を図２に示す。
【００４９】
図２から、本願発明抗体は、抗体濃度依存的にマクロファージ細胞株RAW264.7クローン27-3からG-CSFを産生する作用を有することが確認された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の抗体は、G-CSFの産生能を有し、抗ガン剤の副作用としての好中球減少症や骨髄移植後の好中球減少症の治療及び再生不良性貧血の治療に効果を示す。G-CSFの産生能を有することにより、日和見感染症をはじめとする各種感染症性疾患の予防又は治療に利用できる。
また、該抗体を産生するハイブリドーマは、多大な有用性が期待される本発明の該抗体を生産する際の重要かつ必須の細胞である。
【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】「3-4H7抗体」によるマクロファージ細胞のG-CSF産生確認試験に使用するベクターの遺伝子地図である。
【図２】「3-4H7抗体」のマクロファージ細胞株に及ぼす効果を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention comprises a hybridoma producing a monoclonal antibody having an inducing activity of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), an antibody having an inducing activity of G-CSF, and a part thereof, the antibody or the antibody fragment. It relates to a pharmaceutical composition.
[0002]
[Prior art]
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) has a molecular weight of about 18000 to 22000, and is composed of 174 amino acids (rarely 178) for humans and 178 amino acids for mice. It is a glycoprotein that induces the differentiation and proliferation of neutrophils, a type of white blood cell component.
[0003]
G-CSF has the action of prolonging the survival and function of mature neutrophils, but also enhances the formation of erythroblasts by erythropoietin and blast colonies by interleukin-3. Such G-CSF producing cells include macrophages, stromal cells, monocytes, T lymphocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells and the like.
[0004]
Administration of G-CSF as a drug has an effect on the treatment of neutropenia as a side effect of anticancer agents and neutropenia after bone marrow transplantation and the treatment of aplastic anemia. However, at the time of administration, since blood stability is low, frequent administration is required, and since administration is limited to intravenous administration, both patients and doctors have been burdened and burdened. Furthermore, it has been reported that administration of G-CSF as a drug causes bone pain as a side effect. In addition, direct administration of macrophages and stromal cells as cells that produce G-CSF may cause unexpected side effects because they contain cells and contain various proteins and substances. No such treatment has been performed.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the method of differentiating and proliferating neutrophils by administering G-CSF itself not only causes bone pain as a side effect, but also requires frequent administration, which is painful for patients and doctors. There has been a strong demand for the development of other treatment methods due to the burden imposed, but it has not yet been established.
[0006]
Therefore, the present inventors considered not to administer G-CSF itself but to produce G-CSF and to differentiate and proliferate neutrophils. An object of the present invention is to provide an antibody that produces G-CSF. The present invention provides a G-CSF-inducing antibody that is extremely useful as a reagent for separating and purifying molecules involved in the induction of an inducer of G-CSF clinically and as a pharmaceutical product.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors first immunized macrophages themselves to obtain antibodies, and decided to isolate antibodies that induce G-CSF from the obtained antibodies. This will be specifically described below.
[0008]
First, the present inventors administered a mouse macrophage cell line as an immunogen to MRL / lpr mice (autoimmune disease mice) and isolated monoclonal antibodies. Next, the present inventors made the obtained monoclonal antibody act on a mouse macrophage cell line which is an immunogen cell, and examined the influence of the antibody on the immunogen cell. As a result, the present inventors have found that one of the obtained antibodies has the property of producing G-CSF in a concentration-dependent manner from a mouse macrophage cell line which is an immunogen cell line (hereinafter, this antibody is referred to as “antibody”). Referred to as "3-4H7 antibody").
[0009]
That is, the present invention relates to an antibody having the property of producing G-CSF in a concentration-dependent manner from a mouse macrophage cell line, a hybridoma that produces the antibody, and a pharmaceutical composition comprising the antibody. More specifically, the present invention provides:
(1) an antibody having G-CSF induction activity or a part thereof, for example,
(2) The antibody according to (1) or a part thereof, wherein the antibody is a monoclonal antibody,
(3) The antibody according to (2) or a part thereof, wherein the monoclonal antibody is an antibody produced by a hybridoma having an international deposit number of FERM BP-6103. About.
[0010]
The present invention also provides:
(4) A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to (2) or (3), for example,
(5) relates to a hybridoma having an international deposit number of FERM BP-6103.
