JP3899360B2 - Dna amplifier - Google Patents

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JP3899360B2 JP2005365222A JP2005365222A JP3899360B2 JP 3899360 B2 JP3899360 B2 JP 3899360B2 JP 2005365222 A JP2005365222 A JP 2005365222A JP 2005365222 A JP2005365222 A JP 2005365222A JP 3899360 B2 JP3899360 B2 JP 3899360B2
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悦夫 篠原
聖二 近藤
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オリンパス株式会社
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この発明は、DNAの増幅反応を行なって微量のDNAを増幅するための装置に関する。 This invention relates to an apparatus for amplifying trace amounts of DNA by performing an amplification reaction of DNA.

近年、微量のDNAを増幅する手段として、ポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCRと略記する)が盛んに用いられている。 Recently, as a means for amplifying the trace amount of DNA, polymerase chain reaction (hereinafter, abbreviated as PCR) is used extensively. この方法は、例えば特許文献1(特開平 6-292579 号公報)に開示されるように、まず、目的とする核酸を含有する検体に、目的とするDNAの各々の鎖の両端部の塩基配列を含む2種類のプライマー、耐熱性DNA合成酵素および4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)を加える。 This method, as disclosed in Patent Document 1 (JP-A-6-292579), firstly, the specimen containing the nucleic acid of interest, the nucleotide sequence of both ends of each strand of the target DNA 2 kinds of primers having thermostable DNA synthetase and four deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) are added. 次に、系の温度を制御することのみにより、DNAを解離させる(変性)工程、解離により生成した一本鎖DNAとプライマーとを結合させる(アニーリング)工程、およびプライマーが結合した一本鎖DNAを鋳型としてDNA合成酵素により相補鎖を合成する(伸長)工程の各工程を行ない、これを1回以上繰り返す。 Then, only by controlling the temperature of the system, to dissociate the DNA (denaturation) step, to bond the single-stranded DNA and primers produced by dissociation (annealing) step, and single-stranded DNA primer is bound the synthesized complementary strand by DNA polymerase as a template (extension) performs each process step, This is repeated one or more times.

このようにPCRは微量のDNAを効率よく増幅することが可能であるが、このPCRに加えて、さらに前処理および後処理を含めて自動化しようとする試みがなされている。 Thus the PCR it is possible to efficiently amplify the DNA traces, in addition to the PCR, an attempt has been made to try to automate including further pre-processing and post-processing. 例えば、特許文献2(特開平 6-327476 号公報)に開示される装置では、まず、全血を遠心分離し、フェノールおよびクロロホルム溶液で抽出することにより全血中の核酸成分を精製する(前処理段階)。 For example, the apparatus disclosed in Patent Document 2 (JP-A-6-327476), first, the whole blood is centrifuged and purified nucleic acid component of the whole blood by extraction with phenol and chloroform solution (before processing stage). 次いで、精製した核酸成分をバッファーに溶解し、上述の2種類のプライマー、耐熱性DNA合成酵素および4種類のデオキシリボムクレオシド三リン酸を加え、熱サイクルを実施することにより目的の核酸を増幅する(PCR段階)。 Then, the purified nucleic acid component dissolved in the buffer, 2 kinds of primers described above, a heat-resistant DNA polymerase and four kinds of deoxynucleoside Li bomb Cleo Sid triphosphate added, amplifying the nucleic acid of interest by carrying out the thermal cycle to (PCR stage). 最後に、増幅した核酸が含まれる反応溶液をゲル電気泳動で処理し、プライマー等の不純物や副生物等を除去して目的の核酸を得る(後処理段階)。 Finally, the reaction solution containing the amplified nucleic acid was treated with gel electrophoresis to obtain a nucleic acid of interest by removing impurities and by-products such as primer and the like (post-treatment step).

また、PCRを行なうための反応容器自体についてもいくつかの試みがなされている。 Further, the reaction vessel itself for carrying out the PCR also Several attempts have been made. 例えば、特許文献3(特開平 7-75544号公報)に開示される装置は、2つの恒温槽を経由する毛管を設け、検体を含む混合液を単にこの毛管内に流すことにより、DNA合成反応に必要な熱サイクルを実現している。 For example, the device disclosed in Patent Document 3 (JP-A-7-75544), the capillary passing through the two constant-temperature bath is provided, the mixture containing the analyte by simply flowing in the capillary, DNA synthesis reaction It is realized thermal cycles required to. この方法では、増幅反応を毛管内で行なうため、液流の外側と内側との温度勾配が小さくなり、系内の温度をより迅速に均一化することができるという利点がある。 In this way, for performing the amplification reaction in the capillary, small temperature gradient between the outside and inside of the liquid flow, there is an advantage that it is possible to more quickly equalize the temperature in the system.
特開平 6-292579 号公報 JP-6-292579 discloses 特開平 6-327476 号公報 JP-6-327476 discloses 特開平 7-75544号公報 JP 7-75544 discloses

上記従来のDNA増幅装置においては、反応容器を恒温槽や金属ブロックで取り巻き、この反応容器自体を加熱および冷却することによりDNA増幅反応に必要な熱サイクルを施している。 Above in the prior art DNA amplification device, surrounds the reaction vessel at a constant temperature bath or a metal block, it is subjected to thermal cycles required for DNA amplification reaction by heating and cooling the reaction vessel itself. したがって、これらの装置では反応溶液の温度を直接制御するのではなく、反応容器を介して間接的に制御している。 Thus, instead of controlling the temperature of the reaction solution directly by these devices, it is indirectly controlled through the reaction vessel. 加えて、これらの装置では、反応溶液が微量であることもあって反応溶液の温度を直接測定することはできない。 In addition, in these devices, the reaction solution is not possible to measure the temperature of the reaction solution also directly there by it is small. このため、従来のDNA増幅装置は、反応溶液の温度を精密に制御することができず、信頼性に欠ける。 Therefore, the conventional DNA amplification device, it is impossible to precisely control the temperature of the reaction solution, unreliable. 特開平 7-75544号公報に開示される装置では、毛管内で反応を行なうことにより、反応溶液中で温度勾配が形成されることを防いでいる。 In the apparatus disclosed in JP-A-7-75544, by carrying out the reaction in the capillary it is prevented that the temperature gradient is formed in the reaction solution. しかしながら、この装置でも反応溶液の温度を直接測定することはできず、やはり温度制御が不正確になる。 However, it is not possible to measure the temperature of the reaction solution directly in the device, also the temperature control becomes inaccurate.

また、上記特開平 6-327476 号公報に開示される装置は、前処理および後処理を含めて全ての工程を自動的に行なう全自動化を実現してはいるが、反応容器の移動や分注操作等は全て機械的に行なっている。 The device disclosed in JP-A Hei 6-327476, the pre-treatment and has is realized automatically perform fully automated all processes including post-processing, movement and dispensing of the reaction vessel all the operations and the like are carried out mechanically. このため、装置が大型化し、コストが非常に高くなる。 Therefore, device becomes large, the cost is very high. 同様に、特開平 7-75544号公報に開示される装置でも反応溶液を循環させるために機械式ポンプを用いており、このため装置が大型化し、コストが高くなる欠点を有する。 Similarly, the apparatus disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 7-75544 employs a mechanical pump for circulating the reaction solution has the disadvantage that the order device becomes large, the cost becomes high.

したがって、この発明は、反応溶液の温度を精密に制御し、DNA増幅反応を効率よく行なうことが可能なDNA増幅装置を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention is the temperature of the reaction solution was precisely controlled, and to provide a DNA amplification apparatus capable of performing efficient DNA amplification reaction.

また、この発明は、機械的な作動部分を減少し、それにより装置全体を小型化し、かつコストを低くすることが可能なDNA増幅装置を提供することを目的とする。 Further, the present invention is to reduce the mechanical working portion, thereby downsizing the entire apparatus, and an object of the invention to provide a DNA amplification device capable of low cost.

この発明によると、無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、この反応セルに連通する2つの流路と、この流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた2つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備する第1のDNA増幅装置が提供される。 According to the present invention, the planar shape of the reaction cell formed inorganic or organic substrate, two and a flow path communicating with the reaction cell, two provided across said reaction cell in each of the channel a valve, a first DNA amplification apparatus comprising a heating means provided in either the bottom surface or back surface of the surface reaction cells are formed of the substrate of at least the reaction cell is provided.

また、この発明の別の面によると、 無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する2つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、DNA増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、DNA増幅に必要なプライマー、DNA合成酵素および4種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留 Further, according to another aspect of the invention, a reaction portion formed on the inorganic or organic substrate, two and a flow path communicating with the reaction part, reaction part of the bottom surface or the substrate of at least the reaction section is formed provided on one the of the rear face of the front face is, the sample to separate controllable heating means to a temperature required for DNA amplification, communicating with the flow path, the nucleic acid from the sample before nucleic acid isolation, such as whole blood or serum a separation unit, and the nucleic acid isolated, primers needed for DNA amplification, means for forming in said reaction cell a reaction solution containing a DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleic triphosphates, and the separation portion of the reaction unit communicates through a branch path between a discarding unit for discarding the component other than nucleic acids separated by the separation portion communicates with the flow path, a reaction solution was the amplification reaction in the reaction portion, amplified purposes of the residual nucleic acid る成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、該反応溶液分離部が、ゲル状化合物が充填された流路からなることを特徴とする DNA増幅装置が提供される。 That is separated into a component comprising a reaction solution separation part, the reaction solution separation part, DNA amplification device gel compound is characterized in that it consists of a flow path that is filled is provided.

また、この発明のさらに別の面によると、 無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する2つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、DNA増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、DNA増幅に必要なプライマー、DNA合成酵素および4種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸 Further, according to still another aspect of the invention, a reaction portion formed on the inorganic or organic substrate, two and a flow path communicating with the reaction part, reaction part of the bottom surface or the substrate of at least the reaction section either provided on one of the back surface of the formed surface, controllable heating means to a temperature required for DNA amplification, communicating with the flow path, to separate the nucleic acids from the sample before nucleic acid isolation, such as whole blood or serum a sample separation unit, and the nucleic acid isolated, primers needed for DNA amplification, means for forming in said reaction cell a reaction solution containing a DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleic triphosphates, the reaction section and the separation section communicates through a branch path between the a discarding unit for discarding the components other than isolated nucleic acid in the separation portion communicates with the flow path, a reaction solution was the amplification reaction in the reaction portion, amplified purposes the nucleic acid of 残留する成分とに分離する反応溶液分離部を具備し、該反応溶液分離部が、150μm以下の流路径を有する流路からなることを特徴とするDNA増幅装置が提供される。 Comprising a reaction solution separation part for separating a component remaining, the reaction solution separation part, DNA amplification device is provided which is characterized in that it consists flow path having the flow path diameter 150 [mu] m.

本発明によれば、反応セルをプレーナ状とすることにより反応溶液をより迅速に加熱および冷却することが可能であり、DNA増幅反応に必要な熱サイクルで問題となる、反応溶液中に生じる温度勾配を小さくすることができる。 According to the present invention, it is possible to more rapidly heat and cool the reaction solution by a reaction cell with a planar shape, a problem in thermal cycling required for DNA amplification reaction, the temperature generated in the reaction solution it is possible to reduce the gradient.

以下、この発明によるDNA増幅装置を図面を参照して説明する。 Hereinafter will be described a DNA amplification apparatus according to the present invention with reference to the drawings.

この発明による第1のDNA増幅装置の一具体例の平面図を図1に、また図1に示すDNA増幅装置のA−A線断面図を図2にそれぞれ模式的に示す。 The plan view of one embodiment of a first DNA amplification device according to the present invention in FIG. 1, also in FIGS. 2 schematically shows the A-A line cross-sectional view of a DNA amplification apparatus shown in FIG. この装置では、無機もしくは有機基板 101の上面に反応セル 102並びに流路 103および 104が形成され、さらにその上面に透明基板 105が接合されている。 In this apparatus, reaction cell 102 and channel 103 and 104 on the upper surface of the inorganic or organic substrate 101 is formed, and further bonding the transparent substrate 105 on its upper surface. また、流路 103には弁 105が、流路 104には弁 106がそれぞれ設けられ、さらに基板 101の反応セル 102が形成された面の裏面に接して発熱体 108が設けられている。 The valve 105 to the flow path 103, the valve 106 are respectively provided in the flow path 104, and heating element 108 is provided further contact with the back surface of the surface reaction cell 102 is formed of a substrate 101. 無機もしくは有機基板 101としては、例えば、シリコンウェハ基板、ガラス基板、アルミ、ステンレススティール等の無機基板、およびフッ素樹脂、エポキシ、ポリカーボネート等の有機基板が用いられる。 Examples of the inorganic or organic substrate 101, for example, a silicon wafer substrate, a glass substrate, an aluminum, an inorganic substrate such as stainless steel, and a fluorine resin, an epoxy, an organic substrate such as polycarbonate is used. 反応セル 102並びに流路 103および 104は基板 101の材質に応じて様々な方法で形成することができ、例えば、基板 101としてシリコンウェハ基板を用いる場合には、シリコンウェハ上にプラズマエッチング等によって所定の形状の溝を形成した後、ガラス基板等の透明基板を陽極接合すればよい。 The reaction cell 102 and the channel 103 and 104 may be formed in a variety of ways depending on the material of the substrate 101, for example, in the case of using a silicon wafer substrate as the substrate 101, predetermined by plasma etching or the like on a silicon wafer after forming a groove shape, a transparent substrate such as a glass substrate may be anodic bonding. 反応セル 102はプレーナ状に形成されている。 The reaction cell 102 is formed in a planar shape. この反応セルは、その大きさを含めて、必要とする容量に応じて種々の形状が選択可能である。 The reaction cell, including its size, can be selected various shapes depending on the capacity required. 例えば、容量を 3μlとする場合には、縦長 5mm、横長 3mmおよび深さ 200μmとすればよいが、反応溶液の温度をより精密に制御するためには深さは浅いほうが好ましい。 For example, in the case of a 3μl the capacity Vertical 5 mm, but may be a horizontally elongated 3mm and a depth 200 [mu] m, the depth in order to more precisely control the temperature of the reaction solution shallower preferred. 発熱体 108も、DNA増幅反応に必要な熱サイクルを遂行し得るものであれば特に限定されるものではなく、例えば、電熱ヒータ、ペルチエ素子、赤外線ランプ等を挙げることができる。 Heating element 108 is also not limited in particular as long as it can perform the thermal cycles required for DNA amplification reactions include, for example, electric heater, Peltier device, an infrared lamp or the like.

