JP3862366B2

JP3862366B2 - Liver function diagnostic agent

Info

Publication number: JP3862366B2
Application number: JP17596797A
Authority: JP
Inventors: 匡河野; 五三郎細井; 淳子大嶋; 邦彦柴田; あすか伊藤
Original assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Current assignee: Tokyo Gas Co Ltd
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: JPH1121256A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝機能診断剤、詳しくは少なくとも１以上の特定位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトースを含む肝機能診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝機能障害のスクリーニングには、血中のトランスアミナーゼ（GPTおよびGOT）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、乳酸脱水素酵素（LDH）などの酵素を定量する血液生化学検査が一般的に行われている。これらの酵素は肝障害時に肝臓組織から血中に漏出する。中でも GPT、GOT は肝臓に主に存在する酵素で、正常時では血中濃度が低いのに対し、肝機能障害時には顕著に高くなることから肝障害を鋭敏に検出する優れた指標となっている。しかしながら、肝機能が著しく低下している慢性肝炎や肝硬変時には肝臓組織内の酵素量が低下しているために酵素の漏出量も低下し、障害程度が高いにも関わらず高い値を示さない場合がある（今日の診療 CD-ROM Vol.6 、医学書院刊）。また、漏出した酵素が血中から消失するには時間がかかるため、検査の時点では肝機能障害から回復していても高い値を示す場合もある。したがって、これらの酵素の定量は、肝機能障害の程度を評価する検査法として不充分である。
【０００３】
特に、肝臓外科手術時には、肝臓の障害程度および肝予備能の評価が非常に重要である（消化器診療プラクティス１肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。肝臓の障害程度の評価には血清ビリルビンの測定、ICG 負荷試験等が、肝予備能の評価にはICG 負荷試験、動脈血中ケトン体比の測定等が主に行われている。しかしながら、これらの検査法にもそれぞれ問題点がある（消化器診療プラクティス１肝障害の診断的アプローチ、大久保昭行編、文光堂刊）。例えば、血清ビリルビンの上昇は必ずしも肝機能の低下を意味するものではなく、また、術後等の短時間に肝機能がドラスティックに変化する過程を追うことは困難である。ICG 負荷試験は、ICG が肝細胞に取り込まれる際にビリルビンと競合するため、ビリルビンが高値を示している場合には信頼性のある結果を得ることができない。ケトン体測定は動脈血採血の必要があるため、肝機能の低下により血液凝固能が大きく低下している場合には危険があり、また、測定施設間でのばらつきが大きいのも問題である。こうした状況から、検査を行う時点での肝臓の障害程度および肝予備能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価できる手段が望まれている。
【０００４】
一方、フルクトース投与後の血中フルクトース濃度の減少速度を測定するフルクトース負荷試験が従来より知られており、肝予備能の評価の他、良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等の、フルクトース代謝能が低下している疾患の診断に用いられている。フルクトース負荷試験がかかる各疾患の検査や診断に用いられるのは、フルクトースが肝臓特異的な酵素により代謝されることによる（現代の生化学、坪井昭三、佐藤清美、中島邦夫編、金原出版刊）。しかしながら、本試験は、良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等のフルクトース代謝疾患の診断には現在も用いられているものの（木崎義郎、澤田淳、日本臨床増刊、現代臨床機能検査上巻、1997年刊、239）、肝機能の評価にはフルクトースの血管からの拡散や腎からの排泄などの要素が加わり、必ずしも肝臓における代謝量を反映しないことから（木崎義郎、澤田淳、日本臨床増刊、現代臨床機能検査上巻、1997年刊、239；平山千里他、総合臨床 17 、2083）、現在はほとんど用いられていない。また、本試験の肝予備能の評価への利用の一例として、フルクトース負荷後、肝臓内の高エネルギーリン酸化合物の動態を³¹P-MRSを用いて非侵襲に測定することが報告されているが（相野田隆雄他、箱根シンポジウム５、152 、1993、中外医学社刊）、装置が高価であり、また操作が繁雑であることから実用化には至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、肝臓の障害程度および肝予備能を、被験者の状態に関わらず安全かつ簡便に評価することのできる、肝機能診断剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、少なくとも１以上の特定位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトースを投与し、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率を測定することにより肝機能疾患を正確に診断することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、少なくとも１以上の特定位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトースを含む肝機能診断剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の肝機能診断剤のフルクトースは、その１〜６位の炭素のうち、少なくとも１以上の特定位の炭素が¹³Ｃで置換されたものであればよいが、好適には１位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトース、２位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトースである。
