JP3879037B2

JP3879037B2 - Data collection method for biomolecular microarray

Info

Publication number: JP3879037B2
Application number: JP2001358581A
Authority: JP
Inventors: 英夫田代; 恭光近藤; 徳司橘内
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-11-22
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2021-11-22
Also published as: JP2003156442A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子マイクロアレイのデータ収集方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析できるＤＮＡマイクロアレイは、1枚につき数千〜数万の遺伝子を解析する。従来のＤＮＡマイクロアレイは、ＤＮＡをスタンピングする装置(ＤＮＡアレイヤー)を用い、先が割れたクイルピンでＤＮＡを吸い取り、スライドガラスに４〜４８本程度のクイルピンを同時に打ち付けることによりＤＮＡスポットを作製する。このようにして作製されたＤＮＡスポットは、形状や面積が一定していないため、再現性や定量性に悪影響を与える。また、ＤＮＡスポットの位置は、クイルピンごとに曲がっている向きが異なっていたり、クイルピンがスタンピング時にそれぞれ回転することで、それぞれのＤＮＡスポットが正確に整列することなくＤＮＡスポットはゆがみが生じる結果となる。このようにして作製されたＤＮＡマイクロアレイは、蛍光標識した核酸試料をハイブリダイゼーション反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡をベースにした蛍光スキャナーによりＤＮＡマイクロアレイ全体の蛍光像を取得する。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイの蛍光像は、そのままではスポットごとの蛍光強度を測定することができないため、解析用ソフトウエアにより、グリッディングという操作を行う。グリッディングは、アレイ上のスポットの縦横の数やスポットの間隔、スポットの直径の大きさを入力し、スポットを円で囲む操作をいう。このグリッディングは、スポットの位置がずれていると正確に囲むことができないため、ソフトウエアにより、自動で位置を補正する機能がついている。しかるに、すべての操作が自動になっているわけではなく、手動でスポットの開始点の設定や目視によりすべてのスポットのグリッドを確認し補正する必要がある。そのため、この操作は、非常に煩雑であり、ＤＮＡスポットの数が数千以上になると非常に時間がかかる作業となり、解析スピードを遅らせる要因となっている。
【０００４】
そこで本発明は、ＤＮＡマイクロアレイからの蛍光データの収集を、人手を煩わすことなく自動で行うことができる、ＤＮＡマイクロアレイのデータ収集方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
［請求項１］光反射層スポット上に生体分子プローブが固定された生体分子プローブ固定スポットを基板表面に複数個有する生体分子マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲット生体分子を相互作用させ、得られた生体分子マイクロアレイに励起光を照射し、生体分子マイクロアレイからの反射光及び蛍光を同時に計測し、生体分子マイクロアレイ上の反射光の強度の違いから、光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定スポットを特定し、特定されたスポット範囲からの蛍光データを得ることを含む、生体分子マイクロアレイのデータ収集方法。
［請求項２］光反射層スポット上に生体分子プローブが固定された生体分子プローブ固定スポットを基板表面に複数個有する生体分子マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲット生体分子を相互作用させ、得られた生体分子マイクロアレイに光を照射し、生体分子マイクロアレイからの反射光を計測し、生体分子マイクロアレイ上の反射光の強度の違いから、光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定スポットを特定し、特定された生体分子プローブ固定スポット範囲のみに励起光を照射して蛍光を測定し、特定されたスポット範囲からの蛍光データを得ることを含む、生体分子マイクロアレイのデータ収集方法。
［請求項３］前記特定されたスポット範囲を、生体分子マイクロアレイ上の光反射層スポットとそれ以外の生体分子マイクロアレイ表面との反射率の相違から検出することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］前記光反射層スポットは、前記生体分子プローブ固定スポットと、実質的に同一の平面形状を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］生体分子プローブ固定スポットに照射する光または励起光がレーザ光である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］前記ターゲット生体分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項７］前記特定されたスポット範囲のみからの蛍光データが、蛍光強度のスポット範囲での積算値、平均値または中間値として得られる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］前記特定されたスポット範囲のみからの蛍光データが、蛍光強度のスポット範囲での積算値、平均値または中間値として、各蛍光波長毎に得られる請求項７に記載の方法。
［請求項９］生体分子マイクロアレイ上の各スポットについて順次、前記蛍光データが収集される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］生体分子マイクロアレイ上の複数のスポットについてスポット範囲の特定を行い、次いで、スポット範囲が特定された各スポットが発する蛍光を順次計測し、予め特定されたスポット範囲のデータを用いて、該スポット範囲のみからの蛍光データが、連続的に収集される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］生体分子マイクロアレイ上の一部の領域の生体分子プローブ固定スポットの特定を行い、特定された一部のスポット位置から、全体の生体分子プローブ固定スポットの位置を計算し、該スポット範囲を特定する請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］生体分子マイクロアレイ上の全てのスポットについてスポット範囲の特定を予め行う請求項１０に記載の方法。
【０００６】
【発明の実施の態様】
［生体分子マイクロアレイ］
本発明の生体分子マイクロアレイのデータ収集方法に用いる生体分子マイクロアレイは、光反射層スポット上に生体分子プローブが固定された生体分子プローブ固定スポットを基板表面に複数個有するものである。
【０００７】
上記生体分子マイクロアレイ用基板の基板は、例えば、ガラス基板、シリコン基板または石英ガラス基板であることができる。上記生体分子プローブ固定スポットは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン及びポリ−Ｌ−リジン、並びにアミノ基、アルデヒド基、チオール基、カルボキシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシド基及びイソチオシアネート基を有する化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種の生体分子プローブ固定化用化合物を所定量固定化することにより形成される。生体分子プローブ固定化用化合物の例としては、以下の化合物を挙げることができる。但し、これらの化合物は例示にすぎず、これらに限定される意図ではない。
