JP3878293B2 - Sucrose fatty acid esterase - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ショ糖脂肪酸エステラーゼに関し、更に詳細には、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与する酵素タンパク質、これらをコードするDNAに関する。
【0002】
【従来の技術】
蔗糖脂肪酸エステルは、界面活性剤の一種であり、人体・生態系に対する高い安全性が確認されているため、今日まで、商業ベースで工業的に大量生産され、食用品の乳化・分散剤などの用途を含め、幅広く使用されている。
【0003】
この蔗糖脂肪酸エステルの従来の製造法は、化学法が主流であるが、一方で、酵素法による合成方法を待望する声が根強いのも事実である。
【0004】
この背景として、酵素法によると、化学法に比べて、以下のような利点が期待できることが挙げられる。すなわち;
▲1▼ 酵素反応は常温、常圧、中性pHの条件下で反応が進行するため、耐酸、耐アルカリ、耐圧設計の設備が不要となり、また、反応温度が化学法より低いため、温度調節に要する設備負担が軽減され、その管理も容易になる。
【0005】
▲2▼ 酵素はタンパク質であるため、無毒かつ生分解性であり、環境や生態系に対する影響が小さいSEの製造法の実現が図れる。
【0006】
▲3▼ 酵素反応は反応特異性が高く、常温、中性pHにて反応が進行するため、副反応が起こりにくく、よって、純度の高い生成物が得られやすい。 さらに、反応中に原料の変質が起こりにくく、また、未反応原料が次回の反応に供することができるので、原料の有効利用も可能となる。
【0007】
▲4▼ 酵素反応によれば、位置特異的反応が可能であり、これを利用することで、蔗糖の特定位置の水酸基のみをエステル化して、目的とする改変体(生成物)が高い純度で得ることができる。
【0008】
近年、エステル合成に適した固定化リパーゼ剤(リポザイム、ノボザイム等)の入手が容易になったこともあって、酵素法によるエステル合成への関心が高まり、とりわけ糖類はエステル化可能な水酸基を多数有することから、その位置的選択(部位特異的)エステル化は、多くの科学者が研究テーマとしている。
【0009】
例えば、Klibanov等[Klibanov et al., "Protease-catalyzed Regioselective esterification of sugars and related compunds in anhydrous dimethylformamide", J. Am. Chem. Soc., 110, pp. 584-589 (1988)]は、原料に高反応性の脂肪酸トリクロロエチルエステルを用い、プロテアーゼを触媒とすることで、蔗糖の1'位を選択的にエステル化している[Patil et al., "Enzymatic synthesis of a sucrose-containing linear polyester in nearly anhydrous organic media", Biotechnol. Bioeng., 37, pp. 639-646 (1991); Chan et al., "A regioselective, chemoenzymatic synthesis of sucrose-1'-methacrylate", Biocatalysis, 8, pp.163-169 (1993);及びSoedjak et al., "Enzymatic transesterification of sugars in anhydrous pyridine, Biocatalysis, 11, pp.241-248 (1994)の文献も参照されたい]。
【0010】
また、Fregapane等[Fregapane et al., "Enzymatic solvent-free synthesis of sugar fatty acid ester", Enzyme Microb. Technol., 13, pp. 796-800 (1991)]は、アセトンを付加した糖(イソプロピリデン誘導体)を原料に用いることで、糖の脂肪酸メチルへの溶解性を向上させ、さらに、市販の固定化リパーゼ剤を触媒として用いることで、主に単糖類をエステル化している[Fregapane et al., "Facile chemo-enzymatic synthesis of monosaccharide fatty acid esters", Biocatalysis, 11, pp.9-18 (1994); 及びSarney et al., "Chemo-enzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters", J. Am. Oil Chem. Soc., 71, pp.711-714 (1994)の文献も参照されたい]。
【0011】
また、Klibanov等[Klibanov et al., "Lipase-catalyzed acylation of sugars solubilized in hydrophobic solvents by complexation", Biotechnol. Bioeng., 42, pp. 788-791 (1993)]は、糖のフェニルホウ酸エステルを原料に用いることで、糖類の溶剤への溶解性を向上せしめ、さらに、リポプロテインリパーゼを触媒とすることで、蔗糖アクリレートを合成している[Schlotterbeck et al., "Lipase-catalyzed monoacylation of fructose", Biotechnol. Letters, 15, pp.61-64 (1993)及びOguntimein et al., "Lipase catalyzed synthesis of sugar ester in organic solvents", Biotechnol. Letters, 15, pp.175-180 (1993)等の文献も参照されたい]。
【0012】
さらに、特殊な誘導体を用いずに、単糖類と脂肪酸を直接反応させた例として、市販の固定化酵素剤(リポザイム、ノボザイム等)を触媒として、果糖またはグルコースをエステル化した報告もされている。[Khaled et al., "Fructose oleate synthesis in a fixed catalyst bed reactor", Biotechnol. Letters, 13, pp.167-172 (1991); Coulon et al., "Comparison of direct esterification of fructose by Candida antartica lipase", Biotechnol. Letters, 17, pp.183-186 (1995);及びLjunger et al., "Lipase catalyzed acylation of glucose", Biotechnol. Letters, 11, pp.1167-1172 (1994)等の文献も参照されたい]。
【0013】
このように、糖と脂肪酸を原料として単糖エステルを酵素法で合成することは可能であったのに対して、蔗糖エステルは、特殊な誘導体を原料とすることで初めて酵素法によって合成できていたのが実情であった。このような特殊な誘導体の利用は、蔗糖エステルを工業生産する上には不利であり、従って、このことが酵素法による工業生産が未だ達成されていない理由の一つでもあった。
【0014】
また、合成用に使用されている酵素はいずれも市販のリパーゼ剤またはプロテアーゼ剤であり、これらの蔗糖脂肪酸エステルに対する活性は満足のゆくものではなかった。実際、市販のリパーゼ剤13種の内、蔗糖脂肪酸エステルに対して分解活性が認められたのは、リパーゼMY(名糖産業)とリパーゼOF(名糖産業)の2種類のみであり、これらの分解活性にしても実用レベルにはほど遠いものであった。
【0015】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質はこれまでに知られていない。本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであり、以下のショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片、それをコードするDNA、そのDNAを含有するベクター、ならびにかかるベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。さらに本発明のタンパク質により、入手容易な基質を用い、安全性の高い生物学的方法を利用して高純度のショ糖脂肪酸エステルを工業的レベルで製造するに好ましい方法が提供される。
【0016】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかるショ糖脂肪酸エステルの合成における、前記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果成し遂げられたものであって、下記の(1)〜(13)を特徴とする。
【0017】
(1)ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片。
【0018】
(2)配列番号:2に示されるアミノ酸配列、またはこの配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【0019】
(3)ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、イデオネラ エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質またはその活性断片の製造方法。
【0020】
(4)前記(3)の製造方法によって製造された、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質またはその活性断片。
【0021】
(5)前記(2)のタンパク質をコードするDNA。
【0022】
(6)配列番号:1で示される塩基配列からなるDNA、またはこの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【0023】
(7)前記(6)のDNAによってコードされる、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。
【0024】
(8)前記(6)のDNAを含有する組換えベクター。
【0025】
(9)前記(8)の組換えベクターが宿主細胞に含まれた形質転換体。
【0026】
(10)前記(9)の形質転換体によって生産され、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【0027】
(11)ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、前記(9)の形質転換体を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質またはその活性断片の製造方法。
【0028】
(12)ショ糖と脂肪酸に、前記(1)、(2)、(4)、(7)または(10)のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片を作用させる工程を含むショ糖脂肪酸エステルの製造方法。
【0029】
(13)化学的方法によって合成された複数のショ糖脂肪酸モノエステル置換位置異性体混合物に前記(1)、(2)、(4)、(7)または(10)のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片を作用させて、置換位置が限定されたショ糖脂肪酸モノエステルを製造する方法。
【0030】
【発明の実施の形態】
本発明の、ショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質もしくはその活性を有する変異体またはこれらの活性断片(以下、「ショ糖脂肪酸エステラーゼ」と称する)は、好ましくは、イデオネラ エス・ピー No.13(受託番号:FERM P-16206、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成9年4月24日受託)菌株由来であるが、この菌に限定されることはない。さらに当該ショ糖脂肪酸エステラーゼは、好ましくは、イデオネラ エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む製造方法によって製造される。また、この製造方法において、必要に応じて陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程が含まれてもよい。
【0031】
本発明はまた、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、イデオネラ エス・ピー No.13を培養してその培養液上清を得る工程を含む、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法を提供する。この製造方法において、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製工程により分取されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を得る工程を含むこともできる。
【0032】
ここで、イデオネラ エス・ピーは、L培地、L/10培地、その他肉汁培地、公知の種々の複合培地などにおいて培養されるとよい。炭素源として、ショ糖脂肪酸エステル、酢酸、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸、D-フルクトース、D-グルコース、グリセロール、マルトースなどを追加することができる。特にショ糖脂肪酸エステラーゼの生産及び分泌量に鑑みれば、培地としてショ糖脂肪酸エステル及び/またはグルコースを添加したL培地またはL/10培地が好ましい。この培地を用いて、好ましくは好気的に菌体の培養を行う。培養時間、温度、pHなどは培地及び菌大量に応じて適宜に選択することができるが、前記の好ましい培地を用いて培養する場合、好ましくは30〜37℃、特に好ましくはおよそ37℃にて、中性pH近傍で培地のOD660が2〜4程度になるまで行うとよい。
【0033】
培養終了後、遠心または濾過操作などによって、ショ糖脂肪酸エステラーゼを含む培養上清を得る。その後必要に応じて、例えば、硫安分画、限外濾過などにより酵素を粗抽出し、得られた粗酵素溶液は、適宜、カラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。精製は、好ましくは陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムを組み合わせて行うとよいが、これら以外にも、例えば、陽イオン交換カラム、親和性カラム、逆相カラムなど、酵素タンパク質の失活や変性が生じない限りにおいて酵素活性を指標に適宜精製操作を行うことで、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することができる。
【0034】
また、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼは、好ましくは、配列番号:2で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質である。さらには、配列番号:3で示される塩基配列からなるDNA、またはこの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAによってコードされるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質も好ましい。
【0035】
本発明はまた、配列番号:2で示されるアミノ酸配列、またはこの配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを提供する。そして、配列番号:3で示される塩基配列からなるDNA、またはこの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つショ糖と脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも、本発明により意図されるところである。