【０００９】
フルクトースは通常の食物にも含まれ、輸液にも栄養源として積極的に添加される糖であり、また¹³Ｃは安定同位体であるので放射性同位体と異なり放射線被曝の危険も一切ないので、¹³Ｃ−置換フルクトースを含む本剤の安全性に問題はない。
【００１０】
本発明の肝機能診断剤を用いる検査は、これを被験者に単回投与あるいは持続投与し、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率を測定する呼気テストにより行う。具体的には、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば５分、１０分、１５分）経過後における呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ（‰))、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ（‰))の経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから肝機能の評価を行う。さらに、かかる呼気テストによる評価は、単独でも有用であるが、ビリルビン値等と組み合わせて総合的に判断することがより好ましい。
【００１１】
ここで、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS)、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法で行うことができる。
【００１２】
また、¹³Ｃで置換される炭素位の違いによってそれぞれ特有の評価を行うことが可能である。たとえば、１−¹³Ｃ−フルクトース、２−¹³Ｃ−フルクトースは検査を行った時点での肝臓の障害程度および肝予備能を的確に評価できることから、ドラスティックに肝臓の状態が変化する外科手術前後での予後の良否の判断等に有用である。１−¹³Ｃ−フルクトースはさらに健常者から肝機能障害患者を検出することにも用いることができる。
【００１３】
本発明の肝機能診断剤は、上記の少なくとも１以上の特定位の炭素が¹³Ｃで置換されたフルクトース（以下、置換フルクトースという）を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。注射剤の場合、一般に水、生理食塩水、各種緩衝液が望ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いたり、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解して投与することもできる。
【００１４】
製剤中における置換フルクトースの含量は、製剤の種類により異なるが、通常10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の場合には、通常１〜40重量％となるよう置換フルクトースを添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉剤の場合は、置換フルクトースの含量は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１５】
本発明の肝機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の¹³ＣＯ₂の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投与量は成人の場合、１〜2000mg/kg 体重程度である。
【００１６】
本発明の肝機能診断剤は、肝硬変、慢性肝炎、急性肝炎、肝ガン等の肝疾患、肝障害の診断、外科手術前後の肝臓の障害程度および肝予備能の評価に利用できるほか、フルクトース負荷試験が利用されている良性果糖尿症、遺伝性果糖不耐症、フルクトース-1,6- ビスホスファターゼ欠損症等の、フルクトース代謝能が低下している疾患の診断にも利用できる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの何ら限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
〔実施例１〕
本発明に使用する置換フルクトースの¹³Ｃ標識位置における¹³Ｃ純度は99 %以上である。その他特に明記しない限り特級試薬を用いた。
尚、実験終了後のラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
【００１８】
［１］方法
(1) 急性肝炎ラットの作成
被験動物として、雄性Sprague-Dawley (SD) ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±２℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育した。8〜10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、ガラクトサミン塩酸塩（200 mg/ml 生理食塩水溶液）を 1〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Koff, S. et al., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (1971) ; Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9, 279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発のための試験・実験法、内貴正治監修、126 (1993)] 。2 日後に尾静脈採血を行い血清を分離し、富士ドライケム FDC5500 [（株）富士写真フィルム] により総ビリルビン値を測定した。
