JP3866308B2

JP3866308B2 - Neutral fat measurement reagent

Info

Publication number: JP3866308B2
Application number: JP12789595A
Authority: JP
Inventors: 直樹藤田; 俊克阿部; 正英桑原
Original assignee: 第一化学薬品株式会社
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 2007-01-10
Anticipated expiration: 2022-01-10
Also published as: JPH08322596A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はグリセロール消去系を含む中性脂肪測定に用い、リポプロテインリパーゼが混入しても誤差がなく正確な測定が可能な中性脂肪測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脂質検査の中で中性脂肪の測定は、高リポ蛋白血漿、動脈硬化、糖尿病、内分泌疾患などの診断及び治療経過観察において、臨床上重要な意味を持つものである。
【０００３】
中性脂肪測定法は、近年では化学的測定法から迅速で精度が高い酵素的測定法へと変遷し、更に臨床化学検査の需要が急増し、検査処理能力の高い自動分析装置の普及に伴い、現在では、日常検査法としてほとんどの施設で自動分析装置による酵素的測定法が行われている。
【０００４】
しかしながら、この自動分析装置を用いる場合、反応容器（セル）は、測定終了後、水で洗浄され、再び次の測定に使用されるが、洗浄不十分による試薬の残存が問題となることが多く、特にシングルラインで多項目を検査するシングルマルチ方式で、しばしば問題となっている（信岡学、他、１９８８年、メディカルテクノロジー、第１６巻、４０９頁）。
【０００５】
また、最近の酵素的測定方法は、グリセリン製剤の投与あるいは内因性のグリセロールによる正誤差を回避するため、まず、第１試薬でグリセロールを消去し、次いでリポプロテインリパーゼを含む第２試薬の添加により中性脂肪を測定する構成となっている。しかし、この第１試薬によるグリセロール消去系に、洗浄不十分等の原因でリポプロテインリパーゼが混入すると、検体中の中性脂肪が分解され、負誤差を与えることとなる。
【０００６】
特に反応セルの材質が合成樹脂の場合、第２試薬中のリポプロテインリパーゼが反応セルに吸着し、このセルで次の測定が行われた場合は上記同様の負誤差を与えることが報告され（信岡学、他、１９８８年、メディカルテクノロジー、第１６巻、４０９頁）、問題となっている。
【０００７】
これに対し、リポプロテインリパーゼの反応セルへの吸着を阻止する目的で界面活性剤を測定試薬中のリポプロテインリパーゼと共存させる方法が開示されている（特開昭６１−１０４７９８号公報）。
【０００８】
しかし、この方法は、界面活性剤が低濃度では十分な効果を得ることは難しく、また効果を高めようと高濃度を用いると、反応速度が低下するなど酵素活性測定に悪影響を及ぼす。
【０００９】
更に、リポプロテインリパーゼは、上記以外にも、総コレステロール測定用試薬や中性脂肪測定用試薬にも含まれていることから、これら測定試薬自体が混入しても測定誤差を生ずる。この場合上記方法では解決できない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、リポプロテインリパーゼが、試薬の残存や反応セルへの吸着など、いかなる機序によって混入してもその影響を受けない中性脂肪測定試薬を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意研究を行った結果、まず、リポプロテインリパーゼを阻害する界面活性剤を見出し、これにより混入してきたリポプロテインリパーゼを阻害し、中性脂肪の分解を抑えつつグリセロール消去を行った後、リポプロテインリパーゼとこれを活性化する特定の界面活性剤を含む第２試薬を加え、リポプロテインリパーゼを活性化して測定すれば、リポプロテインリパーゼがいかなるルートで混入しても正確に中性脂肪が測定し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、（Ａ）グリセロールキナーゼ及びグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ又は（Ｂ）グリセロールオキシダーゼを含む第１試薬とリポプロテインリパーゼを含む第２試薬からなる中性脂肪測定試薬において、第１試薬に次の一般式（１）
【００１３】
【化３】

【００１４】
〔式中、Ｒ¹ は炭素数６〜３０のフィトステロール残基を示し、Ａはエチレン基を示し、Ｘは水素原子又は-SO₃Naを示し、ｎは１〜２００の数を示す〕で表わされる界面活性剤を、試料と混合したときの濃度が０．００１〜５重量％となる量含み、第２試薬に次の一般式（２）
【００１５】
【化４】

