JP3897064B2

JP3897064B2 - Method for producing phenolic sugar ester

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Publication number: JP3897064B2
Application number: JP04396097A
Authority: JP
Inventors: 和明益田; 俊彦萩原; 英志石垣; 博明金子; 啓太郎菊田; 仁史青木
Original assignee: Nichirei Corp
Current assignee: Nichirei Corp
Priority date: 1996-02-27
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2007-03-22
Anticipated expiration: 2017-02-27
Also published as: JPH09322794A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素を用いたフェノール酸糖エステルの製造法、及びフェノール酸の一種であるフェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分として含有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フェノール酸エステルは種々の生理活性を有する。例えば、代表的なフェノール酸エステルであるフェルラ酸エステルには間脳の機能を調整する作用があることが知られている（特公昭43-1972 号公報）。また、フェルラ酸自体についても抗酸化作用（Toda S.,Kimura M. and Ohnishi M.:Planta Medical 57,8-10(1990) ）、抗炎症活性があることが知られている（Chawla,A,S.et al.Indian J.Exp.Biol）。
【０００３】
フェルラ酸糖エステルを製造する方法としては、タケノコや米ぬかなどの天然物から抽出する方法や、フェルラ酸と糖を脱水縮合させて合成する方法などが知られている。しかし、天然物から抽出する方法では、天然物中に含まれるフェルラ酸糖エステルが微量であるため、十分な量のフェルラ酸糖エステルを得るには大量の天然物原料が必要である。また、化学的に合成する方法は、収率が悪く、また、食品素材として使用するのに適していない。
【０００４】
糖エステルの合成法として、アルコールエステルと糖を水の少ない条件でリパーゼ等を作用させて合成する、いわゆるエステル交換法が知られている（特開昭62-195292 号公報、特開昭60-70094号公報、特開平5-168489号公報、特開60-227687 号公報）。しかし、フェルラ酸のカルボニル炭素の陰荷電圧が低いなどの理由から、未だにエステル置換法によりフェルラ酸糖エステルを含めフェノール酸糖エステルの合成に成功した例は知られていない。
【０００５】
ところで、炎症反応は、正常な状態では生体にとって必要な生体防御反応であるが、その行き過ぎは病的な状態をもたらすことになる。ＴＮＦは、当初腫瘍に対して傷害を与える物質として発見されたが、最近炎症反応に重要な役割を担っていることがわかった（山崎正利，炎症 10,163 ）。従って、ＴＮＦの産生を抑制することにより、病的な炎症状態を緩和することが可能である。このため、種々の物質についてＴＮＦ産生抑制活性が調べられてきたが、このような活性を有する物質は少なく、わずかにシソ抽出液やショウガ抽出液に見出されているにすぎない（特開平4-79852 号公報、山崎正利，食品の生体調節機能，423-430 頁，学会出版センター発行）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、種々の生理活性を有するフェノール酸糖エステルの効率的な製造法を提供するとともに、該化合物の一種であるフェルラ酸糖エステルの新たな用途を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、種々の反応条件を工夫することによりエステル交換法によりフェノール酸糖エステルを製造することに成功し、また、このフェノール酸糖エステルの一種であるフェルラ酸糖エステルが、ＴＮＦの産生を強く抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、フェノール酸アルコールエステルと糖とを、エステル結合を切断し得る酵素を用いて溶媒中で反応させることを特徴とするフェノール酸糖エステルの製造法である。
また、本発明は、フェルラ酸糖エステル又はフェルラ酸を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ産生抑制剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
１．フェノール酸糖エステルの製造法
本発明では、フェノール酸アルコールエステルと糖とを、酵素を用いて溶媒中で反応させることによりフェノール酸糖エステルを製造する。
【００１０】
ここで用いるフェノール酸アルコールエステルは、どのようなものでもよいが、エステルのフェノール酸相当部位は、フェルラ酸残基、ｐ−クマール酸残基、カフェー酸残基、シナピン酸残基又はケイヒ酸残基が好ましく、フェルラ酸残基が特に好ましい。また、エステルのアルコール相当部位は炭素数が１〜４の置換又は非置換のアルキル基が好ましく、特に炭素数が１〜４のハロゲン置換又は非置換のアルキル基が好ましい。ハロゲン置換アルキル基としては、フェノール酸とエステル結合し得るものであればどのようなものでもよいが、ハロゲン置換メチル基及びハロゲン置換エチル基が好ましく、特にハロゲン置換エチル基が好ましい。ハロゲン置換メチル基及びハロゲン置換エチル基としてはＣＣｌ₃−、ＣＨＣｌ₂−、ＣＨ₂Ｃｌ−、ＣＦ₃−、ＣＨＦ₂−、ＣＨ₂Ｆ−、ＣＢｒ₃−、ＣＨＢｒ₂−、ＣＨ₂Ｂｒ−、ＣＣｌ₃ＣＨ₂−、ＣＨＣｌ₂ＣＨ₂ −、ＣＨ₂ＣｌＣＨ₂−、ＣＦ₃ＣＨ₂ −、ＣＨＦ₂ＣＨ₂−、ＣＨ₂ＦＣＨ₂−、ＣＢｒ₃ＣＨ₂−、ＣＨＢｒ₂ＣＨ₂ −、ＣＨ₂ＢｒＣＨ₂−等を例示することができ、これらの中でも特にＣＣｌ₃ＣＨ₂−が好ましい。非置換アルキル基としては、ＣＨ₃−、Ｃ₂Ｈ₅−、Ｃ₃Ｈ₇−、Ｃ₄Ｈ₉−等を例示することができ、これらの中でも特にＣ₄Ｈ₉−が好ましい。フェノール酸アルコールは、フェノール酸とアルコールを硫酸存在下で脱水縮合させることにより合成できる。
【００１１】
本発明における糖とは、ポリアルコールのアルデヒド、ケトン、酸、さらにポリアルコール自身や、それらの誘導体、縮合体などをいい、単糖、オリゴ糖、多糖のいずれも含む。具体的には、アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース、マンノース、フコース、ガラクトースのような中性単糖、デキストリン、サイクロデキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトシュクロース、イソマルトオリゴ糖、セロオリゴ糖、セロビオースのような中性オリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、セルロース、マンナンのような中性多糖、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコールノイラミン酸のような酸性単糖、ポリシアル酸、ペクチン、アルギン酸、カラギーナンのような酸性多糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンのようなアミノ糖、キトオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、のようなアミノ糖のオリゴ糖、キチン、キトサンのようなアミノ糖の多糖などを例示することができる。
【００１２】
