JP3886061B2

JP3886061B2 - Novel β-galactosidase

Info

Publication number: JP3886061B2
Application number: JP19273996A
Authority: JP
Inventors: 浩藤本; 勝美鰺坂; 隆佐々木; 喜之伊藤
Original assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Current assignee: Meiji Co Ltd; Meiji Dairies Corp
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1996-07-04
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2016-07-04
Also published as: JPH09313177A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β1-3ガラクトシド結合を選択的に加水分解し、β1-3ガラクトシド結合を選択的に形成する作用を有する、バチルス属に属する菌由来の新規なβ−ガラクトシダーゼ、バチルス属に属する菌を用いる該β−ガラクトシダーゼの製造方法、該β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子をベクターに挿入してなる組換えプラスミド、該組換えプラスミドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、該形質転換体を培養して得られる該β−ガラクトシダーゼ、該β−ガラクトシダーゼの製造方法、該β−ガラクトシダーゼの反応を用いることを特徴とするβ1-3ガラクトシド結合で結合した糖質の製造方法、及び該β−ガラクトシダーゼを用いて、糖質中のβ1-3ガラクトシド結合を切断することを特徴とする糖質の製造方法に関する。
【０００２】
本発明のβ−ガラクトシダーゼは、糖蛋白質や糖脂質において重要なキーオリゴ糖であるGalβ1-3GalNAc（２−アセタミド−２−デオキシ−３−Ｏ−(β-D-ガラクトピラノシル)−D−ガラクトピラノース）及びGalβ1-3GlcNAc（２−アセタミド−２−デオキシ−３−Ｏ−(β-D-ガラクトピラノシル)−D−グルコピラノース）を、酵素法により合成する上で有用である。
【０００３】
【従来の技術】
Galβ1-3GalNAcという２糖は、ムチン型糖蛋白質におけるセリンあるいはスレオニンとの結合部位に存在する重要な構成要素である。また、糖脂質においてもグロボ系列、ラクト系列、ガングリオ系列を問わず頻繁に出現するキーオリゴ糖である。また、Galβ1-3GlcNAcという２糖もアスパラギン結合型糖蛋白質のうち複合型糖鎖に含まれる部分構造でもある。
【０００４】
このように、Galβ1-3GalNAcは複合糖質における極めて重要なオリゴ糖であるため、これを簡便かつ安価に製造する方法が求められている。
【０００５】
一般に２糖を合成する方法としては、有機化学的方法と酵素合成法とが知られている。
【０００６】
有機化学的方法により合成する場合には、GalNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン）の１、４及び６位の水酸基を保護し、一方で２、３、４及び６位を保護したガラクトースの１位を活性化しておいて、両者を縮合させることにより２糖を合成する。さらにその後、それらの保護基を全て脱離する必要がある。従って、必然的に工程数が長くなり、工業的生産には極めて不利な方法である。
【０００７】
一方、酵素法により合成する方法としては、２種類の反応方法が知られている。一つは、トランスフェラーゼ（転移酵素）を用いる方法で、もう一つは加水分解酵素を利用する方法である。
【０００８】
トランスフェラーゼを用いる方法は、トランスフェラーゼ自体を入手することが困難である場合が多く、また、供与体となる基質の糖ヌクレオチドも調製が難しいという問題がある。しかも、一般にトランスフェラーゼは基質特異性が高いため、あるシークエンスの糖鎖を合成するために用いられる酵素は、別のシークエンスの糖鎖の合成には用いることができない場合がある等、汎用性の点でも問題が指摘されている。
【０００９】
加水分解酵素を利用する方法は、反応の原理の面から、リバースハイドロリシス反応と転移反応との２種類の反応に分けられる。
【００１０】
リバースハイドロリシス反応とは、単糖と２糖との間の化学平衡を加水分解酵素により２糖生成の側に変移させ、その化学平衡の結果生じる２糖を回収する反応である。その原理をさらに利用した方法として、２糖を活性炭に吸着させて反応系から除去することにより、２糖が生成するように化学平衡をずらす、という方法も考案されている（特開平1-91792）。
【００１１】
加水分解酵素を利用する反応のもう一つの方法である転移反応は、供与体として、酵素の基質と成りうるグリコシド化合物を用いる。そのグリコシド結合が酵素により切断する際に、水と結合すれば加水分解という現象になるが、そこに別の糖が存在すれば２糖が形成される、という原理に基づく。この方法は、一般に基質であるグリコシド化合物が安価であり、また、酵素も植物、動物、微生物など入手が比較的容易であることから、すでにいくつかのオリゴ糖の工業的生産に利用されている。
【００１２】
上記したように、Galβ1-3GalNAcは複合糖質における極めて重要なオリゴ糖であるため、これを簡便かつ安価に製造する方法が求められているが、これまでのところ、Galβ1-3GalNAcの酵素法による合成については、牛精巣由来のβ−ガラクトシダーゼを用いた転移反応の例が報告されているにすぎない（L. Hedbys, E. Johansson, K. Mosbach, and P.O. Larsson, Carbohydr. Res., 186, 217-223 (1989)）。しかしながら、牛精巣は入手困難であるばかりでなく、市販されている牛精巣由来のβ−ガラクトシダーゼ精製酵素は著しく高価であり、しかも、ガラクトシド結合形成の特異性が低く、β1-3ガラクトシド結合以外のβガラクトシド結合をも形成する。このためこの酵素を用いると、目的とするβ1-3ガラクトシド結合の２糖以外に他の結合を持つ２糖が生成するので、一旦生成した２糖の混合物を、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼでさらに処理し、β1-3ガラクトシド結合以外の２糖を加水分解する必要があり、収率や工程数の面からも非効率的である。しかしながら、現在のところこの酵素に代わる、入手が容易で選択性の高い酵素は見い出されていない。
【００１３】
また、微生物由来のβ1-3ガラクトシド結合を加水分解するβ−ガラクトシダーゼとしては、Xanthomonasに属する菌由来のβ−ガラクトシダーゼが唯一知られており（Sharon, T. et al., Glycobiology, 5(1), 19-28 (1995)）、その遺伝子が単離されている（Christopher, H. T. et al., Glycobiology, 5(6), 603-610 (1995)）。このβ−ガラクトシダーゼは、β1-3ガラクトシド結合を優先的に加水分解し、β1-4ガラクトシド結合及びβ1-6ガラクトシド結合をほとんど加水分解しないという作用を有している。
【００１４】
しかしながら、グリコシダーゼの加水分解における作用の特異性と得られるガラクトシルオリゴ糖の結合様式とは、必ずしも対応していない。そのため、このガラクトシダーゼがβ1-3ガラクトシド結合を形成する作用を有するか否かは明らかではなく、また、仮にβ1-3ガラクトシド結合を形成する作用を有していたとしても、β1-3ガラクトシド結合のオリゴ糖が選択的に得られるかどうかは分からない。従って、Galβ1-3GalNAc等の糖質のキーオリゴ糖を合成することが可能であるかは不明である。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、入手が容易であって、高い選択性でβ1-3ガラクトシド結合を加水分解及び形成する作用を有するβ−ガラクトシダーゼを提供することを主な課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、バチルス属に属する菌が、β1-3ガラクトシド結合（以下β1-3結合ということがある）を選択的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを産生することを見出した。そして、該β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子をクローニングし、この遺伝子を挿入した組換えプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、該β−ガラクトシダーゼを発現させることに成功した。更に、発現させたβ−ガラクトシダーゼを用いて、β1-3ガラクトシド結合を有する糖を加水分解し、また、Galβ1-3GalNAc及びGalβ1-3GlcNAcを合成することに成功し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち本発明は、