【００１９】
(2) ¹³Ｃ−呼気テスト
(1)で作成した急性肝炎ラットと健常ラットについて、以下の呼気テストを実施した。
ネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔したラットを手術台に固定し、頭部に呼気吸引用のキャップを被せた。ストロークポンプ [バリアブル・ストロークポンプ VS-500、（株）柴田科学工業] を用いて呼気を約 100 ml/min の速度で吸引¹³ＣＯ₂アナライザー EX-130S [（株）日本分光] のフローセルに導入した。呼気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはシリカゲルを充填したカラムを設置して呼気中の水蒸気を除去した。
【００２０】
¹³ＣＯ₂アナライザーから出力されるデータはＡＤ変換した後パーソナルコンピュータ（Apple Power Macintosh 8500）に取込み、データ処理ソフトウェア Lab VIEW (National Instruments)を用いて 5秒間隔で 100msec毎 10 点のデータを積算平均し、¹³Ｃatom%、Δ¹³Ｃ（‰)、炭酸ガス濃度（%)に変換することで連続測定¹³Ｃ−呼気テストを行った。変換したデータはリアルタイムで画面表示した後、ハードディスク中に保存した。１−¹³Ｃ−フルクトース（ICON社より購入) は生理食塩水に溶解して（100 mg/ml)大腿静脈より 50 mg/kg 投与した。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００２１】
［２］結果
健常ラット(n = 4）では１−¹³Ｃ−フルクトース投与後 15 分までΔ¹³Ｃ（‰)値が増加し続けた（図１）。急性肝炎ラット(n = 4）の場合も同様に 15 分までΔ¹³Ｃ（‰)値が増加し続けたが、各時間において健常ラットと比べて有意に低く、15分におけるΔ¹³Ｃ（‰)値は、健常ラットで59.6± 6.45 ‰、急性肝炎ラットで 45.7 ± 3.89 ‰であった。
【００２２】
したがって、１−¹³Ｃ−フルクトース投与後一定時間後のΔ¹³Ｃ（‰)値、あるいは、投与後のΔ¹³Ｃ（‰)値の増加の傾きから肝機能障害を検出することが可能である。
【００２３】
〔実施例２〕
［１］方法
(1) 部分肝臓切除術
被験動物として、雄性Wistar系ラットを、日本チャールズリバー社より購入した。購入したラットは、23±2 ℃、湿度 55 ±10 %の条件で使用時まで飼育し、体重260± 20 g のラットを実験に用いた。
【００２４】
8〜10週齢のラットにネンブタール腹腔内投与（50 mg/kg）で麻酔後、大腿静脈より5 % ブドウ糖輸液と分枝鎖アミノ酸輸液（アミノレバン、大塚製薬製）を 3：1 に混合した輸液 10 ml中に１−¹³Ｃ−フルクトース、または２−¹³Ｃ−フルクトース（ICON社より購入) を 60 mgを添加し、5 ml/ kg/hour でシリンジポンプによる持続点滴を施行した。点滴開始から 90 分後に開腹し、Higgins and Andersonの方法（Archives of Pathology 12, 183, 1931)に従い肝臓を 2 / 3切除した。肝臓切除は、Pringle 法で15分虚血を加えた群（虚血15分群）、30分虚血を加えた群（虚血30分群）の2群に分けて施行した。
【００２５】
(2) ¹³Ｃ−呼気テスト
手術台に固定した上記ラットの頭部に円筒形のキャップを被せ、炭酸ガス計CAPSTAR-100(CWE, Inc) を用いて呼気を吸引し、肝臓部分切除前は 10 分間隔で、切除後は20分間隔でハミルトンシリンジで呼気を１回につき約25μｌ採取し（図２）、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度をガスクロマトグラフ−質量分析計（GC-MS)にて測定した。 GC-MSの分析条件は下記の通りである。呼気テスト中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントローラー TR-100 (Fine Science Tools INC.）により、37± 0.5℃に維持した。また、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００２６】

【００２７】
[¹³Ｃ濃度計算方法]
酸素同位体存在比を天然存在比とし、m/z=45, 46のイオンピーク面積より¹³Ｃ濃度を下式により算出した。m/z=45, 46の面積比 (A45/A46)をａとする（特開平7-120434号に基づく）。
【００２８】
【式１】
¹³C濃度(%) ＝｛(0.004176-0.0007462a)/(0.9944396＋0.0034298a) ｝×100
【００２９】
[Δ¹³Ｃ（‰）計算方法]
各時点の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度(¹³C tmin)とCO₂標準ガスの¹³Ｃ濃度( ¹³C std)から下式により算出した。
【００３０】
【式２】
Δ¹³C （‰）＝｛(¹³C tmin-¹³C 0min)/¹³C std ｝×1000
【００３１】
(3) ＤＮＡ合成期細胞率の測定
術後24時間後にブロモデオキシウリジン（BrdU）（細胞増殖検出キット、アマシャム社製）を腹腔内投与し、投与1時間後に開腹し肝臓を摘出しホルマリン固定後、抗BrdU抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。
【００３２】
［２］結果
(1) ＤＮＡ合成期細胞率
肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率（BrdU取込み陽性細胞率）は、肝再生が良好に進行しているかどうかの指標として用いられており、この値が高いほど肝再生が良好に進行していると判定される（箱根シンポジウム4、1991、中外医学社刊）。虚血15分群と虚血30分群でこの肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率を比較すると、虚血30分群では虚血15分群と比べて大きく低下していた（図３）。この結果は、虚血30分群では、長時間の虚血処置により肝臓が障害を受けて肝再生の能力、すなわち、肝予備能が低下したことを示している。