次に、この装置を用いたDNA増幅の手順について説明する。 Next, the procedure of DNA amplification using this device. まず、弁 106および 107を開放し、図示しない送出手段により、目的の核酸、2種類以上のプライマー、耐熱性DNA合成酵素および4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)を含有するバッファーを反応セル 102に導入した後、弁 106および 107を閉鎖する。 First, opening valve 106 and 107, by delivery means (not shown), the nucleic acid of interest, two or more primers, thermostable DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleoside three triphosphate (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) the after introduction of a buffer containing the reaction cell 102, closing valves 106 and 107. 次に、発熱体 108を作働させて反応セル 102中のバッファーに熱サイクルを加えて目的の核酸を増幅させる。 Next, by applying heat cycling to amplify the nucleic acid of interest in a buffer in the reaction cell 102 by the heating element 108 is agonizing. 具体的には、まず発熱体 108を発熱させてバッファー中の核酸が解離する温度(90〜94℃)にバッファーを加熱し、この温度を所定時間維持する。 Specifically, first, the heating element 108 to generate heat buffer heated to a temperature (90 to 94 ° C.) the nucleic acid in the buffer is dissociated, the temperature is maintained for a predetermined time. 次に、発熱体 108の動作を停止させ、解離した核酸とプライマーとが結合する温度(約37℃)までバッファーを冷却する。 Next, the operation of the heating element 108 is stopped to cool the buffer to dissociate nucleic acid and primer are bonded to a temperature (about 37 ° C.). 解離した核酸とプライマーとが結合した後、再び発熱体 108を作働させ、耐熱性DNA合成酵素の活性が最も高まる温度(50〜75℃)までバッファーを加熱して所定の時間維持する。 After the dissociated nucleic acid and primer are bound, again heating element 108 is agonizing the activity of thermostable DNA polymerase maintains most increased temperature (50 to 75 ° C.) a predetermined time to heat the buffer to. これにより、プライマーが伸長し、核酸が増幅される。 Thus, the primer is extended, the nucleic acid is amplified. プライマーの伸長が終了した後、再度発熱体 108を作働させて核酸が解離する温度までバッファーを加熱し、生成した二本鎖核酸を解離させる。 After primer extension is complete, heat the buffer to a temperature that dissociates nucleic acid by agonizing a heating element 108 again, dissociating the resulting double-stranded nucleic acid. 以下、このサイクルを所望の回数繰り返せばよい。 Hereinafter, the cycle may be repeated a desired number of times. 核酸の増幅反応が終了した後、再び弁 106および 107を開放し、増幅した核酸を流路 104を介して反応セル 102から回収する。 After the nucleic acid amplification reaction has been completed, again opening the valve 106 and 107, to recover the amplified nucleic acid from the reaction cell 102 through the flow path 104. この際、続けて増幅反応を行なう場合には、回収と同時に新たなバッファーを流路 103を介して反応セル 102内に導入し、同様の熱サイクルを開始する。 In this case, when performing an amplification reaction continuously, at the same time a new buffer and recovered via flow path 103 is introduced into the reaction cell 102, it starts the same thermal cycle.

この装置では、上述のように反応セル 102の形状がプレーナー状である。 In this apparatus, the shape of the reaction cell 102 as described above are planar shape. したがって、発熱体 108から生じた熱を反応セル中のバッファーに効率よく伝えることができ、加熱および冷却の効率を上げることが可能となる。 Therefore, heat generated from the heating element 108 can be efficiently transmitted to the buffer in the reaction cell, it is possible to increase the efficiency of heating and cooling.

図1および図2に示す装置においては、発熱体 108は基板 101の裏面にのみ設けられているが、基板 101の裏面と基板 101の上面、すなわち反応セル 102の底面の両方に設けることもできる。 In the apparatus shown in FIGS. 1 and 2, but the heating element 108 is provided only on the back surface of the substrate 101, the upper surface of the back surface and the substrate 101 of the substrate 101, i.e. can be provided on both of the bottom surface of the reaction cell 102 . この場合には、反応セル 102内のバッファーの昇降温速度を高め、それによりバッファー中の温度勾配を小さくして、DNA増幅反応の精度を高めることができる。 In this case, increase the heating and cooling rate of the buffer in the reaction cell 102, thereby to reduce the temperature gradient in the buffer, it is possible to improve the accuracy of DNA amplification reactions. さらに、上記説明においては、発熱体 108の動作を停止させ、自然に放熱させることによりバッファーの冷却を行なっているが、発熱体 108としてペルチエ素子のような加熱および冷却の両動作が可能なものを用いることにより、冷却時間の短縮と、より精密な温度制御を達成することができる。 Further, in the above description, the operation of the heating element 108 is stopped, but performs a cooling of the buffer by radiating natural, one capable of both operation of such heating and cooling as Peltier element as a heating element 108 by using, it is possible to achieve shortening and cooling time, a more precise temperature control.

また、この発明による第1のDNA増幅装置においては、図3および4に示すように、反応セル 102の底面に1つもしくはそれ以上の温度検出手段 301および 302を設けることができる。 In the first DNA amplification apparatus according to the invention can, as shown in FIGS. 3 and 4, providing a temperature detecting means 301 and 302 bottom one or more in the reaction cell 102. ここで、図3はこの発明による第1のDNA増幅装置の別の具体例を模式的に示す平面図であり、図4は図3に示される装置のB−B線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 3 is a plan view showing another specific example of the first DNA amplification apparatus according to the present invention schematically, FIG. 4 is schematic a cross section taken along the line B-B of the device shown in FIG. 3 is a drawing illustrating manner. なお、図3および4において、図1および2と同じ部材には同一の符号が付されており、以下の図面においても同一の符号は同一の部材を表わすことを原則とする。 Incidentally, in FIG. 3 and 4, the same members as in FIG. 1 and 2 are denoted by the same reference numerals, the same numerals also in the following drawings in principle to represent the same members. 温度検出手段 301および 302としては、例えば、熱電対、ダイオード等を用いることができる。 The temperature detecting means 301 and 302, for example, can be used thermocouples, diodes and the like.

このように反応セル 102の底面に温度検出手段 301および 302を設けることにより、反応セル中の反応溶液の温度を直接測定することが可能となり、DNA増幅反応に必要な熱サイクル時の温度をより精密に制御することができる。 By providing the temperature detecting means 301 and 302 on the bottom surface of the thus reaction cell 102, it is possible to measure the temperature of the reaction solution in the reaction cell directly, more the temperature during thermal cycles required for DNA amplification reaction it can be precisely controlled. この精密な温度制御は、特に、上記熱サイクルにおける核酸の解離工程において重要な意味を持つ。 The precise temperature control, in particular, has important implications in the dissociation step of the nucleic acid in the heat cycle. すなわち、上述のように核酸を解離させる工程においては反応セル 102中の反応溶液を高温(90〜94℃)に加熱する。 That is, in the step of dissociating the nucleic acid as described above to heat the reaction solution in the reaction cell 102 at a high temperature (90 to 94 ° C.). このような高温では、たとえ耐熱性酵素であっても徐々に活性が失われ、94℃を越える温度では酵素が変性して活性が完全に失われてしまうため、過加熱には十分注意する必要がある。 In such a high temperature, though gradually activity even thermostable enzyme is lost, because the activity denatured enzyme at temperatures above 94 ° C. would be completely lost, it must be very careful to overheating there is. 図3および4に示す装置では、温度検出手段 301および 302によって反応溶液の温度を直接測定することができるので、この測定結果を発熱体 108にフィードバックすることにより、核酸解離の効率を落とすことなく過加熱を防ぐことが可能となる。 In the apparatus shown in FIG. 3 and 4, it is possible to measure the temperature of the reaction solution directly by temperature detector 301 and 302, by feeding back the measurement results to the heating element 108, without reducing the efficiency of nucleic acid dissociation it is possible to prevent over heating.

さらに、この発明による第1のDNA増幅装置においては、図5および図6に示すように、反応セル 102の底面に1つもしくはそれ以上の突起 501を設けることができる。 Further, the first DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 5 and 6, it may be provided with one or more protrusions 501 on the bottom surface of the reaction cell 102. ここで、図5はこの発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図6は図5に示される装置のC−C線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 5 is a plan view schematically showing still another embodiment of the first DNA amplification apparatus according to the present invention, a cross section along line C-C of the device 6 is illustrated in FIG. 5 is a diagram schematically illustrating. この突起 501は、プレーナー状の反応セル 102を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはプレーナー状の反応セル 102を形成した後に予め作製した突起を接合してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。 The protrusion 501 may be formed at the same time its shape when forming the planar shape of the reaction cell 102, or it advance may be bonded to projections fabricated after forming the planar shape of the reaction cell 102, substrate it is preferably the same material as 101.

このように反応セル 102の底面に1つ以上の突起 501を設けることにより、反応セルの底面の表面積を増大させることができ、基板 101の裏面に設けられた発熱体 108から生じた熱を反応セル 102内の反応溶液に効率よく伝えることが可能となる。 By providing one or more protrusions 501 on the bottom surface of the thus reaction cell 102, it is possible to increase the surface area of ​​the bottom surface of the reaction cell, the heat generated from the heating element 108 provided on the back surface of the substrate 101 reaction it is possible to transmit efficiently to the reaction solution in the cell 102. また、発熱体 108が前述のような加熱および冷却の両動作が可能なものである場合には、反応溶液の冷却もより迅速に行なうことが可能となる。 Furthermore, the heating element 108 when those capable of heating and both operations of cooling, such as described above, it becomes possible to perform faster cooling of the reaction solution. したがって、図5および6に示される装置は、反応セル 102中の反応溶液の昇降温速度をより高めることができ、かつ反応溶液の温度勾配を小さくすることが可能である。 Accordingly, the apparatus shown in FIGS. 5 and 6, heating and cooling rate of the reaction solution in the reaction cell 102 can be increased, and it is possible to reduce the temperature gradient in the reaction solution. このため、この装置を用いることにより、DNA増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することが可能となる。 Therefore, by using this device, to shorten the time required for the DNA amplification reactions, it is possible to control the temperature of the thermal cycle more precisely.

同様の効果は、図7および8に示すように、反応セル 102の代わりに底面の断面形状が鋸刃状もしくは波状である反応セル 701を用いることによっても達成することができる。 Similar effects can also be achieved by using, as shown in FIGS. 7 and 8, the reaction cell 701 the bottom surface of the cross-sectional shape instead is blade-like or wavy saw of the reaction cell 102. ここで、図7はこの発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図8は図7に示される装置のD−D線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 7 is a plan view showing still another embodiment schematically the first DNA amplification apparatus according to the present invention, Figure 8 is a section along the line D-D of the device shown in FIG. 7 is a diagram schematically illustrating. 図7および8に示す装置においても、反応セル底面の表面積が増大し、基板 101の裏面に設けられた発熱体 108が発生する熱を、反応セル 701内の反応溶液に効率よく伝えることができる。 Also in the apparatus shown in FIGS. 7 and 8, the surface area of ​​the reaction cell bottom is increased, the heat the heating element 108 provided on the back surface of the substrate 101 is generated, can be transmitted efficiently to the reaction solution in the reaction cell 701 . したがって、図5および6に示される装置と同様に、DNA増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することが可能となる。 Therefore, as in the apparatus shown in Figure 5 and 6, to reduce the time required for DNA amplification reaction, it is possible to control the temperature of the thermal cycle more precisely. 反応セル 701の断面形状が鋸刃状もしくは波状の底面は、図5および6に示される装置と同様に、反応セル 701を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはまずプレーナー状の反応セルを形成した後に断面形状を鋸刃状もしくは波状に加工してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。 Sectional shape serrated or wavy bottom surface of the reaction cell 701, similar to the apparatus shown in Figure 5 and 6 may be formed simultaneously its shape when forming the reaction cell 701, or first planar form the cross-sectional shape after forming reaction cell may be processed to the blade-like or wavy saws, but are preferably the same material as the substrate 101.