【０００８】
＜アミノ基を有する化合物＞
３−アミノプロピルトリメトキシシラン
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＥＤＡ）
トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）
３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン
＜アルデヒド基を有する化合物＞
グルタルアルデヒド
＜チオール基を有する化合物＞
４−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）
＜エポキシド基を有する化合物＞
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
＜イソチオシアネート基を有する化合物＞
４−フェニレンジイソチオシアネート（ＰＤＩＴＣ）
＜スクシンイミド及びマレイミド基有する化合物＞
ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）
スクシンイミジル４−（マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）
ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）
【０００９】
生体分子プローブ固定スポットに固定化される生体分子プローブ固定化用化合物の量は、化合物の種類に応じて適宜決定できる。生体分子プローブ固定スポットの形状には特に制限は無いが、例えば、円形であることができ、その直径は、例えば、１０〜５００μｍの範囲であることができる。また、生体分子プローブ固定スポットの形状は、矩形若しくは多角形であることもでき、矩形または多角形の一辺の長さは、例えば、１０〜５００μｍの範囲であることができる。
【００１０】
上記の基板は、生体分子プローブ固定スポットと基板表面との間に光反射層を有する。さらに、この光反射層は、その上に設けられた生体分子プローブ固定スポットと、実質的に同一の形状を有することが好ましい。それにより、光反射層のスポットを検出することにより、生体分子スポットの位置及び面積を自動に認識することができるという利点がある。
【００１１】
光反射層を構成する物質は、光反射性を有する物質であれば特に制限はない。光反射層は、例えば、金属層であることかでき、金属層としては、例えば、アルミニウム、金、銀、プラチナ、ニッケル等を挙げることができる。あるいは、光反射層は、酸化物等からなる単層または多層の反射層であることもできる。
【００１２】
上記の生体分子マイクロアレイ用基板は、生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面に撥水層を有することができる。生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面が撥水処理されていることで、生体分子プローブ固定化用スポットへの生体分子プローブの固定化をより正確に行うことができる。撥水層は、既存の撥水剤を用いて形成することができる。撥水剤としては、例えば、シリコンコート剤、フッ素コート剤、ナイロンコート剤、テフロンコート剤（テフロンは登録商標）等を用いることができる。
【００１３】
生体分子マイクロアレイ用基板に固定化される生体分子プローブは、例えば、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができ、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板には、ＤＮＡマイクロアレイ用基板が包含される。
【００１４】
上記の生体分子マイクロアレイ用基板は、以下の工程を含む製造方法により製造できる。
基板表面に光反射層を設ける工程、
光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程、
生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程、
フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程、
フォトレジスト層を現像する工程、
フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングする工程、
フォトレジスト層を除去する工程
を含む本発明の製造方法により製造できる。
【００１５】
基板表面に光反射層を設ける工程は、例えば、金属を基板表面に蒸着することにより行うことができる。金属の蒸着方法及び条件は、公知の方法及び条件をそのまま用いることができる。尚、金属を基板表面に蒸着する前に、基板表面を洗浄しておくことが好ましい。
次いで、光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を形成するが、光反射層がアルミニウム層の場合、生体分子プローブ固定化層形成の前に、アルミニウム層表面をエタノールで酸化処理し、さらにアミノシラン化合物を用いてアミノシラン処理することができる。光反射層をアミノシラン処理することで、ＤＮＡ等の生体分子を物理吸着ではなく化学的固定が可能となるため、その後の操作におけるＤＮＡ等の生体分子の損失を少なくすることができるという利点がある。
【００１６】
光反射層の上に生体分子プローブ固定化層を設ける工程は、光反射層上に生体分子プローブ固定化用化合物を固定化することにより行うことができる。生体分子プローブ固定化用化合物は上記本発明の基板において挙げた物質から適宜選択できる。生体分子プローブ固定化用化合物がビオチンの場合、その固定化は、例えば、ビオチンスクシンイミドエステルをアミノシラン処理した光反射層表面に反応させることで実施できる。生体分子プローブ固定化用化合物がアルデヒド基を有する化合物であるグルタルアルデヒドの場合、その固定化は、グルタルアルデヒドをアミノシラン処理した光反射層表面に反応させることで実施できる。
【００１７】
生体分子プローブ固定化層の上にフォトレジスト層を設ける工程は、例えば、既存のレジスト材を常法、例えば、スピンコート法によりコーティングし、次いでレジスト材を熱硬化させることで行うことができる。レジスト材の種類、コーティング方法、硬化条件には特に制限はないが、例えば、ポジ型レジスト材をスビンコーターで約１μｍの厚みにコートし、オーブンで加熱することで、レジストの熱硬化を行うことができる。
【００１８】
フォトレジスト層をスポット形成用マスクを介して露光する工程は、レジスト材がポジ型又はネガ型かに応じて、所望の寸法、形状及び間隔で生体分子プローブ固定化用スポットが形成されるようなマスクを用意し、このマスクを介して行われる。露光条件は、フォトレジスト材の種類に応じて適宜決定される。
【００１９】
フォトレジスト層を現像する工程は、露光したフォトレジスト層を、現像液で処理し、必要により洗浄することで行われる。現像液は、使用するレジスト材に応じて適宜選択できる。
【００２０】
現像後、フォトレジスト層にて保護されていない光反射層部分をエッチングする。この工程は、光反射層をエッチングできるエッチング液を適宜選択して行われる。例えば、光反射層が金属層の場合、エッチング液は酸水溶液であることができ、酸水溶液に含まれる酸の種類や濃度等は、エッチングすべき金属の種類や層の厚みを考慮して適宜決定できる。
【００２１】
エッチング後、フォトレジスト層を除去する。この工程は、フォトレジストを溶解できる有機溶媒、例えば、アセトンを用いて行うことができる。フォトレジスト層除去後、必要により洗浄し、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板が得られる。
【００２２】
上記の製造方法においては、エッチング工程とフォトレジスト層除去工程との間に基板表面を撥水処理する工程を含むことができる。この段階で撥水処理することで、生体分子プローブ固定化用スポットが被覆されていない基板表面に撥水層を形成することができる。撥水処理は、撥水剤の種類に応じて適宜行うことができ、例えば、撥水剤に基板を浸漬することで行うことができる。
【００２３】
生体分子マイクロアレイは、上記の生体分子マイクロアレイ用基板の生体分子プローブ固定化用スポットに生体分子プローブが固定化されたものである。
