JP3907863B2 - アポトーシス抑制又は促進物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス（細胞死）抑制作用や、アポトーシス促進作用を有する物質のスクリーニング方法、より詳しくはＶＤＡＣ−リポソームを用いるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法や、アポトーシス抑制作用や、アポトーシス促進作用を有するに新規なポリペプチド関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、生理的条件下で細胞自らが積極的にひき起こす細胞死であり、その形態は細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝縮を特徴とし、最近では、アポトーシスを誘導する細胞表層受容体Ｆａｓ抗原、アポトーシス誘導に必須のプロテアーゼ（カスパーゼ）、アポトーシスを抑制するがん遺伝子ｂｃｌ−２遺伝子などが明らかにされている。
【０００３】
がん遺伝子ｂｃｌ−２遺伝子は、濾胞性リンパ腫附随の染色体転座ｔ（１４；１８）（ｑ２１；ｑ３２）により活性化されるがん遺伝子として同定され、アポトーシス抑制機能を有するユニークながん遺伝子であり、このＢｃｌ−２に相同性を示す多数のタンパク質はＢｃｌ−２ファミリーと呼ばれ、Ｂｃｌ−２ファミリーには、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ｘLで代表されるアポトーシス抑制機能を有するメンバーと、ＢａｘやＢａｋで代表されるアポトーシス促進（又は誘導）機能を有するメンバーが存在することが知られている。
【０００４】
また、ミトコンドリアがアポトーシスシグナルの形質導入におけるきわめて重要な役割を果たし、このミトコンドリアのアポトーシス変化をＢｃｌ−２ファミリータンパク質が調節し、アポトーシス抑制機能を有するＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘLがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを阻害すること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. J. Exp. Med. 183, 1533-1544, 1996. Cell 91, 627-637, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459）や、アポトーシス促進機能を有するＢａｘ及びＢａｋがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを誘導すること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. J. Cell Biol. 143, 217-224, 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）も知られている。
【０００５】
膜透過性遷移（以下「ＰＴ」という）ポアと呼ばれるポリプロテインチャネルにより、Ｂａｘ及びＢａｋに依存する膜透過性の変化が媒介されること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. Science 281, 2027-2031,1998）や、ポリプロテインチャネルは、ミトコンドリアポーリンとも呼ばれるＶＤＡＣ（電位依存性陰イオンチャネル）、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）、シクロフィリンＤ及び他のいくつかの分子からなると考えられていること（J. Bioenerg. Biomembr. 26, 509-517, 1994. Biochem. Biophys. Acta 1241, 139-176, 1995）も知られている。
【０００６】
ＶＡＤＣはミトコンドリアの外層膜に豊富に存在する小さなタンパク質であり、プラナー脂質二重層に取りこまれてＶＡＤＣ−リポソームを形成した場合に大きな（２．６ｎｍ）電位依存性ポアを形成することが知られており（J. Membr. Biol. 111, 103-111, 1989）、またＶＤＡＣは、イオンや中間代謝物を含んだ様々な物質がミトコンドリアを出入りする際の経路として生理学的に機能していると考えられている。さらに、本発明者らによって、Ｂａｘ及びＢａｋがＰＴポアと相互作用することが最近になって明らかにされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. Science 281, 2027-2031, 1998）。また、ＢａｘがＡＮＴ（アデニンヌクレオチドトランスロケーター）と直接相互作用して、ＡＮＴ及びＰＴポアリポソームをアトラクチル酸、すなわちＡＮＴリガンドに感作させることも報告されている（Science 281, 2027-2031, 1998）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
Ｂｃｌ−２やＢａｘは発ガンに深く係わっている。ｔ（１４；１８）転座を有する濾胞性リンパ腫やび慢性大細胞型リンパ腫、ｔ（１８；２２）（ｑ２１；ｑ１１）もしくはｔ（２；１８）（ｑ１１；ｑ２１）を有する慢性リンパ性白血病において、各々免疫グロブリン重鎖、軽鎖領域への転座によりＢｃｌ−２はその発現の脱調節をうけ、細胞死抑制を促し発ガンに寄与する。一方Ｂａｘは、ガン抑制遺伝子として機能し、血球系腫瘍細胞株において高頻度にＢａｘ遺伝子（ＢＨ１とＢＨ３領域）の変異が認められており、ヒトの腫瘍への関与が示唆されている。
【０００８】
また、Ｂｃｌ−２は神経変異性疾患に深く係わっている。Ｂｃｌ−２と結合し、そのアポトーシス抑制機能を増強するＳＭＮ（survival motor neuron）タンパクは、運動神経変性を伴う遺伝子性疾患である脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy）の原因遺伝子産物であり、ＳＭＮの欠損によるＢｃｌ−２機能の低下がこの疾患の発症と深く関わっている。
【０００９】
本発明の課題は、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用を有するＢｃｌ−２ファミリーが各種疾患と深い係わりを有することから、医薬や診断薬としての用途が期待できるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法や、アポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アポトーシスを制御するＢｃｌ−２ファミリータンパク質に属するＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘLなどによるアポトーシスを抑制する機能や、Ｂａｘ、Ｂａｋなどによるアポトーシスを促進する機能が、ミトコンドリアを介して行われることを明らかにしてきたが、そのターゲット分子に関して鋭意研究し、リポソーム系を用いることにより、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質がミトコンドリア外層膜のタンパク質ＶＤＡＣを直接のターゲットとして、アポトーシスシグナル伝達における中心的な現象であるシトクロムｃリリース及びΔΨロスの調節を行っていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ＶＤＡＣがリポソームの脂質二重層に埋め込まれた構造を有するＶＤＡＣ−リポソームと、ＶＤＡＣを通過することができる指標物質と、被検物質とをインキュベーションし、インキュベーション前後におけるＶＤＡＣ−リポソーム内外の指標物質の濃度変化を検出することにより、被検物質のアポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無を判定することを特徴とするアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１）や、インキュベーションが、指標物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項２）や、インキュベーションが、被検物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項３）や、インキュベーションが、被検物質と共にアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質が存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項４）や、ＶＤＡＣ−リポソームが、組換えヒトＶＤＡＣを用いて調製されたＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項５）や、ＶＤＡＣ−リポソームが、小さなユニラメラ小胞にＶＤＡＣを再構成したＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項６）や、指標物質が、標識化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項７）や、標識化合物が、蛍光標識シトクロムｃ及び／又は同位体標識スクロースであることを特徴とする請求項７記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項８）に関する。
【００１２】
また本発明は、被検物質が、タンパク質又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項９）や、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号１に示される塩基配列のうち、３２番目から７５１番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１５）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号３に示される塩基配列のうち、１３５番目から８３６番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１６）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号５に示される塩基配列のうち、１６３番目から２２２番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１７）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるＶＤＡＣ−リポソームとしては、ミトコンドリアポーリンとも呼ばれるＶＤＡＣが、脂質二重層よりなる閉鎖小胞であるリポソームの脂質二重層に埋め込まれた構造を有するものであればどのようなものでもよい。また、ＶＤＡＣ−リポソームを構成するＶＤＡＣとしては、その由来は限定されないが、組換えヒトＶＤＡＣ等のヒト由来のＶＤＡＣを用いて調製したＶＤＡＣ−リポソームが医薬品等を開発する点から好ましく、そしてまた、ＶＤＡＣ−リポソームとしては、小さなユニラメラ小胞（ＳＵＶ）にＶＤＡＣを再構成したＶＤＡＣ−リポソームが反応感度の点から好ましい。そして、リポソームの調製方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
【００１５】
本発明における指標物質としては、アポトーシス促進物質の存在下等においてＶＤＡＣチャネルを通過することができる物質であればどのようなものでもよいが、被検物質のアポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無を判定する上で、インキュベーション前後における濃度変化の検出が容易なものが好ましく、標識化合物、色素、酵素等を挙げることができるが、特に同位体で標識された分子量が比較的小さいスクロースや、そのリリースがアポトーシスシグナルの形質導入における中心的な現象であるとされるシトクロムｃを蛍光物質等の標識化合物により修飾した標識シトクロムｃを具体的に例示することができる。そして指標物質は、ＶＤＡＣ−リポソームと共にインキュベーションするに際して、１種又は２種以上を同時に用いてもよく、またＶＤＡＣ−リポソーム内及び／又はＶＤＡＣ−リポソーム外に存在させておくことができる。
【００１６】
本発明における被検物質としては、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無の判定が期待される物質であればどのような物質でもよく、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用を有する可能性が高いタンパク質を具体的に例示することができ、中でも既にアポトーシスの制御物質として知られているＢｃｌ−２ファミリータンパク質の全部又は一部からなるタンパク質又はポリペプチドの修飾・改変タンパク質又は修飾・改変ポリペプチドが好ましい。修飾・改変されたタンパク質やポリペプチドとしては、例えば、タンパク質やポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質やポリペプチド、タンパク質やポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列又はこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質やポリペプチドを挙げることができる。
【００１７】