（１）バチルス属に属する菌に由来し、β1-3ガラクトシド結合を加水分解し、β1-6ガラクトシド結合及びβ1-4ガラクトシド結合をほとんど加水分解せず、ガラクトースがβ−結合したガラクトシド化合物と糖受容体とからβ1-3ガラクトシド結合を選択的に形成する作用を有するβ−ガラクトシダーゼ、
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部又は少なくとも一部の配列を有する（１）記載のβ−ガラクトシダーゼ、
（３）（１）記載のバチルス属に属する菌が、バチルス・サーキュランス種であることを特徴とする（１）又は（２）記載のβ−ガラクトシダーゼ、
（４）バチルス属に属する菌を培養し、その培養液遠心上清及び／又は菌体から（１）又は（２）記載のβ−ガラクトシダーゼを取得することを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造方法、
（５）バチルス属に属する菌が、バチルス・サーキュランス種であることを特徴とする（４）記載のβ−ガラクトシダーゼの製造方法、
（６）（１）、（２）又は（３）記載のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、
（７）配列番号３に示される塩基配列からなる（６）記載の遺伝子、
（８）（６）又は（７）記載のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子をベクターに挿入してなる組換えプラスミド、
（９）（８）記載の組換えプラスミドを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、
（１０）（９）記載の形質転換体を培養して得られるβ−ガラクトシダーゼ、
（１１）（１０）記載のβ−ガラクトシダーゼを取得することを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造方法、
（１２）（１）、（２）、（３）又は（１０）に記載のβ−ガラクトシダーゼを用いることを特徴とするβ1-3ガラクトシド結合で結合した糖質の製造方法、
（１３）（１）、（２）、（３）又は（１０）に記載のβ−ガラクトシダーゼを用いて、糖質中のβ1-3ガラクトシド結合を切断することを特徴とする糖質の製造方法、
に関する。
【００１８】
その一例として、本発明者らは、これまでβ1-4ガラクトシド結合を優先的に加水分解する性質を有する２種類のβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトシダーゼ−１及びβ−ガラクトシダーゼ−２）を産生するとされてきたBacillus circulans（Z. Mozaffar, K. Nakanishi, R. Matsuno, and T. Kamikubo, Agric. Biol. Chem., 48, 3053-3061 (1984)）が、実は３種類のβ−ガラクトシダーゼを産生し、それらのうちの一つが、β1-3ガラクトシド結合を特異的に加水分解することを初めて見出した。
【００１９】
従来、Bacillus circulans（以下B. circulansという）由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、市販酵素剤ビオラクタ（大和化成）が用いられているが、実施例１に示されるように、この酵素剤にはβ−ガラクトシダーゼ−１及びβ−ガラクトシダーゼ−２の２種類のβ−ガラクトシダーゼしか含んでいない。
【００２０】
B. circulansがβ1-3結合を優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを産生することは全く知られておらず、本発明のβ−ガラクトシダーゼは新規なものである。また、B. circulans以外のバチルス属に属する菌がβ1-3結合を優先的に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを産生することも、これまで全く知られていない。
【００２１】
上記のように、β1-3結合を優先的に加水分解する酵素としては、Xanthomonasに属する菌由来のβ−ガラクトシダーゼが知られている。しかしながら、ガラクトシダーゼの加水分解における作用の特異性と得られるガラクトシルオリゴ糖の結合様式とは、必ずしも対応していない。そのため、このガラクトシダーゼがβ1-3ガラクトシド結合を形成する作用を有するか否かは明らかではなく、また、仮にβ1-3ガラクトシド結合を形成する作用を有していたとしても、β1-3ガラクトシド結合のオリゴ糖が選択的に得られるかどうかは分からない。従って、このβ−ガラクトシダーゼを用いて、Galβ1-3GalNAc等の糖質のキーオリゴ糖を合成することが可能であるかは不明である。
【００２２】
さらに、本発明者らは、B. circulansからβ1-3ガラクトシド結合を選択的に加水分解する上記の新規なβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をクローニングし、この遺伝子を挿入した組換えプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、該β−ガラクトシダーゼを発現させることに成功した。
【００２３】
また、発現させたβ−ガラクトシダーゼを用いて、β1-3ガラクトシド結合を有する糖を加水分解することに成功した。さらに、β1-3ガラクトシド結合で結合した糖質の酵素合成において、本発明β−ガラクトシダーゼの反応により、β1-3ガラクトシド結合以外のβ-ガラクトシド結合が形成されることなく、Galβ1-3GalNAc及びGalβ1-3GlcNAcを、一工程で位置選択的に合成することに初めて成功した。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のβ−ガラクトシダーゼの作用の特徴は以下の通りである。
【００２５】
本発明β−ガラクトシダーゼは、β1-3ガラクトシド結合を有するガラクトシルグルコサミンやガラクトシルガラクトサミンを極めて速く加水分解するが、β1-6ガラクトシド結合あるいはβ1-4ガラクトシド結合を有するガラクトシルグルコサミン、ガラクトシルガラクトサミン及びラクトースはほとんど加水分解しない。また、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、ガラクトースがβ−結合したガラクトシド化合物と糖受容体とから、β1-3ガラクトシド結合を選択的に形成させる作用を有する。
【００２６】
以上から、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、従来より知られているB. circulansのβ−ガラクトシダーゼ−１及びβ−ガラクトシダーゼ−２とは明らかに異なる。
【００２７】
また、本発明のβ−ガラクトシダーゼをクローニングして得られた遺伝子の塩基配列から、本発明のβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号３に示される586個のアミノ酸からなり、分子量は約66800であると推定される。
【００２８】
但し、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、このアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、配列の一部が欠失、置換あるいは他のアミノ酸配列が挿入されていても、上記の作用上の特徴を有している限り、本発明に包含される。
【００２９】
なお、Xanthomonasに属する菌由来のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子配列から推定される該β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列（Christopher, H. T. et al., Glycobiology, 5(6), 603-610 (1995)）と、本発明のβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列との相同性は43.3%に過ぎず、両者は全く異なるものである。
【００３０】
本発明のβ−ガラクトシダーゼを産生する菌としては、Bacillus subtilis、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus stearothermophilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus larvae、Bacillus thuringiensisなど、公知のバチルス属に属するあらゆる種から選択することができ、特に限定はない。
【００３１】
また、本発明のβ−ガラクトシダーゼを製造するには、該酵素を自発的に産生しているバチルス属に属する菌を培養してその培養液遠心上清あるいは菌体から取得してもよく、また、本発明のβ−ガラクトシダーゼを産生しているバチルス属の細菌から、β−ガラクトシダーゼの遺伝子をクローニングし、これを適当なベクターに挿入して組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドを用いて適当な宿主細胞を形質転換させて、該形質転換体細胞を培養することにより、培養液遠心上清あるいは菌体から取得してもよい。