生体分子プローブ固定スポットは、基板上に複数個設けられる。生体分子プローブ固定スポットの個数には特に制限はなく、基板の大きさ、スポットの大きさ及びスポットの間隔等を勘案して適宜決定される。
固定化された生体分子プローブは、各生体分子プローブ固定スポット間で、同一または異なる塩基配列を有することができる。
固定化された生体分子プローブは、例えば、オリゴＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。即ち、本発明の生体分子マイクロアレイには、ＤＮＡマイクロアレイが包含される
【００２４】
生体分子プローブ固定化用スポットへの生体分子プローブの固定化は、生体分子プローブ固定化用スポットを形成する生体分子プローブ固定化用化合物と結合性を有する物質または官能基を生体分子プローブに予め固定化しておき、例えば、この生体分子プローブを含む溶液を、本発明の生体分子マイクロアレイ用基板の生体分子プローブ固定化用スポットに滴下することで、行うことができる。
上記結合性を有する物質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンを挙げることができ、上記結合性を有する官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、スクシンイミド基、及びマレイミド基を挙げることができる。
【００２５】
［データ収集方法］
本発明の第１のデータ収集方法は、
（１）生体分子マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲット生体分子を相互作用させるステップ、
（２）ターゲット生体分子を相互作用させることにより得られた生体分子マイクロアレイに励起光を照射し、生体分子マイクロアレイからの反射光および蛍光を同時に計測するステップ、
（３）生体分子マイクロアレイ上の反射光の強度の違いから、光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定スポットを特定するステップ、及び
（４）前記で特定されたスポット範囲からの蛍光データを得るステップ
の４つのステップを含む。
【００２６】
本発明の第２のデータ収集方法は、
（１）生体分子マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲット生体分子を相互作用させるステップ、
（２）ターゲット生体分子を相互作用させることにより得られた生体分子マイクロアレイに光を照射し、生体分子マイクロアレイからの反射光を計測するステップ、
（３）生体分子マイクロアレイ上の反射光の強度の違いから光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定スポットを特定するステップ、
（４）特定された生体分子プローブ固定スポット範囲のみに励起光を照射して蛍光を計測するステップ、及び
（５）前記で特定されたスポット範囲からの蛍光データを得るステップ
の５つのステップを含む。
【００２７】
相互作用ステップ
このステップでは、前記生体分子マイクロアレイに、蛍光標識したターゲット生体分子を相互作用させる。ターゲット生体分子は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質であることができる。ターゲット生体分子に対する蛍光標識は、公知の方法で行うことができる。
生体分子マイクロアレイ上にスポット状に固定された生体分子プローブとターゲット生体分子との相互作用は、公知の方法及び条件で行うことができる。例えば、ＤＮＡプローブとターゲットｃＤＮＡとの相互作用（ハイブリダイゼーション）については、以下の方法で行うことができる。蛍光標識したターゲットｃＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液に混和し、熱処理によりターゲットｃＤＮＡを熱変性させた後、マイクロアレイ上にこの溶液をのせ、カバーガラスをかけ、この溶液が乾かないように密閉した湿箱にいれ、ターゲットｃＤＮＡ及びＤＮＡプローブに合わせた適温でハイブリッド形成反応を行う。ハイブリッド形成反応後、未反応のターゲットｃＤＮＡを除去するため、塩濃度及び温度を制御した溶液で、マイクロアレイを洗浄する。
【００２８】
反射光計測ステップ
このステップでは、蛍光標識したターゲット生体分子を相互作用させた生体分子マイクロアレイに光を照射し、生体分子マイクロアレイからの反射光を計測する。
生体分子マイクロアレイに照射する光としては、例えば、レーザ光を挙げることができる。レーザ光としては、ガスレーザ、固定レーザ、半導体レーザ等を挙げることができる。レーザの波長及び出力は、用いる蛍光標識により適宜選択される。また、レーザ光以外の光源としては、例えば、キセノンランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ等を挙げることができる。
生体分子マイクロアレイからの反射光の計測は、受光素子を用いることにより行うことができる。受光素子としては、光電子増倍管、フォトダイオード、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
また、反射光を測定する光として、用いる蛍光標識に適した励起光を使用することにより、反射光の測定と同時に蛍光の計測を行うことができる。その場合は、ダイクロイックミラー等により反射光と蛍光を分光し、蛍光を計測する受光素子を、励起光を計測する受光素子とは別に設ける必要がある。蛍光を計測する受光素子としては、光電子増倍管、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００２９】
スポット範囲特定ステップ
このステップでは、反射光計測ステップにより、計測した生体分子マイクロアレイからの反射光の強度データから、光反射層スポットを有する生体分子プローブ固定スポットの範囲を特定する。
本発明の方法で用いる生体分子マイクロアレイは、光反射層スポット上に設けられた生体分子プローブ固定スポットを基板表面に複数個有するものである。光反射層スポットの範囲を特定することで、生体分子プローブ固定スポットの範囲を特定することができる。特に、光反射層スポットが、生体分子プローブ固定用スポットと、実質的に同一の平面形状を有する場合、生体分子プローブ固定スポットの範囲の特定をより正確に行うことができる。
光反射層スポットは、それ以外の基板表面に比べ、反射率が高いため、光反射層スポットからの反射光の強度は、それ以外の基板表面より高くなり、また各光反射層スポットからほぼ一定の値を得ることができる。そのため、生体分子マイクロアレイからの反射光の強度の閾値を設定することで、光反射層スポットを特定することが可能となる。
【００３０】
蛍光計測ステップ
反射光計測ステップにより、同時に蛍光計測を行った場合には、このステップは不要となるが、反射光計測ステップ及びスポット範囲特定ステップにより、スポット範囲を特定した後、生体分子プローブ固定スポットのみの蛍光を計測する場合のステップである。
スポット範囲を特定した生体分子プローブ固定スポットのみに、励起光を照射し、前記スポットが有する蛍光標識から発生した蛍光を計測する。前記スポットからの蛍光計測には、受光素子を用いることができ、その受光素子としては、光電子増倍管、ＣＣＤ素子等を用いることができる。
【００３１】
蛍光データ取得ステップ
このステップでは、前記蛍光計測ステップで得られた蛍光データから、前記スポット範囲特定ステップで特定されたスポット範囲からの蛍光データを得る。このステップでは、生体分子プローブ固定スポット以外の基板表面に付着した蛍光標識されたターゲット生体分子などからの蛍光は排除され、光反射層スポット上の生体分子プローブ固定スポットに相互作用した蛍光標識されたターゲット生体分子のみからの蛍光データを得ることができる。
【００３２】
【実施例】
次に、本発明のデータ収集方法について、実施例に基づきより具体的に説明する。
実施例１
デジタルアレイスキャニング法１
