JP3862304B2 - Sustained release formulation - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドセリン拮抗物質を除く水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩と生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性物質、特にペプチドまたはその誘導体は生体において種々の薬理作用を示すことが知られており、この内いくつかについては化学合成あるいは遺伝子工学、細胞工学の手法の発達により大腸菌、酵母、動物細胞、あるいはハムスターなどの生体を用いて大量に生産させ、医薬品としての応用が図られている。しかしながら、これらのペプチドは一般的に生体内での半減期が短いために、頻回投与が必要であり注射に伴う患者の肉体的負担は無視できないものがある。この問題を解決するために徐放性製剤を開発する種々の試みがなされている。
水溶性生理活性物質、特に水溶性ペプチド（以下単にペプチドと称することもある）の徐放性製剤を開発するときの第１の問題点はペプチドの溶解性をいかにしてコントロールするかにある。即ち、ペプチドの放出速度を抑制することである。
特表平３−５００２８６号には不溶性亜鉛−プロタミン−α−インターフェロン複合体が開示されている。
また、特開昭６３−２９３０号には、ポリラクチドに巨大分子ポリペプチドを分散させたシステムが開示されている。
特開平５−２２１８５５号および特開平６−１７２２０８号には水溶性ペプチドを水不溶性のペプチド塩に変換し、生体内分解性高分子重合物を含有する有機媒体に懸濁することにより水溶性ペプチドを効率良く微小球に取り込ませる技術が開示されている。該公報において用いられる水不溶性ペプチドは水溶性ペプチド分子内部の塩基性部に対する有機酸塩であり、パモエート、タンニン酸、ステアリン酸、またはパルミチン酸塩である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように水溶性生理活性物質の徐放性製剤を製造する種々の試みがなされているものの、まだ満足できるものはなく、水溶性生理活性物質の封入効率が高く、投与後初期の水溶性生理活性物質の漏出が抑制され、水溶性生理活性物質放出速度が一定で、しかも水溶性生理活性物質が安定である徐放性製剤の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の問題点を解決するため鋭意研究をおこなったところ、エンドセリン拮抗物質を除く酸性基を持つ水溶性ペプチド性生理活性物質またはその水溶性塩（以下、単に生理活性物質と称することもある）と水溶性多価金属塩とから生成する生理活性物質の水不溶または水難溶性多価金属塩（以下、単に複合体と称することもある）を製造し、これを生体内分解性ポリマーに分散させることにより、生理活性物質の生体内分解性ポリマー中への取り込み効率が飛躍的に上昇し、生体に投与直後の薬物の漏出も少ない徐放性製剤が得られることを見いだした。この知見に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）エンドセリン拮抗物質を除く水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩と生体内分解性ポリマーとを含有してなる徐放性製剤、（２）生理活性物質が水溶性ペプチドまたはその誘導体である前記（１）記載の徐放性製剤、
（３）ペプチドがホルモン、サイトカイン、増血因子、増殖因子、酵素、可溶性または可溶化受容体、抗体、ペプチド性抗原、血液凝固因子または接着因子である前記（２）記載の徐放性製剤、
（４）生理活性物質がホルモンである前記（１）記載の徐放性製剤、
（５）ホルモンが成長ホルモンである前記（４）記載の徐放性製剤、
（６）ホルモンがインスリンである前記（４）記載の徐放性製剤、
（７）生理活性物質がサイトカインである前記（１）記載の徐放性製剤、
（８）サイトカインがインターフェロンである前記（７）記載の徐放性製剤、
（９）生理活性物質が増殖因子である前記（１）記載の徐放性製剤、
（１０）多価金属塩が遷移金属塩である前記（１）記載の徐放性製剤、
（１１）多価金属塩が亜鉛塩である前記（１）記載の徐放性製剤、
（１２）多価金属塩の水に対する溶解度が２０℃で約０ないし約０．１％（ｗ／ｗ）である前記（１）記載の徐放性製剤、
（１３）多価金属塩の水に対する溶解度が約０ないし約０．０１％（ｗ／ｗ）である前記（１）記載の徐放性製剤、
（１４）多価金属塩を約０．１ないし約５０％（ｗ／ｗ）含有してなる前記（１）記載の徐放性製剤、
（１５）多価金属塩を約０．１ないし約３０％（ｗ／ｗ）含有してなる前記（１）記載の徐放性製剤、
（１６）生体内分解性ポリマーが脂肪族ポリエステルである前記（１）記載の徐放性製剤、
（１７）脂肪族ポリエステルが乳酸及びグリコール酸の重合体である前記（１６）記載の徐放性製剤、
（１８）乳酸及びグリコール酸の組成比（モル／モル％）が１００／０ないし約４０／６０である前記（１７）記載の徐放性製剤、
（１９）組成比（モル／モル％）が約９０／１０ないし約４５／５５である前記（１８）記載の徐放性製剤、
（２０）重合体の重量平均分子量が約３，０００ないし約２０，０００である前記（１７）記載の徐放性製剤、
（２１）重合体の重量平均分子量が約３，０００ないし約１４，０００である前記（１７）記載の徐放性製剤、
（２２）脂肪族ポリエステルが乳酸の単独重合物である前記（１６）記載の徐放性製剤、
（２３）単独重合物の重量平均分子量が約３，０００ないし約２０，０００である前記（２２）記載の徐放性製剤、
（２４）単独重合物の重量平均分子量が約３，０００ないし約１４，０００である前記（２２）記載の徐放性製剤、
（２５）マイクロカプセルである前記（１）記載の徐放性製剤、
（２６）マイクロカプセルが注射用である前記（２５）記載の徐放性製剤、
（２７）注射用である前記（１）記載の徐放性製剤、
（２８）徐放性製剤の製造のためのエンドセリン拮抗物質を除く水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩および生体内分解性ポリマーの使用、及び
（２９）エンドセリン拮抗物質を除く水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩を生体内分解性ポリマーを含む油相に分散しｓ／ｏ型エマルションを調製し、ｓ／ｏ型エマルションを水相に添加しｓ／ｏ／ｗ型エマルションを調製し、次いでｓ／ｏ／ｗ型エマルションを水中乾燥に付すことを特徴とする徐放性製剤の製造法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本明細書において、アミノ酸，ペプチド等に関し、略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ コミッション・オン・バイオケミカル・ノーメンクレーチャー（Commission on Biochemical Nomenclature）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものとし、また、アミノ酸に光学異性体があり得る場合、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩における生理活性物質は、酸性基を持つ生理活性物質である。ここにおいて、酸性基としては、例えばカルボキシル基、スルホ基などが挙げられる。生理活性物質は、好ましくは分子内にペプチド結合を持つか、あるいはアミノ酸を含有し酸性基を持つ生理活性物質である。該酸性基はアミノ酸に由来してもよい。生理活性物質は、さらに好ましくは酸性基を持つペプチドまたはその誘導体である。生理活性物質は、生理活性物質の２５℃で水に対する溶解度は１％（ｗ／ｗ）以上である。
【０００６】
生理活性物質は、二個以上のカルボキシル基を有していることが好ましい。
生理活性物質の分子量は、約２００ないし約２００，０００、好ましくは約２００ないし約５０，０００、さらに好ましくは分子量約５００ないし約４０，０００である。
生理活性物質の活性として代表的なものとしては、ホルモン作用が挙げられる。また、該生理活性物質は天然物、合成物、半合成物、遺伝子工学の産物のいずれでもよいし、さらにこれらの誘導体でもよい。これらの生理活性物質の作用機作は、作動性あるいは拮抗性のいづれでもよい。
本発明の生理活性物質、特に水溶性ペプチドまたはその誘導体としては、例えばホルモン、サイトカイン、造血因子、増殖因子、酵素、可溶性または可溶化受容体、抗体またはそのフラグメント、ペプチド性抗原、血液凝固因子、接着因子あるいは該生理活性物質の受容体に結合しうる作動薬あるいは拮抗薬などが挙げられる。
【０００７】
ホルモンとしては、例えばインスリン，成長ホルモン，ナトリウム利尿ペプチド，ガストリン，プロラクチン，副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），ヒト絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ），モチリン，カリクレインなどが挙げられる。ホルモンは、好ましくはインスリン、成長ホルモンである。
【０００８】
サイトカインとしては、例えばリンホカイン，モノカインなどが挙げられる。リンホカインとしては、例えばインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ），インターロイキン（ＩＬ−２ないしＩＬ−１２）などが挙げられる。モノカインとしては、例えばインターロイキン１（ＩＬ−１），腫瘍壊死因子などが挙げられる。サイトカインは、好ましくはリンホカインであり、さらに好ましくはインターフェロン（アルファ，ベータ，ガンマ）である。
造血因子としては、例えばエリスロポエチン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ），トロンボポエチン，血小板増殖刺激因子，メガカリオサイトポテンシエーターなどが挙げられる。
増殖因子としては、例えば塩基性あるいは酸性の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）あるいはこれらのファミリー（例、ＦＧＦ−９など），神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）あるいはこれらのファミリー，インスリン様成長因子（例、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２など），骨増殖に関与する因子（ＢＭＰ）あるいはこれらのファミリーなどが挙げられる。