用いる酵素は、フェノール酸アルコールエステルのエステル結合を切断し得るものであればどのようなものでもよく、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、セリンプロテアーゼ等を使用することができる。リパーゼとしては、Wheat germ由来のリパーゼ、Porcine pancreas由来のリパーゼ、Candida cylindracea 由来のリパーゼ、Pseudomonas species 由来のリパーゼ（以上、Sigma 社製）、Aspergillus niger 由来のリパーゼ、Mucor javanicus 由来のリパーゼ、Candida rugosa由来のリパーゼ、Rhizopus species由来のリパーゼ（以上、天野製薬社製）、Candida cylindracea 由来のリパーゼ（名糖産業社製）、Rhizopus japonicus由来のリパーゼ（長瀬産業社製）などを用いることができる。エステラーゼとしては、Porcine liver 由来のエステラーゼ（Sigma 社製）、Streptomyces rochei 由来のカルボキシルエステラーゼ（和光純薬社製）、Candida cylindracea 由来のコレステロールエステラーゼ（生化学工業社製）、Bovine pancreas 由来のコレステロールエステラーゼ、Porcine liver 由来のコレステロールエステラーゼ、Pseudomonas species 由来のコレステロールエステラーゼ（以上Sigma 社製）等を用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、Bacillus thermoproteolyticus由来のサーモリシン、Bovine pancreas 由来のキモトリプシン、Bacillus licheniformis由来のズブチリシン（以上Sigma 社製）、Bacillus subtilis 由来のプロテアーゼ（天野製薬社製）等を用いることができる。また、上記酵素は、対ｐＨ及び温度、有機溶媒安定性改良、活性維持、再使用などを目的として適当な担体に固定化することもできる。固定化用担体としては、セルロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコース、イオン交換樹脂、磁性体、活性炭、アルミナ、光架橋体樹脂、アルギン酸塩、セライトなどを使用することができる。
【００１３】
用いる溶媒は、どのようなものでもよいが、水を溶媒とした場合、フェノール酸アルコールエステルが加水分解し、フェノール酸糖エステルの収率が悪くなる。また、ヘキサンのような無極性の溶媒では、フェノール酸アルコールエステル、フェノール酸糖エステルのいずれも溶解しにくいので好ましくない。従って、本発明においては、極性を有する溶媒を使用するのが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、tert- アミルアルコール、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等を挙げることができる。
【００１４】
フェノール酸アルコールエステルと糖の混合比は特に限定されないが、例えば、溶媒としてピリジンを用いた場合には、１０：１〜１：１０とするのが好ましく、３：１〜１：３とするのが更に好ましい。反応に使用する酵素の量は、フェノール酸アルコールエステル１g あたり、１００〜１００００００U とするのが好ましく、１０００〜１０００００U とするのが更に好ましい。反応温度は、用いる酵素の最適温度となるように設定すればよく、例えば、酵素としてPseudomonas species 由来のリパーゼ又はAspergillus niger 由来のリパーゼを用いた場合であれば２０〜５０℃が好ましく、４０〜４５℃が更に好ましい。反応時間は、酵素の量、反応温度等により反応速度が異なるので、反応の進み具合に応じて決めればよいが、通常、４８〜７２時間程度で十分な量のフェノール酸糖エステルが生成する。
【００１５】
得られた反応液からフェノール酸糖エステルを単離精製するには、まず、反応液を遠心分離（例えば、１５０００rpm ，５min ）し、上清を孔径０．２２μm 程度のフィルターで、酵素等の不溶物を除去する。次に、得られた溶液を濃縮乾固し、蒸留水を加え、水溶性画分を分離する。この水溶液画分から、例えば、InertsilＯＤＳカラムを用いた（溶出液３０％メタノール）ＨＰＬＣで、フェノール酸糖エステル画分を分離することができる。
【００１６】
２．フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分とするＴＮＦ産生抑制剤
本発明のＴＮＦ産生抑制剤は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分として含有する。
【００１７】
フェルラ酸は試薬として市販されているので、それを用いることができる。フェルラ酸糖エステルは、上記のようにフェルラ酸糖エステルと糖から酵素を用いて製造できるほか、米ぬかのようなフェルラ酸糖エステルを含む天然物から抽出することもできる。米ぬかからフェルラ酸糖エステルを抽出する方法は、例えば、Ishii and Hiroi の方法（Ishii T. and Hiroi T.:Carbohydr.,206,297,1990 ）に従って行うことができる。この方法では、ホモジナイズした米ぬかを脱脂した後、ドリセラーゼで処理し、カラムクロマトグラフィーによりフェルラ酸糖エステルを単離精製する。
【００１８】
フェルラ酸及びフェルラ酸糖エステルは、ＴＮＦの産生を抑制する作用を持つ。前述の如くＴＮＦは、炎症反応と密接に関係するので、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを製剤化して人体に投与することにより病的な炎症を抑制することができる。
【００１９】
本ＴＮＦ産生抑制剤の人体への投与方法は、特に制限されず、経口、非経口、又は吸引により投与されるが、経口投与が一般的に好ましい。また、クリームなどに製剤化して皮膚炎症部に塗布する外用薬としても用いることができる。
【００２０】
本ＴＮＦ産生抑制剤は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルに、薬理的に許容しうる固体又は液体の製剤担体を配合することができる。製剤化されたＴＮＦ産生抑制剤は、注射剤、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、水剤、シロップ剤、懸濁剤、又は乳剤等の形態を採ることができる。製剤担体としては、かかる形態に通常用いられる、賦形剤、結合剤、滑沢剤、被覆剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁剤、安定化剤、溶剤等を挙げることができる。製剤中におけるフェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルの濃度は、その製剤形態に応じて決めればよい。本ＴＮＦ産生抑制剤の人体への投与量は、製剤形態、治療すべき症状等により異なるが、通常は成人一日当たり、５〜２０mg/kg （体重）が適当である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
【００２２】
【実施例】
〔実施例１〕フェルラ酸糖エステルの製造
＜フェルラ酸トリクロロエチルの合成＞
フェルラ酸（築野食品工業社製）３．８８g をベンゼン１５０ml中に懸濁し、トリクロロエタノール８．９６g 、硫酸０．５ml、そしてモレキュラーシーブ４Ａ（和光純薬社製）を５g 加え、１時間還流した。冷後、反応液を精製水１００mlで２回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。この残渣をシリカゲル（１０g ）カラムクロマトグラフィーに負荷し、クロロホルムで溶出し、フェルラ酸トリクロロエチル３．２mlを得た。
【００２３】
＜フェルラ酸ブチルの合成＞
フェルラ酸１０g をｎ−ブタノール２００mlに溶解し、この混合液に濃硫酸６mlを加え、沸石を少量加えて、冷却管をセットしたナスフラスコ内で１時間還流加熱する。反応液は炭酸ナトリウムで中和後、生成したフェルラ酸ブチルを酢酸エチルで抽出し、濃縮乾固した。このようにして得られたフェルラ酸ブチルの収量は１１．９g であった。
【００２４】
＜フェルラ酸糖エステルの合成＞
あらかじめ８０℃以上に加温したピリジン１mlに糖を８０mg溶解させ、冷後、上記で得られたフェルラ酸アルコールエステル２００mgを溶解させ、次いで、Pseudomonas species 由来のリパーゼ（２５U/mg，シグマ社製）２４mg又はAspergillus niger 由来のリパーゼ（６０U/mg，天野製薬社製）２００mgを加えて、４０℃、１〜７日撹拌し、反応を行った。反応に用いた糖、フェルラ酸アルコールエステル及びリパーゼの組み合わせは、下記の通りである。
【００２５】