【００３２】
なお、本発明のβ−ガラクトシダーゼを、例えばB. circulansを用いて調製する場合、培養液遠心上清あるいは菌体中には、上記したように、β1-4結合特異性が高い二種類のガラクトシダーゼが共在している。このため、β1-3結合特異性が必要とされる用途、例えば、上記のようにβ1-3結合を持つ多糖を、加水分解の逆反応により合成するような用途に用いる場合には、これらのβ1-4結合特異性が高い共在ガラクトシダーゼを除去する必要がある。
【００３３】
それに比較して、本発明のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をβ−ガラクトシダーゼ活性を欠いている大腸菌あるいはそれ以外の適当な宿主に導入して発現させ、β−ガラクトシダーゼを得た場合には、共在するβ1-4結合特異性が高いガラクトシダーゼ活性が含まれていないため、調製物をそのまま反応に用いることができるという利点がある。
【００３４】
本発明のβ−ガラクトシダーゼを産生するバチルス属に属する菌からβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をクローニングする方法には特に限定はなく、遺伝子工学分野で通常用いられている方法に従えばよい。
【００３５】
その一例を示すと、バチルス属に属する菌より染色体DNAを調製し、それを常法により制限酵素Sau3AIで部分分解して切り出す。次いで、このDNA断片を大腸菌のプラスミドベクターpBR322に結合して遺伝子ライブラリーを作成する。このライブラリーを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を欠いた大腸菌株に形質転換し、出現したコロニーの中から、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しているクローンを、X-gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル-β−D-ガラクトピラノシド）の分解による青色の呈色を指標として選択する。
【００３６】
宿主に導入して形質転換させるために使用する、本発明β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を挿入するベクターは、pBR322に限定されるものではない。そして、遺伝子工学分野において通常用いられる手法を用いて、生産量をさらに増大させることが期待できる。例えば本遺伝子を、pUC18などpBR322よりもコピー数の多いベクターに結合して菌当たりの遺伝子数を増やす、あるいはpUC18プラスミド上のlacプロモーターなどの強力なプロモーターの下流に本遺伝子を配置し、その強力なプロモーターから転写を行わせる、などの方法を用いて、本発明β−ガラクトシダーゼの収量を上げることも可能である。
【００３７】
また、遺伝子工学分野にて知られている菌体外分泌手法を用いて、本発明β−ガラクトシダーゼを菌体外に分泌させることが期待できる。この場合、本発明β−ガラクトシダーゼの精製が非常に容易になる利点がある。
【００３８】
本遺伝子を導入し、発現させる宿主としては、大腸菌のみならず、枯草菌（Bacillus subtilis）、ブレビス菌（Bacillus brevis）、チーズ乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）など、遺伝子導入系が確立している様々な属・種の細菌・酵母・細胞などを用いることができる。また、B. circulans菌における遺伝子導入系が開発された場合、B. circulansに本遺伝子を多コピー数導入し、本酵素の生産量を増大させることもできる。
【００３９】
なお、本遺伝子を遺伝子工学的に操作し、配列の一部が欠失、置換あるいは他の塩基配列が挿入された結果、形質転換体が生産するβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列又は蛋白質高次構造が、該遺伝子の由来菌が産生しているβ−ガラクトシダーゼと同一でない場合でも、そのβ1-3結合を特異的に加水分解する性質が保持されているならば、本発明に包含される。
【００４０】
本発明のβ−ガラクトシダーゼを用いることにより、β1-3結合で結合した糖質の製造、あるいは、糖質中のβ1-3結合を切断することによる糖質の製造が可能である。
【００４１】
すなわち、一例として、本酵素の存在下、パラニトロフェニル-β−D-ガラクトピラノシド（Galβ-pNP）を糖供与体とし、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）を糖受容体として転移反応を行なうと、極めて高い位置選択性でGalβ1-3GalNAcが得られる。同様に、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を糖受容体にした反応ではGalβ1-3GlcNAcが得られる。
【００４２】
ここで、糖転移反応における糖供与体は、Galβ-pNPばかりでなく、オルトニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド、フェニル-β-D-ガラクトピラノシドなど、ガラクトースがβ−結合したガラクトシド化合物ならばそのアグリコンにはこだわる必要はない。また、受容体も例示したGalNAcあるいはGlcNAcばかりでなく、グルコース、ガラクトース、GalNAc-セリン、キトビオース、ラクトース、ラクトサミン、GalNAcβ1-3Galβ1-4Glcなどあらゆる単糖およびオリゴ糖を用いることができる。
【００４３】
本発明のβ−ガラクトシダーゼは、ムチン型糖鎖、アスパラギン結合糖鎖あるいは糖脂質の部分構造のオリゴ糖の工業的生産に際し、従来に比較して著しく短い工程で、且つ廉価に合成する方法を提供するものである。
【００４４】
また、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、β1-3結合のオリゴ糖を選択的に合成するという反応に利用できるだけでなく、その加水分解の基質特異性を利用して、糖鎖の構造解析にも応用できる。
【００４５】
従来、β1-3結合を高い選択性で加水分解する酵素は市販品にはなく、わずかに、Streptococcus 6646K由来のβ−ガラクトシダーゼがβ1-3結合とβ1-4結合の両方を加水分解することから、構造解析にはStreptococcus pneumoniae由来のβ−ガラクトシダーゼと組み合わせて利用されていた。即ち、Streptococcus 6646K由来のβ−ガラクトシダーゼで加水分解されればその糖鎖はβ1-4結合かβ1-3結合であると仮定され、その後Streptococcus pneumoniae由来のβ1-4結合特異的なβ−ガラクトシダーゼで加水分解されなければβ1-3結合であると判断されていた。本酵素を用いれば、この解析が一段階で直接決定でき、操作が非常に簡便化される。
【００４６】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
なお以下の実施例において、β−ガラクトシダーゼの活性測定は、下記の方法によって行った。すなわち、50μlの標品に450μlのZバッファー（60mM Na₂HPO₄、40mM NaH₂PO₄、10mM KCl、1mM MgSO₄、50mM β-mercaptoethanol、pH7.0）と100μl 0.4% ONPG（o-nitrophenylgalactopyranoside）溶液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中）を加え、37℃30分反応後、250μlの1M Na₂CO₃を添加して反応を止め、420nmの吸光度の上昇を測定することにより行った。β−ガラクトシダーゼ1ユニットを、本条件下、吸光度を1変化させる酵素量と定義した。なお、活性の弱い標品については、反応時間を延長して測定した。
【００４８】
実施例１（B. circulans ATCC 31382株のβ−ガラクトシダーゼの活性染色）
B. circulans ATCC 31382株（以下、ATCC 31382株と略称することがある）を、LB培地（Sambrook, J. et al., (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.）に0.5%の乳糖を加えた培地に1%濃度で植菌し、37℃で8時間振盪培養した。培養液から、遠心分離によって菌体を除去した上清を、セントリコン30限外濾過装置（アミコン社）により約100倍に濃縮すると同時に、20mMトリス酢酸緩衝液（pH 7.0）への溶媒置換を行ったものを標品とした。標品10μlに、グリセロール5μl、色素液（0.1%ブロモフェノールブルー、10%グリセロール）2.5μl及び0.5Mトリス緩衝液（pH 6.8）0.5μlを加え、マルチゲル12.5（第一化学薬品工業）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動は、トリス・グリシン緩衝液（0.025M Tris、0.192Mグリシン）を用い、20mA、5時間の通電により行った。泳動後のゲルを、0.04% X-galを含む上述のZバッファー中に浸し、37℃12時間放置して染色した。この染色処理により、標品中に含まれている蛋白質のうち、β−ガラクトシダーゼ活性を示すものだけが青く染まる。結果を図１のレーン２に示した。この図に示されているように、ATCC 31382株の培養液中には、少なくとも三種類のβ−ガラクトシダーゼが存在した。これらを移動度の小さいものから順にそれぞれ、β−ガラクトシダーゼ−１、β−ガラクトシダーゼ−２、β−ガラクトシダーゼ−３と名づけた。