酵素としては、例えばスーパーオキシドディスミュターゼ（ＳＯＤ），ティシュープラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）などが挙げられる。
可溶性受容体としては、可溶性インターロイキン６（ＩＬ−６）受容体，インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ），可溶性腫瘍壊死因子受容体，可溶性上皮成長因子受容体，可溶性インターロイキン１受容体などが挙げられる。
可溶化受容体としては、公知の受容体、例えばインターロイキン１受容体，インターロイキン６受容体，腫瘍壊死因子受容体，ファス（Ｆａｓ）リガンド等を遺伝子工学的手法で可溶化したもの等が挙げられる。
抗体としては、例えばヒトモノクーナル抗体，マウス由来の可変部とヒト由来の定常部とからなるヒト−マウスキメラモノクローナル抗体などが挙げられる。抗体のタイプとしては、例えばＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＥなどが挙げられる。抗原としては、例えば前記抗体によって認識されるものなどが挙げられ、さらに血小板、ウイルスなども挙げられる。
血液凝固因子としては、例えば第VIII因子などが挙げられる。
接着因子としては、フィブロネクチン，ＩＣＡＭ−１などが挙げられる。
生理活性物質としては、さらにエンドセリン，Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)、脳下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）なども挙げられる。
【０００９】
生理活性物質は、水溶性多価金属塩と接触させることにより、生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩に変換される。
水溶性多価金属塩における多価金属としては、例えばII価、III価あるいはIV価の金属が挙げられ、具体的にはアルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム等）、遷移金属〔鉄（II価、III価）、銅（II価）、亜鉛（II価）等〕、IIIb属金属〔アルミニウム（II価、III価）等〕、IVb属金属〔スズ（II価、IV価）等〕等が挙げられる。多価金属は、好ましくはアルカリ土類金属または遷移金属、更に好ましくは亜鉛またはカルシウム、特に好ましくは亜鉛である。
水溶性多価金属塩としては、多価金属と酸との塩、例えば多価金属と無機酸との塩または多価金属と有機酸との塩が挙げられる。
多価金属と酸との塩は、好ましくは常温（２０℃）で水に対する溶解度が約２０mg/ml以上の塩、さらに好ましくは溶解度が約１００mg/ml以上の塩、特に好ましくは溶解度が約２００mg/ml以上の塩である。
多価金属と無機酸との塩における無機酸としては、例えば塩酸，硫酸，硝酸，チオシアン酸が挙げられる。
多価金属と有機酸との塩における有機酸としては、例えば脂肪族カルボン酸，芳香族酸が挙げられる。脂肪族カルボン酸は、好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸である。脂肪族カルボン酸としては、例えば脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、脂肪族トリカルボン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、飽和あるいは不飽和のいずれであってもよい。
【００１０】
脂肪族モノカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族モノカルボン酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族モノカルボン酸（例、アクリル酸、プロピオール酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸等）が挙げられる。
脂肪族ジカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸等）および炭素数２ないし９の不飽和脂肪族ジカルボン酸（例、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等）が挙げられる。
脂肪族トリカルボン酸としては、例えば炭素数２ないし９の飽和脂肪族トリカルボン酸（例、トリカルバリル酸、１、２、３−ブタントリカルボン酸等）が挙げられる。
上記した脂肪族カルボン酸は、水酸基を１ないし２個有していてもよく、このような例としては、例えばグリコール酸、乳酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等が挙げられる。
脂肪族カルボン酸は、好ましくは脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸は、さらに好ましくは炭素数２ないし９の脂肪族モノカルボン酸、特に好ましくは炭素数２ないし３の飽和脂肪族モノカルボン酸である。脂肪族カルボン酸の特に好ましい具体例としては、例えば酢酸等が挙げられる。
芳香族酸としては、例えば安息香酸、サリチル酸等が挙げられ、好ましくは安息香酸である。
【００１１】
多価金属と無機酸との塩、すなわち無機酸多価金属塩の具体例を挙げれば、例えばハロゲン化塩（例、塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸塩、硝酸塩、チオシアン酸塩等である。
多価金属と脂肪族カルボン酸との塩、すなわち脂肪族カルボン酸多価金属塩の具体例を挙げれば、例えば酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛、酒石酸亜鉛である。脂肪族カルボン酸多価金属塩の好ましい例を挙げれば、例えば酢酸カルシウム、酢酸亜鉛である。特に好ましい具体例を挙げれば酢酸亜鉛等である。
多価金属と芳香族酸との塩、すなわち芳香族酸多価金属塩の具体例を挙げれば、例えば安息香酸塩、サリチル酸塩等である。特に好ましい具体例を挙げれば安息香酸亜鉛である。
【００１２】
生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩は、生理活性物質と水溶性多価金属塩とを溶媒中で混合することにより製造される。混合操作は、好ましくは水中で行われる。
生理活性物質と水溶性多価金属塩とを水中で混合する際の量比（モル比）は、例えば１：１ないし１：１０００、好ましくは１：１ないし１：１００、より好ましくは１：１ないし１：５０、特に好ましくは１：１ないし１：１０である。また、両者の水中における濃度は、それぞれ単独の溶解度範囲内で、生成する複合体の溶解度以上の濃度であればよい。
上記混合時の水溶液のpHは、生理活性物質の生理活性を損なわず、また、生理活性物質および水溶性多価金属塩それぞれの溶解性を極端に下げないpHが採用される。混合操作は、通常蒸留水中で行われるが、必要に応じて弱酸性、中性または弱アルカリ性に調整した水中で行ってもよい。
本発明における水不溶性または水難溶性とは不可逆的なものではなく、可逆的であり、水に対する溶解度が非常に低いことを意味する。水に対する溶解度としては通常の温度（２０℃）において約０ないし約０．１％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは約０ないし約０．０１％（ｗ／ｗ）である。
このようにして得られた生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩は、必要に応じて真空乾燥あるいは凍結乾燥した後用いられる。
本発明の徐放性製剤中、生理活性物質の水難溶性多価金属塩の含量は、一般的に約０．１％（ｗ／ｗ）ないし約５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）である。
【００１３】
生体内分解性ポリマーとしては、水に難溶または不溶である高分子重合物、例えば脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された単独重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸等）が挙げられる。これらは、適宜の割合で混合して用いてもよい。重合の形式はランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。
生体内分解性ポリマーは、好ましくは脂肪族ポリエステル〔例、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）、ヒドロキシジカルボン酸類（例、リンゴ酸等）、ヒドロキシトリカルボン酸（例、クエン酸等）等の１種以上から合成された単独重合体、共重合体、あるいはこれらの混合物〕である。
上記した脂肪族ポリエステル中、α−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された単独重合体、共重合体が確実な生体内分解性および生体適合性の観点から好ましい。脂肪族ポリエステルは、特に好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸等）の１種以上から合成された共重合体である。また、これらの共重合体は混合して使用されてもよい。
本発明における生体内分解性ポリマーは、自体公知の方法により製造される。
【００１４】
上記α−ヒドロキシカルボン酸類はＤ−体、Ｌ−体、およびＤ、Ｌ−体の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５ないし約２５／７５の範囲のものが好ましい。Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、さらに好ましくは約６０／４０ないし約３０／７０である。
上記α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体の例としてはグリコール酸と他のα−ヒドロキシ酸類との共重合体が挙げられ、該α−ヒドロキシ酸類としては乳酸、２−ヒドロキシ酪酸が好ましい。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体または２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。