【００２６】
上記で得られた反応液を薄層板の一端にスポットし、薄層クロマトグラフィーにより、フェルラ酸糖エステルの生成を確認した。薄層板は、Merck 社製のＲＰ−１８Ｆ_254s（０．２５mm,glass）プレートを使用し、３０％メタノールを移動相に用いて展開を行った。スポットの確認は、検出波長２５４nmおよび３６５nmで行い、糖の検出は、アニリン、ジフェニルアミン、リン酸、アセトン（４ml：４g ：３０ml：２００ml）の混合液を噴霧し、ホットプレート上で加熱して発色させた。
【００２７】
結果を図１、図２、及び図３に示す。図１は糖を発色させた場合、図２は検出波長を３６５nmとした場合、図３は検出波長を２５４nmとした場合を示す。図中の番号は下記のものを示す。
【００２８】
１：後述するFr.5、２：後述するFr.6、３：フェルラ酸、４：反応液Ａ、５：反応液Ｂ、６：反応液Ｃ、７：反応液Ｄ、８：反応液Ｅ、９：反応液Ｆ
【００２９】
図１が示すように、レーン４〜９において、フェルラ酸よりも極性の高い位置に糖の発色で検出されるスポットが確認された。この物質は、図２及び図３が示すように２５４nm及び３６５nmの波長の光でも検出することができた。各レーンのＲｆ値は、レーン１が０．２５、レーン２が０．１４、レーン３が０．１０、レーン４が０．１９、レーン５が０．１９、レーン６が０．１２、レーン７が０．１２、レーン８が０．１６、レーン９が０．１６であった。以上の結果から、反応液Ａ、Ｂ、Ｅ、及びＦではフェルラ酸グルコースが、反応液Ｃではフェルラ酸アラビノースが、反応液Ｄではフェルラ酸キシロースが、それぞれ生成していたことが確認された。
【００３０】
〔実施例２〕
＜フェルラ酸糖エステルの分離精製＞
市販の米ぬかに、その６倍量の蒸留水を加え、ホモジナイズし、ステンレス製の分析ふるい（４０−６０メッシュ）上で濾過した。さらに２４倍量の蒸留水で洗浄後、６倍量のエタノールで洗浄した。残渣に６倍量のベンゼン：エタノール（２：１）を加え、室温で、１７〜２０時間脂質を抽出した。分析ふるいを用いて脂質抽出液を除去した後、残渣を３倍量のベンセン：エタノール（２：１）、次に６倍量のアセトンで洗浄し、脱脂米ぬかを調製した。
【００３１】
得られた脱脂米ぬかに５０倍量の蒸留水を加え懸濁後、精製ドリセラーゼを１８０mg/lの割合で添加し、酢酸でｐＨを５に調整した。３０℃、１５時間インキュベート後、１００℃、１５分間の加熱で反応を停止させた。サラシ布を用いてろ液を分離し、エバポレーターにて濃縮した。濃縮液に５倍量のエタノールを加え、一晩放置後ろ紙で不溶物を除去した。なお、精製ドリセラーゼは、協和醗酵より購入したドリセラーゼをFry の方法（Fry S.C.:Biochem.J.203,493,1982 ）で精製して調製した。また、このとき、ドリセラーゼのセルラーゼ活性及びキシラナーゼ活性を、アビセル及びキシランを基質として、精製した還元糖量測定して求めた（Somogyi M.:J.Biol. Chem.,195,19,1952, Nelson N.:J.Biol. Chem.,153,375,1944）。
【００３２】
得られたエタノール可溶性物質をSephadex LH-20（φ２．６×９０cm）で分画した。溶出液は、蒸留水を用いた。ピークの検出は３２０nmのＵＶ吸収でフェノール酸を検出し、フェノール硫酸法（Dubois M.et al.:Anal.Chem.,28,350,1956）によって処理反応後４９０nmで糖の検出を行った。この分画操作で、フェルラ酸糖エステル画分フラクション５（Fr.5）及びフラクション６（Fr.6）を分離した。
【００３３】
＜腫瘍壊死因子産生抑制試験＞
７週令の近交系Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雌マウス（日本生物材料（株）より購入）に下記の各試験液０．４mlとムラミルジペプチド２７mg/kg を同時に経口投与した。
【００３４】
（１）１％フェルラ酸、（２）５％フェルラ酸、（３）シソエキス（アミノアップ化学製）、（４）１％Fr.5、（５）１％Fr.6、（６）５％Fr.6、（７）蒸留水
【００３５】
（対照）
３時間後、リポポリサッカロイド２５μg を静脈内投与した。そして、２時間後、心臓より採血を行い、血清を分離した。血清の採取には、各試験液ごと３匹のマウスを使用した。
【００３６】
Ｌ９２９細胞（大日本製薬社製）を９６well平底プレートに、８．０×１０⁴ 個／１００μl ／wellになるようにまき、これに上記で得られた試料血清の１０〜１０⁸ 倍希釈液を５０μl 加えた。Ｌ９２９細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ニチレイ（株））を含むEagle's minimal essential medium（ＥＭＥＭ）で３〜４日おきに継代しているものを用いた。また、各wellには、感受性を増強させるためアクチノマイシンＤ（和光純薬社製）を培養液中に最終濃度が１μg/mlになるように加え、３７℃、５％ＣＯ₂ 条件下にて１８時間培養した。培地を除いた後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット−２０％メタノールを２５μl/well加え、２０分間染色した。そして、各wellをＰＢＳで洗い、乾燥してから、０．５％ＳＤＳを１００μl/well加え、マイクロミキサーにて振盪し、マイクロプレートレーダー（Bio-Rad 製）で５４０nmの吸光度を測定した。血清中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の量（Ｕ）は、５０％の殺細胞活性濃度を１Ｕとして算出した。結果を図４に示す。
