JP3887683B2

JP3887683B2 - Genes involved in plant regeneration and their utilization

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Publication number: JP3887683B2
Application number: JP2002314937A
Authority: JP
Inventors: 憲二郎小沢; 広幸川東; 暁明萱野; 安信大川
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2002-10-29
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2022-10-29
Also published as: JP2004000125A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の再分化能に関与する遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の形質転換系の要素技術として培養細胞の再分化系の確立は重要である。しかしながら、培養細胞の誘導及び再分化系の確立は植物種に依存し、未だ一般的な確立方法は見いだされていない。また同じ植物種でも品種間差が大きく培養系の確立に多くの労力と試行錯誤が現在でも必要である。実際、イネ科植物の培養細胞の再分化能は品種間差が大きいことが報告されている。また、イネ品種コシヒカリ等、経済的に重要な品種でありながら、培養特性が悪く、培養細胞の再分化系の確立が困難な品種が多数知られている。さらに、培養細胞の再分化能は急速に低下しやすく、この点も大きな問題である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物の再分化能に関与する遺伝子を単離・同定し、該遺伝子およびその利用方法を提供することにある。より具体的には、植物の再分化能に関与する遺伝子、該遺伝子を有する形質転換植物体、該形質転換植物体の製造方法、該遺伝子をマーカーとして植物の再分化能を判定する方法、および、該方法に使用するための試薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、湖南早の培養特性（誘導した培養細胞の増殖が良く、また再分化能も高い形質）を日本型イネ、ササニシキ（B6F3）、コシヒカリ（B4F3）に導入したアイソジェニックラインを戻し交配を用い作出した。この作出したアイソジェニックラインと親品種より培養細胞を誘導した。培養後、3〜6ヶ月経過した培養細胞の再分化能を確認後、ディファレンシャルディスプレイ法を用い、ササニシキ及びコシヒカリ由来の培養細胞で発現せず、高い再分化能を持つ湖南早及びアイソジェニックライン由来の培養細胞で発現している遺伝子の単離を試みた。その結果、再分化関連遺伝子（22A遺伝子と命名）を1つクローニングすることができた。さらに、ノーザンハイブリダイゼーション解析により、ディファレンシャルディスプレイの結果と同様にコシヒカリササニシキでは22A遺伝子の発現が確認されず、湖南早、高い再分化能をもつコシヒカリ、ササニシキアイソジェニックラインで該遺伝子の発現が観察できた。また、コシヒカリと同等に再分化能の低下してしまったコシヒカリアイソジェニックラインでは、該遺伝子の発現が観察できなかった。
【０００５】
また、22A遺伝子が、湖南早の再分化に関与することを確証するために、2系統の高い再分化能を持つコシヒカリアイソジェニックラインB4F3にコシヒカリを戻し交配しB5F3世代を得、再分化能を確認後、このサンプルを用い再度ノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、再分化能の高いコシヒカリアイソジェニックラインでは、該遺伝子の発現が確認でき、再分化能の低下したアイソジェニックラインでは該遺伝子の発現は確認できなかった。
【０００６】
さらに、他の13品種のイネ品種において、22A遺伝子の発現を調べるためにノーザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、該遺伝子の発現が他品種と比較して高い湖南早、NepVai、Kele、Panbiraの4品種は継代期間を追っても再分化率の低下もほとんど観察されなかった。これに対し、培養初期から再分化率の低いコシヒカリ、IR8、および、Konansenでは該遺伝子の発現は見いだせなかった。幾つかの品種では培養初期にこの遺伝子が発現していたが、培養4ヶ月目には発現がほとんど観察できなくなった。またこれにあわせて再分化率も低下した。
【０００７】
以上の結果から、22A遺伝子が再分化関連遺伝子であること、該遺伝子は高い再分化能を持つ植物細胞を選抜するためのマーカーとして使用できること、並びに、該遺伝子を植物細胞に導入することで、植物細胞に再分化能を付与することができることが判明した。
【０００８】
即ち、本発明は、植物の再分化能に関与する遺伝子およびその利用に関し、より具体的には、
〔１〕植物において再分化能に関与する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするDNA、
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAが挿入されたベクター、
〔４〕〔１〕もしくは〔２〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞、
〔５〕〔４〕に記載の形質転換植物細胞を有する形質転換植物体、
〔６〕〔５〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
〔７〕〔５〕または〔６〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
〔８〕〔５〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕もしくは〔２〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
〔９〕植物細胞における再分化能の有無を判定する方法であって、
（ａ）植物細胞における〔１〕に記載のDNAの発現を検出する工程、および
（ｂ）（ａ）で検出された〔１〕に記載のDNAの発現量を対照細胞における〔１〕に記載のDNAの発現量と比較する工程、を含み、
（ａ）で検出された〔１〕に記載のDNAの発現量が対照細胞における〔１〕に記載のDNAの発現量より多い場合に、該植物細胞が高い再分化能を有すると判定される方法、
〔１０〕〔１〕に記載のDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、植物細胞における再分化能の有無を判定するための試薬、
を、提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物において再分化能に関与するDNAを提供する。なお、本発明においては、本発明で単離された22A遺伝子の cDNAの塩基配列を配列番号：１に、該cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１０】
本発明のDNAの由来する植物としては、特に制限はなく、イネ、トウモロコシ、大麦、コムギなどが例示できる。
【００１１】
本発明において、再分化能とは、植物細胞（カルスなど）がもとの植物個体に再生する能力を意味する。これまでは、植物細胞が再分化能を有するか否かは黙視でのみ測定されていた（再分化能培地に植物細胞（カルスなど）を置床した後に該植物細胞からシュート（shoot）が形成されているか否かで判断されていた）が、本発明によって、本発明のDNAや本発明のDNAからコードされるタンパク質をマーカーとして利用することで、植物細胞が再分化能を有するかを判定できるようになった。
【００１２】
本発明の再分化能に関与するDNAには、ゲノムDNA、cDNAおよび化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、本発明のDNAを有するイネ品種からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のDNA（例えば、配列番号：１）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のDNA（例えば、配列番号：１）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRを行って調製することも可能である。cDNAは、例えば、本発明のDNAを有するイネ品種から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAPなどのベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またPCRを行うことにより調製できる。
【００１３】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸からなるタンパク質と構造的に類似しており、再分化能に関与するタンパク質をコードするDNAを包含する。
【００１４】
あるDNAが再分化能に関与するタンパク質をコードするか否かは、被検DNAが導入された植物から培養細胞を誘導し、該培養細胞が再分化するか否かを観察することで検証することができる。例えば、再分化能培地に培養細胞を置床して約3週間後に該培養細胞からシュート（shoot）が形成される場合に、被検DNAは再分化能に関与するタンパク質をコードすると判定される。
【００１５】
このようなDNAには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１６】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350, 1987）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、自然界において生じた変異により、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のタンパク質（配列番号：２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限りは、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００１７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern EM: J Mol Biol 98: 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki RK, et al: Science 230: 1350, 1985、Saiki RK, et al: Science 239: 487, 1988）を利用する方法が挙げられる。すなわち、22A遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、また22A遺伝子（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から22A遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術によって単離し得る配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた、本発明のDNAに含まれる。
