JP3886942B2 - Signal transduction protein involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin and its gene - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、その遺伝子、及びその利用に関する。 The present invention relates to a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin, a gene thereof, and use thereof.
生体は、常に微生物の侵入等の危機に曝されている。このような危機に対する生体防御は、自然免疫と獲得免疫の協調作用により確立される。自然免疫を担当するマクロファージ、樹状細胞などの抗原提示細胞は、Toll-like receptor（ＴＬＲ）と呼ばれる一群の膜タンパク質を介して、病原体を認識する。この認識により活性化された抗原提示細胞は、ＩＬ−１２、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインを産生すると同時に、ＣＤ４０などの補助機能分子の発現を増強する。補助機能分子の発現は、抗原提示細胞と協同して、獲得免疫を担当するＴ細胞の増殖を誘導する。また、ＩＬ−１２は、ナイーブＴ細胞やインターフェロン（ＩＦＮ）を産生する１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞へと分化誘導し、細胞性免疫を確立させる。したがって、ＴＬＲを介したシグナルは、獲得免疫を量的、質的、双方の面から制御していることになる。
Living organisms are constantly exposed to crises such as invasion of microorganisms. The defense against such a crisis is established by the cooperative action of innate immunity and acquired immunity. Antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells responsible for innate immunity recognize pathogens through a group of membrane proteins called Toll-like receptors (TLRs). Antigen-presenting cells activated by this recognition produce inflammatory cytokines such as IL-12 and TNF, and at the same time enhance the expression of auxiliary function molecules such as CD40. The expression of accessory function molecules induces proliferation of T cells responsible for acquired immunity in cooperation with antigen presenting cells. IL-12 induces differentiation into naive T cells and
ＴＬＲは、病原体のような微生物の特有の成分を認識するレセプターであるが、ＴＬＲには多くのファミリーがあることが確認されている。即ち、ＴＬＲレセプターファミリーは、微生物の構成成分のそれぞれ特定の構造を認識することにより微生物の侵入を認識し、本来の免疫活性を引き起こす（Annu Rev Immunol. 20, 197, 2002；Nat. Immunol 2, 675, 2001；Nat. Rev. Immunol. 1, 135, 2001）。ＴＬＲレセプターファミリーのうち、ＴＬＲ４はグラム陰性菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）のレセプターとして機能している。ＴＬＲ２は、グラム陽性菌由来のペプチドグリカン及び様々な菌由来のリポタンパク質との応答に必須である。ＴＬＲ１とＴＬＲ６はトリアシル化されたマイクロプラズマのリポタンパク質をそれぞれＴＬＲ２とヘテロ二量体を形成することによって認識している（J. Immunol. 169, 10, 2002）。ＴＬＲ５はフラジェリン（flagellin）を認識する。ＴＬＲ３とＴＬＲ９はそれぞれ二重鎖ＲＮＡとＣｐＧＤＮＡ（微生物ＤＮＡ）のレセプターである。ＴＬＲ７は抗ウイルス化合物の応答に関与している（Nat. Immunol. 3, 196, 2002）。 TLRs are receptors that recognize specific components of microorganisms such as pathogens, but it has been confirmed that there are many families of TLRs. That is, the TLR receptor family recognizes the invasion of a microorganism by recognizing a specific structure of each component of the microorganism and causes the original immune activity (Annu Rev Immunol. 20, 197, 2002; Nat. Immunol 2, 675, 2001; Nat. Rev. Immunol. 1, 135, 2001). Of the TLR receptor family, TLR4 functions as a receptor for lipopolysaccharide (LPS) derived from Gram-negative bacteria. TLR2 is essential for the response with peptidoglycan from Gram-positive bacteria and lipoproteins from various bacteria. TLR1 and TLR6 recognize triacylated microplasma lipoproteins by forming heterodimers with TLR2, respectively (J. Immunol. 169, 10, 2002). TLR5 recognizes flagellin. TLR3 and TLR9 are double-stranded RNA and CpGDNA (microbial DNA) receptors, respectively. TLR7 is involved in the response of antiviral compounds (Nat. Immunol. 3, 196, 2002).
ＴＬＲファミリーは、ＩＬ−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）ファミリー（Nat. Immunol 2, 675, 2001）と相同性のある細胞外のロイシンリッチリピート（leucine-rich repeat：ＬＲＲ）領域とＩＬ−１Ｒの細胞質内領域と相同性の高い領域（ＴＩＲ領域）とを含んでいる。ＩＬ−１Ｒに類似し、ＴＬＲはＩＲＡＫをＭｙＤ８８アダプター経由で誘導され、ＴＲＦ６そして最終的にはＮＦ−κＢの活性を誘導する。即ち、ＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998、Mol. Cell 2, 253-258, 1998、Immunity 11, 115-122, 1999）。ＴＬＲを介した炎症性サイトカインの産生はＭｙＤ８８分化細胞においては完全に遮断されている。
The TLR family is an extracellular leucine-rich repeat (LRR) region that is homologous to the IL-1 receptor (IL-1R) family (Nat. Immunol 2, 675, 2001) and the cytoplasm of IL-1R. It includes an inner region and a region having high homology (TIR region). Similar to IL-1R, TLRs induce IRAK via the MyD88 adapter and induce the activity of TRF6 and ultimately NF-κB. That is, it is known that the TLR family recruits IL-1R binding kinase (IRAK), activates TRAF6, and activates downstream NF-κB via MyD88, which is an adapter protein, like IL-1R. (J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998, Mol.
しかしながら、近年の研究によればそれぞれのＴＬＲを通るシグナル経路がそれぞれ異なり、従って異なる生体反応を生じることが示されている（Nat. Immunol 2, 675, 2001）。事実、ＴＬＲ４シグナルは、ＭｙＤ８８依存経路と非依存的経路の両方を含んでいる。前者はサイトカインの産生に必須であり、後者はＩＲＦ−３の活性化と、その後のインターフェロンβ（interferon-beta：ＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−誘導（inducible）遺伝子（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Nat. Immunol. 3, 392, 2002、Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press. 2002）の誘導に関与している。更に、ＭｙＤ−８８非依存的経路は樹状細胞（ＤＣｓ）を機能的に成熟させている（J. Immunol. 166, 5688, 2001）。ＭｙＤ−８８非依存的経路はＴＬＲ３シグナルでも観察されている（Nature 413, 732, 2001）。 However, recent studies have shown that the signal pathways through each TLR are different and thus produce different biological responses (Nat. Immunol 2, 675, 2001). In fact, the TLR4 signal contains both MyD88-dependent and independent pathways. The former is essential for the production of cytokines, and the latter is the activation of IRF-3 followed by the interferon-beta (IFN-β) and IFN-inducible genes (J. Immunol. 167, 5887, 2001, Nat. Immunol. 3, 392, 2002, Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press. 2002). Furthermore, the MyD-88-independent pathway functionally matures dendritic cells (DCs) (J. Immunol. 166, 5688, 2001). A MyD-88-independent pathway has also been observed with TLR3 signals (Nature 413, 732, 2001).
近年、ＴＩＲＡＰ／ＭａｌがＴＩＲ領域に隠れている二番目のアダプター分子として発見された（Nat. Immunol. 2, 835, 2001、Nature 413, 78, 2001）。インビトロでの研究においては、ＴＩＲＡＰ／ＭａｌがＭｙＤ−８８非依存的経路でのＬＰＳ誘導による活性化に関与していることを示唆している（Nat. Immunol. 2, 835, 2001）。しかしながら、ＴＩＲＡＰ欠損マウスにおける研究でＴＩＲＡＰがＴＬＲ２とＴＬＲ４経由のＭｙＤ−８８非依存的シグナル経路内でアダプターとして機能していることが明らかになった（Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press, 2002）。これらの研究は、ＴＩＲを含むいくつかのアダプター分子がＴＬＲを介したシグナル経路に関与し、これらのアダプターの異なる使用がＴＬＲシグナルの特異性をもたらし、さらにＭｙＤ−８８非依存的経路がＴＩＲＡＰ以外の分子によって介されていることを示唆している。 Recently, TIRAP / Mal was discovered as the second adapter molecule hidden in the TIR region (Nat. Immunol. 2, 835, 2001, Nature 413, 78, 2001). In vitro studies suggest that TIRAP / Mal is involved in LPS-induced activation in a MyD-88-independent pathway (Nat. Immunol. 2, 835, 2001). However, studies in TIRAP-deficient mice revealed that TIRAP functions as an adapter in the MyD-88-independent signaling pathway via TLR2 and TLR4 (Essential role for TIRAP in activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature in press, 2002). These studies show that several adapter molecules, including TIR, are involved in TLR-mediated signaling pathways, and that different uses of these adapters result in TLR signal specificity, and that MyD-88-independent pathways other than TIRAP It is suggested that it is mediated by molecules.
一方、細菌感染を防御する機構に関与するタンパク質及びその遺伝子に関する開示としては、ＴＬＲ４分子を介したＮＦ−κＢ活性化の増加に関与する性質を有するタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子（特開２０００−２６２２９０号公報）、及び、細菌感染による過剰なＬＰＳ応答を抑制するフィードバック機構に関与していることが示唆される、ＴＬＲ４遺伝子から選択的にスプライシングの結果生ずるｍＲＮＡのコードするタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子（特開２００２−１７６９８６号公報）などが開示されている。しかしながら、上記のように、ＴＬＲを介したシグナル経路に関与するタンパク質や該タンパク質をコードする遺伝子については、その全容は明らかになっていない。
本発明の課題は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、その遺伝子、及びそれらの利用方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin, a gene thereof, and a method for using them.
本発明者らは、ＴＬＲ（Toll-like receptor）ファミリーが病原体の構成成分の認識に必須の役割を演じる受容体であることを、遺伝子欠損マウスを作製することにより示してきた。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲファミリーの細胞質内領域と相同性の高いＴＩＲドメインをもつアダプターであるが、遺伝子欠損マウスの解析から、全てのＴＬＲファミリーを介した炎症性サイトカインの産生誘導のシグナル伝達に必須であることを示した。しかしながら、リポ多糖を認識するＴＬＲ４を介したシグナルの場合には、ＭｙＤ８８欠損マウスでも炎症性サイトカインの反応は認めないにも関わらず、インターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導した。 The present inventors have shown that a TLR (Toll-like receptor) family is a receptor that plays an essential role in recognizing components of pathogens by creating a gene-deficient mouse. MyD88 is an adapter having a TIR domain highly homologous to the cytoplasmic region of the TLR family, but is essential for signal transduction of inflammatory cytokine production through all TLR families from the analysis of gene-deficient mice. Showed that. However, in the case of a signal via TLR4 recognizing lipopolysaccharide, expression of an interferon-inducible gene was induced even though MyD88-deficient mice did not respond to inflammatory cytokines.
更に、ＴＬＲ４に特異的に結合する分子としてＴＩＲＡＰが同定されたが、遺伝子欠損マウスの解析から、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４だけでなくＴＬＲ２を介した炎症性サイトカインの産生にも必須であることを示した。ＴＩＲＡＰ欠損マウスでも、ＴＬＲ４を介したインターフェロン誘導性遺伝子の発現は誘導されることから、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰに依存しないシグナルの存在が示唆された。 Furthermore, TIRAP was identified as a molecule that specifically binds to TLR4, and analysis of gene-deficient mice showed that TIRAP is essential for the production of inflammatory cytokines not only through TLR4 but also through TLR2. Even in TIRAP-deficient mice, expression of interferon-inducible genes via TLR4 was induced, suggesting the presence of signals independent of MyD88 and TIRAP.