そして、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質としては、アポトーシス抑制作用を有するタンパク質として、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢｃｌ−２、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＢｃｌ−ｘL、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１(Ｂｆｌ−１)、ＢＨＲＦ−１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ＬＭＷ−５−ＨＬ（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、Ｋｓｂｃｌ−２（ＨＨＶ８）、ＯＲＦ１６（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）を、アポトーシス促進作用を有するタンパク質としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢａｘ、Ｂｃｌ−ｘS、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｍｔｄ（Ｂｏｋ）、Ｄｉｖａ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｈｒｋ（ＤＰ５）、Ｂｌｋ、Ｂｎｉｐ３、Ｂｎｉｐ３Ｌを挙げることができる。また、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の一部からなるポリペプチドとしては、アポトーシス抑制作用を有するポリペプチドとして、配列表の配列番号２記載の７番目から３０番目のアミノ酸配列から成るＢｃｌ−２由来のポリペプチドや配列番号４記載の４番目から２３番目のアミノ酸配列から成るＢｃｌ−ｘL由来のポリペプチドを、アポトーシス促進作用を有するポリペプチドとして、配列番号６記載の５５番目から７４番目のアミノ酸配列から成るＢａｘ由来のポリペプチドを、それぞれ具体的に例示することができる。
【００１８】
また、本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法においては、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又ポリペプチドも被検物質として有利に用いることができる。そして、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示されるＢｃｌ−２をコードするＤＮＡ、配列番号３に示されるＢｃｌ−ｘLをコードするＤＮＡ、配列番号５に示されるＢａｘをコードするＤＮＡを具体的に例示することができ、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列のうち３２番目から７５１番目までの塩基配列、配列番号３に示される塩基配列のうち１３５番目から８３６番目までの塩基配列、配列番号５に示される塩基配列のうち１６３番目から２２２番目までの塩基配列を具体的に例示することができる。
【００１９】
また被検物質は、ＶＤＡＣ−リポソームと共にインキュベーションするに際して、単独又は既知の１もしくは２種以上のアポトーシス抑制物質又は１もしくは２種以上のアポトーシス促進物質と併用することができる。被検物質とアポトーシス抑制物質を併用した場合はアポトーシス促進物質を、被検物質とアポトーシス促進物質を併用した場合はアポトーシス抑制物質をそれぞれスクリーニングすることができるが、アポトーシス抑制物質と拮抗する物質やアポトーシス促進物質と拮抗する物質をスクリーニングすることもできる。併用する場合、被検物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質とは、ＶＤＡＣ−リポソーム内に存在させることが好ましいが、どちらか一方又は両者をＶＤＡＣ−リポソーム外に存在させておくこともできる。そして、インキュベーションするに際して被検物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質、被検物質と指標物質、被検物質と指標物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質等をＶＤＡＣ−リポソーム内に存在させるには、従来公知の方法を用いることができる。
【００２０】
本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法においては、インキュベーションにおける温度、ｐＨ、反応時間等の条件は特に制限されるものではないが、インキュベーション前後におけるＶＤＡＣ−リポソーム内外の指標物質の濃度変化を感度よく検出することができる条件を選択することが好ましい。
【００２１】
本発明は、また、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を少なくとも含むアポトーシス制御作用を有するポリペプチドや、これらペプチドに細胞内導入用の化学修飾がなされているポリペプチドや、上記本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法により得られたアポトーシス抑制物質やアポトーシス促進物質に関する。このうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目から７４番目のアミノ酸配列はそれぞれ公知であるが、これらアミノ酸配列からなるポリペプチドが新たに調製されたことはなく、ましてこれらアミノ酸配列からなるポリペプチドがＶＤＡＣチャネルに作用し、アポトーシス抑制作用やアポトーシス促進作用を発揮しうることは本発明をもって嚆矢とするものである。また、上記細胞内導入用の化学修飾がなされているポリペプチドとしては、細胞内への移行をスムーズにするＨＩＶウイルスが産生するタンパク質ＴＡＴ由来のオリゴペプチドを付けたポリペプチドを挙げることができる。
【００２２】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
［材料と方法］
（抗体の入手）
ラット及びウマシトクロムｃと交差反応する抗ハトシトクロムｃモノクローナル抗体（７Ｈ８．２Ｃ１２）、抗酵母シトクロムｃポリクローナル抗体及び抗ラットＡＮＴ抗体は、それぞれDr. E. Margoliash （イリノイ大学、イリノイ）、Dr. G. Shatz（バーゼル大学、スイス）及びDr. H.H. Schmid （ミネソタ大学、ミネソタ）から提供されたものを用いた。ラットＶＤＡＣと交差反応する抗ヒトＶＤＡＣ（ポーリン）モノクローナル抗体（３１ＨＬ）は、カルバイオケム（Calbiochem, La Jolla, CA）から、抗ヒトＢｃｌ−ｘLポリクローナル抗体（Ｌ１９）及び抗ヒトＢａｘポリクローナル抗体（Ｎ２０）は、サンタクルス・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechology, Santa Cruz, CA）からそれぞれ入手した。
【００２３】
（免疫沈降反応及びウェスタンブロット分析）
ラット肝臓ミトコンドリアを、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459, 1998）記載のように単離した。プロテイナーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（最終濃度で１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）ｐＨ７．４、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、０．５％のＮＰ４０）内に溶解され、超音波処理された細胞とミトコンドリアを用いて、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686）記載のように免疫沈降反応を行った。リポソームを用いた免疫沈降実験を行うため、文献（Mol. Cell 1, 337-346, 1998）記載のように、タンパク質クロスリンカーとしてＤＴＢＰを用いた。精製タンパク質間の結合を検出するため、１００μｌの溶解緩衝液内にＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL（０．２μｇ）又はＧＳＴ（０．２μｇ）のどちらかを用いて、ＶＤＡＣ（０．２μｇ）及びＡＮＴ（０．２μｇ）を３時間インキュベートした。そして、グルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースゲル又はセファロースゲルを用いて、これらのタンパク質を３時間インキュベートし吸着させた。遠心分離を短時間行った後、溶解緩衝液を用いてゲルを３回洗浄し、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥを行うためサンプル緩衝液内に再懸濁した。
【００２４】
（ペプチド配列決定）
免疫沈殿物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離されたタンパク質を切り取り、リシルエンドペプチダーゼを用いて３５℃で１日間消化させた。ＴＳＫゲル（トーソー製「ＯＤＳ−８０Ｔｓ」）を用いて、得られたペプチドフラグメントを分離し、Ｎ−末端側から直接、エドマン分解法によって、マイクロシークエンシングを行いペプチドの配列を決定した。
【００２５】
（タンパク質の精製）
ヒトＢｃｌ−ｘL、２種のＢｃｌ−ｘL変異体及びヒトＢａｋ（Ｃ−末端２１アミノ酸残基を欠質している）を、大腸菌（Escherichia coil）ＤＨ５α株内でＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースカラムを用いて精製した。この精製したＧＳＴ融合蛋白質にトロンビンを作用させてＧＳＴから分離させた。ヒトＢａｘは、Ｈｉｓタグタンパク質として文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686）記載のように精製した。エクスプレスシステム（インビトロジェン社製）を用いて、大腸菌株ＤＥ３内にＨＡタグヒトＶＤＡＣ１を発現させ、ＨＡ（乾燥ハイドロキシアパタイト）カラムにて精製した。エンプティーベクターからのＧＳＴ又はＨｉｓタグタンパク質を用いて、模擬コントロ−ルタンパク質を調製した。
【００２６】
文献（Biochem. Biophys. Acta 905, 499-502, 1987）記載のように、ラット肝臓ＶＤＡＣを精製した。すなわち、ラット肝臓ミトコンドリアを１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３％トリトン−Ｘ１００に０℃で３０分間懸濁し、３７，０００ｇで４５分間超遠心分離器によって分離させた。上澄み液を、ＨＡ及びセライト（９：１）カラム（３ｇ）に加えて、精製ＶＤＡＣタンパク質として、フラクションから最初の溶出液（１ｍｌ）を集めた。精製されたＶＤＡＣは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によって、ゲルに１本のバンドを示した。ｒＶＤＡＣの純度は９５％以上を示した。ラット心臓ＡＮＴは、文献（FEBS lett. 426, 97-101, 1998）記載のように精製した。精製されたＡＮＴの純度は上記と同様の方法で調べた結果、９０％以上であった。
【００２７】
（リポソーム内でのＶＤＡＣ再構成）
文献（Biochem. Biopys. Acta 1145, 168-176, 1993）記載の超音波凍結融解処理法に若干の修飾を加え、小さなユニラメラ小胞内で精製されたＶＤＡＣ及び組換えＶＤＡＣを再構成した（Biochem. Biopys. Acta 1145, 168-176, 1993）。すなわち、３０ｍＭのスルホン酸ナトリウム及び２０ｍＭのトリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３又は５．２）を含むリポソーム培地１ｍｌに、８０ｍＭスクロースの存在又は非存在下で、１００ｍｇのリン脂質（ダイズ、タイプII−Ｓ）を溶解した。超音波処理の後、精製されたＶＤＡＣタンパク質又は組換えＶＤＡＣタンパク質（２００μｇ）を、ｒＢｃｌ−ｘL（２００μｇ）及びｒＢａｘ（２００μｇ）の存在又は非存在下で、１ｍｌのリン脂質に添加し、この懸濁液を２回の凍結融解サイクルにかけた。熱変性ＶＤＡＣタンパク質は９５℃で１０分間の加熱により得られた。温和な超音波処理によってユニラメラＶＤＡＣリポソームを産生し、その産生物をセファデックスＧ−５０カラムで分画した。分光光度計（島津製作所社製；ＵＶ−１６０Ａ）で各分画の光散乱を波長５２０ｎｍで測定し、任意の７００〜９００ユニット／μｌを含む分画物を実験に使用した。プレーンリポソームは、タンパク質を全く加えずに、同様な方法で産生された。
【００２８】
14Ｃスクロース吸収を測定しながら、スクロース取込み実験を行った。５μｌの14Ｃスクロース（９７％；２００μＣｉ／ｍｌ）を用いて２５℃でリポソ−ム（２０μｌ）をインキュベートし、分子量３０，０００制限フィルター（ミリポア社製；ウルトラフリー−ＭＣ３０，０００）を用いた遠心分離によって、フリーの14Ｃスクロースを取り除いた。ガンマシンチレーション計数管（ワラック社製「１４１４」）によって、回収されたリポソームに取り込まれている14Ｃスクロースを測定した。
【００２９】
(シトクロムｃ転移実験)
文献（Wiley Interscience. 5.3.1-5.3.11, 1990）記載のように、フルオレセインイソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という）標識シトクロムｃを調製した。すなわち、０．０５Ｍのホウ酸塩及び０．２Ｍの塩化ナトリウムを含むラベル化緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて、１ｍＭのウマシトクロムｃを透析した。ＦＩＴＣ（２５０μｇ）と共に２時間インキュベートした後、未結合のＦＩＴＣをラベル化緩衝液を用いた透析によって除去し、続いてセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーを行い分離した。分光光度計で計測したＦＩＴＣ／シトクロムｃのモル比は、０．４７であった。ルミノイメージアナライザー（富士フィルム社製「ＬＡＳ−１０００」）を用いてＦＩＴＣ標識シトクロムｃを検出した。リポソーム（２μｌ）は、スクロース（５０ｍＭ）とＦＩＴＣ標識シトクロムｃ（５０μＭ）の両者と共に、ｒＢａｘ（１．５μｇ）と共に、ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘL（共に１．５μｇ）と共に、又はどちらも用いることなく、全量を２９μｌとして、ｐＨ５．２でインキュベートし、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ−７４５；オリンパス）を用いて、ラベルされたシトクロムｃを視覚化した。
【００３０】