α−ヒドロキシカルボン酸類の共重合体は、特に好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体である。
【００１５】
乳酸−グリコール酸共重合体において、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル／モル％）は約１００／０ないし約４０／６０が好ましい。該組成比は、さらに好ましくは約９０／１０ないし約４５／５５である。組成比は、特に好ましくは約８０／４０ないし約４５／５５である。乳酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は約３，０００ないし約２０，０００、好ましくは約３，０００ないし約１４，０００、さらに好ましくは約３，０００ないし１２，０００である。
また、乳酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２から約４．０が好ましい。さらに好ましくは、約１．５から約３．５である。
乳酸−グリコール酸共重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体において、グリコール酸が約１０ないし約７５モル％、残りが２−ヒドロキシ酪酸である場合が好ましい。さらに好ましくは、グリコール酸が約２０ないし約７５モル％の場合である。特に好ましくは、グリコール酸が約３０ないし約７０モル％の場合である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の重量平均分子量は、約２，０００ないし約２０，０００が好ましい。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体の分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は約１．２ないし４．０が好ましい。分散度は、特に好ましくは約１．５ないし３．５である。２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体は公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。該共重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
上記α−ヒドロキシカルボン酸類の単独重合体の好ましい例としては乳酸の単独重合体が挙げられる。
乳酸単独重合体の重量平均分子量は約３，０００ないし約２０，０００、好ましくは約３，０００ないし約１４，０００である。
乳酸単独重合体は、自体公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の方法に従って合成できる。該単独重合体は無触媒脱水重縮合で合成されたものが好ましい。
【００１６】
上記した２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体は、さらにポリ乳酸と混合して使用してもよい。該ポリ乳酸としては、Ｄ−体、Ｌ−体およびこれらの混合物の何れでもよいが、Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）が約７５／２５ないし約２０／８０の範囲のものが好ましい。Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、さらに好ましくは約６０／４０ないし約２５／７５である。Ｄ−体／Ｌ−体（モル／モル％）は、特に好ましくは約５５／４５ないし約２５／７５である。該ポリ乳酸の重量平均分子量は、約１，５００ないし約２０，０００、好ましくは約１，５００ないし約１０，０００である。また、ポリ乳酸の分散度は約１．２ないし約４．０が好ましい。分散度は、特に好ましくは約１．５ないし約３．５である。
ポリ乳酸の製造法については、乳酸の二量体であるラクタイドを開環重合する方法と乳酸を脱水重縮合する方法が知られている。本発明で使用する比較的低分子のポリ乳酸を得るためには、乳酸を直接脱水重縮合する方法が好ましい。該方法は、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載されている。
２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体とポリ乳酸とを混合して使用する場合、その混合比は例えば約１０／９０ないし約９０／１０（重量％）である。混合比は、好ましくは約２０／８０ないし約８０／２０である。混合比は、さらに好ましくは約３０／７０ないし７０／３０である。
【００１７】
本明細書中、重量平均分子量とは、重量平均分子量が１２０，０００、５２，０００、２２，０００、９，２００、５，０５０、２，９５０、１，０５０、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質としてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の分子量をいう。ＧＰＣ測定により数平均分子量も計算される。分散度は重量平均分子量と数平均分子量とから計算される。ＧＰＣ測定はＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ ｘ ２（昭和電工製）、ＲＩモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用し、移動相としてクロロホルムを用いた。
【００１８】
上記した無触媒脱水重縮合で合成される共重合体は、一般的に末端に遊離のカルボキシル基を有する。
本発明において、生体内分解性ポリマーは、好ましくは末端に遊離のカルボキシル基を有する。
末端に遊離のカルボキシル基を有する生体内分解性ポリマーとは、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する生体内分解性ポリマーである。
末端基定量による数平均分子量は、以下のようにして算出される。
約１ｇないし３ｇの生体内分解性ポリマーをアセトン(25 ml)とメタノール(5 ml)との混合溶媒に溶解し、フェノールフタレインを指示薬としてこの溶液中のカルボキシル基を0.05 N アルコール性水酸化カリウム溶液で室温での撹拌下、速やかに滴定して末端基定量による数平均分子量を次式で算出した。
末端基定量による数平均分子量 ＝ 20,000 A／B
Ａ：生体内分解性ポリマーの質量 (g)
Ｂ：滴定終点までに添加した 0.05 N アルコール性水酸化カリウム溶液 (ml)
例えば、１種類以上のα-ヒドロキシ酸類から無触媒脱水重縮合法で合成され、末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体では、ＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致する。これに対し、環状二量体から触媒を用いて開環重合法で合成され、末端に遊離カルボキシル基を本質的には有しない重合体では、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回る。この相違によって末端に遊離のカルボキシル基を有する重合体は末端に遊離カルボキシル基を有しない重合体と明確に区別することができる。
【００１９】
末端基定量による数平均分子量が絶対値であるのに対してＧＰＣ測定による数平均分子量は各種分析、解析条件（例えば移動相の種類、カラムの種類、基準物質、スライス幅の選択、ベースラインの選択等）によって変動する相対値であるため、一義的な数値化は困難であるが、例えばＧＰＣ測定による数平均分子量と末端基定量による数平均分子量とがほぼ一致するとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約０．５倍ないし約２倍の範囲内であることをいう。好ましくは、約０．８倍ないし約１．５倍の範囲内であることをいう。また、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量を大きく上回るとは、末端基定量による数平均分子量がＧＰＣ測定による数平均分子量の約２倍を越える場合をいう。
【００２０】
本発明の徐放性製剤は、生理活性物質と水溶性多価金属塩とを混合して得られる生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩を生体内分解性ポリマーに分散または溶解させることによって製造される。徐放性製剤の製造法としては、例えば水中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法あるいはこれらに準ずる方法などが挙げられる。
以下に、徐放性製剤として、例えばマイクロカプセルを製造する場合の製造方法について記述する。
【００２１】
（イ）水中乾燥法（ｏ／ｗ法）
本方法においては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を作製する。本発明の徐放性製剤の製造の際に使用する有機溶媒は、沸点が１２０℃以下であることが好ましい。該有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等）、アルコール類（エタノール、メタノール）、アセトニトリル等が挙げられる。これらは適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリルである。有機溶媒は、特に好ましくはジクロロメタンである。生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量、有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的には約０．０１ないし約８０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。さらに好ましくは約０．１ないし約７０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１ないし約６０％である。