ウイルス由来の二重鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３を介したシグナルでも、インターフェロン誘導性遺伝子の発現が誘導されることから、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ非依存性のシグナルとＴＬＲ３を介したシグナルには共通の分子の関与が示唆された。そこで、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰと同様にＴＩＲドメインを有する分子を検索した結果、ＴＩＲドメインを有する遺伝子ＴＲＩＦ（TIR domain containing adaptor inducing interferon-beta）を見い出した。この遺伝子はヒトではコーディング領域（coding region）が２，１３６ｂｐで、７１２のアミノ酸をコードする。マウスでは、２，１９９ｂｐで、７３３アミノ酸をコードしている。ヒト、マウスともに、ＴＩＲドメインがタンパク質の中央部分に存在している（図２）。 Interferon-inducible gene expression is induced even by a signal via TLR3 that recognizes double-stranded RNA derived from a virus. Therefore, MyD88 and TIRAP-independent signals via TLR4 and signals via TLR3 The involvement of a common molecule was suggested. Thus, as a result of searching for molecules having a TIR domain in the same manner as MyD88 and TIRAP, a gene TRIF (TIR domain containing adapter inducing interferon-beta) having a TIR domain was found. This gene has a coding region of 2,136 bp in human and encodes 712 amino acids. In the mouse, it encodes 733 amino acids at 2,199 bp. In both humans and mice, the TIR domain is present in the central part of the protein (FIG. 2).
２９３細胞（human embryonic kidney cell）に、インターフェロンβ（IFN-beta）の遺伝子プロモーター下にルシフェラーゼ（luciferase）を組み込んだプラスミド（plasmid）とともに導入して、この遺伝子を発現させるとルシフェラーゼ活性化を増強した。この結果は、該遺伝子によりコードされるタンパク質が、インターフェロンβの発現に関与していることを示している。ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰを発現させてもインターフェロンβ遺伝子のプロモーターは活性化されないことから、ＴＩＲドメインを有するタンパク質のなかでも、該遺伝子によりコードされるタンパク質がインターフェロンの誘導シグナルに特異的に関与していることを示していた。ＴＩＲドメインだけにした本遺伝子によりコードされるタンパク質の変異タンパク質では、本遺伝子によりコードされるタンパク質全長の導入によるインターフェロンβの遺伝子プロモーターの活性化をブロックするドミナントネガティブ（dominant negative：抑制）効果を有する。 When 293 cells (human embryonic kidney cells) were introduced together with a plasmid (plasmid) in which luciferase was incorporated under the gene promoter of interferon β (IFN-beta), expression of this gene enhanced luciferase activation. . This result indicates that the protein encoded by the gene is involved in the expression of interferon β. Since the promoter of the interferon β gene is not activated even when MyD88 and TIRAP are expressed, the protein encoded by the gene is specifically involved in the interferon induction signal among the proteins having the TIR domain Was showing. The mutant protein of the protein encoded by this gene with only the TIR domain has a dominant negative effect that blocks the activation of the interferon β gene promoter by introducing the entire protein encoded by this gene. .
２９３細胞にヒトＴＬＲ３（human TLR3）を発現させた細胞では、二重鎖ＲＮＡ刺激でインターフェロンβの遺伝子プロモーターが活性化される。このことは、ＴＬＲ３を介したシグナルがインターフェロンβの誘導に関わっていることを示唆している。これに、本遺伝子によりコードされるタンパク質のドミナントネガティブ（抑制）型、該タンパク質−ＴＩＲを導入すると、二重鎖ＲＮＡ刺激によるインターフェロンβの遺伝子プロモーターの活性化をブロックした。このブロックはＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインでは誘導できないことから、本遺伝子によりコードされるタンパク質がＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ非依存性のインターフェロン誘導のシグナルに関与していることを示している。 In cells in which human TLR3 (human TLR3) is expressed in 293 cells, the interferon β gene promoter is activated by double-stranded RNA stimulation. This suggests that the signal via TLR3 is involved in the induction of interferon β. When the dominant negative (repression) type of the protein encoded by this gene, the protein-TIR, was introduced into this gene, activation of the interferon β gene promoter by double-stranded RNA stimulation was blocked. Since this block cannot be induced in the TIR domains of MyD88 and TIRAP, it indicates that the protein encoded by this gene is involved in MyD88 and TIRAP-independent interferon induction signals.
本発明は、上記知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡによって発現されるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質からなる。該ＤＮＡは、配列表の配列番号１及び配列番号３に、及び、該タンパク質は、配列表の配列番号２及び配列番号４に示される。また、本発明は該ＤＮＡ及びタンパク質の変異体ＤＮＡ及び変異体タンパク質を含む。更に、本発明は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させた非ヒト動物、及び該抗体や非ヒト動物及び本発明の遺伝子プローブを用いた細胞の免疫賦活機能の判定及びインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法、等を含むものである。 The present invention has been completed based on the above findings. That is, this invention consists of DNA which codes the protein which has the interferon induction signaling activity in connection with the immune activation by virus origin double strand RNA and endotoxin, and the protein which has the interferon induction signaling activity expressed by this DNA. The DNA is shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the protein is shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The present invention also includes mutant DNAs and mutant proteins of the DNA and protein. Furthermore, the present invention relates to an antibody that specifically binds to the protein of the present invention, a non-human animal in which the gene of the present invention is deleted on the chromosome, and a cell using the antibody or non-human animal and the gene probe of the present invention. And the screening method of an interferon-inducing signal transduction active substance, and the like.
具体的には本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列表の配列番号２或いは配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを細胞に導入し、発現することを特徴とする細胞へのウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性の導入方法（請求項１）や、細胞が、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞であることを特徴とする請求項１記載の細胞へのウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性の導入方法（請求項２）からなる。
Specifically, the present invention relates to DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. wherein in the amino acid sequence shown, one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and a DNA encoding a protein having interferon-inducing signaling activity is introduced into cells, that express A method for introducing interferon-induced signaling activity related to immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin (Claim 1), or a cell having interferon involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin Gene machine encoding a protein having
また本発明は、細胞における配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子或いは配列表の配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子を検出するか、又は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質或いは配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現状態を検出することを特徴とする細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達機能の判定方法（請求項３）や、遺伝子の検出を、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ或いは配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列を遺伝子検出用プローブとして用いることを特徴とする請求項３記載の細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達機能の判定方法（請求項４）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質或いは配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と特異的に結合する抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することを特徴とする、請求項３記載の細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達機能の判定方法（請求項５）からなる。
The present invention also detects a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the cell sequence or a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence list, or Interferon induction related to immunostimulation by cell-derived virus-derived double-stranded RNA and endotoxin characterized by detecting the expression state of the protein comprising the amino acid sequence shown or the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing determination method (claim 3) or signaling function, the detection of the gene, the base sequence of the DNA consisting of SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: DNA or sequence list consisting of the nucleotide sequence represented by 1 in the sequence listing from the
さらに本発明は、細胞における配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子又は配列表の配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子の、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に、被検物質を投与し、該非ヒト動物のインターフェロン誘導活性を測定・評価することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法（請求項６）からなる。
Furthermore, the present invention provides for immunostimulation of a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing in the cell by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin A test substance is administered to a non-human animal deficient on the chromosome of a gene function encoding a protein having interferon-inducing signaling activity, and the interferon-inducing activity of the non-human animal is measured and evaluated, It comprises a screening method for interferon-inducing signal transduction active substances involved in immunostimulation with cellular viral-derived double-stranded RNA and endotoxin ( Claim 6 ).
本発明により、生物の微生物の侵入に対する生体防御機構に関与する、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を取得し、同定したことにより、本発明が、ウイルス感染によるインターフェロン誘導の分子機構の解明に大きく貢献できることのみならず、該ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活機構に関わる疾病の診断や該疾病を治療する治療薬の創出に有力な手段を提供することができる。 According to the present invention, a protein having interferon-induced signal transduction activity involved in immune activation by a virus-derived double-stranded RNA and endotoxin, which is involved in a biological defense mechanism against the invasion of microorganisms of an organism, and a gene encoding the protein are obtained, As a result of the identification, the present invention not only greatly contributes to the elucidation of the molecular mechanism of interferon induction by viral infection, but also diagnoses diseases related to the immunostimulatory mechanism by the virus-derived double-stranded RNA and therapies for treating the diseases It can provide a powerful tool for drug creation.
本発明は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子からなる。該遺伝子は、配列表の配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡからなる。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性としては、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性が挙げられる。 The present invention comprises a gene encoding a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin. The gene is composed of a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or a complementary sequence thereof and DNA containing a part or all of these sequences. The interferon-induced signaling activity of the present invention includes interferon β-induced signaling activity.
また、本発明は、次の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ；
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、からなる変異遺伝子を含む。該変異遺伝子を取得するには、本発明の配列表の遺伝子配列情報により、適宜公知の遺伝子工学の手法により変異させて、取得することができる。
The present invention also provides a DNA encoding the following protein (a) or (b):
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) Interferon-induced signaling involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 A mutant gene comprising an active protein. In order to obtain the mutated gene, it can be obtained by appropriately mutating it by a known genetic engineering technique using the gene sequence information in the sequence listing of the present invention.
更に、本発明は本発明の遺伝子（配列表の配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、インタクトな遺伝子の変異体を含む。該遺伝子を取得するには、例えば、配列表の配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からＤＮＡプローブを作製し、該ＤＮＡプローブを用いて、ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ機械受容チャネル機能を有するものを選択して、取得することができる。該ＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。 Furthermore, the present invention hybridizes with the gene of the present invention (DNA of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) under stringent conditions and interferon-induced signaling involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA. It includes DNA encoding a protein having activity, that is, a mutant of an intact gene. In order to obtain the gene, for example, a DNA probe is prepared from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing, and the DNA probe is used under conditions that are stringent to the DNA library. Can be obtained by selecting those that hybridize and have a mechanosensitive channel function. Examples of hybridization conditions for obtaining the DNA include hybridization at 42 ° C. and washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS. More preferably, hybridization at 65 ° C. and washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS can be mentioned.
本発明の、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質としては、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質や、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能を有する変異体タンパク質を具体的に挙げることができる。これらのタンパク質は、それをコードする本発明の遺伝子を用いて遺伝子工学的に、或いは本発明のＤＮＡ配列情報に基づき、その配列を組換えて公知の方法により調製することができる。本発明で取得した配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質は、いずれも、ＴＩＲドメインがタンパク質の中央部分に存在している。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性としては、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性が挙げられる。 The protein having interferon-induced signal transduction activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin according to the present invention is a virus-derived double comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing A protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by strand RNA, or an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing Specific examples include mutant proteins having the function of a protein having interferon-induced signal transduction activity involved in immunostimulation with a virus-derived double-stranded RNA comprising a sequence. These proteins can be prepared by a known method by genetic engineering using the gene of the present invention encoding the protein or by recombination of the sequence based on the DNA sequence information of the present invention. In any protein having interferon-induced signaling activity consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing obtained in the present invention, the TIR domain is present in the central part of the protein. The interferon-induced signaling activity of the present invention includes interferon β-induced signaling activity.
本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質は、本発明の遺伝子を用いて、遺伝子工学的に公知の方法により、製造することができる。即ち、本発明の遺伝子を、本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現するための発現ベクターに組込み、該組換えベクターを宿主細胞へ導入し、形質転換させて、該細胞を培養することにより、遺伝子を発現させて、本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を製造することができる。 The virus-derived double-stranded RNA of the present invention and a protein having interferon-induced signal transduction activity related to immunostimulation by endotoxin can be produced by a method known in genetic engineering using the gene of the present invention. That is, the gene of the present invention is incorporated into an expression vector for expressing the protein having interferon-induced signaling activity of the present invention, the recombinant vector is introduced into a host cell, transformed, and the cell is cultured. Thus, the gene can be expressed to produce the protein having interferon-induced signaling activity of the present invention.
上記本発明のタンパク質の遺伝子工学的製造に用いる発現系としては、該本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。 The expression system used for the genetic engineering production of the protein of the present invention may be any expression system that can express the protein of the present invention in a host cell, such as chromosome, episome and virus. Expression systems derived from, for example, bacterial plasmid-derived, yeast plasmid-derived, papovavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus-derived vector, bacteriophage-derived, transposon-derived and these Vectors derived from the combination, for example, plasmids such as cosmids and phagemids and those derived from the genetic elements of bacteriophages can be mentioned. These expression systems may contain control sequences that not only cause expression but also regulate expression.
