JP3864303B2

JP3864303B2 - Ornithine N5-oxygenase gene involved in the biosynthesis of Aspergillus oryzae ferrichrome

Info

Publication number: JP3864303B2
Application number: JP2001176264A
Authority: JP
Inventors: 博樹石田; 洋二秦; 章嗣川戸; 孝二杉並; 康久安部; 聰今安
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2021-06-11
Also published as: JP2002360262A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該遺伝子を含有する組み換え麹菌、該形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質を生産させることによってフェリクローム又はそのデフェリ体高生産麹菌を育種する方法、蛋白質の発現を麹菌菌体内で抑制させフェリクローム又はそのデフェリ体非生産麹菌を育種する方法に関するものである。
【０００２】
フェリクローム又はそのデフェリ体は、糸状菌が生産する鉄イオンキレート物質（シデロフォア）の１種であって、その中で麹菌はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンと呼ばれるフェリクローム又はそのデフェリ体を生産する。本発明によれば、このフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列が明らかにされて、本蛋白質をコードする遺伝子の発現をその抑制を含めて自由に操作することがはじめて可能となり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン（麹菌等の糸状菌においてフェリクローム又はそのデフェリ体の主成分をなす）の生合成を多くしたり、少なくしたり、あるいはそれを停止したり、自由にコントロールすることをはじめて可能ならしたものである。
【０００３】
【従来の技術】
鉄イオンは一部の乳酸菌を除く、ほとんどすべての生物にとって必須の原子である。鉄は、生体内ではＦｅ（II）やＦｅ（III）の形態で利用され、主に酸化還元に関与する酵素群の補欠因子として機能する。しかしながら、一般的に鉄は自然界において鉄鉱石として存在し、可溶化されたイオン状態としてはほとんど存在しない。さらに鉄鉱石から微生物の働きにより可溶化された鉄イオンも、すぐに不溶性の酸化物や水酸化物となるため、生物が利用できる鉄イオンはきわめて微量である。細菌や放線菌、真核微生物はこのような微量な鉄イオンを効率的に獲得するために、シデロフォアと呼ばれる分子量１５００以下の低分子の鉄イオンキレート物質を生産する。このシデロフォアに鉄イオンをキレートすることにより、貴重な鉄イオンの不溶化を防ぎ、鉄イオンを優先的に利用することを図っている。また鉄イオンは生物にとって必須のイオンであるが、過剰に存在すると遊離のラジカルの発生を促し、逆に生体に危害を加える。シデロフォアは鉄イオンの獲得と同時に、このような鉄イオンの無害化にも大きく寄与している。シデロフォアは非キレート状態では無色であるが、鉄イオンをキレートすると、赤色を示し、可視光の吸収を示すことが知られている。
【０００４】
現在までに様々なシデロフォアが同定されているが、糸状菌が生産するシデロフォアはhydroxamates familyと呼ばれ、一般に構成アミノ酸誘導体としてＮ−ヒドロキシオルニチンを含む。研究用モデル糸状菌、工業用微生物、病原性糸状菌として幅広く研究が進められているアスペルギルス属糸状菌はhydroxamates familyの中でもフェリクローム類とフザリニン類と呼ばれるシデロフォアを生産する。前者は、Ｎ−ヒドロキシオルニチンのトリペプチドにグリシン、セリン、アラニンが環状ペプチドを形成している。一方、後者では一部のＮ−ヒドロキシオルニチンのＮ位が無水メバロン酸によってアシル化されている特徴を有する。糸状菌はこのような多種多様なシデロフォアを生産することにより、鉄イオンを優先的に獲得し、自然界での生存競争に活用しているものと考えられる。
【０００５】
一方、清酒醸造では、アスペルギルス・オリゼを蒸米上に生育させて「麹」を作成し、清酒醸造の原料として利用している。この麹造りにおいてアスペルギルス・オリゼが大量のフェリクローム類（中でも主成分はフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン）を生産し、これが酒造用水の鉄イオンをキレートし、清酒が着色することが知られている。従って、清酒醸造においては、シデロフォアであるフェリクローム類が、品質劣化の原因であり、できるだけフェリクローム類を生産しない菌株の育種が進められてきた。
【０００６】
このように、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）はフェリクローム類を大量に生産することが古くから知られているが、その生合成系に関しては、ほとんど明らかになっていない。現在でも、フェリクローム又はそのデフェリ体低生産菌の育種は主に、スクリーニング法や変異法に頼らざるを得ない。また近年このシデロフォアの鉄キレート力は、貧血症の医薬としても利用されるようになっている。麹菌が産生するフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンも鉄イオン結合能力については非常に優れているが、その生産性の向上が困難で工業レベルでの生産の対象とはなっていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、このような現状に鑑み、もしフェリクローム類の生合成遺伝子が同定されれば、麹菌（アスペルギルス・オリゼ：Aspergillus oryzae）によるフェリクローム類の生産を自由に調節する可能性がある点に着目した。
【０００８】
すなわち、清酒醸造においては、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子の発現が抑制できれば、全くフェリクローム又はそのデフェリ体を生産しない株が育種できる。また医薬品製造において、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生合成に関与する遺伝子の発現をより活発に誘導させることにより、大量のフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産が可能となる。さらに麹菌が生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は清酒や酒粕として長年摂取されており、極めて安全性の高い物質である。麹菌によりフェリクローム又はそのデフェリ体が大量に生産できれば、医薬品から食品まで幅広い応用が可能となる点に着目した。
【０００９】
このように、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生産についてはさまざまな分野に応用が期待されるが、その生合成遺伝子が未解明なため、いまだに効率的な活用がなされていないのが現状である。
【００１０】
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであって、先ずはじめに麹菌について検討を行った。
【００１１】
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的酵素産業で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記発酵産業で有用な蛋白質や低分子成分を非常に大量に生産することである。本菌株が持つ高い蛋白質生産能と醸造微生物としての安全性から、異種蛋白質生産の宿主として注目されている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭６２−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用いた異種蛋白質生産においては、アスペルギルス属などの近種の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが認められた。特に、Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場合、非常に大量の蛋白質が生産されることを見出した（特開平１１−１５４２７１，特願２０００−３６７５４）。
【００１２】
また、Ａ．ｏｒｙｚａｅは、上記のような蛋白質、酵素のみならず、産業的にも非常に貴重な低分子成分の生産も報告されている。中でも麹菌が固体培養で生産するフェリクローム又はそのデフェリ体は、近年、貧血などの鉄欠乏症用の機能性成分としても非常に注目されている物質である。
【００１３】
この麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体を医薬・食品に利用するためには、生産性をさらに向上させる必要があるが、変異法などの既存の菌株育種方法では、工業生産レベルにまで生産性が向上した変異株の取得はできなかった。そこで、広範な検討を行った結果、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与する遺伝子を単離し、これらの遺伝子の発現能を強化することによりフェリクローム又はそのデフェリ体の大量生産が可能であるとの着想を得、各方面から鋭意検討の結果、これらの遺伝子の中から麹菌のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼにはじめて着目した。また、遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混入しない方法を用いれば、セルフクローニング株となり組換え微生物の規制からも除外される点にも着目した。
【００１４】