【００３７】
図４が示すように、従来からＴＮＦ産生抑制効果があることが知られていたシソエキスのみならず、フェルラ酸、Fr.5及びFr.6のいずれもＴＮＦ産生を抑制した。特にFr.6の場合は、５％濃度で投与したときには、ＴＮＦの産生量を８０％も抑制した。一方、フェルラ酸の場合は、５％まで濃度を上げても、Fr.6のような大きな抑制効果は認められなかった。
【００３８】
〔参考例１〕ポリエチレングリコール修飾酵素の調製
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾酵素の調製はInada らの方法（Inada Y.et al:Biochemical and Biophysical Reseach Communications.,122,845,1984）に従って行った。まず、０．４M ホウ酸バッファー（ｐＨ１０）３．２mlにCandida cylindracea 由来のリパーゼ（名糖産業社製）１８mgを溶解し、この溶液に塩化シアヌルで活性化したメトキシポリエチレングリコール（活性化ＰＥＧ、シグマ社製）を０．８g 添加して３７℃、１時間撹拌した。０．１M ホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１００ml加えて反応を停止させた後、未反応のＰＥＧを限外濾過（Amicon PM30 メンブレン）により除去した。次に、蒸留水中で透析を行い、凍結乾燥して、白色の乾燥物を得た。
【００３９】
〔実施例３〕
＜フェルラ酸グルコースエステルの合成＞
フェルラ酸１００g をトリクロロエタノール５００g に溶解し、硫酸０．５ml、モレキュラーシーブ（ＭＳ）４Ａを加え、７０℃、１時間反応させた。冷後、トリクロロエタノールを留去し、残渣をシリカゲル（ワコーゲルC-200 、７５０g ）カラムクロマトグラフに負荷し、クロロホルム：メタノール（50：１）で反応成績体を溶出させ、約１００g のフェルラ酸トリクロロエチルを得た。生成物の純度は、Inertsil Silカラム（ＧＬサイエンス製）を用いたＨＰＬＣで分析した。また、生成物の分子量は、ガス質量分析器（島津QP-5000 ）で分析した。
【００４０】
無水硫酸ナトリウムで脱水したピリジン５００mlにＤ−グルコース４０g を溶解させ、この溶液に上記のフェルラ酸トリクロロエチルを４０g 溶解させた。次に、この溶液にリパーゼＡ６（天野製薬製）を添加し、４０℃で３日間反応させた。
【００４１】
得られた酵素合成反応液の不溶物を濾紙（Advantec 5A ）で除去した後、溶媒を留去し、メタノールに溶解した。メタノール可溶画分を蒸留水に再溶解して遠心分離後、上清をＣ−１８（ＧＬサイエンス製）カラムで精製した。蒸留水で溶出後、３０％エタノール、メタノールで順次溶出した。３０％メタノール溶出画分を濃縮した後、逆相ＨＰＬＣ（Inertsil ODS-80A：ＧＬサイエンス）で精製したところ、ピークａ〜ｄの４つのピークが認められた（図５）。これらの成分の中からピークａの成分のみを再び逆相ＨＰＬＣで分離したところ、ピークａとピークｃの２つの成分に分離した（図６）。このように２つのピークは、グルコースのアノマー構造の違いによるものと考え、ピークａとピークｃの成分を混合物のまま以下の構造解析を行った。
【００４２】
＜赤外吸収スペクトル（ＩＲ）測定＞
ＩＲ測定は、FTIR-8200PC （島津製作所製）によりＫＢｒ錠剤法で行った。測定の結果、３４００cm^-1付近に−ＯＨ（伸縮）、２９４０cm^-1付近に−ＣＨ（伸縮）と−ＣＨ₂及びＣＨ₃（逆対称伸縮）、１６９２cm^-1に−Ｃ＝Ｏ（伸縮）、１６３２cm^-1に芳香族の−Ｃ＝Ｃ−（伸縮）、１５９９cm^-1、１５１８cm^-1に芳香族の−Ｃ＝Ｃ−（面内骨格振動）、指紋領域で９００〜８００cm^-1に糖のタイプ吸収に由来する吸収体が認められた。
フェルラ酸でみられた１６６７cm^-1の吸収は、１６９２cm^-1へと高波数側にシフトしていたことから、エステル結合の存在が考えられた。
【００４３】
＜ＦＡＢ−ＭＳ測定＞
ＦＡＢ−ＭＳ測定は、ZAB-HF質量分析計（ＶＧ社）で行った。マトリックスにはグリセロールを用い、イオン加速電圧は８．０kVで測定を行った。測定の結果、 positive ＦＡＢ−ＭＳはm/z 357(M+H)⁺に（図７）、 negative ＦＡＢ−ＭＳはm/z 355(M-H)^-に（図８）、強い分子イオンピークが認められた。この結果より、合成物の分子量は、３５６であり、フェルラ酸とグルコースがエステル結合した分子量に等しいことが明らかとなった。
【００４４】
＜核磁気共鳴スペクトル測定＞
ＮＭＲ測定には、UNITY INOVA 600 型を使用した。¹Ｈ−ＮＭＲの場合は、溶媒に５％ＣＤ₃ＯＤを含むＤ₂Ｏを使用し、ＨＤＯを内部標準として測定した。¹³Ｃ−ＮＭＲは、内部標準としてＣＤ₃ＯＤを使用した。また、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ測定、ＨＭＱＣ（¹Ｈ観測ＣＨ−ＣＯＳＹ）測定も行った。¹Ｈ−ＮＭＲの測定結果を表１に、¹³Ｃ−ＮＭＲの測定結果をを表２に示す。
【００４５】
【表１】