【００１６】
〔式中、Ｒ² はα−メチルベンジル基を示し、Ｂはエチレン基を示し、ｍは１〜２００の数を示す〕
で表わされる界面活性剤を、試料と混合したときの濃度が０．０１〜１０重量％となる量含むことを特徴とする中性脂肪測定試薬を提供するものである。
【００１７】
本発明において第１試薬の成分は、被検体又はセル中に混在するグリセロールによる誤差を回避するため、酵素反応によりグリセロールを消去するためのものであり、第２試薬は酵素により中性脂肪をグリセロールに分解し、ここで生成したグリセロールのみを酵素反応を利用して測定することにより中性脂肪を測定するための試薬である。第１試薬及び第２試薬の組合せとしては、例えば次の表１に示すものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
【表１】

【００１９】
これら３法のうち、例えば第１法は、次のような原理で中性脂肪を測定するものである。
すなわち、この方法は検体中の中性脂肪（トリグリセリド）をリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）で分解し、得られたグリセロールをグリセロールキナーゼ（ＧＫ）によりグリセロール−３−リン酸とし、これにグリセロール−３−リン酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、これと４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、発色剤及びパーオキシダーゼによりキノン色素を生じさせてこれを測定するという原理であり、このうち、第１試薬ではリポプロテインリパーゼ等を含まないことにより、検体中に最初から存在するグリセロールを消去し、次いでリポプロテインリパーゼを含む第２試薬を添加することにより中性脂肪を測定しようという方法である。また、第２法及び第３法も原理的には第１法と同様である。
【００２０】
しかしながら、これら３法では、初期反応中にリポプロテインリパーゼが混入した場合、負誤差を生じてしまうため、本発明では上記第１試薬及び第２試薬のそれぞれに特定の界面活性剤を添加する。
【００２１】
第１試薬に添加される界面活性剤は、リポプロテインリパーゼの活性を阻害するもので、前記一般式（１）で示されるものである。一般式（１）中、Ｒ¹で示される炭素数６〜３０のステロール残基としては植物（フィト）ステロール、動物（ズー）ステロール、菌類（マイコ）ステロール由来のものが挙げられるが、植物由来のものが好ましく、これらに水素添加したものでもよい。また、ポリオキシエチレンの付加モル数ｎは１〜２００であるが、１０〜１００特に２０〜５０が好ましい。第１試薬に添加される界面活性剤としては、ポリオキシエチレンフィトステロールエーテル（ＨＬＢ１８）（市販品としては、ニッコールＢＰＳ−３０（日光ケミカルズ社製）等）、ポリオキシエチレンフィトスタノール（ＨＬＢ１４．５）（市販品としては、ニッコールＢＰＳＨ−２５（日光ケミカルズ社製）等）が好ましい例として挙げられる。
【００２２】
これらの界面活性剤は、１種又は２種以上を組合せて用いることができ、その使用量は特に制限されないが、試料と混合したときの濃度が０．００１〜５重量％、特に０．０１〜１重量％になるような範囲とすることが好ましい。
【００２３】
第２試薬に添加する界面活性剤は、混入したリポプロテインリパーゼを復活させると共に新たに加えるリポプロテインリパーゼを活性化するものである。このような界面活性剤は、前記一般式（２）で表わされるものである。
【００２４】
また、一般式（２）中、ｍで示されるポリオキシエチレンの付加モル数は１〜２００であるが、１〜５０特に５〜３０であるものが好ましい。
【００２５】
第２試薬に添加する界面活性剤の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル（ＨＬＢ１２．８）（市販品としてはエマルゲンＡ−６０（花王社製）等）、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル（ＨＬＢ１４．５）（市販品としてはエマルゲンＡ−９０（花王社製）等）が挙げられる。
【００２６】
第２試薬に添加する界面活性剤は、１種又は２種以上を組合せて用いることができ、その使用量は特に制限されないが、試料と混合したときの濃度が０．０１〜１０重量％、特に０．１〜２重量％になるような範囲で用いるのが好ましい。
【００２７】
本発明の試薬を用いて中性脂肪を定量するには、第１試薬でグリセロールを消去し、第２試薬で中性脂肪を測定する構成となっている従来の試薬の使用法と同様に行えばよい。最終的に中性脂肪を測定する方法は、パーオキシダーゼと色原体を組合せて行う吸光度分析や過酸化水素を直接接出する方法等種々の方法を用いることができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の試薬を用いて中性脂肪を測定すれば、リポプロテインリパーゼが測定当初から混入しても、誤差がなく中性脂肪を正確に測定することができる。
【００２９】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
リポプロテインリパーゼの生理食塩水希釈系列を検体として、本発明試薬と比較の試薬を用いて中性脂肪を測定し、これらの測定値に対するリポプロテインリパーゼの影響を比較した。すなわち、検体３μｌに、ポリオキシエチレンフィトステロールエーテル（ニッコールＢＰＳ−３０、日光ケミカルズ社製）０．０５％、パーオキシダーゼ２Ｕ／ml、グリセロールキナーゼ０．９Ｕ／ml、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ３．７５Ｕ／ml、ＡＴＰ０．８mg／ml、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホブチル−ｍ−トルイジン０．５mg／ml、セロノルムリピッド１．３％を含む第１試薬２６０μｌを加え、３７℃で５分間加温した後、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル（エマルゲンＡ−６０、花王社製）０．５％、リポプロテインリパーゼ２５０Ｕ／ml、４−アミノアンチピリン０．３mg／mlを含む第２試薬１３０μｌを加え、３７℃で５分間加温した後、６００nmにおける吸光度を測定することにより、中性脂肪濃度を求めた。
【００３１】
また、比較例では、第１試薬の界面活性剤ポリオキシエチレンフィトステロールエーテル（ニッコールＢＰＳ−３０、日光ケミカルズ社製）０．０５％をポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル（エマルゲンＡ−６０、花王社製）０．５％に代えて使用した。
なお、以上の操作は、日立７１５０型自動分析装置を用いて行った。
結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】