[0011]
Furthermore, the present invention provides
(6) A pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to (2) or (3), for example,
(7) A pharmaceutical composition for preventing or treating an infectious disease comprising the monoclonal antibody according to (2) or (3), or
(8) A pharmaceutical composition for preventing or treating neutropenia comprising the monoclonal antibody according to (2) or (3).
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail by clarifying the meaning of the words used in the present invention.
The “monoclonal antibody” in the present invention is a monoclonal antibody having reactivity with a macrophage cell line, specifically, a monoclonal antibody having an action of producing G-CSF. The antibodies of the present invention have the property of substantially binding to macrophage cell lines. The antibodies of the present invention include both polyclonal and monoclonal antibodies having the above properties. The monoclonal antibody of the present invention includes monoclonal antibodies belonging to any immunoglobulin class such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, and is preferably an IgG or IgM immunoglobulin class monoclonal antibody.
[0013]
Macrophage cell lines can be prepared, for example, from naturally occurring leukemia cells or can be prepared from transformation with leukemia virus.
The antibody of the present invention can be obtained according to a conventional method (for example, a method described in the literature “Second Life Chemistry Experiment Course 5, Immunobiochemical Research Method, edited by Japanese Biochemical Society: Tokyo Chemical Dojin, etc.”).
For example, the monoclonal antibody of the present invention can be produced from a hybridoma (fused cell) produced by so-called cell fusion. That is, a hybridoma is formed from antibody-producing cells and myeloma cells, the hybridoma is cloned, and a clone that produces an antibody having specific affinity for all or part of a macrophage cell line as an antigen. Manufactured by selecting. For the operation, conventionally known means can be used except that all or part of the macrophage cell line is used as the immunizing antigen.
[0014]
The immunizing antigen is prepared by using, for example, the macrophage cell line itself, or by mixing a membrane fraction of the macrophage cell line or a (poly) peptide solution having all or part of the lysed extract or, for example, a complete Freundage band. Is done. Examples of animals to be used for immunization include mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits, preferably mice or rats, more preferably mice. Immunization is performed by injecting these mammals once or several times subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a foot pad, or intraperitoneally.
Usually, immunization is carried out 1 to 4 times about every 1 to 2 weeks from the first immunization, and then the final immunization is carried out about 1 to 4 weeks later. Producing cells are collected.
The monoclonal antibody of the present invention includes a monoclonal antibody (3-4H7 antibody) produced by a hybridoma of “International Deposit No. FERM BP-6103”, a part thereof, or an antibody having substantially the same properties as the antibody. . The “3-4H7 antibody” has the ability to induce G-CSF production from cells.
[0015]
The present invention also relates to a hybridoma having the “International Deposit No. FERM BP-6103”.
The hybridoma of the present invention can be prepared by a known method. Examples of known methods include, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1975) and a modification method according thereto for the preparation of hybridomas that secrete monoclonal antibodies. That is, the monoclonal antibody of the present invention is a spleen, lymph node, bone marrow or tonsil obtained from an immunized animal as described above, preferably an antibody-producing cell contained in the spleen, preferably the same type of mouse, rat. It is prepared by culturing a fused cell (hybridoma) obtained by fusion with a mammal such as guinea pig, hamster, rabbit or human, more preferably mouse, rat or human myeloma cell (myeloma).
Culturing can be performed in vitro or in vivo in a mammal such as mouse, rat, guinea pig, hamster or rabbit, preferably mouse or rat, more preferably mouse ascites, etc. Alternatively, it can be obtained from the ascites of mammals.
[0016]
Examples of myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived myeloma “P3 / X63-AG8”, “P3 / NSI / 1-Ag4-1”, “P3 / X63-Ag8.U1”, “SP2 / 0” -Ag14, PAI, FO or BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag1.2.3, human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6 ”,“ CEM-AGR ”,“ D1R11 ”,“ CEM-T15 ”, and the like.
The screening of the fusion cell clone producing the monoclonal antibody of the present invention is carried out by culturing the fusion cell in, for example, a microtiter plate, and determining the reactivity of the culture supernatant of the well in which proliferation has been observed with the antigen, for example, flow cytometry. It can be carried out by measuring by an enzyme antibody method such as RIA or ELISA.