【0036】
さらに本発明は、上記のDNAのいずれかを含有する組換えベクターを提供する。この組換えベクターにおいてDNAが挿入されるベクターとしては、一般に使用される種々のものが使用可能であり、例えば、pBR322、PUC19、pUB110、pETシリーズ、RSF1010などのプラスミド、λgtなどのファージ等が挙げられ、このベクターによって形質転換される細胞への感染性に応じて適宜選択される。
【0037】
また本発明によって、上記の組換えベクターが宿主細胞に含まれた形質転換体も提供される。この宿主細胞は、前記ベクターによって形質転換され、目的のショ糖脂肪酸エステラーゼを生成、分泌することができれば大腸菌、酵母、枯草菌、その他動物細胞など種々可能であるが、好ましくは大腸菌が用いられる。
【0038】
前記形質転換は、当業者によく知られている、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法などによって前記宿主細胞にベクターを導入することにより成し遂げられる。
【0039】
このような形質転換体によって生産されるショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有する組換えタンパク質が、本発明によって提供される。ここで、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼは、その配列をコードする DNAを化学的に合成してベクター内の適当なプロモーターの下流に挿入し、前記宿主細胞に導入して、この形質転換体を培養することによって産生させることもできる。また、適当な菌のcDNAライブラリーから 当該タンパク質をコードするDNAを分離し、これに部位特異的変異導入法によって、所望の変異を導入して改変タンパク質をコードするDNAを作製し、これを発現させることも可能である。例えば、プロテアーゼの組換え体において実施されているような、酵素タンパク質自体の分解を抑制する改変による安定な酵素の作成法などを適用して、本発明のDNAの塩基配列を改変することで、さらにショ糖脂肪酸エステル合成に有利な酵素を作り出すことが可能になる。このような組換え体を適切な宿主細胞にて発現させることにより、酵素の大量生産が可能になると予測される。
【0040】
そして、本発明によって、ショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法であって、前記の形質転換体を培養してその培養液上清を得る工程を含む製造方法が提供される。次いで、必要に応じて、得られた培養液上清からショ糖脂肪酸エステラーゼ活性画分を単離する。この単離のための方法は特に限定されることなく、上記したイデオネラ エス・ピー培養上清からのタンパク質精製に準じて、硫安分画、限外濾過などで濃縮及び粗精製した後適宜カラムクロマトグラフィー操作にて精製すればよい。ここで、形質転換体を構成する宿主細胞として大腸菌を用いた場合、その培養上清には前記イデオネラ エス・ピーの培養上清よりも目的のタンパク質が多量に含まれ、不純物の量も少ないので、一層容易に、そして大量に所望のタンパク質を得ることが可能となる。
【0041】
また、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼを適当な他のタンパク質に接続し、安定な融合タンパク質の形で宿主細胞に産生させることも有効である。発現した融合タンパク質は、その接続したタンパク質部分の抗原性等の特性を利用して精製等が行える可能性があるなどの点で有利であり、また、例えば、かように精製した後に、得られた融合タンパク質を適当なタンパク質分解酵素やペプチドの配列に応じた化学的な切断法を用いて部位特異的に切断することにより、目的のタンパク質を分離することもできる。
【0042】
さらに本発明は、これまでに記載したショ糖脂肪酸エステラーゼを、ショ糖と脂肪酸に作用させる工程を含むショ糖脂肪酸エステルの製造方法を提供する。
【0043】
原料の脂肪酸は、炭素数、不飽和度等、特に限定されることなく、種々のものが利用可能である。下記の実施例に示すように本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼを用いて、ショ糖を炭素数8〜14の飽和飽和脂肪酸でエステル化すると、2種のエステル置換位置異性体であるショ糖脂肪酸モノエステルが産生されることが確認されている。
【0044】
前記エステル化において炭素数が大きく水に難溶性の脂肪酸を用いる場合、反応液に脂肪酸の水溶性を高めるための物質を適宜添加することが好ましいであろう。そのような物質として、例えば、ジメチルスルホキシドが挙げられるが、酵素活性への影響に鑑み、添加量は上限を約25容量%とすべきである。反応液のpHは、好ましくは6〜9に調整され、特に好ましくは約7〜8に調整される。さらに反応液には、酵素の安定性を維持するためにショ糖脂肪酸エステラーゼの分解を阻止しうるプロテアーゼ阻害剤や、安定化剤等の添加物を、エステラーゼ活性に影響を与えない範囲で加えてもよい。酵素反応液は、例えば、50 mM程度のリン酸緩衝液(pH 6〜8)に脂肪酸、ショ糖、酵素液及びジメチルスルホキシドを適量含むものである。
【0045】
反応液は、好ましくは30〜80℃、特に好ましくは約40〜55℃にて適当な時間インキュベートされる。次いで、反応液は、得られるショ糖脂肪酸エステルの親媒性に応じて選択した溶媒によって抽出される。例えば、炭素数8〜14の脂肪酸のエステルを得た場合、メタノール/クロロホルム等量混合溶媒、イソブタノール等を用いて溶媒抽出するとよい。
【0046】
本発明の一実施態様において、前記製造方法によって得られる生成物がショ糖脂肪酸モノエステルであって、ジエステル以上のポリエステルが含まれないことを特徴とするショ糖脂肪酸エステルの製造方法が提供される。このように、従来の化学的合成方法では困難であったエステル置換数を限定したショ糖脂肪酸エステルの合成が、本発明によって可能になる。
【0047】
さらに、前記方法においてショ糖のエステル化部位が限定され、特定の置換位置のみにエステルを含むショ糖脂肪酸モノエステルの製造が、本発明によって可能になる。
【0048】
また、このショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解反応は部位特異性を有するので、これを利用して、化学的に合成したショ糖脂肪酸エステルに含まれる複数種のモノエステル異性体のうちの特定の置換位置異性体のみを選択的に分解し、本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼに対して耐性を有するショ糖脂肪酸エステルのみを未分解のまま残して、特定のエステル化部位を有する高純度のモノエステル置換位置異性体を製造することができる。このような高純度ショ糖脂肪酸エステルは、従来知られているショ糖脂肪酸エステルの用途のみならず、さらに広範な用途において有用であることが期待される。
【0049】
以下、本発明を実施例を挙げてさらに説明するが、これら実施例によって本発明が限定的に解釈されるべきものではない。
【0050】
【実施例】
1.イデオネラ エス・ピー No.13 (受託番号: FERM P-16206 )菌株からのショ糖脂肪酸エステラーゼの精製
まず、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することを目的として、廃水処理場の活性汚泥、土壌などから分離した様々な菌株を分離した。培地には、L+SE培地(ペプトン10 g/l、酵母エキス5 g/l、NaCl 5 g/l及びショ糖脂肪酸エステル(DKエステルSS、第一工業製薬社製)10 g/lを含有、pH 7)またはL/10+SE培地(ペプトン1 g/l、酵母エキス0.5 g/l、NaCl 0.5 g/l、ショ糖脂肪酸エステル10 g/lを含有、pH 7)を使用し、固体培地には、上記いずれかの培地にさらに15 g/lの寒天を添加した。分離された84の菌株のうち、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を高発現し、培養液中にこの酵素を多量に分泌している菌株を単離し、イデオネラ エス・ピー (Ideonella sp.)No.13と命名した。このイデオネラ エス・ピー No.13菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、平成9年4月24日付にて受託番号:FERM P-16206として受託された。
【0051】
ここでショ糖脂肪酸エステラーゼ活性の指標としては、ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法によるショ糖脂肪酸エステル分解能の判定結果を採用した。これらの方法は、具体的には以下のとおりである。
【0052】
(a)ショ糖脂肪酸エステル寒天法
0.2重量/容量%のショ糖脂肪酸エステル及びpH 7の50 mMリン酸緩衝液を含む1.5重量/容量%の寒天溶液を厚さ5〜7 mmになるようにペトリディッシュに固化し、寒天に直径4 mmの孔を空けて、試料液20μlを注入した。37℃で一晩静置して酵素反応を許容し、孔の周囲に形成された白濁円(ハロー)の直径を測定した。
【0053】
(b)滴定法
5重量/容量%ショ糖脂肪酸エステル水溶液5 ml、McIlvaine緩衝液(0.2 Mリン酸水素2ナトリウムと0.1 Mクエン酸を混合してpH 8に調整)4 ml及び酵素試料液1 mlを含む酵素反応液を、37℃または60℃にて30分間インキュベートした。反応終了後、アセトン/エタノール=50/50(容量%)の混液10 ml及び10 mlの0.05 N NaOHを加えて反応を停止し、さらにアセトン/エタノール=50/50(容量%)の混液を10 ml加えた。酵素反応によって生じた遊離脂肪酸を、フェノールフタレインを指示薬として0.05 N塩酸で逆滴定した。この条件下において、1分間当たり1μmolの脂肪酸を遊離する酵素量を1単位として規定した。
【0054】
なお、上記のショ糖脂肪酸エステル寒天法(a)によって測定したハローの直径(mm)と、滴定法(b)で測定した酵素活性(単位、対数)との間に、直線的な相関関係があることが示された。
【0055】
このような方法を用いて選択したイデオネラ エス・ピー No.13菌株によるショ糖脂肪酸エステラーゼの生成及び分泌に好ましい培地を検討するために、種々の培地及び炭素源を用いてこの菌を培養した。すなわち、L培地(ペプトン10 g/l、酵母エキス5 g/l及びNaCl 5 g/lを含有、pH 7)、L/10培地(ペプトン1 g/l、酵母エキス0.5 g/l、NaCl 0.5 g/lを含有、pH 7)ならびに最少培地((NH4)2SO4 5g/l、K2HPO4 0.5 g/l及びMgSO4・7H2O 0.25 g/lを含有、pH 7)の3種の培地を基本培地とし、炭素源としてはショ糖脂肪酸エステル及び/またはグルコース(0.5または1重量/容量%)を添加したものを用いた。これらの培地で37℃にて2日間振盪培養した後、上記ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法によって培養上清のショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を測定し、また菌体の増殖を培養液のOD600より推定した。
【0056】
この結果、イデオネラ エス・ピー No.13菌株は、炭素源を添加したL/10培地、L培地及び炭素源を添加したL培地で良好に増殖し、且つショ糖脂肪酸エステラーゼを多量に生成分泌していることが明らかになった。ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を最も高発現していると考えられた、グルコース1重量/容量%を含有するL培地(以下、「L+Glu 1%培地」と称する)を用いてイデオネラ エス・ピー No.13菌株を培養することにした。
【0057】
ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質を多量に得るために、イデオネラ エス・ピー No.13菌株を大容量にて培養した。先ず、グルコース1重量/容量%を含むL/10培地5 mlにおいて試験管内でイデオネラ エス・ピー No.13菌株を37℃にて一晩、前々培養した。次いで、この培養液を加えた1 LのL+Glu 1%培地を、2 L容量の坂口フラスコを用いて37℃にて一晩振盪培養して、前培養液を調製した。この前培養液を50 LのL+Glu 1%培地に加え、100 L容量のジャーファーメンター(マルビシ・バイオ・エンジン社製、タイプMPF)内で、37℃にて通気量50 L/分(1 vvm)として48時間培養した。
【0058】
こうして得られた培養液は、シャープレス連続遠心機で菌体成分を取り除き、上清を4℃にて限外濾過濃縮機(旭化成社製、マイクローザUF SPL-1053)で1/10容量にまで濃縮した。次いで、濃縮液に60重量/容量%飽和となるように硫安を添加し、一夜静置した後、生じた沈殿を遠心分離によって採取した。この沈殿をpH 7.5の20 mMトリス塩酸緩衝液に溶解して、同緩衝液中にて透析することにより脱塩を行った。脱塩後の酵素溶液を凍結乾燥して、粉末状の粗酵素を得た。得られた粗酵素は、滴定法によってショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を測定すると、約3000単位/gであることがわかった。この粗酵素を用い、以下の工程に従ってショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質を精製した。精製工程において、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性は、上記ショ糖脂肪酸エステル寒天法または滴定法をによる測定結果をその指標とした。
【0059】
▲1▼第一陰イオン交換カラム:カラムに充填したDEAEセルロース(DE52、ワットマン社製)φ5.7×14 cmを20 mMトリス塩酸緩衝液(pH 8)で平衡化し、タンパク質試料液(2 gタンパク質)を付した。同様の緩衝液中、0〜0.5 MのNaCl濃度の直線濃度勾配にてタンパク質を溶出して、ショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を呈する画分を集めた。
【0060】
▲2▼第二陰イオン交換カラム:▲1▼と同様の緩衝液の系にて、Hitrap Q(ファルマシア社製、1 ml)に▲1▼の活性画分を付し、さらにショ糖脂肪酸エステラーゼを精製した。カラムは、FPLCシステム(ファルマシア社製)に装備し、流速1 ml/分で50分間にわたって直線濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出させた。酵素活性は、NaCl濃度約0.25 M付近に溶出した。
【0061】
▲3▼第三陰イオン交換カラム:▲1▼と同様の緩衝液を用いて、高性能陰イオン交換カラムMono Q(ファルマシア社製、1 ml)において▲2▼で得られた活性画分をさらに精製した。カラムは、FPLCシステム(ファルマシア社製)に装備し、流速 1 ml/分で30分間にわたって直線濃度勾配をかけることでタンパク質を溶出させた。所望のエステラーゼ活性は、NaCl濃度約0.2 M付近に溶出した。この溶出のプロファイルを図1に示す。図中に矢印を付したのが、エステラーゼ活性のピークである。
【0062】
▲4▼ゲル濾過カラム:150 mMのNaClを含む50 mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を用いて、▲3▼で得られた活性画分をゲル濾過カラムSupedex 200 HR10/30(ファルマシア社製、φ1×30 cm)に付し、流量0.2 ml/分で溶出させ、活性画分を集めた。このカラムからの溶出プロファイルを図2に示す。
【0063】
これらの工程によって、SDS電気泳動上ほぼ単一バンドに近い状態にまで、ショ糖脂肪酸エステラーゼを精製することができた。この電気泳動上の主バンドに相当するタンパク質の見かけ上の分子量は、約48,000ダルトンであった。SDS電気泳動後のゲルからこのタンパク質のバンドに相当する部分を切り出して、N末端アミノ酸配列の分析を試みたが、配列を決定することはできなかった。これはタンパク質のN末端がブロックされているためではないかと思われた。