さらにまた、この発明による第1のDNA増幅装置においては、図9および図10に示すように、反応セル 102の底面に1つもしくはそれ以上の突起 901を反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置することもできる。 Furthermore, in the first DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 9 and 10, one or more protrusions 901 on the bottom surface of the reaction cell 102 obliquely to the flow direction of the reaction solution It can also be arranged. ここで、図9はこの発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図10は図9に示される装置のE−E線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 9 is a plan view showing still another embodiment schematically the first DNA amplification apparatus according to the present invention, FIG 10 is a cross section taken along line E-E of the device shown in FIG. 9 is a diagram schematically illustrating. この突起 901は、図5および6に示される装置と同様に、プレーナー状の反応セル 102を形成する際に同時にその形状を形成してもよく、あるいはプレーナー状の反応セル 102を形成した後に予め作製した突起を接合してもよいが、基板 101と同一の材質であることが好ましい。 The projection 901, similar to the apparatus shown in Figure 5 and 6, previously after forming well, or the planar shape of the reaction cell 102 to form the shape simultaneously with the formation of the planar shape of the reaction cell 102 it may be joined to protrusions produced, but are preferably the same material as the substrate 101.

前述のように、DNA増幅反応は、核酸の解離、解離した核酸とプライマーとの結合および耐熱性DNA合成酵素によるプライマーの伸長の3段階で進行する。 As described above, DNA amplification reactions, dissociation of the nucleic acids proceeds in three stages of binding and heat-resistant DNA synthase by primer extension with dissociated nucleic acid primer. このうち、解離した核酸とプライマーとの結合は、解離した核酸同志が再び結合する反応と競合することになる。 Among the binding of the dissociated nucleic acid and primers dissociated nucleic comrades will be competing with the reaction of binding again. 一方、繰り返し行なわれる増幅反応によって、系内には核酸が徐々に増加し、プライマーは次第に減少してゆく。 On the other hand, the amplification reaction is repeated, the inside of the system nucleic gradually increases, primers gradually decreasing. このため、増幅を繰り返すうちに解離した核酸がプライマーと結合せずに核酸同志で結合することが多くなり、増幅反応の効率が減少する。 Therefore, nucleic acids dissociated after repeated amplification would be more likely to bind a nucleic acid comrades without binding the primer, the efficiency of the amplification reaction is reduced. したがって、効率の減少を最小限に抑えるために、増幅反応を開始する際には、すなわち反応溶液が反応セル 102内に導入される際には、反応溶液中で核酸とプライマーとを可能な限り均一に分散させておくことが好ましい。 Therefore, in order to minimize the reduction of efficiency, when starting the amplification reaction, i.e., when the reaction solution is introduced into the reaction cell 102 is only capable of a nucleic acid and a primer in the reaction solution it is preferable to uniformly dispersed. 図9および図10に示される装置おける反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置された突起 901は、この反応溶液中の核酸とプライマーとをより均一に分散させる機能を果たす。 9 and protrusions 901 disposed obliquely to the flow direction of the apparatus definitive reaction solution shown in Figure 10, functions to more uniformly disperse the nucleic acid and the primer of the reaction solution. すなわち、流路 103から反応セル 102に流入してきた反応溶液は、突起 901による抵抗を受けて乱流を生じ、それにより反応溶液が十分に撹拌される。 That is, the reaction solution flowing in from the channel 103 into the reaction cell 102, turbulence undergoing resistance due to the projections 901, thereby the reaction solution is stirred thoroughly. したがって、図9および図10に示される装置を用いることにより、解離した核酸とプライマーとの結合反応を、ひいてはDNA増幅反応を、効率よく行なうことが可能であり、反応の精度を向上させることもできる。 Thus, by using the apparatus shown in FIGS. 9 and 10, the coupling reaction with dissociated nucleic acid primer, and thus DNA amplification reaction, it is possible to perform efficiently, also to improve the accuracy of the reaction it can. また、弁107 を開放して反応セル102 から反応溶液を流出させる際にもやはり突起109 によって反応溶液が撹拌され、次の精製、分析工程をむらのない状態で行なうことができる。 Further, the stirred reaction solution by again projecting 109 even when caused to flow out the reaction solution from the reaction cell 102 by opening valve 107, subsequent purification can be carried out an analysis process in the absence of unevenness.

もちろん、突起 901は反応セル 102の底面の表面積を増大させることにも貢献する。 Of course, the projections 901 also contribute to increasing the surface area of ​​the bottom surface of the reaction cell 102. したがって、図9および10に示される装置は、図5ないし図8に示される装置と同様に、DNA増幅反応に要する時間を短縮し、熱サイクルの温度をより精密に制御することも可能となる。 Accordingly, the apparatus shown in FIGS. 9 and 10, similar to the apparatus shown in FIGS. 5 to 8, to shorten the time required for the DNA amplification reactions, it is possible to control the temperature of the thermal cycle more precisely .

次に、この発明による第2のDNA増幅装置の一具体例の平面図を図11に、また図11に示されるDNA増幅装置のF−F線断面図を図12にそれぞれ模式的に示す。 Next, FIG. 11 is a plan view of a specific example of the second DNA amplification apparatus according to the present invention, also in FIGS. 12 schematically shows a sectional view taken along line F-F of the DNA amplification apparatus shown in FIG. 11. この装置では、無機もしくは有機基板1101上に、2つの弁1104および1105が設けられた流路1102が形成され、その上面に透明基板1103が接合されている。 In this apparatus, on the inorganic or organic substrate 1101, the two valves 1104 and 1105 flow channel 1102 provided are formed, the transparent substrate 1103 is bonded to the upper surface. 弁1104と1105との間には、基板1101の裏面に接して3つの発熱体1106、1107および1108が設けられており、それぞれ発熱体の温度を個別に制御する発熱体制御装置1109、1110および1111に接続されている。 Between the valve 1104 and 1105, and three heating elements 1106, 1107 and 1108 are provided in contact with the back surface of the substrate 1101, the heat generating element control apparatus 1109, 1110 and individually controlling the temperature of the heating element, respectively It is connected to the 1111. また、これらの発熱体1106、1107および1108に対応して流路1102の底面には、それぞれ、反応溶液の温度を検出するための温度検出手段1112、1113および1114が設けられている。 Further, the bottom surface of the flow path 1102 in response to these heating elements 1106 and 1107 and 1108, respectively, the temperature detecting means 1112 and 1113 and 1114 for detecting the temperature of the reaction solution are provided. さらに、弁1104と発熱体1106の間に位置する流路1102の底面および弁1105と発熱体1108の間に位置する流路1102の底面には、それぞれ電極1115および1116が設けられ、いずれも、電極に電圧を印加することが可能であり、かつ印加した電圧を反転することが可能な電圧制御装置1117に接続されている。 Further, the bottom surface of the flow channel 1102 located between the bottom surface and the valve 1105 and the heating element 1108 of the channel 1102 located between the heating element 1106 and the valve 1104, the electrodes 1115 and 1116 are respectively provided, either, it is possible to apply a voltage to the electrodes, and are connected to the applied voltage to the voltage controller 1117 capable of reversing. 無機もしくは有機基板1101の材質、流路1102の形成方法、透明基板1103の材質、利用可能な発熱体、および利用可能な温度検出手段は全て、上記この発明による第1のDNA増幅装置に用いられるものと同様である。 Method for forming an inorganic or organic material of the substrate 1101, the channel 1102, the material of the transparent substrate 1103, used the heating element is available, and the temperature detecting means available to the first DNA amplification device according to all of the present invention is the same as the stuff.

この第2のDNA増幅装置を用いたDNA増幅反応の手順は以下の通りである。 Procedure of DNA amplification reaction using the second DNA amplification device is as follows. まず、弁1104および1105を開放し、目的の核酸、2種類以上のプライマー、耐熱性DNA合成酵素および4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)を含有するバッファーを流路1102に導入した後、弁1104および1105を閉鎖する。 First, the flow path a buffer opening valve 1104 and 1105, containing nucleic acid of interest, two or more primers, thermostable DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) after introduction to 1102, closing the valve 1104 and 1105. 次に、発熱体制御装置1109、1110および1111の制御の下で、それぞれ発熱体1106、1107および1108を作動させ、各々の発熱体に対応する位置の流路1102内のバッファーを所定の温度に加熱し、その温度を維持する。 Then, under the control of the heating element controller 1109, 1110 and 1111, to activate the heating element 1106 and 1107 and 1108, respectively, the buffer in the flow path 1102 at a position corresponding to each of the heating elements to a predetermined temperature heating and maintaining the temperature. この際、温度検出手段1112、1113および1114によって各々の近傍のバッファーの温度を測定し、その情報を各発熱体制御手段にフィードバックすることにより、バッファーの温度を所定の値に正確に維持することが可能となる。 At this time, the temperature of the buffer in the vicinity of each was measured by the temperature detecting means 1112, 1113 and 1114, by feeding back the information to the heating element control means to accurately maintain the temperature of the buffer to a predetermined value it is possible. また、各発熱体はその加熱温度を違えており、例えば、発熱体1106の加熱温度は核酸が解離する温度(90〜94℃)に、発熱体1107の加熱温度は耐熱性DNA合成酵素の活性が高まり、解離した核酸と結合したプライマーが耐熱性DNA合成酵素の作用によって伸長する温度(50〜75℃)に、さらに発熱体1108の加熱温度は解離した核酸にプライマーが結合する温度(約37℃)に設定すればよい。 Each heating element has Chigae the heating temperature, for example, the heating temperature is a temperature at which the nucleic acid is dissociated in the heating element 1106 (90 to 94 ° C.), the heating temperature of the heating element 1107 active thermostable DNA polymerase is increased, the temperature primers bound to dissociated nucleic acid to a temperature (50 to 75 ° C.) for extended by the action of the thermostable DNA polymerase, further heating the temperature of the heating element 1108 which bind primers to nucleic acids dissociated (about 37 ℃) may be set to. その後、電圧制御装置1117によって電極1115および1116に電圧を印加する。 Then, applying a voltage by a voltage controller 1117 to the electrodes 1115 and 1116. バッファー中に含まれる核酸、プライマー、DNA合成酵素およびデオキシリボヌクオシド三リン酸はそれぞれ等電点が異なり、バッファーのpHによって正もしくは負の極性を示すが、バッファーのpHを適当に選択することにより全ての成分を正もしくは負のいずれかの極性に統一することができる。 Nucleic acid, primers contained in the buffer, different isoelectric DNA synthase and deoxyribonucleotide quinuclidine Oh Sid triphosphates respectively, but a positive or negative polarity by the pH of the buffer, selecting a pH buffer appropriate it is possible to unify all the components in a positive or negative either polarity by. 例えば、バッファー中の全ての成分が負の電荷を帯びるように調整し、電極1115が負に、電極1116が正になるように電圧を印加すると、バッファー中に含まれる成分のみが電極1116に向かって移動を始める。 For example, all of the components in the buffer was adjusted to carry a negative charge, the electrode 1115 is negative, when a voltage is applied so that the electrode 1116 is positive, only the components contained in the buffer toward the electrode 1116 It starts to move Te. このとき、バッファーは移動しない。 At this time, the buffer does not move. 移動を始めた各成分は、まず発熱体1106の上方領域を通過する。 The components started to move, first passes through the upper region of the heating element 1106. この領域は、上述のように、核酸が解離する温度に加熱、維持されているので、移動する成分のうち核酸のみが解離反応を起こす。 This region, as described above, heated to a temperature at which the nucleic acid is dissociated, because it is maintained, only the nucleic acid of the moving component causes dissociation reaction. 解離した核酸を含む各成分はさらに移動を続け、発熱体1107の上方領域を通過して発熱体1108の上方領域に到達する。 Each component containing the dissociated nucleic acid continues to move further through the upper region of the heating element 1107 reaches the upper region of the heating element 1108. この領域は、解離した核酸とプライマーとが結合反応を生じる温度に加熱、維持されており、解離した核酸とプライマーとの結合反応が生じる。 This region is heated to a temperature and dissociated nucleic acid and primer occurs a binding reaction has been maintained, binding reaction between dissociated nucleic acid and primer occurs. ここで、電圧制御装置1117により電極1115と1116との極性を逆転させる。 Here, to reverse the polarity of the electrodes 1115 and 1116 by voltage controller 1117. これにより、核酸とプライマーとの結合体を含む各成分は移動方向を逆転させ、電極1115に向かって移動を始める。 Thus, each component comprising a conjugate of a nucleic acid and a primer reverse the direction of movement, begins to move toward the electrode 1115. 逆方向に移動を始めた各成分は、まず耐熱性DNA合成酵素の活性が高まる温度に加熱、維持された発熱体1107の上方領域を通過し、核酸に結合したプライマーが伸長する。 The components started to move in the opposite direction, first heated to a temperature at which the activity is increased thermostable DNA synthase, passes through the upper region of the heating element 1107 is maintained, the primers bound to the nucleic acid is extended. プライマーが伸長し、二本鎖が形成された核酸を含む各成分は、さらに移動を続け、再び発熱体1106の上方領域に到達して核酸の解離が起こる。 Primer is extended, the components comprising a nucleic acid duplex is formed, further continues to move, the dissociation of the nucleic acid occurs and again reaches the upper area of ​​the heating element 1106. ここで再び両電極1104および1105の極性を逆転することにより、新たな熱サイクルが開始され、これを繰り返すことで核酸を増幅することができる。 By where reversing the polarity of the electrodes 1104 and 1105 again, a new heat cycle is initiated, it is possible to amplify nucleic acids by repeating this.