【００１８】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M 尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4％ SDS、0.1×SSCの条件下では、より相同性の高いDNAを単離できることが期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。
【００１９】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Karlin S & Altschul SF: Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００２０】
また、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするDNAを提供する。
【００２１】
本発明においては、上記DNAまたは上記DNAからコードされるタンパク質は、植物細胞が再分化能を有するか否かを判定するためのマーカーとなりうる。さらに、上記DNAは、植物細胞に再分化能が高い形質を導入するために用いることが可能である。
【００２２】
さらに、本発明には、本発明のDNAが挿入されたベクター、本発明のDNAまたは該ベクターを保持する形質転換植物細胞、該細胞を有する植物体、該植物体の子孫およびクローン、ならびに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００２３】
本発明において、形質転換植物体を作製するには、本発明のDNAまたは本発明のDNAが挿入されたベクターを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００２４】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。
【００２５】
また、本発明において、「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。また、植物細胞の由来する植物としては、特に制限はない。
【００２６】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995）。
【００２７】
例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg, Eds） pp.66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al: Biotechnology 9: 957, 1991）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２８】
ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。このようにして作出された植物体から誘導した植物細胞は再分化能が付与された植物細胞となっている。
【００２９】
さらに、本発明は、植物細胞における再分化能の有無を判定する方法を提供する。該方法では、まず、植物細胞における本発明のDNAの発現を検出する。次いで、植物細胞における該DNAの発現量を対照細胞における該DNAの発現量と比較する。さらに、植物細胞における該DNAの発現量が対照細胞における該DNAの発現量より多い場合に、植物細胞が高い再分化能を有すると判定される。
【００３０】
本発明において、DNAの発現の検出方法としては、特に制限なく、例えばディファレンシャルディスプレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、および、DNAアレイ法などが挙げられる。また、DNAの発現は該DNAからコードされるタンパク質の発現を指標して検出することもできる。
【００３１】
また、本発明は、本発明の判定方法に使用するための試薬を提供する。その一つの態様としては、本発明のDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、植物細胞における再分化能の有無を判定するための試薬が挙げられる。
【００３２】
該オリゴヌクレオチドは、本発明のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のDNAに対し、完全に相補的である必要はない。
【００３３】
本発明のDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の判定方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００３４】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5’端を³²Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして³²P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００３７】
本発明の試薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）培養細胞の誘導
種子を滅菌後、Ozawaらの方法（Ozawa, K. et al., Theor. Appl. Genet., 1989, 77, 205-211.）に従ってイネ培養細胞を誘導した。寒天培地上で、2週間ごとに継代培養を行った。培養細胞誘導後、2ヶ月〜6ヶ月の培養細胞を塚原らの方法（Tsukahara, M. et al., Bot. Mag. Tokyo, 1992, 105, 227-233.）に従い再分化能を検定した。
【００３９】
（２）RNAの単離
Isogen（和光）のプロトコールに従い継代後、2週間目の培養細胞よりRNAを抽出した。
【００４０】
（３）ディファレンシャルディスプレイ及びDNAフラグメントのクローニング GeneHunter社のプロトコールに従い33Pを用いディファレンシャルディスプレイを行った。差の見られたバンドを切り出した後、GeneHunter社のプロトコールに従いクローニングを行った。
【００４１】
（４）シークエンス及び完全長cDNAの単離
得られたバンドをクローニングしDNAを増殖後、シークエンスをABIのプロトコールに従い行った。シークエンス決定後、ClontechのSMART RACE cDNA Amplification Kit のプロトコールに従い完全長cDNAを得た。このシークエンスを決定した（配列番号：１）。
【００４２】
（５）ノーザンハイブリダイゼーション
得られた遺伝子の3’非翻訳領域またはディファレンシャルディスプレイで得られたシークエンスからプローブを作製し、ノーザン解析を行った。具体的には、GCGGCGTCATCGTCAATGGC（22nor1；配列番号：３）およびTCATCTTCTTCCTTGCAGAT（22nor2；配列番号：４）の配列を有するプライマーを用いPCRにより22A遺伝子の3’非翻訳領域を増幅しゲル濾過精製後プローブに用いた。MegaPrime（Amasham）を用いRIプローブを作成した。Isogenを用い培養細胞よりRNAを単離後、Short protocol on Molecular Biology のプロトコールに従い1％ホルムアルデヒド変性ゲルを用い電気泳動を行った後、Amasham社のHybondN+にtransfer後AmashamのRapid-hyb bufferを用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００４３】
[実施例１]
湖南早の高い培養特性（誘導した培養細胞の増殖が良く、また再分化能も高い形質）を導入したコシヒカリ、ササニシキアイソジェニックラインを作出した。図１にコシヒカリ及びコシヒカリアイソジェニックラインの再分化の様子を示す。コシヒカリ由来培養細胞は増殖が悪く、褐変し、ほとんど植物体が再分化してこない。しかし湖南早の遺伝子を導入したアイソジェニックライン由来の培養細胞は増殖も良く、再分化率も90%以上と高かった。そこで、再分化能を確認した培養細胞よりRNAを抽出した後、ディファレンシャルディスプレイを行った。
【００４４】
その結果、高い再分化能を持つ湖南早及びアイソジェニックラインで濃く、ササニシキ、コシヒカリでは非常に薄いバンドを見いだした（図２）。これらのバンドを切り出し、クローニング、シークエンスを行った。このシークエンスを元にRT-PCRを行い、発現の確認を行った。またこのとき、ディファレンシャルディスプレイ法に用いたコシヒカリB4F3系統で再分化能がコシヒカリレベルに低下してしまった系統も同時にコントロールとして用いた。False positiveで発現に差が見られないもの、再分化能の低いコントロールアイソジェニックラインにも発現が見られ、再分化能に関与しない、湖南早の残存遺伝子と考えられるバンドがほとんどで、最終的に再分化関連遺伝子と考えられたバンド(22A)は一つであった。
【００４５】
次に、配列番号：４に記載のDNAをGene specific primer として5’RACEを行い完全長cDNAを得た。この遺伝子(22A；配列番号：１)（22A遺伝子と命名）はHordeum vulgare glucose and ribitol dehydrogenase homolog mRNAと高いホモロジーを示した。なお、22A 遺伝子からコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。
【００４６】
Hordeum vulgare glucose and ribitol dehydrogenase homolog遺伝子は大麦の胚発生後期で特異的に発現していることが報告されている。また該遺伝子がglucoseを代謝する事も調べられている。さらにイネendspermライブラリーや幼穂のripening stageのライブラリーで該遺伝子が確認されている。またトウモロコシでも該遺伝子の発現が胚発生過程で起こる事が報告されている。このことから該遺伝子は胚発生関連遺伝子であることが強く示唆される。
【００４７】
[実施例２]
ディファレンシャルディスプレイで得られたシークエンスをプローブにノーザンハイブリダイゼーションを行った（図３）。ディファレンシャルディスプレイの結果と同様に、コシヒカリ、ササニシキでは発現が見られず、湖南早、及び高い再分化能を持つアイソジェニックラインでは22A 遺伝子の発現が確認できた。また戻し交雑の過程で再分化能がコシヒカリと同様に低下しているアイソジェニックラインもコントロールとして用いた。これらの系統ではコシヒカリと同様に該遺伝子の発現が確認できなかった。
【００４８】
これだけでは戻し交配の結果ランダムに残った湖南早由来の遺伝子の発現が考えられるので、高い再分化能を持つコシヒカリアイソジェニックラインB4F3にコシヒカリを戻し交配しB5F3世代を得、再分化能を確認後、このB5F3世代を用い再度ノーザンハイブリダイゼーションを行った（図４）。具体的には、B4F3、2系統とコシヒカリを交配し得られた2系統のコシヒカリアイソジェニックラインを用いノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、B4F3で得られたノーザンハイブリダイゼーションの結果と同様に高い再分化能を持つ系統では22A 遺伝子の発現が確認でき、低い再分化能を示した系統では該遺伝子の発現は確認できなかった。
【００４９】
[実施例３]
22A 遺伝子の発現と再分化能に関連があるかさらに検証するために、イネ品種13系統を用い再分化率の検定とノーザンハイブリダイゼーションを行った（表１、図５および６）。
【００５０】
【表１】