また、上記本発明のタンパク質の遺伝子工学的製造に用いる、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞など、公知の宿主細胞の中から選択して用いることができる。また、本発明の遺伝子の宿主細胞への導入は、公知の標準的な実験室マニュアルに記載される方法等を用いて実施することができる。 The host cells used for the genetic engineering production of the protein of the present invention include bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus and Staphylococcus, fungal cells such as yeast and Aspergillus, and Drosophila. Insect cells such as S2, Spodoptera Sf9, L cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / c3T3 cells (including mutants lacking dihydrofolate reductase and thymidine kinase), BHK21 cells, HEK293 It can be selected from known host cells such as cells, Bowes melanoma cells, and animal and plant cells such as oocytes. In addition, the gene of the present invention can be introduced into a host cell using a method described in a known standard laboratory manual.
本発明は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体を含む。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等を具体的に挙げることができる。これらは上記本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を抗原として用いて常法により作製することができる。その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点ではより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することにより、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活機能を判定することができる。 The present invention includes antibodies that specifically bind to the protein of the present invention. Specific examples of the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. These can be prepared by a conventional method using, as an antigen, a protein having interferon-induced signaling activity involved in immune activation by the virus-derived double-stranded RNA of the present invention. Among these, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity. By using such an antibody such as a monoclonal antibody, the virus-derived double-stranded RNA of a cell is detected by detecting the expression state of a cell virus-derived double-stranded RNA and a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by endotoxin. The immunostimulatory function can be determined.
上記のような抗体を用いたタンパク質の検出に際して用いる、検出手段としては、適宜公知の手段を用いることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体等に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、抗体の反応を検出し、タンパク質の発現を検知することができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を用いることができる。 As a detection means used when detecting a protein using the antibody as described above, a known means can be appropriately used. For example, the monoclonal antibody of the present invention includes, for example, a fluorescent substance such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, a radioisotope such as 125 I, 32 P, 35 S or 3 H, alkaline phosphatase, peroxidase, Detect antibody reactions and detect protein expression by using fusion proteins fused with β-galactosidase or phycoerythrin and other fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) be able to. Moreover, as an immunological measurement method, methods such as RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, plaque method, spot method, hemagglutination method, and octalony method can be used.
本発明は、更に、染色体上で本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させ、該遺伝子機能の欠損したノックアウト非ヒト動物を含む。該非ヒト動物を作製するには、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸を他のアミノ酸に変換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することにより、インターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させて行うことができる。また、動物遺伝子の、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸配列に相当する部分を欠失させ、インターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損させて行うことができる。本発明における非ヒト動物としては、トリ、ウサギ、マウス、ラット等の非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、実験用として用いる目的からは、マウスが特に好ましい。本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性タンパク質をコードする遺伝子機能を欠損した非ヒト動物の作製に際して、遺伝子を導入する方法としては、ターゲティングベクターの構築等公知の適宜の方法を用いることができる。 The present invention further comprises a gene function encoding a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by the virus-derived double-stranded RNA and endotoxin of the present invention on the chromosome, and the knockout non-deficient gene function is deleted. Includes human animals. In order to produce the non-human animal, by introducing a gene encoding an amino acid sequence obtained by converting some of the amino acids into other amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, It can be performed by deleting the gene function encoding the interferon-inducing signal transduction active protein. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 of the animal gene, a part of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence is deleted, and a gene function encoding an interferon-inducing signal transduction protein is obtained. It can be done with a deficiency. Specific examples of the non-human animal in the present invention include non-human animals such as birds, rabbits, mice, and rats, but mice are particularly preferable for the purpose of use for experiments. In producing a non-human animal deficient in the gene function encoding the interferon-inducing signaling protein of the present invention, a known appropriate method such as construction of a targeting vector can be used as a method for introducing a gene.
本発明においては、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）を導入することによって細胞機能を修復し、インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現する細胞を調製することができる。 In the present invention, the gene (DNA) of the present invention is introduced into a cell in which a gene function encoding a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin is deficient on the chromosome. Thus, cells capable of repairing cell function and expressing a protein having interferon-induced signaling activity can be prepared.
また、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）又はその部分からなるＤＮＡ配列をウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブとして用いて、遺伝子を検出し、検体中のＤＮＡ配列と配列表の配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ配列とを比較することによって、判定することにより、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定を行うことができる。該判定により、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病を診断することができる。 Further, the gene (DNA) of the present invention or a DNA sequence comprising a part thereof is used as a gene detection probe encoding a protein having interferon-induced signaling activity related to immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin, Is detected by comparing the DNA sequence in the sample with the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, thereby determining the immunostimulatory function by the virus-derived double-stranded RNA and endotoxin. It can be carried out. By this determination, it is possible to diagnose a disease associated with the function or expression of a protein having interferon-induced signal transduction activity related to immune activation by virus-derived double-stranded RNA.
また、前記のように、本発明の抗体は、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態の検出に用いて、細胞のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定に用いることができる。該判定により、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病を診断することができる。 In addition, as described above, the antibody of the present invention is used for detection of the expression state of a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by cellular virus-derived double-stranded RNA and endotoxin. It can be used for determination of immunostimulatory function by heavy chain RNA and endotoxin. By this determination, it is possible to diagnose a disease associated with the function or expression of a protein having interferon-induced signal transduction activity related to immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin.
本発明のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブや本発明の抗体は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の診断用のキットとして製品化することができる。 The probe for gene detection encoding the protein having interferon-induced signaling activity of the present invention or the antibody of the present invention is a function or expression of a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin. It can be commercialized as a kit for diagnosing diseases related to.
本発明は、本発明のウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いて、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニングを行うことができる。該インターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニングには、被検物質を非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物の、例えばインターフェロンβのようなインターフェロン誘導活性を測定・評価することにより行うことができる。該インターフェロン誘導シグナル伝達活性物質は、ウイルス由来二重鎖ＲＮＡ及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の機能又は発現に関連する疾病の治療に用いることができる。 The present invention uses a non-human animal deficient in the gene function encoding a protein having interferon-induced signaling activity involved in immunostimulation by the virus-derived double-stranded RNA and endotoxin of the present invention on the basis of a virus-derived duplex. Screening for interferon-inducing signal transduction active substances involved in immunostimulation by strand RNA and endotoxin can be performed. The interferon-inducing signal transduction active substance can be screened by administering a test substance to a non-human animal, and measuring and evaluating the interferon-inducing activity of the non-human animal, such as interferon β. The interferon-inducing signal transduction active substance can be used for treatment of diseases related to the function or expression of a protein having interferon-inducing signal transduction activity involved in immunostimulation by virus-derived double-stranded RNA and endotoxin.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
この実施例では、ＴＬＲを経たシグナル伝達経路を更に明らかにするために、ＭｙＤ８８とＴＩＲＡＰ以外のＴＩＲ領域を含むアダプター分子を検索し、データベースによるスクリーニングによりＴＲＩＦ（インターフェロン−β（interferon-beta）を誘導するＴＩＲ領域を含むアダプター）と名づけた新規のアダプター分子を同定した。この実験により、ＴＲＩＦがＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰではなく、ＩＦＮ−βのプロモーター及びＴＲＩＦのドミナントネガティブ（抑制）型を優位的に活性化し、ポリ（Ｉ：Ｃ）に介されたＴＬＲ３反応を阻害することから、この新規アダプターがＴＬＲ３シグナルにおける特異的な役割をもつことを確認した。 In this example, in order to further clarify the signal transduction pathway via TLR, adapter molecules including TIR regions other than MyD88 and TIRAP were searched, and TRIF (interferon-beta) was induced by database screening. A new adapter molecule was identified which was named adapter containing the TIR region. As a result of this experiment, TRIF activates the IFN-β promoter and the dominant negative (suppressed) form of TRIF, not MyD88 or TIRAP, and inhibits the TLR3 reaction mediated by poly (I: C). This novel adapter was confirmed to have a specific role in the TLR3 signal.
［遺伝子の同定と機能の解明］
材料と方法
（免疫沈降と免疫ブロット）
２９３細胞に、発現ベクターに表示されたＤＮＡ断片を挿入したプラスミドをトランスフェクションし、一過性発現させた。細胞を０．１５％ＮＰ−４０、２０ｍＭ トリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、及びプロテアーゼ阻害剤（混合物：Roche Diagnostics社製）を含む溶菌バッファー中で溶解した。細胞溶解液をProtein G-sepharose（Amersham社製）で前精製を１時間行い、次に２μｇの抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Sigma社製）、２μｇの抗Ｍｙｃ ＰＬ１４抗体（ＭＢＬ社製）もしくは１μｇの抗ヒトＩＲＦ−３抗体（SantaCruz社製）及びProtein G-sepharose（Amersham社製）で２時間免疫沈降した。
[Identification of genes and elucidation of functions]
Materials and methods (immunoprecipitation and immunoblotting)
293 cells were transfected with a plasmid in which the DNA fragment indicated in the expression vector was inserted, and transiently expressed. Cells were treated with 0.15% NP-40, 20 mM Tris-HCL (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 , and protease inhibitors (mixture: It was dissolved in a lysis buffer containing Roche Diagnostics). The cell lysate was pre-purified with Protein G-sepharose (Amersham) for 1 hour, then 2 μg of anti-Flag M2 antibody (Sigma), 2 μg of anti-Myc PL14 antibody (MBL) or 1 μg of anti-antibody. Immunoprecipitation was performed with human IRF-3 antibody (SantaCruz) and Protein G-sepharose (Amersham) for 2 hours.
免疫沈降物を、溶解液中で洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（BIO-RAD社製）に移した。Ｆｌａｇがタグされた（Flag-tagged）タンパク質やＭｙｃがタグされた（Myc-tagged）タンパク質はＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体もしくはＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ ９Ｅ１０抗体（SantaCruz社製）とそれぞれ反応させた。内因性のＩＲＦ−３は抗ヒトＩＲＦ−３抗体とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）と反応させ、抗体によって認識されたバンドをＥＣＬシステムによって検出した（PerkinElmer Life Sciences社製）。 The immunoprecipitate was washed in a lysate, dissolved in SDS sample buffer, separated by SDS-PAGE, and transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (manufactured by BIO-RAD). Flag-tagged protein and Myc-tagged protein were reacted with HRP-labeled anti-Flag M2 antibody or HRP-labeled anti-Myc 9E10 antibody (manufactured by SantaCruz), respectively. Endogenous IRF-3 was reacted with anti-human IRF-3 antibody and HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham), and the band recognized by the antibody was detected by ECL system (PerkinElmer Life Sciences).
［実験結果と考察］
（ＴＲＩＦの同定）
ＭｙＤ８８と、ＴＩＲ領域のＴＩＲＡＰ以外の分子がＴＬＲを介したシグナル経路に関与していると予測し、ＴＩＲドメインを有する配列をexpressed sequence tag（ＥＳＴ）データベース上で検索し、新規のヒトｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：ＢＣ００９８６０、配列番号１）を同定し、ＴＲＩＦと命名した。この遺伝子はＮＣＢＩに登録されているＴＩＲ領域（ｓｍａｒｔ００２５５ ＴＩＲ）と非常に類似していた（図１ａ）。この断片をプローブとして、この遺伝子の完全長ｃＤＮＡを同定した。ＭｙＤ８８（２９６アミノ酸をコード）とＴＩＲＡＰ／Ｍａｌ（２３５アミノ酸）と比較すると、この遺伝子には２１３６ｂｐの長いオープンリーディングフレームがあり、７１２アミノ酸（配列番号２）をコードしていた（図１ｂ）。
[Experimental results and discussion]
(Identification of TRIF)
A molecule other than MyD88 and TIRAP in the TIR region is predicted to be involved in the signal pathway via TLR, and a sequence having a TIR domain is searched on the expressed sequence tag (EST) database, and a new human cDNA clone ( Accession number: BC009860, SEQ ID NO: 1) was identified and named TRIF. This gene was very similar to the TIR region registered in NCBI (smart00255 TIR) (FIG. 1a). Using this fragment as a probe, the full-length cDNA of this gene was identified. Compared to MyD88 (coding 296 amino acids) and TIRAP / Mal (235 amino acids), this gene had a long open reading frame of 2136 bp and encoded 712 amino acids (SEQ ID NO: 2) (FIG. 1b).