【0064】
2.ショ糖脂肪酸エステラーゼの同定
イデオネラ エス・ピー No.13が有するショ糖脂肪酸エステラーゼを酵素学的に同定するため、以下の各特性を調べる実験を行った。
【0065】
▲1▼温度依存性:1.に記載のショ糖脂肪酸エステラーゼ粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステル分解反応の温度依存性を調べた。酵素活性の測定は、前記滴定法により、2単位の粗酵素を用いて行った。結果を図3に示すが、60℃で最も活性が高く、70〜80℃でも活性を有することが明らかである。
【0066】
▲2▼pH依存性:1.に記載の粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステル分解反応のpH依存性を調べた。酵素活性の測定は、緩衝液をpH 4〜8では前記McIlvaine緩衝液を用い、pH 9〜10ではClark-Lubs緩衝液((i)0.1 Mホウ酸+0.1 M KCl、(ii)0.1 M NaOH、(i)+(ii)で所定のpHに調整)を用いたことを除いては前記滴定法に従って、2単位の粗酵素を用いて行った。結果を図4に示すが、本酵素活性の至適pHは8であり、また6〜8の範囲のpHにおいて高い活性を有することが明らかである。
【0067】
▲3▼基質特異性:一般にエステラーゼまたはリパーゼの基質となりうる代表的なエステル化合物の分解活性を、1.に記載の粗酵素を用いて調べた。反応条件は、本質的に1.に記載した滴定法と同様であり、pH 8のMcIlvaine緩衝液、4.75 mlの水、0.25 gの各基質及び粗酵素2単位(1 ml)の反応液を60℃、30分間反応させたものについて各分解産物を定量した。得られた結果を表1に示す。
【0068】
【表1】
【0069】
この結果、本酵素はショ糖脂肪酸モノエステル以外に糖類のエステル誘導体であるTween 80(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル)を分解した。糖エステルであっても、水に溶解しないショ糖脂肪酸ポリエステルにはほとんど作用しなかった。また、エステラーゼの基質である酢酸エチルはこの反応条件下では水溶性であるが、本酵素はほとんど作用しなかった。尚、データは示していないが、エステラーゼ及びリパーゼの活性測定用基質として広く使用されているパラニトロフェニルアセテートにも、本酵素はほとんど活性を示さなかった。さらに、表1に示すように、水溶性のトリアセチンならびに非水溶性のトリブチン及びオリーブ油などのトリグリセリドに対してほとんど活性を示さなかったことから、本酵素はいわゆるリパーゼと称される酵素には属さないと考えられる。このように、得られた酵素は水溶性の糖類エステルに特異的に作用するものであることがわかった。
【0070】
▲4▼ショ糖脂肪酸エステルの分解反応
1.に記載の粗酵素を用いて、ショ糖脂肪酸エステルの分解反応を確認した。ショ糖脂肪酸エステルとしては、主成分としてショ糖モノステアレートを含有するDKエステルSS(第一工業製薬社製)を用いた。5重量/容量%のDKエステルSS水溶液50μl、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7)、粗酵素液10μl(0.6単位)、0〜100μlのジメチルスルホキシド(最終濃度0、5、10、25及び50容量%)及び適宜の量の水からなる総容量200μlの反応液をエッペンドルフチューブに入れ、53℃にて一夜反応させた後、エタノール800μlを加えて反応を停止した。対照群として、粗酵素液を含有しない反応液で同様の操作を行った。10,000 rpmにて5分間遠心した後、得られた上清10μlを、薄層クロマトグラフィー分析に供した。薄層クロマトグラフィーには、シリカゲルプレート60(メルク社製)を使用し、展開溶剤としてクロロホルム/メタノール/酢酸/水=80/10/8/2の混合溶剤を用い、発色は20容量%の硫酸を噴霧した後オーブンで加熱して行った。この結果を図5に示す。図5において反応基質であるショ糖モノステアレートは主として、おそらくエステル化部位が相違する3種の置換位置変異体を表す、3つのスポットとして示される。それぞれのRf値は、およそ0.21、0.18及び0.14であった。本酵素を添加して反応を行うと、ジメチルスルホキシド濃度25容量%以下では(図5、レーンf〜i)、これら3つのスポットのうちRf値が低い2つのスポット(Rf値:0.18及び0.14)が選択的に消失しており、従って、本酵素によってエステル化部位特異的にショ糖モノステアレートが分解され、エステルの置換位置が限定されたショ糖脂肪酸モノエステルが得られることが明らかになった。
【0071】
反応液中にジメチルスルホキシドが50容量%存在すると、分解反応は進行しなかった(同、レーンj)。酵素を添加しない場合は、いずれのジメチルスルホキシド濃度においても分解反応は認められていない(同、レーンa〜e)。
【0072】
▲5▼ショ糖脂肪酸エステルの合成反応
1.に記載の粗酵素を用いて、様々なショ糖脂肪酸エステルの合成反応を行った。オクタン酸(C8)、ラウリン酸(C12)またはミリスチン酸(C14)のうちいずれかの脂肪酸10 mg、50重量/容量%ショ糖を含む50 mMリン酸緩衝液(pH 7)100μl、粗酵素液20μl(3単位)及びジメチルスルホキシド20μl(13.3容量%)を含む反応液をエッペンドルフチューブに入れ、45℃にて20時間反応させた。次いで、反応液に400μlのメタノール、400μlのクロロホルム及び100μlの水を加えて溶媒抽出し、下層のクロロホルム層40μlを▲4▼にて前記したと同様の薄層クロマトグラフィー分析に供した。ここで展開溶剤は、クロロホルム/メタノール/酢酸/水=70/20/8/2の混合溶剤を用いた。対照群として、粗酵素液を含有しない反応液で同様の操作を行った。この結果を図6に示す(図中、微弱なスポットが存在していた箇所に、手書きにてマークしてその存在を示した)。図6において、酵素存在下に反応を行うと、各炭素数の脂肪酸について鎖長に応じたRf値(C8:0.19及び0.15、C12:0.22及び0.18ならびにC14:0.25及び0.20)を有する、矢印で示される各々2種の反応産物が生成されている(図6、レーンb、d及びf)。ここで、脂肪酸の炭素数が大きくなるほど生成物のRf値は大きくなっており、また、上記▲4▼の分解反応において本酵素が2つのショ糖脂肪酸エステル異性体を分解したことに対応するように反応産物が2種であることに基づくと、これらのエステラーゼ反応によってショ糖脂肪酸モノエステルの置換位置異性体2種が生成されたと考えられる。
【0073】
さらに同様の条件下での反応におけるエステルの生成を確認するために、ショ糖とラウリン酸を反応させて合成される産物について検討した。反応条件は、上記と同様であり、反応終了後の抽出物を、ショ糖モノラウレートを含む標準試料(DKエステルS-L18A、第一工業製薬社製)と比較すべく薄層クロマトグラフィー分析した。展開溶剤は、クロロホルム/メタノール/酢酸/水=70/20/8/2の混合溶剤を用いた。この結果を図7に示す。図7に明示されるように、本酵素を用いたショ糖とラウリン酸との反応によって、標品のショ糖モノラウレートと同様のRf値(0.40及び0.33)を有する産物が得られた。次いで、この反応産物を高速液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)に供した。LC-MS装置として、高速液体クロマトグラフィー部分には、カラムCosmosil 5C18-AR(φ4.6 mm×150 mm、ナカライテスク社製)を装備したLC10AT(島津社製)を用いた。使用溶離液は、10 mMの酢酸アンモニウム水溶液(溶離液A)と10 mM酢酸アンモニウムのメタノール溶液(溶離液B)を用い、流速0.7 ml/分にて溶離液A100%から溶離液B100%までの直線濃度勾配とした。質量分析部分には、Finigan Mat LCQ装置(Finigan社製)を用いて、イオン化はESI法により、また検出は負イオンにて行った。得られた液体クロマトグラフィーの結果を図8に示す。主たるピークa及びbの保持時間は、市販のショ糖モノラウレートの標品の保持時間と一致していた。そして、双方のピークのマススペクトルにより、ショ糖モノラウレートの分子量524.6に対して、-H(523.6)、+CH3CO0(583.6)及び+CF3COO(637.6)の質量数にピークが確認された。また、市販の標品のマススペクトルにおいても同様の質量数のピークが確認された。従って、本発明の酵素存在下にショ糖とラウリン酸とを反応させると、ショ糖モノラウレートの2種類のエステル置換位置異性体が得られることが明らかになった。
【0074】
3.ショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子のクローニング
イデオネラ エス・ピー No.13菌株由来のショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子のクローニングをショットガン法を用いて以下の通りに行った。すなわち、sarkosyl法[Morikawaら、J.Ferment.Bioeng.、74巻、255〜261頁(1992)]で調製したイデオネラ エス・ピー No.13菌株の染色体DNAを、制限酵素EcoRIで切断し、pBR322ベクターのEcoRI部位に連結した。Wizard Kit(プロメガ社製)を用い、製造業者のプロトコルに従ってゲノミックライブラリーを作成した。得られたゲノミックライブラリーでEpicurian coli ABLE K [lac(LacZw - ),Kan - ,McrA - ,McrCB - ,McrF - ,Mrr - ,HsdRk - Mk - [F'proAB,lacI q Z Δ M15,Tn10(Tet r )]](ストラタジーン社製)を、LederbergとCohen(Lederberg,E.M.及びCohen,S.N.、J.Bacteriol.119巻、1072〜1074頁(1974))の方法に従って形質転換した。この宿主細胞は、通常用いられる宿主細胞E. coli JM109などよりもベクターのコピー数を1/10に低減するものである。この形質転換体を、アンピシリン50μg/ml及びショ糖脂肪酸エステル(DKエステルSS)2g/L及び1.5重量/容量%の寒天を含むL培地に塗布した。37℃にて一夜培養した後、室温下に1週間放置した。約5000の形質転換体コロニーについて、その周辺に生じる、エステラーゼの作用によって形成される白いハローを指標として、目的のクローンを探索した。しかして、微弱であるがハローを形成する11の陽性クローンが得られた。
【0075】
この陽性クローンから、約10 kbのEcoRI−EcoRI断片を取り出し、サブクローニングに供した。サブクローニングにおいて、E. coli JM109 [recA1,endA1,gryA96,thi,hsdR17,supE44,relA1, Δ (Lac-proAB),F'(traD36,proAB + ,lacI q ,lacZ Δ M15)]を宿主細胞として用い、ベクターとしてはpUC18を用いた。次いで前記の約10 kbのEcoRI−EcoRI断片を、BamHIで消化した。切断部位は、図9、aに示す通りであり、得られる4つの断片の各々について上記寒天法にてエステラーゼ活性を確認したところ、EcoRI−EcoRI断片の5'上流域に位置する、3.3 kbのEcoRI−BamHI(図9、b)断片に高い活性が認められた。この活性は、EcoRI−EcoRI断片よりも高いものであった。このようにして得られたEcoRI−BamHI断片の塩基配列を、Dideoxy法に従って、Auto Read Sequencing Kit(ファルマシア社製)を用い、ALFexpress装置で分析した。かくして得られた塩基配列は、配列番号:1に示される通りであった。
【0076】
次いで、得られた塩基配列のうち、エステラーゼの構造遺伝子を特定するために、当該DNAの上流及び下流領域の削除を行い、削除に伴うエステラーゼ活性の変動に基づき、1613塩基対の断片(図9、c)にまで活性断片を限定した。このように領域を限定していくに伴って、コロニー周囲のハローの直径は大きくなったので、得られた断片により発現されるエステラーゼ活性が強くなっていることが示唆された。
【0077】
この1613塩基対の断片の塩基配列を調べると、1416塩基対の読み取り枠が存在していることが示された。また、この断片をプロモーターに対して逆向きになるようにpUC19ベクターに挿入すると、エステラーゼ活性は著しく低下したので、この遺伝子の向きが図9、cに示すとおりであることが示唆された。
【0078】
図9、cに示すように、得られたエステラーゼDNAをコードする1613塩基対の断片の読み取り枠において、▲印に示す4箇所の開始コドンの配列が認められた。正確な開始コドンを確認するために、この断片の5'上流側の配列を欠失させた。図9、dに示すように2番目のATG配列の下流まで削除したところエステラーゼ活性が認められなくなったので、開始コドンは1または2番目のATG配列であると考えられた。さらにシャイン・ダルガーノ配列を検索すると、1番目のATG配列(配列番号:1の第689〜691位)上流には見出されず、2番目のATG配列(配列番号:1の第710〜712位)の上流(同、第697〜703位)に当該配列の存在が確認された。従って、2番目のATG配列が開始コドンであると考えた。また、終止コドンの下流には、ターミネーター配列(配列番号:1の第2134〜2149位)が見出された。
【0079】
上記の結果より、イデオネラ エス・ピー No.13の有するショ糖脂肪酸エステラーゼの構造遺伝子は、1416塩基対からなり、酵素タンパク質を構成するアミノ酸残基数は471(配列番号:2参照)、そしてタンパク質の分子量は48,758ダルトンと推定された。これは1.において前記したイデオネラ エス・ピー No.13由来のエステラーゼタンパク質のSDS電気泳動上の見かけの分子量約48,000ダルトンとほぼ一致していた。
【0080】
このタンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端部分には、塩基性アミノ酸に富む配列の次に非極性アミノ酸に富む配列が続いており、およそ20のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドが存在していると推定された。
【0081】
また、アミノ酸配列のほぼ中央部(配列番号:1のアミノ酸残基第189〜193位)に、エステラーゼ類及びリパーゼ類のタンパク質の活性中心に共通のアミノ酸配列「-Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly-」(配列番号:4)が見出された。このなかのセリン残基をシステイン残基に置換すべく、配列番号:1の塩基配列第1340〜1342位のTCGを、TGCにする変異を導入し、このDNAがコードするタンパク質を発現させたところ、そのエステラーゼ活性は著しく低いことが示された。従って、この5つのアミノ酸残基からなる配列が活性中心であることが確認された。
【0082】
このようにして明らかになったイデオネラ エス・ピー由来のエステラーゼの配列について、既知の配列との相同性をDNASIS(日立社製)のソフトを用いて解析した。一般に真核細胞性物のエステラーゼ類及びリパーゼ類の配列は高い相同性を呈することが見出されている[Cygler,M.ら、Protein Science、2巻、366〜382頁(1993)]が、細菌のリパーゼについてはあまり互いに相同性がないことが報告されている(Jeager,K.E.ら、Bacterial lipase, FEMS Microbiology Reviews、15巻、29〜63頁(1994))。配列を検索した結果、本ショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質と高い相同性を示すものは見出されなかった。
【0083】
4.ショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子を含む形質転換体におけるタンパク質発現