麹菌におけるフェリクローム又はそのデフェリ体生合成経路については不明であるが、他の糸状菌のフェリクローム類の生合成経路から、その生合成の律速段階はオルニチンＮ５−オキシゲナーゼによるオルニチンの酸化であると推測される。そこでこの、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子が取得できれば、フェリクロームの生産を自由に制御できる遺伝子組み換え麹菌を育種でき、フェリクロームの工業生産が可能になると考えた。以下は麹菌が生産するフェリクローム類の中でも、最も含有量の多いフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を中心に記述するが、本発明は全てのフェリクローム類に応用が可能な技術であり、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンだけに限定するものではない。
【００１５】
我々は、清酒醸造において清酒の着色を起こす鉄イオンキレート低分子フェリクリシンを貧血改善用の機能性成分などとして大量生産させるために、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の遺伝子クローニングを行い、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの工業生産に適した遺伝子組み換え麹菌を育種することを試み、鋭意研究の結果、遂に本発明の完成に至った。
【００１６】
近年、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンなどシデロフォア生合成系の遺伝子については、トウモロコシの病原菌であるUstilago maydisにおいてその詳細な合成メカニズムが検討されてきた。生合成の第一反応であるオルニチンの酸化を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼが生合成の律速となり、これをコードする遺伝子ｓｉｄ１がクローニングされた。ｓｉｄ１などのシデロフォア生合成酵素遺伝子群の発現は、鉄が存在する環境下では発現が抑制され、鉄制限下ではその発現が開始される。このようなヒドロキシオルニチンを含むシデロフォアの生合成に必須なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia由来のものがクローニングされている。そこでこれらのシデロフォア生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の相同性から、麹菌におけるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性を担う遺伝子が取得できると考えた。
【００１７】
現在までに遺伝子が単離されたUstilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、非常に保存性の高い３つの領域を見いだした。この領域それぞれに対応する縮重合成プライマーを設計した。本プライマーを用いてＡ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子と相同性を示した。
【００１８】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、１つのイントロンを含んでいた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００１９】
単離した遺伝子は単独であるいはｍｅｌＯやｇｌａＢ遺伝子プロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を制御しうるものである。遺伝子導入方法は、例えば宿主としてｎｉａＤ変異株を用いる公知方法により、目的遺伝子とマーカー遺伝子であるｎｉａＤ遺伝子を同時に導入する。（Ｅ．Ｓ．Ｕｎｋｌｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，ｐ．９９−１０４、１９８９）この遺伝子導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質転換体を得ることができる。ｎｉａＤ変異株（硝酸を資化できない麹菌変異株：ＮｉｔｒａｔｅＲｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株）としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ１０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭＰ−１７７０７）を使用することができる。
【００２０】
すなわち、本発明は、麹菌Aspergillus oryzaeのフェリクローム又はそのデフェリ体生産を自由に制御するために、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成に関与するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子を提供するものであり、また、本発明は本遺伝子を含有する組み換えベクターとこの組み換えベクターを含有する形質転換体を提供するものである。本発明は、上記形質転換体を用いるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質の麹菌体内での発現を抑制することによって、米麹を用いた固体培養でフェリクロームを生産しない麹菌を提供するものであり、得られた麹菌は、清酒、味噌、醤油、みりんなどの我が国独自の醸造産業へ有利に利用することができる。また、本発明は、該遺伝子の発現を遺伝子工学的手法を用いて高めることによって、あらゆる培養条件下でフェリクローム又はそのデフェリ体を高生産する麹菌を提供するものである。また、こうして生産されたフェリクローム又はそのデフェリ体を鉄キレート剤としての試薬、ならびに貧血の改善効果が期待できる機能性食品への添加に提供することができる。
【００２１】
以下に本発明の詳細について述べる。
【００２２】
まず、鉄制限下でヒドロキシオルニチン類を基本構成アミノ酸とするシデロフォア生産が報告されている微生物の中で、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているものを選択した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（ＡｌａｏｒＧｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（ＳｅｒｏｒＡｌａ）−（ＴｈｒｏｒＡｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つはＧｌｎ−（ＶａｌｏｒＩｌｅ）−Ｓｅｒ（ＰｒｏｏｒＰｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（ＴｈｒｏｒＳｅｒ）−（ＬｅｕｏｒＭｅｔ）−Ａｒｇ−（ＡｓｐｏｒＡｓｎ）−Ｐｒｏ、最後にＡｒｇ−（ＡｌａｏｒＧｌｙ）−（ＳｅｒｏｒＧｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＶａｌｏｒＬｙｓ）−Ｐｒｏ−（ＳｅｒｏｒＡｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（ＴｈｒｏｒＳｅｒ）−（ＧｌｙｏｒＰｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。これら３種類の部分アミノ酸配列をもとに作製した縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った結果、約８００ｂｐの遺伝子断片が増幅した。本遺伝子の塩基配列を決定した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ遺伝子及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００２３】
得られた遺伝子断片の塩基配列をもとに５′方向及び３′方向のプライマーを合成し、Ａ．ｏｒｙｚａｅの鉄制限培養条件下から構築した５′，３′−ＲＡＣＥライブラリーに対してＰＣＲを行った。その結果、得られた部分遺伝子の全長ｃＤＮＡが取得できた。本クローンの全塩基配列を決定した結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％の相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベル３４％の相同性を有していた。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。
【００２４】
ａｓｂ１の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を試みた。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡをｐＥＴ２３ｂベクター中のＴ７プロモーター下流に挿入した。本プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。得られた形質転換体のＩＰＴＧ誘導培養を行った結果、菌体内に著量のオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が確認された。よって、得られたａｓｂ１遺伝子には麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の律速となるオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質がコードされていることが明らかとなった。
【００２５】
上記により決定した本発明に係るａｓｂ１遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２（図３、図４）に示し、この塩基配列から推定される蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１（図１、図２）に示す。
【００２６】
本発明に係るａｓｂ１遺伝子のＤＮＡを、プラスミドｐＥＴ−２３ｂ（ノバジェン社）に連結し、組換えベクター（ｐＥＡＳ１）を得た。組換えベクターである該連結ＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社）に形質転換した。アンピシリン含有培地で培養し、アンピシリン耐性株を選択し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１８３６０として寄託した。