次に、シトクロムｃ漏出実験を以下の方法で行った。スクロース（８０ｍＭ）を含むリポソーム（１ｍｌ）緩衝液にシトクロムｃ（１００μＭ）と混合させ、冷凍解凍サイクルに２回かけた。ユニラメラ化した後、２５℃で１０分間、２０μｇ／ｍｌのｒＢａｋあり、又はなしで、１ｍｌのスクロースフリー緩衝液で２０μｌのリポソームをインキュベートした。次にリポソームをフリーシトクロムｃから分離するために、Ｍ．Ｗ．３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離によって分離した。吸光度４０８ｎｍで分光光度計を用いて、フリーシトクロムｃの量を決定し、全シトクロムｃに対する割合を計算した。
【００３１】
(酵母ミトコンドリア)
ＶＤＡＣ欠質酵母株（以下「ΔＶＤＡＣ」という；Ｍ２２−２）及びその親株（Ｍ３）は、Ｍ．フォルテ博士（Dr. M. Forte、ボラム・インスチチュート・フォー・アドバンスド・バイオケミカル・リサーチ、オレゴンVollum Institute for Advanced Biomedical Research, Oregon)から提供されたものを用いた。酢酸リチウムを用いてヒトｖｄａｃ１のｃＤＮＡをトランスフェクトすることによって、ヒトＶＤＡＣ１発現をするΔＶＤＡＣ酵母株を作出した。スフェロプラストを形成するために、細胞１ｇに対し２ｍｇのチモリアーゼ２０Ｔを用いて、文献（J. Biol. Chem. 257, 13028-13033, 1982）記載の方法に準じてミトコンドリアを単離した。タイトフィッティングホモジェナイザーを用いてセファロプラストをホモジェネートした。０．６Ｍのマンニトール、１０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．４）及び０．１％の脂肪酸フリーＢＳＡ（以下「ｙＭｔ緩衝液」という）中で、単離されたミトコンドリアを懸濁した。４．２ｍＭのコハク酸塩を添加したｙＭＴ緩衝液中で、ミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２５℃でインキュベートした。文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459）記載のように、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の吸収を測定することによって、ΔΨを測定した。上記のミトコンドリアをスピンし、得られた上澄み液は、抗酵母シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によってシトクロムｃのリリースを検出した。
【００３２】
［Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用］
（Ｂｃｌ−ｘLに結合する３種のタンパク質）
ラット肝臓ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を組換えＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）と共に５分間インキュベートした後、このミトコンドリア溶解物を抗Ｂｃｌ−ｘL抗体（α−Ｂｃｌ−ｘL）又はラビット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いた免疫沈降にかけ、得られた免疫複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳導法によって分離させ、銀染色法によって染色した。この抗Ｂｃｌ−ｘL抗体を用いた共免疫沈降法により、ミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLに結合する３種のタンパク質、３３ｋＤ、１８ｋＤ、及び１３ｋＤを検出した（図１ａ）。
【００３３】
（ミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用）
上記の方法によって得られた３３ｋＤタンパク質のアミノ酸配列の一部が、ラットＶＤＡＣと一致していたため、抗ＶＤＡＣ抗体及び抗Ｂｃｌ−ｘL抗体を用いた共免疫沈降に引き続きウェスタンブロット法により、単離されたミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を調べた。結果を図１ｂに示す。
【００３４】
（ＨｅｐＧ２細胞におけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用）
Ｂｃｌ−ｘLを発現するＨｅｐＧ２細胞（Oncogene 12, 2045-2050, 1996）におけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を調べた。結果を図１ｃに示す。他方、Ｂｃｌ−ｘLとＴｏｍ４０（内在性外膜タンパク質）及びＢｃｌ−ｘLとＦ1−ＡＴＰアーゼ（内膜タンパク質）との共免疫沈降が可能な相互作用は、共に観察されなかったので、Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとが特異的な相互作用を有することがわかる。
【００３５】
（Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣ又はＡＮＴとの直接的な相互作用）
ＰＴポアはＶＤＡＣを含むポリプロテインチャネルであることから、ミトコンドリア及び細胞からのＶＤＡＣとＢｃｌ−ｘLにおける共免疫沈降が、必ずしもＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの直接的な相互作用を示すとはいえないことから、以下の実験を行い確認した。精製されたラット肝臓ＶＤＡＣ（０．２μｇ）及びラット心臓ＡＮＴ（０．２μｇ）をＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質（０．２μｇ）又はＧＳＴ（０．２μｇ）のいずれかと共にインキュベートし、続いてグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースゲルとインキュベーションした。ＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘLとインキュベーションされたＶＤＡＣ及びＡＮＴを更にセファロースゲルとインキュベートした。その後ゲルを３回洗浄し、結合したＶＤＡＣ及びＡＮＴを、ウェスタンブロットで分析した。結果を図１ｄに示す。図１ｄ中、「トータル」は、免疫沈降に使用された各タンパク質の量を表す。図１ｄに示すように、ラット肝臓ミトコンドリアから精製されたＶＤＡＣがＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質と高い割合で結合したことから、Ｂｃｌ−ｘLはＶＤＡＣと直接的な相互作用を示すことがわかった。そして、ラット心臓から精製されたＡＮＴは、ＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘLに対して低い割合での結合しか示さなかったことは文献（Science 281, 2027-2031, 1998）記載の結果と一致していた。
【００３６】
［ＶＤＡＣ−リポソーム内におけるＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性阻害］
（ＶＤＡＣ−リポソームによるスクロース取込み）
上記のことからＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの直接的な相互作用を確認でき、次に、Ｂｃｌ−ｘLが直接ＶＤＡＣ活性を調節するのかどうかを調べた。ラット肝臓ミトコンドリアのホモジェネートから精製されたＶＤＡＣをリポソーム内に再構成した。このＶＤＡＣ−リポソームの他に、熱変性ＶＤＡＣ−リポソームと対照としてのプレーンリポソームを用い、これらをそれぞれと14Ｃスクロース（１μＣｉ）とをｐＨ５．２で所定の時間インキュベートし、分子量３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離によって濾過した後、リポソームを回収して２％ＳＤＳに溶解し、リポソーム内の14Ｃスクロースの放射能を計測した。結果を図２ａに示す。図２ａに示すように、熱変性ＶＤＡＣ−リポソーム（□−□）やプレーンリポソーム（●−●）と異なり、ＶＤＡＣ−リポソーム（○−○）が、放射性同位元素でラベルされたスクロースを取り込んだことから、リポソームのスクロース取込みは、ＶＤＡＣによって媒介されたことがわかった。
【００３７】
（Ｂｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ−リポソーム内のＶＤＡＣ活性の阻害）
14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いてＶＤＡＣ−リポソームをそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘL（○−○）又は模擬タンパク質（●−●）と共にｐＨ５．２でインキュベートした。同様に、組換えＢｃｌ−ｘL（□−□）又は模擬タンパク質（■−■）と共にｐＨ７．３でインキュベートした。これらの結果を図２ｂに示す。ｐＨ５．２において、Ｂｃｌ−ｘLを添加すると、ＶＤＡＣ媒介のスクロース取込みは阻害された。酸性ｐＨでＢｃｌ−ｘLが機能したということは、酸性条件下でのみ合成脂質膜上でイオンチャネルとしてｒＢｃｌ−ｘLが働くという文献（Science 277, 370-372, 1997. Nature385, 353-357, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5113-5118, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11357-11362, 1997）の結果と一致していた。次に、Ｂｃｌ−ｘL及びＶＤＡＣをリポソームに同時に挿入した場合について検討した。
【００３８】
（ＶＤＡＣ及び組換えＢｃｌ−ｘLを含むリポソーム内における中性ｐＨでのＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害）
精製されたＶＤＡＣと、組換えＢｃｌ−ｘL又は模擬タンパク質の両方を同時にリポソーム内に導入したＶＤＡＣ／Ｂｃｌ−ｘLリポソーム及びＶＤＡＣ／模擬タンパク質リポソームを、14Ｃスクロース（１μＣｉ）と共にｐＨ７．３で３分間インキュベートし、14Ｃスクロース吸収を測定した。結果を図２ｃに示す。図２ｃからもわかるように、ｐＨが７．３でもＢｃｌ−ｘLは14Ｃスクロースの取込みを抑制する機能を有することから、酸性環境においてはリポソーム内へのＢｃｌ−ｘL自体の取込みが促進されたことが示唆された。また、ｐＨ５．０以下でＶＤＡＣはクローズすることが報告されているが、本実験におけるＶＤＡＣ−リポソームも、ｐＨ５．２〜７．３までの間の挙動に関して何ら顕著な違いを示さなかった。
【００３９】
（種々のＢｃｌ−ｘL投与量におけるＶＤＡＣ活性の阻害作用及びＢｃｌ−ｘL変異体によるＶＤＡＣ活性の阻害作用）
次に、０、１０、２０及び５０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘLとそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘL変異体ｍｔ−１（Ｆ１３１Ｖ、Ｄ１３３Ａ）及びｍｔ−７（１３５〜１３７がＡＩＬからＶＮＷ）と共に14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ｐＨ５．２で３分間ＶＤＡＣ−リポソームとインキュベートした後に、リポソーム内の14Ｃスクロースを計測した。結果を図２ｄに示す。図２ｄより、組換えＢｃｌ−ｘLの量が増えるに従ってＶＤＡＣ活性の阻害が大きくなっていることがわかる。また、２種の組換えＢｃｌ−ｘL変異体のうち、ｍｔ−１が部分的に抗アポトーシス活性を有すること、ｍｔ−７が抗アポトーシス活性を全く有さないことが文献（Nature 379, 554-556, 1996）に示されているが、ＶＤＡＣ媒介のスクロース吸収に関して、これら変異体は、それぞれ、ｍｔ−１が部分的に阻害作用を示し、ｍｔ−７が全く阻害作用を示さなかったことから、これら２つの活性には相関関係があることがわかった。
【００４０】
（組換えＶＤＡＣを組み込んだリポソーム内のＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害）
精製された組換えＶＤＡＣを、リポソームに組み込み、次に、14Ｃスクロース（１μＣｉ）及び組換えＢｃｌ−ｘLの（２０μｇ／ｍｌ）と共にｐＨ５．２で３分間インキュベートし、14Ｃスクロース吸収を測定した。結果を図２ｅに示す。組換えＶＤＡＣを用いてＶＤＡＣ−リポソームが作られた場合、Ｂｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害もまた観察されたことから、ＶＤＡＣはＢｃｌ−ｘLの直接のターゲットであることが確認された。
【００４１】
［ｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害とｒＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進］
次に、ＢａｘがＶＤＡＣ活性に影響を与えるかどうかについて検討した。
（ＢａｘによるＶＤＡＣ−リポソーム内への14Ｃスクロース取込みの促進）
14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ＶＤＡＣ−リポソームをそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢａｘ（○−○）又は模擬タンパク質（●−●）とともにｐＨ５．２で所定の時間インキュベートした。同様に、ＶＤＡＣ−リポソームをプレーンリポソームに変えて、組換えＢａｘ（□−□）又は模擬タンパク質（■−■）と共にインキュベートし、分子量３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離による濾過した後、リポソームを回収して２％ＳＤＳに溶解した後、リポソーム内の14Ｃスクロースの放射能を計測した。結果を図３ａに示す。図３ａより、ｒＢａｘによりＶＤＡＣ媒介のスクロース取込みは増大するが、Ｂａｘ自体の取込みによるプレインリポソームにおけるスクロースの取込みはなかったことがわかる。このことから、ＶＤＡＣ−リポソームにおけるｒＢａｘ誘導のスクロース取込みの増大は、Ｂａｘイオンチャネルによっては媒介されず、ＶＤＡＣにおけるＢａｘの何等かの作用を介して媒介されたことを示している。
【００４２】
（組換えＶＤＡＣが組み込まれたリポソーム内におけるＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進）