前記3.の工程によって調製した、配列番号:1に示すDNAの第658〜2276位の部分をpUC18ベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、これを用いて宿主細胞の大腸菌(E.coli JM109)を形質転換した。前記と同様に、LederbergとCohenの方法に従って形質転換を行った。
【0084】
形質転換した大腸菌をアンピシリン50μg/ml及びショ糖脂肪酸エステル(DKエステルSS)2 g/Lを含むL寒天培地に塗布し、37℃で一夜培養した。ハローを形成している1つのコロニーを選択し、アンピシリン50μg/mlを含む5 mlのL培地に植菌し、37℃で振盪培養した。培養開始2時間後に、最終濃度が0.1 mMとなるようにIPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を添加し、誘導発現を行った。さらに3時間振盪培養して培養を終了した。培養物は10,000 rpmにて2分遠心分離して集菌した。集菌した菌体を50 mMリン酸緩衝液pH 7.0に懸濁し、超音波破砕した。破砕液を上記の寒天法によって活性測定したところ、培養液1 ml当たり0.25単位の酵素活性が検出された。
【0085】
【発明の効果】
本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによって、特殊な誘導体などの原料を用いる必要なく、また副産物の少ない温和な条件下でショ糖と脂肪酸から直接ショ糖脂肪酸エステルを合成することが可能になるという効果が奏される。特にかかる反応において生成するショ糖脂肪酸エステルがモノエステルであって、ジエステル以上のポリエステルが合成されないので、本発明によって、選択的にショ糖脂肪酸モノエステルを製造する上で非常に有用な製造方法が提供されるのである。また、かかるショ糖脂肪酸モノエステルが、特にショ糖が位置選択的にエステル化された結果得られるものであるので、置換位置を限定したショ糖脂肪酸モノエステルの製造において、本発明が貢献するとことろは大である。
【0086】
また、本発明によりショ糖脂肪酸エステラーゼタンパク質の遺伝子の構造が解明されたので、この遺伝子の塩基配列を改変して、さらにショ糖脂肪酸エステル合成に有利な酵素を作り出すことが可能になる。例えば、プロテアーゼにおいて実施されているように、酵素タンパク質自体の分解を抑制するような改変を行なって、より安定な酵素を作り出すことができると予測される。このような酵素の組換え体を適切な宿主細胞において発現させることによって、大量の酵素生産が可能になると考えられる。
【0087】
また、このショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解反応の部位特異性を利用して、化学的に合成したショ糖脂肪酸エステルに含まれる3種のモノエステル異性体のうちの2つを選択的に分解し、特定のエステル化部位を有する高純度のモノエステル異性体を得ることができる。このような高純度ショ糖脂肪酸エステルは、従来知られているショ糖脂肪酸エステルの用途のみならず、さらに広範な用途において有用であることが期待される。
【0088】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法の1工程である高性能陰イオン交換カラムからの、タンパク質溶出の態様を示す図である。
【図2】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの製造方法の1工程であるゲル濾過カラムからの、タンパク質溶出の態様を示す図である。
【図3】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの活性のpH依存性を示すグラフである。
【図4】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼの温度依存性を示すグラフである。
【図5】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖脂肪酸エステルの分解の態様を表す図である。
【図6】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによる種々のショ糖脂肪酸エステルの合成の態様を表す図である。
【図7】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼによるショ糖ラウレートの合成の態様を表す図である。
【図8】図7において得られたショ糖ラウレートの高速液体クロマトグラフィーにおける分離を示す図である。
【図9】本発明のショ糖脂肪酸エステラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sucrose fatty acid esterase, and more particularly to an enzyme protein involved in the synthesis / decomposition reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as substrates, and a DNA encoding them.
[0002]
[Prior art]
Sucrose fatty acid esters are a type of surfactant that has been confirmed to be highly safe for the human body and ecosystem, and to date, have been mass-produced industrially on a commercial basis and used as emulsifying and dispersing agents for food products. Widely used, including applications.
[0003]
The conventional production method of this sucrose fatty acid ester is mainly a chemical method, but on the other hand, it is also true that there is a long-awaited voice for a synthesis method by an enzymatic method.
[0004]
This is because the following advantages can be expected according to the enzymatic method as compared with the chemical method. Ie;
(1) Since the enzyme reaction proceeds under normal temperature, normal pressure, and neutral pH conditions, there is no need for acid, alkali, and pressure resistant equipment, and the reaction temperature is lower than the chemical method, so the temperature is adjusted. The equipment burden required for this is reduced and its management becomes easy.
[0005]
(2) Since an enzyme is a protein, it is possible to realize a method for producing SE that is non-toxic and biodegradable and has little influence on the environment and ecosystem.
[0006]
(3) The enzymatic reaction has high reaction specificity, and the reaction proceeds at room temperature and neutral pH. Therefore, side reactions are unlikely to occur, and thus a product with high purity is easily obtained. Further, the raw material is hardly changed during the reaction, and the unreacted raw material can be used for the next reaction, so that the raw material can be effectively used.
[0007]
(4) According to the enzymatic reaction, a position-specific reaction is possible, and by utilizing this, only the hydroxyl group at a specific position of sucrose is esterified, and the target modified product (product) has high purity. Obtainable.
[0008]
In recent years, the availability of immobilized lipase agents (lipozymes, novozymes, etc.) suitable for ester synthesis has increased, and interest in enzymatic ester synthesis has increased. In particular, saccharides have many esterifiable hydroxyl groups. Because of this, regioselective (site-specific) esterification has been the subject of research by many scientists.
[0009]
For example, Klibanov et al. [Klibanov et al., "Protease-catalyzed Regioselective esterification of sugars and related compunds in anhydrous dimethylformamide",J. Am. Chem. Soc., 110, pp. 584-589 (1988)] uses a highly reactive fatty acid trichloroethyl ester as a raw material, and selectively esterifies the 1 'position of sucrose by using protease as a catalyst [Patil et al., "Enzymatic synthesis of a sucrose-containing linear polyester in nearly anhydrous organic media",Biotechnol. Bioeng., 37, pp. 639-646 (1991); Chan et al., "A regioselective, chemoenzymatic synthesis of sucrose-1'-methacrylate",Biocatalysis, 8, pp. 163-169 (1993); and Soedjak et al., "Enzymatic transesterification of sugars in anhydrous pyridine,Biocatalysis, 11, pp.241-248 (1994)].
[0010]
Also, Fregapane et al. [Fregapane et al., "Enzymatic solvent-free synthesis of sugar fatty acid ester",Enzyme Microb. Technol., 13, pp. 796-800 (1991)] improve the solubility of sugar in fatty acid methyl by using sugar added with acetone (isopropylidene derivative) as a raw material, and further, commercially available immobilized lipase. Monosaccharides are mainly esterified by using an agent as a catalyst [Fregapane et al., "Facile chemo-enzymatic synthesis of monosaccharide fatty acid esters",Biocatalysis, 11, pp. 9-18 (1994); and Sarney et al., "Chemo-enzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters",J. Am. Oil Chem. Soc.71, pp.711-714 (1994)].
[0011]
Also, Klibanov et al. [Klibanov et al., "Lipase-catalyzed acylation of sugars solubilized in hydrophobic solvents by complexation",Biotechnol. Bioeng., 42, pp. 788-791 (1993)] improves the solubility of saccharides in solvents by using a phenyl borate ester of sugar as a raw material, and further uses lipoprotein lipase as a catalyst. Synthesizes acrylates [Schlotterbeck et al., "Lipase-catalyzed monoacylation of fructose",Biotechnol. Letters, 15, pp. 61-64 (1993) and Oguntimein et al., "Lipase catalyzed synthesis of sugar ester in organic solvents",Biotechnol. Letters, 15, pp.175-180 (1993) etc.].
[0012]
Furthermore, as an example of directly reacting a monosaccharide and a fatty acid without using a special derivative, it has been reported that fructose or glucose is esterified using a commercially available immobilized enzyme agent (lipozyme, novozyme, etc.) as a catalyst. . [Khaled et al., "Fructose oleate synthesis in a fixed catalyst bed reactor",Biotechnol. Letters, 13, pp.167-172 (1991); Coulon et al., "Comparison of direct esterification of fructose by Candida antartica lipase",Biotechnol. Letters, 17, pp.183-186 (1995); and Ljunger et al., "Lipase catalyzed acylation of glucose",Biotechnol. Letters, 11, pp.1167-1172 (1994), etc.].