このヒトＴＲＩＦアミノ酸配列がコードされたｃＤＮＡは未知の機能のマウスＴＲＩＦ ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号：ＸＭ１１０２４４、配列番号３）と５５％の相同性を示した。この遺伝子産物をＴＲＩＦ、即ちＩＦＮ−βを誘導するアダプターを含むＴＩＲ領域とした（図２）。 The cDNA encoding this human TRIF amino acid sequence showed 55% homology with a mouse TRIF cDNA clone of unknown function (accession number: XM110244, SEQ ID NO: 3). This gene product was designated as TIR region containing an adapter that induces TRIF, that is, IFN-β (FIG. 2).
ＴＲＩＦのＴＩＲ領域は、ＴＲＩＦタンパク質のＣ末端側に存在した。また、ＴＬＲ中に保存されＴＬＲを介したシグナルの活性に必須なプロリン残基がみられた（図１ａ）（Science 282, 2085, 1998；J. Immunol. 162, 374, 1999；Nature 401, 811, 1999）。ＴＲＩＦの発現を、ヒトの組織から抽出した全ＲＮＡを用いてノーザンハイブリダイゼーションにより解析した。プローブとして、ヒトＴＲＩＦ ｃＤＮＡの６７８〜１４８１番目のｃＤＮＡ断片を、［32Ｐ］−ｄＣＴＰでメガプライムＤＮＡラベリングキット（Amersham社製）を用いてラベルし、human MTN blot（Clontech社製）のExpressHyb solution（Clontech社製）１０ｍｌで６５℃、１２時間ハイブリダイズを行った後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで６５℃、３０分洗浄し、BioMax MSフィルム（KODAK社製）で現像を行った。その結果、脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋等多くの組織で観察され、特に肝臓で高発現していた（図１ｃ）。 The TIR region of TRIF was present on the C-terminal side of TRIF protein. In addition, proline residues conserved in TLR and essential for signal activity via TLR were observed (FIG. 1a) (Science 282, 2085, 1998; J. Immunol. 162, 374, 1999; Nature 401, 811). 1999). The expression of TRIF was analyzed by Northern hybridization using total RNA extracted from human tissues. As a probe, the 678 to 1481th cDNA fragment of human TRIF cDNA was labeled with [ 32 P] -dCTP using a megaprime DNA labeling kit (Amersham), and ExpressHyb solution of human MTN blot (Clontech). (Clontech) After hybridization with 10 ml at 65 ° C. for 12 hours, 2 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes, 0.2 × SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. , Washed for 30 minutes, and developed with BioMax MS film (manufactured by KODAK). As a result, it was observed in many tissues such as brain, lung, heart, liver, spleen, kidney, skeletal muscle, and was particularly highly expressed in the liver (FIG. 1c).
（ＴＲＩＦによるＩＦＮ−βプロモーターとＮＦ−κＢ誘導活性）
ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの強制発現が、２９３細胞においてＮＦ−κＢの活性を誘導することを、ヒトＥＬＡＭ−１遺伝子のＮＦ−κＢ応答性プロモーター（配列番号５）のルシフェラーゼ活性を測定することにより解析した。（図３ａ、左）。ＴＲＩＦの発現はＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰを介する誘導と比較して低水準ではあるが、ＮＦ−κＢの活性化を誘導した。ＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）及び二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（ＴＬＲ３リガンド）は、ＭｙＤ８８非依存的にＩＦＮ−βの発現を誘導した（Nat. Immunol. 3, 392, 2002、J. Immunol. 162, 374, 2002、Nature 413, 732, 2001）。次にマウスＩＦＮ−βプロモーター（配列番号６）活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて観察した（図３ａ、右）。レポータープラスミドと共に誘導されたＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰの発現が誘導されたときは、プロモーター活性は観察されなかった。しかしながら、ＴＲＩＦの発現は、ＩＦＮ−βのプロモーター活性を劇的に誘導した。
(IFN-β promoter and NF-κB induction activity by TRIF)
The forced expression of MyD88 and TIRAP induced NF-κB activity in 293 cells by analyzing the luciferase activity of the human ELAM-1 gene NF-κB responsive promoter (SEQ ID NO: 5). (Figure 3a, left). Although the expression of TRIF was at a low level compared to induction via MyD88 or TIRAP, it induced activation of NF-κB. LPS (TLR4 ligand) and double-stranded RNA (dsRNA) (TLR3 ligand) induced IFN-β expression independent of MyD88 (Nat. Immunol. 3, 392, 2002, J. Immunol. 162, 374). , 2002, Nature 413, 732, 2001). Next, mouse IFN-β promoter (SEQ ID NO: 6) activity was observed using a luciferase reporter gene (Fig. 3a, right). No promoter activity was observed when MyD88 or TIRAP expression induced with the reporter plasmid was induced. However, the expression of TRIF dramatically induced IFN-β promoter activity.
ＴＲＩＦタンパク質内のプロモーターの活性に必須な領域を同定するために、末端欠損型ＴＲＩＦを数種類作製した。ＴＩＲ領域及びＴＲＩＦのＮ末端側半分（１〜５４１番目のアミノ酸）を含むものを△Ｃ、ＴＩＲ領域及びＴＲＩＦのＣ末端側半分（３８０番目〜Ｃ末端終点までのアミノ酸）含むものを△Ｎ、及びＴＩＲ領域でのみ構成されているものを△Ｎ△Ｃとした（図３ｂ）。２９３細胞にＮＦ−κＢ応答性ルシフェラーゼレポーターを共トランスフェクションさせると、△Ｃ或いは△Ｎの一方が全長ＴＲＩＦを介する誘導と比較して活性が減少しているものの、ルシフェラーゼ活性を誘導した（図３ｃ、左）。ＩＦＮ−βプロモーター由来ルシフェラーゼ遺伝子の場合、△Ｃは全長ＴＲＩＦによる誘導と同程度のプロモーター活性が認められたが、△Ｎでは認められなかった（図３ｃ、右）。△Ｎ△Ｃにおいては、ルシフェラーゼレポータープロモーターの活性は認められなかった。これらの結果により、ＴＲＩＦの明確な領域が次に挙げる２種類のプロモーターの活性化の原因となること、即ち、ＴＲＩＦのＮ末端の一部分はＩＦＮ−βプロモーター活性に必須であり、ＴＲＩＦのＮ末端とＣ末端双方の一部分はＮＦ−κＢの活性化に関与している、ということが示唆された。 In order to identify the region essential for the activity of the promoter in the TRIF protein, several types of terminal-deficient TRIF were prepared. ΔC containing TIR region and TRIF N-terminal half (amino acid from 1 to 541), ΔN containing TIR region and CIF half of TRIF (amino acid from 380th to C-terminal end) And what was comprised only in the TIR area | region was set to (DELTA) N (DELTA) C (FIG. 3b). When 293 cells were co-transfected with an NF-κB responsive luciferase reporter, either ΔC or ΔN induced luciferase activity, although the activity was reduced compared to induction via full-length TRIF (FIG. 3c). ,left). In the case of the IFN-β promoter-derived luciferase gene, ΔC showed promoter activity similar to that induced by full-length TRIF, but not ΔN (FIG. 3c, right). In ΔNΔC, the activity of the luciferase reporter promoter was not observed. These results indicate that a distinct region of TRIF is responsible for the activation of the following two promoters: a portion of the N-terminus of TRIF is essential for IFN-β promoter activity, and the N-terminus of TRIF It was suggested that a part of both the C-terminal and C-terminal is involved in the activation of NF-κB.
（ＴＲＩＦ抑制型のＴＬＲ経由シグナル伝達経路への影響）
ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの場合と同様に、ＴＲＩＦのＴＩＲ領域（△Ｎ△Ｃ）の発現はドミナント阻害因子（dominant inhibitor）として作用した。全長ＴＲＩＦが誘導したＮＦ−κＢ及びＩＦＮ−βプロモーターの活性化はＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの発現により顕著に抑制された（図４ａ）。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃを用いて、ＴＲＩＦがＴＬＲ依存性シグナル伝達経路であるかどうかを解析した。２９３細胞におけるＴＬＲ４／ＭＤ−２の発現は、この細胞がＬＰＳに応答してＮＦ−κＢレポーターを活性化することを可能にした。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの共発現は、ＴＬＲ４−に依存したＮＦ−κＢの活性化を阻害（inhibit）した（図４ｂ）。さらに、ＴＬＲ−２及びＴＬＲ−７に依存したＮＦ−κＢの活性化は、ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの発現により抑制（prohibit）された（図４ｃ、ｄ）。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの強制発現は、ＮＦ−κＢのリガンド非依存的な活性化をもたらした。ＴＲＩＦ△Ｎ△Ｃの共発現は、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰを介したＮＦ−κＢの活性化を顕著に阻害した（図４ｅ、ｆ）。これらの結果により、ＴＲＩＦがＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの下流で多くのＴＬＲ仲介シグナル伝達経路に関与していることが示唆された。
(Influence on TRIF-inhibited TLR-mediated signaling pathway)
As with MyD88 and TIRAP, expression of the TIR region (ΔNΔC) of TRIF acted as a dominant inhibitor. The activation of NF-κB and IFN-β promoters induced by full-length TRIF was remarkably suppressed by the expression of TRIFΔNΔC (FIG. 4a). TRIFΔNΔC was used to analyze whether TRIF is a TLR-dependent signaling pathway. Expression of TLR4 / MD-2 in 293 cells allowed the cells to activate the NF-κB reporter in response to LPS. Co-expression of TRIFΔNΔC inhibited TLR4-dependent NF-κB activation (FIG. 4b). Furthermore, the activation of NF-κB depending on TLR-2 and TLR-7 was inhibited by the expression of TRIFΔNΔC (FIGS. 4c and d). Forced expression of MyD88 and TIRAP resulted in ligand-independent activation of NF-κB. Co-expression of TRIFΔNΔC markedly inhibited activation of NF-κB via MyD88 and TIRAP (FIGS. 4e, f). These results suggested that TRIF is involved in many TLR-mediated signaling pathways downstream of MyD88 and TIRAP.
他のＴＬＲメンバーと比較して、ＴＬＲ３は、ＩＬ−１２及びＴＮF−ａ（Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1364, 2002）のような他の炎症性サイトカインよりもさらに優性にＩＦＮ−βを誘導する独自のシグナル経路を介している。安定してＴＬＲ３を発現している２９３細胞に、１００ｎｇのレポータープラスミドをlipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いてトランスフェクションし、２４時間後に５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で８時間刺激すると、ＮＦ−κＢ及びＩＦＮ−βプロモーターの両方が活性化された（図４ｅ、ｆ）。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの抑制型の共発現は、ＩＦＮ−βプロモーター及びＮＦ−κＢ応答性ＥＬＡＭ−１プロモーターの活性をポリ（Ｉ：Ｃ）依存的に阻害しなかったことから、ＴＬＲ−３シグナルは主にＭｙＤ−８８非依存的経路で構成されていることを示している（図４ｅ、ｆ）。ＴＲＩＦの強制発現はＩＦＮ−βプロモーターを優位的に活性化したことから、我々はＴＬＲ３シグナルにおけるＴＲＩＦの役割に焦点を当てた。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの抑制型に対する明確な対照として、ＴＲＩＦ△Ｎ△ＣはＴＬＲ３を安定して発現する２９３細胞において、両プロモーターのポリ（Ｉ：Ｃ）依存的な活性を阻害した。これらの結果は、ＴＲＩＦがＴＬＲ３シグナルのＭｙＤ８８非依存的活性化に関与していることを示している。 Compared to other TLR members, TLR3 is more predominantly IFN-β than other inflammatory cytokines such as IL-12 and TNF-a (Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1364, 2002). Through its own signaling pathway to induce When 293 cells stably expressing TLR3 are transfected with 100 ng of a reporter plasmid using lipofectamine 2000 (Invitrogen), 24 hours later, the cells are stimulated with 50 μg / ml poly (I: C) for 8 hours. Both the NF-κB and IFN-β promoters were activated (Fig. 4e, f). The repressive co-expression of MyD88 and TIRAP did not inhibit the activity of the IFN-β promoter and NF-κB-responsive ELAM-1 promoter in a poly (I: C) -dependent manner. It is shown that it is composed of a MyD-88-independent route (FIGS. 4e and f). Since forced expression of TRIF preferentially activated the IFN-β promoter, we focused on the role of TRIF in the TLR3 signal. As a clear control for the inhibitory forms of MyD88 and TIRAP, TRIFΔNΔC inhibited poly (I: C) -dependent activity of both promoters in 293 cells stably expressing TLR3. These results indicate that TRIF is involved in MyD88-independent activation of TLR3 signal.