マイクロアレイの蛍光を読みとるスキャナーは、大まかにレーザ光源とダイクロイックミラー、カットフィルター及び光電子増倍管から成る（図１）。レーザ光源10から発振されたレーザ光の大部分は、ダイクロイックミラー(A) 11で反射され、対物レンズ12を通して、マイクロアレイ20上の微小領域に照射されるが、ダイクロイックミラー(A) 11を透過するレーザ光もあり、そのレーザ光の光強度を受光素子(A) 13(フォトダイオード、光電子増倍管等)で計測し、レーザ光の反射率の補正値として利用する。ステージ上のマイクロアレイ20から発せられた蛍光と反射されたレーザ光は、対物レンズ12により集光され、次にダイクロイックミラー(B) 14を透過したレーザ光を受光素子(B) 15により計測する。蛍光は、ダイクロイックミラー(B) 14により反射され、カットフィルター16を通して光電子増倍管17で計測される。
【００３３】
アレイ上の顕微反射率は、次の式から表される。
Rf=kP_B/P_A
(Rf:アレイ上の顕微反射率、P_A:受光素子(A)でとらえたレーザ光源からのレーザ光の出力、P_B:受光素子(B)でとらえたアレイからのレーザ光の反射光の出力、k:フィルター及びミラー等の反射率による係数)
【００３４】
このように反射率の測定は、蛍光計測用のレーザ光を用いて行うため、既存のスキャナーに受光素子(A)と受光素子(B)を取り付けるだけで簡単に行うことができる。また、蛍光測定と同時に反射率測定を行うため、蛍光測定時間を延ばすことなく、反射率の測定が行える。さらに、一つのピクセル座標上に蛍光のデータと反射率のデータが存在することになり、蛍光のデータと反射率のデータの位置がずれることはない。受光素子(A)と受光素子(B)を使うことで、レーザ光源のパワー変動による誤差を補正できる。しかし、レーザ光源のパワー変動が大きくなく、無視できるような場合は、受光素子(A)を省くことができる。
【００３５】
二種類の蛍光色素(たとえば、Cy3,Cy5)を用いて、１枚のマイクロアレイ上で相対比較を行う場合一つのピクセル座標には、二つの蛍光データが存在することになる。このような場合にもこのデジタルアレイスキャニングは可能である。レーザ光源として二種類ある場合でも同様に、そのうちの一つのレーザ光源の反射率を基に計測すればよい。この場合には、一つのピクセル座標には、一つの反射率のデータと二つの蛍光データが存在することになる。本発明は、一つのピクセルの大きさを限定するものではないが、生体分子プローブ固定スポットの形状が直径50-500マイクロメーターの円の場合には、１ピクセルの大きさは、5-10マイクロメーターが好ましい。
【００３６】
解析手法を二種類の蛍光色素(Cy3及びCy5)を用いた場合について、図２に基づいて説明する。
スキャニングした画像を解析する際、生体分子プローブ固定スポットを認識する必要がある。生体分子プローブ固定スポットの認識は、反射率の相違を基に行う(図２最上段)。反射率のデータは、蛍光強度のデータと違い、全生体分子プローブ固定スポットにおいてほぼ一定の値を取るので、一定の閾値を設定することで生体分子プローブ固定スポットのみを認識することが可能となる。各スポットの蛍光強度は、その囲みの中にある蛍光データの積算値、平均値または中間値を計算することで求めることができる(図２、2段目及び3段目)。各生体分子プローブ固定スポットは、相対位置が一定であるので、順番に番号を振ることでそれぞれの位置を識別することができる。この方法では、生体分子プローブ固定スポットの大きさや形、数を設定する必要性はなく、自動的に認識することが可能となる。
【００３７】
実施例２
デジタルアレイスキャニング法２
本方法は、上記のデジタルアレイスキャニング法１をさらに高速にするための方法である。この方法では、アレイ上の全領域の蛍光を走査計測し、蛍光画像を取得するのではなく、アレイ上の生体分子プローブ固定スポットのみの蛍光を１点として計測するものである。図３及び４に基づいてさらに説明する。
【００３８】
生体分子プローブ固定スポットの位置を特定するために、生体分子マイクロアレイのAの領域及びBの領域において連続的に生体分子マイクロアレイを動かし、それぞれの領域に光を照射し、反射率の計測を行う（図３）。Ａの領域とＢの領域は、アレイの傾きと位置を割り出すために利用するため、対角線に位置していることが望ましいが、それに限定するものではない。また、それぞれの領域の広さについても限定しない。領域Ａ及びＢの全生体分子プローブ固定スポットにおいて反射率は、ほぼ一定の値を取るので、一定の閾値を設定し、生体分子プローブ固定スポットのみを認識することができる(図４最上段)。認識した各生体分子プローブ固定スポットの領域から、それぞれの中心を求め、全体のスポットの配列の位置を計算する。その際に、生体分子プローブ固定スポットの大きさ、横列の数、縦列の数、ブロック数などのスポットの配列を計算するのに必要なデータを入力する。
【００３９】
予備計測により求めたスポット配列を基にスポット地点に速やかに生体分子マイクロアレイを移動し、生体分子プローブ固定スポットより小さなあるいは同程度のレーザ焦光径で、各スポットを１点として計測する(図４、2段目、3段目)。その際、生体分子マイクロアレイを動かすためにステージを移動させてもよいし、また、レーザ光を光学的に動かしてもよい。レーザ光の照射により生体分子プローブ固定スポットから発せられた蛍光を計測し、生体分子プローブ固定スポットの蛍光強度とする。次のスポットの測定は、次のスポット地点に速やかにアレイを移動し行う。この方法では、生体分子プローブ固定スポットの蛍光強度を１点としてデジタル的に計測しているため、解析の段階で、スポットを認識し、データ化する必要はなく、計測と同時に数値化されている。また、基板表面の全領域の蛍光を計測する必要はないので、計測と解析のさらなる高速化を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロアレイの蛍光を読みとるスキャナーの概略図。
【図２】スキャニングした画像の解析方法（デジタルアレイスキャニング法１）の説明図。
【図３】スキャニングした画像の解析方法（デジタルアレイスキャニング法２）の説明図。
【図４】スキャニングした画像の解析方法（デジタルアレイスキャニング法２）の説明図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a data collection method for a biomolecule microarray.
[0002]
[Prior art]
A DNA microarray capable of comprehensively analyzing gene expression profiles analyzes thousands to tens of thousands of genes per sheet. A conventional DNA microarray uses a DNA stamping device (DNA arrayer), sucks DNA with a broken quill pin, and simultaneously strikes about 4 to 48 quill pins on a slide glass to produce a DNA spot. Since the DNA spot produced in this way has a non-constant shape and area, it adversely affects reproducibility and quantification. In addition, the DNA spot position is different for each quill pin, and the quill pin rotates at the time of stamping, resulting in the DNA spot being distorted without the DNA spots being accurately aligned. . The DNA microarray thus prepared is subjected to a hybridization reaction with a fluorescently labeled nucleic acid sample, and then a fluorescence image of the entire DNA microarray is obtained by a fluorescence scanner based on a confocal fluorescence microscope.