[0013]
In this way, it was possible to synthesize monosaccharide esters using sugar and fatty acids as raw materials, whereas sucrose esters could only be synthesized by enzymatic methods using special derivatives as raw materials. It was the actual situation. The use of such special derivatives is disadvantageous for industrial production of sucrose esters, and this is one of the reasons why industrial production by enzymatic methods has not yet been achieved.
[0014]
In addition, the enzymes used for synthesis are all commercially available lipase agents or protease agents, and their activity against sucrose fatty acid esters is not satisfactory. In fact, of the 13 types of commercially available lipase agents, only two types of lipase MY (name sugar industry) and lipase OF (name sugar industry) have been found to have a degradation activity on sucrose fatty acid esters. Even the decomposition activity was far from practical level.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
Thus, a sucrose fatty acid esterase protein involved in the synthesis / degradation reaction of sucrose fatty acid ester using sucrose and fatty acid as substrates has not been known so far. The present invention has been made in view of the present situation. The following sucrose fatty acid esterase proteins or mutants having the activity or active fragments thereof, DNA encoding the same, vectors containing the DNA, and such vectors It aims at providing the transformant containing this. Furthermore, the protein of the present invention provides a preferable method for producing a high-purity sucrose fatty acid ester at an industrial level by using an easily available substrate and utilizing a highly safe biological method.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been accomplished as a result of intensive studies in order to achieve the above object in the synthesis of such sucrose fatty acid esters, and is characterized by the following (1) to (13).
[0017]
(1) A sucrose fatty acid esterase protein involved in the synthesis / decomposition reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as substrates, or a variant having the activity or an active fragment thereof.
[0018]
(2) Sucrose comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in this sequence, and using sucrose and a fatty acid as substrates A protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the synthesis / decomposition reaction of fatty acid ester.
[0019]
(3) A method for producing sucrose fatty acid esterase involved in the synthesis / degradation reaction of sucrose fatty acid ester using sucrose and fatty acid as a substrate, cultivating Ideoneella sp. A method for producing a sucrose fatty acid esterase protein or an active fragment thereof, comprising the step of:
[0020]
(4) A protein having a sucrose fatty acid esterase activity or an active fragment thereof, which is involved in the synthesis / decomposition reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as a substrate, produced by the production method of (3).
[0021]
(5) DNA encoding the protein of (2) above.
[0022]
(6) Synthesis of a sucrose fatty acid ester that hybridizes with DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or DNA comprising this base sequence under stringent conditions and uses sucrose and a fatty acid as substrates. DNA encoding a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in a degradation reaction.
[0023]
(7) A protein having a sucrose fatty acid esterase activity involved in a synthesis / degradation reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as a substrate, encoded by the DNA of (6).
[0024]
(8) A recombinant vector containing the DNA of (6).
[0025]
(9) A transformant in which the recombinant vector of (8) is contained in a host cell.
[0026]
(10) A recombinant protein produced by the transformant of (9) above and having a sucrose fatty acid esterase activity involved in a synthesis / decomposition reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as substrates.
[0027]
(11) A method for producing a sucrose fatty acid esterase involved in a synthesis / decomposition reaction of a sucrose fatty acid ester using sucrose and a fatty acid as a substrate, wherein the transformant of (9) is cultured, A method for producing a sucrose fatty acid esterase protein or an active fragment thereof, comprising a step of obtaining a liquid.
[0028]
(12) A protein having sucrose fatty acid esterase activity according to the above (1), (2), (4), (7) or (10), a mutant having the activity, or an active fragment thereof, in sucrose and a fatty acid The manufacturing method of sucrose fatty acid ester including the process of making it act.
[0029]
(13) The sucrose fatty acid esterase activity of (1), (2), (4), (7) or (10) is added to a mixture of a plurality of sucrose fatty acid monoester substitution position isomers synthesized by a chemical method. A method for producing a sucrose fatty acid monoester having a limited substitution position by allowing an active protein or a mutant having the activity or an active fragment thereof to act.
[0030]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The sucrose fatty acid esterase protein involved in the synthesis / decomposition reaction of sucrose fatty acid ester using sucrose and fatty acid as substrates, or a variant having the activity thereof or an active fragment thereof (hereinafter referred to as “sucrose fatty acid esterase”) Is preferably derived from the strain of Ideoneella sp. No. 13 (Accession number: FERM P-16206, contracted to Biotechnology Institute of Industrial Technology, April 24, 1997). It is not limited to bacteria. Furthermore, the sucrose fatty acid esterase is preferably produced by a production method including a step of culturing Ideoneella sp. Moreover, in this manufacturing method, the process of obtaining the sucrose fatty acid esterase active fraction fractionated by the refinement | purification process which combined the anion exchange column chromatography and the gel filtration column chromatography may be included as needed.
[0031]
The present invention also provides a method for producing sucrose fatty acid esterase, which comprises a step of culturing Ideoneella sp. No. 13 to obtain a culture supernatant thereof. This production method can also include a step of obtaining a sucrose fatty acid esterase activity fraction fractionated by a purification step combining anion exchange column chromatography and gel filtration column chromatography.
[0032]
Here, Ideoneella sp. May be cultured in L medium, L / 10 medium, other broth medium, various known complex media, and the like. As a carbon source, sucrose fatty acid ester, acetic acid, lactic acid, malic acid, pyruvic acid, succinic acid, D-fructose, D-glucose, glycerol, maltose and the like can be added. In particular, in view of production and secretion amount of sucrose fatty acid esterase, L medium or L / 10 medium supplemented with sucrose fatty acid ester and / or glucose is preferable as the medium. Using this medium, the cells are cultured preferably aerobically. The culture time, temperature, pH and the like can be appropriately selected according to the medium and the amount of bacteria, but when culturing using the above-mentioned preferable medium, it is preferably 30 to 37 ° C, particularly preferably about 37 ° C. OD of medium at around neutral pH660It is good to carry out until it becomes about 2-4.
[0033]
After completion of the culture, a culture supernatant containing sucrose fatty acid esterase is obtained by centrifugation or filtration. Thereafter, if necessary, the enzyme is roughly extracted by, for example, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, etc., and the resulting crude enzyme solution may be appropriately purified by column chromatography. Purification is preferably carried out in combination with an anion exchange column and a gel filtration column. In addition to these, for example, cation exchange columns, affinity columns, and reverse phase columns can be used to inactivate and denature enzyme proteins. As long as it does not occur, sucrose fatty acid esterase can be purified by appropriately performing a purification operation using the enzyme activity as an index.
[0034]
The sucrose fatty acid esterase of the present invention preferably comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in this sequence, It is a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the synthesis / decomposition reaction of sucrose fatty acid esters using sucrose and fatty acids as substrates. Furthermore, the synthesis / synthesis of sucrose fatty acid ester which hybridizes with DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or DNA comprising this base sequence under stringent conditions and uses sucrose and fatty acid as substrates. A protein having sucrose fatty acid esterase activity encoded by a DNA encoding a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the degradation reaction is also preferred.
[0035]
The present invention also comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in this sequence, and sucrose and fatty acids as substrates. Provided is a DNA encoding a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the synthesis / degradation reaction of sucrose fatty acid ester. Synthesis / decomposition of DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or sucrose fatty acid ester that hybridizes with DNA consisting of this base sequence under stringent conditions and uses sucrose and fatty acids as substrates. A DNA encoding a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the reaction is also contemplated by the present invention.
[0036]
Furthermore, the present invention provides a recombinant vector containing any of the above DNAs. As the vector into which DNA is inserted in this recombinant vector, various commonly used vectors can be used, for example, plasmids such as pBR322, PUC19, pUB110, pET series, RSF1010, phages such as λgt, etc. And is appropriately selected according to the infectivity to cells transformed with this vector.
[0037]
The present invention also provides a transformant in which the above recombinant vector is contained in a host cell. The host cell can be variously transformed into E. coli, yeast, Bacillus subtilis, and other animal cells as long as it can be transformed with the above-described vector to produce and secrete the desired sucrose fatty acid esterase. E. coli is preferably used.
[0038]
The transformation is accomplished by introducing a vector into the host cell, which is well known to those skilled in the art, for example, calcium chloride method, electroporation method and the like.
[0039]
A recombinant protein having sucrose fatty acid esterase activity produced by such a transformant is provided by the present invention. Here, in the sucrose fatty acid esterase of the present invention, DNA encoding the sequence is chemically synthesized, inserted downstream of an appropriate promoter in the vector, introduced into the host cell, and this transformant is introduced. It can also be produced by culturing. In addition, DNA encoding the protein is isolated from the cDNA library of an appropriate fungus, and a desired mutation is introduced into the DNA by site-directed mutagenesis to produce a DNA encoding the modified protein. It is also possible to make it. For example, by applying a method for producing a stable enzyme by modification that suppresses the degradation of the enzyme protein itself, as practiced in protease recombinants, by modifying the base sequence of the DNA of the present invention, Furthermore, it becomes possible to produce an enzyme advantageous for sucrose fatty acid ester synthesis. It is expected that the enzyme can be mass-produced by expressing such a recombinant in an appropriate host cell.
[0040]
According to the present invention, there is provided a method for producing sucrose fatty acid esterase, the method comprising culturing the transformant to obtain a culture supernatant. Subsequently, a sucrose fatty acid esterase active fraction is isolated from the obtained culture supernatant as necessary. The method for this isolation is not particularly limited, and after concentration and crude purification by ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, etc. according to protein purification from the above-mentioned Ideone sp. It may be purified by a graphic operation. Here, when Escherichia coli is used as the host cell constituting the transformant, the culture supernatant contains a larger amount of the target protein and the amount of impurities than the culture supernatant of Ideone sp. This makes it possible to obtain the desired protein more easily and in large quantities.
[0041]
It is also effective to connect the sucrose fatty acid esterase of the present invention to a suitable other protein and produce it in the form of a stable fusion protein in the host cell. The expressed fusion protein is advantageous in that it can be purified by utilizing the antigenic properties of the connected protein portion, and can be obtained, for example, after such purification. The target protein can also be isolated by cleaving the fusion protein in a site-specific manner using an appropriate proteolytic enzyme or a chemical cleavage method corresponding to the peptide sequence.
[0042]
Furthermore, this invention provides the manufacturing method of sucrose fatty acid ester including the process which makes sucrose fatty acid esterase described so far act on sucrose and a fatty acid.
[0043]
The raw material fatty acid is not particularly limited, such as the number of carbon atoms and the degree of unsaturation, and various fatty acids can be used. As shown in the following examples, when sucrose is esterified with a saturated saturated fatty acid having 8 to 14 carbon atoms using the sucrose fatty acid esterase of the present invention, sucrose fatty acid monoesters that are two ester-substituted positional isomers Esters have been produced.
[0044]
In the esterification, when a fatty acid having a large number of carbon atoms and hardly soluble in water is used, it is preferable to appropriately add a substance for increasing the water solubility of the fatty acid to the reaction solution. An example of such a substance is dimethyl sulfoxide, but in view of the influence on the enzyme activity, the upper limit of the addition amount should be about 25% by volume. The pH of the reaction solution is preferably adjusted to 6-9, particularly preferably about 7-8. In addition, to the reaction mixture, additives such as protease inhibitors and stabilizers that can prevent the degradation of sucrose fatty acid esterase in order to maintain the stability of the enzyme are added to the extent that they do not affect the esterase activity. Also good. The enzyme reaction solution contains, for example, an appropriate amount of fatty acid, sucrose, enzyme solution and dimethyl sulfoxide in a phosphate buffer (
[0045]
The reaction solution is preferably incubated at 30 to 80 ° C, particularly preferably at about 40 to 55 ° C for an appropriate time. Next, the reaction solution is extracted with a solvent selected according to the philicity of the obtained sucrose fatty acid ester. For example, when an ester of a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms is obtained, solvent extraction may be performed using a mixed solvent of methanol / chloroform equivalents, isobutanol and the like.