【００４６】
【表２】

【００４７】
¹Ｈ−ＮＭＲより、グルコースのアノメリックプロトンの化学シフトが確認され、ピークａ、ｃはアノマー構造の違いによるものと考えられた。さらに結合定数Ｊ_7.8が15.9Hzであったことは、フェルラ酸がトランス体として存在していることを示している。また、¹³Ｃ−ＮＭＲより、フェルラ酸の結合位置は、未置換のグルコースのＣ−６位の６２ppm シグナルが観察されず、６４．５ppm に低磁場シフトしていたので、フェルラ酸はグルコース残基のＣ−６位に結合していることが示された。すなわち、ピークａは６−Ｏ−フェルロイル−β−グルコピラノシドで、ピークｃは６−Ｏ−フェルロイル−α−グルコピラノシドということが明らかになった（図９）。
【００４８】
【発明の効果】
本発明は、エステル置換反応を利用したフェノール酸糖エステルの新規な製造法を提供する。
また、本発明は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分とする新規なＴＮＦ産生抑制剤を提供する。ＴＮＦは、人体における炎症に関連するサイトカインであるので、この産生を抑制する本抑制剤は、抗炎症剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図２】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図３】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図４】フェルラ酸糖エステル画分のマウスのＴＮＦ産生抑制効果を示す図である。
【図５】３０％メタノール溶出画分の逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図６】ピークａの成分の逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図７】ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（正イオン）を示す図である。
【図８】ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（負イオン）を示す図である。
【図９】フェルラ酸グルコースエステルの構造を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a phenolic acid sugar ester using an enzyme, and a tumor necrosis factor (TNF) production inhibitor containing ferulic acid or a ferulic acid sugar ester which is a kind of phenolic acid as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Phenolic acid esters have various physiological activities. For example, it is known that ferulic acid ester, which is a typical phenolic acid ester, has an action of adjusting the function of the diencephalon (Japanese Patent Publication No. 43-1972). Ferulic acid itself is also known to have antioxidant activity (Toda S., Kimura M. and Ohnishi M .: Planta Medical 57,8-10 (1990)) and anti-inflammatory activity (Chawla, A S. et al. Indian J. Exp. Biol).
[0003]
As a method for producing ferulic acid sugar ester, a method of extracting from natural products such as bamboo shoots and rice bran, a method of synthesizing ferulic acid and sugar by dehydration condensation, and the like are known. However, in the method of extracting from a natural product, since a small amount of ferulic acid sugar ester is contained in the natural product, a large amount of natural material raw material is required to obtain a sufficient amount of ferulic acid sugar ester. Moreover, the chemical synthesis method has a low yield and is not suitable for use as a food material.
[0004]
As a method of synthesizing a sugar ester, a so-called transesterification method is known in which an alcohol ester and a sugar are synthesized by the action of lipase or the like under a condition with little water (Japanese Patent Laid-Open Nos. 62-195292 and 60-61). 70094, JP-A 5-168489, JP-A 60-227687). However, there are no known examples of successful synthesis of phenolic sugar esters including ferulic acid sugar esters by the ester substitution method because of the low negative voltage of the carbonyl carbon of ferulic acid.
[0005]
By the way, the inflammatory reaction is a biological defense reaction necessary for a living body in a normal state, but excessively leading to a pathological state. Although TNF was first discovered as a substance that damages tumors, it has recently been found to play an important role in the inflammatory response (Masatoshi Yamazaki, Inflammation 10,163). Therefore, it is possible to alleviate a pathological inflammatory state by suppressing the production of TNF. For this reason, TNF production inhibitory activity has been investigated for various substances, but there are few substances having such activity, and only a few have been found in perilla extract and ginger extract (Japanese Patent Laid-Open No. 4). -79852, Masatoshi Yamazaki, Bioregulatory function of food, pp. 423-430, published by Academic Publishing Center).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to provide an efficient method for producing phenolic sugar esters having various physiological activities and to provide a new use of ferulic acid sugar ester which is one of the compounds.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in producing phenolic sugar esters by transesterification by devising various reaction conditions. It has been found that a ferulic acid sugar ester which is a kind of ester strongly suppresses the production of TNF, and has completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention is a method for producing a phenolic acid sugar ester, characterized in that a phenolic alcohol ester and a sugar are reacted in a solvent using an enzyme capable of cleaving an ester bond.
Moreover, this invention is a TNF production inhibitor characterized by containing ferulic-acid sugar ester or ferulic acid as an active ingredient.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
1. Method for Producing Phenolic Acid Sugar Ester In the present invention, a phenolic acid sugar ester is produced by reacting a phenolic alcohol ester and a sugar in a solvent using an enzyme.
[0010]
Any phenolic alcohol ester may be used here, but the phenolic acid equivalent site of the ester may be ferulic acid residue, p-coumaric acid residue, caffeic acid residue, sinapinic acid residue or cinnamic acid residue. Groups are preferred, and ferulic acid residues are particularly preferred. Further, the alcohol-corresponding portion of the ester is preferably a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably a halogen substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. Any halogen-substituted alkyl group may be used as long as it can form an ester bond with phenolic acid, but a halogen-substituted methyl group and a halogen-substituted ethyl group are preferable, and a halogen-substituted ethyl group is particularly preferable. CCl ₃ is halogen substituted methyl group and halogen-substituted ethyl group _{_{-, CHCl 2 -, CH 2}} Cl-, CF 3 -, CHF 2 -, CH 2 F-, CBr 3 -, CHBr 2 -, CH 2 Br-, _{_{_{CCl 3 CH 2 -, CHCl 2}}} CH 2 -, CH 2 ClCH 2 -, CF 3 CH 2 -, CHF 2 CH 2 -, CH 2 FCH 2 -, CBr 3 CH 2 -, CHBr 2 CH 2 -, CH 2 BrCH ₂ — and the like can be exemplified, and among these, CCl ₃ CH ₂ — is particularly preferable. Examples of the unsubstituted alkyl group include CH ₃ —, C ₂ H ₅ —, C ₃ H ₇ —, C ₄ H ₉ —, etc. Among these, C ₄ H ₉ — is particularly preferable. The phenolic alcohol can be synthesized by dehydrating condensation of phenolic acid and alcohol in the presence of sulfuric acid.
[0011]
The saccharide in the present invention refers to polyalcohol aldehyde, ketone, acid, polyalcohol itself, derivatives or condensates thereof, and includes any of monosaccharide, oligosaccharide, and polysaccharide. Specifically, neutral monosaccharides such as arabinose, xylose, glucose, fructose, mannose, fucose, galactose, dextrin, cyclodextrin, maltose, maltooligosaccharide, fructooligosaccharide, lactosucrose, isomaltoligosaccharide, cellooligosaccharide, Neutral oligosaccharides such as cellobiose, neutral polysaccharides such as amylose, amylopectin, cellulose, mannan, acidic monosaccharides such as ascorbic acid, N-acetylneuraminic acid, N-glycolneuraminic acid, polysialic acid, pectin Amino sugars such as alginic acid, carrageenan, amino sugars such as N-acetylglucosamine and N-acetylgalactosamine, chitooligosaccharides, chitosan oligosaccharides, amino sugars such as chitin and chitosan The like can be exemplified polysaccharides.
[0012]