【００４９】
対照として、ビオラクタN5（大和化成）200μgについても同様な活性染色を行った。その結果を図１のレーン１に示す。この図から、ビオラクタには、上記の３つのガラクトシダーゼのうち、β−ガラクトシダーゼ-1及びβ−ガラクトシダーゼ-2のみが存在することが明らかとなった。
【００５０】
このことから、β−ガラクトシダーゼ-3は、従来未知のβ−ガラクトシダーゼであることが明らかとなった。
【００５１】
実施例２（B. circulans ATCC 31382株のβ−ガラクトシダーゼ−３遺伝子のクローニング）
ATCC 31382株をLB培地（Sambrook, J. et al., (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York）にて培養し、遠心分離によって回収した菌体から、Saitoら（Saito, H. and Miura, K., (1963) Biochem. Biophys. Acta., 72, 619）記載の方法に準じた方法で染色体のDNAを調製した。調製したDNAを制限酵素Sau3AIで部分分解し、アガロース電気泳動で分画後、約2kbから約10kbのDNA断片を含む領域だけを切り出し、GENECLEAN DNA精製キット（BIO 101社）を用いて回収した。回収された断片をBamHIで切断した大腸菌プラスミドpBR322（宝酒造）にライゲーションし、大腸菌TG1株（アマシャム社）に形質転換した。この形質転換されたTG1株を0.002％のX-galと50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地で培養し、β−ガラクトシダーゼ活性が発現しているコロニーを選択した。青色を呈しているコロニーのうち８つのコロニーからプラスミドDNAを調製し、その中で最も短い2.3kbの挿入を持っているクローンをpBCBG12-1と命名した。
【００５２】
実施例３（β−ガラクトシダーゼ−３遺伝子の解析）
pBCBG12-1中のDNA断片を、大腸菌pUC118および119（宝酒造）にサブクローニングし、キロ・シークエンス・キット（宝酒造）と373A型蛍光式DNA自動シークエンス装置（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて全DNA塩基配列を決定した。得られた2297塩基の塩基配列を配列番号２に示す。本配列中には、第217番目の塩基Aから第1974番目の塩基Tまでのオープン・リーディング・フレームが存在し、これが本発明のβ−ガラクトシダーゼをコードしている遺伝子本体である。このオープン・リーディング・フレーム部分の塩基配列を配列番号３に示し、この塩基配列から推定される本発明のβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。これから、本発明のβ−ガラクトシダーゼは586個のアミノ酸からなり、分子量は約66800であると推定された。
【００５３】
実施例４（β−ガラクトシダーゼ−３遺伝子を導入した宿主細胞が産生するβ−ガラクトシダーゼの活性染色）
実施例２にて取得したβ−ガラクトシダーゼ-3遺伝子を含むクローンpBCBG12-1を保持している大腸菌TG1株を、50μg/mlアンピシリンを含む上述LB培地で、37℃、12時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集菌し、1/2容の20mMトリス酢酸緩衝液（pH 7.0）に懸濁したこの液を、W-375型超音波破砕装置（Heat Systems-Ultrasonics社）を用いて菌体を破砕し、その遠心上清を標品とした。標品を、実施例１と同様に電気泳動しX-galによる活性染色を行った。結果を図１のレーン３に示す。BCBG12-1遺伝子によって発現したβ−ガラクトシダーゼは、ATCC 31382株のβ−ガラクトシダーゼ-3と同じ移動度を示した。
【００５４】
実施例５（β−ガラクトシダーゼ-3の精製）
実施例２にて取得したβ−ガラクトシダーゼ−３遺伝子を含むクローンpBCBG12-1を保持している大腸菌TG1株を、50μg/mlアンピシリンを含む上述LB培地60mlで、37℃、12時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集菌し、1/15容の20mMトリス酢酸緩衝液（pH7.0）に懸濁した。この液を、W-375型超音波破砕装置（Heat Systems-Ultrasonic社）を用いて菌体を破砕し、その遠心上清（以下粗酵素液といい、以後の実施例で用いた）1mlを、10mMのナトリウム緩衝液（pH 7.4）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したResource Q（1ml、ファルマシア社）にアプライした。酵素は0から0.5Mの食塩の濃度勾配により溶出させた。各フラクション中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、活性のあったフラクションをウルトラフリーCL（分画分子量30k、ミリポア社）を用いて濃縮した。上記の濃縮液を0.2M食塩を含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡化したSephacryl S-200カラム（2.6cm×100cm、ファルマシア社）にアプライした。同緩衝液で溶出された各フラクションのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、活性のあったフラクションを濃縮することにより精製酵素を得た。
【００５５】
実施例６（β−ガラクトシダーゼ−３による種々のガラクトシド結合を有する２糖の加水分解実験）
β1-3ガラクトシド結合、β1-4ガラクトシド結合あるいはβ1-6ガラクトシド結合を有するGal-GlcNAc 25 μgおよびキトテトラオース25μgを、50μlの水に溶解し、1μlの1Mリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）を加えた。これに0.5μlの粗酵素液を加え、37℃で反応を行った。定時的にサンプリングを行い、HPLCにて２糖の加水分解率を求めた。結果を図２に示す。この図から、本発明のβ−ガラクトシダーゼは、β1-3結合を急速に加水分解するが、β1-4結合及びβ1-6結合はほとんど加水分解しないことが明らかである。
【００５６】
実施例７（β−ガラクトシダーゼ−３によるGalβ1-3GalNAcの合成）
72mgのGalβ-pNPと160mgのGalNAcを、20% (v/v)のジメチルホルムアミド (DMF)を含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）1mlに溶解した。この溶液に20μlの粗酵素液を加えて37℃で8時間反応を行った。得られた反応生成物のHPLCを図３に示す。この反応物を活性炭カラムに供して２糖画分を濃縮したところ、9.3mgのGalβ1-3GalNAcが得られた（収率10.1％）。
【００５７】
実施例８（β−ガラクトシダーゼ−３によるGalβ1-3GalNAcα-pNPの合成）
15.4mgのGalβ−pNPと35mgのGalNAcα-pNPとを、20% (v/v)のDMFを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）3mlに溶解した。この溶液に60μlの粗酵素液を加えて37℃で3.5時間反応を行った。反応液をSephadex G-10カラム（2.6cm×100cm、ファルマシア社）に供して２糖画分を濃縮したところ、11.8mgのGalβ1-3GalNAcα-pNPが得られた（収率45.7％）。
【００５８】
実施例９（β−ガラクトシダーゼ−３によるGalβ1-3GlcNAcの合成）
72mgのGalβ-pNPと160mgのN-アセチルグルコサミンとを、20% (v/v)のアセトニトリルを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）1mlに溶解した。この溶液に20μlの粗酵素液を加えて37℃で3時間反応を行った。得られた反応液を20gの活性炭を充填したカラムにアプライし、２糖画分を集めて濃縮したところ、11.2mgのGalβ1-3GlcNAcが得られた（収率12.2％）。反応生成物の¹H-NMRスペクトルを図４に示す。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、β1-3ガラクトシド結合を特異的に加水分解し、β1-3ガラクトシド結合を選択的に形成する作用を有するβ−ガラクトシダーゼを、安価且つ大量に得ることができるようになった。本発明のβ−ガラクトシダーゼにより、糖蛋白質や糖脂質の構造において重要なキーオリゴ糖であるGalβ1-3GalNAcなどを、酵素法により安価に合成することができるようになった。
【００６０】
【配列表】