[0046]
In one embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a sucrose fatty acid ester, wherein the product obtained by the production method is a sucrose fatty acid monoester and does not contain a polyester of a diester or higher. . As described above, the present invention makes it possible to synthesize sucrose fatty acid esters with a limited number of ester substitutions, which has been difficult with conventional chemical synthesis methods.
[0047]
Furthermore, the esterification site | part of sucrose is limited in the said method, The manufacture of the sucrose fatty acid monoester which contains ester only in a specific substitution position is enabled by this invention.
[0048]
Moreover, since the decomposition reaction of sucrose fatty acid ester by this sucrose fatty acid esterase has site specificity, using this, among the plural types of monoester isomers contained in chemically synthesized sucrose fatty acid ester High purity having a specific esterification site, selectively decomposing only the specific substitution position isomers, leaving only the sucrose fatty acid ester resistant to the sucrose fatty acid esterase of the present invention undegraded The monoester substituted regioisomers can be prepared. Such high-purity sucrose fatty acid esters are expected to be useful not only for conventionally known uses of sucrose fatty acid esters but also for a wider range of uses.
[0049]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further, this invention should not be limitedly interpreted by these Examples.
[0050]
【Example】
1.Ideonera SP No.13 (Trust number: FERM P-16206 ) Purification of sucrose fatty acid esterase from strains
First, for the purpose of purifying sucrose fatty acid esterase, various strains isolated from activated sludge, soil, etc. of a wastewater treatment plant were isolated. The medium contains L + SE medium (peptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 5 g / l and sucrose fatty acid ester (DK ester SS, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku) 10 g / l , PH 7) or L / 10 + SE medium (containing peptone 1 g / l, yeast extract 0.5 g / l, NaCl 0.5 g / l, sucrose fatty acid ester 10 g / l, pH 7), solid To the medium, 15 g / l of agar was further added to any of the above media. Of the 84 isolates isolated, a strain that highly expresses sucrose fatty acid esterase activity and secretes a large amount of this enzyme in the culture medium was isolated, and Ideoneella sp (Ideonella sp.) No.13 This Ideoneella sp. No. 13 strain was deposited with the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and was deposited with the accession number: FERM P-16206 on April 24, 1997.
[0051]
Here, as an index of sucrose fatty acid esterase activity, the determination result of sucrose fatty acid ester resolution by sucrose fatty acid ester agar method or titration method was adopted. Specifically, these methods are as follows.
[0052]
(a) Sucrose fatty acid ester agar method
A 1.5 wt / vol% agar solution containing 0.2 wt / vol% sucrose fatty acid ester and 50 mM phosphate buffer at pH 7 is solidified in a Petri dish to a thickness of 5-7 mm, and the agar has a diameter. A 4 mm hole was made and 20 μl of the sample solution was injected. The enzyme reaction was allowed to stand overnight at 37 ° C., and the diameter of a cloudy circle (halo) formed around the pores was measured.
[0053]
(b) Titration method
Enzymatic reaction containing 5 ml of 5% w / v sucrose fatty acid ester aqueous solution, 4 ml of McIlvaine buffer (adjusted to
[0054]
There is a linear correlation between the halo diameter (mm) measured by the sucrose fatty acid ester agar method (a) and the enzyme activity (unit, logarithm) measured by the titration method (b). It was shown that there is.
[0055]
In order to examine a preferable medium for production and secretion of sucrose fatty acid esterase by Ideonella sp. No. 13 strain selected using such a method, this bacterium was cultured using various media and carbon sources. That is, L medium (containing peptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l and NaCl 5 g / l, pH 7), L / 10 medium (peptone 1 g / l, yeast extract 0.5 g / l, NaCl 0.5 Contains g / l, pH 7) as well as minimal medium ((NHFour)2SOFour 5g / l, K2HPOFour 0.5 g / l and MgSOFour・ 7H2Three types of medium containing O 0.25 g / l and pH 7) were used as the basic medium, and sucrose fatty acid esters and / or glucose (0.5 or 1% by weight / volume) were added as the carbon source. After shaking culture at 37 ° C. for 2 days in these media, the sucrose fatty acid esterase activity of the culture supernatant is measured by the sucrose fatty acid ester agar method or titration method, and the cell growth is determined by OD of the culture solution.600More estimated.
[0056]
As a result, Ideoneella sp. No. 13 strain grows well in L / 10 medium supplemented with carbon source, L medium and L medium supplemented with carbon source, and produces and secretes a large amount of sucrose fatty acid esterase. It became clear that. Ideone SSP No. using L medium (hereinafter referred to as “L +
[0057]
In order to obtain a large amount of sucrose fatty acid esterase protein, Ideoneella sp. No. 13 strain was cultured in a large volume. First, Ideone sp. No. 13 strain was cultured in advance in a test tube in 5 ml of an L / 10 medium containing 1% by weight / volume of glucose overnight at 37 ° C. overnight. Next, 1 L of L +
[0058]
The culture broth thus obtained was removed from the bacterial cell components with a Sharpless continuous centrifuge, and the supernatant was reduced to 1/10 volume with an ultrafiltration concentrator (Asahi Kasei Co., Ltd., Microza UF SPL-1053) at 4 ° C. Until concentrated. Subsequently, ammonium sulfate was added to the concentrate so as to be 60 wt / vol% saturation, and the mixture was allowed to stand overnight, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was dissolved in 20 mM Tris-HCl buffer having a pH of 7.5, and desalted by dialysis in the same buffer. The desalted enzyme solution was freeze-dried to obtain a powdery crude enzyme. The obtained crude enzyme was found to be about 3000 units / g when sucrose fatty acid esterase activity was measured by a titration method. Using this crude enzyme, sucrose fatty acid esterase protein was purified according to the following steps. In the purification step, the sucrose fatty acid esterase activity was measured using the sucrose fatty acid ester agar method or titration method as an index.
[0059]
(1) First anion exchange column: DEAE cellulose (DE52, manufactured by Whatman) φ5.7 × 14 cm packed in the column was equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8), and a protein sample solution (2 g Protein). In the same buffer, protein was eluted with a linear concentration gradient of 0 to 0.5 M NaCl, and fractions exhibiting sucrose fatty acid esterase activity were collected.
[0060]
(2) Second anion exchange column: Hitrap Q (Pharmacia, 1 ml) with the active fraction of (1) in the same buffer system as in (1), and sucrose fatty acid esterase Was purified. The column was equipped with an FPLC system (Pharmacia), and the protein was eluted by applying a linear concentration gradient over 50 minutes at a flow rate of 1 ml / min. The enzyme activity eluted at a NaCl concentration of about 0.25 M.
[0061]
(3) Third anion exchange column: Using the same buffer as in (1), the active fraction obtained in (2) on the high performance anion exchange column Mono Q (Pharmacia, 1 ml) Further purified. The column was equipped with an FPLC system (Pharmacia), and the protein was eluted by applying a linear concentration gradient over 30 minutes at a flow rate of 1 ml / min. The desired esterase activity eluted at a NaCl concentration around 0.2 M. The elution profile is shown in FIG. An arrow is attached to the peak of the esterase activity.
[0062]
(4) Gel filtration column: Using 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 150 mM NaCl, the active fraction obtained in (3) is gel filtration column Supedex 200 HR10 / 30 (manufactured by Pharmacia) The active fraction was collected by eluting at a flow rate of 0.2 ml / min. The elution profile from this column is shown in FIG.
[0063]
By these steps, sucrose fatty acid esterase could be purified to a state close to a single band on SDS electrophoresis. The apparent molecular weight of the protein corresponding to the main band on electrophoresis was about 48,000 daltons. A portion corresponding to this protein band was cut out from the gel after SDS electrophoresis, and an analysis of the N-terminal amino acid sequence was attempted, but the sequence could not be determined. This was probably because the N-terminus of the protein was blocked.
[0064]
2.Identification of sucrose fatty acid esterase
In order to enzymatically identify the sucrose fatty acid esterase possessed by Ideoneella sp. No. 13, experiments were conducted to examine the following characteristics.
[0065]
(1) Temperature dependence: Using the sucrose fatty acid esterase crude enzyme described in 1), the temperature dependence of the sucrose fatty acid ester decomposition reaction was examined. The enzyme activity was measured using 2 units of crude enzyme by the titration method. The results are shown in FIG. 3, and it is clear that the activity is the highest at 60 ° C. and the activity is also at 70-80 ° C.
[0066]
(2) pH dependence: The pH dependency of the sucrose fatty acid ester decomposition reaction was examined using the crude enzyme described in 1. above. The enzyme activity was measured using the above-mentioned McIlvaine buffer at pH 4-8, and Clark-Lubs buffer ((i) 0.1 M boric acid + 0.1 M KCl, (ii) 0.1 M at pH 9-10). According to the titration method, 2 units of crude enzyme were used except that NaOH (adjusted to a predetermined pH with (i) + (ii)) was used. The results are shown in FIG. 4, and it is clear that the optimum pH of this enzyme activity is 8, and it has high activity at a pH in the range of 6-8.
[0067]
(3) Substrate specificity: Degradation activity of typical ester compounds that can generally serve as substrates for esterases or lipases. The crude enzyme described in 1. The reaction conditions are essentially 1. This is the same as the titration method described in 1. The reaction solution of
[0068]
[Table 1]
[0069]
As a result, this enzyme decomposed Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester) which is an ester derivative of saccharides in addition to sucrose fatty acid monoester. Even sugar esters had little effect on sucrose fatty acid polyesters that were not soluble in water. In addition, ethyl acetate, which is a substrate for esterase, is water-soluble under the reaction conditions, but the enzyme hardly acted. Although the data is not shown, this enzyme showed almost no activity even for paranitrophenyl acetate which is widely used as a substrate for measuring the activity of esterase and lipase. Furthermore, as shown in Table 1, since this enzyme showed little activity against triglycerides such as water-soluble triacetin and water-insoluble tributin and olive oil, this enzyme does not belong to an enzyme called so-called lipase. it is conceivable that. Thus, the obtained enzyme was found to act specifically on the water-soluble saccharide ester.
[0070]
(4) Decomposition reaction of sucrose fatty acid ester
1. The decomposition reaction of sucrose fatty acid ester was confirmed using the crude enzyme described in 1. As the sucrose fatty acid ester, DK ester SS (Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) containing sucrose monostearate as a main component was used. 50 μl of 5% w / v DK ester SS aqueous solution, 0.1 M phosphate buffer (pH 7), 10 μl of crude enzyme solution (0.6 units), 0-100 μl of dimethyl sulfoxide (
[0071]
When 50% by volume of dimethyl sulfoxide was present in the reaction solution, the decomposition reaction did not proceed (the same, lane j). When no enzyme was added, no degradation reaction was observed at any dimethyl sulfoxide concentration (same lanes a to e).