このように、この装置は電極に電圧を印加することによって、バッファー中に含まれる、DNA増幅反応に必要な成分のみを移動させる。 Thus, by the apparatus for applying a voltage to the electrodes, contained in the buffer, moving only components necessary for DNA amplification reactions. すなわち、最も容量が多く、したがって最も熱容量が大きいバッファーを加熱および冷却する必要がなく、各発熱体の上方領域のバッファーは温度測定手段の情報に基づく発熱体制御装置の作用により常に一定の温度に保たれている。 That is, most space is large and hence the most heat capacity is large buffers heating and there is no need to cool, always a constant temperature by the action of the heating element controller buffer of the upper region based on information of the temperature measurement means of each heating element It is maintained. 異なる温度領域の間を移動する各成分の熱容量は小さく、異なる温度領域に達したときには瞬時に温度変化が完了する。 Heat capacity of the components to move between the different temperature zones is small, temperature change instantaneously when it reaches a different temperature regions is completed. このため、熱サイクルの実施に伴う温度勾配の問題が解消され、DNA増幅反応をより精密に行なうことができる。 Therefore, the temperature gradient associated with the implementation of the thermal cycling problem can be solved, it is possible to carry out the DNA amplification reaction more precisely. また、機械的なバッファーの送出手段を必要としないため、装置を小型化し、コストを抑えることが可能である。 Moreover, since it does not require the delivery means of a mechanical buffer, size of the apparatus, it is possible to suppress the cost.

また、近年、熱サイクルに用いる温度を2種類、すなわち核酸が解離する温度と耐熱性酵素が最も活性化してプライマーの伸長が生じる温度とにしてDNA増幅反応を行なう研究がなされている。 In recent years, two types of temperature used thermal cycle, that is, research nucleic acid in the temperature and the temperature and the thermostable enzyme is most activated by primer extension occurs to dissociate performing DNA amplification reactions have been made. この方法には、熱サイクルに要する時間を短縮し、DNA増幅反応をより短時間で行なうことができるという利点がある。 The method shortens the time required for the thermal cycle, there is an advantage that can be performed in a shorter time DNA amplification reactions. この発明による第2のDNA増幅装置は、このような方法にも対応することができる。 The invention according to a second DNA amplification device, it is possible to cope with such a method. すなわち、図11および12に示される装置において、発熱体1106を核酸の解離が生じる温度に、発熱体1107をプライマーの伸長が効率的に生じる温度にそれぞれ設定し、この間でバッファー中の各成分を往復させればよい。 That is, in the apparatus shown in Figure 11 and 12, the heating element 1106 to a temperature dissociation occurs nucleic acid, the heating element 1107 primer extension is set to the efficient resulting temperature, the components in the buffer in the meantime it is only necessary to round-trip. 装置をこの方法に専用の装置とする場合には、発熱体1108、発熱体制御装置1111および温度検出手段1114は省くことができる。 When the dedicated device the device in this method, the heating element 1108, the heating element control unit 1111 and a temperature detection unit 1114 can be omitted.

この発明による第2のDNA増幅装置においては、図13および14に示されるように、耐熱性酵素の活性が高まる温度に維持される発熱体1107の上方に位置する流路1102の内面、すなわち流路1102の温度検出手段1113の近傍内面に耐熱性酵素1301を固定することができる。 In the second DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 13 and 14, the inner surface of the flow channel 1102 positioned above the heating element 1107 is maintained at a temperature that increases the activity of the thermostable enzyme, that flow it is possible to fix the thermostable enzyme 1301 near the inner surface of the temperature detection means 1113 of the road 1102. ここで、図13はこの発明による第2のDNA増幅装置の別の具体例を模式的に示す平面図であり、図14は図13に示される装置のG−G線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 13 is a plan view showing another specific example of the second DNA amplification apparatus according to the present invention schematically, FIG. 14 schematically a section along the line G-G of the device shown in FIG. 13 is a drawing illustrating manner. 耐熱性酵素を固定する位置は、流路1102の内面であれば底面、側面および上面のいずれでもよい。 Position to secure the thermostable enzyme, if the inner surface of the flow channel 1102 bottom may be either sides and the top. 流路1102の内面への耐熱性酵素を固定は、例えば、流路1102の内面をアミノ基を含有するシランカップリング剤で処理しておけば、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸ナトリウム法等の常法により行なうことができる。 Fixing the thermostable enzyme of the inner surface of the channel 1102, for example, if processing the inner surface of the flow channel 1102 with a silane coupling agent containing an amino group, carbodiimide method, glutaraldehyde method, sodium periodate method it can be carried out by a conventional method and the like. このように耐熱性酵素1301を固定化した装置を用いることにより、増幅しようとする核酸、2種類のプライマーおよび4種類にデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを移動させることで増幅反応を行なうことができる。 The use of such a device with immobilized thermostable enzyme 1301, nucleic acid to be amplified, it is possible to carry out the amplification reaction by moving two primers and four only deoxyribonucleoside triphosphates.

上述のように、図11および12に示される装置においては、耐熱性DNA合成酵素を含む増幅反応に必要な各成分を予め温度が設定、維持された領域の間を移動させることにより増幅反応を行なっている。 As described above, in the apparatus shown in Figure 11 and 12, advance temperature setting each component necessary for amplification reactions involving thermostable DNA polymerase, the amplification reaction by moving between the maintenance area is performed. しかしながら、耐熱性酵素は、耐熱性とはいうもののタンパク質であるため核酸が解離する温度に晒されると徐々に劣化する。 However, thermostable enzyme is gradually deteriorated nucleic acid is exposed to a temperature that dissociates for a protein Nevertheless heat resistance. したがって、熱サイクルの回数が増すに従って反応の効率が低下してしまう。 Accordingly, the number of thermal cycles the efficiency of the reaction decreases according to increase. すなわち、この耐熱性酵素の劣化がDNA増幅反応における増幅率の上限を決定する一つの要因となっている。 That is one of the factors that deteriorate the thermostable enzyme will determine the upper limit of the amplification factor of DNA amplification reactions. 図13および14に示される装置では、耐熱性酵素は常にその活性が最も高まる部位に留まっており、高温により劣化することがなく、活性を長時間に亘って維持することができる。 In the device shown in FIGS. 13 and 14, thermostable enzymes are always remains the most growing site its activity, without being degraded by the high temperature, it can be maintained over the activity for a long time. このため、DNA増幅反応をより効率よく、長時間に亘って行なうことが可能であり、DNAの増幅率を高めることができる。 Therefore, more efficient DNA amplification reactions, it is possible to carry out for a long time, it is possible to increase the amplification factor of the DNA.

また、この発明による第2のDNA増幅装置においては、図15および16に示されるように、各発熱体と発熱体との間、すなわち発熱体1106と1107との間および発熱体1107と1108との間に、基板1101の裏面に接して、冷却液を循環させるための冷却液流路1501を設けることができる。 In the second DNA amplification device according to the present invention, as shown in FIGS. 15 and 16, between each heating element and the heating element, i.e., and between the heating element 1107 and 1108 the heating element 1106 and 1107 between, in contact with the back surface of the substrate 1101 can be provided with a cooling fluid flow path 1501 for circulating a cooling fluid. ここで、図15はこの発明による第2のDNA増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図16は図15に示される装置のH−H線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 15 is a plan view showing still another embodiment schematically a second DNA amplification apparatus according to the present invention, a cross-section along the line H-H of the device shown in Figure 16 Figure 15 is a diagram schematically illustrating. この冷却液流路1501内には、図示しないポンプ等により、少なくとも解離した核酸がプライマーと結合する温度(約37℃)よりも低温の冷却液を循環させる。 This cooling liquid passage 1501, by a pump, not shown, to circulate cold coolant than the temperature (about 37 ° C.) of nucleic acids at least dissociated binds to the primer.

このように各発熱体と発熱体との間に冷却液を循環させることにより、各発熱体の上方領域の流路1102内の反応溶液の温度を、隣接する発熱体の影響を受けることなくより精密に制御することが可能となる。 Thus by circulating coolant between the heat generator and the heating element, the temperature of the reaction solution in the channel 1102 of the upper region of the heating element, than without being affected by adjacent heating elements it is possible to precisely control.

さらに、この発明の第2のDNA増幅装置においては、図17および18に示すように、発熱体1107と1108との間の流路1102、すなわち流路1102の温度検出手段1113と1114との間に、底面に電極1701を備えた貯留セル1702に連通する分岐流路1703を設けることもできる。 Furthermore, during the second DNA amplification device of the present invention, as shown in FIGS. 17 and 18, a temperature detecting means 1113 and 1114 of flow channel 1102, that the channel 1102 between the heating element 1107 and 1108 to, it may also be provided a branch passage 1703 which communicates with the reservoir cell 1702 with electrodes 1701 on the bottom. ここで、図17はこの発明による第2のDNA増幅装置のさらに別の具体例を模式的に示す平面図であり、図18は図17に示される装置のI−I線に沿った断面を模式的に示す図である。 Here, FIG. 17 is a plan view showing still another embodiment schematically a second DNA amplification apparatus according to the present invention, FIG 18 is a section along line I-I of the device shown in FIG. 17 is a diagram schematically illustrating. 貯留セル1702にはプライマーが貯留され、貯留セル1702の底面に設けられた電極1701は電圧制御装置1117に接続されている。 The storage cell 1702 primer is stored, the electrode 1701 provided on the bottom surface of the storage cell 1702 is connected to the voltage control unit 1117.

前述のように、DNAの増幅反応では、解離した核酸にプライマーを結合させ、耐熱性DNA合成酵素の作用によりこのプライマーを伸長させる。 As described above, the amplification reaction DNA, a primer is bound to the dissociated nucleic acid, the primer is extended by the action of the thermostable DNA polymerase. したがって、一度結合したプライマーはそのまま増幅した核酸の一部として消費される。 Accordingly, once the bound primer is consumed as part of the amplified nucleic acid as is. このため、増幅反応を繰り返すに従ってプライマーが減少し、プライマーが完全に消費されると増幅反応も終結する。 Therefore, the primer is reduced according to repeated amplification reactions, primer also terminate the amplification reaction to be completely consumed. すなわち、前述の耐熱性酵素の劣化と同様、プライマーの減少もDNA増幅反応における増幅率の上限を決定する一要素である。 That is, similarly to the deterioration of the aforementioned heat-resistant enzyme, a decrease in primer also one factor that determines the upper limit of the amplification factor of DNA amplification reactions. 図17および18に示される装置では、貯留セル1702から分岐流路1703を介して流路1102にプライマーを追加供給することが可能であり、増幅反応を繰り返すに従ってプライマーが不足する問題を解消することができる。 In the device shown in FIGS. 17 and 18, it is possible to supply additional primer to the channel 1102 via a branch passage 1703 from the storage cell 1702, to solve the problem of primer is insufficient according to repeated amplification reactions can.

図17および18に示される装置を用いたDNA増幅の手順は以下の通りである。 Procedure of DNA amplification using the apparatus shown in FIGS. 17 and 18 are as follows. まず、図11および12に示される装置を用いたDNA増幅の手順と同様にして、流路1102のバッファーを導入し、各発熱体1106、1107および1108の上方領域の流路1102内のバッファーを所定の温度に維持した後、電極1115および1116に電圧を印加し、または反転させ、バッファー中の各成分を移動させて増幅反応を行なう。 First, as in the procedure of DNA amplification using the apparatus shown in FIGS. 11 and 12, by introducing a buffer of the channel 1102, the buffer in the channel 1102 of the upper region of the heating elements 1106, 1107 and 1108 after maintained at a predetermined temperature, a voltage is applied to the electrodes 1115 and 1116, or is inverted, the amplification reaction by moving the respective components in the buffer. 熱サイクルを適当な回数繰り返した後、新たなサイクルを開始し、発熱体1106の上方領域を通過させて核酸を解離させるところまでは同様に行なう。 After repeating appropriate times the thermal cycle, to start a new cycle, it is passed through an upper region of the heating element 1106 far dissociating the nucleic acid is carried out in the same manner. その後、さらに各成分を電極1116に向けて移動させ、適当な位置に到達したときに、電極1701に電極1115と同じ極性の電圧を印加する。 Thereafter, by further moving toward the components to the electrode 1116, when it reaches the appropriate position, to apply the same polarity of the voltage between the electrodes 1115 to the electrode 1701. これにより貯留セル1702に貯留されているプライマーは電極1116に向けて移動を開始する。 Thereby it starts to move toward the in which primers electrode 1116 stored in the storage cell 1702. 移動を開始したプライマーは分岐流路1703を介して流路1102に流入し、発熱体1106の上方領域から流路1102を移動してきた各成分と合流する。 Starts moving primer flows into the flow passage 1102 through the branch passage 1703, and merges with the component moved through the channel 1102 from the upper region of the heating element 1106. その後は、再び同様にして熱サイクルを繰り返せばよい。 Thereafter, it may be repeated thermal cycles in the same way again.

このように、図17および18に示される装置を用いることにより、DNA増幅反応を繰り返している途中であってもプライマーを追加供給することが可能であり、プライマーの不足を回避し、DNAの増幅率を高めることができる。 Thus, by using the apparatus shown in Figure 17 and 18, it is possible to add even a primer supplied in the middle which are repeated DNA amplification reaction, avoiding lack of primers, amplification of DNA it is possible to increase the rate. また、DNAの増幅反応においては、プライマーだけではなく4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸もそれぞれ消費され、増幅反応を繰り返すに従って反応の効率が低下する要因となるが、貯留セル1702にプライマーに加えて4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を貯留することにより、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の不足を回避し、増幅率をより高めることができる。 In the amplification reactions of DNA, are consumed each alone also deoxyribonucleoside triphosphates four instead primer, becomes a factor in the efficiency of the reaction decreases as repeated amplification reactions, in addition to the primer reservoir cell 1702 by storing four kinds of deoxyribonucleoside triphosphates to avoid shortage of deoxyribonucleoside triphosphates, it is possible to increase the amplification factor.