For purification and isolation of the monoclonal antibody, serum, ascites or hybridoma culture supernatant containing the monoclonal antibody of the present invention obtained by the method as described above is subjected to ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), anti-immunoglobulin column. Alternatively, it can be carried out by subjecting it to affinity column chromatography such as protein A or protein G column, or by adding caproic acid.
[0017]
The “monoclonal antibody” of the present invention is not limited to the production method described above, and may be obtained by any method. In addition, “monoclonal antibodies” usually have sugar chains with different structures depending on the type of mammal to be immunized, but “monoclonal antibodies” in the present invention are not limited by structural differences in the sugar chains. In addition, monoclonal antibodies derived from all mammals are also included. Monoclonal antibodies produced by phage display, and further, human monoclonal antibodies obtained using transgenic mice engineered to produce human antibodies, for example, by incorporating human immunoglobulin genes, or By means of genetic recombination technology, a chimeric monoclonal antibody obtained by recombining the constant region (Fc region) of a monoclonal antibody derived from a mammal with the Fc region of a human monoclonal antibody, and a complementarity determining site capable of directly binding complementarily to an antigen ( Other than CDR: complementarity-determining residue), humanized monoclonal antibodies in which the entire region is recombined with the corresponding region of the human monoclonal antibody are also included in the “monoclonal antibody” of the present invention.
[0018]
In the present invention, “part of an antibody” means an antibody fragment containing at least one variable region, and means a partial region of the above-described antibody, preferably a monoclonal antibody, in the present invention, specifically Fv, F (ab ') 2, Fab' or Fab. Here, "F (ab ') 2" and "Fab'" are produced by treating immunoglobulin (monoclonal antibody) with proteolytic enzyme pepsin or papain, etc., and two in the hinge region. It means an antibody fragment produced by digestion before and after disulfide bonds existing between H chains. For example, when IgG is treated with papain, an L chain consisting of VL (L chain variable region) and CL (L chain constant region) is cleaved upstream of a disulfide bond existing between two H chains in the hinge region, In addition, two homologous antibody fragments in which an H chain fragment consisting of VH (H chain variable region) and CHγ1 (γ1 region in the H chain constant region) is linked by a disulfide bond in the C-terminal region can be produced. Each of these two homologous antibody fragments is called Fab ′. In addition, when IgG is treated with pepsin, an antibody fragment is produced that is cleaved downstream of the disulfide bond existing between the two H chains in the hinge region, so that the two Fab's are slightly larger than the hinge region. be able to. This antibody fragment is called F (ab ') 2.
[0019]
The binding activity of the monoclonal antibody to the cells can be detected, for example, by a method such as analyzing a macrophage cell line stained with the antibody using flow cytometry or ELISA.
[0020]
A macrophage cell line for detecting G-CSF production-inducing activity is achieved by introducing a vector into which a reporter gene has been introduced into a host cell (macrophage cell line).
Stable retention of reporter gene by introducing the reporter gene into a vector such as a plasmid vector, phage vector, retrovirus vector, etc. and transforming the cell or transfecting the host cell after in vitro packaging A transformed cell is prepared.
[0021]
The plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host cell, and any phage vector that can be propagated in the host cell may be used. Examples of commonly used vectors include pUC119, λgt10, λgt11, Pickergene enhancer vector 2, pMC1 neo Poly A and the like.
[0022]
As a method for incorporating the 5 ′ regulatory region of the G-CSF gene into a plasmid, for example, “Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (second edition)”, Cold Spring Harbor Laboratory , 1.53 (1989) ". Examples of a method for incorporating the 5 ′ regulatory region of the G-CSF gene into a phage vector include the method of Hyunh, TV et al. (Hyunh, TV, DNA Cloning, a practical approach, 1, 49 (1985)). For convenience, a commercially available ligation kit (for example, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can also be used. Recombinant plasmids and phage vectors thus obtained are prokaryotic cells (eg, E. coli HB101, DH5 or MC1061 / P3) and / or eukaryotic cells (J774.1, PU5-1.8, RAW264.7, ST2) Introduce into various appropriate host cells of eukaryotic cells.
[0023]
The method for introducing a plasmid into a host cell is described in “Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989)”. The calcium chloride method or the calcium chloride / rubidium chloride method, the electroporation method, the electroinjection method, the method using chemical treatment such as PEG, the method using a gene gun and the like. Examples of the method for introducing a phage vector into a host cell include a method for introducing phage DNA into in vitro packaging and then introducing it into a propagated host cell. In vitro packaging can be performed conveniently by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, manufactured by Stratagene, Amersham, etc.).