精製された組換えＶＤＡＣをリポソームに組み込み、組換えＢａｘ（２０μｇ／ｍｌ）又は模擬タンパク質と共に14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ｐＨ５．２でインキュベートし、14Ｃスクロース吸収を３分間測定した。結果を図３ｂに示す。図３ｂからもわかるように、組換えＶＤＡＣを用いてＶＤＡＣ−リポソームを調製した場合にも、同様の結果が観察された。
【００４３】
（ｒＢａｘ及びｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣリポソーム内へのスクロースインポートにに関する拮抗作用）
図３ｃに示される割合のｒＢａｘ及びｒＢｃｌ−ｘLと共に、14Ｃスクロース（１μＣｉ）、ＶＤＡＣ−リポソ−ムを用いて、ｐＨ５．２でインキュベートし、14Ｃスクロース吸収を３分間測定した。結果を図３ｃに示す。図３ｃに示されるように、ｒＢａｘとＢｃｌ−ｘLとは、ＶＤＡＣ活性において拮抗作用を示した。
【００４４】
（ＢａｘとＶＤＡＣとの直接の相互作用）
ｒＢａｘ及びＶＤＡＣを共にリポソームに取り込ませた場合、ｐＨ７．３でＢａｘはアポトーシス促進作用を示し、また、ｒＢａｘの代わりにアポトーシス促進作用を有するＢａｋのＣ末端２１アミノ酸残基を欠損させた変異体を用いた場合にも、同様の結果が得られた。抗ＶＤＡＣ抗体を用いて、ウェスタンブロット法により免疫複合体を分析したところ、ラット肝臓及び大腸菌から調製されたＶＤＡＣは、検出可能なレベルのＡＮＴを含んでいないことから、さらに２種のＡＮＴリガンドであるアトラクチル酸及びボンクレキン酸によって、ＶＤＡＣ−リポソームによるスクロース取込みは影響を受けなかった。このことから、ＶＤＡＣ調製物中にＡＮＴのコンタミがなかったことを結論できる。
【００４５】
［Ｂａｘ及びＢａｋによるＶＤＡＣを通過するシトクロムｃの誘導］
本発明者らは、既に、ＰＴポア（Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）を介し、単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃのリリースをＢａｘ及びＢａｋが誘導すること（Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. J. Cell Biol. 143, 217-224, 1998. Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）を報告している。そして、上記のように、Ｂａｘ及びＢａｋがＶＤＡＣ活性を直接増大することが明らかになったことから、Ｂａｘ及びＢａｋ存在下でＶＤＡＣを通じてシトクロムｃがリリースされるかどうかについて検討した。
【００４６】
（シトクロムｃのＦＩＴＣラベル）
顕微鏡を使ってシトクロムｃの移動を測定するため、その分子質量に大幅な変更を加えないようにＦＩＴＣラベルのシトクロムｃを調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。蛍光によってＦＩＴＣを、抗シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によってシトクロムｃをそれぞれ検出した。図４ａ中、レーン１はＦＩＴＣ−シトクロムｃ（２５ｐｇ）、レーン２はシトクロムｃ（２５ｐｇ）をそれぞれ示す。
【００４７】
（Ｂａｘ誘導によるＶＤＡＣ−リポソームへのＦＩＴＣ−シトクロムｃの取込み）
前述したように、５０μＭのＦＩＴＣ−シトクロムｃ及び５０ｍＭのスクロースと、さらにｒＢａｘ（５２μｇ／ｍｌ）を用いた場合、ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘL（ともに５２μｇ／ｍｌ）を用いた場合、又はどちらも用いない場合でｐＨ５．２で５分間、ＶＤＡＣ−リポソーム（図４ｂ、４ｃ）及びプレーンリポソーム（図４ｃ）をインキュベートして、共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。ＶＤＡＣ−リポソームの典型的な写真（４，８００倍）を図４ｂに示す。リポソ−ム内のシトクロムｃの蓄積に基づいてリポソームを分類し、頻度（％）及び典型的な写真を図４ｃに示す。写真はいずれも２μｍ×２μｍである。
【００４８】
図４ｂや図４ｃに示されているように、スクロース存在下で、ＦＩＴＣラベルのシトクロムｃを用いてＶＤＡＣ−リポソームをインキュベートして、共焦点蛍光顕微鏡下でラベルされたシトクロムｃを検出したところ、ｒＢａｘ非存在下で、ＶＤＡＣ−リポソームと同様に、プレーンリポソーム表面にシトクロムｃが蓄積した（図４ｂ、４ｃ）。対照的に、ｒＢａｘ（図４ｂ、４ｃ）存在下で、ＶＤＡＣ−リポソーム内側にシトクロムｃが蓄積したことから、ＢａｘがシトクロムｃにＶＤＡＣ通過をさせることがわかった。ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘLの共存下では、シトクロムｃのＢａｘ媒介による移動が阻害された（図４ｂ、４ｃ）。また、ｒＢａｘに代えてＢａｋを用いたところ同様な結果が得られた。
【００４９】
（ＶＤＡＣ−リポソームからのＢａｋ誘導シトクロムｃリリース）
上記のように、８０ｍＭのスクロース及び１００μＭのシトクロムｃを含むＶＤＡＣ−リポソーム（左パネル）及びプレーンリポソーム（右パネル）を、ｒＢａｋ（２０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、スクロースフリー緩衝液中で、ｐＨ５．２で５分間インキュベートした。結果を図４ｄに示す。図４ｄには、最初に取り込まれたシトクロムｃの全体量が１００％として示されている。また、シトクロムｃリリースは、分光光度計により測定した。
【００５０】
図４ｄからわかるように、ＶＤＡＣ−リポソーム内にシトクロムｃとスクロースとを取り込ませて、次に、スクロースフリー緩衝剤を用いてＶＤＡＣ−リポソームをインキュベートすると、ｒＢａｋ存在下においてはシトクロムｃは大量にリリースしたが、ｒＢａｘ存在下でプレーンリポソームを用いた場合には、このようなシトクロムｃリリースは認められなかった。また、スクロースフリー緩衝剤でのインキュベーションの後、ＶＤＡＣ−リポソームとプレーンリポソームの両方から、少量のシトクロムｃリリースがあったのは、リポソーム表面に、非特異的に結合したシトクロムｃが遊離したためと考えられる。
【００５１】
スクロース非存在下でもまた、ＢａｋによりシトクロムｃがＶＤＡＣを透過することが観察された。これらの実験の間、フローサイトメトリーによって測定されたように、リポソームの数は変わらず、ＧＳＴ−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むＶＤＡＣ−リポソームに対してｒＢａｋを添加した場合、ＧＳＴ−ＧＦＰ融合タンパク質（５０ｋＤ）はリリースされなかったことから、リポソームの破裂が生じていないことがわかる。また、ｒＢａｋに代えてｒＢａｘを用いた場合も、同様にシトクロムｃにＶＤＡＣ透過を行わせることがわかった。
【００５２】
［酵母ミトコンドリア内におけるＢａｋ誘導ΔΨロス及びシトクロムｃリリースに対するＶＤＡＣの要求］
チャネル活性を媒介するために、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質がＶＤＡＣを直接のターゲットとすることが明らかになったことから、次に、ＶＤＡＣがアポトーシスに関連するミトコンドリアのΔΨロス及びシトクロムｃリリースの調節に関わるＢｃｌ−２ファミリータンパク質のターゲットなのかどうかについて検討した。
【００５３】
（ＶＤＡＣ欠質ミトコンドリアのｒＢａｋ誘導ΔΨロスに対する無能力）
哺乳類由来のＶＤＡＣ欠損細胞が入手できないこと、及びＢｃｌ−２ファミリータンパク質は酵母細胞内で機能することが明らかになっている（FEBS lett. 380, 169-175, 1996. Molecular Cell 1, 327-336, 1998）ことから、ＶＤＡＣ１を欠失したΔＶＤＡＣ（Science 247, 1233-1236, 1990）を用いて調べた。ｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）（図５ａ）、模擬タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）（図５ｂ）、及びｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）とｒＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）（図５ｃ）を用いて、野生型酵母（ｗｉｌｄ）、ΔＶＤＡＣ及びヒトＶＤＡＣを発現するΔＶＤＡＣ酵母（ｈＶＤＡＣ）からそれぞれ単離されたミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）をＲｈ１２３と共にインキュベートして、ΔΨを測定した。結果を図５ａ〜ｃに示す。
【００５４】
（Ｂａｋ誘導シトクロムｃリリースを示さないＶＤＡＣ１欠損ミトコンドリア）ｒＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、ｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）又は模擬タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）を用いて、２０分間、野生型酵母（ｗｉｌｄ）、ΔＶＤＡＣ及びｈＶＤＡＣを発現するΔＶＤＡＣ酵母（ｈＶＤＡＣ）から単離されたミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートした。サンプルを遠心分離にかけて、上澄みの一部（２０μｌ）を、抗酵母シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。結果を図５ｄに示す。図５ｄ中「トータル」は、等量のミトコンドリアを表している。
【００５５】
図５ａ及び図５ｄからわかるように、哺乳類由来のミトコンドリアと同様に、野生型酵母から単離したミトコンドリアも、ｒＢａｋを添加した後、ΔΨロス及びシトクロムｃリリースを示したが、ΔＶＤＡＣ酵母から単離したミトコンドリアにおいては、ｒＢａｘによるΔΨロス及びシトクロムｃリリースの誘導は認められなかった。しかし、ヒトｖｄａｃ１遺伝子（ｈＶＤＡＣ）をトランスフェクトしたΔＶＤＡＣ酵母からのミトコンドリアにおいては、ｒＢａｋがΔΨロス及びシトクロムｃリリースを誘導したことから、ΔＶＤＡＣ酵母からのミトコンドリアがｒＢａｋに対して反応しなかったことは機能するＶＤＡＣが存在しなかったことによることがわかった。
【００５６】
図５ｃ及び図５ｄからわかるように、酵母ミトコンドリア内で、Ｂａｋ媒介ΔΨロス及びシトクロムｃリリースは、Ｂｃｌ−ｘLによって阻害された。本研究において用いられたミトコンドリアは全て、同じレベルのＡＴＰを有していたので、使用したミトコンドリアの質的な差による影響の可能性は除外された。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質が、ＶＤＡＣをターゲットして、アポトーシスに関連するミトコンドリアのΔΨロス及びシトクロムｃリリースを調節することはこの結果から明らかである。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法により、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用に起因する各種疾患における医薬や診断薬としての用途が期待できるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質を提供することができる。また、本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質は、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用に起因する各種疾患における医薬や診断薬としての用途が期待できる。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を示す図である。
【図２】ＶＤＡＣ−リポソーム系におけるＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣの活性阻害を示す図である。
【図３】ｒＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進とｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害を示す図である。
【図４】Ｂａｘ及びＢａｋによるシトクロムｃのＶＤＡＣ通過の誘導を示す図である。
【図５】酵母ミトコンドリア内におけるＢａｋ誘導ΔΨロス及びシトクロムｃリリースに対するＶＤＡＣの要求を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス（細胞死）抑制作用や、アポトーシス促進作用を有する物質のスクリーニング方法、より詳しくはＶＤＡＣ−リポソームを用いるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法や、アポトーシス抑制作用や、アポトーシス促進作用を有するに新規なポリペプチド関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、生理的条件下で細胞自らが積極的にひき起こす細胞死であり、その形態は細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝縮を特徴とし、最近では、アポトーシスを誘導する細胞表層受容体Ｆａｓ抗原、アポトーシス誘導に必須のプロテアーゼ（カスパーゼ）、アポトーシスを抑制するがん遺伝子ｂｃｌ−２遺伝子などが明らかにされている。
【０００３】
がん遺伝子ｂｃｌ−２遺伝子は、濾胞性リンパ腫附随の染色体転座ｔ（１４；１８）（ｑ２１；ｑ３２）により活性化されるがん遺伝子として同定され、アポトーシス抑制機能を有するユニークながん遺伝子であり、このＢｃｌ−２に相同性を示す多数のタンパク質はＢｃｌ−２ファミリーと呼ばれ、Ｂｃｌ−２ファミリーには、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ｘLで代表されるアポトーシス抑制機能を有するメンバーと、ＢａｘやＢａｋで代表されるアポトーシス促進（又は誘導）機能を有するメンバーが存在することが知られている。