【００５１】
プローブにはPCRで増幅した3’非翻訳領域を用いた。誘導した培養細胞の高い再分化能が長期間、保持される湖南早、Panbira、Kele及びNepVaiでは22A 遺伝子は培養細胞誘導初期、及び、4ヶ月経過後でも強く発現していた。他の品種では、培養4ヶ月目には発現がほとんど確認できなくなった。また再分化率も低下した。培養初期から細胞の増殖も悪く再分化能も低いコシヒカリ、IR8及びKonansenでは誘導初期及び培養4ヶ月目の培養細胞いずれでも発現が確認できなかった。そこで培養初期に発現が確認できた日本晴れの培養初期と培養6ヶ月目の培養細胞の再分化能と該遺伝子の発現を調べた。また高い再分化能を長期間保持するNepVaiで再分化能が低下した培養細胞が得られたので、分化能が維持されている培養細胞との比較を行った。各培養細胞の分化率を表２で、ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図７で示す。
【００５２】
【表２】

【００５３】
日本晴れ培養初期の再分化率は高く、2系統とも100%の再分化率を示した。しかし培養6ヶ月時点では再分化率は30％以下に低下していた。またNepVai2系統は高い再分化能を示したが、1系統は10％以下の低い再分化率であった。これら8系統のノーザンハイブリダイゼーションの結果を図７に示している。高い再分化能を持つ培養細胞では22A 遺伝子の発現が確認でき、低い再分化能を示した培養細胞では発現が確認できないかまたは非常に弱かった。
【００５４】
以上の結果は、22A遺伝子が再分化関連遺伝子であること、また、該遺伝子が発現していることにより、培養細胞の再分化能が長期間維持されるように成ることを強く示唆している。培養初期と長期間培養した日本晴れ培養細胞及び高い再分化能持つNepVai培養細胞、分化能を失ったNepVai培養細胞の該遺伝子の発現解析の結果もこの考えを支持する。
【００５５】
[実施例４]
22A遺伝子を、単子葉植物で強い発現を誘導するプロモーターであるubiquitin (Ubi-1)プロモーターでドライブする発現ベクターを構築し（図８）、イネ品種、コシヒカリにアグロバクテリウム法で導入した。ハイグロマイシン抵抗性カルスを選抜後、各カルスよりmRNAを抽出しノーザンハイブリダイゼーションを行い、抵抗性カルスで導入遺伝子の発現を確認した（図９）。
次いで、形質転換カルスを再分化培地に置床し、その再分化率を検定した（図１０、表３）。
【表３】