[0072]
(5) Synthesis reaction of sucrose fatty acid ester
1. Using the crude enzyme described in 1., various sucrose fatty acid esters were synthesized.
[0073]
Furthermore, in order to confirm the formation of esters in the reaction under the same conditions, the products synthesized by reacting sucrose and lauric acid were examined. Reaction conditions are the same as above, and thin-layer chromatography analysis is performed to compare the extract after completion of the reaction with a standard sample (DK ester S-L18A, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) containing sucrose monolaurate. did. As the developing solvent, a mixed solvent of chloroform / methanol / acetic acid / water = 70/20/8/2 was used. The result is shown in FIG. As clearly shown in FIG. 7, a product having an Rf value (0.40 and 0.33) similar to that of the standard sucrose monolaurate was obtained by the reaction between sucrose and lauric acid using this enzyme. The reaction product was then subjected to high performance liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS). As the LC-MS apparatus, LC10AT (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a column Cosmosil 5C18-AR (φ4.6 mm × 150 mm, manufactured by Nacalai Tesque) was used for the high performance liquid chromatography part. The eluent used was a 10 mM ammonium acetate aqueous solution (eluent A) and a 10 mM ammonium acetate methanol solution (eluent B), and the eluent A from 100% to
[0074]
3.Cloning of sucrose fatty acid esterase gene
Cloning of the sucrose fatty acid esterase gene derived from Ideoneella sp. No. 13 was performed as follows using the shotgun method. That is, the sarkosyl method [Morikawa et al.J. Ferment.Bioeng.74, pp. 255-261 (1992)], the chromosomal DNA of Ideoneella sp.EcoCut with RI and pBR322 vectorEcoLigated to the RI site. A genomic library was created using Wizard Kit (Promega) according to the manufacturer's protocol. With the resulting genomic libraryEpicurian coli ABLE K [lac (LacZw - ), Kan - , McrA - , McrCB - , McrF - , Mrr - , HsdRk - Mk - [F'proAB, lacI q Z Δ M15, Tn10 (Tet r )]] (Stratagene) was transformed according to the method of Lederberg and Cohen (Lederberg, E.M. and Cohen, S.N., J. Bacteriol. 119, 1072-1074 (1974)). This host cell is a commonly used host cellE. coli The number of vector copies is reduced to 1/10 compared to JM109. This transformant was applied to L medium containing 50 μg / ml of ampicillin, 2 g / L of sucrose fatty acid ester (DK ester SS) and 1.5% weight / volume agar. After overnight culture at 37 ° C., it was left at room temperature for 1 week. About 5,000 transformant colonies were searched for the target clone using white halo formed by the action of esterase in the vicinity as an index. Thus, 11 positive clones that were weak but formed a halo were obtained.
[0075]
About 10 kb from this positive cloneEcoRI−EcoThe RI fragment was removed and subjected to subcloning. In subcloning,E. coli JM109 [recA1, endA1, gryA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, Δ (Lac-proAB), F '(traD36, proAB + , lacI q , lacZ Δ M15)] As a host cell and pUC18 as a vector. Then about 10 kbEcoRI−EcoRI fragment,BamDigested with HI. The cleavage site is as shown in FIG. 9, a, and when the esterase activity was confirmed by the agar method for each of the four fragments obtained,EcoRI−Eco3.3 kb, located 5 'upstream of the RI fragmentEcoRI−BamHigh activity was observed in the HI (FIG. 9, b) fragment. This activity isEcoRI−EcoIt was higher than the RI fragment. Obtained in this wayEcoRI−BamThe base sequence of the HI fragment was analyzed with an ALFexpress apparatus using an Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia) according to the Dideoxy method. The base sequence thus obtained was as shown in SEQ ID NO: 1.
[0076]
Next, in order to specify the structural gene of esterase in the obtained base sequence, the upstream and downstream regions of the DNA were deleted, and based on the fluctuation of esterase activity accompanying the deletion, a fragment of 1613 base pairs (FIG. 9). The active fragment was limited to c). As the area was limited in this way, the diameter of the halo around the colony increased, suggesting that the esterase activity expressed by the obtained fragment was enhanced.
[0077]
Examination of the base sequence of this 1613 base pair fragment indicated that an open reading frame of 1416 base pairs was present. In addition, when this fragment was inserted into the pUC19 vector in the opposite direction to the promoter, the esterase activity was significantly reduced, suggesting that the orientation of this gene is as shown in FIG.
[0078]
As shown in FIGS. 9 and c, in the open reading frame of the 1613 base pair fragment encoding the obtained esterase DNA, sequences of four initiation codons indicated by ▲ were observed. In order to confirm the correct start codon, the
[0079]
From the above results, the structural gene of sucrose fatty acid esterase possessed by Ideoneella sp. No. 13 consists of 1416 base pairs, the number of amino acid residues constituting the enzyme protein is 471 (see SEQ ID NO: 2), and the protein The molecular weight of was estimated to be 48,758 daltons. This is 1. In FIG. 4, the apparent molecular weight of the esterase protein derived from Ideoneella sp.
[0080]
The amino terminal portion of the amino acid sequence of this protein is followed by a sequence rich in non-polar amino acids followed by a sequence rich in basic amino acids, and it is estimated that a signal peptide consisting of about 20 amino acid residues exists. It was.
[0081]
In addition, the amino acid sequence “-Gly-Xaa-Ser-Xaa-”, which is common to the active centers of the proteins of esterases and lipases, is located in the almost central part of the amino acid sequence (amino acid residues 189 to 193 of SEQ ID NO: 1). "Gly-" (SEQ ID NO: 4) was found. In order to replace the serine residue in this with a cysteine residue, the mutation which makes TGC the TCG of the 1340th to 1342th base sequence of SEQ ID NO: 1 was introduced, and the protein encoded by this DNA was expressed. Its esterase activity was shown to be significantly lower. Therefore, it was confirmed that the sequence consisting of these five amino acid residues is the active center.
[0082]
The homology with the known sequence of the esterase sequence derived from Ideoneella sp. Thus clarified was analyzed using DNASIS (manufactured by Hitachi). In general, the sequences of eukaryotic esterases and lipases have been found to exhibit high homology [Cygler, M. et al.Protein Science2, 366-382 (1993)] have been reported to be less homologous to bacterial lipases (Jeager, KE et al., Bacterial lipase, FEMS Microbiology Reviews, 15, 29-63). (1994)). As a result of searching the sequence, no one showing high homology with the present sucrose fatty acid esterase protein was found.
[0083]
4).Protein expression in transformants containing sucrose fatty acid esterase gene
3 above. The portion from position 658 to 2276 of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 prepared by the above step was inserted into the multi-cloning site of the pUC18 vector, and this was used for E. coli (E.coli JM109) was transformed. In the same manner as described above, transformation was performed according to the method of Lederberg and Cohen.
[0084]
The transformed E. coli was applied to an L agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin and 2 g / L of sucrose fatty acid ester (DK ester SS), and cultured overnight at 37 ° C. One colony forming a halo was selected, inoculated into 5 ml of L medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C. with shaking. Two hours after the start of the culture, IPTG (isopropylthiogalactoside) was added so that the final concentration was 0.1 mM, and induced expression was performed. The culture was further terminated by shaking for 3 hours. The culture was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 2 minutes. The collected cells were suspended in 50 mM phosphate buffer pH 7.0 and sonicated. When the activity of the crushed liquid was measured by the agar method described above, 0.25 units of enzyme activity was detected per 1 ml of the culture solution.
[0085]
【The invention's effect】
The sucrose fatty acid esterase of the present invention has the effect that it is possible to synthesize sucrose fatty acid esters directly from sucrose and fatty acids under mild conditions with little by-products and without the use of raw materials such as special derivatives. Played. In particular, since the sucrose fatty acid ester produced in such a reaction is a monoester, and a polyester higher than a diester is not synthesized, the present invention provides a very useful production method for selectively producing a sucrose fatty acid monoester. It is provided. In addition, since the sucrose fatty acid monoester is obtained as a result of regioselective esterification of sucrose in particular, the present invention contributes to the production of sucrose fatty acid monoester with limited substitution positions. Roh is big.
[0086]
Further, since the structure of the sucrose fatty acid esterase protein gene has been elucidated by the present invention, it is possible to modify the base sequence of this gene to further produce an enzyme advantageous for sucrose fatty acid ester synthesis. For example, it is expected that a more stable enzyme can be created by performing modifications that inhibit the degradation of the enzyme protein itself, as is done in proteases. It is considered that a large amount of enzyme can be produced by expressing such a recombinant enzyme in an appropriate host cell.
[0087]
In addition, using the site specificity of the sucrose fatty acid ester degradation reaction by this sucrose fatty acid esterase, two of the three monoester isomers contained in the chemically synthesized sucrose fatty acid ester are selected. It is possible to obtain a highly pure monoester isomer having a specific esterification site. Such high-purity sucrose fatty acid esters are expected to be useful not only for conventionally known uses of sucrose fatty acid esters but also for a wider range of uses.
[0088]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a mode of protein elution from a high-performance anion exchange column, which is one step of the method for producing sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing an embodiment of protein elution from a gel filtration column, which is one step in the method for producing sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the pH dependence of the activity of the sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the temperature dependence of the sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 5 is a view showing an aspect of decomposition of sucrose fatty acid ester by sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing a mode of synthesis of various sucrose fatty acid esters by the sucrose fatty acid esterase of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing an embodiment of synthesis of sucrose laurate by sucrose fatty acid esterase of the present invention.
8 is a diagram showing separation of sucrose laurate obtained in FIG. 7 by high performance liquid chromatography.
FIG. 9 shows a restriction enzyme map of the sucrose fatty acid esterase gene of the present invention.