Any enzyme can be used as long as it can cleave the ester bond of phenolic alcohol ester. For example, lipase, esterase, serine protease and the like can be used. Lipases from Wheat germ, lipase from Porcine pancreas, lipase from Candida cylindracea, lipase from Pseudomonas species (from Sigma), lipase from Aspergillus niger, lipase from Mucor javanicus, Candida rugosa Lipase derived from Rhizopus species (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), lipase derived from Candida cylindracea (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.), lipase derived from Rhizopus japonicus (manufactured by Nagase Sangyo Co., Ltd.), and the like. Examples of esterases include Porcine liver-derived esterase (Sigma), Streptomyces rochei-derived carboxylesterase (Wako Pure Chemical Industries), Candida cylindracea-derived cholesterol esterase (Seikagaku Corporation), Bovine pancreas-derived cholesterol esterase, For example, cholesterol esterase derived from Porcine liver, cholesterol esterase derived from Pseudomonas species (manufactured by Sigma) and the like can be used. As the serine protease, thermolysin derived from Bacillus thermoproteolyticus, chymotrypsin derived from Bovine pancreas, subtilisin derived from Bacillus licheniformis (manufactured by Sigma), protease derived from Bacillus subtilis (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), and the like can be used. The enzyme can also be immobilized on a suitable carrier for the purpose of improving pH and temperature, organic solvent stability, maintaining activity, and reusing. As the carrier for immobilization, cellulose, dextran, polystyrene, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, ion exchange resin, magnetic material, activated carbon, alumina, photocrosslinked resin, alginate, celite and the like can be used.
[0013]
Any solvent may be used. However, when water is used as the solvent, the phenolic alcohol ester is hydrolyzed and the yield of the phenolic sugar ester is deteriorated. In addition, a nonpolar solvent such as hexane is not preferable because both the phenolic alcohol ester and the phenolic sugar ester are difficult to dissolve. Therefore, in the present invention, it is preferable to use a solvent having polarity. Specific examples include methanol, ethanol, isopropanol, isobutanol, acetone, dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, dimethylformamide, pyridine, dimethyl sulfoxide, 2-pyrrolidone, tert-amyl alcohol, ethyl ether, isopropyl ether, and the like. .
[0014]
The mixing ratio of the phenolic alcohol ester and the sugar is not particularly limited. For example, when pyridine is used as the solvent, it is preferably 10: 1 to 1:10, and 3: 1 to 1: 3. Is more preferable. The amount of enzyme used in the reaction is preferably 100 to 1000000 U, more preferably 1000 to 100000 U, per 1 g of phenolic alcohol ester. What is necessary is just to set reaction temperature so that it may become the optimal temperature of the enzyme to be used, for example, when the lipase derived from Pseudomonas species or the lipase derived from Aspergillus niger is used as an enzyme, 20-50 degreeC is preferable, 40-45 More preferred is ° C. The reaction time varies depending on the amount of enzyme, reaction temperature, and the like, and may be determined according to the progress of the reaction. Usually, a sufficient amount of phenolic sugar ester is produced in about 48 to 72 hours.
[0015]
In order to isolate and purify the phenolic acid ester from the obtained reaction solution, first, the reaction solution is centrifuged (for example, 15000 rpm, 5 min), and the supernatant is filtered with a filter having a pore size of about 0.22 μm to insoluble enzymes and the like. Remove objects. Next, the obtained solution is concentrated to dryness, distilled water is added, and the water-soluble fraction is separated. From this aqueous solution fraction, for example, the phenolic acid sugar ester fraction can be separated by HPLC using an Inertsil ODS column (eluent 30% methanol).
[0016]
2. TNF production inhibitor containing ferulic acid or ferulic acid sugar ester as an active ingredient The TNF production inhibitor of the present invention contains ferulic acid or ferulic acid sugar ester as an active ingredient.
[0017]
Since ferulic acid is commercially available as a reagent, it can be used. Ferulic acid sugar ester can be produced from ferulic acid sugar ester and sugar as described above using an enzyme, and can also be extracted from a natural product containing ferulic acid sugar ester such as rice bran. The method for extracting ferulic acid sugar ester from rice bran can be performed, for example, according to the method of Ishii and Hiroi (Ishii T. and Hiroi T .: Carbohydr., 206, 297, 1990). In this method, homogenized rice bran is defatted, then treated with doriserase, and ferulic acid sugar ester is isolated and purified by column chromatography.
[0018]
Ferulic acid and ferulic acid sugar ester have the effect | action which suppresses production of TNF. As described above, since TNF is closely related to the inflammatory reaction, pathological inflammation can be suppressed by formulating ferulic acid or ferulic acid sugar ester and administering it to the human body.
[0019]
The method for administering the TNF production inhibitor to the human body is not particularly limited, and oral, parenteral, or inhalation is used, but oral administration is generally preferred. It can also be used as a topical medicine that is formulated into a cream or the like and applied to the skin inflammation site.
[0020]
The present TNF production inhibitor can be mixed with ferulic acid or ferulic acid sugar ester with a pharmacologically acceptable solid or liquid pharmaceutical carrier. The formulated TNF production inhibitor can take the form of injections, tablets, capsules, powders, fine granules, liquids, syrups, suspensions, or emulsions. Examples of the pharmaceutical carrier include excipients, binders, lubricants, coating agents, solubilizers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, solvents and the like that are usually used in such forms. The concentration of ferulic acid or ferulic acid sugar ester in the preparation may be determined according to the form of the preparation. The dose of the present TNF production inhibitor to the human body varies depending on the preparation form, symptoms to be treated, etc., but usually 5 to 20 mg / kg (body weight) per day for an adult is appropriate.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0022]
【Example】
[Example 1] Production of ferulic acid sugar ester <Synthesis of trichloroethyl ferulate>
3.88 g of ferulic acid (manufactured by Tsukino Food Industry Co., Ltd.) is suspended in 150 ml of benzene, 8.96 g of trichloroethanol, 0.5 ml of sulfuric acid, and 5 g of molecular sieve 4A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are added and refluxed for 1 hour. did. After cooling, the reaction solution was washed twice with 100 ml of purified water, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. This residue was loaded on silica gel (10 g) column chromatography and eluted with chloroform to obtain 3.2 ml of trichloroethyl ferulate.
[0023]
<Synthesis of butyl ferulate>
10 g of ferulic acid is dissolved in 200 ml of n-butanol, 6 ml of concentrated sulfuric acid is added to this mixed solution, a small amount of zeolite is added, and the mixture is refluxed and heated in an eggplant flask equipped with a condenser. The reaction solution was neutralized with sodium carbonate, and the resulting butyl ferulate was extracted with ethyl acetate and concentrated to dryness. The yield of butyl ferulate thus obtained was 11.9 g.
[0024]
<Synthesis of ferulic acid sugar ester>
80 mg of sugar is dissolved in 1 ml of pyridine that has been heated to 80 ° C. or higher in advance, and after cooling, 200 mg of ferulic acid alcohol ester obtained above is dissolved, and then lipase derived from Pseudomonas species (25 U / mg, manufactured by Sigma) 24 mg or 200 mg of lipase derived from Aspergillus niger (60 U / mg, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 to 7 days for reaction. Combinations of sugar, ferulic acid alcohol ester and lipase used in the reaction are as follows.
[0025]