【００３３】
(2) ¹³Ｃ−呼気テスト
１−¹³Ｃ−フルクトース持続投与開始後のΔ¹³Ｃ（‰）値は、肝切除を施行した90分までほぼ直線的に増加を続けたが、増加の傾きは個体間で異なった（図４）。そこで、個体間のばらつきを補正するために、Δ¹³Ｃ（‰）値が直線的に増加した肝切除前（投与開始から90分まで）の変化の一次近似直線を外挿し、外挿Δ¹³Ｃ（‰）値と実測値との差を求めることで、肝部分切除後のΔ¹³Ｃ（‰）値の経時変化の挙動を比較した（図５）。その結果、Δ¹³Ｃ（‰）値は、肝切除後24時間におけるDNA合成期細胞率の結果から（図２）、肝臓の障害により肝予備能が低下していたことが示されている虚血30分群では虚血15分群と比べて外挿した一次近似直線から大きく低下していた。２−¹³Ｃ−フルクトースを持続投与した場合も同様なデータ処理を行うと、１−¹³Ｃ−フルクトースの場合と同様に、虚血30分群では虚血15分群と比べて外挿した一次近似直線から大きく低下していた（図６）。したがって、１−¹³Ｃ−フルクトース、または２−¹³Ｃ−フルクトースを持続投与して呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ（‰））の経時変化を測定することで、その時点での肝予備能、肝障害の程度を評価できると考えられる。
【００３４】
〔製剤例１〕（注射剤）
１−¹³Ｃ−フルクトース１０重量部に対し、生理食塩水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
【００３５】
〔製剤例２〕（内服液剤）
２−¹³Ｃ−フルクトース１０重量部に対し、精製水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、被験者の身体的負担が小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作用がなく安全に使用できる肝機能診断剤が提供される。本発明の肝機能診断剤は、検査を行った時点での肝障害程度や肝予備能の評価、術後の予後の良否の判断に有用である。
【００３７】
さらに、本発明の肝機能診断剤によれば、フルクトースが肝臓特異的な酵素によって代謝された後に初めて¹³ＣＯ₂が生じるため、肝臓における代謝量を正確に反映しない従来のフルクトース負荷試験の問題が解決されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１−¹³Ｃ−フルクトース投与後の呼気中¹³ＣＯ₂の増加を示す。
【図２】ラットの呼気回収法の模式図を示す。
【図３】肝切除24時間後のBrdU取込み陽性率を示す。
【図４】１−¹³Ｃ−フルクトース持続投与時の呼気中¹³ＣＯ₂の増加を示す。
【図５】１−¹³Ｃ−フルクトース持続投与時の部分肝切除後のΔ¹³Ｃ（‰）経時変化の挙動を示す。
【図６】２−¹³Ｃ−フルクトース持続投与時の部分肝切除後のΔ¹³Ｃ（‰）経時変化の挙動を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a liver function diagnostic agent, and more particularly to a liver function diagnostic agent comprising fructose in which at least one or more specific carbons are substituted with ¹³ C.
[0002]
[Prior art]
For screening for hepatic dysfunction, blood biochemical tests that quantify enzymes such as transaminases (GPT and GOT), alkaline phosphatase (ALP), and lactate dehydrogenase (LDH) in blood are generally performed. These enzymes leak into the blood from liver tissue during liver injury. Among them, GPT and GOT are enzymes mainly present in the liver and are excellent indicators for sensitive detection of liver damage because they are significantly higher in liver function disorders while being low in normal blood levels. . However, when chronic hepatitis or liver cirrhosis in which liver function is remarkably reduced, the amount of enzyme in the liver tissue is reduced, so the amount of leaked enzyme is also reduced, and although the degree of injury is high, it does not show a high value (Today's medical CD-ROM Vol.6, published by Medical School). In addition, since it takes time for the leaked enzyme to disappear from the blood, it may show a high value even if it recovers from liver dysfunction at the time of the test. Therefore, quantification of these enzymes is insufficient as a test method for evaluating the degree of liver dysfunction.