このようにして得られた生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に、生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩を、必要により凍結乾燥あるいは真空乾燥した後、添加し、溶解させる。この際、複合体の添加量は、複合体：生体内分解性ポリマーの重量比の上限が約１：２まで、好ましくは約１：３までとなるようにする。
ついで、このようにして調製された有機溶媒溶液をさらに水相中に加えて、タービン型攪拌機などを用いてｏ／ｗエマルションを形成させた後、油相溶媒を蒸発させ、マイクロカプセルを製造する。この際の水相体積は一般的には油相体積の約１倍ないし約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２倍ないし約５，０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５倍ないし約２，０００倍から選ばれる。
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般的に安定なｏ／ｗエマルションを形成できるものであれば何れでもよい。乳化剤としては、例えばアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらは適宜組み合わせて使用してもよい。外水相中の乳化剤の濃度は、好ましくは約０．００１％ないし２０％（ｗ／ｗ）である。さらに好ましくは約０．０１％ないし１０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約０．０５％ないし５％（ｗ／ｗ）である。
上記したｏ／ｗ法においては、複合体を生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中に分散させる方法、すなわちｓ／ｏ／ｗ法によりマイクロカプセルを製造してもよい。
【００２２】
（ロ）水中乾燥法（ｗ／ｏ／ｗ法）
本方法においては、まず生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液を製造する。この際、生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液中の濃度は、生体内分解性ポリマーの分子量、有機溶媒の種類などによって異なるが、一般的には約０．０１ないし約８０％（ｗ／ｗ）から選ばれる。さらに好ましくは約０．１ないし約７０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは約１ないし約６０％である。内水相として複合体の水分散液を使用する。複合体の水分散液中の濃度は、例えば約１０％（ｗ／ｖ）ないし約９０％（ｗ／ｖ）である。上記した複合体の水分散液を生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に乳化，分散し、ｗ／ｏエマルションを製造する。乳化操作は、公知の分散方法により行われる。乳化操作は、例えばタービン型撹拌機、ホモジナイザー等を用いて行われる。この際、内水相と生体内分解性ポリマーの重量比の上限が約１：２まで、好ましくは約１：３までとなるようにする。内水相と生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液との比率は１：１，０００（ｖ／ｖ）ないし１：１（ｖ／ｖ）、好ましくは１：１００（ｖ／ｖ）ないし１：５（ｖ／ｖ）、特に好ましくは１：５０（ｖ／ｖ）ないし１：５（ｖ／ｖ）である。
ついでこのようにして製造されたｗ／ｏエマルションをさらに水相中に加えて、ｗ／ｏ／ｗエマルションを製造し、油相溶媒を蒸発させマイクロカプセルを製造する。具体的操作は上記（イ）に準ずる。
【００２３】
本発明で用いられる徐放性製剤は微粒子状であることが好ましい。なぜならば徐放性製剤は、通常の皮下あるいは筋肉内注射に使用される注射針を通して投与される方が、患者に対し過度の苦痛を与えることがないからである。該徐放性製剤の粒子径は、例えば平均粒子径として約０．１ないし３００μm、好ましくは約１ないし１５０μm、特に好ましくは約２ないし１００μmである。
本明細書中、微粒子状の徐放性製剤を、マイクロカプセルと称することもある。
マイクロカプセルはマイクロスフィアと称することもある。
【００２４】
本発明の徐放性製剤は、例えばマイクロカプセルとして、あるいはマイクロカプセルを原料物質として種々の剤形に製剤化し、非経口剤（例、筋肉内、皮下、臓器などへの注射剤または埋め込み剤、鼻腔、直腸、子宮などへの経粘膜剤等）、経口剤（例、カプセル剤（例、硬カプセル剤、軟カプセル剤等）、顆粒剤、散剤等の固形製剤、懸濁剤等の液剤等）などとして投与することができる。
本発明において、徐放性製剤は特に注射用であることが好ましい。例えば、徐放性製剤がマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルを分散剤（例、Tween 80、HCO-60 等の界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸等の多糖類など）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ブドウ糖など）等と共に水性懸濁剤とすることにより実用的な注射用徐放製剤が得られる。また、ゴマ油、コーン油などの植物油あるいはこれにレシチンなどのりん脂質を混合したもの、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（例、ミグリオール８１２）と共に分散して油性懸濁剤として実際に使用できる徐放性注射剤とする。
【００２５】
徐放性製剤が例えばマイクロカプセルである場合、マイクロカプセルの粒子径は、懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば平均粒子径として約０．１ないし約３００μmの範囲が挙げられる。粒子径は、好ましくは約１ないし約１５０μm、特に好ましくは約２ないし約１００μmの範囲である。
上記したマイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２６】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。
本発明の徐放性製剤の適応は、使用する生理活性物質により異なる。本発明の徐放性製剤は、生理活性物質が例えばインスリンである場合には糖尿病などの治療または予防に、インターフェロンアルファである場合には腎癌，Ｃ型肝炎などの治療または予防に、エリスロポエチンである場合には貧血などの治療または予防に、成長ホルモンである場合には発育不全などの治療または予防に、顆粒球コロニー刺激因子である場合には癌化学療法後の好中球減少症などの治療または予防に有効である。また、生理活性物質がエリスロポエチンである場合、本発明の徐放性製剤は、自己血輸血のための造血促進にも有効である。
徐放性製剤の投与量は、生理活性物質の種類と含量、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって種々異なるが、生理活性物質の有効量であればよい。該生理活性物質の１回当たりの投与量としては、例えば徐放性製剤が１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人、約 0.0001 ないし10mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約 0.0005 ないし1mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の投与量は、成人１人、１回当たり好ましくは、約 0.0005 ないし50 mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約 0.0025 ないし10mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回，４週間に１回等、生理活性物質の種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾病、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
本発明の製剤の保存は常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃を、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
参考例１
０．５ｇの豚インスリン（２７．３Ｕ／ｍｇ、ディオシンス社、オランダ））を１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液２２ｍｌに溶解させた溶液と、１ｇの酢酸亜鉛（２水和物）を１０ｍｌの蒸留水に溶解させた溶液を混合し、室温で１時間放置した。約３，０００ rpm で遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。これを再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。上清を捨てた後、少量の蒸留水を加えて凍結乾燥し、約１ｇの粗豚インスリン亜鉛塩を乾燥粉末として得た。
得られた粉末中のインスリン含量を調べるため、３０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液で３時間振とうして抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量した。その結果、乾燥粉末１００ｍｇあたり豚インスリンを４７．６ｍｇ含有していた。
【００２８】
参考例２
４０％水酸化カリウム水溶液１６８ｍｌとエチルエーテル１，０００ｍｌの混液に氷冷撹拌下、ニトロソエチル尿素１０４ｇを少しずつ加えた。生じた黄色のエーテル層を分液し、粒状の水酸化カリウムを加え乾燥した。ついで水酸化カリウムを除去し、ジアゾエタン溶液約９００ｍｌを得た。
重量平均分子量約5,800の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸/グリコール酸＝５０／５０（モル／モル％））、１３０ｇを塩化メチレン１，９００ｍｌに溶解し、撹拌冷却した。氷冷下、上記したジアゾエタン溶液を滴下し、その後室温下２時間撹拌した。一夜放置後、溶媒を減圧留去し、残留物を室温で真空乾燥することにより、乳酸−グリコール酸共重合体のエチルエステル１３１ｇを得た。