[0026]
The reaction solution obtained above was spotted on one end of a thin layer plate, and the production of ferulic acid sugar ester was confirmed by thin layer chromatography. The thin layer plate used was a RP-18F _254s (0.25 mm, glass) plate manufactured by Merck and developed using 30% methanol as the mobile phase. Spots are confirmed at detection wavelengths of 254 nm and 365 nm, and sugars are detected by spraying a mixture of aniline, diphenylamine, phosphoric acid and acetone (4 ml: 4 g: 30 ml: 200 ml) and heating on a hot plate to develop color. I let you.
[0027]
The results are shown in FIG. 1, FIG. 2, and FIG. 1 shows a case where sugar is developed, FIG. 2 shows a case where the detection wavelength is 365 nm, and FIG. 3 shows a case where the detection wavelength is 254 nm. The numbers in the figure indicate the following.
[0028]
1: Fr.5 described later, 2: Fr.6 described later, 3: Ferulic acid, 4: Reaction solution A, 5: Reaction solution B, 6: Reaction solution C, 7: Reaction solution D, 8: Reaction solution E , 9: Reaction solution F
[0029]
As shown in FIG. 1, in lanes 4 to 9, spots detected by color development of sugar were confirmed at positions having higher polarity than ferulic acid. As shown in FIGS. 2 and 3, this substance could be detected even with light having wavelengths of 254 nm and 365 nm. The Rf values for each lane are 0.25 for lane 1, 0.14 for lane 2, 0.10 for lane 3, 0.19 for lane 4, 0.19 for lane 5, 0.12 for lane 6, lane 7 was 0.12, lane 8 was 0.16, and lane 9 was 0.16. From the above results, it was confirmed that in the reaction liquids A, B, E, and F, ferulic acid glucose was generated, in the reaction liquid C, ferulic acid arabinose was generated, and in the reaction liquid D, ferulic acid xylose was generated.
[0030]
[Example 2]
<Separation and purification of ferulic acid sugar ester>
Six times the amount of distilled water was added to commercially available rice bran, homogenized, and filtered on a stainless steel analytical sieve (40-60 mesh). Further, after washing with 24 times the amount of distilled water, it was washed with 6 times the amount of ethanol. Six times the amount of benzene: ethanol (2: 1) was added to the residue, and lipids were extracted at room temperature for 17-20 hours. After removing the lipid extract using an analytical sieve, the residue was washed with 3 volumes of benzene: ethanol (2: 1) and then 6 volumes of acetone to prepare defatted rice bran.
[0031]
To the resulting defatted rice bran, 50 times the amount of distilled water was added and suspended, and then purified doriserase was added at a rate of 180 mg / l, and the pH was adjusted to 5 with acetic acid. After incubation at 30 ° C. for 15 hours, the reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 15 minutes. The filtrate was separated using a smooth cloth and concentrated with an evaporator. Five times the amount of ethanol was added to the concentrate and left overnight to remove insolubles with a back paper. The purified doriserase was prepared by purifying dorycelase purchased from Kyowa Hakko in accordance with the method of Fry (Fry SC: Biochem. J. 203, 493, 1982). At this time, the cellulase activity and xylanase activity of doriserase were determined by measuring the amount of purified reducing sugar using Avicel and xylan as substrates (Somogyi M .: J. Biol. Chem., 195, 19, 1952, Nelson). N .: J. Biol. Chem., 153, 375, 1944).
[0032]
The obtained ethanol-soluble substance was fractionated with Sephadex LH-20 (φ2.6 × 90 cm). Distilled water was used as the eluent. For detection of the peak, phenolic acid was detected by UV absorption at 320 nm, and sugar was detected at 490 nm after the treatment reaction by the phenol sulfuric acid method (Dubois M. et al .: Anal. Chem., 28, 350, 1956). By this fractionation operation, the ferulic acid sugar ester fractions fraction 5 (Fr. 5) and fraction 6 (Fr. 6) were separated.
[0033]
<Tumor necrosis factor production suppression test>
The following test solutions 0.4 ml and muramyl dipeptide 27 mg / kg were orally administered simultaneously to 7-week-old inbred C3H / He female mice (purchased from Nippon Biological Materials Co., Ltd.).
[0034]
(1) 1% ferulic acid, (2) 5% ferulic acid, (3) Perilla extract (Amino Up Chemical), (4) 1% Fr.5, (5) 1% Fr.6, (6) 5% Fr.6, (7) Distilled water [0035]
(Control)
Three hours later, 25 μg of lipopolysaccharide was administered intravenously. Two hours later, blood was collected from the heart and serum was separated. For collecting serum, 3 mice were used for each test solution.
[0036]
L929 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) in 96well flat bottom plates, were seeded such that 8.0 × 10 ⁴ cells / 100 [mu] l / well, which in the 10 to 10 ^8-fold dilutions of the sample serum obtained above 50 μl was added. L929 cells used were Eagle's minimal essential medium (EMEM) containing 10% fetal calf serum (Nichirei Co., Ltd.), which was passaged every 3 to 4 days. To each well, actinomycin D (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added in the culture solution to increase the sensitivity, and the final concentration was 1 μg / ml, and the conditions were 37 ° C. and 5% CO ₂ . Cultured for 18 hours. After removing the medium, the plate was washed once with a phosphate buffer (PBS), added with 25 μl / well of 0.5% crystal violet-20% methanol, and stained for 20 minutes. Each well was washed with PBS and dried, then 0.5% SDS was added at 100 μl / well, shaken with a micromixer, and the absorbance at 540 nm was measured with a microplate radar (Bio-Rad). The amount (U) of tumor necrosis factor (TNF) in serum was calculated with a 50% cytotoxic activity concentration as 1U. The results are shown in FIG.
[0037]
As shown in FIG. 4, not only the perilla extract, which has been conventionally known to have a TNF production inhibitory effect, but also ferulic acid, Fr.5, and Fr.6 all inhibited TNF production. In particular, in the case of Fr.6, TNF production was suppressed by 80% when administered at a concentration of 5%. On the other hand, in the case of ferulic acid, even if the concentration was increased to 5%, a large inhibitory effect like Fr. 6 was not recognized.
[0038]
[Reference Example 1] Preparation of polyethylene glycol-modified enzyme Polyethylene glycol (PEG) -modified enzyme was prepared according to the method of Inada et al. (Inada Y. et al: Biochemical and Biophysical Reseach Communications., 122, 845, 1984). First, 18 mg of Candida cylindracea-derived lipase (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.) was dissolved in 3.2 ml of 0.4 M borate buffer (pH 10), and methoxypolyethylene glycol (activated PEG, sigma) activated with cyanuric chloride was dissolved in this solution. 0.8 g) was added and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by adding 100 ml of 0.1 M borate buffer (pH 8.0), and then unreacted PEG was removed by ultrafiltration (Amicon PM30 membrane). Next, dialysis was performed in distilled water and freeze-dried to obtain a white dry product.
[0039]
Example 3
<Synthesis of ferulic acid glucose ester>
100 g of ferulic acid was dissolved in 500 g of trichloroethanol, 0.5 ml of sulfuric acid and molecular sieve (MS) 4A were added and reacted at 70 ° C. for 1 hour. After cooling, the trichloroethanol was distilled off, the residue was loaded onto a silica gel (Wakogel C-200, 750 g) column chromatograph, the reaction product was eluted with chloroform: methanol (50: 1), and about 100 g of trichloroferrate Ethyl was obtained. The purity of the product was analyzed by HPLC using an Inertsil Sil column (GL Science). The molecular weight of the product was analyzed with a gas mass spectrometer (Shimadzu QP-5000).
[0040]
40 g of D-glucose was dissolved in 500 ml of pyridine dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and 40 g of the above trichloroethyl ferulate was dissolved in this solution. Next, lipase A6 (manufactured by Amano Pharmaceutical) was added to this solution and reacted at 40 ° C. for 3 days.
[0041]
The insoluble matter in the resulting enzyme synthesis reaction solution was removed with filter paper (Advantec 5A), and then the solvent was distilled off and dissolved in methanol. The methanol soluble fraction was redissolved in distilled water and centrifuged, and then the supernatant was purified with a C-18 (GL Science) column. After elution with distilled water, elution was successively performed with 30% ethanol and methanol. After concentrating the 30% methanol elution fraction, purification by reverse phase HPLC (Inertsil ODS-80A: GL Science) revealed four peaks, peaks a to d (FIG. 5). Of these components, only the component of peak a was separated again by reverse phase HPLC, and separated into two components, peak a and peak c (FIG. 6). Thus, the two peaks were considered to be due to the difference in the anomeric structure of glucose, and the following structural analysis was performed while the components of peak a and peak c were mixed.
[0042]
<Infrared absorption spectrum (IR) measurement>
IR measurement was performed by KBr tablet method using FTIR-8200PC (manufactured by Shimadzu Corporation). As a result of the measurement, in the vicinity of 3400 cm ^-1 -OH (stretching), 2940 cm -CH (stretch) in the vicinity of ^-1 and -CH ₂ and CH ₃ (antisymmetric stretch), -C to 1692cm ^-1 = O (stretching), 1632Cm ^-1 aromatic -C of = C-(stretch), 1599cm ^-1, aromatic -C = C-(plane skeleton vibration) of the 1518cm ^-1, fingerprint region 900～800Cm ^-1 sugar Absorbers derived from type absorption were observed.
The absorption at 1667 cm ⁻¹ observed with ferulic acid was shifted to the high wavenumber side to 1692 cm ⁻¹ , suggesting the presence of an ester bond.
[0043]
<FAB-MS measurement>
FAB-MS measurement was performed with a ZAB-HF mass spectrometer (VG). Glycerol was used for the matrix, and measurement was performed at an ion acceleration voltage of 8.0 kV. As a result of the measurement, positive FAB-MS has a strong molecular ion peak at m / z 357 (M + H) ⁺ (Fig. 7), negative FAB-MS has a m / z 355 (MH) ^- (Fig. 8). It was. From this result, it was revealed that the molecular weight of the synthesized product was 356, which was equal to the molecular weight of esterified ferulic acid and glucose.
[0044]
<Nuclear magnetic resonance spectrum measurement>
For NMR measurement, UNITY INOVA 600 type was used. ^In the case of ¹ H-NMR, D ₂ O containing 5% CD ₃ OD was used as a solvent, and HDO was measured as an internal standard. ¹³ C-NMR used CD ₃ OD as an internal standard. In addition, DQF-COSY measurement and HMQC ( ¹ H observation CH-COSY) measurement were also performed. The measurement results of ¹ H-NMR are shown in Table 1, and the measurement results of ¹³ C-NMR are shown in Table 2.
[0045]
[Table 1]