（ＴＲＩＦによるＴＬＲ３及びＩＲＦ−３の認識）
ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３或いはＴＬＲ２を認識するかどうかを解析した。ヒト腎細胞２９３細胞に７μｇのＦｌａｇ−ＴＬＲ２（ＦｌａｇがタグされたＴＬＲ２：Flag-tagged TLR2）若しくはＦｌａｇ−ＴＬＲ３（ＦｌａｇがタグされたＴＬＲ３：Flag-tagged TLR3）と、３μｇのＭｙｃ−ＴＲＩＦ（ＭｙｃがタグされたＴＲＩＦ：Myc-tagged TRIF）をトランスフェクションし、一過性発現させた。ｍｏｃｋ（対照）群においては、空のベクターを１０μｇトランスフェクションしたものを用いた。トランスフェクションの３６時間後、細胞を０．１５％ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、及びプロテアーゼ阻害剤（混合物はRoche Diagnostics社製）を含む溶菌バッファー中で溶解した。
(Recognition of TLR3 and IRF-3 by TRIF)
It was analyzed whether TRIF recognizes TLR3 or TLR2.
細胞溶解液をProtein G-sepharose（Amersham社製）を用いて前精製を１時間行い、次に２μｇの抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（anti-Flag M2 antibody：Sigma社製）、２μｇの抗Ｍｙｃ ＰＬ１４抗体（anti-Myc PL14 antibody：ＭＢＬ社製）もしくは１μｇの抗ヒトＩＲＦ−３抗体（anti-human IRF-3 antibody:SantaCruz社製）及びProtein G-sepharose（Amersham社製）で２時間免疫沈降を行った（図５ａ）。免疫沈降物を、溶解バッファーで洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量別に分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（BIO-RAD社製）に移した。Flag-Taggedタンパク質及びMyc-Taggedタンパク質は、それぞれＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体もしくはＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ ９Ｅ１０抗体（SantaCruz社製）とそれぞれ反応させた。内因性のＩＲＦ−３は抗ヒトＩＲＦ−３抗体及びＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham社製）と反応させ、抗体によって認識されたバンドをＥＣＬシステム（PerkinElmer Life Sciences社製）により検出した。 The cell lysate was pre-purified using Protein G-sepharose (Amersham) for 1 hour, and then 2 μg of anti-Flag M2 antibody (manufactured by Sigma), 2 μg of anti-Myc PL14 antibody (manufactured by Sigma). anti-Myc PL14 antibody (manufactured by MBL) or immunoprecipitation was performed with 1 μg of anti-human IRF-3 antibody (anti-human IRF-3 antibody: SantaCruz) and Protein G-sepharose (manufactured by Amersham) for 2 hours. (Figure 5a). The immunoprecipitate was washed with a lysis buffer, dissolved in an SDS sample buffer, separated according to molecular weight by SDS-PAGE, and transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (manufactured by BIO-RAD). Flag-Tagged protein and Myc-Tagged protein were respectively reacted with HRP-labeled anti-Flag M2 antibody or HRP-labeled anti-Myc 9E10 antibody (manufactured by SantaCruz). Endogenous IRF-3 was reacted with an anti-human IRF-3 antibody and an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham), and a band recognized by the antibody was detected by an ECL system (PerkinElmer Life Sciences).
既に報告したとおり、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰのＴＩＲ領域はＴＬＲとの相互作用に必須である。そこで、ＴＲＩＦのＴＩＲ領域（△Ｎ△Ｃ）がＴＬＲ３を認識するかどうかを解析した。Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３を安定的に発現させた２９３細胞に、空のベクター若しくはＭｙｃ−ＴＲＩＦ（△Ｎ△Ｃ）発現ベクター（１０μｇ）をトランスフェクションし、一過性発現させた。Ｍｙｃ−ＴＲＩＦ△Ｎ△ＣをＦｌａｇ−ＴＬＲ３で免疫沈降した後、上記と同様の方法により免疫ブロットを行った。その結果、ＴＲＩＦがＴＩＲ領域を介してＴＬＲ３を認識する（図５ｂ）ことから、ポリ（Ｉ：Ｃ）．ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してＩＦＮ−βの誘導を介し、ＬＰＳによる刺激がＩＲＦ−３を活性化することを示唆された（J. Biol. Chem. 274, 35535, 1999、FEBS Lett. 517, 251, 2001）。 As already reported, the TIR region of MyD88 and TIRAP is essential for interaction with TLR. Therefore, it was analyzed whether or not the TIR region (ΔNΔC) of TRIF recognizes TLR3. An empty vector or Myc-TRIF (ΔNΔC) expression vector (10 μg) was transfected into 293 cells stably expressing Flag-TLR3 to cause transient expression. After immunoprecipitation of Myc-TRIFΔNΔC with Flag-TLR3, immunoblotting was performed by the same method as described above. As a result, since TRIF recognizes TLR3 via the TIR region (FIG. 5b), poly (I: C). It was suggested that stimulation with LPS activates IRF-3 via induction of IFN-β in response to poly (I: C) (J. Biol. Chem. 274, 35535, 1999, FEBS Lett. 517, 251, 2001).
さらに、ＴＲＩＦが、内因性のＩＲＦ−３を認識するかどうかを解析した。２９３細胞に５μｇのＦｌａｇ−ＧＳＴもしくはＦｌａｇ−ＴＲＩＦ発現ベクターをトランスフェクションし、一過性発現させた。トランスフェクション２４時間後に細胞を溶解し、全細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体、若しくは抗ヒトＩＲＦ−３抗体と共に免疫沈降した後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて、上記と同様の方法により免疫ブロットを行った。また、内因性ＩＲＦ−３を検出するために、全細胞溶解物（whole cell lysate：ＷＣＬ）を抗ＩＲＦ−３抗体を用いて免疫ブロットした。その結果、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３に認識されることから、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３と相互作用することが示唆された（図５ｃ）。 Furthermore, it was analyzed whether TRIF recognizes endogenous IRF-3. 293 cells were transfected with 5 μg of Flag-GST or Flag-TRIF expression vector for transient expression. Cells were lysed 24 hours after transfection, and the whole cell lysate was immunoprecipitated with anti-Flag antibody or anti-human IRF-3 antibody, and then immunoblotted with anti-Flag antibody in the same manner as described above. . In addition, in order to detect endogenous IRF-3, whole cell lysate (WCL) was immunoblotted using an anti-IRF-3 antibody. As a result, TRIF was recognized by IRF-3, suggesting that TRIF interacts with IRF-3 (FIG. 5c).
［考察］
本実験において、ＴＩＲ領域を含む新規アダプター分子を同定してＴＲＩＦと命名し、解析を行った。ＴＲＩＦの過剰発現は、ＥＬＡＭ−１遺伝子のＮＦ−κＢ応答性プロモーターと同様、ＩＦＮ−β遺伝子のプロモーターを活性化した。既に公知であるアダプター分子であるＭｙＤ８８やＴＩＲＡＰとは異なり、ＴＲＩＦはＮＦ−κＢ応答性プロモーターと比較してＩＦＮ−βプロモーターを優位的に活性化させた。注目すべき点は、ＴＲＩＦの抑制型は、ＭｙＤ８８或いはＴＩＲＡＰではなく、完全にＴＬＲ３を介したシグナルを阻害したことである。このことは、ＴＬＲ３シグナルにおけるＴＲＩＦの特異的な役割を示している。さらに、ＴＲＩＦの抑制型は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、或いはＴＬＲ７を介したＮＦ−κＢ活性を阻害することから、他のＴＬＲシグナル経路において何らかの役割が存在することが示唆される。それぞれのＴＬＲ応答におけるＴＲＩＦの機能的役割がノックアウトマウスの発生の過程で観察されたとしても、ＴＲＩＦが優位的にＩＦＮ−βプロモーターを活性化させ、ＴＲＩＦがＩＲＦ−３と認識するということは、ＴＲＩＦがＴＬＲ３シグナルのＭｙＤ８８非依存的経路においてＴＲＩＦが関与していることを示している。
[Discussion]
In this experiment, a novel adapter molecule containing the TIR region was identified and named TRIF for analysis. Overexpression of TRIF activated the promoter of the IFN-β gene as well as the NF-κB responsive promoter of the ELAM-1 gene. Unlike MyD88 and TIRAP, which are already known adapter molecules, TRIF activated the IFN-β promoter predominantly compared to the NF-κB responsive promoter. It should be noted that the inhibitory form of TRIF completely inhibited TLR3-mediated signals, not MyD88 or TIRAP. This indicates a specific role for TRIF in the TLR3 signal. Furthermore, the suppressed form of TRIF inhibits NF-κB activity via TLR2, TLR4, or TLR7, suggesting that some role exists in other TLR signaling pathways. Even though the functional role of TRIF in each TLR response was observed during the development of knockout mice, TRIF preferentially activates the IFN-β promoter and TRIF recognizes as IRF-3. It shows that TRIF is involved in the MyD88-independent pathway of TLR3 signal.
Toll-like receptor（ＴＬＲ）の刺激は、炎症性サイトカインの産出を導く共通のＭｙＤ８８依存経路、及びＩＦＮ−βの生成を導き、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナルに独特のＭｙＤ８８非依存経路の活性化を誘因する。本実施例で、本発明者は、ＴＩＲドメインを含むアダプター、ＴＲＩＦをコードする遺伝子を破壊し、ＴＲＩＦ欠損マウスを作製して、ＴＲＩＦのＴＬＲを経たシグナル伝達経路における役割について更に明らかにした。 Stimulation of Toll-like receptor (TLR) leads to the generation of a common MyD88-dependent pathway that leads to the production of inflammatory cytokines, and IFN-β, and triggers activation of a MyD88-independent pathway that is unique to TLR3 and TLR4 signals . In this example, the present inventor disrupted a gene encoding an adapter containing TIR domain, TRIF, and created a TRIF-deficient mouse, and further clarified its role in the signal transduction pathway via TLR TLR.
すなわち、ＴＲＩＦ欠損マウスには、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を介したＩＦＮ−βの発現及びＩＲＦ−３の活性化に欠陥があった。更に、ＴＬＲ４を介した、炎症性サイトカインの産出が、ＴＲＩＦ欠損マクロファージで、消失していた。ＭｙＤ８８及びＴＲＩＦの両方が欠損したマウスでは、ＴＬＲ４刺激に応答したＮＦ−κＢの活性化が完全に喪失していた。これらの結果は、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を介したシグナル経路に必須であることを立証した。 That is, TRIF-deficient mice were defective in IFN-β expression and IRF-3 activation via TLR3 and TLR4. Furthermore, the production of inflammatory cytokines via TLR4 was lost in TRIF-deficient macrophages. Mice deficient in both MyD88 and TRIF had a complete loss of NF-κB activation in response to TLR4 stimulation. These results demonstrated that TRIF is essential for signaling pathways via TLR3 and TLR4.