[0003]
Since the fluorescence image of the DNA microarray cannot directly measure the fluorescence intensity for each spot, an operation called gridding is performed by analysis software. Gridding is an operation in which the number of spots on an array, the interval between spots, the size of the spot diameter are input, and the spots are circled. Since this gridding cannot be accurately enclosed when the spot position is deviated, it has a function of automatically correcting the position by software. However, not all operations are automatic, and it is necessary to manually check and correct the grid of all spots by setting the start point of the spot or by visual observation. Therefore, this operation is very complicated, and when the number of DNA spots is several thousand or more, it becomes a very time-consuming work, which causes the analysis speed to be delayed.
[0004]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a data collection method for DNA microarrays, which can automatically collect fluorescence data from DNA microarrays without bothering humans.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
[Claim 1] Obtained by interacting a fluorescently-labeled target biomolecule with a biomolecule microarray having a plurality of biomolecule probe-fixed spots on the surface of the substrate, each having a biomolecule probe immobilized on a light reflecting layer spot. Irradiate the biomolecule microarray with excitation light, simultaneously measure the reflected light and fluorescence from the biomolecule microarray, and identify the biomolecule probe fixed spot with the light reflection layer spot from the difference in intensity of the reflected light on the biomolecule microarray And obtaining data of fluorescence from a specified spot range.
[Claim 2] Obtained by interacting a fluorescently labeled target biomolecule with a biomolecule microarray having a plurality of biomolecule probe-fixed spots on the surface of the substrate on which the biomolecule probe is immobilized on the light reflecting layer spot. The biomolecule microarray is irradiated with light, the reflected light from the biomolecule microarray is measured, and the biomolecule probe fixed spot having the light reflecting layer spot is identified and identified from the difference in the intensity of the reflected light on the biomolecule microarray. A method for collecting data of a biomolecule microarray, comprising: irradiating excitation light only to a spot range where the biomolecule probe is fixed and measuring fluorescence to obtain fluorescence data from the specified spot range.
[Claim 3] The specified spot range is detected from a difference in reflectance between the light reflecting layer spot on the biomolecule microarray and the surface of the other biomolecule microarray. The method described.
[Claim 4] The light reflecting layer spot is formed of the biomolecular probe.FixedThe method according to claim 1, wherein the method has substantially the same planar shape as the spot.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the light or excitation light applied to the biomolecular probe fixed spot is laser light.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the target biomolecule is DNA, RNA, cDNA, mRNA or protein.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein fluorescence data from only the specified spot range is obtained as an integrated value, average value, or intermediate value in the spot range of fluorescence intensity. .
[Claim 8] The method according to claim 7, wherein fluorescence data from only the specified spot range is obtained for each fluorescence wavelength as an integrated value, average value, or intermediate value in the spot range of fluorescence intensity.
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the fluorescence data is sequentially collected for each spot on the biomolecule microarray.
[Claim 10] A spot range is specified for a plurality of spots on the biomolecule microarray, then fluorescence emitted from each spot with the specified spot range is sequentially measured, and data of the spot range specified in advance are used. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein fluorescence data from only the spot range is continuously collected.
[Claim 11] The biomolecule probe fixing spot of a part of the region on the biomolecule microarray is specified, and the position of the whole biomolecule probe fixing spot is calculated from the specified part of the spot position. The method of claim 10, wherein the range is specified.
[Claim 12] The method according to claim 10, wherein the spot range is specified in advance for all spots on the biomolecule microarray.
[0006]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[Biomolecular microarray]
The biomolecule microarray used for the data collection method of the biomolecule microarray of the present invention has a plurality of biomolecule probe fixing spots on the surface of the substrate in which the biomolecule probe is fixed on the light reflection layer spot.
[0007]
  The substrate of the biomolecule microarray substrate can be, for example, a glass substrate, a silicon substrate, or a quartz glass substrate. The biomolecular probeFixedThe spot is selected from the group consisting of biotin, avidin, streptavidin and poly-L-lysine, and compounds having amino groups, aldehyde groups, thiol groups, carboxyl groups, succinimide groups, maleimide groups, epoxide groups and isothiocyanate groups. It is formed by immobilizing a predetermined amount of at least one kind of biomolecular probe immobilization compound. Examples of the biomolecular probe immobilization compound include the following compounds. However, these compounds are merely examples and are not intended to be limited thereto.
[0008]
<Compound having an amino group>
3-aminopropyltrimethoxysilane
N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA)
Trimethoxysilylpropyldiethylenetriamine (DETA)
3- (2-Aminoethylaminopropyl) trimethoxysilane
<Compound having an aldehyde group>
Glutaraldehyde
<Compound with thiol group>
4-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS)
<Compound having an epoxide group>
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
<Compound having an isothiocyanate group>
4-Phenylenediisothiocyanate (PDITC)
<Compounds having succinimide and maleimide groups>
Disuccinimidyl carbonate (DSC)
Succinimidyl 4- (maleimidophenyl) butyrate (SMPB)
m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS)
Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)
m-maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide ester (MPS)
[0009]
  Biomolecular probeFixedThe amount of the biomolecular probe immobilization compound immobilized on the spot can be appropriately determined according to the type of compound. Biomolecular probeFixedAlthough there is no restriction | limiting in particular in the shape of a spot, For example, it can be circular and the diameter can be the range of 10-500 micrometers, for example. Biomolecular probesFixedThe shape of the spot may be a rectangle or a polygon, and the length of one side of the rectangle or the polygon may be, for example, in the range of 10 to 500 μm.
[0010]
  The substrate is a biomolecular probeFixedA light reflecting layer is provided between the spot and the substrate surface. Furthermore, this light reflecting layer is provided with a biomolecular probe provided thereon.FixedIt is preferable to have substantially the same shape as the spot. Accordingly, there is an advantage that the position and area of the biomolecule spot can be automatically recognized by detecting the spot of the light reflecting layer.
[0011]
The substance constituting the light reflecting layer is not particularly limited as long as it is a substance having light reflectivity. The light reflecting layer can be, for example, a metal layer, and examples of the metal layer include aluminum, gold, silver, platinum, nickel, and the like. Alternatively, the light reflection layer can be a single-layer or multilayer reflection layer made of an oxide or the like.