【００２７】
以上の結果よりクローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、オルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】
オルニチンＮ５−オキシゲナーゼの相同性を利用したａｓｂ１遺伝子クローニング
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅのフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼの遺伝子クローニングを行うために、既にクローニングが報告される他の微生物由来オルニチンＮ５−オキシゲナーゼのアミノ酸配列保存領域を比較した。現在までにUstilago maydis、Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepaciaの４つの株でのクローニングが報告されている。これらの遺伝子のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、少なくとも３つのアミノ酸配列保存領域を見出した。１つは、▲１▼Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−（ＡｌａｏｒＧｌｙ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（ＳｅｒｏｒＡｌａ）−（ＴｈｒｏｒＡｌａ）−Ｇｌｕ、もう１つは▲２▼Ｇｌｎ−（ＶａｌｏｒＩｌｅ）−Ｓｅｒ（ＰｒｏｏｒＰｈｅ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−（ＴｈｒｏｒＳｅｒ）−（ＬｅｕｏｒＭｅｔ）−Ａｒｇ−（ＡｓｐｏｒＡｓｎ）−Ｐｒｏ、最後に▲３▼Ａｒｇ−（ＡｌａｏｒＧｌｙ）−（ＳｅｒｏｒＧｌｙ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＶａｌｏｒＬｙｓ）−Ｐｒｏ−（ＳｅｒｏｒＡｌａ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−（ＴｈｒｏｒＳｅｒ）−（ＧｌｙｏｒＰｒｏ）−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎである。
【００２９】
領域▲１▼のアミノ酸配列は、配列番号３（図５）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＡｌａを表わす。領域▲２▼のアミノ酸配列は、配列番号４（図６）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＶａｌ又はＩｌｅ、第２番目のＸａａはＰｒｏ又はＰｈｅ、第３番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第４番目のＸａａはＬｅｕ又はＭｅｔ、第５番目のＸａａはＡｓｐ又はＡｓｎを表わす。領域▲３▼のアミノ酸配列は、配列番号５（図７）に示す。同配列において、第１番目のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙ、第２番目のＸａａはＳｅｒ又はＧｌｙ、第３番目のＸａａはＶａｌ又はＬｙｓ、第４番目のＸａａはＳｅｒ又はＡｌａ、第５番目のＸａａはＴｈｒ又はＳｅｒ、第６番目のＸａａはＧｌｙ又はＰｒｏを表わす。
【００３０】
上記配列▲１▼、▲２▼、▲３▼をもとに、３本の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３を合成した。プライマーＰ１の塩基配列を配列番号６（図８）に示し、プライマーＰ２の塩基配列を配列番号７（図９）に示し、プライマーＰ３の塩基配列を配列番号８（図１０）に示す。これらの配列において、ｎ（図中Ｉ）はデオキシイノシン残基、ｓはＧ又はＣ、ｒはＧ又はＡ、ｗはＡ又はＴ若しくはＵ、ｙはＴ若しくはＵ又はＣのＩＵＢコードによる縮重塩基を表わす。
【００３１】
また、同時に、３０℃、４日間鉄制限培地（２％グルコース、０．６％アスパラギン、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０４％塩化カルシウム、ｐＨ６．０）で液体培養した麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅからニッポンジーン社ＩＳＯＧＥＮを利用して全ＲＮＡを抽出した。その全ＲＮＡから宝酒造Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．５μｇをもとにクローンテック社のＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔにより５′−及び３′−に対応したＲＡＣＥのライブラリーを構築した。上記縮重プライマーとＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（その塩基配列を配列番号９（図１１）に示す）を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥライブラリーに対して３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３２】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３３】
反応液をアガロースゲル電気泳動で解析を行った結果、Ｐ３プライマーを用いたものについてのみ約８００ｂｐのフラグメントの増幅が認められた。本遺伝子増幅産物の塩基配列を決定した結果、確かに上記Ｐ３配列と３′末端のポリＡ付加配列を含んでおり、相同性を検索した結果、Aureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼ及びPseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子の順に相同性を示した。
【００３４】
【実施例２】
ａｓｂ１の全塩基配列の決定と相同性検索
上記から得られた部分遺伝子の塩基配列をもとに５′−ＲＡＣＥ用、３′−ＲＡＣＥ用にプライマーＰ４、Ｐ５を合成した。プライマーＰ４の塩基配列を配列番号１０（図１２）に示し、プライマーＰ５の塩基配列を配列番号１１（図１３）に示した。
【００３５】
上記Ｐ４、Ｐ５プライマーと、ＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ付属のＡＰＩプライマー（配列番号９（図１１））を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅのＲＡＣＥのライブラリーに対して、５′−ＲＡＣＥ、３′−ＲＡＣＥのＰＣＲ反応を行った。
【００３６】
ＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（４分）、１サイクル
【００３７】
増幅されたバンドを切り出し、ｃＤＮＡの全塩基配列をジデオキシ法を用いて決定した。その結果、本遺伝子は５０２アミノ酸残基からなることが明らかとなった。プロモーター領域は配列番号２の１から２３５ｂｐ、コーディング領域は配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ、ターミネーター領域は配列番号２の１８０８から２１６８ｂｐまでである。イントロンは、１つ含まれており、配列番号２の１１０８から１１７３ｂｐまでである。またAureobasidium pullulansの推定オキシゲナーゼとアミノ酸レベルで４４％相同性、Pseudomonas aeruginosaのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質とアミノ酸レベルで３４％の相同性を有していた。得られた遺伝子をａｓｂ１と命名した。その塩基配列を配列番号２（図３、４）に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１（図１、２）に示した。
【００３８】
【実施例３】
ａｓｂ１遺伝子の大腸菌での大量発現と酵素アッセイ
ａｓｂ１遺伝子の機能を同定するために、本遺伝子の大腸菌での大量発現を行った。ａｓｂ１の全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２の２３６から１８０７ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。その際、Ｎ末端側にＮｄｅＩ、Ｃ末端側にＸｈｏＩ部位を導入した。本断片をノパジェン社ｐＥＴ−２３ｂベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向にサブクローニングした。本プラスミドａｓｂ１大腸菌高発現プラスミドｐＥＡＳ１（図１４）とした。本プラスミドをノパジェン社大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｓｂ１と命名し、これを特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１８３６０として寄託した。
【００３９】
得られた形質転換体を３７℃でＯＤ０．６までＬＢ培地で培養後、最後１ｍＭＩＰＴＧを加えてさらに３０℃で３時間培養した。得られた大腸菌の菌体内蛋白質を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）で抽出後、上清に１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−オルニチンを加え、３７℃で好気的に約２時間インキュベートした。１０％トリクロロ酢酸で反応停止後、遠心上清中のヒドロキシアミンをヨード酸化法（GillamらAnal. Chem., 5:841-844, 1981)に従って定量した。比活性は１分当たりに１ｎｍｏｌのヒドロキシアミンを産生する酵素量を１ｕｎｉｔとして、菌体蛋白質ｍｇあたりの生産量を算出し、表１に結果を示した。
【００４０】