値は、３回の独立した実験の平均値を表わす。＋は、標準偏差。
コントロールのカルスとして形質転換処理を行っていないカルスを用いた。また再分化率は「再分化したカルス数／置床したカルス数」で計算した。その結果、形質転換カルスはコントロールのコシヒカリと比較して明らかに再分化率が高く、ほぼ全てのカルスから植物体が再分化した。以上の結果からOs22A遺伝子は再分化能の高いカルスの誘導に非常に重要な働きをしていると考えられた。
【００５６】
イネ科植物の培養細胞の再分化能は培養過程で急速に低下しやすく、再分化能を長期間維持することは困難であった。エンブリオジェニック・カルス（Embryogenic callus）と言われる、再分化能の高い培養細胞を継代ごとに選抜する事により、高い再分化能を維持していくことができると多くイネ科植物で報告されている。このエンブリオジェニック・カルス形成にこの遺伝子が何らかの関与をしているのでは考えられた。実際、湖南早、NepVai、Kele、Panbiraの培養細胞は白色でコンパクトな形態をしておりエンブリオジェニック・カルスの報告されている形態と酷似していた。
【００５７】
トウモロコシ、小麦等このエンブリオジェニック・カルス形成が報告されているイネ科植物22A遺伝子の発現を詳細に調べることによりこの関係が明らかに成ると考えられる。また該遺伝子発現をマーカーに高い再分化能を持つ培養細胞を選抜することも可能と考えられた。今までは高い再分化能を持つイネ科植物培養細胞の選抜、維持は黙視でしかできなかったが、22A遺伝子発現を調べることにより容易に細胞選抜ができると考えられる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明者らによって、植物の再分化能に関与する遺伝子が見出された。該遺伝子は、高い再分化能を持つ植物細胞を選抜するためのマーカーとして使用できる。また、該遺伝子を植物細胞に導入することで、植物細胞に再分化能を付与することができる。さらに、植物の再分化能に関与する遺伝子を用いた植物細胞の再分化系の確立によって、より広範囲の植物において、形質転換技術を適用する事が可能となるものと期待される。
【００５９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES
<120> The gene involved in regeneration ability of plants and use thereof
<130> MOAX0109Y1
<140> JP 2002-314937
<141> 2002-10-29
<150> JP 2002-100358
<151> 2002-04-02
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<221> CDS
<222> (243)..(1145)
<400> 1
ggaccaccca cctcgccgcg ccacgtacgc cgcatcgcat gcgcgcgctc tccctcgcca 60
gagcaagtag cccgccgcct cttcttcttc acctccgacg agcccttgca cccgcgtcgt 120
cgtcttctcc ggcgccggtg ctgttgctgc gtcctgcggt ttcttgttct tctttgtttg 180
ttagcgacag ggcggcggcg gcggcggcgg ctcgccggag cagcggcagc agcaggagaa 240
gc atg gcg tcg cag cag ttc ccg ccg cag aag cag gag acg cag ccg 287
Met Ala Ser Gln Gln Phe Pro Pro Gln Lys Gln Glu Thr Gln Pro
1 5 10 15
ggg aag gag cac gcc atg gat ccc cgc ccc gag gcc atc atc cag agc 335
Gly Lys Glu His Ala Met Asp Pro Arg Pro Glu Ala Ile Ile Gln Ser
20 25 30
tac aag cca gcc aac aag ctg aag gac gag gtg gcg atc gtg acc ggc 383
Tyr Lys Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asp Glu Val Ala Ile Val Thr Gly
35 40 45
ggc gac tcc ggc atc ggg cgg gcg gtg tgc ctg tgc ttc gcg ctg gag 431
Gly Asp Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Cys Leu Cys Phe Ala Leu Glu
50 55 60
ggc gcg acg gtg gcg ttc acg tac gtg aag ggg cag gag gag aag gac 479
Gly Ala Thr Val Ala Phe Thr Tyr Val Lys Gly Gln Glu Glu Lys Asp
65 70 75
gcg gag gag acg ctc cgc gcg ctg cgc gac atc agg gcg cgc acc ggc 527
Ala Glu Glu Thr Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Arg Thr Gly
80 85 90 95
gcc aag gac ccc atg gcg atc ccc gcc gac ctc ggg tac gac gac aac 575
Ala Lys Asp Pro Met Ala Ile Pro Ala Asp Leu Gly Tyr Asp Asp Asn
100 105 110
tgc cgc aag gtg gtc gac gag gtc gcc ggc gcg tac ggc ggc gcc atc 623
Cys Arg Lys Val Val Asp Glu Val Ala Gly Ala Tyr Gly Gly Ala Ile
115 120 125
gac atc ctc gtc aac aac gcc gcc gag cag tac gag cgc ccc tcc atc 671
Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Glu Gln Tyr Glu Arg Pro Ser Ile
130 135 140
acc gac atc acc gag gac gac ctg gaa cgc gtg ttc cgc acc aac atc 719
Thr Asp Ile Thr Glu Asp Asp Leu Glu Arg Val Phe Arg Thr Asn Ile
145 150 155
ttc tcc tac ttc ttc atg tcg aag cac gcc gtg aag cgg atg cgc gat 767
Phe Ser Tyr Phe Phe Met Ser Lys His Ala Val Lys Arg Met Arg Asp
160 165 170 175
cgc cgc ggc ggc gcc ggc gcc ggc ggg tgc agc atc atc aac acg tcg 815
Arg Arg Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ser Ile Ile Asn Thr Ser
180 185 190
tcg atc aac gcg tac aag ggg aac aag acg ctg ctg gac tac acg gcg 863
Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Asn Lys Thr Leu Leu Asp Tyr Thr Ala
195 200 205
acc aag ggc gcc atc gtg gcg ttc acg agg gcg ctg gcg ctg cag ctg 911
Thr Lys Gly Ala Ile Val Ala Phe Thr Arg Ala Leu Ala Leu Gln Leu
210 215 220
gcg gag gag ggg atc cgg gtg aac ggc gtc gcg ccg ggg ccg atc tgg 959
Ala Glu Glu Gly Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Pro Ile Trp
225 230 235
acg ccg ctg atc ccg gcg tcg ttc gcg gag gag aag gtg agg cag ttc 1007
Thr Pro Leu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Glu Glu Lys Val Arg Gln Phe
240 245 250 255
ggc tcc cag gtg ccc atg ggc cgc gcc ggc cag ccg tcg gag gtg gcg 1055
Gly Ser Gln Val Pro Met Gly Arg Ala Gly Gln Pro Ser Glu Val Ala
260 265 270
ccc agc ttc gtc ttc ctc gcc agc gac gac gcc tcc tac atg tcc ggc 1103
Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Met Ser Gly
275 280 285
cag atg ctg cac gtc aac ggc ggc gtc atc gtc aat ggc tagtttttca 1152
Gln Met Leu His Val Asn Gly Gly Val Ile Val Asn Gly
290 295 300
cttgtcccat atcgccgccg gcgggcgagc tcgccgtcgc cggccgccgt gtctgtcttg 1212
gcttttgctg tgggcatgtg cccacgtgtt tgcagtgcga gtccaccaca tgtcagtcag 1272
tagtagcttg tgatcctgtg atactgtgat gattagagtt gcagttgttg tctgtgtcct 1332
aagcttgcaa ctcaatctgc aaggaagaag atgaataaaa acgtcccatc tcatcactaa 1392
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1416
<210> 2
<211> 300
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Ala Ser Gln Gln Phe Pro Pro Gln Lys Gln Glu Thr Gln Pro Gly
1 5 10 15
Lys Glu His Ala Met Asp Pro Arg Pro Glu Ala Ile Ile Gln Ser Tyr
20 25 30
Lys Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asp Glu Val Ala Ile Val Thr Gly Gly
35 40 45
Asp Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Cys Leu Cys Phe Ala Leu Glu Gly
50 55 60
Ala Thr Val Ala Phe Thr Tyr Val Lys Gly Gln Glu Glu Lys Asp Ala
65 70 75 80
Glu Glu Thr Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Arg Thr Gly Ala
85 90 95
Lys Asp Pro Met Ala Ile Pro Ala Asp Leu Gly Tyr Asp Asp Asn Cys
100 105 110
Arg Lys Val Val Asp Glu Val Ala Gly Ala Tyr Gly Gly Ala Ile Asp
115 120 125
Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Glu Gln Tyr Glu Arg Pro Ser Ile Thr
130 135 140
Asp Ile Thr Glu Asp Asp Leu Glu Arg Val Phe Arg Thr Asn Ile Phe
145 150 155 160
Ser Tyr Phe Phe Met Ser Lys His Ala Val Lys Arg Met Arg Asp Arg
165 170 175
Arg Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ser Ile Ile Asn Thr Ser Ser
180 185 190
Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Asn Lys Thr Leu Leu Asp Tyr Thr Ala Thr
195 200 205
Lys Gly Ala Ile Val Ala Phe Thr Arg Ala Leu Ala Leu Gln Leu Ala
210 215 220
Glu Glu Gly Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Pro Ile Trp Thr
225 230 235 240
Pro Leu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Glu Glu Lys Val Arg Gln Phe Gly
245 250 255
Ser Gln Val Pro Met Gly Arg Ala Gly Gln Pro Ser Glu Val Ala Pro
260 265 270
Ser Phe Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Met Ser Gly Gln
275 280 285
Met Leu His Val Asn Gly Gly Val Ile Val Asn Gly
290 295 300
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 3
gcggcgtcat cgtcaatggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 4
tcatcttctt ccttgcagat 20
【図面の簡単な説明】
【図１】コシヒカリおよび各コシヒカリアイソジェニックラインの再分化を示す写真である。
【図２】ディファレンシャルディスプレイで得られたバンドパターンを示す写真である。
【図３】 22A遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図４】各種アイソジェニックラインにおける22A遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図５】培養初期の各種における22A遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図６】培養4ヶ月目の各種における22A遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図７】日本晴れおよびPanbiraの各培養細胞における22A遺伝子の発現パターンを示す写真である。
【図８】イネ形質転換に用いるOs22A cDNAを含むバイナリベクターの構成を示す図である。NosPは、ノパリンシンターゼプロモーター、NPT IIは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、NosTはノパリンシンターゼ遺伝子の3'シグナル、Ubi1-Pはトウモロコシユビキチン1遺伝子プロモーター、35S-Pはカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、HptIIはハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、BRは右ボーダー、BLは左ボーダー、矢印は、転写の方向を示す。
【図９】コシヒカリ由来の形質転換カルスにおけるOs22Aの発現パターンをノーザンブロットで分析した結果を示す写真である。レーン１：コシヒカリ、レーン２〜８：コシヒカリ形質転換カルス。カルスからのTotal RNA(15μg/レーン)を、ノーザンハイブリダイゼーション分析に供した。
【図１０】コシヒカリ及び形質転換したコシヒカリのカルスの再分化の写真である。ハイグロマイシン選抜によりスクリーニング後、形質転換カルスを2,4-D(2 mg/L)、プロリン(10 mM)、カゼイン加水分解物(300 mg/L)、スクロース(30 g/L)およびゲルライト(4 g/L)を添加したN6培地にて３週間のインターバルでサブカルチャーし、再分化培地へトランスファーした。Tubi-3は、コシヒカリ由来形質転換カルスである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene involved in plant regeneration ability and use thereof.
[0002]
[Prior art]
Establishment of a redifferentiation system for cultured cells is important as an elemental technology for plant transformation systems. However, the induction of cultured cells and the establishment of a redifferentiation system depend on the plant species, and no general establishment method has yet been found. Even among the same plant species, varietal differences are large, and much labor and trial and error are still required to establish a culture system. In fact, it has been reported that the redifferentiation ability of cultured cells of gramineous plants varies greatly between cultivars. In addition, many rice varieties such as rice cultivar Koshihikari are known that are economically important but have poor culture characteristics and it is difficult to establish a redifferentiation system for cultured cells. Furthermore, the redifferentiation ability of cultured cells tends to decrease rapidly, which is also a big problem.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to isolate and identify the gene involved in the regeneration ability of a plant, and to provide this gene and its utilization method. More specifically, a gene involved in plant regeneration ability, a transformed plant having the gene, a method for producing the transformed plant, a method for determining plant regeneration ability using the gene as a marker, and An object of the present invention is to provide a reagent for use in the method.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention introduced an isogenic line in which Hunan early culture characteristics (characteristics of the induced cultured cells being good and high redifferentiation ability) were introduced into Japanese rice, Sasanishiki (B6F3), and Koshihikari (B4F3). Created using backcross. Cultured cells were induced from the produced isogenic lines and parent varieties. After confirming the redifferentiation ability of the cultured cells that have passed 3-6 months after culturing, using the differential display method, it is not expressed in cultured cells derived from Sasanishiki and Koshihikari, derived from Konan early and isogenic lines with high redifferentiation ability Attempts were made to isolate genes expressed in cultured cells. As a result, one redifferentiation-related gene (named 22A gene) could be cloned. Furthermore, by Northern hybridization analysis, the expression of the 22A gene was not confirmed in Koshihikari Sasanishiki, as in the differential display results, and the expression of this gene could be observed in Koshihikari and Sasanishiki isogenic lines with high regenerative potential. It was. In addition, the expression of the gene could not be observed in the Koshihikari isogenic line in which the redifferentiation ability was reduced to the same level as Koshihikari.
[0005]