【００３３】
表２の結果より、比較例では、第１試薬、第２試薬ともにリポプロテインリパーゼを活性化する界面活性剤を含んでいるため、リポプロテインリパーゼによる著しい負の影響を受けたのに対して、第１試薬にリポプロテインリパーゼを阻害する界面活性剤、第２試薬にリポプロテインリパーゼを活性化する界面活性剤を含む本発明方法では、リポプロテインリパーゼの影響が全く認められなかった。すなわち、本発明方法は、リポプロテインリパーゼの影響を受けず、中性脂肪を極めて正確に測定できる方法であることが確認された。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a neutral fat measurement reagent that can be used for measurement of neutral fat including a glycerol elimination system and can be measured accurately without error even when lipoprotein lipase is mixed.
[0002]
[Prior art]
In the lipid test, measurement of neutral fat has clinically important meaning in diagnosis and treatment follow-up of high lipoprotein plasma, arteriosclerosis, diabetes, endocrine diseases and the like.
[0003]
In recent years, the neutral fat measurement method has changed from a chemical measurement method to a rapid and highly accurate enzymatic measurement method, and the demand for clinical chemistry tests has increased rapidly. With the spread of automated analyzers with high test processing capabilities, At present, an enzymatic measurement method using an automatic analyzer is carried out at most facilities as a daily inspection method.
[0004]
However, when this automatic analyzer is used, the reaction vessel (cell) is washed with water after the measurement is completed and used again for the next measurement, but the remaining of the reagent due to insufficient washing often becomes a problem. In particular, the single-multi method in which multiple items are inspected with a single line is often a problem (Kano Nobuoka et al., 1988, Medical Technology, Vol. 16, p. 409).
[0005]
Moreover, in order to avoid the positive error due to administration of glycerin preparation or endogenous glycerol, recent enzymatic measurement methods first eliminate glycerol with the first reagent, and then add a second reagent containing lipoprotein lipase. It is configured to measure neutral fat. However, when lipoprotein lipase is mixed into the glycerol elimination system using the first reagent due to insufficient washing or the like, the neutral fat in the specimen is decomposed and gives a negative error.
[0006]
In particular, when the material of the reaction cell is a synthetic resin, lipoprotein lipase in the second reagent is adsorbed to the reaction cell, and it is reported that the same negative error is given when the next measurement is performed in this cell ( Nobuoka Manabu et al., 1988, Medical Technology, Vol. 16, p. 409).
[0007]
On the other hand, a method in which a surfactant coexists with lipoprotein lipase in a measurement reagent for the purpose of preventing adsorption of lipoprotein lipase to a reaction cell is disclosed (Japanese Patent Laid-Open No. 61-104798).
[0008]
However, this method makes it difficult to obtain a sufficient effect when the surfactant is at a low concentration, and when a high concentration is used to enhance the effect, the reaction rate is adversely affected.
[0009]
Furthermore, in addition to the above, lipoprotein lipase is also contained in a reagent for measuring total cholesterol and a reagent for measuring neutral fat, so that even if these measuring reagents themselves are mixed, a measurement error occurs. In this case, the above method cannot be solved.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a neutral fat measurement reagent in which lipoprotein lipase is not affected by any mechanism such as remaining reagent or adsorption to a reaction cell.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In this situation, the present inventors have conducted extensive research and, as a result, firstly found a surfactant that inhibits lipoprotein lipase, thereby inhibiting the lipoprotein lipase mixed therein and suppressing the degradation of neutral fat. After erasing glycerol, add a second reagent containing lipoprotein lipase and a specific surfactant that activates it, and activate and measure lipoprotein lipase. In addition, the present inventors have found that neutral fat can be measured accurately and completed the present invention.
[0012]
That is, the present invention provides a neutral fat measurement reagent comprising (A) a first reagent containing glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase or (B) a glycerol oxidase and a second reagent containing lipoprotein lipase. The following general formula (1)
[0013]
[Chemical 3]