［ＴＲＩＦ欠損マウスの作製と機能の解明］
材料と方法
（ＴＲＩＦ欠損マウスの作製）
ＥＳ細胞（Ｅ１４．１）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法で、Takara LA TaqTM（TaKaRa社製）を使用して、Trif遺伝子を単離した。ＴＲＩＦ ＯＲＦ全体をコードする２．１Ｋｂ断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏ）で置換して、ターゲティングベクターを構築した。負の選択のために、ＰＧＫプロモーターにより促進された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを、ゲノム断片に挿入した（図１ａ）。ターゲティングベクターをＥＳ細胞に挿入した後、Ｇ４１８及びgancyclovir二重耐性コロニーを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法でスクリーニングした。相同的な組替え体をＣ５７ＢＬ／６メスのマウスに注入し、ヘテロＦ１子をインタークロスして、ＴＲＩＦ欠損マウスを作製した。ＴＲＩＦ欠損マウスとそれらをインタークロスした野生型の同腹子とを実験に使用した。
[Creation of TRIF-deficient mice and elucidation of their functions]
Materials and methods (production of TRIF-deficient mice)
Trif gene was isolated from genomic DNA of ES cells (E14.1) by PCR using Takara LA Taq ™ (TaKaRa). A 2.1 Kb fragment encoding the entire TRIF ORF was replaced with a neomycin resistance gene cassette (neo) to construct a targeting vector. For negative selection, herpes simplex virus thymidine kinase promoted by the PGK promoter was inserted into the genomic fragment (FIG. 1a). After inserting the targeting vector into ES cells, G418 and gancyclovir double resistant colonies were selected and screened by PCR and Southern blotting. Homologous recombinants were injected into C57BL / 6 female mice and hetero F1 pups were intercrossed to produce TRIF-deficient mice. TRIF-deficient mice and wild-type littermates intercrossed with them were used in the experiment.
（抗体）
Ｒ−４８４は株式会社ジャパンエナジー、医薬バイオ研究所から提供された。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを、文献記載に準じて調製した。サルモネラ内毒素Ｒｅ５９５からのＬＰＳを、フェノールクロロフォルム石油エーテル抽出過程により調製した。S.aureus（黄色ブドウ球菌）からのＰＧＮ及びポリ（Ｉ：Ｃ）は、それぞれFluka社及びAmersham社から購入した。抗phosphoＪＮＫ抗体及び抗ＥＲＫ１／２抗体は、Cell Signaling社より購入した。抗ＪＮＫ１抗体は、Santa Cruz社から購入した。免疫沈降又は免疫ブロット用に、ＴＲＩＦマウスのアミノ酸６７２〜６８４又は７１８〜７３２に対するポリクロナール抗ＴＲＩＦ抗体を、それぞれ産出した。ＩＦＲ−３マウスのアミノ酸１３１〜１４４に対するポリクロナール抗ＩＲＦ３抗体を産出した。ＦＡＣＳ分析を行った抗ＩｇＭ抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratoryから購入した。
(antibody)
R-484 was provided by Japan Energy, Pharmaceutical Biolab. CpG oligodeoxynucleotides were prepared according to literature descriptions. LPS from Salmonella endotoxin Re595 was prepared by a phenol chloroform petroleum ether extraction process. PGN and poly (I: C) from S. aureus (S. aureus) were purchased from Fluka and Amersham, respectively. Anti-phosphoJNK antibody and anti-ERK1 / 2 antibody were purchased from Cell Signaling. Anti-JNK1 antibody was purchased from Santa Cruz. Polyclonal anti-TRIF antibodies against amino acids 672-684 or 718-732 of TRIF mice were produced for immunoprecipitation or immunoblotting, respectively. A polyclonal anti-IRF3 antibody against amino acids 131-144 of IFR-3 mice was produced. The anti-IgM antibody subjected to FACS analysis was purchased from Jackson ImmunoResearch Laboratory.
（電気泳動度シフト法）
胎児の繊維芽細胞及び肺繊維芽細胞（１×１０6）を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ−αで、示された時間刺激した。細胞から核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合部位用の特異のプローブとインキュベートし、電気泳動し、文献記載に準じて、オートラジオグラフィで視覚化した（Immunity 9:143,1998）。
(Electrophoresis shift method)
Fetal fibroblasts and lung fibroblasts (1 × 10 6 ) were stimulated with 10 μg / ml LPS, 50 μg / ml poly (I: C) and 10 ng / ml TNF-α for the indicated times. Nuclear extracts from cells were purified, incubated with specific probes for NF-κB DNA binding sites, electrophoresed and visualized by autoradiography according to literature descriptions (Immunity 9: 143,1998).
（炎症誘発性サイトカイン濃度の測定）
９６well plateで、ＰＧＮ、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡの示された濃度で、チオグリコール酸が誘出した腹腔マクロファージを培養した（well毎に５×１０4細胞）。腹腔マクロファージが産出したＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０を、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡで測定した（Genzyme社製）。
(Measurement of pro-inflammatory cytokine concentration)
In 96-well plates, peritoneal macrophages elicited by thioglycolic acid were cultured at the indicated concentrations of PGN, LPS, R-848 or CpG DNA (5 × 10 4 cells per well). TNF-α, IL-6 and IL-12p40 produced by peritoneal macrophages were measured by ELISA according to the manufacturer's instructions (Genzyme).
（Ｂ細胞増殖分析）
９６well plateで、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡの示された濃度で、２４時間脾細胞（１×１０5）を培養した。１マイクロキュリーの［3Ｈ］チミジンを、後半の１２時間パルスし、次に［3Ｈ］摂取量を、βシンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
(B cell proliferation analysis)
Spleen cells (1 × 10 5 ) were cultured in 96 well plates at the indicated concentrations of poly (I: C), LPS, R-848 or CpG DNA for 24 hours. One microcurie of [ 3 H] thymidine was pulsed for the last 12 hours, and then [ 3 H] intake was measured with a β scintillation counter (Packard).
（フローサイトメトリー分析）
２００万の脾細胞を、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体で培養した。３６時間の培養後、細胞を収集し、ＰＥ共役抗Ｂ２２０抗体及びビオチン共役抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗Ｉ−Ａｂ抗体、その後ストレプトアビジンＦＩＴＣで染色した。染色した細胞はCellQuest software（Becton Dickison 社製）を使用して、ＦＡＣＳ Caliburで分析した。
(Flow cytometry analysis)
Two million splenocytes were cultured with 50 μg / ml poly (I: C), 10 μg / ml LPS or 10 μg / ml anti-IgM antibody. After 36 hours of culture, cells were collected and stained with PE-conjugated anti-B220 antibody and biotin-conjugated anti-CD69 antibody, anti-CD86 antibody, anti-I-Ab antibody, and then streptavidin FITC. The stained cells were analyzed with FACS Calibur using CellQuest software (Becton Dickison).
（ウェスタンブロット分析）
肺繊維芽細胞（１×１０6）を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。次に、１．０％ Nonidet-P 40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ抑制カクテル（Roche社製）を含む溶解緩衝液内で、細胞を溶解した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分解し、ＰＶＤＦ細胞膜（BioRad社製）上に移動した。細胞膜は、抗phosphoＪＮＫ抗体又は抗ＪＮＫ１抗体でブロットし、強化された化学発光システムにより視覚化した（NEN Life Science Product社製）。
(Western blot analysis)
Lung fibroblasts (1 × 10 6 ) were stimulated with 10 μg / ml LPS for the indicated times. Next, the cells were lysed in a lysis buffer containing 1.0% Nonidet-
（肺繊維芽細胞の調整）
マウスの肺を切除し、ＰＢＳ内で洗浄し、小さく切断し、攪拌し、３０分間３７℃で酵素消化した。消化緩衝液（１０ｍｌ／肺）は、４００ｎＭのＥＤＴＡを含む０．２５％のトリプシン溶液である。生じた細胞懸濁液に、冷えた完全ＤＭＥＭ培地を加えた。遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分間）した後、ペレットを完全培地に再び懸濁し、その後皿で培養した。切除から１０日で、肺繊維芽細胞を各実験に使用した。
(Regulation of lung fibroblasts)
Mouse lungs were excised, washed in PBS, cut into small pieces, agitated, and enzymatically digested at 37 ° C. for 30 minutes. Digestion buffer (10 ml / lung) is a 0.25% trypsin solution containing 400 nM EDTA. To the resulting cell suspension, cold complete DMEM medium was added. After centrifugation (1100 rpm, 5 minutes), the pellet was resuspended in complete medium and then cultured in a dish. Ten days after resection, lung fibroblasts were used for each experiment.
（Native−ＰＡＧＥ分析：非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
肺繊維芽細胞（１×１０6）及び腹腔マクロファージ（５×１０6）を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された期間刺激し、その後溶解した。native−ＰＡＧＥサンプル緩衝液内の細胞溶解物（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、１５％のグリセロール及び１％のデオキシコラーテ）を、native−ＰＡＧＥで単離し、その後文献記載に準じて、抗ＩＲＦ−３抗体で免疫ブロットした（Int. Immunol. 14, 783, 2002）。
(Native-PAGE analysis: non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis)
Lung fibroblasts (1 × 10 6 ) and peritoneal macrophages (5 × 10 6 ) were stimulated with 50 μg / ml poly (I: C) and 1 μg / ml LPS, respectively, for the indicated period and then lysed. . Cell lysate (62.5 mM Tris-Cl, pH 6.8, 15% glycerol and 1% deoxycholate) in native-PAGE sample buffer was isolated by native-PAGE and then according to the literature description And immunoblotted with anti-IRF-3 antibody (Int. Immunol. 14, 783, 2002).
［実験結果と考察］
Toll-like receptor（ＴＬＲ）は、微生物の構成成分の特異なパターンを認識し、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＩＦ等のＴｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）ドメインを有するアダプターを経由した、シグナル伝達経路の活性化を通じて、自然免疫反応を誘発する（Annu. Rev. Immunol. 20:197,2002; Annu. Rev. Immunol. 21:335,2003）。ＭｙＤ８８は、全てのＴＬＲに共通のアダプターであるが、ＴＩＲＡＰはＴＬＲ２及びＴＬＲ４を介したシグナル経路に特異的に関与している（Nat. Immunol. 2, 675, 2001、Nature 420, 324, 2002、Nature 420, 329, 2002）。共通のＭｙＤ８８依存経路に加えて、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４は、ＩＲＦ−３の活性化とＩＦＮ―βの誘導を導くＭｙＤ８８非依存経路を使用している（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。ＩＦＮ−βを誘導するＴＩＲドメインを有するアダプター（ＴＲＩＦ）が、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化し、ＴＬＲ３と関連する、ＴＩＲドメインを有する、第３のアダプターであると同定した（J. Immunol. 169, 6668, 2002、Nat. Immunol. 4, 161, 2003）。
[Experimental results and discussion]
Toll-like receptor (TLR) recognizes peculiar patterns of microbial constituents and activates signal transduction pathways via adapters with Toll / IL-1 receptor (TIR) domains such as MyD88, TIRAP and TRIF Induction of an innate immune response through crystallization (Annu. Rev. Immunol. 20: 197, 2002; Annu. Rev. Immunol. 21: 335, 2003). MyD88 is an adapter common to all TLRs, but TIRAP is specifically involved in signaling pathways via TLR2 and TLR4 (Nat. Immunol. 2, 675, 2001,
ＴＲＩＦの生理学的な役割を評価するために、本発明者は、胚性幹（ＥＳ）細胞内の相同組換えを行って、ＴＲＩＦが欠損したマウスを作製した。マウスTrif遺伝子は、１つのエクソンで構成されている。本発明者は、１つのエクソン全体をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換した、ターゲティングベクターを構築した（図６Ａ）。正しくターゲットされたＥＳ細胞クローンを使用して、突然変異対立遺伝子を有するマウスを作製した（図６Ｂ）。Trif遺伝子を破壊したホモ接合体の突然変異マウスは、想定されたメンデル比で出生し、健康に発育した。ノーザンブロット分析は、突然変異マウスの腹腔マクロファージが、ＴＲＩＦ ｍＲＮＡを発現しないことを示唆した（図６Ｃ）。肺繊維芽細胞の免疫ブロット分析により、Trif遺伝子を破壊すると、ＴＲＩＦタンパク質の発現が消失することを確認した（図６Ｄ）。 In order to evaluate the physiological role of TRIF, the present inventors performed homologous recombination in embryonic stem (ES) cells to produce mice lacking TRIF. The mouse Trif gene is composed of one exon. The present inventor constructed a targeting vector in which one entire exon was replaced with a neomycin resistance gene (neo) (FIG. 6A). Using correctly targeted ES cell clones, mice with mutant alleles were generated (FIG. 6B). Homozygous mutant mice that disrupted the Trif gene were born at the expected Mendelian ratio and developed healthy. Northern blot analysis suggested that peritoneal macrophages of mutant mice did not express TRIF mRNA (FIG. 6C). Immunoblotting analysis of lung fibroblasts confirmed that the expression of TRIF protein disappeared when the Trif gene was disrupted (FIG. 6D).