【０００４】
また、ミトコンドリアがアポトーシスシグナルの形質導入におけるきわめて重要な役割を果たし、このミトコンドリアのアポトーシス変化をＢｃｌ−２ファミリータンパク質が調節し、アポトーシス抑制機能を有するＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘLがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを阻害すること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. J. Exp. Med. 183, 1533-1544, 1996. Cell 91, 627-637, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459）や、アポトーシス促進機能を有するＢａｘ及びＢａｋがミトコンドリア膜電位（ΔΨ）ロス及びシトクロムｃリリースを誘導すること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. J. Cell Biol. 143, 217-224, 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）も知られている。
【０００５】
膜透過性遷移（以下「ＰＴ」という）ポアと呼ばれるポリプロテインチャネルにより、Ｂａｘ及びＢａｋに依存する膜透過性の変化が媒介されること（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. Science 281, 2027-2031,1998）や、ポリプロテインチャネルは、ミトコンドリアポーリンとも呼ばれるＶＤＡＣ（電位依存性陰イオンチャネル）、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）、シクロフィリンＤ及び他のいくつかの分子からなると考えられていること（J. Bioenerg. Biomembr. 26, 509-517, 1994. Biochem. Biophys. Acta 1241, 139-176, 1995）も知られている。
【０００６】
ＶＡＤＣはミトコンドリアの外層膜に豊富に存在する小さなタンパク質であり、プラナー脂質二重層に取りこまれてＶＡＤＣ−リポソームを形成した場合に大きな（２．６ｎｍ）電位依存性ポアを形成することが知られており（J. Membr. Biol. 111, 103-111, 1989）、またＶＤＡＣは、イオンや中間代謝物を含んだ様々な物質がミトコンドリアを出入りする際の経路として生理学的に機能していると考えられている。さらに、本発明者らによって、Ｂａｘ及びＢａｋがＰＴポアと相互作用することが最近になって明らかにされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998. Science 281, 2027-2031, 1998）。また、ＢａｘがＡＮＴ（アデニンヌクレオチドトランスロケーター）と直接相互作用して、ＡＮＴ及びＰＴポアリポソームをアトラクチル酸、すなわちＡＮＴリガンドに感作させることも報告されている（Science 281, 2027-2031, 1998）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
Ｂｃｌ−２やＢａｘは発ガンに深く係わっている。ｔ（１４；１８）転座を有する濾胞性リンパ腫やび慢性大細胞型リンパ腫、ｔ（１８；２２）（ｑ２１；ｑ１１）もしくはｔ（２；１８）（ｑ１１；ｑ２１）を有する慢性リンパ性白血病において、各々免疫グロブリン重鎖、軽鎖領域への転座によりＢｃｌ−２はその発現の脱調節をうけ、細胞死抑制を促し発ガンに寄与する。一方Ｂａｘは、ガン抑制遺伝子として機能し、血球系腫瘍細胞株において高頻度にＢａｘ遺伝子（ＢＨ１とＢＨ３領域）の変異が認められており、ヒトの腫瘍への関与が示唆されている。
【０００８】
また、Ｂｃｌ−２は神経変異性疾患に深く係わっている。Ｂｃｌ−２と結合し、そのアポトーシス抑制機能を増強するＳＭＮ（survival motor neuron）タンパクは、運動神経変性を伴う遺伝子性疾患である脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy）の原因遺伝子産物であり、ＳＭＮの欠損によるＢｃｌ−２機能の低下がこの疾患の発症と深く関わっている。
【０００９】
本発明の課題は、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用を有するＢｃｌ−２ファミリーが各種疾患と深い係わりを有することから、医薬や診断薬としての用途が期待できるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法や、アポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アポトーシスを制御するＢｃｌ−２ファミリータンパク質に属するＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘLなどによるアポトーシスを抑制する機能や、Ｂａｘ、Ｂａｋなどによるアポトーシスを促進する機能が、ミトコンドリアを介して行われることを明らかにしてきたが、そのターゲット分子に関して鋭意研究し、リポソーム系を用いることにより、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質がミトコンドリア外層膜のタンパク質ＶＤＡＣを直接のターゲットとして、アポトーシスシグナル伝達における中心的な現象であるシトクロムｃリリース及びΔΨロスの調節を行っていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、ＶＤＡＣがリポソームの脂質二重層に埋め込まれた構造を有するＶＤＡＣ−リポソームと、ＶＤＡＣを通過することができる指標物質と、被検物質とをインキュベーションし、インキュベーション前後におけるＶＤＡＣ−リポソーム内外の指標物質の濃度変化を検出することにより、被検物質のアポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無を判定することを特徴とするアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１）や、インキュベーションが、指標物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項２）や、インキュベーションが、被検物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項３）や、インキュベーションが、被検物質と共にアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質が存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項４）や、ＶＤＡＣ−リポソームが、組換えヒトＶＤＡＣを用いて調製されたＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項５）や、ＶＤＡＣ−リポソームが、小さなユニラメラ小胞にＶＤＡＣを再構成したＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項６）や、指標物質が、標識化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項７）や、標識化合物が、蛍光標識シトクロムｃ及び／又は同位体標識スクロースであることを特徴とする請求項７記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項８）に関する。
【００１２】
また本発明は、被検物質が、タンパク質又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項９）や、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号１に示される塩基配列のうち、３２番目から７５１番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１５）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号３に示される塩基配列のうち、１３５番目から８３６番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１６）や、タンパク質又はポリペプチドが、配列番号５に示される塩基配列のうち、１６３番目から２２２番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法（請求項１７）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるＶＤＡＣ−リポソームとしては、ミトコンドリアポーリンとも呼ばれるＶＤＡＣが、脂質二重層よりなる閉鎖小胞であるリポソームの脂質二重層に埋め込まれた構造を有するものであればどのようなものでもよい。また、ＶＤＡＣ−リポソームを構成するＶＤＡＣとしては、その由来は限定されないが、組換えヒトＶＤＡＣ等のヒト由来のＶＤＡＣを用いて調製したＶＤＡＣ−リポソームが医薬品等を開発する点から好ましく、そしてまた、ＶＤＡＣ−リポソームとしては、小さなユニラメラ小胞（ＳＵＶ）にＶＤＡＣを再構成したＶＤＡＣ−リポソームが反応感度の点から好ましい。そして、リポソームの調製方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
【００１５】
本発明における指標物質としては、アポトーシス促進物質の存在下等においてＶＤＡＣチャネルを通過することができる物質であればどのようなものでもよいが、被検物質のアポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無を判定する上で、インキュベーション前後における濃度変化の検出が容易なものが好ましく、標識化合物、色素、酵素等を挙げることができるが、特に同位体で標識された分子量が比較的小さいスクロースや、そのリリースがアポトーシスシグナルの形質導入における中心的な現象であるとされるシトクロムｃを蛍光物質等の標識化合物により修飾した標識シトクロムｃを具体的に例示することができる。そして指標物質は、ＶＤＡＣ−リポソームと共にインキュベーションするに際して、１種又は２種以上を同時に用いてもよく、またＶＤＡＣ−リポソーム内及び／又はＶＤＡＣ−リポソーム外に存在させておくことができる。
【００１６】
本発明における被検物質としては、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無の判定が期待される物質であればどのような物質でもよく、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用を有する可能性が高いタンパク質を具体的に例示することができ、中でも既にアポトーシスの制御物質として知られているＢｃｌ−２ファミリータンパク質の全部又は一部からなるタンパク質又はポリペプチドの修飾・改変タンパク質又は修飾・改変ポリペプチドが好ましい。修飾・改変されたタンパク質やポリペプチドとしては、例えば、タンパク質やポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質やポリペプチド、タンパク質やポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列又はこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質やポリペプチドを挙げることができる。
【００１７】
そして、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質としては、アポトーシス抑制作用を有するタンパク質として、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＢｃｌ−２、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＢｃｌ−ｘL、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１(Ｂｆｌ−１)、ＢＨＲＦ−１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ＬＭＷ−５−ＨＬ（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、Ｋｓｂｃｌ−２（ＨＨＶ８）、ＯＲＦ１６（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓａｉｍｉｒｉ）を、アポトーシス促進作用を有するタンパク質としては、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢａｘ、Ｂｃｌ−ｘS、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｍｔｄ（Ｂｏｋ）、Ｄｉｖａ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｈｒｋ（ＤＰ５）、Ｂｌｋ、Ｂｎｉｐ３、Ｂｎｉｐ３Ｌを挙げることができる。また、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の一部からなるポリペプチドとしては、アポトーシス抑制作用を有するポリペプチドとして、配列表の配列番号２記載の７番目から３０番目のアミノ酸配列から成るＢｃｌ−２由来のポリペプチドや配列番号４記載の４番目から２３番目のアミノ酸配列から成るＢｃｌ−ｘL由来のポリペプチドを、アポトーシス促進作用を有するポリペプチドとして、配列番号６記載の５５番目から７４番目のアミノ酸配列から成るＢａｘ由来のポリペプチドを、それぞれ具体的に例示することができる。
【００１８】