[0012]
The biomolecule microarray substrate can have a water repellent layer on the surface of the substrate not covered with the biomolecule probe immobilization spot. Since the substrate surface that is not covered with the biomolecule probe immobilization spot is treated with water repellency, the biomolecule probe can be more accurately immobilized on the biomolecule probe immobilization spot. The water repellent layer can be formed using an existing water repellent. As the water repellent, for example, a silicon coating agent, a fluorine coating agent, a nylon coating agent, a Teflon coating agent (Teflon is a registered trademark), or the like can be used.
[0013]
The biomolecule probe immobilized on the biomolecule microarray substrate can be, for example, oligo DNA or cDNA, and the biomolecule microarray substrate of the present invention includes a DNA microarray substrate.
[0014]
The biomolecule microarray substrate can be manufactured by a manufacturing method including the following steps.
Providing a light reflecting layer on the substrate surface;
Providing a biomolecular probe immobilization layer on the light reflection layer;
Providing a photoresist layer on the biomolecular probe immobilization layer;
Exposing the photoresist layer through a spot forming mask;
Developing a photoresist layer;
Etching the light reflecting layer portion not protected by the photoresist layer;
Step of removing the photoresist layer
It can manufacture by the manufacturing method of this invention containing this.
[0015]
The step of providing the light reflecting layer on the substrate surface can be performed, for example, by evaporating metal on the substrate surface. As the metal deposition method and conditions, known methods and conditions can be used as they are. In addition, it is preferable to wash the substrate surface before depositing the metal on the substrate surface.
Next, a biomolecule probe immobilization layer is formed on the light reflection layer. When the light reflection layer is an aluminum layer, the surface of the aluminum layer is oxidized with ethanol before the biomolecule probe immobilization layer is formed. An aminosilane compound can be used for aminosilane treatment. Since the light reflecting layer is treated with aminosilane, biomolecules such as DNA can be chemically immobilized instead of physically adsorbed, so that the loss of biomolecules such as DNA in subsequent operations can be reduced. .
[0016]
The step of providing the biomolecule probe immobilization layer on the light reflection layer can be performed by immobilizing the biomolecule probe immobilization compound on the light reflection layer. The compound for immobilizing a biomolecular probe can be appropriately selected from the substances listed in the substrate of the present invention. When the biomolecular probe immobilization compound is biotin, the immobilization can be performed, for example, by reacting biotin succinimide ester with the surface of the light reflection layer treated with aminosilane. When the compound for immobilizing a biomolecular probe is glutaraldehyde, which is a compound having an aldehyde group, the immobilization can be carried out by reacting glutaraldehyde with the surface of the light reflecting layer treated with aminosilane.
[0017]
The step of providing a photoresist layer on the biomolecular probe immobilization layer can be performed, for example, by coating an existing resist material by a conventional method, for example, a spin coating method, and then thermally curing the resist material. There are no particular restrictions on the type of resist material, coating method, and curing conditions. For example, a positive resist material is coated to a thickness of about 1 μm with a spin coater and heated in an oven to thermally cure the resist. Can do.
[0018]
The step of exposing the photoresist layer through the spot forming mask is such that spots for immobilizing biomolecule probes are formed with desired dimensions, shapes and intervals depending on whether the resist material is a positive type or a negative type. A mask is prepared and the process is performed through this mask. The exposure conditions are appropriately determined according to the type of photoresist material.
[0019]
The step of developing the photoresist layer is performed by treating the exposed photoresist layer with a developer and washing as necessary. The developer can be appropriately selected according to the resist material to be used.
[0020]
After the development, the light reflection layer portion not protected by the photoresist layer is etched. This step is performed by appropriately selecting an etchant that can etch the light reflecting layer. For example, when the light reflection layer is a metal layer, the etching solution can be an acid aqueous solution, and the type and concentration of the acid contained in the acid aqueous solution are appropriately determined in consideration of the type of metal to be etched and the thickness of the layer. Can be determined.
[0021]
After the etching, the photoresist layer is removed. This step can be performed using an organic solvent that can dissolve the photoresist, for example, acetone. After removing the photoresist layer, the substrate is washed as necessary to obtain the biomolecule microarray substrate of the present invention.
[0022]
The above manufacturing method may include a step of water repellent treatment of the substrate surface between the etching step and the photoresist layer removing step. By performing water-repellent treatment at this stage, a water-repellent layer can be formed on the surface of the substrate that is not covered with the biomolecular probe immobilization spot. The water repellent treatment can be appropriately performed according to the type of the water repellent, and for example, can be performed by immersing the substrate in the water repellent.
[0023]
The biomolecule microarray is obtained by immobilizing a biomolecule probe on a biomolecule probe immobilization spot on the biomolecule microarray substrate.
A plurality of biomolecular probe fixing spots are provided on the substrate. The number of biomolecular probe fixing spots is not particularly limited, and is determined appropriately in consideration of the size of the substrate, the size of the spots, the interval between spots, and the like.
The immobilized biomolecule probes can have the same or different base sequences between the biomolecule probe fixation spots.
The immobilized biomolecular probe can be, for example, oligo DNA or cDNA. That is, the biomolecule microarray of the present invention includes a DNA microarray.
[0024]
The biomolecule probe is immobilized on the biomolecule probe immobilization spot by preliminarily immobilizing the biomolecule probe immobilizing substance or functional group having a binding property with the biomolecule probe immobilization compound forming the biomolecule probe immobilization spot. For example, this can be performed by dropping a solution containing the biomolecule probe onto the biomolecule probe immobilization spot on the biomolecule microarray substrate of the present invention.
Examples of the substance having the binding property include avidin, streptavidin, and biotin. Examples of the functional group having the binding property include a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, a thiol group, and a succinimide group. , And maleimide groups.
[0025]
[Data collection method]
The first data collection method of the present invention includes:
(1) interacting a biomolecule microarray with a fluorescently labeled target biomolecule;
(2) irradiating a biomolecule microarray obtained by interacting with a target biomolecule with excitation light, and simultaneously measuring reflected light and fluorescence from the biomolecule microarray;
(3) identifying a biomolecule probe fixing spot having a light reflecting layer spot from the difference in intensity of reflected light on the biomolecule microarray; and
(4) Step of obtaining fluorescence data from the spot range specified above
These four steps are included.