[0014]
[Wherein, R ¹ represents a phytosterol residue having 6 to 30 carbon atoms, A represents an ethylene group , X represents a hydrogen atom or —SO ₃ Na, and n represents a number of 1 to 200]. In the second reagent, the following general formula (2) is added to the surfactant so that the concentration when mixed with the sample is 0.001 to 5% by weight.
[0015]
[Formula 4]

[0016]
[Wherein R ² represents an α-methylbenzyl group , B represents an ethylene group , and m represents a number of 1 to 200]
And a neutral fat measuring reagent characterized in that it contains an amount of 0.01 to 10% by weight when mixed with a sample.
[0017]
In the present invention, the component of the first reagent is to eliminate glycerol by an enzymatic reaction in order to avoid an error due to glycerol mixed in the subject or cell, and the second reagent is to remove neutral fat by glycerol. It is a reagent for measuring triglycerides by measuring only glycerol produced by decomposition using an enzymatic reaction. Examples of the combination of the first reagent and the second reagent include, but are not limited to, those shown in Table 1 below.
[0018]
[Table 1]

[0019]
Of these three methods, the first method, for example, measures neutral fat on the following principle.
That is, in this method, neutral fat (triglyceride) in a sample is decomposed with lipoprotein lipase (LPL), and the obtained glycerol is converted into glycerol-3-phosphate by glycerol kinase (GK). The principle is to generate hydrogen peroxide by the action of phosphate oxidase, and to measure quinone dye with 4-aminoantipyrine (4AA), color former and peroxidase. In this method, the reagent does not contain lipoprotein lipase or the like, so that glycerol present in the specimen is erased from the beginning, and then a neutral reagent is measured by adding a second reagent containing lipoprotein lipase. The second method and the third method are the same as the first method in principle.
[0020]
However, in these three methods, when lipoprotein lipase is mixed during the initial reaction, a negative error occurs. Therefore, in the present invention, a specific surfactant is added to each of the first reagent and the second reagent.
[0021]
The surfactant added to the first reagent inhibits the activity of lipoprotein lipase and is represented by the general formula (1). In general formula (1), examples of the sterol residue having 6 to 30 carbon atoms represented by R ¹ include those derived from plant (phyto) sterol, animal (zoo) sterol, and fungi (myco) sterol. These are preferable, and hydrogenated to these may be used. Moreover, although the addition mole number n of polyoxyethylene is 1-200, 10-100 are especially preferable 20-50. As the surfactant to be added to the first reagent, (Commercially available products include Nikkol BPS-30 (manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.), etc.) Polyoxyethylene phytosterol ether (having a HLB of 18), polyoxyethylene phytostanol (HLB14.5) (As a commercially available product, Nikkor BPSH-25 (manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.)) is a preferred example.
[0022]
These surfactants can be used singly or in combination of two or more, and the amount used is not particularly limited, but the concentration when mixed with a sample is 0.001 to 5% by weight, particularly 0.01. It is preferable to be in a range such that it is ˜1% by weight.
[0023]
The surfactant added to the second reagent activates the newly added lipoprotein lipase while restoring the contaminated lipoprotein lipase. Such a surfactant is represented by the general formula (2) .
[0024]
Moreover, in general formula (2), although the addition mole number of the polyoxyethylene shown by m is 1-200, what is 1-50, especially 5-30 is preferable.
[0025]
Preferable specific examples of the surfactant to be added to the second reagent include polyoxyethylene styrenated phenyl ether (HLB12.8) (Emergen A-60 (manufactured by Kao Corporation) etc. as a commercial product), polyoxyethylene styrenation Phenyl ether (HLB14.5) (Emergen A-90 (manufactured by Kao Corporation) and the like are listed as commercial products).
[0026]