初期のインビトロの研究は、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３を介したＩＦＮ−βの誘導に関与していることを示唆していた（J. Immunol. 169:6668,2002; Nat. Immunol. 4:161,2003）。したがって、本発明者は、まず、腹腔マクロファージにおいてポリ（Ｉ：Ｃ）刺激で誘導されるＩＦＮ−β及びＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０、及びＭＣＰ−１などの幾つかのＩＦＮ誘導性遺伝子のｍＲＮＡを分析した（図７Ａ）。ＴＲＩＦ-/-マウスのマクロファージでは、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答したＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現が欠陥を示した。これは、ＴＬＲ３-/-マウスで見られた結果と一致した（Nature 413, 732, 2001）。更に、ＴＲＩＦ-/-マウスの脾細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答した、増殖に著しい欠陥を示した。しかし、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧ ＤＮＡには正常に応答した（図７Ｂ）。ＴＲＩＦ-/-Ｂ細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性の、ＣＤ６９、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスIIの細胞表面上の発現の増加に著しい欠陥があったが、抗ＩｇＭ抗体誘導性では障害はなかった（図７Ｃ）。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウス及びＴＬＲ３-/-マウスは、ポリ（Ｉ:Ｃ）に対する応答に欠陥があり、ＴＲＩＦが、ＴＬＲ３を介したシグナル経路に必須であることを示唆した。 Early in vitro studies suggested that TRIF is involved in the induction of IFN-β via TLR3 (J. Immunol. 169: 6668,2002; Nat. Immunol. 4: 161,2003). ). Therefore, the present inventors first analyzed the mRNA of several IFN-inducible genes such as IFN-β and RANTES, IP-10, and MCP-1 induced by poly (I: C) stimulation in peritoneal macrophages. (FIG. 7A). TRIF − / − mouse macrophages showed defective expression of IFN-β and IFN-inducible genes in response to poly (I: C). This was consistent with the results seen in TLR3 − / − mice (Nature 413, 732, 2001). Furthermore, the splenocytes of TRIF − / − mice showed a significant defect in proliferation in response to poly (I: C). However, it responded normally to TLR9 ligand CpG DNA (FIG. 7B). TRIF − / − B cells were markedly defective in poly (I: C) -induced, increased expression on the cell surface of CD69, CD86 and MHC class II, but not impaired when induced by anti-IgM antibodies. (FIG. 7C). Thus, TRIF − / − and TLR3 − / − mice are defective in response to poly (I: C), suggesting that TRIF is essential for the signaling pathway through TLR3.
ＴＬＲ３リガンドに加えて、ＴＬＲ４リガンドＬＰＳが、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現をＭｙＤ８８非依存性に誘導することを示した（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。本発明者らは、胎児の繊維芽細胞におけるＬＰＳ刺激で誘導されるＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＭＣＰ−１などのＩＦＮ誘導性遺伝子のｍＲＮＡを分析した（図８Ａ）。ＴＲＩＦ-/-細胞では、ＬＰＳが誘導するＩＦＮ誘導性遺伝子の発現は著しく減少した。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＬＰＳに対するＭｙＤ８８非依存的応答に欠陥があった。 In addition to TLR3 ligand, TLR4 ligand LPS was shown to induce IFN-β and IFN-inducible gene expression in a MyD88-independent manner (J. Immunol. 167, 5887, 2001, Int. Immunol. 14, 1225, 2002, Immunity 17, 251, 2002). The present inventors analyzed mRNAs of IFN-inducible genes such as RANTES, IP-10, and MCP-1 induced by LPS stimulation in fetal fibroblasts (FIG. 8A). In TRIF − / − cells, LPS-induced IFN-inducible gene expression was markedly reduced. Therefore, TRIF − / − mice were defective in MyD88-independent responses to LPS.
次に、ＭｙＤ８８依存性で誘導される、幾つかのＴＬＲリガンドに応答した、炎症性サイトカインの産出を分析した（図８Ｂ）。野生型及びＴＲＩＦ-/-のマクロファージは、両方とも、ＴＬＲ２リガンドベプチドグリカン、ＴＬＲ７リガンドＲ−８４８及びＴＬＲ９リガンドＣｐＧ ＤＮＡに応答して、同程度のレベルのＩＬ−１２ｐ４０を生成した。 Next, the production of inflammatory cytokines in response to several TLR ligands induced in a MyD88 dependence was analyzed (FIG. 8B). Wild-type and TRIF − / − macrophages both produced similar levels of IL-12p40 in response to TLR2 ligand peptide glycans, TLR7 ligand R-848 and TLR9 ligand CpG DNA.
しかし、ＬＰＳが誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２ｐ４０の生成は、ＴＲＩＦ-/-マクロファージでは、消失した（図８Ｂ、Ｃ）。さらに、ＴＲＩＦ-/-マウスの脾細胞は、Ｒ−８４８に応答して、通常通り増殖するにもかかわらず、ＬＰＳに応答した増殖では著しい欠陥を示した（図８Ｄ）。さらに、ＬＰＳが誘導するＣＤ６９及びＣＤ８９発現の増加は、ＴＲＩＦ-/-Ｂ細胞では、抗ＩｇＭ抗体が誘導する発現が通常通りであったにもかかわらず、著しく減少した（図８Ｅ）。したがって、ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＭｙＤ８８依存経路及びＭｙＤ８８非依存経路が介するＬＰＳに対する応答に欠陥を示した。 However, LPS-induced production of TNF-α, IL-6, and IL-12p40 was abolished in TRIF − / − macrophages (FIGS. 8B, C). In addition, splenocytes from TRIF − / − mice showed a significant defect in proliferation in response to LPS, despite normal proliferation in response to R-848 (FIG. 8D). Furthermore, the LPS-induced increase in CD69 and CD89 expression was markedly reduced in TRIF − / − B cells despite the normal expression induced by anti-IgM antibodies (FIG. 8E). Thus, TRIF − / − mice showed a defect in response to LPS via MyD88-dependent and MyD88-independent pathways.
ＴＬＲ３及びＴＬＲ４を通るＭｙＤ８８非依存経路では、ＩＲＦ−３転写遺伝子が活性化されていると報告されていた（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002）。 In the MyD88-independent pathway through TLR3 and TLR4, it was reported that the IRF-3 transcription gene was activated (J. Immunol. 167, 5887, 2001, Int. Immunol. 14, 1225, 2002, Immunity 17). , 251, 2002).
確かに、native-ＰＡＧＥ分析（非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、野生型の肺繊維芽細胞及び腹腔マクロファージでそれぞれ、ポリ（Ｉ：Ｃ）及びＬＰＳ誘導性の、ＩＲＦ−３二量体が形成されたことを示した（図９Ａ、Ｂ）。しかし、ＴＲＩＦ-/-細胞では、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＬＰＳ誘導性のＩＲＦ−３の二量体は形成されなかった。この観察結果は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナリングにおけるＭｙＤ８８非依存経路の活性化に、ＴＲＩＦが必須であることを示している。ＩＲＦ−３に加えて、ＮＦ−κＢは、野生型の肺繊維芽細胞で、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答して、活性化した（図９Ｃ）。ＴＬＲ３-/-及びＴＲＩＦ-/-細胞で、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性ＮＦ−κＢ活性化は著しく低下し、ＴＬＲ３が介するシグナル経路で、ＴＲＩＦが重要な役割を持つことを示唆した。それとは対照的に、ＬＰＳ刺激は、ＴＲＩＦ-/-胎児繊維芽細胞でも、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼＪＮＫのほぼ通常通りの活性化を導いた（図９Ｄ）。ＴＬＲ４シグナリングでは、ＭｙＤ８８依存経路は、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの初期相（early phase)の活性化を導くが、ＭｙＤ８８非依存経路は、ＭｙＤ８８-/-細胞内の遅延したＮＦ―κＢ及びＭＡＰキナーゼ活性化で立証されているように、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの、遅延相（late phase）の活性化を導く（J. Immunol. 167, 5887, 2001、Immunity 11, 115, 1999）。
Certainly, native-PAGE analysis (non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis) showed that poly (I: C) and LPS-induced IRF-3 dimers were found in wild-type lung fibroblasts and peritoneal macrophages, respectively. It was shown that it was formed (FIGS. 9A and 9B). However, poly (I: C) or LPS-induced dimer of IRF-3 was not formed in TRIF − / − cells. This observation indicates that TRIF is essential for activation of the MyD88-independent pathway in TLR3 and TLR4 signaling. In addition to IRF-3, NF-κB was activated in response to poly (I: C) in wild-type lung fibroblasts (FIG. 9C). Poly (I: C) -induced NF-κB activation was markedly reduced in TLR3 − / − and TRIF − / − cells, suggesting that TRIF has an important role in the TLR3-mediated signaling pathway. In contrast, LPS stimulation led to almost normal activation of NF-κB and MAP kinase JNK in TRIF − / − fetal fibroblasts (FIG. 9D). In TLR4 signaling, the MyD88-dependent pathway leads to the activation of the early phase of NF-κB and MAP kinase, whereas the MyD88-independent pathway is a delayed NF-κB and MAP kinase in MyD88 − / − cells. As demonstrated by activation, it leads to the late phase activation of NF-κB and MAP kinase (J. Immunol. 167, 5887, 2001,
そこで、本発明者は、ＴＲＩＦ依存性の遅延したＮＦ−κＢ及びＪＮＫ活性化の欠陥が、ＴＲＩＦ-/-マウスのＭｙＤ８８依存性の早期活性化により遮蔽されていると仮定し、ＴＲＩＦ及びＭｙＤ８８の両方が欠損したマウスを作製した。ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞では、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化が完全に消失していた（図９Ｅ）。更に、例えばＩＰ−１０、ＭＣＰ−１及びＲＡＮＴＥＳなどのＩＦＮ誘導性遺伝子のＬＰＳによる誘導は、ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト細胞では全く観察されなかった（図９Ｆ）。これらの観察結果は、ＴＬＲ４が介するＭｙＤ８８非依存性経路の活性化に、ＴＲＩＦが必須であることを明確に示した。 Thus, we hypothesize that TRIF-dependent delayed NF-κB and JNK activation defects are masked by MyD88-dependent early activation of TRIF − / − mice, and that TRIF and MyD88 Mice lacking both were generated. In TRIF / MyD88 double knockout mouse fetal fibroblasts, LPS-induced NF-κB and JNK activation was completely lost (FIG. 9E). Furthermore, induction of IFN-inducible genes such as IP-10, MCP-1 and RANTES by LPS was not observed at all in TRIF / MyD88 double knockout cells (FIG. 9F). These observations clearly showed that TRIF is essential for activation of the MyD88-independent pathway mediated by TLR4.
本発明者は、ＴＲＩＦ-/-マウスの分析で明らかになったＴＲＩＦの生理学的機能を報告する。ＴＲＩＦ-/-マウスは、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４リガンドが誘導するＭｙＤ８８非依存性の応答において、著しい欠陥があった。ＴＲＩＦ-/-マウスでは、すべてのポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性応答が消失していたので、ＴＲＩＦは、ＴＬＲ３シグナル経路では、ＴＬＲ３シグナリングに必須のアダプターである。ＴＬＲ４刺激では、ＴＲＩＦ-/-マウスは通常のＬＰＳ誘導性ＭｙＤ８８依存性ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼ活性化を示したにもかかわらず、ＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカインの産出には欠陥があった。ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ４シグナル経路において、重要な役割を持つことが示された。 The inventor reports the physiological function of TRIF as revealed by analysis of TRIF − / − mice. TRIF − / − mice were markedly defective in MyD88-independent responses induced by TLR3 and TLR4 ligands. TRIF is an essential adapter for TLR3 signaling in the TLR3 signaling pathway, since all poly (I: C) -induced responses were lost in TRIF − / − mice. Upon TLR4 stimulation, TRIF − / − mice were defective in producing LPS-induced inflammatory cytokines, despite showing normal LPS-induced MyD88-dependent NF-κB and MAP kinase activation. MyD88 and TIRAP have been shown to have an important role in the TLR4 signaling pathway.