【００６１】

【００６２】

【図面の簡単な説明】
【図１】β−ガラクトシダーゼの活性染色である。レーン１は、ビオラクタN5（大和化成）200μgの、レーン２は、B. circulans ATCC 31382株を、1%のラクトースを含むLB培地で8時間培養した培養液遠心上清の、レーン３は、クローニングしたβ−ガラクトシダーゼ-3遺伝子が含まれているpBCBG12-1プラスミドで形質転換された大腸菌TG1株の菌体粗抽出液の活性染色を、それぞれ示す。なお、この図において、β-gal1、β-gal2及びβ-gal3は、それぞれβ−ガラクトシダーゼ−１、β−ガラクトシダーゼ−２及びβ−ガラクトシダーゼ−３を意味する。
【図２】本発明β−ガラクトシダーゼを用いて、各ガラクトシド結合を有する２糖を加水分解した実験の結果を示す。酵素添加前のピーク強度を100としたときの経時的なピーク強度の減少をプロットしたものである。
【図３】本発明β−ガラクトシダーゼを用いた転移反応によりGalβ1-3GalNAcを合成した時の反応液のHPLCである。カラムはAsahipakNH2-P50、溶離液は70％アセトニトリル（0.8ml／分）、モニターはUV (215nm)である。
【図４】本発明β−ガラクトシダーゼを用いた反応により合成されたGalβ1-3GlcNAcの500 MHz ¹H-NMRスペクトルである。測定装置はバリアン社Unity-500 NMR Spectrometerである。サンプルをD₂Oに溶解し、HDOのピークをケミカルシフトの標準（4.65ppm）として用いた。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is a novel β-galactosidase derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, which has an action of selectively hydrolyzing a β1-3 galactoside bond and selectively forming a β1-3 galactoside bond, a bacterium belonging to the genus Bacillus A method for producing the β-galactosidase using the gene, a gene encoding the β-galactosidase, a recombinant plasmid obtained by inserting the gene into a vector, a transformant obtained by introducing the recombinant plasmid into a host cell, The β-galactosidase obtained by culturing the transformant, a method for producing the β-galactosidase, a method for producing a carbohydrate linked by a β1-3 galactoside bond, characterized by using the reaction of the β-galactosidase, and The present invention relates to a method for producing a carbohydrate, which comprises cleaving a β1-3 galactoside bond in a carbohydrate using the β-galactosidase.
[0002]
The β-galactosidase of the present invention is Galβ1-3GalNAc (2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-galactopyranosyl) -D-galacto, which is an important key oligosaccharide in glycoproteins and glycolipids. Pyranose) and Galβ1-3GlcNAc (2-acetamido-2-deoxy-3-O- (β-D-galactopyranosyl) -D-glucopyranose) are useful for synthesis by enzymatic methods.
[0003]
[Prior art]
The disaccharide, Galβ1-3GalNAc, is an important component present in the binding site with serine or threonine in mucin-type glycoproteins. In addition, it is a key oligosaccharide that frequently appears in glycolipids regardless of globo series, lacto series, or ganglio series. The disaccharide Galβ1-3GlcNAc is also a partial structure contained in the complex sugar chain of the asparagine-linked glycoprotein.
[0004]
Thus, since Galβ1-3GalNAc is an extremely important oligosaccharide in complex carbohydrates, a method for producing it easily and inexpensively is required.
[0005]
In general, organic chemical methods and enzyme synthesis methods are known as methods for synthesizing disaccharides.
[0006]
When synthesizing by an organic chemical method, the hydroxyl groups at 1, 4 and 6 positions of GalNAc (N-acetylgalactosamine) are protected, while the 1 position of galactose protected at the 2, 3, 4 and 6 positions is active. And then disaccharides are synthesized by condensing them. Thereafter, all of these protecting groups need to be removed. Therefore, the number of processes is inevitably increased, which is a disadvantageous method for industrial production.
[0007]
On the other hand, as a method of synthesizing by an enzymatic method, two kinds of reaction methods are known. One is a method using a transferase (transferase), and the other is a method using a hydrolase.
[0008]
In many cases, the method using a transferase has a problem that it is difficult to obtain the transferase itself, and it is difficult to prepare a sugar nucleotide as a donor substrate. Moreover, since transferases generally have high substrate specificity, the enzymes used to synthesize sugar chains of one sequence may not be used for the synthesis of sugar chains of another sequence. But problems have been pointed out.
[0009]
The method using a hydrolase is divided into two types of reactions, a reverse hydrolysis reaction and a transfer reaction, from the viewpoint of the principle of the reaction.
[0010]
The reverse hydrolysis reaction is a reaction in which a chemical equilibrium between a monosaccharide and a disaccharide is changed to a disaccharide production side by a hydrolase, and a disaccharide generated as a result of the chemical equilibrium is recovered. As a method further utilizing the principle, a method has been devised in which the chemical equilibrium is shifted so that disaccharides are produced by adsorbing disaccharides on activated carbon and removing them from the reaction system (Japanese Patent Laid-Open No. 1-91792). ).
[0011]
In the transfer reaction, which is another method using a hydrolase, a glycoside compound that can be a substrate of the enzyme is used as a donor. When the glycosidic bond is cleaved by an enzyme, it is based on the principle that hydrolysis occurs when it is combined with water, but disaccharide is formed if another sugar is present. This method is already used for industrial production of some oligosaccharides because glycoside compounds as substrates are generally inexpensive and enzymes are relatively easy to obtain such as plants, animals and microorganisms. .
[0012]
As mentioned above, Galβ1-3GalNAc is an extremely important oligosaccharide in glycoconjugates, so a method for producing it easily and inexpensively has been sought, but so far it has been based on the enzymatic method of Galβ1-3GalNAc. Regarding the synthesis, only examples of transfer reactions using β-galactosidase derived from bovine testis have been reported (L. Hedbys, E. Johansson, K. Mosbach, and PO Larsson, Carbohydr. Res., 186, 217-223 (1989)). However, not only is the bovine testis difficult to obtain, but commercially available β-galactosidase-purifying enzyme derived from bovine testis is extremely expensive, and the specificity of galactoside bond formation is low, and other than β1-3 galactoside bonds It also forms a β-galactoside bond. For this reason, when this enzyme is used, disaccharides having other bonds in addition to the intended β1-3 galactoside-linked disaccharide are produced. Thus, once the mixture of disaccharides is produced, β-galactosidase derived from E. coli is further added. It is necessary to treat and hydrolyze disaccharides other than β1-3 galactoside bonds, which is inefficient in terms of yield and number of steps. However, at present, no readily available and highly selective enzyme has been found to replace this enzyme.
[0013]
In addition, as β-galactosidase that hydrolyzes β1-3 galactoside bonds derived from microorganisms,XanthomonasThe only β-galactosidase derived from bacteria belonging to the genus is known (Sharon, T. et al., Glycobiology, 5 (1), 19-28 (1995)) and its gene has been isolated (Christopher, HT et al., Glycobiology, 5 (6), 603-610 (1995)). This β-galactosidase has an action of preferentially hydrolyzing β1-3 galactoside bonds and hardly hydrolyzing β1-4 galactoside bonds and β1-6 galactoside bonds.
[0014]
However, the specificity of action in hydrolysis of glycosidase does not necessarily correspond to the binding mode of the galactosyl oligosaccharide obtained. Therefore, it is not clear whether this galactosidase has the action of forming β1-3 galactoside bonds, and even if it has the action of forming β1-3 galactoside bonds, It is not known whether oligosaccharides can be selectively obtained. Therefore, it is unclear whether it is possible to synthesize key carbohydrate oligosaccharides such as Galβ1-3GalNAc.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
The main object of the present invention is to provide β-galactosidase which is easily available and has an action of hydrolyzing and forming a β1-3 galactoside bond with high selectivity.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that bacteria belonging to the genus Bacillus produce β-galactosidase that selectively hydrolyzes β1-3 galactoside bonds (hereinafter sometimes referred to as β1-3 bonds). And the gene which codes this (beta) -galactosidase was cloned, E. coli was transformed using the recombinant plasmid which inserted this gene, and it succeeded in expressing this (beta) -galactosidase. Furthermore, using the expressed β-galactosidase, a sugar having a β1-3 galactoside bond was hydrolyzed, and Galβ1-3GalNAc and Galβ1-3GlcNAc were successfully synthesized, thereby completing the present invention.
[0017]
That is, the present invention
(1) Derived from bacteria belonging to the genus Bacillus, hydrolyzes β1-3 galactoside bonds, hardly hydrolyzes β1-6 galactoside bonds and β1-4 galactoside bonds, and galactoside compounds and sugars in which galactose is β-linked Β-galactosidase having an action of selectively forming a β1-3 galactoside bond with a receptor,
(2) β-galactosidase according to (1), which has the whole or at least part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(3) The bacterium belonging to the genus Bacillus according to (1) is a Bacillus circulans species (1) or β-galactosidase according to (2),
(4) A method for producing β-galactosidase, comprising culturing a bacterium belonging to the genus Bacillus and obtaining the β-galactosidase according to (1) or (2) from the culture supernatant and / or the microbial cell. ,
(5) The method for producing β-galactosidase according to (4), wherein the bacterium belonging to the genus Bacillus is a Bacillus circulans species,
(6) A gene encoding β-galactosidase according to (1), (2) or (3),
(7) The gene according to (6), comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(8) A recombinant plasmid obtained by inserting a gene encoding β-galactosidase according to (6) or (7) into a vector,
(9) A transformant obtained by introducing the recombinant plasmid according to (8) into a host cell,
(10) β-galactosidase obtained by culturing the transformant according to (9),
(11) A method for producing β-galactosidase, comprising obtaining β-galactosidase according to (10),
(12) A method for producing a carbohydrate linked by a β1-3 galactoside bond, characterized by using the β-galactosidase described in (1), (2), (3) or (10),
(13) A method for producing a carbohydrate, comprising cleaving a β1-3 galactoside bond in a carbohydrate using the β-galactosidase described in (1), (2), (3) or (10) ,
About.
[0018]
As an example, the present inventors have so far produced two types of β-galactosidase (β-galactosidase-1 and β-galactosidase-2) having the property of preferentially hydrolyzing β1-4 galactoside bonds. CameBacillus circulans(Z. Mozaffar, K. Nakanishi, R. Matsuno, and T. Kamikubo, Agric. Biol. Chem., 48, 3053-3061 (1984)) actually produce three types of β-galactosidase, of which For the first time was found to specifically hydrolyze β1-3 galactoside bonds.