さらにまた、この発明による第2のDNA増幅装置は、図11ないし図18に示される装置を1ユニットとして、複数のユニットを分岐を有する流路で連結することもできる。 Furthermore, the present invention according to a second DNA amplification device as one unit apparatus shown in FIGS. 11 to 18, may be connected in the flow path having a branching a plurality of units. 図13および14に示される装置を1ユニットとして、このユニットを複数連結した具体例を図19に示す。 The apparatus shown in Figure 13 and 14 as a unit, a specific example of the unit a plurality coupled to Figure 19. この図では、それぞれが図13および図14に示される構造を有するユニット1901、1902および1903が、流路1904を介して連結されている。 In this figure, each unit 1901, 1902 and 1903 having the structure is shown in FIGS. 13 and 14, are connected via a flow path 1904. 流路1904は、ユニット1901を通過した後、具体的にはユニット1901の弁1905の下流で分岐し、一方が弁1906を介してユニット1902に、他方が弁1907を介してユニット1903にそれぞれ連通している。 Flow path 1904, after passing through the unit 1901 is branched downstream of the valve 1905 specific to the unit 1901, the unit 1902 through one of the valves 1906, respectively communicating with the unit 1903 via the other valve 1907 are doing.

この装置を用いたDNAの増幅反応は以下の手順で行なう。 DNA amplification reaction using this apparatus is performed by the following procedure. まず、ユニット1901において、前述の図11および12に示される装置を用いたDNAの増幅反応において説明した手順でDNAの増幅反応を行なう。 First, the unit 1901 performs amplification reaction of a DNA by the procedure described in the amplification reaction of DNA using the apparatus shown in FIGS. 11 and 12 described above. 熱サイクルを所定の回数繰り返した後、増幅した核酸を含む各成分を発熱体1908の上方を通過させて電極1909の近傍に集める。 After the thermal cycle is repeated a predetermined number of times, collecting the components containing the amplified nucleic acid is passed over the heating element 1908 in the vicinity of the electrode 1909. 次に、弁1905、1906および1907を開放し、電極1909および1910に印加していた電圧を遮断する、続いて、電極1909の極性を反転させ、同時に電極1911および1912に電圧を印加する。 Next, opening valve 1905 and 1906 and 1907, to block the voltage applied to the electrodes 1909 and 1910, then, by reversing the polarity of the electrodes 1909, a voltage is applied to the same time the electrodes 1911 and 1912. 具体的には、電極1909が負に、電極1911および1912が正になるように電圧を印加する。 More specifically, the electrode 1909 is negative, a voltage is applied so that the electrode 1911 and 1912 is positive. これにより、電極1909近傍に集まっていた各成分は流路1904内を電極1911および1912に向けて移動する。 Thus, each component has been gathered in the electrode 1909 near moves toward the inside flow path 1904 to the electrodes 1911 and 1912. 各成分がユニット1902および1903内に移動したところで各電極に印加していた電圧を遮断し、弁1905、1906および1907を閉鎖する。 Each component blocks the voltage applied to each electrode at which moves the unit 1902 and 1903, closing the valve 1905, 1906 and 1907. その後、ユニット1902および1903において、前述の手順によりDNAの増幅反応を行なう。 Then, the unit 1902 and 1903, the amplification reaction of DNA by the procedure described above.

耐熱性酵素の劣化およびプライマーの減少がDNA増幅反応における増幅率の上限を決定する要因となることは前述したが、増幅反応の結果生じるDNAの濃度上昇もまた増幅率の上限を左右する要因となる。 Although the degradation and primer decreased the thermostable enzyme is a factor that determines the upper limit of the amplification factor of DNA amplification reactions described above, the factors that affect the upper limit of the concentration increase also the amplification factor of the resulting amplification reaction DNA Become. 解離した核酸とプライマーとの結合が核酸同士の結合との競合反応であることも前に説明した。 Also described before it is coupled with dissociated nucleic acid primer is a competitive reaction with the binding between nucleic acids. 図17および18に示される装置では、増幅反応の途中でプライマーを追加供給可能なシステムを加えることによりこの問題を解決している。 In the device shown in FIGS. 17 and 18, solves this problem by adding an additional supply system capable primers during the amplification reaction. しかしながら、流路の容量は一定であり、核酸は増幅する一方であるため、例えプライマーの濃度を高めたとしても、核酸同士が会合して結合する機会は増加する。 However, the capacity of the channel is constant, since the nucleic acid is one that amplifies, even increasing concentrations of for example a primer, the opportunity to bind the nucleic acid with each other to associate increases. この装置では、ユニット1901を流出した各成分が、流路1904の分岐点でほぼ2等分されてユニット1902および1903に流入する。 In this apparatus, each component flowing out of the unit 1901, flows substantially bisected by units 1902 and 1903 at the branch point of the channel 1904. すなわち、ユニット1902および1903に流入する核酸の濃度は、ユニット1901における核酸の最終濃度のほぼ半分である。 That is, the concentration of nucleic acids flowing into units 1902 and 1903 is approximately half the final concentration of nucleic acid in the unit 1901. このため、増幅反応の最中に核酸同志が結合する確率が低下して、増幅反応をより効率的に行なうことが可能であり、その結果増幅率を高めることができる。 Therefore, it decreases the probability that nucleic acid comrade to bind during the amplification reaction, it is possible to carry out an amplification reaction more efficiently, it is possible to enhance the results gain.

なお、図19においては、ユニット1901に続くユニットの数は2つであるが、これに限定されるものではなく、流路1904をさらに分岐させてより多くのユニットに連結することもできる。 In FIG. 19, the number of units following the unit 1901 although two is not limited thereto, may be connected to more units by further branching the flow path 1904. また、図19においては増幅反応は2段階でおこなっているが、ユニット1902および1903の後でさらに流路1904を分岐させて複数のユニットを連結させ、より多段階で増幅反応を行なうこともできる。 Further, the amplification reaction in 19 although performed in two steps, by branching the further flow path 1904 after the units 1902 and 1903 is connected a plurality of units, it is also possible to carry out the amplification reaction at more levels .

次に、この発明による第3のDNA増幅装置の一具体例の平面図を図20に示す。 Next, a plan view of one embodiment of a third DNA amplification apparatus according to the present invention in FIG. 20. この装置では、無機もしくは有機基板2001上に、2つの弁2003および2004が設けられた流路2002が形成され、さらに基板2001の上面に接して透明基板が接合されている。 In this apparatus, on the inorganic or organic substrate 2001, the two valves 2003 and 2004 flow path 2002 that is provided is formed, and further the upper surface in contact transparent substrate is bonded substrate 2001. 弁2003と2004との間には、基板2001の裏面に接して3つの発熱体2005、2006および2007が設けられており、それぞれ発熱体の温度を個別に制御する発熱体制御装置2008、2009および2010に接続されている。 Between the valve 2003 and 2004, are in contact with the back surface of the substrate 2001 are three heating elements 2005, 2006 and 2007 provided, the heating element controller 2008, 2009 and individually controlling the temperature of the heating element, respectively It is connected to the 2010. また、これらの発熱体2005、2006および2007に対応して流路2002の底面には、それぞれ、反応溶液の温度を検出するための温度検出手段2011、2012および2013が設けられている。 Further, the bottom surface of the flow path 2002 in response to these heating elements 2005, 2006 and 2007, respectively, the temperature detecting means 2011 and 2012 and 2013 for detecting the temperature of the reaction solution are provided. さらに、発熱体2006に対応する位置の流路2002の底面には耐熱性DNA合成酵素2014が固定されている。 Furthermore, the heat-resistant DNA synthetase 2014 is fixed to the bottom surface of the channel 2002 at a position corresponding to the heating element 2006. また、弁2003と発熱体2005との間に位置する流路2002の底面および弁2004と発熱体2007との間に位置する流路2002の底面にはそれぞれ電極2015および2016が設けられており、さらに電極2015と弁2003との間には、底面に電極2017を備えた貯留セル2018に連通する分岐流路2019が設けられている。 Further, each on the bottom face of the flow path 2002 electrodes 2015 and 2016 located is provided between the bottom surface and the valve 2004 of the channel 2002 is located between the heating element 2007 between the heating element 2005 and a valve 2003, between further the electrode 2015 and the valve 2003, the branch channel 2019 communicating with the reservoir cell 2018 with electrodes 2017 to the bottom surface is provided. 弁2003の上流側の流路2002の底面には電極2020が設けられ、この電極2020と弁2003との間には、基板2001の上面に接合された透明基板を貫通する試料投入口2021が設けられている。 The bottom surface of the upstream side of the flow path 2002 of the valve 2003 electrodes 2020 are provided between this electrode 2020 and the valve 2003, a sample inlet 2021 through the transparent substrate bonded to the upper surface of the substrate 2001 is provided It is. 試料投入口2021は外部から試料を流路2002内に取り込むことが可能な形態をとっている。 Sample slot 2021 takes the form capable of capturing a sample from the outside flow passage 2002. また、試料投入口2021と弁2003との間の流路2002にはゲル状化合物2022が流路2002を塞ぐ形で充填され、このゲル状化合物2022が充填された部位と弁2003との間には、弁2023を介して、底面に電極2024を備えた廃棄物セル2025に連通する分岐流路2026が設けられている。 Further, the flow path 2002 between the sample inlet 2021 and the valve 2003 are filled in the form of gel-like compound 2022 closes the flow path 2002, between the gel compound 2022 site and a valve 2003, which is filled through a valve 2023, the branch passage 2026 which communicates with the waste cell 2025 with electrodes 2024 are provided on the bottom surface. 同様に、弁2004の下流側の流路2002にも電極2027が設けられ、この電極2027と弁2004との間にはDNA検出手段2028が設けられている。 Similarly, electrode 2027 is also provided on the downstream side of the flow path 2002 of the valve 2004, DNA detection unit 2028 is provided between the electrode 2027 and the valve 2004. 電極2015、2016、2017、2020、2024および2027は全て、各電極に電圧を印加することが可能であり、かつ印加した電圧を反転することが可能な電圧制御装置2029に接続されている。 All electrodes 2015,2016,2017,2020,2024 and 2027 are connected to the respective electrode voltages it is possible to apply to, and the applied voltage capable of inverting the voltage controller 2029. 無機もしくは有機基板2001の材質、流路2002の形成方法、透明基板の材質、利用可能な発熱体、および利用可能な温度検出手段等は全て、上記この発明による第1のDNA増幅装置に用いられるものと同様である。 Method for forming an inorganic or organic substrate material 2001, the channel 2002, the material of the transparent substrate, is used the heating element available, and all the temperature detection means or the like available to the first DNA amplification device according to the present invention is the same as the stuff. 流路2002に充填されるゲル状化合物2022としては、例えば、セルロース、アガロース、アルリルアミド等を用いることができる。 The gel compound 2022 to be filled in the flow channel 2002, for example, can be used cellulose, agarose, Aruriruamido like. また、DNA検出手段2028は特に限定されるものではなく、通常DNAの検出に用いられるいかなる手段をも用いることができ、例としては紫外線吸光度検出法、屈折率検出法、蛍光検出法および楕円偏光解析法を利用するものを挙げることができる。 Also, DNA detection unit 2028 is not limited in particular, usually also can be used any means used for the detection of DNA, ultraviolet absorbance detection method as an example, the refractive index detection, fluorescence detection methods and elliptically polarized light mention may be made of those to use the analysis method.