また、本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法においては、タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又ポリペプチドも被検物質として有利に用いることができる。そして、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示されるＢｃｌ−２をコードするＤＮＡ、配列番号３に示されるＢｃｌ−ｘLをコードするＤＮＡ、配列番号５に示されるＢａｘをコードするＤＮＡを具体的に例示することができ、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列のうち３２番目から７５１番目までの塩基配列、配列番号３に示される塩基配列のうち１３５番目から８３６番目までの塩基配列、配列番号５に示される塩基配列のうち１６３番目から２２２番目までの塩基配列を具体的に例示することができる。
【００１９】
また被検物質は、ＶＤＡＣ−リポソームと共にインキュベーションするに際して、単独又は既知の１もしくは２種以上のアポトーシス抑制物質又は１もしくは２種以上のアポトーシス促進物質と併用することができる。被検物質とアポトーシス抑制物質を併用した場合はアポトーシス促進物質を、被検物質とアポトーシス促進物質を併用した場合はアポトーシス抑制物質をそれぞれスクリーニングすることができるが、アポトーシス抑制物質と拮抗する物質やアポトーシス促進物質と拮抗する物質をスクリーニングすることもできる。併用する場合、被検物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質とは、ＶＤＡＣ−リポソーム内に存在させることが好ましいが、どちらか一方又は両者をＶＤＡＣ−リポソーム外に存在させておくこともできる。そして、インキュベーションするに際して被検物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質、被検物質と指標物質、被検物質と指標物質とアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質等をＶＤＡＣ−リポソーム内に存在させるには、従来公知の方法を用いることができる。
【００２０】
本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法においては、インキュベーションにおける温度、ｐＨ、反応時間等の条件は特に制限されるものではないが、インキュベーション前後におけるＶＤＡＣ−リポソーム内外の指標物質の濃度変化を感度よく検出することができる条件を選択することが好ましい。
【００２１】
本発明は、また、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を少なくとも含むアポトーシス制御作用を有するポリペプチドや、これらペプチドに細胞内導入用の化学修飾がなされているポリペプチドや、上記本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法により得られたアポトーシス抑制物質やアポトーシス促進物質に関する。このうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、７番目から３０番目のアミノ酸配列、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち、４番目から２３番目のアミノ酸配列又は配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち、５５番目から７４番目のアミノ酸配列はそれぞれ公知であるが、これらアミノ酸配列からなるポリペプチドが新たに調製されたことはなく、ましてこれらアミノ酸配列からなるポリペプチドがＶＤＡＣチャネルに作用し、アポトーシス抑制作用やアポトーシス促進作用を発揮しうることは本発明をもって嚆矢とするものである。また、上記細胞内導入用の化学修飾がなされているポリペプチドとしては、細胞内への移行をスムーズにするＨＩＶウイルスが産生するタンパク質ＴＡＴ由来のオリゴペプチドを付けたポリペプチドを挙げることができる。
【００２２】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、かかる実施例に限定されるものではない。
［材料と方法］
（抗体の入手）
ラット及びウマシトクロムｃと交差反応する抗ハトシトクロムｃモノクローナル抗体（７Ｈ８．２Ｃ１２）、抗酵母シトクロムｃポリクローナル抗体及び抗ラットＡＮＴ抗体は、それぞれDr. E. Margoliash （イリノイ大学、イリノイ）、Dr. G. Shatz（バーゼル大学、スイス）及びDr. H.H. Schmid （ミネソタ大学、ミネソタ）から提供されたものを用いた。ラットＶＤＡＣと交差反応する抗ヒトＶＤＡＣ（ポーリン）モノクローナル抗体（３１ＨＬ）は、カルバイオケム（Calbiochem, La Jolla, CA）から、抗ヒトＢｃｌ−ｘLポリクローナル抗体（Ｌ１９）及び抗ヒトＢａｘポリクローナル抗体（Ｎ２０）は、サンタクルス・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechology, Santa Cruz, CA）からそれぞれ入手した。
【００２３】
（免疫沈降反応及びウェスタンブロット分析）
ラット肝臓ミトコンドリアを、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459, 1998）記載のように単離した。プロテイナーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（最終濃度で１０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）ｐＨ７．４、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）、０．５％のＮＰ４０）内に溶解され、超音波処理された細胞とミトコンドリアを用いて、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686）記載のように免疫沈降反応を行った。リポソームを用いた免疫沈降実験を行うため、文献（Mol. Cell 1, 337-346, 1998）記載のように、タンパク質クロスリンカーとしてＤＴＢＰを用いた。精製タンパク質間の結合を検出するため、１００μｌの溶解緩衝液内にＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL（０．２μｇ）又はＧＳＴ（０．２μｇ）のどちらかを用いて、ＶＤＡＣ（０．２μｇ）及びＡＮＴ（０．２μｇ）を３時間インキュベートした。そして、グルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースゲル又はセファロースゲルを用いて、これらのタンパク質を３時間インキュベートし吸着させた。遠心分離を短時間行った後、溶解緩衝液を用いてゲルを３回洗浄し、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥを行うためサンプル緩衝液内に再懸濁した。
【００２４】
（ペプチド配列決定）
免疫沈殿物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離されたタンパク質を切り取り、リシルエンドペプチダーゼを用いて３５℃で１日間消化させた。ＴＳＫゲル（トーソー製「ＯＤＳ−８０Ｔｓ」）を用いて、得られたペプチドフラグメントを分離し、Ｎ−末端側から直接、エドマン分解法によって、マイクロシークエンシングを行いペプチドの配列を決定した。
【００２５】
（タンパク質の精製）
ヒトＢｃｌ−ｘL、２種のＢｃｌ−ｘL変異体及びヒトＢａｋ（Ｃ−末端２１アミノ酸残基を欠質している）を、大腸菌（Escherichia coil）ＤＨ５α株内でＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタチオン−セファロースカラムを用いて精製した。この精製したＧＳＴ融合蛋白質にトロンビンを作用させてＧＳＴから分離させた。ヒトＢａｘは、Ｈｉｓタグタンパク質として文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681-14686）記載のように精製した。エクスプレスシステム（インビトロジェン社製）を用いて、大腸菌株ＤＥ３内にＨＡタグヒトＶＤＡＣ１を発現させ、ＨＡ（乾燥ハイドロキシアパタイト）カラムにて精製した。エンプティーベクターからのＧＳＴ又はＨｉｓタグタンパク質を用いて、模擬コントロ−ルタンパク質を調製した。
【００２６】
文献（Biochem. Biophys. Acta 905, 499-502, 1987）記載のように、ラット肝臓ＶＤＡＣを精製した。すなわち、ラット肝臓ミトコンドリアを１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３％トリトン−Ｘ１００に０℃で３０分間懸濁し、３７，０００ｇで４５分間超遠心分離器によって分離させた。上澄み液を、ＨＡ及びセライト（９：１）カラム（３ｇ）に加えて、精製ＶＤＡＣタンパク質として、フラクションから最初の溶出液（１ｍｌ）を集めた。精製されたＶＤＡＣは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によって、ゲルに１本のバンドを示した。ｒＶＤＡＣの純度は９５％以上を示した。ラット心臓ＡＮＴは、文献（FEBS lett. 426, 97-101, 1998）記載のように精製した。精製されたＡＮＴの純度は上記と同様の方法で調べた結果、９０％以上であった。
【００２７】
（リポソーム内でのＶＤＡＣ再構成）
文献（Biochem. Biopys. Acta 1145, 168-176, 1993）記載の超音波凍結融解処理法に若干の修飾を加え、小さなユニラメラ小胞内で精製されたＶＤＡＣ及び組換えＶＤＡＣを再構成した（Biochem. Biopys. Acta 1145, 168-176, 1993）。すなわち、３０ｍＭのスルホン酸ナトリウム及び２０ｍＭのトリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３又は５．２）を含むリポソーム培地１ｍｌに、８０ｍＭスクロースの存在又は非存在下で、１００ｍｇのリン脂質（ダイズ、タイプII−Ｓ）を溶解した。超音波処理の後、精製されたＶＤＡＣタンパク質又は組換えＶＤＡＣタンパク質（２００μｇ）を、ｒＢｃｌ−ｘL（２００μｇ）及びｒＢａｘ（２００μｇ）の存在又は非存在下で、１ｍｌのリン脂質に添加し、この懸濁液を２回の凍結融解サイクルにかけた。熱変性ＶＤＡＣタンパク質は９５℃で１０分間の加熱により得られた。温和な超音波処理によってユニラメラＶＤＡＣリポソームを産生し、その産生物をセファデックスＧ−５０カラムで分画した。分光光度計（島津製作所社製；ＵＶ−１６０Ａ）で各分画の光散乱を波長５２０ｎｍで測定し、任意の７００〜９００ユニット／μｌを含む分画物を実験に使用した。プレーンリポソームは、タンパク質を全く加えずに、同様な方法で産生された。
【００２８】
14Ｃスクロース吸収を測定しながら、スクロース取込み実験を行った。５μｌの14Ｃスクロース（９７％；２００μＣｉ／ｍｌ）を用いて２５℃でリポソ−ム（２０μｌ）をインキュベートし、分子量３０，０００制限フィルター（ミリポア社製；ウルトラフリー−ＭＣ３０，０００）を用いた遠心分離によって、フリーの14Ｃスクロースを取り除いた。ガンマシンチレーション計数管（ワラック社製「１４１４」）によって、回収されたリポソームに取り込まれている14Ｃスクロースを測定した。
【００２９】
(シトクロムｃ転移実験)
文献（Wiley Interscience. 5.3.1-5.3.11, 1990）記載のように、フルオレセインイソチオシアネート（以下「ＦＩＴＣ」という）標識シトクロムｃを調製した。すなわち、０．０５Ｍのホウ酸塩及び０．２Ｍの塩化ナトリウムを含むラベル化緩衝液（ｐＨ９．２）を用いて、１ｍＭのウマシトクロムｃを透析した。ＦＩＴＣ（２５０μｇ）と共に２時間インキュベートした後、未結合のＦＩＴＣをラベル化緩衝液を用いた透析によって除去し、続いてセファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーを行い分離した。分光光度計で計測したＦＩＴＣ／シトクロムｃのモル比は、０．４７であった。ルミノイメージアナライザー（富士フィルム社製「ＬＡＳ−１０００」）を用いてＦＩＴＣ標識シトクロムｃを検出した。リポソーム（２μｌ）は、スクロース（５０ｍＭ）とＦＩＴＣ標識シトクロムｃ（５０μＭ）の両者と共に、ｒＢａｘ（１．５μｇ）と共に、ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘL（共に１．５μｇ）と共に、又はどちらも用いることなく、全量を２９μｌとして、ｐＨ５．２でインキュベートし、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ−７４５；オリンパス）を用いて、ラベルされたシトクロムｃを視覚化した。
【００３０】
次に、シトクロムｃ漏出実験を以下の方法で行った。スクロース（８０ｍＭ）を含むリポソーム（１ｍｌ）緩衝液にシトクロムｃ（１００μＭ）と混合させ、冷凍解凍サイクルに２回かけた。ユニラメラ化した後、２５℃で１０分間、２０μｇ／ｍｌのｒＢａｋあり、又はなしで、１ｍｌのスクロースフリー緩衝液で２０μｌのリポソームをインキュベートした。次にリポソームをフリーシトクロムｃから分離するために、Ｍ．Ｗ．３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離によって分離した。吸光度４０８ｎｍで分光光度計を用いて、フリーシトクロムｃの量を決定し、全シトクロムｃに対する割合を計算した。
【００３１】
(酵母ミトコンドリア)
ＶＤＡＣ欠質酵母株（以下「ΔＶＤＡＣ」という；Ｍ２２−２）及びその親株（Ｍ３）は、Ｍ．フォルテ博士（Dr. M. Forte、ボラム・インスチチュート・フォー・アドバンスド・バイオケミカル・リサーチ、オレゴンVollum Institute for Advanced Biomedical Research, Oregon)から提供されたものを用いた。酢酸リチウムを用いてヒトｖｄａｃ１のｃＤＮＡをトランスフェクトすることによって、ヒトＶＤＡＣ１発現をするΔＶＤＡＣ酵母株を作出した。スフェロプラストを形成するために、細胞１ｇに対し２ｍｇのチモリアーゼ２０Ｔを用いて、文献（J. Biol. Chem. 257, 13028-13033, 1982）記載の方法に準じてミトコンドリアを単離した。タイトフィッティングホモジェナイザーを用いてセファロプラストをホモジェネートした。０．６Ｍのマンニトール、１０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ７．４）及び０．１％の脂肪酸フリーＢＳＡ（以下「ｙＭｔ緩衝液」という）中で、単離されたミトコンドリアを懸濁した。４．２ｍＭのコハク酸塩を添加したｙＭＴ緩衝液中で、ミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２５℃でインキュベートした。文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1455-1459）記載のように、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の吸収を測定することによって、ΔΨを測定した。上記のミトコンドリアをスピンし、得られた上澄み液は、抗酵母シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット分析によってシトクロムｃのリリースを検出した。