【００２９】
参考例３
１ｍｇのヒト成長ホルモン（バイオテクノロジー・ジェネラル社、米国）を０．９ｍｌの蒸留水に溶解した溶液に、９．９８、２９．４３、４９．８８、６９．８４、７９．８１または９９．７７μｇの酢酸亜鉛（二水和物）を１００μｌの蒸留水に溶解した水溶液を混合した。亜鉛／成長ホルモンのモル比はそれぞれ１、３、５、７、８、１０である。このモル比が５の時には成長ホルモンの約６０％が沈殿し、７以上ではほぼ１００％の成長ホルモンが沈殿した。
【００３０】
実施例１
インターフェロンアルファ水溶液２００ｍｌ（４００億国際単位を含有）に酢酸亜鉛（２水和物）水溶液１ｍｌ（２００ｍｇ／ｍｌ）と１規定水酸化ナトリウム１ｍｌを加えて、混合後４℃にて一晩静置した。３，０００rpmで遠心分離後、不溶性の複合体を回収し、凍結乾燥して、約２００ｍｇの粗インターフェロンアルファ亜鉛塩を得た。
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝50/50、分子量５８００、和光純薬製）１．５ｇと参考例２で得られた乳酸−グリコール酸共重合体のエチルエステル１．５ｇをジクロロメタン４ｍｌに溶解した溶液に、前記した粗インターフェロンアルファ亜鉛塩２００ｍｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌し、ｓ／ｏエマルションを得た。得られたｓ／ｏエマルションを予め１８℃に調節しておいた０．１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液７００ｍｌ 中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６，０００ rpm でｓ／ｏ／ｗエマルションとした。このｓ／ｏ／ｗエマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。ついで、約２，０００ rpm で遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた。得られる残渣を再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集されたマイクロカプセルにＤ−マンニトール５０ｍｇを加え、さらに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末状のマイクロカプセルを得た。
【００３１】
実施例２
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５（モル／モル％）、重量平均分子量１３，５８５、数平均分子量 ４，４１３、和光純薬工業製）３．６ｇにジクロロメタン６．６ｇ（５ｍｌ) を加えて溶解した。また参考例１で得られた粗豚インスリン亜鉛塩４２０ｍｇ（豚インスリンを２００ｍｇ含有）をジクロロメタン６．６ｇ（５ｍｌ) に分散し、両者を混合した後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約１０秒間攪拌し、ｓ／ｏエマルションを得た。得られたｓ／ｏエマルションを予め１８℃に調節しておいた０．１％ (w/w) ポリビニルアルコール（EG-40、日本合成化学製）水溶液８００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサーを用い、６，０００ rpm でｓ／ｏ／ｗエマルションとした。このｓ／ｏ／ｗエマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、油相を固化させた。ついで、約２，０００ rpm で遠心分離操作を行ない（05PR-22、日立製作所）上清を捨てた 。得られる残渣を再び蒸留水に分散後、さらに遠心分離を行った。捕集されたマイクロカプセルにＤ−マンニトール５０ｍｇを加え、さらに少量の蒸留水を加えて再分散した後、この分散液を凍結乾燥して粉末状のマイクロカプセルを得た（約３グラム回収）。
得られたマイクロカプセル中のインスリン含量を調べるため、３０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液で３時間振とうして抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量した。その結果、マイクロカプセル１００ｍｇあたりインスリンを６．２ｍｇ含有していた。
【００３２】
実施例３
エリスロポエチン注射液（エスポーTM 注射液３０００、三共株式会社製）８ｍｌ（１２０００国際単位を含有）に塩化亜鉛１ｇを少量づつ加え、室温で１時間放置した。得られる混合液を３，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物を蒸留水に再度分散したのち、さらに遠心分離により沈殿物を得た。該沈殿物に少量の蒸留水を加えて凍結乾燥し、粗エリスロポエチン亜鉛塩と粗アルブミン亜鉛塩との混合物６０ｍｇを粉末として得た。
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝50/50、分子量１４０００、和光純薬製）０．５ｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した溶液に、前記した粗エリスロポエチン亜鉛塩と粗アルブミン亜鉛塩との混合物６０ｍｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌しｓ／ｏエマルションを得た。ついで、実施例１と同様にして粉末状のマイクロカプセル１５２ｍｇを得た。
【００３３】
実施例４
ヒト成長ホルモン（ジェノトロピンTM １６ＩＵ、住友製薬株式会社製）を蒸留水１ｍｌに溶解し、さらに塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、室温で１時間放置した。得られる混合液を遠心分離し、沈殿物を蒸留水に再度分散したのち、さらに遠心分離により沈殿物を得た。該沈殿物に少量の蒸留水を加えて凍結乾燥し、粗ヒト成長ホルモン亜鉛塩５．６ｍｇを粉末として得た。乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝75/25、分子量９，８００、和光純薬製）０．５ｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した溶液に、前記した粗ヒト成長ホルモン亜鉛塩５．６ｍｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌しｓ／ｏエマルションを得た。ついで、実施例１と同様にして粉末状のマイクロカプセル１２１ｍｇを得た。
【００３４】
実施例５
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）注射液〔フィルグラスチンノイポージェン（Filgrastin Neupogen）（商品名）、アムジェン社，米国〕１０ｍｌ（３×１０8国際単位を含有）を希水酸化ナトリウム水溶液で中性にしたのち、塩化亜鉛水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温で１時間放置した。得られる混合液を遠心分離し、沈殿物を蒸留水に再度分散したのち、さらに遠心分離により沈殿物を得た。該沈殿物に少量の蒸留水を加えて凍結乾燥し、粗顆粒球コロニー刺激因子亜鉛塩４ｍｇを粉末として得た。
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝50/50、分子量８，０００、和光純薬製）０．５ｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した溶液に、前記した粗顆粒球コロニー刺激因子亜鉛塩４ｍｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌しｓ／ｏエマルションを得た。ついで、実施例１と同様にして粉末状のマイクロカプセル１１０ｍｇを得た。
【００３５】
実施例６
ヒトインスリン（ヒト組換え体インスリン、和光純薬製）５．２１ｍｇ（２６Ｕ／ｍｇ）を５７ｍＭ塩酸水溶液０．６３ｍｌに溶解した後、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．３５ｍｌを加えて、ｐＨが中性付近のヒトインスリン溶液を得た。該ヒトインスリン溶液に酢酸亜鉛水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを加え、４℃で１晩放置した。得られる混合液を約３，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物を蒸留水に再度分散したのち、さらに遠心分離により沈殿物を得た。該沈殿物に少量の蒸留水を加えて凍結乾燥し、粗ヒトインスリン亜鉛塩１１ｍｇを粉末として得た。
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝50/50、分子量６，０００、和光純薬製）０．５ｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した溶液に、前記した粗ヒトインスリン亜鉛塩１１ｍｇを添加し、ホモジナイザー（ポリトロン）で約３０秒間攪拌しｓ／ｏエマルションを得た。ついで、実施例１と同様にして粉末状のマイクロカプセル１０５ｍｇを得た。
【００３６】
比較例
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸比＝50/50、分子量６，０００、和光純薬製）０．９ｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。この溶液に亜鉛をほとんど含まないヒトインスリン１００ｍｇ（亜鉛含量０．０００１％（w/w）以下）を添加し、ボルテックスミキサーにて混合後、ホモジナイザー（ポリトロン）で約１０秒間撹拌しｓ／ｏエマルションを得た。ついで、実施例１と同様にして粉末状のマイクロカプセル４７０ｍｇを得た。
得られたマイクロカプセル中のインスリン含量を調べるため、３０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液で３時間振とうして抽出し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量した。その結果、マイクロカプセル１００ｍｇあたりインスリンを８．７ｍｇ含有していた。