In addition, in order to confirm that the 22A gene is involved in the early differentiation of Hunan, Koshihikari is backcrossed into the Koshihikari isogenic line B4F3, which has high redifferentiation ability, to obtain the B5F3 generation, After confirmation, Northern hybridization was performed again using this sample. As a result, expression of the gene could be confirmed in the Koshihikari isogenic line with high redifferentiation ability, and expression of the gene could not be confirmed in the isogenic line with reduced redifferentiation ability.
[0006]
Furthermore, Northern hybridization analysis was conducted to examine the expression of the 22A gene in the other 13 rice varieties. As a result, in the four cultivars, Konan Saya, NepVai, Kele, and Panbira, in which the expression of the gene was high compared to other varieties, almost no decrease in the redifferentiation rate was observed even after the passage period. On the other hand, expression of the gene was not found in Koshihikari, IR8, and Konansen, which had a low redifferentiation rate from the early stage of culture. In some cultivars, this gene was expressed at the early stage of culture, but it became almost unobservable after 4 months of culture. In accordance with this, the redifferentiation rate also decreased.
[0007]
From the above results, the 22A gene is a regeneration-related gene, the gene can be used as a marker for selecting a plant cell having high regeneration ability, and by introducing the gene into a plant cell, It was found that plant cells can be given redifferentiation ability.
[0008]
That is, the present invention relates to a gene involved in plant regeneration ability and use thereof, more specifically,
[1] The DNA according to any one of the following (a) to (d), which is involved in redifferentiation ability in a plant,
(A) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) DNA comprising the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1,
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(D) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
[2] DNA encoding a partial peptide of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
[3] A vector into which the DNA according to [1] or [2] is inserted,
[4] A transformed plant cell carrying the DNA of [1] or [2], or the vector of [3],
[5] A transformed plant having the transformed plant cell according to [4],
[6] A transformed plant that is a descendant or clone of the transformed plant according to [5],
[7] A propagation material for the transformed plant according to [5] or [6],
[8] A method for producing a transformed plant according to [5], wherein the DNA according to [1] or [2] or the vector according to [3] is introduced into a plant cell, A method comprising a step of regenerating a plant from
[9] A method for determining the presence or absence of redifferentiation in plant cells,
(A) detecting the expression of the DNA according to [1] in a plant cell; and
(B) comparing the expression level of the DNA according to [1] detected in (a) with the expression level of the DNA according to [1] in a control cell,
When the expression level of the DNA described in [1] detected in (a) is larger than the expression level of the DNA described in [1] in a control cell, it is determined that the plant cell has a high redifferentiation ability. Method,
[10] A reagent for determining the presence or absence of redifferentiation in plant cells, comprising an oligonucleotide that hybridizes to the DNA of [1] and has a chain length of at least 15 nucleotides;
Is provided.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides DNA involved in redifferentiation ability in plants. In the present invention, the nucleotide sequence of the 22A gene cDNA isolated in the present invention is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA is shown in SEQ ID NO: 2.
[0010]
The plant from which the DNA of the present invention is derived is not particularly limited, and examples thereof include rice, corn, barley and wheat.
[0011]
In the present invention, regeneration ability means the ability of plant cells (such as callus) to regenerate to the original plant individual. Until now, whether or not a plant cell has redifferentiation ability has been measured only with unaidedness (a shoot is formed from the plant cell after placing the plant cell (such as callus) on the regeneration ability medium). However, according to the present invention, by using the DNA of the present invention or the protein encoded by the DNA of the present invention as a marker, it is possible to determine whether a plant cell has redifferentiation ability. It became so.
[0012]
The DNA involved in the regeneration ability of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA. Genomic DNA and cDNA can be prepared by those skilled in the art by conventional means. Genomic DNA is extracted from rice varieties having the DNA of the present invention, for example, and a genomic library (eg, vectors, plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used) And colony hybridization or plaque hybridization is performed using a probe prepared based on the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1). It is also possible to prepare a primer specific for the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1) and perform PCR using this primer. For example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from rice varieties having the DNA of the present invention, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and developed as described above. Similarly, it can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization, or by performing PCR.
[0013]
The present invention includes DNA that is structurally similar to the protein consisting of the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2 and encodes a protein involved in redifferentiation ability.
[0014]
Whether a certain DNA encodes a protein involved in redifferentiation ability is verified by inducing cultured cells from the plant into which the test DNA is introduced and observing whether the cultured cells are redifferentiated. be able to. For example, when a shoot is formed from the cultured cells after placing the cultured cells in the redifferentiation medium, the test DNA is determined to encode a protein involved in the redifferentiation ability.
[0015]
Such DNA includes, for example, mutants, derivatives, and the like that encode proteins consisting of amino acid sequences in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Allyls, variants and homologs are included.
[0016]
Methods well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding proteins with altered amino acid sequences include, for example, the site-directed mutagenesis method (Kramer W & Fritz HJ: Methods Enzymol 154: 350, 1987). Can be mentioned. Also in nature, it is possible that the amino acid sequence of the encoded protein is mutated due to the mutation of the base sequence. Thus, a DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 due to a mutation that occurs in nature. Even so long as it encodes a protein having a function equivalent to that of the natural protein (SEQ ID NO: 2), it is included in the DNA of the present invention. Moreover, even if the base sequence is mutated, the mutation may not accompany the amino acid mutation in the protein (degenerate mutation). Such a degenerate mutant is also included in the DNA of the present invention.
[0017]
In order to prepare DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, other methods well known to those skilled in the art include hybridization techniques (Southern EM: J Mol Biol 98: 503, 1975) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki RK, et al: Science 230: 1350, 1985, Saiki RK, et al: Science 239: 487, 1988). . That is, 22A gene base sequence (SEQ ID NO: 1) or a part thereof is used as a probe, and an oligonucleotide that specifically hybridizes to 22A gene (SEQ ID NO: 1) is used as a primer from rice or other plants. Isolating DNA with high homology to a gene is usually possible for one skilled in the art. Thus, DNA encoding a protein having a function equivalent to that of the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 that can be isolated by hybridization technology or PCR technology is also included in the DNA of the present invention.
[0018]
In order to isolate such DNA, the hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions. In the present invention, stringent hybridization conditions refer to hybridization conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 × SSC or equivalent stringency. It is expected that DNA with higher homology can be isolated under conditions of higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 × SSC. High homology refers to sequence identity of at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of the entire amino acid sequence.
[0019]
The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, 1990, Karlin & Altschul SF: Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, by Carlin and Arthur. 1993). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. In addition, when an amino acid sequence is analyzed using BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0020]
The present invention also provides a DNA encoding a partial peptide of a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
[0021]
In the present invention, the DNA or a protein encoded from the DNA can serve as a marker for determining whether or not a plant cell has redifferentiation ability. Furthermore, the above DNA can be used for introducing a trait with high redifferentiation ability into plant cells.
[0022]
Furthermore, the present invention includes a vector into which the DNA of the present invention has been inserted, the DNA of the present invention or a transformed plant cell carrying the vector, a plant having the cell, progeny and clones of the plant, and the plant. The body, its offspring, and clonal propagation material are included.
[0023]
In the present invention, in order to produce a transformed plant body, the DNA of the present invention or a vector into which the DNA of the present invention is inserted is introduced into a plant cell, and the transformed plant cell thus obtained is regenerated.
[0024]
In the present invention, the vector used for transformation of plant cells is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in the cells. For example, using a vector having a promoter (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter) for constitutive expression of the gene in plant cells, or a vector having a promoter inducibly activated by an external stimulus. You can also.
[0025]
In the present invention, the “plant cell” includes various forms of plant cells such as cultured cells, protoplasts, leaf sections, and callus. Moreover, there is no restriction | limiting in particular as a plant from which a plant cell originates.
[0026]