Claims (18)
Met-Arg-Phe-Leu-Arg-Pro-Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Leu-Thr-Ala-Ala-Leu-
Val-Leu-Ala-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Asp-Ala-Pro-Pro-Ala-Arg-
Gly-Thr-Ile-Met-Ser-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Gln-Leu-Asn-Pro-Asn-Gln-
Thr-Trp-Pro-Ile-Pro-Ala-Ala-Gln-Ile-Asp-Ala-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-
Gly-Val-Gln-Ala-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Thr-Cys-Asp-Val-His-Ile-Ala-
Tyr-Val-Leu-Tyr-Met-Thr-Arg-Asp-Pro-Lys-Gly-Glu-Ala-Ala-Thr-Ala-
Ser-Thr-Ala-Val-Phe-Val-Pro-Ser-Gly-Thr-Asn-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-
Ser-Arg-Pro-Val-Val-Leu-Tyr-Ala-His-Gly-Thr-Thr-Thr-Glu-Lys-Ala-
Phe-Asn-Met-Ala-Asp-Ile-Ala-Asn-Asn-Gln-Glu-Gly-Ser-Leu-Thr-Ala-
Ala-Met-Phe-Ala-Ala-Gln-Gly-Tyr-Ile-Val-Val-Ala-Pro-Asn-Tyr-Leu-
Gly-Tyr-Asp-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-His-Pro-Tyr-Leu-Asn-Ala-Glu-
Ala-Glu-Ala-Val-Asp-Met-Val-Asp-Gly-Leu-Arg-Ala-Ala-Lys-Ser-Tyr-
Leu-Thr-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Thr-Pro-Ser-Ala-Gln-Leu-Phe-Val-Thr-
Gly-Tyr-Ser-Glu-Gly-Gly-His-Val-Ala-Met-Ala-Thr-Gln-Lys-Val-Leu-
Glu-Arg-Asp-Tyr-Ala-Ser-Glu-Phe-Thr-Val-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Met-
Ser-Gly-Pro-Tyr-Asn-Leu-Thr-Lys-Phe-Val-Gly-Gln-Ile-Met-Ala-Ser-
Pro-Asp-Tyr-Cys-Ala-Ser-Val-Gly-Ser-Thr-Asp-Pro-Asn-Cys-Ala-Val-
Asn-Val-Gly-Ala-Thr-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Trp-Gln-
Lys-Ala-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Gly-Ser-Ala-Ser-Asp-Val-Tyr-Gln-Ala-Ala-
Tyr-Ala-Gly-Phe-Met-Glu-Thr-Leu-Leu-Pro-Ser-Asn-Ser-Ser-Val-Asp-
Asp-Leu-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Leu-Pro-Ala-Asp-Pro-Thr-Ala-Arg-Leu-
Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Met-Ile-Asn-Glu-Ser-Phe-Arg-Thr-Ala-Ala-
Leu-Ala-Asn-Ala-Ser-Ser-Gly-Leu-Met-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Asn-Thr-
Leu-Leu-Gly-Trp-Lys-Pro-Lys-Asn-His-Met-Ala-Met-Cys-Tyr-Ser-Ser-
Ala-Asp-Pro-Thr-Val-Tyr-Gly-Tyr-Asn-Thr-Thr-Asp-Ala-Gln-Ala-Asp-
Phe-Tyr-Ser-Ser-Gly-Val-Thr-Val-Pro-Ala-Leu-Asn-Leu-Arg-Gly-Asp-
Leu-Ala-Thr-Ile-Gln-Thr-Gln-Phe-Gly-Ala-Ala-Thr-Ala-Gln-Leu-Ala-
Gly-Ala-Phe-Gln-Gln-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ser-Val-Pro-Gln-Asn-Gln-Gly-
Asn-Glu-His-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Phe-Cys-Ala-Ala-Phe-Val-Arg-Gly-
Tyr-Phe-Ala-Asn-Phe-Ala-Gln
で示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質。The following amino acid sequence:
Met-Arg-Phe-Leu-Arg-Pro-Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Leu-Thr-Ala-Ala-Leu-
Val-Leu-Ala-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Asp-Ala-Pro-Pro-Ala-Arg-
Gly-Thr-Ile-Met-Ser-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Gln-Leu-Asn-Pro-Asn-Gln-
Thr-Trp-Pro-Ile-Pro-Ala-Ala-Gln-Ile-Asp-Ala-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-
Gly-Val-Gln-Ala-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Thr-Cys-Asp-Val-His-Ile-Ala-
Tyr-Val-Leu-Tyr-Met-Thr-Arg-Asp-Pro-Lys-Gly-Glu-Ala-Ala-Thr-Ala-
Ser-Thr-Ala-Val-Phe-Val-Pro-Ser-Gly-Thr-Asn-Ala-Ala-Cys-Thr-Gly-
Ser-Arg-Pro-Val-Val-Leu-Tyr-Ala-His-Gly-Thr-Thr-Thr-Glu-Lys-Ala-
Phe-Asn-Met-Ala-Asp-Ile-Ala-Asn-Asn-Gln-Glu-Gly-Ser-Leu-Thr-Ala-
Ala-Met-Phe-Ala-Ala-Gln-Gly-Tyr-Ile-Val-Val-Ala-Pro-Asn-Tyr-Leu-
Gly-Tyr-Asp-Leu-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-His-Pro-Tyr-Leu-Asn-Ala-Glu-
Ala-Glu-Ala-Val-Asp-Met-Val-Asp-Gly-Leu-Arg-Ala-Ala-Lys-Ser-Tyr-
Leu-Thr-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Thr-Pro-Ser-Ala-Gln-Leu-Phe-Val-Thr-
Gly-Tyr-Ser-Glu-Gly-Gly-His-Val-Ala-Met-Ala-Thr-Gln-Lys-Val-Leu-
Glu-Arg-Asp-Tyr-Ala-Ser-Glu-Phe-Thr-Val-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Met-
Ser-Gly-Pro-Tyr-Asn-Leu-Thr-Lys-Phe-Val-Gly-Gln-Ile-Met-Ala-Ser-
Pro-Asp-Tyr-Cys-Ala-Ser-Val-Gly-Ser-Thr-Asp-Pro-Asn-Cys-Ala-Val-
Asn-Val-Gly-Ala-Thr-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Trp-Gln-
Lys-Ala-Tyr-Gly-Ile-Tyr-Gly-Ser-Ala-Ser-Asp-Val-Tyr-Gln-Ala-Ala-
Tyr-Ala-Gly-Phe-Met-Glu-Thr-Leu-Leu-Pro-Ser-Asn-Ser-Ser-Val-Asp-
Asp-Leu-Val-Ala-Ala-Gly-Lys-Leu-Pro-Ala-Asp-Pro-Thr-Ala-Arg-Leu-
Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Met-Ile-Asn-Glu-Ser-Phe-Arg-Thr-Ala-Ala-
Leu-Ala-Asn-Ala-Ser-Ser-Gly-Leu-Met-Gly-Ala-Ala-Ala-Thr-Asn-Thr-
Leu-Leu-Gly-Trp-Lys-Pro-Lys-Asn-His-Met-Ala-Met-Cys-Tyr-Ser-Ser-
Ala-Asp-Pro-Thr-Val-Tyr-Gly-Tyr-Asn-Thr-Thr-Asp-Ala-Gln-Ala-Asp-
Phe-Tyr-Ser-Ser-Gly-Val-Thr-Val-Pro-Ala-Leu-Asn-Leu-Arg-Gly-Asp-
Leu-Ala-Thr-Ile-Gln-Thr-Gln-Phe-Gly-Ala-Ala-Thr-Ala-Gln-Leu-Ala-
Gly-Ala-Phe-Gln-Gln-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ser-Val-Pro-Gln-Asn-Gln-Gly-
Asn-Glu-His-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Phe-Cys-Ala-Ala-Phe-Val-Arg-Gly-
Tyr-Phe-Ala-Asn-Phe-Ala-Gln
Or a sucrose fatty acid ester comprising a sucrose and a fatty acid as a substrate, wherein the amino acid sequence is represented by the following formula or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added: A protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the degradation reaction.
5'-ATGCGTTTCC TGCGCCCATT GTCTTTGCTG CCGCTGACTG CGGCCCTTGT GTTGGCCGGT
TGTGGTGGTG GCAGCGAGGA TGCCCCGCCG GCTCGGGGAA CCATCATGTC TGCGCTGGCG
GATGCCCAGC TCAACCCCAA CCAGACATGG CCCATCCCTG CGGCCCAGAT CGACGCCGGA
ACCTCGGCGT CCGGCGTTCA GGCGCTGACC GGTGCTGCGA CCTGTGATGT GCACATCGCC
TACGTGCTGT ACATGACGCG TGACCCGAAG GGTGAGGCGG CCACCGCCTC CACCGCGGTG
TTCGTGCCTT CCGGCACCAA CGCGGCCTGC ACGGGCTCTC GGCCGGTGGT GCTGTATGCG
CACGGCACGA CGACCGAGAA GGCCTTCAAC ATGGCCGACA TCGCCAACAA CCAGGAAGGC
AGCCTGACCG CTGCCATGTT CGCCGCGCAA GGCTACATCG TCGTCGCGCC GAACTACCTG
GGTTACGACC TTTCCAGCCT GAGCTACCAC CCCTACCTCA ACGCCGAAGC CGAGGCGGTG
GACATGGTCG ATGGTCTGCG TGCCGCCAAG AGCTATCTGA CGGCGTCCGG TCTGGGCACG
CCCTCGGCCC AGCTGTTCGT GACCGGCTAT TCGGAAGGTG GCCATGTGGC CATGGCCACC
CAGAAGGTGC TCGAGCGCGA CTATGCGAGC GAGTTCACCG TGACGGCCGC CGCGCCCATG
TCTGGTCCTT ATAACCTGAC CAAGTTCGTT GGCCAGATCA TGGCCAGCCC AGACTATTGC
GCCAGTGTCG GCTCCACCGA CCCGAACTGC GCGGTCAATG TGGGCGCTAC GCTGTTTACT
CCGCTACTGC TCACCAGCTG GCAGAAAGCC TACGGTATCT ACGGCTCGGC CTCGGACGTG
TATCAGGCGG CCTACGCCGG GTTCATGGAG ACGCTGCTGC CTAGCAACAG CTCCGTGGAC
GACTTGGTCG CAGCAGGCAA GTTGCCGGCC GATCCGACAG CCCGCCTGCT GTTCGGCACC
GGTGGCATGA TCAATGAAAG CTTCCGCACT GCAGCCTTGG CCAATGCGTC CAGCGGCTTG
ATGGGGGCGG CTGCCACCAA TACCTTGCTG GGGTGGAAGC CCAAGAACCA CATGGCGATG
TGCTACTCGT CCGCAGACCC GACCGTGTAT GGCTATAACA CGACGGATGC GCAGGCCGAC
TTTTACAGCA GTGGCGTGAC CGTGCCTGCT CTGAACCTGC GGGGAGACTT AGCCACGATT
CAAACTCAGT TCGGCGCGGC GACGGCGCAA CTGGCAGGTG CTTTCCAACA GACCTATTCG
CTGAGCGTGC CGCAGAACCA GGGCAACGAG CATAGCAACG CCGCTCCCTT CTGCGCGGCC
TTCGTCCGCG GCTACTTCGC GAACTTCGCC CAGTGA-3'
で示される塩基配列からなり、かつショ糖および脂肪酸を基質とするショ糖脂肪酸エステルの合成/分解反応に関与するショ糖脂肪酸エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。The following base sequence:
5'-ATGCGTTTCC TGCGCCCATT GTCTTTGCTG CCGCTGACTG CGGCCCTTGT GTTGGCCGGT
TGTGGTGGTG GCAGCGAGGA TGCCCCGCCG GCTCGGGGAA CCATCATGTC TGCGCTGGCG
GATGCCCAGC TCAACCCCAA CCAGACATGG CCCATCCCTG CGGCCCAGAT CGACGCCGGA
ACCTCGGCGT CCGGCGTTCA GGCGCTGACC GGTGCTGCGA CCTGTGATGT GCACATCGCC
TACGTGCTGT ACATGACGCG TGACCCGAAG GGTGAGGCGG CCACCGCCTC CACCGCGGTG
TTCGTGCCTT CCGGCACCAA CGCGGCCTGC ACGGGCTCTC GGCCGGTGGT GCTGTATGCG
CACGGCACGA CGACCGAGAA GGCCTTCAAC ATGGCCGACA TCGCCAACAA CCAGGAAGGC
AGCCTGACCG CTGCCATGTT CGCCGCGCAA GGCTACATCG TCGTCGCGCC GAACTACCTG
GGTTACGACC TTTCCAGCCT GAGCTACCAC CCCTACCTCA ACGCCGAAGC CGAGGCGGTG
GACATGGTCG ATGGTCTGCG TGCCGCCAAG AGCTATCTGA CGGCGTCCGG TCTGGGCACG
CCCTCGGCCC AGCTGTTCGT GACCGGCTAT TCGGAAGGTG GCCATGTGGC CATGGCCACC
CAGAAGGTGC TCGAGCGCGA CTATGCGAGC GAGTTCACCG TGACGGCCGC CGCGCCCATG
TCTGGTCCTT ATAACCTGAC CAAGTTCGTT GGCCAGATCA TGGCCAGCCC AGACTATTGC
GCCAGTGTCG GCTCCACCGA CCCGAACTGC GCGGTCAATG TGGGCGCTAC GCTGTTTACT
CCGCTACTGC TCACCAGCTG GCAGAAAGCC TACGGTATCT ACGGCTCGGC CTCGGACGTG
TATCAGGCGG CCTACGCCGG GTTCATGGAG ACGCTGCTGC CTAGCAACAG CTCCGTGGAC
GACTTGGTCG CAGCAGGCAA GTTGCCGGCC GATCCGACAG CCCGCCTGCT GTTCGGCACC
GGTGGCATGA TCAATGAAAG CTTCCGCACT GCAGCCTTGG CCAATGCGTC CAGCGGCTTG
ATGGGGGCGG CTGCCACCAA TACCTTGCTG GGGTGGAAGC CCAAGAACCA CATGGCGATG
TGCTACTCGT CCGCAGACCC GACCGTGTAT GGCTATAACA CGACGGATGC GCAGGCCGAC
TTTTACAGCA GTGGCGTGAC CGTGCCTGCT CTGAACCTGC GGGGAGACTT AGCCACGATT
CAAACTCAGT TCGGCGCGGC GACGGCGCAA CTGGCAGGTG CTTTCCAACA GACCTATTCG
CTGAGCGTGC CGCAGAACCA GGGCAACGAG CATAGCAACG CCGCTCCCTT CTGCGCGGCC
TTCGTCCGCG GCTACTTCGC GAACTTCGCC CAGTGA-3 '
In indicated by Do nucleotide sequence Ri, and sucrose and fatty acids encoding a protein having sucrose fatty acid esterase activity involved in the synthesis / degradation reaction of sucrose fatty acid ester as a substrate DNA.
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