The surfactant added to the second reagent can be used alone or in combination of two or more, and the amount used is not particularly limited, but the concentration when mixed with the sample is 0.01 to 10% by weight, In particular, it is preferable to use in the range of 0.1 to 2% by weight.
[0027]
In order to quantify neutral fat using the reagent of the present invention, glycerol is eliminated with the first reagent, and neutral fat is measured with the second reagent in the same manner as in the conventional reagent usage method. Just do it. As a method of finally measuring neutral fat, various methods such as an absorbance analysis performed by combining peroxidase and a chromogen and a method of directly exposing hydrogen peroxide can be used.
[0028]
【The invention's effect】
If neutral fat is measured using the reagent of the present invention, even if lipoprotein lipase is mixed from the beginning of the measurement, the neutral fat can be accurately measured without error.
[0029]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is further demonstrated, this invention is not limited to these Examples.
[0030]
Example 1
Using a saline dilution series of lipoprotein lipase as a sample, neutral fat was measured using the reagent of the present invention and a comparative reagent, and the influence of lipoprotein lipase on these measured values was compared. Specifically, 3 μl of a sample was mixed with 0.05% polyoxyethylene phytosterol ether (Nikkor BPS-30, manufactured by Nikko Chemicals), 2 U / ml peroxidase, 0.9 U / ml glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase Add 260 μl of the first reagent containing 75 U / ml, ATP 0.8 mg / ml, N-ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidine 0.5 mg / ml, seronorm lipid 1.3%, and warm at 37 ° C. for 5 minutes. Then, 130 μl of a second reagent containing 0.5% polyoxyethylene styrenated phenyl ether (Emulgen A-60, Kao), lipoprotein lipase 250 U / ml, 4-aminoantipyrine 0.3 mg / ml was added, After heating at 37 ° C. for 5 minutes, the neutral fat concentration was determined by measuring the absorbance at 600 nm. .
[0031]
In the comparative example, 0.05% of polyoxyethylene phytosterol ether (Nikkor BPS-30, manufactured by Nikko Chemicals Co., Ltd.) as the first reagent was added to polyoxyethylene styrenated phenyl ether (Emulgen A-60, manufactured by Kao Corporation). ) Used in place of 0.5%.
The above operation was performed using a Hitachi 7150 type automatic analyzer.
The results are shown in Table 2.
[0032]
[Table 2]

[0033]
From the results of Table 2, in the comparative example, both the first reagent and the second reagent contain a surfactant that activates lipoprotein lipase, so that they were significantly negatively affected by lipoprotein lipase, In the method of the present invention in which the first reagent contains a surfactant that inhibits lipoprotein lipase and the second reagent contains a surfactant that activates lipoprotein lipase, no influence of lipoprotein lipase was observed. That is, it was confirmed that the method of the present invention is a method that can measure neutral fat very accurately without being affected by lipoprotein lipase.

Claims

In the neutral fat measurement reagent comprising (A) a first reagent containing glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase or (B) glycerol oxidase and a second reagent containing lipoprotein lipase, the first reagent has the following general formula: (1)

[Wherein, R ¹ represents a phytosterol residue having 6 to 30 carbon atoms, A represents an ethylene group , X represents a hydrogen atom or —SO ₃ Na, and n represents a number of 1 to 200]. In the second reagent, the following general formula (2) is added to the surfactant so that the concentration when mixed with the sample is 0.001 to 5% by weight.

[Wherein R ² represents an α-methylbenzyl group , B represents an ethylene group , and m represents a number of 1 to 200]
The neutral fat measuring reagent characterized by including the quantity represented by density | concentration when it mixes with a sample by 0.01 to 10weight%.

The first reagent according to claim 1 is added to the specimen to eliminate glycerol, then the second reagent according to claim 1 is added thereto, the neutral fat is decomposed into glycerol, and the produced glycerol is utilized by an enzymatic reaction. A method for measuring neutral fat, characterized by