[0019]
Traditionally,Bacillus circulans(Less thanB. circulansThe commercially available enzyme agent Biolacta (Daiwa Kasei) is used as the β-galactosidase derived from the above), and as shown in Example 1, β-galactosidase-1 and β-galactosidase-2 are included in this enzyme agent. Only two types of β-galactosidase.
[0020]
B. circulansIs not known to produce β-galactosidase which preferentially hydrolyzes β1-3 linkages, and the β-galactosidase of the present invention is novel. Also,B. circulansIt has not been known so far that bacteria belonging to the genus Bacillus other than the above produce β-galactosidase that preferentially hydrolyzes β1-3 bonds.
[0021]
As mentioned above, as an enzyme that preferentially hydrolyzes β1-3 bond,Xanthomonas[Beta] -galactosidase derived from a bacterium belonging to No. 2 is known. However, the specificity of the action in the hydrolysis of galactosidase does not necessarily correspond to the resulting galactosyl oligosaccharide binding mode. Therefore, it is not clear whether this galactosidase has the action of forming β1-3 galactoside bonds, and even if it has the action of forming β1-3 galactoside bonds, It is not known whether oligosaccharides can be selectively obtained. Therefore, it is unclear whether it is possible to synthesize key carbohydrate oligosaccharides such as Galβ1-3GalNAc using this β-galactosidase.
[0022]
Furthermore, the inventors haveB. circulansThe above-mentioned novel β-galactosidase gene that selectively hydrolyzes β1-3 galactoside bonds from E. coli is transformed, E. coli is transformed with the recombinant plasmid inserted with this gene, and the β-galactosidase is expressed. Succeeded.
[0023]
Moreover, it succeeded in hydrolyzing the sugar which has a β1-3 galactoside bond using the expressed β-galactosidase. Furthermore, in the enzymatic synthesis of carbohydrates linked by β1-3 galactoside bonds, Galβ1-3GalNAc and Galβ1- are not formed by the β-galactosidase reaction of the present invention without the formation of β-galactoside bonds other than β1-3 galactoside bonds. For the first time, 3GlcNAc was successfully regioselectively synthesized in one step.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The features of the action of β-galactosidase of the present invention are as follows.
[0025]
The β-galactosidase of the present invention hydrolyzes galactosylglucosamine or galactosylgalactosamine having a β1-3 galactoside bond very rapidly. Do not disassemble. The β-galactosidase of the present invention has an action of selectively forming a β1-3 galactoside bond from a galactoside compound in which galactose is β-linked and a sugar receptor.
[0026]
From the above, the β-galactosidase of the present invention is conventionally known.B. circulansIs clearly different from β-galactosidase-1 and β-galactosidase-2.
[0027]
Further, from the base sequence of the gene obtained by cloning the β-galactosidase of the present invention, the amino acid sequence of the β-galactosidase of the present invention consists of 586 amino acids shown in SEQ ID NO: 3, and the molecular weight is about 66800. Presumed to be.
[0028]
However, the β-galactosidase of the present invention is not limited to those having this amino acid sequence, and even if a part of the sequence is deleted, substituted, or another amino acid sequence is inserted, As long as it has the characteristics, it is included in the present invention.
[0029]
In addition,XanthomonasThe amino acid sequence of the β-galactosidase deduced from the gene sequence of β-galactosidase derived from a bacterium belonging to (Christopher, HT et al., Glycobiology, 5 (6), 603-610 (1995)), and β of the present invention -The homology with the amino acid sequence of galactosidase is only 43.3%, and they are completely different.
[0030]
As a bacterium that produces β-galactosidase of the present invention,Bacillus subtilis,Bacillus brevis,Bacillus circulans,Bacillus stearothermophilus,Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium,Bacillus larvae,Bacillus thuringiensisAnd can be selected from any species belonging to the known genus Bacillus, and is not particularly limited.
[0031]
In order to produce the β-galactosidase of the present invention, a bacterium belonging to the genus Bacillus that spontaneously produces the enzyme may be cultured and obtained from the supernatant of the culture broth or the microbial cells. The β-galactosidase gene is cloned from a bacterium belonging to the genus Bacillus producing the β-galactosidase of the present invention, and this is inserted into an appropriate vector to prepare a recombinant plasmid. An appropriate host cell may be transformed and cultured from the culture supernatant or the cells by culturing the transformed cell.
[0032]
In addition, β-galactosidase of the present invention is, for example,B. circulansAs described above, two types of galactosidases having high β1-4 binding specificity coexist in the culture supernatant or cells. For this reason, when used in applications where β1-3 binding specificity is required, for example, in a case where a polysaccharide having β1-3 bonds as described above is synthesized by the reverse reaction of hydrolysis, these It is necessary to remove the commensal galactosidase with high β1-4 binding specificity.
[0033]
In comparison, when the β-galactosidase gene of the present invention is introduced into E. coli lacking β-galactosidase activity or expressed in another suitable host to obtain β-galactosidase, the coexisting β1 -4 Since there is no galactosidase activity with high binding specificity, there is an advantage that the preparation can be used as it is in the reaction.
[0034]
There is no particular limitation on the method for cloning a β-galactosidase gene from a bacterium belonging to the genus Bacillus that produces β-galactosidase of the present invention, and any method commonly used in the field of genetic engineering may be followed.
[0035]
One example is the preparation of chromosomal DNA from bacteria belonging to the genus Bacillus,SauPartially disassemble and cut with 3AI. Next, this DNA fragment is ligated to an Escherichia coli plasmid vector pBR322 to prepare a gene library. Using this library, an E. coli strain lacking β-galactosidase activity was transformed. From the colonies that appeared, clones expressing β-galactosidase activity were identified as X-gal (5-bromo-4-chloro The blue coloration due to the decomposition of (-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) is selected as an index.
[0036]
The vector for inserting the gene encoding β-galactosidase of the present invention used for introduction into a host and transformation is not limited to pBR322. And it can be expected to further increase the production amount by using a method usually used in the field of genetic engineering. For example, this gene is linked to a vector with a higher copy number than pBR322, such as pUC18, to increase the number of genes per bacterium, or the gene is placed downstream of a strong promoter such as the lac promoter on the pUC18 plasmid. It is also possible to increase the yield of the β-galactosidase of the present invention by using a method such as transcription from an appropriate promoter.
[0037]
In addition, it can be expected that the β-galactosidase of the present invention is secreted outside the microbial cells using a method for exocrine microbial cells known in the field of genetic engineering. In this case, there is an advantage that the purification of β-galactosidase of the present invention becomes very easy.
[0038]
As a host for introducing and expressing this gene, not only Escherichia coli but also Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Brevis bacteria (Bacillus brevis), Cheese lactic acid bacteria (Lactococcus lactis subsp.lactisBacteria, yeasts, cells, etc. of various genera / species for which gene transfer systems have been established. Also,B. circulansWhen a gene transfer system for fungi was developed,B. circulansIt is also possible to increase the production amount of the present enzyme by introducing multiple copies of this gene.
[0039]
In addition, as a result of genetic engineering of this gene and partial deletion of the sequence, substitution, or insertion of other nucleotide sequences, the amino acid sequence or protein conformation of β-galactosidase produced by the transformant Even if it is not identical to β-galactosidase produced by the bacterium from which the gene is derived, it is included in the present invention as long as the property of specifically hydrolyzing the β1-3 bond is retained.
[0040]
By using the β-galactosidase of the present invention, it is possible to produce carbohydrates linked by β1-3 bonds, or to produce carbohydrates by cleaving β1-3 bonds in carbohydrates.
[0041]
That is, as an example, in the presence of this enzyme, transfer reaction is performed using paranitrophenyl-β-D-galactopyranoside (Galβ-pNP) as a sugar donor and N-acetylgalactosamine (GalNAc) as a sugar acceptor. Galβ1-3GalNAc can be obtained with extremely high regioselectivity. Similarly, Galβ1-3GlcNAc is obtained in a reaction using N-acetylglucosamine (GlcNAc) as a sugar receptor.
[0042]
Here, the sugar donor in the transglycosylation reaction is not only Galβ-pNP but also β-linked galactose such as orthonitrophenyl-β-D-galactopyranoside and phenyl-β-D-galactopyranoside. If it is a galactoside compound, it is not necessary to stick to the aglycone. Further, not only GalNAc or GlcNAc exemplified as receptors, but also any monosaccharide and oligosaccharide such as glucose, galactose, GalNAc-serine, chitobiose, lactose, lactosamine, GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc can be used.
[0043]
The β-galactosidase of the present invention provides a method for synthesizing a mucin-type sugar chain, an asparagine-linked sugar chain or an oligosaccharide having a partial structure of a glycolipid in an extremely short process and at a low cost compared to conventional methods. To do.
[0044]
In addition, the β-galactosidase of the present invention can be used not only for the reaction of selectively synthesizing β1-3 linked oligosaccharides, but also for structural analysis of sugar chains by utilizing the substrate specificity of the hydrolysis. Can be applied.