【００３２】
［Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用］
（Ｂｃｌ−ｘLに結合する３種のタンパク質）
ラット肝臓ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を組換えＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）と共に５分間インキュベートした後、このミトコンドリア溶解物を抗Ｂｃｌ−ｘL抗体（α−Ｂｃｌ−ｘL）又はラビット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いた免疫沈降にかけ、得られた免疫複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳導法によって分離させ、銀染色法によって染色した。この抗Ｂｃｌ−ｘL抗体を用いた共免疫沈降法により、ミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLに結合する３種のタンパク質、３３ｋＤ、１８ｋＤ、及び１３ｋＤを検出した（図１ａ）。
【００３３】
（ミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用）
上記の方法によって得られた３３ｋＤタンパク質のアミノ酸配列の一部が、ラットＶＤＡＣと一致していたため、抗ＶＤＡＣ抗体及び抗Ｂｃｌ−ｘL抗体を用いた共免疫沈降に引き続きウェスタンブロット法により、単離されたミトコンドリアにおけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を調べた。結果を図１ｂに示す。
【００３４】
（ＨｅｐＧ２細胞におけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用）
Ｂｃｌ−ｘLを発現するＨｅｐＧ２細胞（Oncogene 12, 2045-2050, 1996）におけるＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を調べた。結果を図１ｃに示す。他方、Ｂｃｌ−ｘLとＴｏｍ４０（内在性外膜タンパク質）及びＢｃｌ−ｘLとＦ1−ＡＴＰアーゼ（内膜タンパク質）との共免疫沈降が可能な相互作用は、共に観察されなかったので、Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとが特異的な相互作用を有することがわかる。
【００３５】
（Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣ又はＡＮＴとの直接的な相互作用）
ＰＴポアはＶＤＡＣを含むポリプロテインチャネルであることから、ミトコンドリア及び細胞からのＶＤＡＣとＢｃｌ−ｘLにおける共免疫沈降が、必ずしもＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの直接的な相互作用を示すとはいえないことから、以下の実験を行い確認した。精製されたラット肝臓ＶＤＡＣ（０．２μｇ）及びラット心臓ＡＮＴ（０．２μｇ）をＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質（０．２μｇ）又はＧＳＴ（０．２μｇ）のいずれかと共にインキュベートし、続いてグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースゲルとインキュベーションした。ＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘLとインキュベーションされたＶＤＡＣ及びＡＮＴを更にセファロースゲルとインキュベートした。その後ゲルを３回洗浄し、結合したＶＤＡＣ及びＡＮＴを、ウェスタンブロットで分析した。結果を図１ｄに示す。図１ｄ中、「トータル」は、免疫沈降に使用された各タンパク質の量を表す。図１ｄに示すように、ラット肝臓ミトコンドリアから精製されたＶＤＡＣがＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘL融合タンパク質と高い割合で結合したことから、Ｂｃｌ−ｘLはＶＤＡＣと直接的な相互作用を示すことがわかった。そして、ラット心臓から精製されたＡＮＴは、ＧＳＴ−Ｂｃｌ−ｘLに対して低い割合での結合しか示さなかったことは文献（Science 281, 2027-2031, 1998）記載の結果と一致していた。
【００３６】
［ＶＤＡＣ−リポソーム内におけるＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性阻害］
（ＶＤＡＣ−リポソームによるスクロース取込み）
上記のことからＢｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの直接的な相互作用を確認でき、次に、Ｂｃｌ−ｘLが直接ＶＤＡＣ活性を調節するのかどうかを調べた。ラット肝臓ミトコンドリアのホモジェネートから精製されたＶＤＡＣをリポソーム内に再構成した。このＶＤＡＣ−リポソームの他に、熱変性ＶＤＡＣ−リポソームと対照としてのプレーンリポソームを用い、これらをそれぞれと14Ｃスクロース（１μＣｉ）とをｐＨ５．２で所定の時間インキュベートし、分子量３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離によって濾過した後、リポソームを回収して２％ＳＤＳに溶解し、リポソーム内の14Ｃスクロースの放射能を計測した。結果を図２ａに示す。図２ａに示すように、熱変性ＶＤＡＣ−リポソーム（□−□）やプレーンリポソーム（●−●）と異なり、ＶＤＡＣ−リポソーム（○−○）が、放射性同位元素でラベルされたスクロースを取り込んだことから、リポソームのスクロース取込みは、ＶＤＡＣによって媒介されたことがわかった。
【００３７】
（Ｂｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ−リポソーム内のＶＤＡＣ活性の阻害）
14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いてＶＤＡＣ−リポソームをそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘL（○−○）又は模擬タンパク質（●−●）と共にｐＨ５．２でインキュベートした。同様に、組換えＢｃｌ−ｘL（□−□）又は模擬タンパク質（■−■）と共にｐＨ７．３でインキュベートした。これらの結果を図２ｂに示す。ｐＨ５．２において、Ｂｃｌ−ｘLを添加すると、ＶＤＡＣ媒介のスクロース取込みは阻害された。酸性ｐＨでＢｃｌ−ｘLが機能したということは、酸性条件下でのみ合成脂質膜上でイオンチャネルとしてｒＢｃｌ−ｘLが働くという文献（Science 277, 370-372, 1997. Nature385, 353-357, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5113-5118, 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11357-11362, 1997）の結果と一致していた。次に、Ｂｃｌ−ｘL及びＶＤＡＣをリポソームに同時に挿入した場合について検討した。
【００３８】
（ＶＤＡＣ及び組換えＢｃｌ−ｘLを含むリポソーム内における中性ｐＨでのＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害）
精製されたＶＤＡＣと、組換えＢｃｌ−ｘL又は模擬タンパク質の両方を同時にリポソーム内に導入したＶＤＡＣ／Ｂｃｌ−ｘLリポソーム及びＶＤＡＣ／模擬タンパク質リポソームを、14Ｃスクロース（１μＣｉ）と共にｐＨ７．３で３分間インキュベートし、14Ｃスクロース吸収を測定した。結果を図２ｃに示す。図２ｃからもわかるように、ｐＨが７．３でもＢｃｌ−ｘLは14Ｃスクロースの取込みを抑制する機能を有することから、酸性環境においてはリポソーム内へのＢｃｌ−ｘL自体の取込みが促進されたことが示唆された。また、ｐＨ５．０以下でＶＤＡＣはクローズすることが報告されているが、本実験におけるＶＤＡＣ−リポソームも、ｐＨ５．２〜７．３までの間の挙動に関して何ら顕著な違いを示さなかった。
【００３９】
（種々のＢｃｌ−ｘL投与量におけるＶＤＡＣ活性の阻害作用及びＢｃｌ−ｘL変異体によるＶＤＡＣ活性の阻害作用）
次に、０、１０、２０及び５０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘLとそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢｃｌ−ｘL変異体ｍｔ−１（Ｆ１３１Ｖ、Ｄ１３３Ａ）及びｍｔ−７（１３５〜１３７がＡＩＬからＶＮＷ）と共に14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ｐＨ５．２で３分間ＶＤＡＣ−リポソームとインキュベートした後に、リポソーム内の14Ｃスクロースを計測した。結果を図２ｄに示す。図２ｄより、組換えＢｃｌ−ｘLの量が増えるに従ってＶＤＡＣ活性の阻害が大きくなっていることがわかる。また、２種の組換えＢｃｌ−ｘL変異体のうち、ｍｔ−１が部分的に抗アポトーシス活性を有すること、ｍｔ−７が抗アポトーシス活性を全く有さないことが文献（Nature 379, 554-556, 1996）に示されているが、ＶＤＡＣ媒介のスクロース吸収に関して、これら変異体は、それぞれ、ｍｔ−１が部分的に阻害作用を示し、ｍｔ−７が全く阻害作用を示さなかったことから、これら２つの活性には相関関係があることがわかった。
【００４０】
（組換えＶＤＡＣを組み込んだリポソーム内のＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害）
精製された組換えＶＤＡＣを、リポソームに組み込み、次に、14Ｃスクロース（１μＣｉ）及び組換えＢｃｌ−ｘLの（２０μｇ／ｍｌ）と共にｐＨ５．２で３分間インキュベートし、14Ｃスクロース吸収を測定した。結果を図２ｅに示す。組換えＶＤＡＣを用いてＶＤＡＣ−リポソームが作られた場合、Ｂｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害もまた観察されたことから、ＶＤＡＣはＢｃｌ−ｘLの直接のターゲットであることが確認された。
【００４１】
［ｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害とｒＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進］
次に、ＢａｘがＶＤＡＣ活性に影響を与えるかどうかについて検討した。
（ＢａｘによるＶＤＡＣ−リポソーム内への14Ｃスクロース取込みの促進）
14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ＶＤＡＣ−リポソームをそれぞれ２０μｇ／ｍｌの組換えＢａｘ（○−○）又は模擬タンパク質（●−●）とともにｐＨ５．２で所定の時間インキュベートした。同様に、ＶＤＡＣ−リポソームをプレーンリポソームに変えて、組換えＢａｘ（□−□）又は模擬タンパク質（■−■）と共にインキュベートし、分子量３０，０００制限フィルターを用いた遠心分離による濾過した後、リポソームを回収して２％ＳＤＳに溶解した後、リポソーム内の14Ｃスクロースの放射能を計測した。結果を図３ａに示す。図３ａより、ｒＢａｘによりＶＤＡＣ媒介のスクロース取込みは増大するが、Ｂａｘ自体の取込みによるプレインリポソームにおけるスクロースの取込みはなかったことがわかる。このことから、ＶＤＡＣ−リポソームにおけるｒＢａｘ誘導のスクロース取込みの増大は、Ｂａｘイオンチャネルによっては媒介されず、ＶＤＡＣにおけるＢａｘの何等かの作用を介して媒介されたことを示している。
【００４２】
（組換えＶＤＡＣが組み込まれたリポソーム内におけるＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進）
精製された組換えＶＤＡＣをリポソームに組み込み、組換えＢａｘ（２０μｇ／ｍｌ）又は模擬タンパク質と共に14Ｃスクロース（１μＣｉ）を用いて、ｐＨ５．２でインキュベートし、14Ｃスクロース吸収を３分間測定した。結果を図３ｂに示す。図３ｂからもわかるように、組換えＶＤＡＣを用いてＶＤＡＣ−リポソームを調製した場合にも、同様の結果が観察された。
【００４３】
（ｒＢａｘ及びｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣリポソーム内へのスクロースインポートにに関する拮抗作用）
図３ｃに示される割合のｒＢａｘ及びｒＢｃｌ−ｘLと共に、14Ｃスクロース（１μＣｉ）、ＶＤＡＣ−リポソ−ムを用いて、ｐＨ５．２でインキュベートし、14Ｃスクロース吸収を３分間測定した。結果を図３ｃに示す。図３ｃに示されるように、ｒＢａｘとＢｃｌ−ｘLとは、ＶＤＡＣ活性において拮抗作用を示した。
【００４４】
（ＢａｘとＶＤＡＣとの直接の相互作用）
ｒＢａｘ及びＶＤＡＣを共にリポソームに取り込ませた場合、ｐＨ７．３でＢａｘはアポトーシス促進作用を示し、また、ｒＢａｘの代わりにアポトーシス促進作用を有するＢａｋのＣ末端２１アミノ酸残基を欠損させた変異体を用いた場合にも、同様の結果が得られた。抗ＶＤＡＣ抗体を用いて、ウェスタンブロット法により免疫複合体を分析したところ、ラット肝臓及び大腸菌から調製されたＶＤＡＣは、検出可能なレベルのＡＮＴを含んでいないことから、さらに２種のＡＮＴリガンドであるアトラクチル酸及びボンクレキン酸によって、ＶＤＡＣ−リポソームによるスクロース取込みは影響を受けなかった。このことから、ＶＤＡＣ調製物中にＡＮＴのコンタミがなかったことを結論できる。