【００３７】
実験例１
実施例２で得られた粉末状のマイクロカプセル３２３ｍｇを注射用分散媒（蒸留水１ｍｌあたり５ｍｇのカルボキシメチルセルロース、１ｍｇのポリソルベート８０、５０ｍｇのマンニトールを溶解したもの）１ｍｌに分散し、６週令の雄性ＳＤ系ラットの背部に皮下投与した（インスリン投与量：一匹あたり約２０ｍｇ）。投与後、経時的に尾部より採血し、血清中の豚インスリン濃度を酵素免疫学的手法（ＥＩＡ）（三光純薬製）で測定した。その結果、投与後１週間以上、血清中に活性を持つ豚インスリンが検出された。
【００３８】
実験例２
実施例４で得られたマイクロカプセル７０ｍｇを注射用分散媒（５ｇのカルボキシメチルセルロース、２ｇのポリソルベート８０および５０ｇのマンニトールを蒸留水１Ｌに溶解した溶液）０．５ｍｌに分散して、６週齢雄性ＳＤラットの背部に皮下投与した（成長ホルモン投与量：一匹あたり約３ｍｇ）。投与後、経時的に尾部より採血し、血清中の成長ホルモン濃度をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した。その結果、投与後１週間以上、血清中に活性を持つ成長ホルモンが検出された。
【００３９】
比較実験例
比較例で得られた粉末状のマイクロカプセル１５４．７ｍｇを注射用分散媒（蒸留水１ｍｌあたり５ｍｇのカルボキシメチルセルロース、１ｍｇのポリソルベート８０、５０ｍｇのマンニトールを溶解したもの）１．７５ｍｌに分散し、６週令の雄性ＳＤ系ラットの背部皮下投与した（インスリン投与量：一匹あたり約４４ｍｇ）。投与後、経時的に尾部より採血し、血清中のヒトインスリン濃度を酵素免疫学的手法（ＥＩＡ）で測定した。その結果、投与後１日目以降は、血清中にインスリンは、ほとんど検出されなかった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、生理活性物質の封入効率を高め、投与後初期の漏出を抑制した徐放性製剤が得られる。また、本発明の徐放性製剤は、生体内投与後に生理活性物質の生物活性を保持したまま徐放できる。さらに、徐放性製剤中の生理活性物質が長期間にわたって安定に保たれ、生物活性の損失が少ない。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sustained-release preparation comprising a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a water-soluble peptide physiologically active substance excluding an endothelin antagonist and a biodegradable polymer.
[0002]
[Prior art]
Physiologically active substances, especially peptides or their derivatives, are known to exhibit various pharmacological actions in the living body, and some of these are known to have been used in Escherichia coli, yeast, animal cells due to the development of chemical synthesis, genetic engineering, and cell engineering techniques. Alternatively, it can be produced in large quantities using a living body such as a hamster and applied as a medicine. However, since these peptides generally have a short half-life in vivo, they require frequent administration, and there are some cases in which the physical burden on the patient accompanying injection cannot be ignored. In order to solve this problem, various attempts have been made to develop sustained-release preparations.
The first problem in developing a sustained-release preparation of a water-soluble physiologically active substance, particularly a water-soluble peptide (hereinafter sometimes simply referred to as a peptide) is how to control the solubility of the peptide. That is, to suppress the release rate of the peptide.
Japanese Patent Publication No. 3-500286 discloses an insoluble zinc-protamine-α-interferon complex.
Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-2930 discloses a system in which a macromolecular polypeptide is dispersed in polylactide.
In JP-A-5-221855 and JP-A-6-172208, a water-soluble peptide is converted into a water-insoluble peptide salt and suspended in an organic medium containing a biodegradable polymer. Has been disclosed for efficiently incorporating a sphere into a microsphere. The water-insoluble peptide used in this publication is an organic acid salt for the basic part inside the water-soluble peptide molecule, and is pamoate, tannic acid, stearic acid, or palmitate.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Although various attempts have been made to produce sustained-release preparations of water-soluble physiologically active substances as described above, none of them are yet satisfactory, the encapsulation efficiency of water-soluble physiologically active substances is high, and the initial water-solubility after administration Development of a sustained-release preparation in which leakage of a physiologically active substance is suppressed, the water-soluble physiologically active substance release rate is constant, and the water-soluble physiologically active substance is stable is desired.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors conducted extensive research to solve the above problems, and found that a water-soluble peptide physiologically active substance having an acidic group excluding an endothelin antagonist or a water-soluble salt thereof (hereinafter simply referred to as a physiologically active substance). And a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt (hereinafter sometimes simply referred to as a complex) produced from a water-soluble polyvalent metal salt and biodegradable It has been found that by dispersing in a polymer, a sustained-release preparation can be obtained in which the uptake efficiency of a bioactive substance into a biodegradable polymer is dramatically increased and the leakage of the drug immediately after administration to the living body is reduced. As a result of further research based on this finding, the present invention was completed.