[0003]
In particular, during liver surgery, it is very important to evaluate the degree of liver damage and liver reserve (Gastrointestinal Practice 1 Diagnostic approach for liver damage, edited by Akiyuki Okubo, published by Bunkodo). Serum bilirubin and ICG tolerance tests are mainly used to evaluate the degree of liver damage, and ICG tolerance tests and arterial ketone body ratio measurements are mainly used to evaluate liver reserve. However, each of these test methods has its own problems (Gastrointestinal Practice 1 Diagnostic approach to liver damage, edited by Akiyuki Okubo, published by Bunkodo). For example, an increase in serum bilirubin does not necessarily mean a decrease in liver function, and it is difficult to follow a process in which the liver function changes drastically in a short period of time such as after surgery. The ICG tolerance test competes with bilirubin when ICG is taken up by hepatocytes, so reliable results cannot be obtained when bilirubin is elevated. Since ketone body measurement requires arterial blood collection, there is a danger if blood coagulation ability is greatly reduced due to a decrease in liver function, and there is also a problem that there is a large variation between measurement facilities. Under such circumstances, there is a demand for means capable of safely and simply evaluating the degree of liver damage and liver reserve at the time of examination regardless of the condition of the subject.
[0004]
On the other hand, a fructose tolerance test that measures the rate of decrease in blood fructose concentration after administration of fructose has been known. In addition to evaluating liver reserve, benign fruit diabetes, hereditary fructose intolerance, fructose-1 , 6-bisphosphatase deficiency, etc., used for diagnosis of diseases in which fructose metabolic ability is reduced. The fructose tolerance test is used for the examination and diagnosis of each disease. Fructose is metabolized by liver-specific enzymes (modern biochemistry, Shozo Tsuboi, Kiyomi Sato, Kunio Nakajima, published by Kanehara Publishing). . However, although this study is still used for the diagnosis of fructose metabolic diseases such as benign fruit diabetes, hereditary fructose intolerance, and fructose-1,6-bisphosphatase deficiency (Yoshio Kizaki, Satoshi Sawada) , Japan Clinical Extra Number, Modern Clinical Function Test, Volume 1, 1997, 239), because liver function evaluation includes factors such as diffusion of fructose from blood vessels and excretion from the kidney, and does not necessarily reflect the amount of metabolism in the liver (Yoshiki Kizaki, Kaoru Sawada, Japanese Clinical Extra Number, Modern Clinical Function Test, Volume 1, 1997, 239; Chisato Hirayama et al., General Clinic 17, 2083), currently rarely used. In addition, as an example of the use of this study for the evaluation of liver reserve, it has been reported that the dynamics of high-energy phosphate compounds in the liver can be measured non-invasively using ³¹ P-MRS after fructose loading. (Takao Ainoda et al., Hakone Symposium 5, 152, 1993, published by Chugai Medical Co., Ltd.) has not been put into practical use because of its expensive equipment and complicated operation.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The subject of this invention is providing the liver function diagnostic agent which can evaluate the disorder | damage | failure degree and liver reserve ability of a liver safely and simply irrespective of a test subject's state.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have result of intensive studies to solve the above problems, administering fructose carbon of at least one or more specific positions is substituted with ¹³ C, the rate of increase of ¹³ C levels in exhaled CO ₂ It has been found that liver function diseases can be accurately diagnosed by measurement, and the present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention is a liver function diagnostic agent comprising fructose in which at least one specific carbon is substituted with ¹³ C.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
The fructose of the liver function diagnostic agent of the present invention may be any one in which at least one or more specific-position carbons are substituted with ¹³ C among the 1- to 6-position carbons. Is fructose substituted with ¹³ C, and fructose in which the carbon at the 2-position is substituted with ¹³ C.
[0009]
Fructose is a sugar that is also included in normal foods and is actively added as a nutrient source to infusions. Since ¹³ C is a stable isotope, there is no risk of radiation exposure unlike radioisotopes. There is no problem with the safety of this drug containing ¹³ C-substituted fructose.
[0010]
The test using the liver function diagnostic agent of the present invention is carried out by an exhalation test in which this is administered to a subject once or continuously, and an increase rate of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after the administration is measured. Specifically, the ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after administration is measured, and the rate of increase in ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after a certain period of time (eg, 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes) after administration ( Δ ¹³ C (‰)), or the change over time (Δ ¹³ C (‰)) of the increase rate of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ up to a certain time after administration (rise slope, change in slope, peak time, etc. ) To evaluate liver function. Furthermore, evaluation by such a breath test is useful alone, but it is more preferable to make a comprehensive judgment in combination with a bilirubin value or the like.
[0011]
Here, measurement of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ is performed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), infrared spectroscopy, mass spectrometry, photoelectric acoustic spectroscopy, NMR (nuclear magnetic resonance) method. be able to.