この第3のDNA増幅装置を用いたDNA増幅反応の手順は以下の通りである。 Procedures of the third DNA amplification reaction using a DNA amplification device is as follows. まず、バッファーを満たした流路2002内に、試料投入口2021から、全血もしくは血清等の試料を導入する。 First, the flow path 2002 that satisfies the buffer, from the sample inlet 2021, introducing a sample, such as whole blood or serum. 次に、弁2003を閉鎖し、弁2023を開放した後、電極2020および2024に、電極2020が負に、2024が正になるように電圧を印加し、核酸を含む試料を電極2024に移動させる。 Then, closing the valve 2003, after opening the valve 2023, the electrodes 2020 and 2024, the electrode 2020 is negative, 2024 a voltage is applied so that positive, moves the sample containing nucleic acid to the electrode 2024 . 流路2002を電極2024に向けて移動する試料は、ゲル状化合物2022を通過する。 Sample moves toward the flow path 2002 to the electrode 2024, it passes through a gel-like compound 2022. この際、ゲル電気泳動の原理により、核酸がゲル状化合物2022を通過するより早く、不純物であるより低分子の化合物がゲル状化合物2022を通過し、分岐流路2026を経て廃棄物セル2025に到達する。 In this case, by the principle of gel electrophoresis, faster than the nucleic acid to pass through the gel-like compound 2022, compound of low molecular than it is impurities pass through the gel-like compound 2022, waste cell 2025 through the branch passage 2026 arriving. この後、目的とする核酸がゲル状化合物2022を通過し終えた時点で、弁2023を閉鎖して電極2024に印加していた電圧を遮断し、次いで弁2003を開放して電極2015に電圧を印加する。 Thereafter, when the nucleic acid of interest has finished passing through the gel compound 2022, it cuts off the voltage applied to the electrodes 2024 to close the valve 2023, then the voltage to the electrodes 2015 by opening the valves 2003 applied to. これにより、不純物が除去された、目的とする核酸のみが弁2023を通過する。 Thereby, impurities are removed, to pass through the nucleic acid Nomigaben 2023 of interest. また、電極2015に電圧を印加するのと同時に電極2017にも電圧を印加する。 Also, a voltage is applied to the same time the electrode 2017 as a voltage is applied to the electrode 2015. 貯留セル2018には、予めDNA増幅反応に必要な2種類のプライマーおよび4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)が貯留されており、電極2017に電圧が印加されると同時に電極2015に向けて移動を開始して、分岐流路2019を介して流路2002に流入し、弁2003を通過した核酸と合流する。 The storage cell 2018, previously two primers needed for DNA amplification reactions and four deoxyribonucleoside triphosphates and (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) are stored, when a voltage is applied to the electrode 2017 simultaneously it starts moving toward the electrode 2015, via the branch passage 2019 flows into the flow path 2002, and merges with the nucleic acid that has passed through the valve 2003. 核酸が弁2003を通過し、貯留セル2018からの各成分と共に電極2015の近傍に集まった後、弁2003を閉鎖して電極2017および2020に印加されていた電圧を遮断し、次いで電極2016に電圧を印加すると同時に電極2015に印加される電圧の極性を反転させる。 Nucleic acid passes through the valve 2003, after gathered in the vicinity of the electrode 2015 together with other components from the storage cell 2018, cuts off the voltage applied to the electrodes 2017 and 2020 to close the valve 2003, then the voltage to the electrode 2016 applying to the the reversing the polarity of the voltage applied at the same time the electrode 2015. これにより、各成分は電極2016に向けて移動を開始し、以下、前述の第2のDNA増幅装置に各具体例において説明した手順によりDNAの増幅反応を行なう。 Thus, each component starts moving toward the electrode 2016, the following, an amplification reaction of DNA according to the procedure described in the specific examples in the second DNA amplification device described above. 所定の回数熱サイクルを行なって増幅反応が終了した後、まず増幅した核酸を含む各成分を電極2016の近傍に集める。 After the amplification reaction was completed by performing a predetermined number of times heat cycles, collecting the components containing the first amplified nucleic acid in the vicinity of the electrode 2016. 次に、電極2015に印加していた電圧を遮断して弁2004を開放し、電極2027に電圧を印加すると同時に電極2016に印加されていた電圧の極性を反転させる。 Next, opening valve 2004 blocks the voltage applied to the electrodes 2015, when a voltage is applied to the electrode 2027 to invert the polarity of the voltage applied at the same time the electrode 2016. これにより、増幅した核酸は電極2027に向けて移動を開始する。 Accordingly, amplified nucleic acid starts to move toward the electrode 2027. 核酸がDNA検出手段2028の位置まで移動した時点で電極2016および電極2027に印加していた電圧を遮断し、DNAの検出を行なう。 Nucleic acid blocks the position voltage applied to the electrode 2016 and the electrode 2027 at the time of the move to the DNA detector 2028 performs detection of DNA.

この装置では、試料の投入から、DNAを増幅し、増幅したDNAを検出するまで全て電気的な動作であり、機械的な動作は必要としない。 In this device, the introduction of the sample, DNA was amplified, all until detecting the amplified DNA is electrical operation, mechanical operation is not required. このため、装置を非常に小型化することが可能であり、コストの低下にも非常に有利である。 Therefore, it is possible to highly miniaturized apparatus, it is very advantageous in cost reduction. また、同じ理由により、全自動化も容易である。 For the same reason, the total automation is also easy.

図20に示される装置においては、ゲル状化合物は試料投入口2021と弁2003との間にのみ充填されているが、弁2004とDNA検出手段2028との間の流路2002に充填することもできる。 In the apparatus shown in Figure 20 is a gel-like compound is filled only between the sample inlet 2021 and the valve 2003, may be filled in the flow path 2002 between the valve 2004 and the DNA detection means 2028 it can. このようにゲル状化合物を配置することにより、DNA増幅後にも反応せずに残留し、DNA検出の妨げになるプライマーやデオキシリボヌクレオシド三リン酸を分離することができ、検出の精度をより高めることができる。 By thus disposing the gel-like compound, also remaining without reaction after DNA amplification, it can be separated primers and deoxyribonucleoside triphosphates that impede DNA detection, increase the accuracy of detection can.

また、流路2002にゲル状化合物2022を充填する代わりに、この部分の流路の径を 150μm以下とすることによっても同様の効果を得ることができる。 Instead of filling the gel-like compound 2022 in flow channel 2002, the diameter of the flow path of this portion it is possible to obtain the same effect by a 150μm or less. すなわち、流路の径を 150μm以下とすることにより、壁面との電気親和力の差により、核酸と他の不純物とを分離することができる。 That is, by the diameter of the flow passage and 150μm or less, the difference in electron affinity between the wall surface, can be separated from the nucleic acid and other impurities.

以上、図面に基づいてこの発明によるDNA増幅装置の実施の形態を説明したが、この発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、この発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能である。 Having described the embodiments of the DNA amplification device according to the invention with reference to the drawings, the invention is not limited to the above embodiments, and various modifications and applications within the scope of the invention it is possible. ここで、この発明の要旨をまとめると以下のようになる。 Here, it is summarized as follows from the gist of the present invention.

(1)図1ないし10に対応 無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、該反応セルに連通する2つの流路と、該流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた2つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備するDNA増幅装置。 (1) is provided across the planar shape of the reaction cell formed in a corresponding inorganic or organic substrate in FIG. 1 to 10, two and a flow path communicating with said reaction cell, said reaction cell in each of the flow paths two valves that are, DNA amplification apparatus comprising a heating means provided in either the rear surface of the bottom or the surface of the reaction cell is formed of the substrate of at least the reaction cell.

この装置は、反応セルがプレーナ状であり、これにより反応セル内の反応溶液をより迅速に加熱および冷却することができる。 The device reaction cell is planar-shaped, thereby the reaction solution in the reaction cell can be more quickly heat and cool. また、加熱手段を反応セルの底面および基板の裏面の両方に設けた場合には、反応セル内の反応溶液の昇降温速度を高めることができる。 Further, in case of providing the heating means in both the bottom and the back surface of the substrate in the reaction cell, can increase the heating and cooling rate of the reaction solution in the reaction cell. その結果、反応溶液内の温度勾配を小さくすることが可能であり、DNA増幅反応の精度を高めることができる。 As a result, it is possible to reduce the temperature gradient in the reaction solution, it is possible to improve the accuracy of DNA amplification reactions.

(2)図11ないし19に対応 無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた2つの弁、該2つの弁の間の流路の底面に設けられた2つの電極、該2つの電極の間の流路の底面に設けられた少なくとも1つの温度検出手段、該少なくとも1つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、前記2つの電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するDNA増幅装置。 (2) flow path provided in the corresponding inorganic or organic substrate in FIG. 11 to 19, the two valves provided in the flow channel, two electrodes provided on the bottom surface of the flow path between the two valves , the surface of at least one temperature detecting means provided on the bottom surface of the flow path between the two electrodes, the flow path of the flow channel bottom surface or the substrate in the vicinity of each of the one temperature sensing means said at least is provided information on at least one of the back, from each heating means provided in pairs, the voltage control means for controlling a voltage applied to the two electrodes, and the temperature detecting means of said temperature detecting means DNA amplification apparatus comprising heating control means for controlling the heating means based on.

この装置では、流路内に満たされた反応溶液に電圧を印加し、反応溶液中の核酸、耐熱性DNA合成酵素、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを所定の温度に維持された複数の領域の間で移動させ、DNAの増幅反応を行なう。 In this device, a voltage is applied to the reaction solution filled in the flow path, the nucleic acid in the reaction solution, a thermostable DNA synthetase, primers and deoxyribonucleoside triphosphates only maintained at a predetermined temperature plurality of regions moving between, performing an amplification reaction of DNA. このため、増幅反応に必要な熱サイクルの際に生じる温度勾配の問題が解消される。 Therefore, the problem of temperature gradients occurring during thermal cycles required for the amplification reaction is eliminated. また、電気的な手段で溶液中の成分のみを移動させ、溶液の移動を伴わないため、ポンプ等の機械的な作動部材を必要とせず、装置の小型化および低価格化が可能となる。 Further, only the component in the solution by an electrical means to move, because without movement of the solution, without the need for mechanical actuation member such as a pump, it is possible to size and cost of the apparatus.

(3)図20に対応 無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路の底面に設けられた第1ないし第4の電極、第1の電極と第2の電極との間に設けられた第1の弁、第1の電極と第1の弁との間に設けられた試料投入口、該試料投入口と第1の弁との間に位置し、底面に第5の電極を有する不純物導入セルに連通する第1の分岐流路、該第1の分岐流路と前記試料投入口との間の流路内に設けられたゲル状化合物、第1の弁と第2の電極との間に位置し、底面に第6の電極を有する貯留セルに連通する第2の分岐流路、第2の電極と第3の電極との間の流路底面に設けられた少なくとも1つの温度検出手段、該少なくとも1つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれ (3) a flow path provided in the corresponding inorganic or organic substrate in FIG. 20, first to fourth electrode provided on the bottom surface of the flow path, provided between the first electrode and the second electrode was first valve, sample slot provided between the first electrode and the first valve, located between the sample inlet and the first valve, the fifth electrode on the bottom the first branch flow channel, gelatinous compound which is provided in the flow path between the first branch flow path and the sample inlet, the first valve and a second electrode which communicates with the impurity introduction cell having located between the second branch flow passage communicating with the reservoir cell having a sixth electrode on the bottom, at least one of which is provided in a flow path bottom between the second electrode and the third electrode temperature detection means, said at each vicinity of without even one temperature detecting means flow channel bottom surface or the back surface of the flow path of the substrate is provided at least one 一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、第3の電極と第4の電極との間に設けられたDNA検出手段、該DNA検出手段と第4の電極との間に設けられた第2の弁、前記第1ないし第6の電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するDNA増幅装置。 On the other hand, the respective paired heating means provided at an of said temperature detecting means, and the third electrode and the DNA detection means provided between the fourth electrode, the DNA detection means and a fourth electrode second valve provided between the first to the voltage control means for controlling a voltage applied to the sixth electrode, and a heating control for controlling the heating means based on information from the temperature detecting means DNA amplification apparatus comprising means.

この装置では、試料の投入から、DNAを増幅し、増幅したDNAを検出するまで全て電気的な動作で行なうことが可能であり、装置を非常に小型にすることができ、また低コスト化も可能である。 In this device, the introduction of the sample, DNA was amplified, all until detecting the amplified DNA can be based on electrical operation, can be very compact device, also cost reduction also possible it is. さらに、機械的な部材を必要としないことから全自動化も容易である。 Furthermore, it is easy to fully automated since it does not require a mechanical member.

また、この発明は以下の態様をも含むものである。 Further, the invention also includes the following aspects.

(4)図3および4に対応 前記(1)の装置において、反応セルの底面に少なくとも1つの温度検出手段を有するDNA増幅装置。 (4) In the device of the corresponding said (1) in FIG. 3 and 4, DNA amplification device having at least one temperature sensing means to the bottom of the reaction cell.

この装置では、反応セルの底面に設けられた少なくとも1つの温度検出手段が反応溶液の温度を直接測定する。 In this apparatus, at least one temperature detecting means provided on the bottom surface of the reaction cell to measure the temperature of the reaction solution directly. したがって、加熱手段によって加熱される反応溶液の温度をより精密に制御することができる。 Therefore, it is possible to control the temperature of the reaction solution is heated by the heating means more precisely.

(5)図5および6に対応 前記(1)の装置において、反応セルの底面に少なくとも1つの突起を有するDNA増幅装置。 (5) In the device of the corresponding said (1) in FIG. 5 and 6, DNA amplification device having at least one protrusion on the bottom surface of the reaction cell.

この装置では、反応セルの底面に少なくとも1つの突起を設けることにより、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積を拡大している。 In this apparatus, by providing at least one protrusion on the bottom surface of the reaction cell, the reaction solution in the reaction cell is an enlarged area of ​​contact with the cell bottom. その結果、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。 As a result, it is possible to transmit the heat generated from the heating means to more efficiently the reaction solution, it is possible to more quickly heat or cool the reaction solution.

(6)図7および8に対応 前記(1)の装置において、反応セル底面の断面形状が鋸刃状もしくは波状であるDNA増幅装置。 (6) In the device of the corresponding said (1) in FIG. 7 and 8, DNA amplification device cross-sectional shape of the reaction cell bottom is blade-like or wavy saw.

この装置も、上記(5)の装置と同様に、反応セル底面の断面形状を鋸刃状もしくは波状とすることにより、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積をより拡大している。 This device, like the device described in (5), by the cross-sectional shape of the reaction cell bottom with serrated or corrugated, the reaction solution in the reaction cell are expanding more the area in contact with the cell bottom. したがって、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。 Therefore, it is possible to transmit the heat generated from the heating means to more efficiently the reaction solution, it is possible to more quickly heat or cool the reaction solution.

(7)図9および10に対応 前記(1)の装置において、反応セルの底面に1つもしくはそれ以上の突起が反応溶液の流れ方向に対して斜めに配置されたDNA増幅装置。 (7) The apparatus of the corresponding said (1) in FIG. 9 and 10, DNA amplification device arranged diagonally is one or more projections on the bottom surface of the reaction cell relative to the direction of flow of the reaction solution.

