JP3865129B2

JP3865129B2 - LC-MS analysis method and mobile phase thereof

Info

Publication number: JP3865129B2
Application number: JP2002237803A
Authority: JP
Inventors: 栄一山本; 泰石濱; 直樹浅川
Original assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Shimadzu Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2002-08-19
Filing date: 2002-08-19
Publication date: 2007-01-10
Anticipated expiration: 2022-08-19
Also published as: JP2004077276A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）を用いた分離分析分野に関し、例えばペプチドやタンパク質を分析するプロテオーム解析や細胞内代謝物を分析するメタボローム解析など、ＬＣ−ＭＳを使って分析する方法と、その分析方法で使用される移動相に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＬＣ−ＭＳでペプチドなどを分析する場合、試料成分の高分離と高感度検出が要求されるため、ＬＣでの高分離効率とＭＳでの高イオン化効率を両立させる移動相添加剤として、主にギ酸とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ギ酸を用いた場合は、ＭＳの感度向上という点では効果があるものの、試料成分の分離が悪い場合が多く、分離性能の点で課題がある。
一方、ＴＦＡは、試料成分の分離という点では効果があるものの、検出感度がギ酸に比べて低くなってしまうので、高感度化という点で課題がある。
【０００４】
そこで、感度と分離性能の両立を実現できるような移動相添加剤が望まれている。
本発明は、ＬＣ−ＭＳにおいて、ペプチドや塩基性薬物などを分析する場合、適当な添加剤を移動相に添加することにより、感度と分離性能の両立を実現できるようにすることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の分析方法は、ＬＣ−ＭＳにおいて、移動相に３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（ＴｒｉＦＰＡ）及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸（ＴＦＴＦＰＡ）のうちのいずれかを添加することを特徴とする。
また、本発明の移動相は、ＬＣ−ＭＳで使用される移動相であり、上記の試薬を添加した移動相である。
【０００６】
本発明では、移動相に上記の部分フッ素化カルボン酸をイオンペアー試薬として添加したことにより、ＬＣでの高い分離効率を維持した状態で、ＭＳでの高イオン化効率を保持した高感度検出が可能になり、例えばペプチドやタンパク質などの高感度精密分離が可能となる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＬＣ−ＭＳとして液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）システムを用いて、ＬＣでの高分離効率と、ＭＳでの高イオン化効率を両立させる移動相添加剤として、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（TriＦＰＡ）及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸（ＴＦＴＦＰＡ）を見出し、その有用性を確認した。
【０００８】
【実施例】
（液体クロマトグラフィー）
ａ）塩基性薬物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）分析
高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）としてＬＣ−１０Ａｖｐシステム（株式会社島津製作所製）を使用した。
【０００９】
カラムとしてＬ−カラムＯＤＳ（登録商標：ＣＥＲＩ社）（内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）を使用し、移動相として水−アセトニトリル混液を用い、移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸（酢酸、ギ酸、ＤＦＡ、ＴＦＡ、２，２，３，３−テトラフルオロプロピオン酸（TetraＦＰＡ）、TriＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡ）をそれぞれ添加した。移動相の流速は２００μＬ／ｍｉｎとした。溶出はアセトニトリル濃度のリニアグラジエントを採用した（１０−９０％アセトニトリル／２５ｍｉｎ）。
【００１０】
試料として塩基性薬物混合試料（濃度１００μｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；２００ｎｇ）、検出波長ＵＶ２３１ｎｍで得たＬＣ−ＵＶクロマトグラムから各薬物のピークについて、ＵＳＰ（United States Pharmacopoeia）法により、理論段数（Ｎ）及び保持比（ｋ）を求めた。
【００１１】
ｂ）ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）分析
高速液体クロマトグラフとしてＬＣ−１０Ａｖｐシステムを使用した。
カラムとしてCadenza CD-C18 ODS （内径２．０ｍｍ、長さ７５ｍｍ）を使用し、移動相、流速は前述の条件を適用し、アセトニトリル濃度のグラジエント条件は１０−６０％アセトニトリル／１０ｍｉｎとした。
【００１２】
試料としてペプチド混合試料（濃度；１００マイクロｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；２００ｎｇ）、検出波長ＵＶ２３１ｎｍでＬＣ−ＵＶクロマトグラムを得た。
【００１３】
（インフュ−ジョン−マススペクトロメトリー）
質量分析計としてＡＰＩ−ＩＩＩ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用した。１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸（酢酸、ギ酸、ＤＦＡ、ＴＦＡ、TetraＦＰＡ、TriＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡ）を含む薬物溶液及びアンギオテンシンＩＩ溶液（濃度；５００ｎｇ／ｍＬ、３０％メタノール）をシリンジポンプで５μＬ／ｍｉｎでＭＳに導入した。オリフィス電圧を６０ｋＶ、イオンスプレー電圧を５ｋＶとし、ポジティブモードで測定した。スキャンはスキャンスピード５ｍｓｅｃ／ｓｃａｎ、スキャン範囲２００−６００ａｍｕで２０回積算により、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを記録した。