[0024]
A vector can be conveniently prepared by ligating a desired gene to a recombination vector (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art by a conventional method. Specific examples of vectors used include plasmids derived from E. coli, such as pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc., yeast-derived plasmids, such as pSH19, pSH15, etc., as Bacillus subtilis-derived plasmids, Examples include pUB110, pTP5, and pC194, but are not limited thereto. Examples of phages include bacteriophages such as λ phage, and animal and insect viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and nuclear polyhedrosis virus [pVL1393 (manufactured by Invitrogen)]. Not.
[0025]
For the purpose of producing a desired protein, an expression vector is particularly useful. The expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene and producing a desired protein in various host cells of prokaryotic cells and / or eukaryotic cells. pGEX-5X-1) or an expression vector derived from SV-40 is preferred.
[0026]
A transformant can be prepared by introducing a desired expression vector into a host cell. The host cell to be used is not particularly limited as long as it is compatible with the expression vector of the present invention and can be transformed. Natural cells or artificially established sets that are usually used in the technical field of the present invention are used. Various cells such as a recombinant cell can be used. Examples include bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells, insect cells, and the like.
[0027]
In particular, Escherichia coli or animal cells are preferable. Specifically, Escherichia coli (DH5, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1, NIH3T3, etc.), rat-derived cells, hamster-derived Examples include cells (BHK, CHO, etc.), monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, cells derived from diploid fibroblasts, myeloma cells, Namalwa, etc.) Is done. In addition, examples of animal cells include macrophages, stromal cells, monocytes, T lymphocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, or cultured cell lines established from these animal cells.
[0028]
When a bacterium, particularly E. coli, is used as a host cell, the expression vector is generally composed of at least a promoter-operator region, a start codon, a desired gene, a stop codon, and a replicable unit. When yeast, animal cells, or insect cells are used as host cells, it is generally preferable that an expression vector contains at least a promoter, a start codon, a desired gene, and a stop codon. Further, it may optionally contain DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the desired gene, splicing junction, polyadenylation site, selectable marker region or replicable unit, etc. . Moreover, the gene amplification gene (marker) normally used according to the objective may be included.
[0029]
In the vector of the present invention, a suitable initiation codon is exemplified by methionine codon (ATG). Moreover, as a stop codon, a common stop codon (for example, TAG, TGA, etc.) is illustrated.
[0030]
A replicable unit refers to a DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a DNA fragment prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included. Suitable plasmids include E. coli. In Escherichia coli, the plasmid pBR322, or an artificially modified product thereof (DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), in yeast, the yeast 2μ plasmid or yeast chromosomal DNA, and in mammalian cells, the plasmid pRSVneo ATCC 37198 Plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmid pSV2neo ATCC 37149, plasmid pME18S and the like.
[0031]
As the enhancer sequence, polyadenylation site and splicing junction site, those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, respectively, can be used.
[0032]
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples include tetracycline, ampicillin, or antibiotic resistance genes such as kanamycin or neomycin.
[0033]
Gene amplification genes include dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase gene, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, hygromycin-B-phosphotransferase gene, aspartate transcarbamylase gene Etc. can be illustrated.
[0034]
An expression vector can be prepared by linking at least the above-mentioned promoter, start codon, desired gene, stop codon, and terminator region to appropriate replicable units continuously and circularly. At this time, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, other restriction sites, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase, if desired.
[0035]
Introduction of the expression vector used in the present invention into a host cell [transformation (transfection)] can be performed by a conventionally known method.
For example, in the case of bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), for example, the method of Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method [Mol. Gen. Genet. , 168, 111 (1979)] and the competent method [J. Mol. Biol. , 56, 209 (1971)], in the case of Saccharomyces cerevisiae, for example, the method of Hinnnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)] and the lithium method [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)], in the case of animal cells, for example, Graham's method [Virology, 52, 456 (1973)], and in the case of insect cells, for example, the method of Summers et al. [Mol. Cell. Biol. , 3, 2156-2165 (1983)], respectively.