For introduction of a vector into a plant cell, various methods known to those skilled in the art such as polyethylene glycol method, electroporation method (electroporation method), Agrobacterium-mediated method, particle gun method and the like can be used. Regeneration of a plant body from a transformed plant cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell (Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1995).
[0027]
For example, as a method for producing a transformed plant body in rice, a method of regenerating a plant body (suitable for Indian rice varieties) by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp.66-74, 1995), a method for regenerating plants (Japanese rice varieties are suitable) by introducing genes into protoplasts by electric pulses (Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992), a method of introducing a gene directly into a cell by the particle gun method to regenerate a plant (Christou P, et al: Biotechnology 9: 957, 1991), and a gene via Agrobacterium Some techniques have already been established and widely used in the technical field of the present invention, such as a method for introducing plant and regenerating plant bodies (Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994). In the present invention, these methods can be suitably used.
[0028]
Once a transformed plant into which the DNA of the present invention is introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant body, its descendants or clones, and mass-produce the plant body based on them. Is possible. Plant cells derived from the plant thus produced are plant cells to which regeneration ability is imparted.
[0029]
Furthermore, this invention provides the method of determining the presence or absence of the regeneration ability in a plant cell. In this method, first, the expression of the DNA of the present invention in a plant cell is detected. Next, the expression level of the DNA in plant cells is compared with the expression level of the DNA in control cells. Furthermore, when the expression level of the DNA in the plant cell is larger than the expression level of the DNA in the control cell, it is determined that the plant cell has a high redifferentiation ability.
[0030]
In the present invention, a method for detecting the expression of DNA is not particularly limited, and examples thereof include a differential display method, a Northern hybridization method, an RT-PCR method, and a DNA array method. The expression of DNA can also be detected by using the expression of the protein encoded by the DNA as an index.
[0031]
The present invention also provides a reagent for use in the determination method of the present invention. One embodiment thereof includes a reagent for determining the presence or absence of regeneration ability in plant cells, which comprises an oligonucleotide that hybridizes to the DNA of the present invention and has a chain length of at least 15 nucleotides.
[0032]
The oligonucleotide specifically hybridizes to the DNA of the present invention. Here, “specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, In the condition described in the second edition 1989), it means that cross-hybridization does not occur significantly with DNA encoding other proteins. If specific hybridization is possible, the oligonucleotide need not be perfectly complementary to the DNA of the present invention.
[0033]
An oligonucleotide that hybridizes to the DNA of the present invention and has a chain length of at least 15 nucleotides can be used as a probe (including a substrate on which the probe is immobilized) or a primer in the determination method of the present invention. When the oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. The primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA of the present invention.
[0034]
In addition, when the oligonucleotide is used as a probe, the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to the DNA of the present invention. The probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
[0035]
The oligonucleotide of the present invention can be prepared, for example, by a commercially available oligonucleotide synthesizer. The probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
[0036]
When the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after appropriately labeling. As a labeling method, T4 polynucleotide kinase is used to remove the 5 'end of the oligonucleotide.³²A method of labeling by phosphorylating with P, and using a DNA polymerase such as Klenow enzyme and using random hexamer oligonucleotides as primers³²Examples thereof include a method (such as a random prime method) of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as P, a fluorescent dye, or biotin.
[0037]
In the reagent of the present invention, in addition to the active ingredient oligonucleotide, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizer, buffer, preservative, etc. are mixed as necessary. It may be.
[0038]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
(1) Induction of cultured cells
After the seeds were sterilized, rice cultured cells were induced according to the method of Ozawa et al. (Ozawa, K. et al., Theor. Appl. Genet., 1989, 77, 205-211.). Subculture was performed every 2 weeks on agar medium. After induction of the cultured cells, the cultured cells for 2 to 6 months were tested for redifferentiation ability according to the method of Tsukahara et al. (Tsukahara, M. et al., Bot. Mag. Tokyo, 1992, 105, 227-233.).
[0039]
(2) RNA isolation
After passage according to the protocol of Isogen (Wako), RNA was extracted from cultured cells at 2 weeks.
[0040]
(3) Differential Display and Cloning of DNA Fragments Differential display was performed using 33P according to the GeneHunter protocol. After cutting out the band where the difference was seen, cloning was performed according to the GeneHunter protocol.
[0041]
(4) Sequence and full-length cDNA isolation
The obtained band was cloned and the DNA was propagated, followed by sequencing according to the ABI protocol. After sequencing, full-length cDNA was obtained according to the protocol of Clontech's SMART RACE cDNA Amplification Kit. This sequence was determined (SEQ ID NO: 1).
[0042]
(5) Northern hybridization
A probe was prepared from the 3 ′ untranslated region of the obtained gene or a sequence obtained by differential display, and Northern analysis was performed. Specifically, GCGGCGTCATCGTCAATGGC (22nor1; SEQ ID NO:3) And TCATCTTCTTCCTTGCAGAT (22nor2; SEQ ID NO:4The 3 'untranslated region of the 22A gene was amplified by PCR using a primer having the sequence of) and purified by gel filtration and used as a probe. An RI probe was prepared using MegaPrime (Amasham). After isolating RNA from cultured cells using Isogen, electrophoresis was performed using 1% formaldehyde-denaturing gel according to the protocol of Short protocol on Molecular Biology, transferred to HybondN + from Amasham, and Northern using Amasham Rapid-hyb buffer. Hybridization was performed.
[0043]
[Example 1]
Koshihikari and Sasanishiki isogenic lines were introduced with the high culture characteristics of early Konan (introduced culture cells with good growth and redifferentiation ability). FIG. 1 shows the redifferentiation of Koshihikari and Koshihikari isogenic lines. Koshihikari-derived cultured cells are poorly proliferated, browned, and hardly redifferentiated. However, cultured cells derived from the isogenic line introduced with Hunan early genes showed good growth and a high redifferentiation rate of over 90%. Then, after extracting RNA from the cultured cell which confirmed the redifferentiation ability, the differential display was performed.
[0044]
As a result, it was found in Hunan early and isogenic lines with high redifferentiation ability, and very thin bands were found in Sasanishiki and Koshihikari (FIG. 2). These bands were excised, cloned and sequenced. RT-PCR was performed based on this sequence to confirm expression. At this time, the Koshihikari B4F3 line used in the differential display method in which the redifferentiation ability was reduced to the Koshihikari level was also used as a control. There is no false positive expression in the expression, there is also expression in the control isogenic line with low redifferentiation ability, and most of the bands considered to be residual genes in early Hunan that are not involved in redifferentiation ability. There was only one band (22A) considered to be a redifferentiation-related gene.
[0045]
Next, 5'RACE was performed using the DNA described in SEQ ID NO: 4 as a gene specific primer to obtain a full-length cDNA. This gene (22A; SEQ ID NO: 1) (named as 22A gene) showed high homology with Hordeum vulgare glucose and ribitol dehydrogenase homolog mRNA. The amino acid sequence of the protein encoded by the 22A gene is set forth in SEQ ID NO: 2.
[0046]
It has been reported that the Hordeum vulgare glucose and ribitol dehydrogenase homolog gene is specifically expressed in the late stage of embryo development in barley. It has also been investigated that the gene metabolizes glucose. Furthermore, the gene has been confirmed in the rice endsperm library and the library of the ripening stage of young ears. In maize, it has been reported that the gene expression occurs during embryogenesis. This strongly suggests that the gene is an embryogenesis-related gene.
[0047]
[Example 2]
Northern hybridization was performed using the sequence obtained by the differential display as a probe (FIG. 3). Similar to the results of the differential display, no expression was observed in Koshihikari and Sasanishiki, and the expression of 22A gene was confirmed in the early Hunan and isogenic lines with high redifferentiation ability. In addition, an isogenic line in which the redifferentiation ability decreased in the same manner as Koshihikari during backcrossing was also used as a control. In these lines, the expression of the gene could not be confirmed as in Koshihikari.
[0048]
Since this alone may result in the expression of genes derived from the early pre-Hannan region from the backcrossing, Koshihikari is backcrossed to the Koshihikari isogenic line B4F3, which has high redifferentiation ability, to obtain the B5F3 generation, and after confirming redifferentiation ability Northern hybridization was performed again using this B5F3 generation (FIG. 4). Specifically, Northern hybridization was performed using two Koshihikari isogenic lines obtained by crossing two strains of B4F3 and Koshihikari. As a result, the expression of 22A gene was confirmed in the line with high redifferentiation ability as in the Northern hybridization result obtained with B4F3, and the expression of the gene was not confirmed in the line showing low redifferentiation ability. .
[0049]
[Example 3]
In order to further verify whether there is a relationship between the expression of 22A gene and the ability to redifferentiate, 13 lines of rice varieties were tested for regeneration rate and Northern hybridization (Table 1, FIGS. 5 and 6).
[0050]
[Table 1]