【００１４】
（液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）
試料として塩基性薬物混合試料を用い、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）分析を行った。ＨＰＬＣカラムはCadenza CD-C18（登録商標：インタクト社）（内径２．０ｍｍ、長さ７５ｍｍ）を用いた。
【００１５】
液体クロマトグラフィーは、前述のように、移動相として水−アセトニトリル混液を用い、移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸を添加し、移動相の流速は２００μＬ／ｍｉｎとした。溶出はアセトニトリル濃度のリニアグラジエントを採用した（１０−９０％アセトニトリル／１０ｍｉｎ）。
【００１６】
マススペクトロメトリーは、前述のように、ＡＰＩ−ＩＩＩ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、オリフィス電圧を６０ｋＶ、イオンスプレー電圧を５ｋＶとし、ポジティブモードで測定した。スキャンはスキャンスピード５ｍｓｅｃ／ｓｃａｎ、スキャン範囲２００−６００ａｍｕで２０回積算により、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを記録した。
試料（濃度；３００ｎｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；６００ｐｇ）、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを得た。
【００１７】
（結果）
各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのｋ値及びＮ値をそれぞれ図１及び図２に示す。
ＤＦＡ、TetraＦＰＡ、TriＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、酢酸、ギ酸に比べ、ＴＦＡと同様にｋ及びＮに大きな値を示した。このことより、ＤＦＡ、TetraＦＰＡ、TriＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡはＴＦＡと同様に塩基性化合物に対し、ペアードイオンとして機能していることが示唆された。
【００１８】
一方、インフュ−ジョンＥＳＩ−ＭＳで得られたＥＳＩ−ＭＳシグナル強度比（ＴＦＡを１．００）を図３に示す。
ＤＦＡ、TriＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、酢酸、ギ酸と同様にＴＦＡに比べ、各薬物、ペプチドに対し、高いＥＳＩ−ＭＳシグナル強度を与えた。
【００１９】
TriＦＰＡを用いた分析例として、塩基性薬物混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを図４に示す。図４の各図の左上の数値は質量数、右上の数値はピーク強度を表す。化合物とも良好なピーク形状とシグナル／ノイズ比を示している。
【００２０】
さらに、図５に示されるように、酢酸、TriＦＰＡ、ＴＦＡをそれぞれ移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＵＶクロマトグラムにおいて、良好な分離が確認された。
【００２１】
図６に１０ｍｍｏｌ／ＬのTriＦＰＡを移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料（試料濃度；３００ｎｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；６００ｐｇ）、得たＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す。図７にそのとき分離された各アンギオテンシンのマススペクトルを示す。このように、各アンギオテンシンの良好な分離が確認された。
【００２２】
以上のように、ＤＦＡ、TriＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、ＬＣにおいて、トリフルオロ酢酸と同様に揮発性のペアードイオンとして機能し、塩基性化合物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）、ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に対して、酢酸、ギ酸に比べ、高い理論段数（Ｎ）と良好な保持比（ｋ）を与えた。更に、これらの酸を用いた場合の化合物のＥＳＩ−ＭＳシグナル強度はトリフルオロ酢酸よりも高く、ギ酸、酢酸と同等であった。
このことから、塩基性化合物やペプチドのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析にとって、ＤＦＡ、TriＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは高感度と高分離効率を両立させる有用なイオンペアー試薬であることが明らかとなった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、部分フッ素化化合物であるＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡをＬＣ−ＭＳの移動相に用いることで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と同様に揮発性のペアードイオンとして機能し、塩基性化合物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）、ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に対して、酢酸、ギ酸に比べ、高い理論段数（Ｎ）と良好な保持比（ｋ）を与えることができる。更に、これらの酸を用いた場合の化合物のＥＳＩ−ＭＳシグナル強度はＴＦＡよりも高く、ギ酸、酢酸と同等であった。
今後、ペプチドの高感度ＬＣ−ＭＳ分析において広く利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのｋ値を示す図である。
【図２】各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのＮ値を示す図である。