That is, the present invention
(1) A sustained-release preparation comprising a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a water-soluble peptide physiologically active substance excluding an endothelin antagonist and a biodegradable polymer, (2) the physiologically active substance is water-soluble The sustained-release preparation according to the above (1), which is a functional peptide or a derivative thereof,
(3) The sustained release preparation according to the above (2), wherein the peptide is a hormone, cytokine, blood growth factor, growth factor, enzyme, soluble or solubilized receptor, antibody, peptidic antigen, blood coagulation factor or adhesion factor,
(4) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a hormone,
(5) The sustained-release preparation according to (4), wherein the hormone is growth hormone,
(6) The sustained release preparation according to the above (4), wherein the hormone is insulin,
(7) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a cytokine,
(8) The sustained release preparation according to the above (7), wherein the cytokine is interferon,
(9) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the physiologically active substance is a growth factor,
(10) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the polyvalent metal salt is a transition metal salt,
(11) The sustained-release preparation according to the above (1), wherein the polyvalent metal salt is a zinc salt,
(12) The sustained-release preparation according to the above (1), wherein the solubility of the polyvalent metal salt in water is about 0 to about 0.1% (w / w) at 20 ° C.,
(13) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the solubility of the polyvalent metal salt in water is about 0 to about 0.01% (w / w),
(14) The sustained release preparation according to the above (1), comprising about 0.1 to about 50% (w / w) of a polyvalent metal salt,
(15) The sustained release preparation according to the above (1), comprising about 0.1 to about 30% (w / w) of a polyvalent metal salt,
(16) The sustained release preparation according to the above (1), wherein the biodegradable polymer is an aliphatic polyester,
(17) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the aliphatic polyester is a polymer of lactic acid and glycolic acid,
(18) The sustained release preparation according to the above (17), wherein the composition ratio (mol / mol%) of lactic acid and glycolic acid is from 100/0 to about 40/60,
(19) The sustained release preparation according to the above (18), wherein the composition ratio (mol / mol%) is about 90/10 to about 45/55,
(20) The sustained release preparation according to the above (17), wherein the polymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 20,000,
(21) The sustained release preparation according to the above (17), wherein the polymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 14,000.
(22) The sustained release preparation according to the above (16), wherein the aliphatic polyester is a homopolymer of lactic acid,
(23) The sustained release preparation according to the above (22), wherein the homopolymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 20,000,
(24) The sustained release preparation according to the above (22), wherein the homopolymer has a weight average molecular weight of about 3,000 to about 14,000.
(25) The sustained release preparation according to the above (1), which is a microcapsule,
(26) The sustained release preparation according to the above (25), wherein the microcapsule is for injection,
(27) The sustained-release preparation according to (1), which is for injection,
(28) Use of a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a water-soluble peptide-based physiologically active substance excluding an endothelin antagonist for production of a sustained-release preparation and a biodegradable polymer, and
(29) A water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a water-soluble peptide physiologically active substance excluding an endothelin antagonist is dispersed in an oil phase containing a biodegradable polymer to prepare an s / o emulsion, The present invention relates to a method for producing a sustained-release preparation, characterized in that a s / o / w emulsion is prepared by adding a mold emulsion to an aqueous phase, and then the s / o / w emulsion is subjected to drying in water.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In this specification, when amino acids, peptides, etc. are represented by abbreviations, they shall be based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, In addition, when an amino acid may have an optical isomer, L form is shown unless otherwise specified.
The physiologically active substance in the water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of the physiologically active substance is a physiologically active substance having an acidic group. Here, examples of the acidic group include a carboxyl group and a sulfo group. The physiologically active substance is preferably a physiologically active substance having a peptide bond in the molecule or containing an amino acid and having an acidic group. The acidic group may be derived from an amino acid. The physiologically active substance is more preferably a peptide having an acidic group or a derivative thereof. The bioactive substance has a solubility in water of 1% (w / w) or more at 25 ° C.
[0006]
The physiologically active substance preferably has two or more carboxyl groups.
The molecular weight of the physiologically active substance is about 200 to about 200,000, preferably about 200 to about 50,000, more preferably about 500 to about 40,000.
A typical example of the activity of a physiologically active substance is hormonal action. The physiologically active substance may be a natural product, a synthetic product, a semi-synthetic product, a genetic engineering product, or a derivative thereof. The mechanism of action of these physiologically active substances may be either agonistic or antagonistic.
Examples of the physiologically active substance of the present invention, particularly water-soluble peptides or derivatives thereof, include hormones, cytokines, hematopoietic factors, growth factors, enzymes, soluble or solubilized receptors, antibodies or fragments thereof, peptide antigens, blood coagulation factors, Examples include agonists or antagonists that can bind to an adhesion factor or a receptor for the physiologically active substance.
[0007]
Examples of hormones include insulin, growth hormone, natriuretic peptide, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), human chorionic gonadotropin. (HCG), motilin, kallikrein and the like. The hormone is preferably insulin or growth hormone.
[0008]
Examples of cytokines include lymphokines and monokines. Examples of lymphokines include interferon (alpha, beta, gamma), interleukin (IL-2 to IL-12) and the like. Examples of monokines include interleukin 1 (IL-1) and tumor necrosis factor. The cytokine is preferably lymphokine, more preferably interferon (alpha, beta, gamma).
Examples of hematopoietic factors include erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), thrombopoietin, platelet growth stimulating factor, megacaryocytopotentiator and the like.
Examples of the growth factor include basic or acidic fibroblast growth factor (FGF) or a family thereof (eg, FGF-9), nerve cell growth factor (NGF) or a family thereof, insulin-like growth factor (eg, , IGF-1, IGF-2, etc.), factors involved in bone growth (BMP) or their families.
Examples of the enzyme include superoxide dismutase (SOD) and tissue plasminogen activator (TPA).
Soluble receptors include soluble interleukin 6 (IL-6) receptor, insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), soluble tumor necrosis factor receptor, soluble epidermal growth factor receptor, and soluble interleukin 1 receptor. Can be mentioned.
Examples of solubilized receptors include known receptors such as interleukin 1 receptor, interleukin 6 receptor, tumor necrosis factor receptor, and Fas ligand solubilized by genetic engineering techniques. It is done.
Examples of the antibody include a human monoclonal antibody, a human-mouse chimeric monoclonal antibody comprising a mouse-derived variable region and a human-derived constant region. Examples of the antibody type include IgM, IgG, IgE and the like. Examples of the antigen include those recognized by the antibody, and further include platelets and viruses.
Examples of blood coagulation factors include Factor VIII.
Examples of the adhesion factor include fibronectin and ICAM-1.
Examples of the physiologically active substance further include endothelin, Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS), pituitary adenylate cyclase activation polypeptide (PACAP), and the like.
[0009]
The physiologically active substance is converted into a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of the physiologically active substance by contacting with the water-soluble polyvalent metal salt.
Examples of the polyvalent metal in the water-soluble polyvalent metal salt include II-valent, III-valent, and IV-valent metals. Specifically, alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium, etc.), transition metals [iron ( II, III), copper (II), zinc (II) etc.], Group IIIb metals [Aluminum (II, III) etc.], IVb metals [tin (II, IV) etc.] Etc. The polyvalent metal is preferably an alkaline earth metal or a transition metal, more preferably zinc or calcium, particularly preferably zinc.
Examples of the water-soluble polyvalent metal salt include a salt of a polyvalent metal and an acid, for example, a salt of a polyvalent metal and an inorganic acid or a salt of a polyvalent metal and an organic acid.
The salt of polyvalent metal and acid is preferably a salt having a solubility in water of about 20 mg / ml or more at room temperature (20 ° C.), more preferably a salt having a solubility of about 100 mg / ml or more, particularly preferably a solubility of about 200 mg. The salt is / ml or more.