【００４１】
表１に示したように、対照株と比較して有意なオルニチンＮ５−オキシゲナーゼ活性が認められた。よって、ａｓｂ１がフェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードすることが明らかとなった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、クローニングした遺伝子断片ａｓｂ１には、フェリクローム又はそのデフェリ体生合成の第１段階を触媒するオルニチンＮ５−オキシゲナーゼがコードされていることが確認できた。また、この遺伝子を含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ａｓｂ１はＦＥＲＭＰ−１８３６０として特許生物寄託センターに寄託されているので、ａｓｂ１遺伝子を保持するプラスミドを抽出することにより適宜取得することができる。このように、本菌株は、Escherichia coli BL21(DE3)を宿主として、プラスミドｐＥＴ−２３ｂに麹菌Aspergillus oryzaeのオルニチンＮ５−オキシゲナーゼをコードする遺伝子ａｓｂ１を挿入したプラスミドを含有している。本プラスミドはａｓｂ１遺伝子を用いた種々の応用へ遺伝子を供給できる。
【００４３】
したがって、このプラスミドからａｓｂ１遺伝子を単離し、麹菌高発現プロモーター下流に接続した大腸菌形質転換プラスミドを用いて、麹菌をエレクトロポレーション法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法等常法にしたがって形質転換してフェリクリシン又はデフェリフェリクリシン高生産株を得ることができ、フェリクリシン又はデフェリフェリクリシンを大量生産することが可能となり、また、ａｓｂ１遺伝子を破壊することによってフェリクリシン又はデフェリフェリクリシンの生産を抑制ないし防止した形質転換麹菌を得ることができ、例えば、清酒醸造において着色を抑制し、品質の劣化防止に利用することができる。
【００４４】
このように、この遺伝子を用いて、麹菌のフェリクローム又はそのデフェリ体生合成を鉄制限下で高生産あるいは非生産させることが可能であり、用途に応じたフェリクローム又はそのデフェリ体生産の改変が分子レベルで可能となり、様々な産業分野に応用が可能であることも確認した。
【００４５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】本オルニチンＮ５−オキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】保存領域▲１▼のアミノ酸配列を示す。
【図６】保存領域▲２▼のアミノ酸配列を示す。
【図７】保存領域▲３▼のアミノ酸配列を示す。
【図８】プライマーＰ１を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＲはＡ又はＧを示す。
【図９】プライマーＰ２を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、ＳはＧ又はＣ、をそれぞれ示す。
【図１０】プライマーＰ３を示す。配列中、Ｉはデオキシイノシン残基、ＳはＧ又はＣ、ＹはＴ若しくはＵ又はＣ、ＲはＡ又はＧ、ＷはＡ又はＴ若しくはＵ、をそれぞれ示す。
【図１１】ＡＰＩプライマーを示す。
【図１２】プライマーＰ４を示す。
【図１３】プライマーＰ５を示す。
【図１４】ａｓｂ１遺伝子の大腸菌発現プラスミドｐＥＡＳ１の制限酵素地図を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to ornithine N5-oxygenase protein involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae or its deferi body, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the recombinant vector, the gene , A method for breeding ferrichrome or its deferior high-producing gonococci by producing ornithine N5-oxygenase protein using the transformant, ferrichrome or its deferior that suppresses protein expression in the gonococcus The present invention relates to a method for breeding non-productive gonococci.
[0002]
Ferrichrome or its deferiated form is one of iron ion chelating substances (siderophores) produced by filamentous fungi, in which gonorrhea produces ferrichrome or its deferied form called ferriclysin or deferriferriclysin. . According to the present invention, the DNA sequence of the gene encoding ornithine N5-oxygenase protein essential for biosynthesis of this ferrichrome or its deferri body has been clarified, and the expression of the gene encoding this protein, including its suppression, has been clarified. It becomes possible for the first time to operate freely, increasing or decreasing the biosynthesis of ferriclysin or deferriferriclysin (which is the main component of ferrichrome or its deferriform in filamentous fungi such as Neisseria gonorrhoeae), or It is possible for the first time to stop and control freely.
[0003]
[Prior art]
Iron ions are essential atoms for almost all living organisms except some lactic acid bacteria. Iron is used in the form of Fe (II) or Fe (III) in vivo, and functions as a prosthetic factor for a group of enzymes mainly involved in redox. However, in general, iron exists as iron ore in nature and hardly exists as a solubilized ionic state. Furthermore, since iron ions solubilized from iron ore by the action of microorganisms immediately become insoluble oxides and hydroxides, the amount of iron ions that can be used by organisms is extremely small. Bacteria, actinomycetes, and eukaryotic microorganisms produce a low-molecular iron ion chelate substance having a molecular weight of 1500 or less called a siderophore in order to efficiently acquire such a small amount of iron ions. By chelating iron ions with this siderophore, insolubilization of valuable iron ions is prevented, and iron ions are used preferentially. Iron ions are essential for living organisms, but if they are present in excess, they promote the generation of free radicals, which in turn harm the living organisms. Siderophores contribute greatly to the detoxification of iron ions as well as the acquisition of iron ions. It is known that siderophores are colorless in an unchelated state, but when chelated with iron ions, they show a red color and absorb visible light.
[0004]
Various siderophores have been identified to date, but the siderophores produced by filamentous fungi are called the hydroxamates family and generally contain N-hydroxyornithine as a constituent amino acid derivative. Aspergillus fungi, which are widely studied as research model filamentous fungi, industrial microorganisms, and pathogenic fungi, produce siderophores called ferrichromes and fusarinins in the hydroxamates family. In the former, glycine, serine and alanine form a cyclic peptide on a tripeptide of N-hydroxyornithine. On the other hand, the latter is characterized in that the N-position of some N-hydroxyornithine is acylated with mevalonic anhydride. By producing such a wide variety of siderophores, filamentous fungi preferentially acquire iron ions and use them for survival competition in nature.
[0005]
On the other hand, in sake brewing, Aspergillus oryzae is grown on steamed rice to make “mochi” and used as a raw material for sake brewing. It is known that Aspergillus oryzae produces a large amount of ferrichromes (particularly the main component is ferriclysin or deferifericin) in this koji making, and this chelates iron ions in brewing water and colors sake. . Therefore, in sake brewing, ferrichromes, which are siderophores, cause quality degradation, and breeding of strains that do not produce ferrichromes as much as possible has been promoted.
[0006]
As described above, A. oryzae has been known for a long time to produce ferrichromes in large quantities, but its biosynthetic system is hardly clarified. Even now, breeding of ferrichrome or its deferior low-producing bacteria must rely mainly on screening methods and mutation methods. In recent years, the iron chelating power of this siderophore has been used as an anemia medicine. Ferriclicin or deferriferriclicin produced by Aspergillus is also very excellent in iron ion binding ability, but it is difficult to improve its productivity and is not a target for production at an industrial level.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
In view of this situation, the present inventors have the possibility of freely regulating the production of ferrichromes by Aspergillus oryzae if a biosynthetic gene of ferrichromes is identified. I focused on a certain point.
[0008]