この装置では、反応セルに流入する反応溶液がセル底面に設けられた突起の抵抗を受けて反応セル内で撹拌される。 In this apparatus, the reaction solution into the reaction cell is stirred in the reaction cell by receiving the resistance of the projection provided on the cell bottom. その結果、各成分が反応溶液中で均一に分散し、DNA増幅反応が均一に生じる。 As a result, each component is uniformly dispersed in the reaction solution, DNA amplification reaction occurs uniformly. また、反応セルから反応溶液を流出させる際にもやはり突起により反応溶液が撹拌され、次の精製、分析工程をむらのない状態で行なうことができる。 Further, the stirred reaction solution by again projecting even when caused to flow out the reaction solution from the reaction cell, following purification, can be performed the analysis step in the absence of unevenness. さらに、前記(5)および(6)の装置と同様に、反応セル底面に設けられた突起は、反応セル中の反応溶液がセル底面と接する面積を拡大する作用をする。 Furthermore, the (5) and (6) of the apparatus and in the same manner, the projection provided on the reaction cell bottom, which acts to the reaction solution in the reaction cell to enlarge the area in contact with the cell bottom. したがって、加熱手段から生じた熱をより効率的に反応溶液に伝えることができ、反応溶液をより迅速に加熱もしくは冷却することが可能である。 Therefore, it is possible to transmit the heat generated from the heating means to more efficiently the reaction solution, it is possible to more quickly heat or cool the reaction solution.

(8)図11ないし19に対応 無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた2つの弁および該2つの弁の間の流路の底面に設けられた2つの電極を具備するDNA増幅装置。 (8) a flow channel provided in the corresponding inorganic or organic substrate in FIG. 11 to 19, two electrodes provided on the bottom surface of the flow path between the two valves and the two valves provided in the flow path comprising a DNA amplification apparatus.

この装置は、流路底面に設けられた2つの電極に電圧を印加することにより、反応溶液中の核酸、プライマー、耐熱性DNA合成酵素およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを移動させる。 This apparatus, by applying a voltage to the two electrodes provided in the flow path bottom, the nucleic acid in the reaction solution, a primer, to only move thermostable DNA polymerase and deoxyribonucleoside triphosphates. したがって、溶液の移動を伴わないために、DNA増幅反応に必要な熱サイクルにおいて生じる温度勾配の問題が解消される。 Therefore, in order not to involve the movement of the solution, the temperature gradient that occurs in thermal cycling required for DNA amplification reaction problems are corrected. また、溶液の移動を伴わないために、ポンプ等の機械的作動部材を必要とせず、装置の小型化および低価格化が可能となる。 In order without movement of the solution, without the need for mechanical operating member such as a pump, it is possible to size and cost of the apparatus.

(9)図13および14に対応 前記(2)の装置において、少なくとも1つの温度検出手段が設けられた位置の流路内面に耐熱性DNA合成酵素が固定化されているDNA増幅装置。 (9) 13 and 14 to a corresponding said The apparatus of (2), at least one temperature sensing means DNA amplification device thermostable DNA polymerase is immobilized to the flow path inner surface locations provided.

耐熱性DNA合成酵素は、その名の通り、核酸が解離するような温度においてもその活性をある程度維持することができるが、反応を繰り返す毎に活性が低下し、これがDNA増幅反応における増幅率の上限を決定する要因の一つとなっている。 Thermostable DNA synthase, as its name, can be a nucleic acid to some extent maintain its activity at a temperature such that dissociation reaction activity decreases every repeat, which is the amplification factor of DNA amplification reactions It has become one of the factors that determines the upper limit. この装置では、この耐熱性DNA合成酵素を、核酸に結合したプライマーを伸長させる温度領域の流路内壁、例えば流路底面や上面に固定化している。 In this apparatus, the heat-resistant DNA polymerase, channel inner wall temperature region extending the primer bound to the nucleic acid, is immobilized for example to the flow channel bottom surface and top surface. これにより、増幅反応に支障をきたすことなく、酵素の劣化を大幅に抑制し、DNA増幅反応における増幅率を高めることができる。 Thus, without affecting the amplification reaction, the degradation of the enzyme was significantly suppressed, it is possible to increase the amplification factor of DNA amplification reactions.

(10)図15および16に対応 前記(2)の装置において、2つ以上の加熱手段を有し、各々の加熱手段と加熱手段との間に相当する位置の、無機もしくは有機基板の上面もしくは裏面に、基板に接して設けられた冷却液流路を具備するDNA増幅装置。 (10) The apparatus of the corresponding said (2) in FIG. 15 and 16, have two or more heating means, the position corresponding to between the heating means and each of the heating means, the upper surface of the inorganic or organic substrate or on the back, DNA amplification device having a cooling fluid flow path provided in contact with the substrate.

この装置では、冷却液流路に冷却液を循環させることにより、基板上に複数設けられた加熱手段の各々を熱的に分離することができる。 In this device, by circulating a cooling fluid to the cooling fluid channel, each of the plurality was heating means on the substrate may be thermally isolated. したがって、各加熱手段によって加熱される流路内のバッファーの温度をより精密に制御することが可能となる。 Therefore, it is possible to more precisely control the temperature of the buffer is the passage heated by the heating means.

(11)図17および18に対応 前記(2)の装置において、2つ以上の加熱手段を有し、所定の加熱手段と加熱手段との間に相当する位置の流路に、底面に電極が設けられた貯留セルに連通する分岐流路が設けられているDNA増幅装置。 (11) The apparatus of the corresponding said (2) in FIG. 17 and 18, have two or more heating means, the flow path of the corresponding positions between the heating means and the predetermined heating means, the electrodes on the bottom and branch channels communicating is provided provided a storage cell and DNA amplifier.

前述のように、DNA増幅反応における増幅率の上限を決定する要因の一つは耐熱性DNA合成酵素の劣化であるが、他の要因としてプライマーの減少も挙げられる。 As mentioned above, one factor that determines the upper limit of the amplification factor of DNA amplification reactions is a reduction in the heat resistant DNA synthetase, a decrease in primer are also described as other factors. 解離した核酸にプライマーが結合することが耐熱性酵素がプライマーの伸長を開始する条件であるが、一度結合したプライマーはそのまま増幅した核酸の一部となるため、増幅反応を繰り返す毎にプライマーは消費されていく。 Although the primer dissociated nucleic acid joins are conditions thermostable enzyme initiates primer extension, to become part of the nucleic acid once bound primers amplified as it is, the primer for each repetition of the amplification reaction consumption we are. したがって、プライマーが完全に消費された時点で増幅反応は終了する。 Thus, amplification reactions when primers were completely consumed ends.

この装置では、予め貯留セルにプライマーを貯留することにより、増幅反応の途中であってもプライマーを追加供給することが可能であり、DNA増幅反応における増幅率を高めることができる。 In this device, by storing the primers previously stored cell, a course of the amplification reaction is also possible to supply additional primer, can increase the amplification factor of DNA amplification reactions. 貯留セルから流路へのプライマーの供給は、貯留セルの底面に設けられた電極を用いて電気的に行なうことができる。 Supply of primer from the reservoir cell to the flow path may be electrically performed by using the electrode provided on the bottom surface of the storage cell.

さらに、この装置では、プライマーだけではなく、4種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を貯留セルに貯留してもよい。 Furthermore, in this apparatus, not only a primer, may be stored four deoxyribonucleoside triphosphates in a storage cell. この場合には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸が不足することも回避することができる。 In this case, it is also possible to avoid the shortage of deoxyribonucleoside triphosphates.

(12)図19に対応 前記(2)、(8)、(9)、(10)または(11)の装置のいずれかを1ユニットとするユニットを少なくとも3つ有し、1つのユニットの下流側に他のユニットが分岐を有する流路によって連結されているDNA増幅装置。 (12) corresponding the 19 (2), (8), (9), (10) or one of the devices (11) comprises at least three units and 1 unit, downstream of one unit other units DNA amplification devices are connected by a flow path having a branch on the side.

DNA増幅反応における増幅率の上限を決定する要因としては、前述の耐熱性酵素の劣化およびプライマーの減少の他に、増幅反応の結果生じるDNAの濃度上昇も挙げることができる。 The factors that determine the upper limit of the amplification factor of DNA amplification reactions, in addition to the reduction in degradation and primers of the aforementioned heat-resistant enzyme can also include elevated concentrations of resulting DNA amplification reactions. DNAの濃度が上昇すると、解離した核酸とプライマーが結合するときに核酸同士が結合する可能性が高くなる。 When the concentration of DNA increases, the possibility that the nucleic acid are bonded to each other when dissociated nucleic acid and primer binds increased. 核酸がプライマーと結合する反応と核酸同士が結合する反応とは競合するので、核酸濃度に対するプライマー濃度を高めることにより相対的に核酸同士が結合する確率は低くなる。 Since nucleic acid competes with the reaction of binding of the reaction and between nucleic acids that bind to the primer, the probability of relatively nucleic each other bound by increasing the primer concentration to the nucleic acid concentration is low. しかし、流路の容量は一定なので、プライマーの濃度を高めることにより核酸同士の再結合を抑制するのには限りがある。 However, since the capacity of the channel is constant, there is always in suppressing recombination between nucleic acids by increasing the concentration of primers.

この装置は、単体でDNA増幅反応を行なうことが可能な3つ以上のユニットを有し、1つのユニットの下流側に、分岐した流路を介して、他のユニットが連結されている。 This device has three or more units capable of performing the DNA amplification reaction itself, on the downstream side of the one unit, through the branched flow path, other units are connected. この装置では、まず、上流側のユニットにおいて所定の回数DNA増幅反応を繰り返した後、各ユニットの弁を開放し、上流側のユニットにおいて増幅した核酸を下流側のユニットに電気的に移動させる。 In this apparatus, first, after repeating a predetermined number of times DNA amplification reaction in the unit on the upstream side, and open the valve of each unit, electrically moved to the downstream side of the unit the amplified nucleic acid in the unit on the upstream side. この際、流路の分岐点において核酸はほぼ等分に分割されて下流側のユニットに導入される。 In this case, the nucleic acid at a branch point of the channel is introduced is divided substantially equally by the unit on the downstream side. 例えば、下流側のユニットの数が2つである場合には、各ユニットに導入される核酸の濃度は、上流側のユニットにおける核酸の最終濃度のほぼ半分である。 For example, when the number of units on the downstream side is two, the concentration of the nucleic acid to be introduced in each unit is approximately half the final concentration of nucleic acid in the unit on the upstream side. したがって、核酸とプライマーとが結合する際に核酸同士が結合する確率が低くなり、DNA増幅反応を効率的に行なうことができる。 Therefore, the probability that nucleic acid are bonded to each other in the nucleic acid and primer binds is lowered, it is possible to carry out the DNA amplification reaction efficiently.

この装置では、1つのユニットの下流側での流路の分岐数は2つ以上であればよく、特に制限はない。 In this apparatus, the number of branches of the flow path at the downstream side of one unit may be two or more, it is not particularly limited. また、分岐したユニットの後でさらに流路を分岐して複数のユニットを設けて多段階の反応を行なうことも可能であり、その段階数にも制限はない。 The branches further passage after branched units it is also possible to provide a plurality of units performing multi-stage reaction, there is no limitation on the number of stages.

(13) (13)
前記(3)の装置において、第1の分岐流路と試料投入口との間の流路にゲル状化合物を充填する代わりに、径が 150μm以下の流路を設けたDNA増幅装置。 The apparatus of (3), instead of filling the gel-like compound in a flow path between the first branch flow path and the sample slot, DNA amplification device size provided the following flow channel 150 [mu] m.

前記(3)の装置においては、試料投入口から投入された試料から不純物を除去するために、アフィニティを利用したキャピラリ電気泳動を利用している。 The apparatus of the above (3), in order to remove the impurities from the sample which is introduced from the sample inlet, utilizes capillary electrophoresis utilizing affinity. キャピラリ電気泳動には、このアフィニティを利用するものの他に、毛管内の電気親和力を利用するものがある。 The capillary electrophoresis, in addition to the use of this affinity, it is intended to use the electron affinity in the capillaries. この装置は、流路の径を 150μm以下とすることにより、この電気親和力を利用したキャピラリ電気泳動を利用して不純物の分離を行なう。 This apparatus, by the diameter of the flow passage and 150μm or less, the separation of impurities using a capillary electrophoresis using the electron affinity. したがって、ゲル状化合物のような担体は不要であり、装置構成をより単純化し、コストをさらに低くすることができる。 Thus, a carrier such as a gel-like compound is required, it is possible to more simplify the apparatus configuration, the even lower cost.

本発明に従えば、無機もしくは有機基板上に形成されたプレーナ状の反応セルと、該反応セルに連通する2つの流路と、該流路の各々に前記反応セルを挟んで設けられた2つ弁と、少なくとも前記反応セルの底面もしくは前記基板の反応セルが形成された面の裏面のいずれか一方に設けられた加熱手段とを具備するDNA増幅装置が提供される。 According to the present invention, the planar shape of the reaction cell formed inorganic or organic substrate, provided across two and a flow path communicating with said reaction cell, said reaction cell in each of the flow paths 2 one and the valve, DNA amplification apparatus comprising a heating means provided in either the rear surface of the bottom or the surface of the reaction cell is formed of the substrate of at least the reaction cell is provided.