[0026]
The second data collection method of the present invention includes:
(1) interacting a biomolecule microarray with a fluorescently labeled target biomolecule;
(2) irradiating the biomolecule microarray obtained by interacting with the target biomolecule, measuring the reflected light from the biomolecule microarray,
(3) identifying a biomolecule probe fixing spot having a light reflection layer spot from the difference in intensity of reflected light on the biomolecule microarray;
(4) irradiating excitation light only to the identified biomolecular probe fixed spot range and measuring fluorescence; and
(5) Step of obtaining fluorescence data from the spot range specified above
These five steps are included.
[0027]
Interaction step
In this step, a fluorescently labeled target biomolecule is allowed to interact with the biomolecule microarray. The target biomolecule can be, for example, DNA, RNA, cDNA, mRNA or protein. Fluorescent labeling on the target biomolecule can be performed by a known method.
The interaction between the biomolecule probe fixed in a spot shape on the biomolecule microarray and the target biomolecule can be performed by known methods and conditions. For example, the interaction (hybridization) between the DNA probe and the target cDNA can be performed by the following method. After mixing the fluorescently labeled target cDNA with the hybridization solution and heat denaturing the target cDNA by heat treatment, place this solution on the microarray, cover it with a cover glass, and place it in a sealed wet box to prevent the solution from drying. The hybridization reaction is performed at an appropriate temperature according to the target cDNA and DNA probe. After the hybridization reaction, the microarray is washed with a solution with controlled salt concentration and temperature in order to remove unreacted target cDNA.
[0028]
Reflected light measurement step
In this step, the biomolecule microarray in which the fluorescently labeled target biomolecule interacts is irradiated with light, and the reflected light from the biomolecule microarray is measured.
An example of the light that irradiates the biomolecule microarray is a laser beam. Examples of the laser light include a gas laser, a fixed laser, and a semiconductor laser. The wavelength and output of the laser are appropriately selected depending on the fluorescent label used. Examples of the light source other than the laser beam include a xenon lamp, a mercury lamp, a halogen lamp, and a metal halide lamp.
The reflected light from the biomolecule microarray can be measured by using a light receiving element. As the light receiving element, a photomultiplier tube, a photodiode, a CCD element or the like can be used.
Further, by using excitation light suitable for the fluorescent label to be used as the light for measuring the reflected light, the fluorescence can be measured simultaneously with the measurement of the reflected light. In that case, it is necessary to provide a light receiving element that separates reflected light and fluorescence by a dichroic mirror or the like and measures the fluorescence separately from the light receiving element that measures excitation light. As a light receiving element for measuring fluorescence, a photomultiplier tube, a CCD element or the like can be used.
[0029]
Spot range identification step
In this step, the range of the biomolecule probe fixing spot having the light reflection layer spot is specified from the intensity data of the reflected light from the measured biomolecule microarray in the reflected light measurement step.
The biomolecule microarray used in the method of the present invention has a plurality of biomolecule probe fixing spots provided on the light reflecting layer spot on the substrate surface. By specifying the range of the light reflecting layer spot, the range of the biomolecule probe fixing spot can be specified. In particular, when the light reflection layer spot has substantially the same planar shape as the biomolecule probe fixing spot, the range of the biomolecule probe fixing spot can be specified more accurately.
Since the light reflection layer spot has a higher reflectance than the other substrate surfaces, the intensity of the reflected light from the light reflection layer spot is higher than the other substrate surface, and is almost constant from each light reflection layer spot. Can be obtained. Therefore, the light reflection layer spot can be specified by setting the threshold value of the intensity of the reflected light from the biomolecule microarray.
[0030]
Fluorescence measurement step
This step is not necessary if the fluorescence measurement is performed at the same time by the reflected light measurement step, but after the spot range is specified by the reflected light measurement step and the spot range specification step, the fluorescence of only the biomolecule probe fixed spot is detected. This is a step when measuring.
Only the biomolecular probe fixed spot whose spot range is specified is irradiated with excitation light, and the fluorescence generated from the fluorescent label of the spot is measured. For fluorescence measurement from the spot, a light receiving element can be used, and as the light receiving element, a photomultiplier tube, a CCD element or the like can be used.
[0031]
Fluorescence data acquisition step
In this step, fluorescence data from the spot range identified in the spot range identification step is obtained from the fluorescence data obtained in the fluorescence measurement step. In this step, the fluorescence from the fluorescently labeled target biomolecules attached to the substrate surface other than the biomolecular probe fixing spot is excluded, and the fluorescence labeled with the biomolecular probe fixing spot on the light reflecting layer spot is removed. Fluorescence data from only the target biomolecule can be obtained.
[0032]
【Example】
Next, the data collection method of the present invention will be described more specifically based on examples.
Example 1
Digital array scanning method 1
A scanner that reads the fluorescence of a microarray roughly comprises a laser light source, a dichroic mirror, a cut filter, and a photomultiplier tube (FIG. 1). Most of the laser light emitted from the laser light source 10 is reflected by the dichroic mirror (A) 11, passes through the objective lens 12, and irradiates a minute region on the microarray 20, but passes through the dichroic mirror (A) 11. There is also laser light, and the light intensity of the laser light is measured by the light receiving element (A) 13 (photodiode, photomultiplier tube, etc.) and used as a correction value for the reflectance of the laser light. The fluorescence emitted from the microarray 20 on the stage and the reflected laser light are collected by the objective lens 12, and then the laser light transmitted through the dichroic mirror (B) 14 is measured by the light receiving element (B) 15. The fluorescence is reflected by the dichroic mirror (B) 14 and measured by the photomultiplier tube 17 through the cut filter 16.
[0033]
The microscopic reflectance on the array is expressed by the following equation.
Rf = kP_B/ P_A
(Rf: microscopic reflectance on the array, P_A: Laser light output from the laser light source captured by the light receiving element (A), P_B: Output of the reflected light of the laser beam from the array captured by the light receiving element (B), k: coefficient depending on the reflectance of the filter, mirror, etc.)
[0034]
In this way, the reflectance is measured using the laser light for fluorescence measurement, and thus can be easily performed simply by attaching the light receiving element (A) and the light receiving element (B) to an existing scanner. Moreover, since the reflectance measurement is performed simultaneously with the fluorescence measurement, the reflectance can be measured without extending the fluorescence measurement time. Further, the fluorescence data and the reflectance data exist on one pixel coordinate, and the positions of the fluorescence data and the reflectance data do not shift. By using the light receiving element (A) and the light receiving element (B), it is possible to correct errors due to power fluctuations of the laser light source. However, when the power fluctuation of the laser light source is not large and can be ignored, the light receiving element (A) can be omitted.