That is, in sake brewing, if expression of a gene involved in biosynthesis of ferrichrome or its deferri body can be suppressed, a strain that does not produce ferrichrome or its deferier can be bred at all. In pharmaceutical production, a large amount of ferricrisin or deferlifericin can be produced by more actively inducing the expression of genes involved in biosynthesis of ferriclicin or deferriferricin. Furthermore, ferrichrome produced by Aspergillus or its deferri body has been ingested for many years as sake or sake lees and is a very safe substance. We focused on the point that if ferrichrome or its deferiate can be produced in large quantities by Neisseria gonorrhoeae, a wide range of applications from pharmaceuticals to foods will be possible.
[0009]
As described above, the production of gonococcal ferrichrome or its deferied body is expected to be applied in various fields, but its biosynthetic genes are not yet elucidated, so that it is still not efficiently used. .
[0010]
This invention was made | formed in view of such a present condition, Comprising: First, the gonococcus was examined.
[0011]
Neisseria gonorrhoeae A. oryzae is a filamentous fungus that has been used in traditional enzyme industries in Japan such as sake, soy sauce, and miso. The feature of this strain is that it produces very large amounts of proteins and low-molecular components useful in the fermentation industry. Due to the high protein-producing ability of this strain and the safety as a brewing microorganism, it has been attracting attention as a host for producing heterologous proteins (Biotechnology, 6, 1419 (1988), JP-A-62-272988). From our study, A.I. In the production of heterologous proteins using oryzae, it was confirmed that the production ability of a gene of a nearby species such as Aspergillus was further increased. In particular, A.I. oryzae gene It was found that a very large amount of protein was produced when expressed under the control of an oryzae high expression promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-154271, Japanese Patent Application No. 2000-36754).
[0012]
A. Oryzae has been reported to produce not only proteins and enzymes as described above but also industrially very valuable low molecular components. Among them, ferrichrome produced by gonococcus in solid culture or a deferier thereof is a substance that has attracted much attention as a functional component for iron deficiency such as anemia in recent years.
[0013]
In order to use this Aspergillus oryzae ferrichrome or its deferiated product for pharmaceuticals or foods, it is necessary to further improve the productivity. However, existing strain breeding methods such as the mutation method have the productivity up to the industrial production level. An improved mutant strain could not be obtained. Therefore, as a result of extensive studies, it is possible to mass-produce ferrichrome or its deferri form by isolating the genes involved in biosynthesis of ferrichrome or its deferi form and enhancing the expression ability of these genes As a result of intensive studies from various directions, attention was first paid to ornithine N5-oxygenase of Neisseria gonorrhoeae among these genes. When introducing a gene, A. It was also noted that if a method that does not mix heterologous DNA other than oryzae is used, it becomes a self-cloning strain and is excluded from the regulation of recombinant microorganisms.
[0014]
Although the biosynthesis pathway of ferrichrome or its deferri body in Neisseria gonorrhoeae is unknown, the rate-limiting step of biosynthesis is the oxidation of ornithine by ornithine N5-oxygenase from the biosynthetic pathway of ferrichromes of other filamentous fungi. Guessed. Therefore, if this ornithine N5-oxygenase gene could be obtained, it was thought that genetically modified koji molds that can freely control the production of ferrichrome could be bred, and industrial production of ferrichrome would be possible. The following describes mainly the production of ferriclicin or deferifericin, which has the highest content among ferrichromes produced by Neisseria gonorrhoeae, but the present invention is a technology that can be applied to all ferrichromes, It is not limited to ferriclysin or deferifericin.
[0015]
In order to mass-produce iron ion chelate low molecular weight ferriclicin which causes coloration of sake in sake brewing as a functional component for improving anemia, ornithine N5-oxygenase protein involved in biosynthesis of ferrichrome or its deferri body As a result of diligent research, the present invention was finally completed as a result of intensive research on the breeding of genetically modified koji molds suitable for the industrial production of ferricrisin or deferriferricrisin.
[0016]
In recent years, the detailed synthesis mechanism of the siderophore biosynthetic genes such as ferricricin or deferifericin has been studied in Ustilago maydis, a pathogen of maize. Ornithine N5-oxygenase, which catalyzes the oxidation of ornithine, which is the first reaction of biosynthesis, became the rate-limiting factor for biosynthesis, and the gene sid1 encoding this was cloned. Expression of a siderophore biosynthetic enzyme gene group such as sid1 is suppressed in an environment where iron is present, and is started under iron restriction. A gene encoding ornithine N5-oxygenase essential for biosynthesis of a siderophore containing such hydroxyornithine has been cloned from Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia. Therefore, it was considered that a gene responsible for ornithine N5-oxygenase activity in Aspergillus oryzae can be obtained from the homology of these ornithine N5-oxygenase proteins involved in siderophore biosynthesis.
[0017]
As a result of comparing the homology at the amino acid level of ornithine N5-oxygenase protein of Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa, and Burkholderia cepacia from which the genes have been isolated so far, it was found that three regions with very high conservation were found. I found it. Degenerate synthetic primers corresponding to each of these regions were designed. Using this primer, A. As a result of performing PCR on the 3′-RACE library constructed from iron restriction culture conditions of oryzae, a gene fragment of about 800 bp was amplified. As a result of determining the base sequence of this gene, it was found to be homologous with a gene encoding a putative oxygenase of Aureobasidium pullulans and an ornithine N5-oxygenase of Pseudomonas aeruginosa.
[0018]
Based on the base sequence of the obtained gene fragment, primers in 5 ′ direction and 3 ′ direction were synthesized. PCR was performed on a 5 ', 3'-RACE library constructed from oryzae iron-restricted culture conditions. As a result, a full-length cDNA of the obtained partial gene was obtained. As a result of determining the entire nucleotide sequence of this clone, this gene encoded a protein consisting of 502 amino acid residues and contained one intron. Further, it had 44% homology with the putative oxygenase of Aureobasidium pullulans at the amino acid level and 34% homology with the ornithine N5-oxygenase protein of Pseudomonas aeruginosa at the amino acid level. The resulting gene was named asb1. In order to identify the function of asb1, large-scale expression of this gene in E. coli was attempted. The full length cDNA of asb1 was inserted downstream of the T7 promoter in the pET23b vector. This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain. As a result of carrying out IPTG induction culture of the obtained transformant, a significant amount of ornithine N5-oxygenase activity was confirmed in the cells. Therefore, it was clarified that the obtained asb1 gene encodes ornithine N5-oxygenase protein which controls rate of ferrichrome of Neisseria gonorrhoeae or its deferri body.