[0045]
Conventionally, there are no commercially available products that hydrolyze β1-3 bonds with high selectivity.Streptococcus Since 6646K-derived β-galactosidase hydrolyzes both β1-3 and β1-4 bonds,Streptococcus pneumoniaeIt was used in combination with β-galactosidase derived from it. That is,Streptococcus If hydrolyzed with β-galactosidase derived from 6646K, the sugar chain is assumed to be β1-4 or β1-3, and thenStreptococcus pneumoniaeIf it was not hydrolyzed with β-galactosidase specific to β1-4 binding, it was judged to be β1-3 binding. If this enzyme is used, this analysis can be directly determined in one step, and the operation is greatly simplified.
[0046]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0047]
In the following examples, β-galactosidase activity was measured by the following method. In other words, 50 μl of the sample and 450 μl of Z buffer (60 mM Na₂HPO_Four, 40 mM NaH₂PO_Four, 10 mM KCl, 1 mM MgSO_Four, 50 mM β-mercaptoethanol, pH 7.0) and 100 μl 0.4% ONPG (o-nitrophenylgalactopyranoside) solution (in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)), reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then 250 μl of 1M Na₂CO_ThreeWas added to stop the reaction, and the increase in absorbance at 420 nm was measured. One unit of β-galactosidase was defined as the amount of enzyme that changed the absorbance by 1 under this condition. In addition, about the standard with weak activity, reaction time was extended and it measured.
[0048]
Example 1 (B. circulans Activity staining of β-galactosidase of ATCC 31382)
B. circulans ATCC 31382 strain (hereinafter sometimes abbreviated as ATCC 31382 strain) was added to LB medium (Sambrook, J. et al., (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) Was inoculated at a concentration of 1% in a medium containing 0.5% lactose, and cultured with shaking at 37 ° C. for 8 hours. The supernatant from which the cells have been removed by centrifugation is concentrated about 100 times with Centricon 30 ultrafiltration device (Amicon), and at the same time, the solvent is replaced with 20 mM Tris acetate buffer (pH 7.0). The sample was used as a standard. To 10 μl of the sample, add 5 μl of glycerol, 2.5 μl of dye solution (0.1% bromophenol blue, 10% glycerol) and 0.5 μl of 0.5M Tris buffer (pH 6.8), and use Multigel 12.5 (Daiichi Chemical Industry) Polyacrylamide gel electrophoresis was performed. Electrophoresis was performed using a Tris-glycine buffer solution (0.025M Tris, 0.192M glycine) with a current of 20 mA for 5 hours. The gel after electrophoresis was immersed in the above-mentioned Z buffer containing 0.04% X-gal and left to stand at 37 ° C. for 12 hours for staining. By this staining treatment, only the protein showing β-galactosidase activity among the proteins contained in the sample is stained blue. The results are shown in lane 2 of FIG. As shown in this figure, at least three kinds of β-galactosidase were present in the culture solution of ATCC 31382 strain. These were named β-galactosidase-1, β-galactosidase-2, and β-galactosidase-3, respectively, in ascending order of mobility.
[0049]
As a control, the same activity staining was performed on 200 μg of Biolacta N5 (Daiwa Kasei). The result is shown in lane 1 of FIG. From this figure, it was clarified that only β-galactosidase-1 and β-galactosidase-2 among the above three galactosidases exist in violacta.
[0050]
This revealed that β-galactosidase-3 is a conventionally unknown β-galactosidase.
[0051]
Example 2 (B. circulans Cloning of ATCC 31382 β-galactosidase-3 gene)
ATCC 31382 strain was cultured in LB medium (Sambrook, J. et al., (1982) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York) and centrifuged. Chromosomal DNA was prepared from the cells collected by the method described in Saito et al. (Saito, H. and Miura, K., (1963) Biochem. Biophys. Acta., 72, 619). Restriction enzyme to prepared DNASauAfter partial digestion with 3AI and fractionation by agarose electrophoresis, only the region containing a DNA fragment of about 2 kb to about 10 kb was cut out and recovered using a GENECLEAN DNA purification kit (BIO 101). The recovered fragment was ligated to E. coli plasmid pBR322 (Takara Shuzo) cleaved with BamHI and transformed into E. coli TG1 strain (Amersham). This transformed TG1 strain was cultured on an LB agar medium containing 0.002% X-gal and 50 μg / ml ampicillin, and colonies expressing β-galactosidase activity were selected. Plasmid DNA was prepared from 8 colonies showing blue color, and the clone having the shortest 2.3 kb insertion was named pBCBG12-1.
[0052]
Example 3 (Analysis of β-galactosidase-3 gene)
DNA fragments in pBCBG12-1 were subcloned into E. coli pUC118 and 119 (Takara Shuzo), and all DNA bases using the Kilo Sequence Kit (Takara Shuzo) and a 373A type fluorescent DNA automatic sequencing device (Applied Biosystems) The sequence was determined. The obtained base sequence of 2297 bases is shown in SEQ ID NO: 2. In this sequence, there is an open reading frame from the 217th base A to the 1974th base T, and this is the gene body encoding the β-galactosidase of the present invention. The base sequence of this open reading frame portion is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of β-galactosidase of the present invention deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 1. From this, it was estimated that the β-galactosidase of the present invention consists of 586 amino acids and has a molecular weight of about 66800.
[0053]
Example 4 (Activity staining of β-galactosidase produced by host cells introduced with β-galactosidase-3 gene)
The Escherichia coli TG1 strain carrying the clone pBCBG12-1 containing the β-galactosidase-3 gene obtained in Example 2 was cultured with shaking in the above-mentioned LB medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C. for 12 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 1/2 volume of 20 mM Tris acetate buffer (pH 7.0) using a W-375 ultrasonic crusher (Heat Systems-Ultrasonics). The cells were crushed, and the centrifuged supernatant was used as a standard. The sample was electrophoresed in the same manner as in Example 1 and was subjected to activity staining with X-gal. The results are shown in lane 3 of FIG. Β-galactosidase expressed by BCBG12-1 gene showed the same mobility as β-galactosidase-3 of ATCC 31382 strain.
[0054]
Example 5 (Purification of β-galactosidase-3)
The Escherichia coli TG1 strain carrying the clone pBCBG12-1 containing the β-galactosidase-3 gene obtained in Example 2 was cultured with shaking in the above-mentioned LB medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ° C. for 12 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 1/15 volume of 20 mM Tris acetate buffer (pH 7.0). This liquid is crushed using W-375 type ultrasonic crusher (Heat Systems-Ultrasonic), and 1 ml of the centrifugal supernatant (hereinafter referred to as crude enzyme solution, used in the following examples) is used. , Dialyzed against 10 mM sodium buffer (pH 7.4) and applied to Resource Q (1 ml, Pharmacia) equilibrated with the same buffer. The enzyme was eluted with a 0 to 0.5 M saline gradient. The β-galactosidase activity in each fraction was measured, and the active fraction was concentrated using Ultra Free CL (fractionated molecular weight 30 k, Millipore). The above concentrated solution was applied to a Sephacryl S-200 column (2.6 cm × 100 cm, Pharmacia) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.2 M sodium chloride. The β-galactosidase activity of each fraction eluted with the same buffer was measured, and a purified enzyme was obtained by concentrating the active fraction.
[0055]
Example 6 (Experiment on hydrolysis of disaccharides having various galactoside bonds by β-galactosidase-3)
Dissolve 25 μg of Gal-GlcNAc and 25 μg of chitotetraose with β1-3 galactoside bond, β1-4 galactoside bond or β1-6 galactoside bond in 50 μl of water, 1 μl of 1M potassium phosphate buffer (pH 6.0) Was added. 0.5 μl of the crude enzyme solution was added thereto, and the reaction was performed at 37 ° C. Sampling was performed periodically and the hydrolysis rate of the disaccharide was determined by HPLC. The results are shown in FIG. From this figure, it is clear that β-galactosidase of the present invention rapidly hydrolyzes β1-3 bonds, but hardly hydrolyzes β1-4 bonds and β1-6 bonds.
[0056]
Example 7 (Synthesis of Galβ1-3GalNAc with β-galactosidase-3)
72 mg of Galβ-pNP and 160 mg of GalNAc were dissolved in 1 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 20% (v / v) dimethylformamide (DMF). 20 μl of the crude enzyme solution was added to this solution and reacted at 37 ° C. for 8 hours. The HPLC of the obtained reaction product is shown in FIG. When this reaction product was applied to an activated carbon column and the disaccharide fraction was concentrated, 9.3 mg of Galβ1-3GalNAc was obtained (yield 10.1%).
[0057]
Example 8 (Synthesis of Galβ1-3GalNAcα-pNP with β-galactosidase-3)
15.4 mg of Galβ-pNP and 35 mg of GalNAcα-pNP were dissolved in 3 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 20% (v / v) DMF. 60 μl of the crude enzyme solution was added to this solution and reacted at 37 ° C. for 3.5 hours. When the reaction solution was applied to a Sephadex G-10 column (2.6 cm × 100 cm, Pharmacia) and the disaccharide fraction was concentrated, 11.8 mg of Galβ1-3GalNAcα-pNP was obtained (yield 45.7%).
[0058]
Example 9 (Synthesis of Galβ1-3GlcNAc with β-galactosidase-3)
72 mg of Galβ-pNP and 160 mg of N-acetylglucosamine were dissolved in 1 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 20% (v / v) acetonitrile. 20 μl of the crude enzyme solution was added to this solution and reacted at 37 ° C. for 3 hours. The obtained reaction solution was applied to a column packed with 20 g of activated carbon, and the disaccharide fraction was collected and concentrated to obtain 11.2 mg of Galβ1-3GlcNAc (yield 12.2%). Of reaction products¹The H-NMR spectrum is shown in FIG.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention, β-galactosidase having an action of specifically hydrolyzing β1-3 galactoside bonds and selectively forming β1-3 galactoside bonds can be obtained at low cost and in large quantities. With β-galactosidase of the present invention, Galβ1-3GalNAc, which is a key oligosaccharide important in the structure of glycoproteins and glycolipids, can be synthesized at low cost by an enzymatic method.
[0060]
[Sequence Listing]