【図３】各種の移動相添加剤を用いたインフュ−ジョンＥＳＩ−ＭＳで得られたＥＳＩ−ＭＳシグナル強度比（ＴＦＡを１．００）を示す図である。
【図４】添加剤としてTriＦＰＡを用いたときの塩基性薬物混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図５】酢酸、TriＦＰＡ、ＴＦＡをそれぞれ移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＵＶクロマトグラムを示す図である。
【図６】 TriＦＰＡを移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図７】そのときの各アンギオテンシンのマススペクトルを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
In the field of separation analysis using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), for example, analysis using LC-MS, such as proteome analysis for analyzing peptides and proteins and metabolome analysis for analyzing intracellular metabolites And the mobile phase used in the analysis method.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, when analyzing peptides and the like by LC-MS, high separation of sample components and high sensitivity detection are required, so as a mobile phase additive that achieves both high separation efficiency in LC and high ionization efficiency in MS, Mainly formic acid and trifluoroacetic acid (TFA) have been used.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, when formic acid is used, although it is effective in terms of improving the sensitivity of MS, there are many cases where the separation of sample components is poor, and there is a problem in terms of separation performance.
On the other hand, TFA is effective in terms of separation of sample components, but has a problem in terms of increasing sensitivity because detection sensitivity is lower than formic acid.
[0004]
Therefore, a mobile phase additive that can realize both sensitivity and separation performance is desired.
An object of the present invention is to achieve both sensitivity and separation performance by adding an appropriate additive to a mobile phase when analyzing a peptide or a basic drug in LC-MS. Is.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In the LC-MS, the analysis method of the present invention comprises 3,3,3-trifluoropropionic acid (TriFPA) and 3,3,3-trifluoromethyl-2-trifluoromethylpropionic acid (TFTFPA) as mobile phases. Any one of them is added.
Moreover, the mobile phase of the present invention is a mobile phase used in LC-MS, and is a mobile phase to which the above-mentioned reagent is added.
[0006]
In the present invention, by adding the above partially fluorinated carboxylic acid to the mobile phase as an ion pair reagent, high sensitivity detection with high ionization efficiency in MS is possible while maintaining high separation efficiency in LC. Thus, for example, highly sensitive and precise separation of peptides and proteins becomes possible.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As a mobile phase additive that achieves both high separation efficiency in LC and high ionization efficiency in MS using liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry (LC-ESI-MS) system as LC-MS, difluoro Acetic acid (DFA), 3,3,3-trifluoropropionic acid (TriFPA) and 3,3,3-trifluoromethyl-2-trifluoromethylpropionic acid (TFTPA) were found and their usefulness was confirmed.