【００４５】
［Ｂａｘ及びＢａｋによるＶＤＡＣを通過するシトクロムｃの誘導］
本発明者らは、既に、ＰＴポア（Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）を介し、単離されたミトコンドリアからのシトクロムｃのリリースをＢａｘ及びＢａｋが誘導すること（Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 4997-5002, 1998. J. Cell Biol. 143, 217-224, 1998. Proc. Natl. acad. Sci. USA 95, 14681-14686, 1998）を報告している。そして、上記のように、Ｂａｘ及びＢａｋがＶＤＡＣ活性を直接増大することが明らかになったことから、Ｂａｘ及びＢａｋ存在下でＶＤＡＣを通じてシトクロムｃがリリースされるかどうかについて検討した。
【００４６】
（シトクロムｃのＦＩＴＣラベル）
顕微鏡を使ってシトクロムｃの移動を測定するため、その分子質量に大幅な変更を加えないようにＦＩＴＣラベルのシトクロムｃを調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。蛍光によってＦＩＴＣを、抗シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によってシトクロムｃをそれぞれ検出した。図４ａ中、レーン１はＦＩＴＣ−シトクロムｃ（２５ｐｇ）、レーン２はシトクロムｃ（２５ｐｇ）をそれぞれ示す。
【００４７】
（Ｂａｘ誘導によるＶＤＡＣ−リポソームへのＦＩＴＣ−シトクロムｃの取込み）
前述したように、５０μＭのＦＩＴＣ−シトクロムｃ及び５０ｍＭのスクロースと、さらにｒＢａｘ（５２μｇ／ｍｌ）を用いた場合、ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘL（ともに５２μｇ／ｍｌ）を用いた場合、又はどちらも用いない場合でｐＨ５．２で５分間、ＶＤＡＣ−リポソーム（図４ｂ、４ｃ）及びプレーンリポソーム（図４ｃ）をインキュベートして、共焦点蛍光顕微鏡下で観察した。ＶＤＡＣ−リポソームの典型的な写真（４，８００倍）を図４ｂに示す。リポソ−ム内のシトクロムｃの蓄積に基づいてリポソームを分類し、頻度（％）及び典型的な写真を図４ｃに示す。写真はいずれも２μｍ×２μｍである。
【００４８】
図４ｂや図４ｃに示されているように、スクロース存在下で、ＦＩＴＣラベルのシトクロムｃを用いてＶＤＡＣ−リポソームをインキュベートして、共焦点蛍光顕微鏡下でラベルされたシトクロムｃを検出したところ、ｒＢａｘ非存在下で、ＶＤＡＣ−リポソームと同様に、プレーンリポソーム表面にシトクロムｃが蓄積した（図４ｂ、４ｃ）。対照的に、ｒＢａｘ（図４ｂ、４ｃ）存在下で、ＶＤＡＣ−リポソーム内側にシトクロムｃが蓄積したことから、ＢａｘがシトクロムｃにＶＤＡＣ通過をさせることがわかった。ｒＢａｘとｒＢｃｌ−ｘLの共存下では、シトクロムｃのＢａｘ媒介による移動が阻害された（図４ｂ、４ｃ）。また、ｒＢａｘに代えてＢａｋを用いたところ同様な結果が得られた。
【００４９】
（ＶＤＡＣ−リポソームからのＢａｋ誘導シトクロムｃリリース）
上記のように、８０ｍＭのスクロース及び１００μＭのシトクロムｃを含むＶＤＡＣ−リポソーム（左パネル）及びプレーンリポソーム（右パネル）を、ｒＢａｋ（２０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、スクロースフリー緩衝液中で、ｐＨ５．２で５分間インキュベートした。結果を図４ｄに示す。図４ｄには、最初に取り込まれたシトクロムｃの全体量が１００％として示されている。また、シトクロムｃリリースは、分光光度計により測定した。
【００５０】
図４ｄからわかるように、ＶＤＡＣ−リポソーム内にシトクロムｃとスクロースとを取り込ませて、次に、スクロースフリー緩衝剤を用いてＶＤＡＣ−リポソームをインキュベートすると、ｒＢａｋ存在下においてはシトクロムｃは大量にリリースしたが、ｒＢａｘ存在下でプレーンリポソームを用いた場合には、このようなシトクロムｃリリースは認められなかった。また、スクロースフリー緩衝剤でのインキュベーションの後、ＶＤＡＣ−リポソームとプレーンリポソームの両方から、少量のシトクロムｃリリースがあったのは、リポソーム表面に、非特異的に結合したシトクロムｃが遊離したためと考えられる。
【００５１】
スクロース非存在下でもまた、ＢａｋによりシトクロムｃがＶＤＡＣを透過することが観察された。これらの実験の間、フローサイトメトリーによって測定されたように、リポソームの数は変わらず、ＧＳＴ−グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むＶＤＡＣ−リポソームに対してｒＢａｋを添加した場合、ＧＳＴ−ＧＦＰ融合タンパク質（５０ｋＤ）はリリースされなかったことから、リポソームの破裂が生じていないことがわかる。また、ｒＢａｋに代えてｒＢａｘを用いた場合も、同様にシトクロムｃにＶＤＡＣ透過を行わせることがわかった。
【００５２】
［酵母ミトコンドリア内におけるＢａｋ誘導ΔΨロス及びシトクロムｃリリースに対するＶＤＡＣの要求］
チャネル活性を媒介するために、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質がＶＤＡＣを直接のターゲットとすることが明らかになったことから、次に、ＶＤＡＣがアポトーシスに関連するミトコンドリアのΔΨロス及びシトクロムｃリリースの調節に関わるＢｃｌ−２ファミリータンパク質のターゲットなのかどうかについて検討した。
【００５３】
（ＶＤＡＣ欠質ミトコンドリアのｒＢａｋ誘導ΔΨロスに対する無能力）
哺乳類由来のＶＤＡＣ欠損細胞が入手できないこと、及びＢｃｌ−２ファミリータンパク質は酵母細胞内で機能することが明らかになっている（FEBS lett. 380, 169-175, 1996. Molecular Cell 1, 327-336, 1998）ことから、ＶＤＡＣ１を欠失したΔＶＤＡＣ（Science 247, 1233-1236, 1990）を用いて調べた。ｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）（図５ａ）、模擬タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）（図５ｂ）、及びｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）とｒＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）（図５ｃ）を用いて、野生型酵母（ｗｉｌｄ）、ΔＶＤＡＣ及びヒトＶＤＡＣを発現するΔＶＤＡＣ酵母（ｈＶＤＡＣ）からそれぞれ単離されたミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）をＲｈ１２３と共にインキュベートして、ΔΨを測定した。結果を図５ａ〜ｃに示す。
【００５４】
（Ｂａｋ誘導シトクロムｃリリースを示さないＶＤＡＣ１欠損ミトコンドリア）ｒＢｃｌ−ｘL（２０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、ｒＢａｋ（５０μｇ／ｍｌ）又は模擬タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）を用いて、２０分間、野生型酵母（ｗｉｌｄ）、ΔＶＤＡＣ及びｈＶＤＡＣを発現するΔＶＤＡＣ酵母（ｈＶＤＡＣ）から単離されたミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートした。サンプルを遠心分離にかけて、上澄みの一部（２０μｌ）を、抗酵母シトクロムｃ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。結果を図５ｄに示す。図５ｄ中「トータル」は、等量のミトコンドリアを表している。
【００５５】
図５ａ及び図５ｄからわかるように、哺乳類由来のミトコンドリアと同様に、野生型酵母から単離したミトコンドリアも、ｒＢａｋを添加した後、ΔΨロス及びシトクロムｃリリースを示したが、ΔＶＤＡＣ酵母から単離したミトコンドリアにおいては、ｒＢａｘによるΔΨロス及びシトクロムｃリリースの誘導は認められなかった。しかし、ヒトｖｄａｃ１遺伝子（ｈＶＤＡＣ）をトランスフェクトしたΔＶＤＡＣ酵母からのミトコンドリアにおいては、ｒＢａｋがΔΨロス及びシトクロムｃリリースを誘導したことから、ΔＶＤＡＣ酵母からのミトコンドリアがｒＢａｋに対して反応しなかったことは機能するＶＤＡＣが存在しなかったことによることがわかった。
【００５６】
図５ｃ及び図５ｄからわかるように、酵母ミトコンドリア内で、Ｂａｋ媒介ΔΨロス及びシトクロムｃリリースは、Ｂｃｌ−ｘLによって阻害された。本研究において用いられたミトコンドリアは全て、同じレベルのＡＴＰを有していたので、使用したミトコンドリアの質的な差による影響の可能性は除外された。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質が、ＶＤＡＣをターゲットして、アポトーシスに関連するミトコンドリアのΔΨロス及びシトクロムｃリリースを調節することはこの結果から明らかである。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法により、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用に起因する各種疾患における医薬や診断薬としての用途が期待できるアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質を提供することができる。また、本発明のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質は、アポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用に起因する各種疾患における医薬や診断薬としての用途が期待できる。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｃｌ−ｘLとＶＤＡＣとの相互作用を示す図である。
【図２】ＶＤＡＣ−リポソーム系におけるＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣの活性阻害を示す図である。
【図３】ｒＢａｘによるＶＤＡＣ活性の促進とｒＢｃｌ−ｘLによるＶＤＡＣ活性の阻害を示す図である。
【図４】Ｂａｘ及びＢａｋによるシトクロムｃのＶＤＡＣ通過の誘導を示す図である。
【図５】酵母ミトコンドリア内におけるＢａｋ誘導ΔΨロス及びシトクロムｃリリースに対するＶＤＡＣの要求を示す図である。
Claims (17)
- ＶＤＡＣがリポソームの脂質二重層に埋め込まれた構造を有するＶＤＡＣ−リポソームと、ＶＤＡＣを通過することができる指標物質と、被検物質とをインキュベーションし、インキュベーション前後におけるＶＤＡＣ−リポソーム内外の指標物質の濃度変化を検出することにより、被検物質のアポトーシス抑制作用又はアポトーシス促進作用の有無を判定することを特徴とするアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- インキュベーションが、指標物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- インキュベーションが、被検物質がＶＤＡＣ−リポソーム内に存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- インキュベーションが、被検物質と共にアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質が存在する状態で行われることを特徴とする請求項１又は２記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- ＶＤＡＣ−リポソームが、組換えヒトＶＤＡＣを用いて調製されたＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- ＶＤＡＣ−リポソームが、小さなユニラメラ小胞にＶＤＡＣを再構成したＶＤＡＣ−リポソームであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- 指標物質が、標識化合物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- 標識化合物が、蛍光標識シトクロムｃ及び／又は同位体標識スクロースであることを特徴とする請求項７記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- 被検物質が、タンパク質又はポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち７番目から３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち４番目から２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち５５番目から７４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又ポリペプチドであることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号１に示される塩基配列のうち、３２番目から７５１番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号３に示される塩基配列のうち、１３５番目から８３６番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
- タンパク質又はポリペプチドが、配列番号５に示される塩基配列のうち、１６３番目から２２２番目までの塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含むＤＮＡをプローブとして用いることにより得られるタンパク質又はポリペプチドからなることを特徴とする請求項９記載のアポトーシス抑制物質又はアポトーシス促進物質のスクリーニング方法。
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