[0036]
The production confirmation test of the desired protein from the host cell prepared as described above may be performed as follows. That is, a marker gene is introduced into the desired gene site of the vector into the host cell prepared as described above, and a protein serving as a marker is produced from the host cell. The protein produced by binding of the antibody of the present invention to a host cell may be detected.
[0037]
Here, examples of the reporter gene used for the desired gene site include luciferase gene, β-galactosidase, green fluorescent protein (GFP), β-lactamase, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and the like.
[0038]
As a method for detecting the produced protein, a luciferase assay method can be used when the protein is luciferase, and a CAT assay method can be used when the protein is chloramphenicol acetyltransferase (CAT). When the protein is green fluorescence protein (GFP) or the like, a fluorescence measurement method can be used.
[0039]
The prepared monoclonal antibody of the present invention can be used for, for example, detection or treatment of diseases involving neutrophils, which are a kind of blood component white blood cells.
[0040]
The antibody of the present invention can be used for the treatment of neutropenia as a side effect of an anticancer agent and neutropenia after bone marrow transplantation and the diagnosis, prevention and treatment of aplastic anemia. is there. The antibody of the present invention can usually be administered systemically or locally, generally in a parenteral form. Of parenteral administration, intravenous administration is particularly preferred.
[0041]
Dosage is age, sex, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, what to administer (full length protein, part of the protein substituted, deleted, inserted protein, type of antibody of the protein) ), Etc., but it may be administered parenterally once to several times a day in the range of 10 μg to 100 mg per adult. Since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required. The injections for parenteral administration according to the present invention include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. As an aqueous or non-aqueous solution or suspension, one or more active substances are mixed as at least one inert diluent. Examples of the aqueous diluent include distilled water for injection and physiological saline. Examples of non-aqueous diluents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and alcohols such as ethanol.
Such compositions may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg, arginine, aspartic acid, etc.).
These are sterilized by filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by preparing a sterile solid composition by, for example, a freeze-drying method and dissolving it in sterile water for injection or other solvents before use.
Other compositions for parenteral administration include topical solutions formulated with conventional methods, suppositories and pessaries for enteric administration, which contain one or more active substances.
[0042]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
【Example】
[Example 1] Preparation of monoclonal antibody
The antibody-producing hybridoma described below is prepared with reference to the method of Kohler et al. (Blood, Vol. 81, pages 101-111, 1993, Omori et al.). The preparation was carried out with reference to the method of Kanaki et al. (Handbook of Experimental Immunology, Vol. 4, 117.21-117.21, 1986).
First, the mouse macrophage cell line RAW264.7 was used as an immunizing antigen, and the antigen was applied to MRL / lpr mice on the 0th, 7th, 14th and 28th days (each 10 days). ⁷ (Individual / animal) and intraperitoneally. Three days after the last immunization, the spleen of the mouse was collected and fused with mouse myeloma cell PAI (Stocker, JW et al. Res. Disclosure, 217: 155 (1982)) by a conventional method. Each culture supernatant of the obtained hybridoma was added to macrophage cells as an immunogen, and hybridomas producing antibodies that bind to the macrophage cells were selected by ELISA.
[0043]
[Example 2] Preparation of vector used for G-CSF production confirmation test of macrophage cells
The effect of the monoclonal antibody prepared in Example 1 on macrophage cells was analyzed by the following method.
The Picker Gene System (Picagene System (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) using a luciferase gene as a reporter gene was used.
Using the Picker Gene Enhancer Vector 2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), insert the G-CSF promoter gene from the Xho I site to the Nco I site, and bind the luciferase gene downstream of it instead of the G-CSF gene. Furthermore, a PicaGCSFneo vector was constructed in which the neomycin resistance gene excised from pMC1Neo Poly A was inserted into the Sal I site downstream of SV40. The result is shown in FIG.
[0044]
[Example 3] Introduction of vector into macrophages
Next, the above vector was introduced into the mouse macrophage cell line RAW264.7 by the following method. The RAW264.7 cell line in logarithmic growth phase was harvested, washed once with Eagle's medium containing 10% fetal calf serum (FCS; manufactured by Bio-Whittacker) and non-essential amino acids (NEAA), and 2 × in the same medium. Ten ⁷ Resuspended at a concentration of pcs / ml. 250 μl of the above cell suspension (5 × 10 ⁶ 10 μg of PicaGCSFneo plasmid DNA purified with cesium chloride in a 0.4 cm electroporation cuvette at 300 V, 960 μF using a Bio-Rad Gene Pulser with a capacitance extender. Introduced.