[0019]
The isolated gene can be used alone or in combination with a high expression promoter such as melO or glaB gene promoter (Japanese Patent Application No. 11-154271, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-243965). It can be expressed in oryzae to control the production of ferriclysin or deferlifericin. As a gene introduction method, for example, a target gene and a niaD gene as a marker gene are simultaneously introduced by a known method using a niaD mutant as a host. (ES Unkle et al., Mol. Gen. Genet., 218, p. 99-104, 1989) By excluding heterologous genes such as vector sequences at the time of this gene introduction, no heterologous genes are contained. Transformants of self-cloning strains can be obtained. For example, Aspergillus oryzae 1013-niaD (FERM P-17707) can be used as the niaD mutant (Nitrate Reductase-deficient strain that cannot assimilate nitrate).
[0020]
That is, the present invention provides an ornithine N5-oxygenase gene involved in the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae ferrichrome or its deferier in order to freely control the production of Aspergillus oryzae ferrichrome or its deferier, The present invention also provides a recombinant vector containing this gene and a transformant containing this recombinant vector. The present invention provides a koji mold that does not produce ferrichrome in solid culture using rice bran by suppressing the expression of ornithine N5-oxygenase protein in the koji mold using the transformant. The koji mold can be advantageously used in Japanese brewing industries such as sake, miso, soy sauce and mirin. The present invention also provides a koji mold that highly produces ferrichrome or a deferier thereof under any culture conditions by enhancing the expression of the gene using a genetic engineering technique. In addition, the ferrichrome thus produced or its deferiated form can be provided for addition to a reagent as an iron chelator and functional foods that can be expected to improve anemia.
[0021]
Details of the present invention will be described below.
[0022]
First, among the microorganisms that have been reported to produce siderophore having hydroxyornithine as a basic amino acid under iron restriction, those having cloned the gene encoding ornithine N5-oxygenase were selected. To date, cloning in four strains of Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia has been reported. As a result of comparing the homology at the amino acid level of these genes, at least three amino acid sequence conservation regions were found. One is Ala-Val-Ile-Gly- (Ala or Gly) -Gly-Gln-Ser (Ser or Ala)-(Thr or Ala) -Glu, and the other is Gln- (Val or Ile) -Ser. (Pro or Phe) -Leu-Lys-Asp-Leu-Val- (Thr or Ser)-(Leu or Met) -Arg- (Asp or Asn) -Pro, and finally Arg- (Ala or Gly)-(Ser or Gly) -Ala-Leu- (Val or Lys) -Pro- (Ser or Ala) -Asp-Asp- (Thr or Ser)-(Gly or Pro) -Phe-Val-Asn. Using degenerate oligonucleotide probes prepared based on these three types of partial amino acid sequences, A. As a result of performing PCR on the 3′-RACE library constructed from iron restriction culture conditions of oryzae, a gene fragment of about 800 bp was amplified. As a result of determining the nucleotide sequence of this gene, homology was shown in the order of the putative oxygenase gene of Aureobasidium pullulans and the gene encoding ornithine N5-oxygenase of Pseudomonas aeruginosa.
[0023]
Based on the base sequence of the obtained gene fragment, primers in 5 ′ direction and 3 ′ direction were synthesized. PCR was performed on a 5 ', 3'-RACE library constructed from oryzae iron-restricted culture conditions. As a result, a full-length cDNA of the obtained partial gene was obtained. As a result of determining the entire nucleotide sequence of this clone, this gene encoded a protein consisting of 502 amino acid residues. Moreover, it had 44% homology with the putative oxygenase of Aureobasidium pullulans at the amino acid level and 34% homology with the ornithine N5-oxygenase protein of Pseudomonas aeruginosa. The promoter region is 1 to 235 bp of SEQ ID NO: 2, the coding region is 236 to 1807 bp of SEQ ID NO: 2, and the terminator region is 1808 to 2168 bp of SEQ ID NO: 2. One intron is included and is from 1108 to 1173 bp of SEQ ID NO: 2. The resulting gene was named asb1.
[0024]
In order to identify the function of asb1, large-scale expression of this gene in E. coli was attempted. The full length cDNA of asb1 was inserted downstream of the T7 promoter in the pET23b vector. This plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain. As a result of carrying out IPTG induction culture of the obtained transformant, a significant amount of ornithine N5-oxygenase activity was confirmed in the cells. Therefore, it was clarified that the obtained asb1 gene encodes ornithine N5-oxygenase protein which controls rate of ferrichrome of Neisseria gonorrhoeae or its deferri body.
[0025]
The base sequence of the asb1 gene according to the present invention determined as described above is shown in SEQ ID NO: 2 (FIGS. 3 and 4) in the sequence listing, and the amino acid sequence of the protein deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1, FIG. 2).
[0026]
The asb1 gene DNA according to the present invention was ligated to plasmid pET-23b (Novagen) to obtain a recombinant vector (pEAS1). The ligated DNA, which is a recombinant vector, was transformed into E. coli BL21 (DE3) (Novagen). After culturing in an ampicillin-containing medium, an ampicillin resistant strain is selected, and the resulting transformant is named Escherichia coli asb1, and is registered with FERRM P-18360 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary. As deposited.
[0027]
From the above results, it was confirmed that ornithine N5-oxygenase was encoded in the cloned gene fragment asb1. In addition, this gene can be used to highly or non-produce the production of Aspergillus oryzae ferrichrome or its deferri body under iron restriction. It was possible at the level, and it was confirmed that it could be applied to various industrial fields.
Examples of the present invention will be described below.
[0028]
[Example 1]