[0012]
In addition, it is possible to perform a unique evaluation depending on the difference in carbon position substituted with ¹³ C. For example, ^1-13 C-fructose, ^2-13 C-fructose because it can evaluate accurately disability levels and hepatic functional reserve of the liver at the time of performing the examination, surgery before and after the change drastically liver condition This is useful for determining the prognosis of the prognosis. ^1-13 C-fructose can also be used to further detect liver dysfunction patients from healthy subjects.
[0013]
The agent for diagnosing liver function of the present invention comprises the above-mentioned fructose in which at least one or more specific carbons are substituted with ¹³ C (hereinafter referred to as substituted fructose) alone or mixed with an excipient or a carrier. Depending on the dosage form, it is formulated into oral preparations (tablets, capsules, powders, granules, liquids, etc.), injections and the like. The excipient or carrier may be any one that is conventionally used in the art and is pharmaceutically acceptable, and the type and composition thereof are appropriately changed depending on the administration route and administration method. For example, water is used as the liquid carrier. As the solid carrier, cellulose derivatives such as hydroxypropyl cellulose, organic acid salts such as magnesium stearate, and the like are used. In the case of injections, water, physiological saline and various buffer solutions are generally desirable. Further, it can be used as an oral preparation as a lyophilized preparation, or it can be administered after being dissolved in an appropriate solvent for injection such as sterile water, physiological saline, electrolyte solution or the like at the time of administration.
[0014]
The content of substituted fructose in the preparation varies depending on the kind of preparation, but is usually 10 to 100% by weight, preferably 50 to 100% by weight. For example, in the case of injections, substituted fructose may be added so that it is usually 1 to 40% by weight. In the case of capsules, tablets, granules, and powders, the content of substituted fructose is about 10 to 100% by weight, preferably 50 to 100% by weight, and the balance is the carrier.
[0015]
The dose of the liver function diagnostic agent of the present invention is required to be an amount capable of confirming an increase in ¹³ CO _{2 in} exhaled breath by administration, and varies depending on the patient's age, weight, and examination purpose, for example, the dose per dose Is about 1 to 2000 mg / kg body weight for adults.
[0016]
The liver function diagnostic agent of the present invention can be used for liver disease such as cirrhosis, chronic hepatitis, acute hepatitis, and liver cancer, diagnosis of liver damage, evaluation of liver damage before and after surgery and liver reserve, and fructose load. It can also be used for diagnosis of diseases in which fructose metabolic ability is reduced, such as benign fruit diabetes, hereditary fructose intolerance, and fructose-1,6-bisphosphatase deficiency.
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
[0017]
【Example】
[Example 1]
The ¹³ C purity at the ¹³ C labeling position of the substituted fructose used in the present invention is 99% or more. Unless otherwise specified, special grade reagents were used.
In addition, the rat after completion | finish of experiment administered the excess amount of Nembutal, and was sacrificed.
[0018]
[1] Method
(1) Preparation of acute hepatitis rats Male Sprague-Dawley (SD) rats were purchased from Charles River, Japan as test animals. The purchased rats were bred until use under conditions of 23 ± 2 ° C. and humidity of 55 ± 10%. The rats aged 8-10 weeks were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal (50 mg / kg), and then galactosamine hydrochloride (200 mg / ml saline solution) was intraperitoneally administered 1-1.2 g / kg [Koff, S et al., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (1971); Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9, 279 (1968); Testing and experimental methods for development, supervised by Masaharu Uchi, 126 (1993)]. Two days later, blood was collected from the tail vein, and the serum was separated, and the total bilirubin level was measured with Fuji Drychem FDC5500 [Fuji Photo Film Co., Ltd.].
[0019]
(2) ¹³ C-Breath test
The following exhalation tests were performed on acute hepatitis rats and healthy rats prepared in (1).
Rats anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal (50 mg / kg) were fixed to the operating table, and a cap for exhalation was placed on the head. Using a stroke pump [Variable Stroke Pump VS-500, Shibata Kagaku Kogyo Co., Ltd.], breath is introduced at a rate of approximately 100 ml / min. ¹³ CO ₂ Analyzer EX-130S [JASCO Corporation] flow cell did. A column filled with silica gel was installed between the cap for exhalation and the stroke pump to remove water vapor in the exhalation.