[0008]
【Example】
(Liquid chromatography)
a) LC-10Avp system (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as a high performance liquid chromatograph (HPLC) for analysis of basic drugs (atenolol, sulpiride, nadolol, tetrahydrozoline).
[0009]
An L-column ODS (registered trademark: CERI) (inner diameter: 2.0 mm × length: 150 mm) was used as a column, a water-acetonitrile mixture was used as a mobile phase, and 10 mmol / L acid (acetic acid, formic acid was used as the mobile phase. , DFA, TFA, 2,2,3,3-tetrafluoropropionic acid (TetraFPA), TriFPA, TFTFPA) were added respectively. The flow rate of the mobile phase was 200 μL / min. For elution, a linear gradient of acetonitrile concentration was employed (10-90% acetonitrile / 25 min).
[0010]
As a sample, 2 μL of a basic drug mixed sample (concentration: 100 μg / mL) was injected into HPLC (injection amount: 200 ng), and the peak of each drug was determined from the LC-UV chromatogram obtained at a detection wavelength of UV 231 nm. The number of theoretical plates (N) and retention ratio (k) were determined by the method.
[0011]
b) Peptide (Angiotensin I, II, III) Analysis The LC-10Avp system was used as a high performance liquid chromatograph.
Cadenza CD-C18 ODS (inner diameter 2.0 mm, length 75 mm) was used as a column, the mobile phase and flow rate were applied with the above-mentioned conditions, and the gradient condition of acetonitrile concentration was 10-60% acetonitrile / 10 min.
[0012]
As a sample, 2 μL of a peptide mixed sample (concentration: 100 microg / mL) was injected into HPLC (injection amount: 200 ng), and an LC-UV chromatogram was obtained at a detection wavelength of UV 231 nm.
[0013]
(Infusion-Mass Spectrometry)
API-III (Applied Biosystems) was used as a mass spectrometer. Drug solution containing 10 mmol / L acid (acetic acid, formic acid, DFA, TFA, TetraFPA, TriFPA, TFTFPA) and angiotensin II solution (concentration: 500 ng / mL, 30% methanol) are introduced into MS at 5 μL / min with a syringe pump did. The orifice voltage was set to 60 kV, the ion spray voltage was set to 5 kV, and measurement was performed in the positive mode. In the scan, an ESI-MS spectrum was recorded by integrating 20 times at a scan speed of 5 msec / scan and a scan range of 200 to 600 amu.
[0014]
(Liquid chromatography-mass spectrometry)
Using a basic drug mixed sample as a sample, liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry (LC-ESI-MS) analysis was performed. As the HPLC column, Cadenza CD-C18 (registered trademark: Intact) (inner diameter: 2.0 mm, length: 75 mm) was used.
[0015]
As described above, in liquid chromatography, a water-acetonitrile mixture was used as the mobile phase, 10 mmol / L acid was added to the mobile phase, and the flow rate of the mobile phase was 200 μL / min. A linear gradient of acetonitrile concentration was employed for elution (10-90% acetonitrile / 10 min).
[0016]
As described above, for mass spectrometry, API-III (manufactured by Applied Biosystems) was used, the orifice voltage was set to 60 kV, the ion spray voltage was set to 5 kV, and measurement was performed in the positive mode. In the scan, an ESI-MS spectrum was recorded by integrating 20 times at a scan speed of 5 msec / scan and a scan range of 200 to 600 amu.
2 μL of a sample (concentration: 300 ng / mL) was injected into HPLC (injection amount: 600 pg) to obtain an LC-ESI-MS chromatogram.
[0017]
(result)
The k value and N value of the drug peak obtained from the LC chromatogram using various mobile phase additives are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
DFA, TetraFPA, TriFPA, and TFTFPA showed large values for k and N, as with TFA, compared to acetic acid and formic acid. From this, it was suggested that DFA, TetraFPA, TriFPA and TFTFPA function as a paired ion with respect to a basic compound like TFA.