Asbl gene cloning utilizing homology of ornithine N5-oxygenase To perform gene cloning of ornithine N5-oxygenase that catalyzes the first step of oryzae ferrichrome or its deferier biosynthesis, comparison of amino acid sequence conserved regions of ornithine N5-oxygenase from other microorganisms already reported for cloning did. To date, cloning in four strains of Ustilago maydis, Pseudomonas sp. B10, Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia has been reported. As a result of comparing the homology at the amino acid level of these genes, at least three amino acid sequence conservation regions were found. One is (1) Ala-Val-Ile-Gly- (Ala or Gly) -Gly-Gln-Ser (Ser or Ala)-(Thr or Ala) -Glu, and the other is (2) Gln- ( Val or Ile) -Ser (Pro or Phe) -Leu-Lys-Asp-Leu-Val- (Thr or Ser)-(Leu or Met) -Arg- (Asp or Asn) -Pro and finally (3) Arg -(Ala or Gly)-(Ser or Gly) -Ala-Leu- (Val or Lys) -Pro- (Ser or Ala) -Asp-Asp- (Thr or Ser)-(Gly or Pro) -Phe-Val -Asn.
[0029]
The amino acid sequence of region (1) is shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 5). In the same arrangement, the first Xaa represents Ala or Gly, the second Xaa represents Ser or Ala, and the third Xaa represents Thr or Ala. The amino acid sequence of region (2) is shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 6). In the same sequence, the first Xaa is Val or Ile, the second Xaa is Pro or Phe, the third Xaa is Thr or Ser, the fourth Xaa is Leu or Met, and the fifth Xaa is Represents Asp or Asn. The amino acid sequence of region (3) is shown in SEQ ID NO: 5 (FIG. 7). In the same arrangement, the first Xaa is Ala or Gly, the second Xaa is Ser or Gly, the third Xaa is Val or Lys, the fourth Xaa is Ser or Ala, and the fifth Xaa is Thr or Ser, and the sixth Xaa represents Gly or Pro.
[0030]
Three degenerate oligonucleotide primers P1, P2, and P3 were synthesized based on the sequences (1), (2), and (3). The base sequence of primer P1 is shown in SEQ ID NO: 6 (FIG. 8), the base sequence of primer P2 is shown in SEQ ID NO: 7 (FIG. 9), and the base sequence of primer P3 is shown in SEQ ID NO: 8 (FIG. 10). In these sequences, n (I in the figure) is deoxyinosine residue, s is G or C, r is G or A, w is A or T or U, y is degenerate by T or U or C IUB code Represents a base.
[0031]
At the same time, iron-restricted medium (2% glucose, 0.6% asparagine, 0.1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.1% magnesium sulfate, 0.04% calcium chloride, pH 6. 0) Total RNA was extracted from oryzae using Nippon Gene ISOGEN. From the total RNA, mRNA was extracted using Takara Shuzo Oligotex-dT30 <Super> mRNA purification kit. Based on 0.5 μg of the obtained mRNA, a RACE library corresponding to 5′- and 3′- was constructed by Marathon cDNA amplification kit of Clontech. Using the degenerate primer and the API primer attached to Marathon cDNA amplification kit (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 9 (FIG. 11)) A 3'-RACE PCR reaction was performed on the oryzae RACE library.
[0032]
PCR reaction conditions are as follows.
PCR conditions • 95 ° C. (1 minute), 1 cycle • 94 ° C. (5 seconds), 72 ° C. (3 minutes), 7 cycles • 94 ° C. (5 seconds), 67 ° C. (3 minutes), 32 cycles • 67 ° C. 4 minutes), 1 cycle [0033]
As a result of analyzing the reaction solution by agarose gel electrophoresis, amplification of a fragment of about 800 bp was observed only for those using the P3 primer. As a result of determining the base sequence of this gene amplification product, it certainly contains the above-mentioned P3 sequence and the 3'-terminal poly A addition sequence. As a result of searching for homology, the predicted oxygenase of Aureobasidium pullulans and ornithine N5- of Pseudomonas aeruginosa Homology was shown in the order of genes encoding oxygenases.
[0034]
[Example 2]
Determination of the entire base sequence of asb1 and homology search Primers P4 and P5 were synthesized for 5'-RACE and 3'-RACE based on the base sequence of the partial gene obtained above. The base sequence of primer P4 is shown in SEQ ID NO: 10 (FIG. 12), and the base sequence of primer P5 is shown in SEQ ID NO: 11 (FIG. 13).
[0035]
Using the P4 and P5 primers and the API primer (SEQ ID NO: 9 (FIG. 11)) attached to Marathon cDNA amplification kit, A. A 5'-RACE, 3'-RACE PCR reaction was performed on an oryzae RACE library.
[0036]
PCR reaction conditions are as follows.
PCR conditions • 95 ° C. (1 minute), 1 cycle • 94 ° C. (5 seconds), 72 ° C. (3 minutes), 7 cycles • 94 ° C. (5 seconds), 67 ° C. (3 minutes), 32 cycles • 67 ° C. 4 minutes), 1 cycle [0037]
The amplified band was cut out and the entire base sequence of cDNA was determined using the dideoxy method. As a result, it was revealed that this gene consists of 502 amino acid residues. The promoter region is 1 to 235 bp of SEQ ID NO: 2, the coding region is 236 to 1807 bp of SEQ ID NO: 2, and the terminator region is 1808 to 2168 bp of SEQ ID NO: 2. One intron is included and is from 1108 to 1173 bp of SEQ ID NO: 2. Further, it had 44% homology with the putative oxygenase of Aureobasidium pullulans at the amino acid level and 34% homology with the ornithine N5-oxygenase protein of Pseudomonas aeruginosa at the amino acid level. The resulting gene was named asb1. The base sequence is shown in SEQ ID NO: 2 (FIGS. 3 and 4), and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 and 2).
[0038]
[Example 3]
Mass expression of asb1 gene in E. coli and enzyme assay To identify the function of asb1 gene, mass expression of this gene in E. coli was performed. The full length cDNA region of asb1 (236 to 1807 bp of SEQ ID NO: 2) was amplified by PCR. At that time, NdeI was introduced on the N-terminal side, and XhoI site was introduced on the C-terminal side. This fragment was subcloned in the forward direction with the T7 promoter into the NdeI-XhoI site of the nopagen pET-23b vector. This plasmid was designated asb1 E. coli high expression plasmid pEAS1 (FIG. 14). After transforming this plasmid into Nopagen E. coli BL21 (DE3), a transformant showing ampicillin resistance was selected. The obtained transformant was named Escherichia coli asb1 and deposited as FERM P-18360 at the Patent Organism Depositary.
[0039]
The obtained transformant was cultured in LB medium at 37 ° C. to OD 0.6, and finally 1 mM IPTG was added and further cultured at 30 ° C. for 3 hours. The obtained Escherichia coli intracellular protein was extracted with 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6), 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-ornithine was added to the supernatant, and the mixture was incubated aerobically at 37 ° C. for about 2 hours. After stopping the reaction with 10% trichloroacetic acid, the hydroxyamine in the centrifugal supernatant was quantified according to the iodooxidation method (Gillam et al. Anal. Chem., 5: 841-844, 1981). The specific activity was calculated by calculating the production amount per mg of bacterial cell protein, with the amount of enzyme producing 1 nmol of hydroxyamine per minute being 1 unit. Table 1 shows the results.
[0040]