[0020]
¹³ Data output from the CO ₂ analyzer is A / D converted and imported into a personal computer (Apple Power Macintosh 8500). Using the data processing software Lab VIEW (National Instruments), 10 points of data are averaged every 100 msec at 5-second intervals. Then, a continuous measurement ¹³ C-expiration test was performed by converting into ¹³ Cattom%, Δ ¹³ C (‰), and carbon dioxide gas concentration (%). The converted data was displayed on the screen in real time and then saved on the hard disk. ^1-13 C-fructose (purchased from ICON Co.) was 50 mg / kg dose than dissolved to (100 mg / ml) the femoral vein in saline. During the breath test, rectal temperature was monitored and maintained at 37 ± 0.5 ° C. with a small animal body temperature controller TR-100 (Fine Science Tools INC.). The carbon dioxide concentration in the exhaled breath was maintained at 3 ± 0.5%.
[0021]
[2] Results healthy rats (n = 4) in ^1-13 C-fructose until 15 minutes after the administration delta ¹³ C (‰) value continued to increase (Figure 1). Although ¹³ C (‰) value delta to 15 minutes in the same manner in the case of acute hepatitis rats (n = 4) continued to increase, significantly lower than the normal rats at each time, at 15 minutes Δ ¹³ C (‰ ) Values were 59.6 ± 6.45 ‰ in healthy rats and 45.7 ± 3.89 ‰ in acute hepatitis rats.
[0022]
Therefore, it is possible to detect liver dysfunction from the Δ ¹³ C (‰) value after a certain period of time after administration of 1 ¹³ C-fructose or the slope of increase in Δ ¹³ C (‰) value after administration. .
[0023]
[Example 2]
[1] Method
(1) Male Wistar rats were purchased from Charles River Japan as a partial hepatectomy test animal. The purchased rats were raised until use under conditions of 23 ± 2 ° C. and humidity of 55 ± 10%, and rats weighing 260 ± 20 g were used for the experiment.
[0024]
8-10 week-old rats were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal (50 mg / kg), then mixed with 5% glucose infusion and branched chain amino acid infusion (aminolevan, manufactured by Otsuka Pharmaceutical) 3: 1 from the femoral vein. during 10 ml ^1-13 C-fructose or ^2-13 C-fructose, (purchased from ICON Ltd.) was added 60 mg, underwent continuous infusion by syringe pump at 5 ml / kg / hour. After 90 minutes from the start of infusion, the abdomen was opened, and the liver was excised 2/3 according to the method of Higgins and Anderson (Archives of Pathology 12, 183, 1931). Liver resection was performed in two groups, the group that was subjected to 15-minute ischemia by the Pringle method (the ischemic 15-minute group) and the group that was subjected to 30-minute ischemia (the 30-minute ischemic group).
[0025]
(2) Put the cylindrical cap on the head of the rat fixed on the ¹³ C-exhalation test operating table, and inhale the exhalation using the carbon dioxide meter CAPSTAR-100 (CWE, Inc). About 25 μl of exhaled breath was collected with a Hamilton syringe at 10 min intervals and 20 min after excision (Fig. 2), and the ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ was transferred to a gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS). Measured. The analytical conditions for GC-MS are as follows. During the breath test, rectal temperature was monitored and maintained at 37 ± 0.5 ° C. with a small animal body temperature controller TR-100 (Fine Science Tools INC.). The carbon dioxide concentration in the exhaled breath was maintained at 3 ± 0.5%.
[0026]

[0027]
[ ^13C concentration calculation method]
The oxygen isotope abundance ratio was taken as the natural abundance ratio, and the ¹³ C concentration was calculated from the ion peak area at m / z = 45, 46 by the following equation. The area ratio (A45 / A46) of m / z = 45, 46 is assumed to be a (based on Japanese Patent Laid-Open No. 7-120434).
[0028]
[Formula 1]
¹³ C concentration (%) = {(0.004176-0.0007462a) / (0.9944396 + 0.0034298a)} × 100
[0029]
[Δ ¹³ C (‰) calculation method]
It was calculated by the following equation from the ¹³ C concentration of ¹³ C concentration ⁽¹³ C tmin) and the CO ₂ standard gas exhaled CO ₂ at each time point ⁽¹³ C std).
[0030]
[Formula 2]
Δ ¹³ C (‰) = {( ¹³ C tmin- ¹³ C 0 min) / ¹³ C std} × 1000
[0031]
(3) Measurement of cell rate during DNA synthesis 24 hours after the operation, bromodeoxyuridine (BrdU) (cell proliferation detection kit, manufactured by Amersham) was intraperitoneally administered. After 1 hour of administration, the abdomen was opened and the liver was removed and formalin fixed. Immunohistochemical staining using an anti-BrdU antibody was performed.