[0035]
When relative comparison is performed on one microarray using two types of fluorescent dyes (for example, Cy3 and Cy5), two fluorescent data exist in one pixel coordinate. Even in such a case, this digital array scanning is possible. Similarly, even when there are two types of laser light sources, measurement may be performed based on the reflectance of one of the laser light sources. In this case, one pixel data includes one reflectance data and two fluorescence data. The present invention does not limit the size of one pixel, but when the shape of the biomolecular probe fixing spot is a circle having a diameter of 50 to 500 micrometers, the size of one pixel is 5 to 10 micrometers. A meter is preferred.
[0036]
An analysis method using two types of fluorescent dyes (Cy3 and Cy5) will be described with reference to FIG.
When analyzing the scanned image, it is necessary to recognize the biomolecular probe fixed spot. Recognition of the biomolecular probe fixed spot is performed based on the difference in reflectance (uppermost stage in FIG. 2). Unlike the fluorescence intensity data, the reflectance data takes almost constant values in all biomolecule probe fixed spots, so it is possible to recognize only the biomolecule probe fixed spots by setting a constant threshold value. . The fluorescence intensity of each spot can be obtained by calculating the integrated value, average value, or intermediate value of the fluorescence data in the box (FIG. 2, second and third stages). Since the relative position of each biomolecule probe fixing spot is constant, each position can be identified by numbering in order. In this method, there is no need to set the size, shape and number of biomolecular probe fixing spots, and it is possible to automatically recognize the spots.
[0037]
Example 2
Digital array scanning method 2
This method is a method for further increasing the speed of the digital array scanning method 1 described above. In this method, the fluorescence of the entire region on the array is scanned and measured, and the fluorescence image is not acquired, but the fluorescence of only the biomolecule probe fixed spot on the array is measured as one point. Further description will be given based on FIGS.
[0038]
In order to specify the position of the biomolecule probe fixing spot, the biomolecule microarray is continuously moved in the area A and the area B of the biomolecule microarray, and each area is irradiated with light to measure the reflectance ( FIG. 3). The area A and the area B are used to determine the inclination and position of the array, and are preferably located on a diagonal line, but are not limited thereto. Further, the width of each region is not limited. Since the reflectivity takes almost a constant value in all the biomolecule probe fixed spots in the regions A and B, it is possible to recognize only the biomolecule probe fixed spot by setting a constant threshold value (the uppermost stage in FIG. 4). The respective centers are obtained from the recognized areas of the biomolecular probe fixed spots, and the positions of the entire spots are calculated. At that time, data necessary for calculating the arrangement of the spots, such as the size of the biomolecular probe fixing spot, the number of rows, the number of columns, the number of blocks, is input.
[0039]
The biomolecule microarray is quickly moved to the spot point based on the spot arrangement obtained by the preliminary measurement, and each spot is measured with one laser spot diameter smaller than or equal to the biomolecule probe fixed spot (FIG. 4). , 2nd stage, 3rd stage). At that time, the stage may be moved in order to move the biomolecule microarray, or the laser beam may be optically moved. The fluorescence emitted from the biomolecule probe fixing spot by the laser light irradiation is measured and used as the fluorescence intensity of the biomolecule probe fixing spot. The next spot is measured by quickly moving the array to the next spot. In this method, since the fluorescence intensity of the biomolecular probe fixed spot is digitally measured as one point, it is not necessary to recognize the spot and convert it into data at the analysis stage, and it is digitized simultaneously with the measurement. . In addition, since it is not necessary to measure the fluorescence of the entire region of the substrate surface, it is possible to realize further speeding up of measurement and analysis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a scanner that reads fluorescence of a microarray.
FIG. 2 is an explanatory view of a method for analyzing a scanned image (digital array scanning method 1).
FIG. 3 is an explanatory diagram of a method for analyzing a scanned image (digital array scanning method 2).
FIG. 4 is an explanatory diagram of a method for analyzing a scanned image (digital array scanning method 2).

Claims

Fluorescently-labeled target biomolecules interact with a biomolecule microarray having a plurality of biomolecule probe fixed spots on the surface of the substrate, on which the biomolecule probe is immobilized on the light reflecting layer spot, and the resulting biomolecule microarray is excited. Light was irradiated, and the reflected light and fluorescence from the biomolecule microarray were measured simultaneously, and the biomolecule probe fixed spot having the light reflecting layer spot was identified and identified from the difference in the intensity of the reflected light on the biomolecule microarray. A method for collecting data of a biomolecule microarray, comprising obtaining fluorescence data from a spot range.

Fluorescently-labeled target biomolecules interact with a biomolecule microarray having a plurality of biomolecule probe-fixed spots on the surface of the substrate where biomolecule probes are immobilized on the light reflecting layer spot. , Measure the reflected light from the biomolecule microarray, identify the biomolecule probe fixing spot with the light reflecting layer spot from the difference in intensity of the reflected light on the biomolecule microarray, and fix the identified biomolecule probe A method for collecting data of a biomolecule microarray, comprising irradiating excitation light only to a spot range to measure fluorescence and obtaining fluorescence data from the specified spot range.

The method according to claim 1, wherein the specified spot range is detected from a difference in reflectance between a light reflecting layer spot on the biomolecule microarray and a surface of the other biomolecule microarray.

The method according to claim 1, wherein the light reflection layer spot has substantially the same planar shape as the biomolecule probe fixing spot.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the light or excitation light applied to the biomolecular probe fixed spot is laser light.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the target biomolecule is DNA, RNA, cDNA, mRNA or protein.

The method according to claim 1, wherein fluorescence data from only the specified spot range is obtained as an integrated value, an average value, or an intermediate value in the spot range of fluorescence intensity.

The method according to claim 7, wherein fluorescence data from only the specified spot range is obtained for each fluorescence wavelength as an integrated value, average value, or intermediate value in the spot range of fluorescence intensity.

The method according to claim 1, wherein the fluorescence data is collected sequentially for each spot on the biomolecule microarray.

The spot range is specified for a plurality of spots on the biomolecule microarray, then the fluorescence emitted from each spot with the specified spot range is sequentially measured, and only the spot range is determined using the data of the specified spot range. The method of any one of claims 1 to 9, wherein fluorescence data from is collected continuously.

The biomolecule probe fixing spot of a part of the region on the biomolecule microarray is specified, and the position of the whole biomolecule probe fixing spot is calculated from the specified part of the spot position to identify the spot range. Item 11. The method according to Item 10.

The method according to claim 10, wherein the spot range is specified in advance for all spots on the biomolecule microarray.