本発明者の観察結果は、恐らくＴＬＲ４とこれら３つ（又はそれ以上）のＴＩＲドメインを有するアダプターとの大きな複合体の形成を通じて、ＴＲＩＦが、ＭｙＤ８８依存経路にも関与していることを示唆した。ＩＦＮ−βプロモーターの活性化にはＮ末端部分だけが関与していたが、ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＲＩＦのＮ末端及びＣ末端部分の両方が誘導されることを示された（J. Immunol. 169, 6668, 2002）。したがって、ＴＲＩＦのＣ末端部分は、ＴＬＲ４シグナリングのＭｙＤ８８依存経路において必要となる可能性がある。本発明者は、ウイルス感染に重要な役割を持つと想定される、ＭｙＤ８８非依存経路を調節する必須のアダプターを同定した。ウイルス感染へのＴＲＩＦの関与に関する、ＴＲＩＦ-/-マウスの細かな分析は、ＴＬＲとウイルス認識との関係に新たな見識を提供する。 Our observations suggested that TRIF is also involved in the MyD88-dependent pathway, probably through the formation of large complexes between TLR4 and adapters with these three (or more) TIR domains. . While only the N-terminal part was involved in the activation of the IFN-β promoter, NF-κB activation was shown to induce both the N-terminal and C-terminal parts of TRIF (J. Immunol 169, 6668, 2002). Thus, the C-terminal part of TRIF may be required in the MyD88-dependent pathway of TLR4 signaling. The inventor has identified an essential adapter that regulates the MyD88-independent pathway, which is assumed to have an important role in viral infection. A detailed analysis of TRIF − / − mice regarding the involvement of TRIF in viral infection provides new insights into the relationship between TLR and virus recognition.
［実施例２における図面の解説］
図６は、突然変異Trif遺伝子の標的欠損について示す図である。
（Ａ）Trif遺伝子、ターゲッティングベクター、及び予測した欠損遺伝子の構造。塗りつぶしたボックスは、コードしたエクソンを示す。制限酵素：H、Hinc II。
（Ｂ）ヘテロ接合体をインタークロスして出生した子のサザンブロットによる分析。ゲノムＤＮＡを、マウス尾部から抽出し、Hinc IIで消化し、電気泳動し、ａで示したラジオラベルしたプローブとハイブリダイズした。サザンブロット分析したところ、野生型（＋／＋）では、単一の３．８ｋｂバンドを、ホモ接合体（−／−）では、６．１ｋｂバンドを、又、ヘテロ接合型（＋／−）では両方を生じた。
（Ｃ）胎児繊維芽細胞のノーザンブロット分析。胎児の繊維芽細胞から抽出した全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動し、ナイロン細胞膜に移動し、ＴＲＩＦ断片をプローブとして、ハイブリダイズした。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｄ）ＴＲＩＦの内因性発現。胎児の繊維芽細胞から調製した細胞溶解物を、抗ＴＲＩＦ抗体で、免疫沈殿した。次に、免疫沈澱物を別の抗ＴＲＩＦ抗体で、免疫ブロットした。タンパク質発現を調べるために、ＥＲＫ１／２に対する抗体で、同じ溶解物にブロットした。
図７は、ＴＲＩＦ欠損細胞内のポリ（Ｉ：Ｃ）応答の欠陥について示す図である。
（Ａ）腹腔マクロファージを、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（５μｇ）を抽出し、ＩＦＮ−β、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｂ）ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＣｐＧ ＤＮＡで刺激した脾細胞の増殖。ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＣｐＧ ＤＮＡの示された濃度で、脾細胞を２４時間培養した。［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）を後半の１２時間パルスした。［3Ｈ］チミジン取り込みを、シンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
（Ｃ）脾臓Ｂ２２０＋細胞を、５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体と共に培養した。３６時間の培養後、細胞を収集し、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体若しくは抗ＣＤ８６抗体で、又は抗Ｉ−Ａb抗体に続いてストレプトアビジンＰＥで染色した。Cell Quest softwareを使用して、ＦＡＣＳ Caliburで染色した細胞を分析した。
[Explanation of Drawing in Example 2]
FIG. 6 is a diagram showing the target deletion of the mutated Trif gene.
(A) Trif gene, targeting vector, and predicted defective gene structure. A filled box indicates the encoded exon. Restriction enzymes: H, Hinc II.
(B) Southern blot analysis of offspring born by intercrossing heterozygotes. Genomic DNA was extracted from the mouse tail, digested with Hinc II, electrophoresed and hybridized with the radiolabeled probe indicated by a. Southern blot analysis revealed a single 3.8 kb band for wild type (+ / +), a 6.1 kb band for homozygote (− / −), and a heterozygous type (+/−). Then it produced both.
(C) Northern blot analysis of fetal fibroblasts. Total RNA (10 μg) extracted from fetal fibroblasts was electrophoresed, transferred to a nylon cell membrane, and hybridized using the TRIF fragment as a probe. The same cell membrane was rehybridized with a β-actin probe.
(D) Endogenous expression of TRIF. Cell lysates prepared from fetal fibroblasts were immunoprecipitated with anti-TRIF antibody. The immunoprecipitate was then immunoblotted with another anti-TRIF antibody. To examine protein expression, the same lysates were blotted with antibodies against ERK1 / 2.
FIG. 7 is a diagram showing defects in poly (I: C) response in TRIF-deficient cells.
(A) Peritoneal macrophages were stimulated with 50 μg / ml poly (I: C) for the indicated times. Total RNA (5 μg) was extracted and Northern blot analysis was performed to examine the expression of IFN-β, IP-10, RANTES and MCP-1. The same cell membrane was rehybridized with a β-actin probe.
(B) Proliferation of splenocytes stimulated with poly (I: C) or CpG DNA. Splenocytes were cultured for 24 hours at the indicated concentrations of poly (I: C) or CpG DNA. [ 3 H] thymidine (1 μCi) was pulsed for the latter 12 hours. [ 3 H] thymidine incorporation was measured with a scintillation counter (Packard).
(C) Spleen B220 + cells were cultured with 50 μg / ml poly (I: C) or 10 μg / ml anti-IgM antibody. After 36 hours of culture, cells were harvested, with biotin-conjugated anti-CD69 antibody or anti-CD86 antibody, or stained with streptavidin-PE Following anti I-A b antibody. Cells stained with FACS Calibur were analyzed using Cell Quest software.
図８は、ＴＲＩＦ欠損細胞内のＬＰＳに対する応答の欠陥について示す図である。
（Ａ）胎児の繊維芽細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ組織膜をβ−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
（Ｂ）ＴＲＩＦ欠損マウス又は野生型のマウスからの腹腔マクロファージを、刺激しない状態にしたか、又は１０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００ｎＭのＲ−８４８、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ-γの存在下の１μＭのＣｐＧ ＤＮＡで刺激した。ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２ｐ４０分析のために、２４時間後に、上澄みを収集した。表示値は、平均値±標準偏差の３倍である。
（Ｃ）腹腔マクロファージを、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下、示されたＬＰＳ濃度で、２４時間刺激し、上澄みにＥＬＩＳＡを行い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を測定した。表示値は、平均値±標準偏差の３倍である。
（Ｄ）ＬＰＳ又はＣｐＧ ＤＮＡで刺激した脾細胞の増殖。脾細胞を、ＬＰＳ又はＣｐＧ ＤＮＡの示された濃度で、２４時間培養した。［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）を後半の１２時間パルスした。［3Ｈ］チミジン取り込みを、シンチレーション計数器（Packard社製）で測定した。
（Ｅ）脾細胞Ｂ２２０＋を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体で培養した。３６時間培養した時点で、細胞を収穫し、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体又はＣＤ８６抗体で染色し、続いてストレプタビジンＰＥで染色した。Cell Quest softwareを使用して、ＦＡＣＳ Caliburで、染色した細胞を分析した。
FIG. 8 is a diagram showing a defective response to LPS in TRIF-deficient cells.
(A) Fetal fibroblasts were stimulated with 10 μg / ml LPS for the indicated times. Total RNA (10 μg) was extracted and Northern blot analysis was performed to examine the expression of IP-10, RANTES and MCP-1. The same tissue membrane was rehybridized with β-actin probe.
(B) Peritoneal macrophages from TRIF-deficient or wild type mice were left unstimulated or 10 μg / ml peptidoglycan (PGN), 100 ng / ml LPS, 100 nM R-848, 30 ng / ml Stimulated with 1 μM CpG DNA in the presence of IFN-γ. Supernatants were collected after 24 hours for IL-12p40 analysis by ELISA. The displayed value is 3 times the average value ± standard deviation.
(C) Peritoneal macrophages were stimulated for 24 hours at the indicated LPS concentration in the presence of 30 ng / ml IFN-γ, the supernatant was subjected to ELISA, and TNF-α, IL-6 and IL-12p40 were measured. . The displayed value is 3 times the average value ± standard deviation.
(D) Proliferation of splenocytes stimulated with LPS or CpG DNA. Splenocytes were cultured for 24 hours with the indicated concentrations of LPS or CpG DNA. [ 3 H] thymidine (1 μCi) was pulsed for the latter 12 hours. [ 3 H] thymidine incorporation was measured with a scintillation counter (Packard).
(E) Spleen cells B220 + were cultured with 10 μg / ml LPS or 10 μg / ml anti-IgM antibody. When cultured for 36 hours, the cells were harvested and stained with biotin-conjugated anti-CD69 antibody or CD86 antibody, followed by streptavidin PE. Stained cells were analyzed with a FACS Calibur using Cell Quest software.
図９は、ＴＲＩＦ欠損及びＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト細胞におけるシグナルカスケードの活性化（Ａ及びＢ）について示す図である。
肺繊維芽細胞（Ａ）又は腹腔マクロファージ（Ｂ）を、（Ａ）５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は（Ｂ）１μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。細胞可溶物を調製し、native-PAGEを行った。ウェスタンブロット法により、ＩＲＦ−３の単量体（矢印）又は、二量体（矢頭）を検出した。
（Ｃ及びＤ）（Ｃ）５０μｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）及び（Ｄ）１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、繊維芽細胞を、示された時間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ特異プローブを使用して、ＥＭＳＡで、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性化を測定した。矢印及び米印は、誘導されたＮＦ−κＢ複合体及び非特異バンドを、それぞれ示している（上パネル）。細胞抽出物に対する抗phosphoＪＮＫ特異抗体を使用して、ＬＰＳ刺激細胞のＪＮＫ活性化を、ウエスタンブロット法で、測定した（下パネル）。（Ｆ）野生型及びＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８ＤＫＯマウスの胎児の繊維芽細胞を、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、示された時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−１の発現を調べるために、ノーザンブロット法で分析した。同じ細胞膜をβ―アクチンプローブで、再度ハイブリダイズした。
FIG. 9 shows signal cascade activation (A and B) in TRIF-deficient and TRIF / MyD88 double knockout cells.
Lung fibroblasts (A) or peritoneal macrophages (B) were stimulated with (A) 50 μg / ml poly (I: C) or (B) 1 μg / ml LPS for the indicated times. Cell lysate was prepared and subjected to native-PAGE. IRF-3 monomer (arrow) or dimer (arrowhead) was detected by Western blotting.
Fibroblasts were stimulated for the indicated times with (C and D) (C) 50 μg / ml poly (I: C) and (D) 10 μg / ml LPS. Nuclear extracts were prepared and NF-κB DNA binding activation was measured with EMSA using NF-κB specific probes. Arrows and rice marks indicate the induced NF-κB complex and non-specific bands, respectively (upper panel). JNK activation of LPS-stimulated cells was measured by Western blot using anti-phosphoJNK specific antibody against cell extract (lower panel). (F) Wild-type and TRIF / MyD88DKO mouse fetal fibroblasts were stimulated with 10 μg / ml LPS for the indicated times. Total RNA (10 μg) was extracted and analyzed by Northern blotting to examine the expression of IP-10, RANTES and MCP-1. The same cell membrane was hybridized again with β-actin probe.
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