[0032]
[2] Results
(1) DNA synthesis phase cell rate DNA synthesis phase cell rate (BrdU uptake positive cell rate) 24 hours after hepatectomy is used as an indicator of whether liver regeneration is progressing well, and this value is high It is determined that liver regeneration is progressing well (Hakone Symposium 4, 1991, published by Chugai Medical). Compared with the 15-minute ischemic group and the 30-minute ischemic group, the cell rate during DNA synthesis at 24 hours after hepatectomy was significantly lower in the 30-minute ischemic group than in the 15-minute ischemic group (FIG. 3). This result shows that in the ischemia 30 minute group, the liver was damaged by the ischemia treatment for a long time, and the liver regeneration ability, that is, the liver reserve ability was reduced.
[0033]
(2) ¹³ C-Breath Test 1 ¹³ C-fructose Δ ¹³ C (‰) value after the start of continuous administration continued to increase almost linearly until 90 minutes after hepatectomy, but the slope of the increase It varied between individuals (Fig. 4). Therefore, in order to correct the variation among individuals, a first-order approximation line of the change before hepatectomy (from the start of administration to 90 minutes) in which the Δ ¹³ C (‰) value increased linearly was extrapolated, and extrapolation Δ ¹³ By calculating the difference between the C (‰) value and the measured value, the behavior of the Δ ¹³ C (‰) value over time after partial hepatectomy was compared (FIG. 5). As a result, the Δ ¹³ C (‰) value was shown from the result of the cell rate during DNA synthesis at 24 hours after hepatectomy (FIG. 2). Compared with the 15-minute ischemic group, the 30-minute blood group showed a significant decrease from the extrapolated linear approximation line. ^2-13 C-fructose Doing sustained administration also similar data processing if, ^1-13 C-as in the case of fructose, primary approximate line extrapolated compared to 15 min group ischemia 30 min group ischemia (Fig. 6). Thus, by measuring the time course of ^1-13 C-fructose, or ^2-13 C-fructose sustained administration to the rate of increase in ¹³ C concentration in exhaled _{^{CO 2 (Δ 13 C (‰}} )), the It is considered that hepatic reserve ability and degree of liver damage at the time can be evaluated.
[0034]
[Formulation Example 1] (Injection)
^1-13 to C- fructose 10 parts by weight, 100 parts by weight of the total amount of physiological saline was added, and sterilization filtration using a dissolved after Millipore filter it. The filtrate was taken in a vial and sealed to obtain an injection.
[0035]
[Formulation Example 2] (Internal solution)
Purified water was added to 10 parts by weight of 2 ¹³ C-fructose to make the total amount 100 parts by weight, and this was dissolved and then sterilized by filtration using a Millipore filter. The filtrate was taken in a vial and sealed to obtain an internal solution.
[0036]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the liver function diagnostic agent which a test subject's physical burden is small, can know an exact test result immediately, can be used safely without a side effect is provided. The liver function diagnostic agent of the present invention is useful for the evaluation of the degree of liver damage and liver reserve at the time of examination, and the determination of the prognosis after surgery.
[0037]
Furthermore, according to the liver function diagnostic agent of the present invention, since ¹³ CO ₂ is produced only after fructose is metabolized by a liver-specific enzyme, there is a problem of the conventional fructose load test that does not accurately reflect the metabolic amount in the liver. It can be solved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an increase in exhaled ¹³ CO ₂ after administration of 1 ¹³ C-fructose.
FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for collecting exhaled breath in rats.
FIG. 3 shows BrdU uptake positive rate 24 hours after hepatectomy.
[4] ^1-13 C-show an increase in breath ¹³ CO ₂ during fructose continuous administration.
[5] ^1-13 C-fructose continuous administration during partial hepatectomy after Δ ¹³ C (‰) shows the behavior of aging.
FIG. 6 shows the behavior of Δ ¹³ C (‰) over time after partial hepatectomy during continuous administration of 2 ¹³ C-fructose.

Claims

A liver function diagnostic agent comprising fructose in which carbon at the 1-position or the 2-position is substituted with ¹³ C, for measuring ¹³ CO _{2 in} exhaled breath .

A fructose metabolic disease diagnostic agent comprising fructose in which carbon at the 1-position or the 2-position is substituted with ¹³ C, for measuring ¹³ CO _{2 in} exhaled breath .