[0061]

[0062]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an activity stain of β-galactosidase. Lane 1 is 200 μg of Biolacta N5 (Daiwa Kasei), Lane 2 isB.

circulans

Lane 3 of the supernatant of the culture broth obtained by culturing ATCC 31382 strain in LB medium containing 1% lactose for 8 hours was transformed with the pBCBG12-1 plasmid containing the cloned β-galactosidase-3 gene. The activity staining of the crude cell extract of Escherichia coli TG1 is shown respectively. In this figure, β-gal1, β-gal2, and β-gal3 mean β-galactosidase-1, β-galactosidase-2, and β-galactosidase-3, respectively.
FIG. 2 shows the results of an experiment in which a disaccharide having each galactoside bond was hydrolyzed using the β-galactosidase of the present invention. It is a plot of the decrease in peak intensity over time when the peak intensity before enzyme addition is taken as 100.
FIG. 3 is a HPLC of the reaction solution when Galβ1-3GalNAc was synthesized by a transfer reaction using β-galactosidase of the present invention. The column is AsahipakNH2-P50, the eluent is 70% acetonitrile (0.8 ml / min), and the monitor is UV (215 nm).
[Fig. 4] 500 MHz of Galβ1-3GlcNAc synthesized by a reaction using β-galactosidase of the present invention.¹It is an H-NMR spectrum. The measuring device is a Varian Unity-500 NMR Spectrometer. D sample₂Dissolved in O, the peak of HDO was used as a standard for chemical shift (4.65 ppm).

Claims

Β-galactosidase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

The gene encoding β-galactosidase according to claim 1, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.

A recombinant plasmid obtained by inserting a gene encoding β-galactosidase according to claim 2 into a vector.

A transformant obtained by introducing the recombinant plasmid according to claim 3 into a host cell.

Β-galactosidase obtained by culturing the transformant according to claim 4.

A method for producing β-galactosidase, comprising obtaining the β-galactosidase according to claim 5.