また、本発明の他の面から、無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路に設けられた2つの弁、該2つの弁の間の流路の底面に設けられた2つの電極、該2つの電極の間の流路の底面に設けられた少なくとも1つの温度検出手段、該少なくとも1つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なくともいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、前記2つの電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するDNA増幅装置が提供される。 Further, from another aspect of the present invention, inorganic or flow provided on an organic substrate path, two valves provided in the flow path, two provided on the bottom surface of the flow path between the two valves electrodes, at least one temperature detecting means provided on the bottom surface of the flow path between the two electrodes, each flow channel bottom surface or flow path of the substrate in the vicinity of one temperature sensing means said at least is provided in at least one of the back surface, each pair heating means provided at an of said temperature detecting means, voltage control means for controlling a voltage applied to the two electrodes, and from the temperature detecting means DNA amplification apparatus is provided having a heating control means for controlling the heating means based on the information.

本発明のさらに他の面から、無機もしくは有機基板上に設けられた流路、該流路の底面に設けられた第1ないし第4の電極、第1の電極と第2の電極との間に設けられた第1の弁、第1の電極と第1の弁との間に設けられた試料投入口、該試料投入口と第1の弁との間に位置し、底面に第5の電極を有する不純物導入セルに連通する第1の分岐流路、該第1の分岐流路と前記試料投入口との間の流路内に設けられたゲル状化合物、第1の弁と第2の電極との間に位置し、底面に第6の電極を有する貯留セルに連通する第2の分岐流路、第2の電極と第3の電極との間の流路底面に設けられた少なくとも1つの温度検出手段、該少なくとも1つの温度検出手段の各々の近傍の流路底面もしくは前記基板の流路が設けられている面の裏面の少なく Between the still another aspect of the present invention, inorganic or flow provided on an organic substrate path, first through fourth electrodes provided on the bottom surface of the flow path, the first electrode and the second electrode a first valve provided, a sample inlet provided between the first electrode and the first valve, located between the sample inlet and the first valve, the fifth to the bottom the first branch flow path in communication with the impurity introduction cell having an electrode, gel-like compound provided in the flow path between the first branch flow path and the sample slot, a first valve second at least positioned between the electrodes, the second branch flow passage communicating with the reservoir cell having a sixth electrode on the bottom, is provided in a flow path bottom between the second electrode and the third electrode one temperature sensing means, said at least a surface of the flow channel bottom surface or flow path of the substrate in the vicinity of each of the one temperature sensing means is provided backside of less もいずれか一方に、前記温度検出手段の各々と対をなして設けられた加熱手段、第3の電極と第4の電極との間に設けられたDNA検出手段、該DNA検出手段と第4の電極との間に設けられた第2の弁、前記第1ないし第6の電極に印加される電圧を制御する電圧制御手段、および前記温度検出手段からの情報に基づいて前記加熱手段を制御する加熱制御手段を具備するDNA増幅装置が提供される。 To either be, each paired heating means provided at an of said temperature detecting means, DNA detection means provided between the third electrode and the fourth electrode, said DNA detecting means and the fourth second valve provided between the electrodes, controlling the first to voltage control means for controlling a voltage applied to the sixth electrode, and said heating means based on information from the temperature detecting means DNA amplification apparatus is provided having a heating control means for.

[発明の効果] [Effect of the invention]
以上のように、この発明による第1のDNA増幅装置は、反応セルをプレーナ状とすることにより反応溶液をより迅速に加熱および冷却することが可能であり、DNA増幅反応に必要な熱サイクルで問題となる、反応溶液中に生じる温度勾配を小さくすることができる。 As described above, the first DNA amplification device according to the present invention, it is possible to more rapidly heat and cool the reaction solution by a reaction cell with planar shape, a thermal cycle required for DNA amplification reaction becomes a problem, the temperature gradient generated in the reaction solution can be reduced. また、加熱手段を設ける部位および加熱手段の材質を適当に選択することにより、さらに迅速に加熱および冷却を行なうことも可能である。 Moreover, by suitably selecting the material of the part and heating means for providing the heating means, it is possible to perform more rapid heating and cooling.

また、この発明による第2のDNA増幅装置は、流路内に満たされた反応溶液に電圧を印加し、反応溶液中の核酸、耐熱性DNA合成酵素、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸のみを所定の温度に維持された複数の領域の間で移動させてDNAの増幅反応を行なう。 Further, the invention according to a second DNA amplification device, a voltage is applied to the reaction solution filled in the flow path, the nucleic acid in the reaction solution, a thermostable DNA synthesizing enzymes, only the primers and deoxyribonucleoside triphosphates predetermined of moving between a plurality of regions which are maintained at a temperature in the amplification reaction of DNA. このため、最も熱容量の大きい溶媒を加熱、冷却する必要がなく、熱サイクルの際に生じる温度勾配の問題を解消することができる。 Therefore, the greatest solvent capacity of the heating, it is not necessary to cool, it is possible to eliminate the temperature gradient which occurs during thermal cycling problems. また、電気的な手段で溶液中の成分のみを移動させ、溶液の移動を伴わないため、ポンプ等の機械的な作動部材が不要であり、装置の小型化および低価格化が可能となる。 Also, electrical means to move only the components in the solution, since without moving of the solution, the mechanical actuation member, such as a pump is not necessary, it is possible to reduce the size and cost of the apparatus.

さらに、この発明による第3のDNA装置では、試料の投入から、DNAを増幅し、増幅したDNAを検出するまで全て電気的な動作で行なうことが可能であり、装置を非常に小型にすることができ、また低コスト化も可能である。 Furthermore, in accordance with a third DNA apparatus the present invention, the introduction of the sample, DNA was amplified, all until detecting the amplified DNA can be based on electrical operation, very possible to compact the device It can be also be also cost reduction. さらに、機械的な部材を必要としないことから全自動化も容易である。 Furthermore, it is easy to fully automated since it does not require a mechanical member.

この発明による第1のDAN増幅装置の一具体例の平面図。 Plan view of one embodiment of a first DAN amplifying apparatus according to the present invention. 図1に示す装置のA−A線断面図。 A-A line cross-sectional view of the device shown in FIG. この発明による第1のDNA増幅装置の別の具体例の平面図。 Plan view of another embodiment of the first DNA amplification apparatus according to the present invention. 図3に示す装置のB−B線断面図。 Sectional view taken along line B-B of the apparatus shown in FIG. この発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例の平面図。 Moreover plan view of another embodiment of the first DNA amplification apparatus according to the present invention. 図5に示す装置のC−C線断面図。 Sectional view taken along line C-C of the device shown in FIG. この発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例の平面図。 Moreover plan view of another embodiment of the first DNA amplification apparatus according to the present invention. 図7に示す装置のD−D線断面図。 D-D line cross-sectional view of the device shown in FIG. この発明による第1のDNA増幅装置のさらに別の具体例の平面図。 Moreover plan view of another embodiment of the first DNA amplification apparatus according to the present invention. 図9に示す装置のE−E線断面図。 The line E-E sectional view of the device shown in FIG. この発明による第2のDNA増幅装置の一具体例の平面図。 Plan view of one embodiment of a second DNA amplification apparatus according to the present invention. 図11に示す装置のF−F線断面図。 Line F-F sectional view of the device shown in FIG. 11. この発明による第2のDNA増幅装置の別の具体例の平面図。 Plan view of another embodiment of the second DNA amplification apparatus according to the present invention. 図13に示す装置のG−G線断面図。 Line G-G cross-sectional view of the device shown in FIG. 13. この発明による第2のDNA増幅装置のさらに別の具体例の平面図。 Moreover plan view of another embodiment of the second DNA amplification apparatus according to the present invention. 図15に示す装置のH−H線断面図。 Line H-H cross-sectional view of the device shown in FIG. 15. この発明による第2のDNA増幅装置のさらに別の具体例の平面図。 Moreover plan view of another embodiment of the second DNA amplification apparatus according to the present invention. 図17に示す装置のI−I線断面図。 Sectional view taken along line I-I of the device shown in FIG. 17. 図11ないし図18に示す装置のいずれかを1ユニットとする複数のユニットを、1つのユニットの下流に、分岐した流路を介して連結してなる装置の平面図。 Plan view of a plurality of units, downstream of one unit, formed by connecting through a branched flow path device according to any one unit of the apparatus shown in FIGS. 11 to 18. この発明による第3のDNA増幅装置の一具体例の平面図。 Plan view of one embodiment of a third DNA amplification apparatus according to the present invention.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

101、1101、2001…無機もしくは有機基板、 102、 701…反応セル、 103、 104、1102、2002…流路、 105、1103…透明基板、 106、 107、1104、1105、1905、1906、1907、2003、2004、2023…弁、 108、1106、1107、1108、1908、2005、2006、2007…加熱手段、 301、 302、1112、1113、1114、2011、2012、2013…温度検出手段、 501、 901…突起、1109、1110、1111、2008、2009、2010…発熱体制御手段、1115、1116、1701、1909、1910、1911、1912、2015、2016、2017、2020、2024、2027…電極、1117、2029…電圧制御手段、1301、2014…耐熱性DNA合成酵素、1501…冷却液流路、1702、2018…貯留セル、1703、1904、2019、2026…分岐流路、1901、1902、1903…ユニット、2021…試料投入口、2022…ゲル状化合物、2025…不純物セル、2028…DNA検出手段。 101,1101,2001 ... inorganic or organic substrate, 102, 701 ... reaction cell, 103, 104,1102,2002 ... passage, 105,1103 ... transparent substrate, 106, 107,1104,1105,1905,1906,1907, 2003,2004,2023 ... valve, 108,1106,1107,1108,1908,2005,2006,2007 ... heating means 301, 302,1112,1113,1114,2011,2012,2013 ... temperature detecting means, 501, 901 ... protrusion, 1109,1110,1111,2008,2009,2010 ... heating element control means, 1115,1116,1701,1909,1910,1911,1912,2015,2016,2017,2020,2024,2027 ... electrode, 1117, 2029 ... voltage control means, 1301,2014 ... thermostable DNA polymerase, 1501 ... coolant passage, 1702,2018 ... storage cell, 1703,1904,2019,2026 ... branch flow channel, 1901, 1902 and 1903 ... units, 2021 ... sample slot, 2022 ... gel compound, 2025 ... impurities cells, 2028 ... DNA detection means.

Claims (2)

  1. 無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する2つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、DNA増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、DNA増幅に必要なプライマー、DNA合成酵素および4種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離 A reaction portion formed on the inorganic or organic substrate, two and a flow path communicating with the reaction part, provided in either the rear surface of the bottom or the surface of the reaction portion is formed of said substrate of at least the reaction unit are, controllable heating means to a temperature required for DNA amplification, communicating with the flow path, a sample separation unit for separating the nucleic acids from the sample before nucleic acid isolation, such as whole blood or serum, and isolated nucleic acid, DNA amplification primers required, means for forming in said reaction cell a reaction solution containing a DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleic triphosphates, communicates via the branch passage between the separating portion and the reaction portion, said a discarding unit for discarding the components other than separated by the separating portion nucleic acid, communicating with the flow path, the reaction solution and the reaction solution was amplification reaction in the reaction section, is separated into a component remaining as nucleic acid amplification purpose separation を具備し、 Equipped with,
    該反応溶液分離部が、ゲル状化合物が充填された流路からなることを特徴とする DNA増幅装置。 The reaction solution separation part, DNA amplification device characterized by comprising a gel compound is filled flow paths.
  2. 無機もしくは有機基板上に形成された反応部と、該反応部に連通する2つの流路と、少なくとも前記反応部の底面もしくは前記基板の反応部が形成された面の裏面のいずれか一方に設けられ、DNA増幅に必要な温度に制御可能な加熱手段、前記流路と連通し、全血もしくは血清等の核酸分離前の試料から核酸を分離する試料分離部と、分離した核酸と、DNA増幅に必要なプライマー、DNA合成酵素および4種類のデオキシリボ三リン酸とを含む反応溶液を前記反応セルにおいて形成する手段と、前記分離部と前記反応部の間に分岐路を介して連通し、前記分離部で分離された核酸以外の成分を廃棄する廃棄部と、前記流路と連通し、前記反応部で増幅反応した反応溶液を、増幅した目的の核酸と残留する成分とに分離する反応溶液分離 A reaction portion formed on the inorganic or organic substrate, two and a flow path communicating with the reaction part, provided in either the rear surface of the bottom or the surface of the reaction portion is formed of said substrate of at least the reaction unit are, controllable heating means to a temperature required for DNA amplification, communicating with the flow path, a sample separation unit for separating the nucleic acids from the sample before nucleic acid isolation, such as whole blood or serum, and isolated nucleic acid, DNA amplification primers required, means for forming in said reaction cell a reaction solution containing a DNA polymerase and four kinds of deoxyribonucleic triphosphates, communicates via the branch passage between the separating portion and the reaction portion, said a discarding unit for discarding the components other than separated by the separating portion nucleic acid, communicating with the flow path, the reaction solution and the reaction solution was amplification reaction in the reaction section, is separated into a component remaining as nucleic acid amplification purpose separation を具備し、 Equipped with,
    該反応溶液分離部が、150μm以下の流路径を有する流路からなることを特徴とする DNA増幅装置。 The reaction solution separation part, DNA amplification device characterized by comprising a channel having the following channel diameter 150 [mu] m.
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