[0045]
[Example 4] Selection of clones
48 hours after transformation, the obtained cells were treated with a medium containing 200 μg / ml of geneticin (a kind of neomycin), and a group of cells forming colonies was selected 10 to 15 days later. Of the 50 geneticin-resistant clones, 43 clones showed detectable luciferase activity when treated with lipopolysaccharide (LPS). Among them, one clone showed extremely high luciferase activity and was named RAW264.7 clone 27-3.
[0046]
It was confirmed by the following experiment that the luciferase activity reflected the actual expression of G-CSF mRNA.
RAW264.7 clone 27-3 cells treated with LPS 10 μg / ml for 18 hours (1.5 × 10 ⁷ Were washed with phosphate buffered saline (PBS). Electrophoresis of total RNA on 1% formaldehyde agarose gel, transfer to nylon filter, ³² Northern blot analysis was performed using cDNA of P-labeled mouse G-CSF as a probe. Filter as a control ³² Hybridization was performed with P-labeled β-actin cDNA.
The above experiments confirmed that the luciferase activity reflects the actual expression of G-CSF mRNA.
[0047]
[Example 5] G-CSF production action of antibody by macrophage cells
Antibodies having G-CSF producing ability were selected using luciferase as an index. 5 x 10 per well in a 96-well microplate ^Four Each macrophage cell line was seeded, cultured at 37 ° C. for 24 hours, a culture supernatant of an antibody-producing hybridoma that binds to the macrophage cells selected in Example 1 was added, and further cultured at 37 ° C. for 18 hours.
Luciferase measurement was performed according to the manual using Picagene Luminescence Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The luciferase activity is measured with a CT9000 luminometer (Dia-Iatron), the protein concentration is measured by a Bicinchoninic Acid (BCA) assay, and displayed in relative light units (RLU) per μg of protein. did.
[0048]
Seven clones of hybridomas having the ability to produce G-CSF were obtained, and among them, the most active hybridone was named “3-4H7”. The hybridoma was deposited with the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry (Deposit number: FERM BP-6103).
Further, when isotypes were identified using a mouse monoclonal antibody isotype identification kit (manufactured by Amersham), a monoclonal antibody (deposit number: FERM BP-6103) prepared from the hybridoma clone was “3-4H7 antibody”. The immunoglobulin class of IgM was IgM.
Furthermore, the “3-4H7 antibody” was purified using an EG-SEP IgM purification kit (Pharmacia), and 5 × 10 5 per well was added to a 96-well microplate. ^Four Each macrophage cell line was seeded, cultured at 37 ° C. for 24 hours, added at concentrations of 0, 3.75, 7.5, 15, 30, 60 μg / ml, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
The result is shown in FIG.
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From FIG. 2, it was confirmed that the antibody of the present invention has an effect of producing G-CSF from the macrophage cell line RAW264.7 clone 27-3 in an antibody concentration-dependent manner.
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【The invention's effect】
The antibody of the present invention has the ability to produce G-CSF, and is effective in the treatment of neutropenia as a side effect of anticancer agents and neutropenia after bone marrow transplantation and the treatment of aplastic anemia. Show. Having the ability to produce G-CSF can be used to prevent or treat various infectious diseases including opportunistic infections.
Moreover, the hybridoma producing the antibody is an important and essential cell for producing the antibody of the present invention, which is expected to have great utility.
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a genetic map of a vector used in a test for confirming G-CSF production of macrophage cells by “3-4H7 antibody”.
FIG. 2 is a graph showing the effect of “3-4H7 antibody” on a macrophage cell line.

Claims

A monoclonal antibody having a granulocyte colony-stimulating factor-inducing activity, or a part thereof , produced by a hybridoma having an international deposit number of FERM BP-6103.

A hybridoma having an international deposit number of FERM BP-6103.

A pharmaceutical composition comprising the antibody or a part thereof according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

A pharmaceutical composition for preventing or treating an infectious disease comprising the antibody or a part thereof according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier as active ingredients.

A pharmaceutical composition for preventing or treating neutropenia comprising the antibody according to claim 1 or a part thereof and a pharmaceutically acceptable carrier as active ingredients.