[0018]
On the other hand, the ESI-MS signal intensity ratio (TFA is 1.00) obtained by infusion ESI-MS is shown in FIG.
DFA, TriFPA and TFTFPA gave higher ESI-MS signal intensity to each drug and peptide than TFA as well as acetic acid and formic acid.
[0019]
As an analysis example using TriFPA, an LC-ESI-MS chromatogram of a basic drug mixed sample is shown in FIG. The numerical value at the upper left of each figure in FIG. 4 represents the mass number, and the numerical value at the upper right represents the peak intensity. Both compounds show good peak shape and signal / noise ratio.
[0020]
Furthermore, as shown in FIG. 5, good separation was confirmed in the LC-UV chromatogram of the angiotensin mixed sample when acetic acid, TriFPA, and TFA were added to the mobile phase.
[0021]
In FIG. 6, 2 μL of an angiotensin mixed sample (sample concentration: 300 ng / mL) when 10 mmol / L TriFPA was added to the mobile phase was injected into the HPLC (injection amount: 600 pg), and the obtained LC-ESI-MS chromatogram was obtained. Show. FIG. 7 shows a mass spectrum of each angiotensin separated at that time. Thus, good separation of each angiotensin was confirmed.
[0022]
As described above, DFA, TriFPA, and TFTFPA function as volatile paired ions in LC, as in trifluoroacetic acid, and include basic compounds (atenolol, sulpiride, nadolol, tetrahydrozoline), peptides (angiotensin I, II). , III) gave a higher theoretical plate number (N) and better retention ratio (k) than acetic acid and formic acid. Furthermore, the ESI-MS signal intensity of the compound when these acids were used was higher than that of trifluoroacetic acid, and was equivalent to formic acid and acetic acid.
From this, it became clear that DFA, TriFPA, and TFTFPA are useful ion pair reagents that achieve both high sensitivity and high separation efficiency for LC-ESI-MS analysis of basic compounds and peptides.
[0023]
【The invention's effect】
According to the present invention, by using TriFPA and TFTFPA, which are partially fluorinated compounds, as a mobile phase of LC-MS, it functions as a volatile paired ion like trifluoroacetic acid (TFA), and a basic compound (atenolol, Compared to acetic acid and formic acid, a higher theoretical plate number (N) and a better retention ratio (k) can be given to sulpiride, nadolol, tetrahydrozoline) and peptides (angiotensin I, II, III). Furthermore, the ESI-MS signal intensity of the compounds when these acids were used was higher than that of TFA and was equivalent to formic acid and acetic acid.
In the future, it is expected to be widely used in high-sensitivity LC-MS analysis of peptides.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing k values of drug peaks obtained from LC chromatograms using various mobile phase additives.
FIG. 2 is a diagram showing N values of drug peaks obtained from LC chromatograms using various mobile phase additives.
FIG. 3 is a diagram showing an ESI-MS signal intensity ratio (TFA is 1.00) obtained by infusion ESI-MS using various mobile phase additives.
FIG. 4 is a diagram showing an LC-ESI-MS chromatogram of a basic drug mixed sample when TriFPA is used as an additive.
FIG. 5 is an LC-UV chromatogram of an angiotensin mixed sample when acetic acid, TriFPA, and TFA are added to the mobile phase, respectively.
FIG. 6 shows an LC-ESI-MS chromatogram of an angiotensin mixed sample when TriFPA is added to the mobile phase.
FIG. 7 is a diagram showing a mass spectrum of each angiotensin at that time.

Claims

In liquid chromatography-mass spectrometry,
An LC-MS analysis method characterized by adding any of 3,3,3-trifluoropropionic acid and 3,3,3-trifluoromethyl-2-trifluoromethylpropionic acid to a mobile phase.

In the mobile phase used in liquid chromatography-mass spectrometry,
A mobile phase for LC-MS, wherein any one of 3,3,3-trifluoropropionic acid and 3,3,3-trifluoromethyl-2-trifluoromethylpropionic acid is added.