[0051]
As a probe, a 3 'untranslated region amplified by PCR was used. In Hunan Saya, Panbira, Kele and NepVai where the high redifferentiation ability of the induced cultured cells was maintained for a long period of time, the 22A gene was strongly expressed at the early stage of the cultured cell induction and after 4 months. In other varieties, almost no expression was confirmed at 4 months of culture. Moreover, the redifferentiation rate also decreased. In Koshihikari, IR8, and Konansen, which had poor cell proliferation and low redifferentiation from the beginning of the culture, expression could not be confirmed in any of the cultured cells at the initial induction and 4 months of culture. Therefore, the redifferentiation ability and expression of the genes of cultured cells at the early days of sunny Japan and the sixth month of culture, in which expression was confirmed at the initial stage of culture, were examined. In addition, cultured cells with reduced redifferentiation ability were obtained with NepVai, which retains high redifferentiation ability for a long period of time, and were compared with cultured cells in which differentiation ability was maintained. The differentiation rate of each cultured cell is shown in Table 2, and the result of Northern hybridization is shown in FIG.
[0052]
[Table 2]

[0053]
The redifferentiation rate in the early days of Japanese fine culture was high, and both lines showed 100% redifferentiation rate. However, the redifferentiation rate decreased to 30% or less at 6 months of culture. NepVai2 line showed high redifferentiation ability, but one line had a low redifferentiation rate of 10% or less. The results of these eight lines of Northern hybridization are shown in FIG. Expression of the 22A gene could be confirmed in cultured cells with high redifferentiation ability, and expression could not be confirmed or very weak in cultured cells that showed low redifferentiation ability.
[0054]
The above results strongly suggest that the 22A gene is a redifferentiation-related gene and that the expression of this gene will maintain the redifferentiation ability of cultured cells for a long period of time. . The results of expression analysis of this gene in the early and long-term cultured Japanese sunny cultured cells, NepVai cultured cells with high redifferentiation ability, and NepVai cultured cells that have lost differentiation ability also support this idea.
[0055]
[Example 4]
An expression vector that drives the 22A gene with a ubiquitin (Ubi-1) promoter, which is a promoter that induces strong expression in monocotyledonous plants, was constructed (FIG. 8), and introduced into rice varieties and Koshihikari by the Agrobacterium method. After selecting hygromycin-resistant calli, mRNA was extracted from each callus and Northern hybridization was performed, and expression of the transgene was confirmed in the resistant callus (FIG. 9).
Subsequently, the transformed callus was placed on a regeneration medium, and the regeneration rate was tested (FIG. 10, Table 3).
[Table 3]