[0046]
[Table 2]

[0047]
^{From 1} H-NMR, the chemical shift of the anomeric proton of glucose was confirmed, and peaks a and c were considered to be due to the difference in the anomeric structure. Further, the fact that the coupling constant J _7.8 was 15.9 Hz indicates that ferulic acid exists as a trans isomer. Further, from the ¹³ C-NMR, the binding position of ferulic acid was not observed as 62 ppm signal at the C-6 position of unsubstituted glucose and was shifted to a low magnetic field of 64.5 ppm. It was shown to be bonded to the C-6 position. That is, it was revealed that peak a was 6-O-feruloyl-β-glucopyranoside and peak c was 6-O-feruloyl-α-glucopyranoside (FIG. 9).
[0048]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel method for producing a phenolic sugar ester utilizing an ester substitution reaction.
The present invention also provides a novel TNF production inhibitor containing ferulic acid or ferulic acid sugar ester as an active ingredient. Since TNF is a cytokine related to inflammation in the human body, the present inhibitor that suppresses this production can be used as an anti-inflammatory agent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing a thin-layer chromatogram of an enzyme synthesis product.
FIG. 2 is a photograph showing a thin-layer chromatogram of an enzyme synthesis product.
FIG. 3 is a photograph showing a thin-layer chromatogram of an enzyme synthesis product.
FIG. 4 is a graph showing an inhibitory effect on TNF production in mice of the ferulic acid sugar ester fraction.
FIG. 5 is a diagram showing an analysis result of a 30% methanol elution fraction by reverse phase HPLC.
FIG. 6 is a diagram showing the analysis result of the component of peak a by reverse phase HPLC.
FIG. 7 is a diagram showing a FAB-MS spectrum (positive ions).
FIG. 8 is a diagram showing an FAB-MS spectrum (negative ions).
FIG. 9 is a diagram showing the structure of ferulic acid glucose ester.

Claims

A method for producing a phenolic acid sugar ester, comprising reacting a phenolic acid alcohol ester with a sugar in a solvent using an enzyme capable of cleaving the ester bond.

2. The phenol according to claim 1, wherein the phenolic acid equivalent site of the phenolic alcohol ester is a ferulic acid residue, a p-coumaric acid residue, a caffeic acid residue, a sinapic acid residue or a cinnamic acid residue. Method for producing acid sugar ester.

The method for producing a phenolic sugar ester according to claim 1 or 2, wherein the alcohol-corresponding portion of the phenolic alcohol ester is a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.

The method for producing a phenolic sugar ester according to claim 3, wherein the substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is a halogen-substituted or unsubstituted alkyl group.

The method for producing a phenolic sugar ester according to claim 4, wherein the halogen-substituted or unsubstituted alkyl group is a butyl group or a halogen-substituted ethyl group.

The halogen-substituted ethyl group is CCl ₃ CH ₂ —, CHCl ₂ CH ₂ —, CH ₂ ClCH ₂ —, CF ₃ CH ₂ —, CHF ₂ CH ₂ —, CH ₂ FCH ₂ —, CBr ₃ CH ₂ —, CHBr _2. CH ₂ -, or _CH 2 BrCH ₂ - preparation of phenolic acid sugar esters according to claim 5, characterized in that the.

7. The phenolic sugar ester according to claim 1, wherein the sugar is an acidic sugar, a neutral sugar, an amino sugar, or an oligosaccharide or polysaccharide having such sugar as a constituent sugar. Law.

Acid saccharides, neutral saccharides, amino saccharides, or oligosaccharides or polysaccharides comprising these saccharides are L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-galactose, L-fucose, D-mannose. , Ascorbic acid, N-acetylneuraminic acid, N-glycolneuraminic acid, polysialic acid, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, dextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, pectin, cellulose, cerobios, cellooligosaccharide, mannan The method for producing a phenolic sugar ester according to claim 7, which is alginic acid, carrageenan, maltose, maltooligosaccharide, fructooligosaccharide, lactosucrose, or isomaltoligosaccharide.

The method for producing a phenolic sugar ester according to any one of claims 1 to 8, wherein the enzyme capable of cleaving the ester bond is esterase, lipase, or serine protease.

The method for producing a phenolic sugar ester according to any one of claims 1 to 9, wherein the solvent is a polar solvent.

The polar solvent is methanol, ethanol, isopropanol, isobutanol, acetone, dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, dimethylformamide, pyridine, dimethyl sulfoxide, 2-pyrrolidone, tert-amyl alcohol, ethyl ether, or isopropyl ether. The method for producing a phenolic sugar ester according to claim 10.