[0041]
As shown in Table 1, significant ornithine N5-oxygenase activity was observed compared to the control strain. Thus, it was revealed that asb1 encodes ornithine N5-oxygenase that catalyzes the first step of ferrichrome or its deferier biosynthesis.
[0042]
【The invention's effect】
According to the present invention, it was confirmed that the cloned gene fragment asb1 encodes ornithine N5-oxygenase that catalyzes the first step of biosynthesis of ferrichrome or its deferior body. Moreover, since the transformant Escherichia coli asb1 containing this gene has been deposited as FERM P-18360 at the Patent Organism Depositary, it should be obtained as appropriate by extracting a plasmid carrying the asb1 gene. Can do. Thus, this strain contains Escherichia coli BL21 (DE3) as a host and a plasmid in which the gene asb1 encoding ornithine N5-oxygenase of Aspergillus oryzae is inserted into plasmid pET-23b. This plasmid can supply the gene for various applications using the asb1 gene.
[0043]
Therefore, the asb1 gene was isolated from this plasmid, and the E. coli was transformed using the Escherichia coli transformation plasmid connected downstream of the high expression promoter of the koji mold according to conventional methods such as electroporation method, protoplast-polyethylene glycol method, and ferriclysin. Alternatively, a high production strain of deferifericin can be obtained, and it is possible to mass-produce ferricrisin or deferifericin, and to suppress the production of ferricrisin or deferlifericin by disrupting the asb1 gene In addition, it is possible to obtain transformed koji molds that can be prevented, for example, to suppress coloration in sake brewing and to be used for preventing deterioration of quality.
[0044]
Thus, using this gene, it is possible to produce or non-produce the biosynthesis of Neisseria gonorrhoeae ferrichrome or its deferri body under iron restriction, and modification of ferrichrome or its deferri body production depending on the application It has been confirmed that is possible at the molecular level and can be applied to various industrial fields.
[0045]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of ornithine N5-oxygenase protein.
FIG. 2 shows the continuation of the above.
FIG. 3 shows the base sequence of the ornithine N5-oxygenase gene.
FIG. 4 shows the continuation of the above.
FIG. 5 shows the amino acid sequence of the conserved region (1).
FIG. 6 shows the amino acid sequence of the conserved region (2).
FIG. 7 shows the amino acid sequence of the conserved region (3).
FIG. 8 shows primer P1. In the sequence, I represents a deoxyinosine residue, S represents G or C, W represents A or T or U, and R represents A or G.
FIG. 9 shows primer P2. In the sequences, I represents deoxyinosine residue, Y represents T or U or C, R represents A or G, W represents A or T or U, and S represents G or C, respectively.
FIG. 10 shows primer P3. In the sequence, I represents deoxyinosine residue, S represents G or C, Y represents T or U or C, R represents A or G, and W represents A or T or U, respectively.
FIG. 11 shows API primers.
FIG. 12 shows primer P4.
FIG. 13 shows primer P5.
FIG. 14 shows a restriction map of E. coli expression plasmid pEAS1 of asb1 gene.

Claims

An ornithine N5-oxygenase protein involved in the biosynthesis of ferrichrome or a deferri body thereof having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.

The DNA of the gene encoding the protein according to claim 1, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

A recombinant vector comprising at least a coding region in the DNA of claim 2.

Recombinant vector recombinant vector described that a recombinant vector PEAS1, characterized in claim 3.

A transformant obtained by inserting the recombinant vector according to claim 3 or 4.

Transformants transformant according to claim 5, it is Escherichia coli (Escherichia coli) asb1 (FERM P -18360), transformant characterized.

A recombinant gonococcus comprising the recombinant vector according to claim 3 or 4.

A method for breeding a ferrichrome or its highly producing deferior gonococcus by producing an ornithine N5-oxygenase protein involved in biosynthesis of the ferrichrome or its deferier in a koji mold into which the DNA according to claim 2 is introduced.

A method for mass-producing ferrichrome or a deferior thereof, characterized by culturing the transformant according to any one of claims 5 to 7.