Values represent the average of 3 independent experiments. + Is the standard deviation.
Callus that had not undergone transformation treatment was used as a control callus. The redifferentiation rate was calculated by “number of regenerated callus / number of callus placed”. As a result, the transformed callus clearly had a higher redifferentiation rate than the control Koshihikari, and the plant body was regenerated from almost all callus. These results suggest that the Os22A gene plays a very important role in inducing callus with high redifferentiation ability.
[0056]
The redifferentiation ability of cultured cells of Gramineae plants tends to decline rapidly during the cultivation process, and it was difficult to maintain the redifferentiation ability for a long period of time. It has been reported in many Gramineae plants that high redifferentiation ability can be maintained by selecting cultured cells with high redifferentiation ability, which are called Embryogenic callus, at each passage. Yes. It was thought that this gene was involved in this embryogenic callus formation. In fact, the cultured cells of Konan Haya, NepVai, Kele, and Panbira were white and compact in shape, which was very similar to the reported form of embryogenic callus.
[0057]
It is considered that this relationship will be clarified by examining in detail the expression of the 22A gene of the gramineous plant that has been reported to form this embryogenic callus such as corn and wheat. It was also considered possible to select cultured cells having high redifferentiation ability using the gene expression as a marker. Until now, selection and maintenance of cultured cells of the grass family with high redifferentiation ability could only be done with unaided eye, but it is considered that cell selection can be easily performed by examining 22A gene expression.
[0058]
【The invention's effect】
The present inventors have found a gene involved in plant regeneration ability. The gene can be used as a marker for selecting plant cells having high redifferentiation ability. In addition, by introducing the gene into a plant cell, the regeneration ability can be imparted to the plant cell. Furthermore, it is expected that transformation techniques can be applied to a wider range of plants by establishing a plant cell redifferentiation system using genes involved in plant redifferentiation.
[0059]
[Sequence Listing]
                            SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES
<120> The gene involved in regeneration ability of plants and use thereof
<130> MOAX0109Y1
<140> JP 2002-314937
<141> 2002-10-29
<150> JP 2002-100358
<151> 2002-04-02
<160>Four
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<220>
<221> CDS
<222> (243) .. (1145)
<400> 1
ggaccaccca cctcgccgcg ccacgtacgc cgcatcgcat gcgcgcgctc tccctcgcca 60
gagcaagtag cccgccgcct cttcttcttc acctccgacg agcccttgca cccgcgtcgt 120
cgtcttctcc ggcgccggtg ctgttgctgc gtcctgcggt ttcttgttct tctttgtttg 180
ttagcgacag ggcggcggcg gcggcggcgg ctcgccggag cagcggcagc agcaggagaa 240
gc atg gcg tcg cag cag ttc ccg ccg cag aag cag gag acg cag ccg 287
   Met Ala Ser Gln Gln Phe Pro Pro Gln Lys Gln Glu Thr Gln Pro
     1 5 10 15
ggg aag gag cac gcc atg gat ccc cgc ccc gag gcc atc atc cag agc 335
Gly Lys Glu His Ala Met Asp Pro Arg Pro Glu Ala Ile Ile Gln Ser
                 20 25 30
tac aag cca gcc aac aag ctg aag gac gag gtg gcg atc gtg acc ggc 383
Tyr Lys Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asp Glu Val Ala Ile Val Thr Gly
             35 40 45
ggc gac tcc ggc atc ggg cgg gcg gtg tgc ctg tgc ttc gcg ctg gag 431
Gly Asp Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Cys Leu Cys Phe Ala Leu Glu
         50 55 60
ggc gcg acg gtg gcg ttc acg tac gtg aag ggg cag gag gag aag gac 479
Gly Ala Thr Val Ala Phe Thr Tyr Val Lys Gly Gln Glu Glu Lys Asp
     65 70 75
gcg gag gag acg ctc cgc gcg ctg cgc gac atc agg gcg cgc acc ggc 527
Ala Glu Glu Thr Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Arg Thr Gly
80 85 90 95
gcc aag gac ccc atg gcg atc ccc gcc gac ctc ggg tac gac gac aac 575
Ala Lys Asp Pro Met Ala Ile Pro Ala Asp Leu Gly Tyr Asp Asp Asn
                100 105 110
tgc cgc aag gtg gtc gac gag gtc gcc ggc gcg tac ggc ggc gcc atc 623
Cys Arg Lys Val Val Asp Glu Val Ala Gly Ala Tyr Gly Gly Ala Ile
            115 120 125
gac atc ctc gtc aac aac gcc gcc gag cag tac gag cgc ccc tcc atc 671
Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Glu Gln Tyr Glu Arg Pro Ser Ile
        130 135 140
acc gac atc acc gag gac gac ctg gaa cgc gtg ttc cgc acc aac atc 719
Thr Asp Ile Thr Glu Asp Asp Leu Glu Arg Val Phe Arg Thr Asn Ile
    145 150 155
ttc tcc tac ttc ttc atg tcg aag cac gcc gtg aag cgg atg cgc gat 767
Phe Ser Tyr Phe Phe Met Ser Lys His Ala Val Lys Arg Met Arg Asp
160 165 170 175
cgc cgc ggc ggc gcc ggc gcc ggc ggg tgc agc atc atc aac acg tcg 815
Arg Arg Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ser Ile Ile Asn Thr Ser
                180 185 190
tcg atc aac gcg tac aag ggg aac aag acg ctg ctg gac tac acg gcg 863
Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Asn Lys Thr Leu Leu Asp Tyr Thr Ala
            195 200 205
acc aag ggc gcc atc gtg gcg ttc acg agg gcg ctg gcg ctg cag ctg 911
Thr Lys Gly Ala Ile Val Ala Phe Thr Arg Ala Leu Ala Leu Gln Leu
        210 215 220
gcg gag gag ggg atc cgg gtg aac ggc gtc gcg ccg ggg ccg atc tgg 959
Ala Glu Glu Gly Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Pro Ile Trp
    225 230 235
acg ccg ctg atc ccg gcg tcg ttc gcg gag gag aag gtg agg cag ttc 1007
Thr Pro Leu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Glu Glu Lys Val Arg Gln Phe
240 245 250 255
ggc tcc cag gtg ccc atg ggc cgc gcc ggc cag ccg tcg gag gtg gcg 1055
Gly Ser Gln Val Pro Met Gly Arg Ala Gly Gln Pro Ser Glu Val Ala
                260 265 270
ccc agc ttc gtc ttc ctc gcc agc gac gac gcc tcc tac atg tcc ggc 1103
Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Met Ser Gly
            275 280 285
cag atg ctg cac gtc aac ggc ggc gtc atc gtc aat ggc tagtttttca 1152
Gln Met Leu His Val Asn Gly Gly Val Ile Val Asn Gly
        290 295 300
cttgtcccat atcgccgccg gcgggcgagc tcgccgtcgc cggccgccgt gtctgtcttg 1212
gcttttgctg tgggcatgtg cccacgtgtt tgcagtgcga gtccaccaca tgtcagtcag 1272
tagtagcttg tgatcctgtg atactgtgat gattagagtt gcagttgttg tctgtgtcct 1332
aagcttgcaa ctcaatctgc aaggaagaag atgaataaaa acgtcccatc tcatcactaa 1392
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1416
<210> 2
<211> 300
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Ala Ser Gln Gln Phe Pro Pro Gln Lys Gln Glu Thr Gln Pro Gly
  1 5 10 15
Lys Glu His Ala Met Asp Pro Arg Pro Glu Ala Ile Ile Gln Ser Tyr
             20 25 30
Lys Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asp Glu Val Ala Ile Val Thr Gly Gly
         35 40 45
Asp Ser Gly Ile Gly Arg Ala Val Cys Leu Cys Phe Ala Leu Glu Gly
     50 55 60
Ala Thr Val Ala Phe Thr Tyr Val Lys Gly Gln Glu Glu Lys Asp Ala
65 70 75 80
Glu Glu Thr Leu Arg Ala Leu Arg Asp Ile Arg Ala Arg Thr Gly Ala
                 85 90 95
Lys Asp Pro Met Ala Ile Pro Ala Asp Leu Gly Tyr Asp Asp Asn Cys
            100 105 110
Arg Lys Val Val Asp Glu Val Ala Gly Ala Tyr Gly Gly Ala Ile Asp
        115 120 125
Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Glu Gln Tyr Glu Arg Pro Ser Ile Thr
    130 135 140
Asp Ile Thr Glu Asp Asp Leu Glu Arg Val Phe Arg Thr Asn Ile Phe
145 150 155 160
Ser Tyr Phe Phe Met Ser Lys His Ala Val Lys Arg Met Arg Asp Arg
                165 170 175
Arg Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ser Ile Ile Asn Thr Ser Ser
            180 185 190
Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Asn Lys Thr Leu Leu Asp Tyr Thr Ala Thr
        195 200 205
Lys Gly Ala Ile Val Ala Phe Thr Arg Ala Leu Ala Leu Gln Leu Ala
    210 215 220
Glu Glu Gly Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Pro Ile Trp Thr
225 230 235 240
Pro Leu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Glu Glu Lys Val Arg Gln Phe Gly
                245 250 255
Ser Gln Val Pro Met Gly Arg Ala Gly Gln Pro Ser Glu Val Ala Pro
            260 265 270
Ser Phe Val Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Tyr Met Ser Gly Gln
        275 280 285
Met Leu His Val Asn Gly Gly Val Ile Val Asn Gly
    290 295 300
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 3
gcggcgtcat cgtcaatggc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 4
tcatcttctt ccttgcagat 20
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing regeneration of Koshihikari and each Koshihikari isogenic line.
FIG. 2 is a photograph showing a band pattern obtained by a differential display.
FIG. 3 is a photograph showing the expression pattern of the 22A gene.
FIG. 4 is a photograph showing expression patterns of 22A gene in various isogenic lines.
FIG. 5 is a photograph showing expression patterns of 22A gene in various cultures at the early stage of culture.
FIG. 6 is a photograph showing expression patterns of 22A gene in various cultures at 4 months of culture.
FIG. 7 is a photograph showing the expression pattern of 22A gene in cultured cells of Nipponbare and Panbira.
FIG. 8 is a diagram showing the structure of a binary vector containing Os22A cDNA used for rice transformation. NosP is the nopaline synthase promoter, NPT II is the neomycin phosphotransferase II, NosT is the 3 'signal of the nopaline synthase gene, Ubi1-P is the maize ubiquitin 1 gene promoter, 35S-P is the cauliflower mosaic virus 35S promoter, and HptII is Hygromycin B phosphotransferase, BR is the right border, BL is the left border, and the arrow indicates the direction of transcription.
FIG. 9 is a photograph showing the results of analysis of the expression pattern of Os22A in transformed calli derived from Koshihikari by Northern blotting. Lane 1: Koshihikari, Lane 2-8: Koshihikari transformed callus. Total RNA (15 μg / lane) from callus was subjected to Northern hybridization analysis.
FIG. 10 is a photograph of regeneration of calli from Koshihikari and transformed Koshihikari. After screening by hygromycin selection, transformed calli were treated with 2,4-D (2 mg / L), proline (10 mM), casein hydrolyzate (300 mg / L), sucrose (30 g / L) and gellite ( Subculture was performed in an N6 medium supplemented with 4 g / L) at an interval of 3 weeks and transferred to a regeneration medium. Tubi-3 is a transformed callus derived from Koshihikari.

Claims

A DNA encoding a protein having a function of imparting redifferentiation ability in a rice plant, the DNA according to any one of (a) to (c) below.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B) DNA containing the coding region of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(C) DNA encoding a protein having at least 95% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

A vector into which the DNA according to claim 1 is inserted.

A transformed plant cell carrying the DNA according to claim 1 or the vector according to claim 2.

A transformed plant having the transformed plant cell according to claim 3.

A transformed plant which is a descendant or clone of the transformed plant according to claim 4.

A propagation material comprising the transformed plant according to claim 4 or 5.

A method of manufacturing a transgenic plant according to claim 4, DNA of claim 1 or the vector of claim 2 is introduced into the rice cells, to regenerate the rice plants from the rice cells A method comprising the steps.

A method for determining the presence or absence of redifferentiation in rice cells,
(A) a step of detecting the expression of the DNA according to claim 1 in rice cells; and (b) the expression level of the DNA according to claim 1 detected in (a) according to claim 1 in a control cell. Comparing the expression level of the DNA of
When the expression level of the DNA according to claim 1 detected in (a) is greater than the expression level of the DNA according to claim 1 in a control cell, the rice cell is determined to have a high redifferentiation ability. Method.