Examples of the inorganic acid in the salt of the polyvalent metal and the inorganic acid include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and thiocyanic acid.
Examples of the organic acid in the salt of a polyvalent metal and an organic acid include aliphatic carboxylic acids and aromatic acids. The aliphatic carboxylic acid is preferably an aliphatic carboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms. Examples of the aliphatic carboxylic acid include aliphatic monocarboxylic acid, aliphatic dicarboxylic acid, and aliphatic tricarboxylic acid. These aliphatic carboxylic acids may be either saturated or unsaturated.
[0010]
Examples of the aliphatic monocarboxylic acid include saturated aliphatic monocarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms (eg, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, etc.) And unsaturated aliphatic monocarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms (eg, acrylic acid, propiolic acid, methacrylic acid, crotonic acid, isocrotonic acid, etc.).
Examples of the aliphatic dicarboxylic acid include saturated aliphatic dicarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms (eg, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, etc.) and unsaturated aliphatic dicarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms. Examples include acids (eg, maleic acid, fumaric acid, citraconic acid, mesaconic acid, etc.).
Examples of the aliphatic tricarboxylic acid include saturated aliphatic tricarboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms (eg, tricarballylic acid, 1,2,3-butanetricarboxylic acid, etc.).
The above aliphatic carboxylic acid may have 1 to 2 hydroxyl groups, and examples thereof include glycolic acid, lactic acid, glyceric acid, tartronic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid and the like. It is done.
The aliphatic carboxylic acid is preferably an aliphatic monocarboxylic acid. The aliphatic carboxylic acid is more preferably an aliphatic monocarboxylic acid having 2 to 9 carbon atoms, particularly preferably a saturated aliphatic monocarboxylic acid having 2 to 3 carbon atoms. A particularly preferred specific example of the aliphatic carboxylic acid is, for example, acetic acid.
Examples of the aromatic acid include benzoic acid and salicylic acid, and benzoic acid is preferable.
[0011]
Specific examples of salts of polyvalent metals and inorganic acids, that is, inorganic acid polyvalent metal salts include, for example, halide salts (eg, zinc chloride, calcium chloride), sulfates, nitrates, thiocyanates, and the like.
Specific examples of salts of polyvalent metals and aliphatic carboxylic acids, that is, aliphatic carboxylic acid polyvalent metal salts include, for example, calcium acetate, zinc acetate, calcium propionate, zinc glycolate, calcium lactate, zinc lactate, tartaric acid Zinc. Preferred examples of the aliphatic carboxylic acid polyvalent metal salt include calcium acetate and zinc acetate. A particularly preferred specific example is zinc acetate.
Specific examples of a salt of a polyvalent metal and an aromatic acid, that is, an aromatic acid polyvalent metal salt include, for example, benzoate and salicylate. A particularly preferred specific example is zinc benzoate.
[0012]
A water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a physiologically active substance is produced by mixing a physiologically active substance and a water-soluble polyvalent metal salt in a solvent. The mixing operation is preferably performed in water.
The amount ratio (molar ratio) when the physiologically active substance and the water-soluble polyvalent metal salt are mixed in water is, for example, 1: 1 to 1: 1000, preferably 1: 1 to 1: 100, more preferably 1: 1 to 1:50, particularly preferably 1: 1 to 1:10. Moreover, the concentration in both water should just be the density | concentration more than the solubility of the composite_body | complex to produce | generate within the solubility range of each respectively.
The pH of the aqueous solution at the time of mixing is such that the physiological activity of the physiologically active substance is not impaired and the solubility of the physiologically active substance and the water-soluble polyvalent metal salt is not extremely lowered. The mixing operation is usually performed in distilled water, but may be performed in water adjusted to be weakly acidic, neutral or weakly alkaline as necessary.
In the present invention, water-insoluble or poorly water-soluble is not irreversible but is reversible and means very low solubility in water. The solubility in water is about 0 to about 0.1% (w / w) at normal temperature (20 ° C.), more preferably about 0 to about 0.01% (w / w).
The water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of the physiologically active substance thus obtained is used after vacuum drying or freeze-drying as necessary.
In the sustained-release preparation of the present invention, the content of the poorly water-soluble polyvalent metal salt of the physiologically active substance is generally about 0.1% (w / w) to about 50% (w / w), preferably about 1 % (W / w) to about 30% (w / w).
[0013]
Examples of biodegradable polymers include polymers that are hardly soluble or insoluble in water, such as aliphatic polyesters (eg, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids ( For example, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acid (eg, citric acid, etc.) homopolymers, copolymers, or mixtures thereof synthesized from one or more types], poly-α-cyanoacrylic acid esters, poly Examples include amino acids (eg, poly-γ-benzyl-L-glutamic acid). These may be mixed and used at an appropriate ratio. The type of polymerization may be random, block or graft.
The biodegradable polymer is preferably an aliphatic polyester [eg, α-hydroxycarboxylic acid (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acid (eg, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acid (eg, A homopolymer, a copolymer, or a mixture thereof synthesized from one or more of citric acid and the like].
Among the above-mentioned aliphatic polyesters, homopolymers and copolymers synthesized from one or more of α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.) ensure biodegradability and biocompatibility. From the viewpoint of The aliphatic polyester is particularly preferably a copolymer synthesized from one or more α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.). Moreover, these copolymers may be used in mixture.
The biodegradable polymer in the present invention is produced by a method known per se.
[0014]
The α-hydroxycarboxylic acids may be any of D-form, L-form, and D and L-form, and the D-form / L-form (mol / mol%) is about 75/25 to about 25/75. The thing of the range of is preferable. The D-form / L-form (mol / mol%) is more preferably about 60/40 to about 30/70.
Examples of the copolymer of α-hydroxycarboxylic acids include copolymers of glycolic acid and other α-hydroxy acids, and lactic acid and 2-hydroxybutyric acid are preferable as the α-hydroxy acids.
The copolymer of α-hydroxycarboxylic acids is preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer or a 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer.
The copolymer of α-hydroxycarboxylic acids is particularly preferably a lactic acid-glycolic acid copolymer.
[0015]
In the lactic acid-glycolic acid copolymer, the composition ratio (lactic acid / glycolic acid) (mol / mol%) is preferably about 100/0 to about 40/60. The composition ratio is more preferably about 90/10 to about 45/55. The composition ratio is particularly preferably about 80/40 to about 45/55. The weight average molecular weight of the lactic acid-glycolic acid copolymer is about 3,000 to about 20,000, preferably about 3,000 to about 14,000, more preferably about 3,000 to 12,000.
Further, the dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the lactic acid-glycolic acid copolymer is preferably about 1.2 to about 4.0. More preferably from about 1.5 to about 3.5.
The lactic acid-glycolic acid copolymer can be synthesized according to a production method known per se, for example, the method described in JP-A No. 61-28521. The copolymer is preferably synthesized by non-catalytic dehydration polycondensation.
In the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer, it is preferred that the glycolic acid is about 10 to about 75 mol% and the remainder is 2-hydroxybutyric acid. More preferably, the glycolic acid is about 20 to about 75 mol%. Particularly preferred is when the glycolic acid is about 30 to about 70 mol%. The weight average molecular weight of the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer is preferably about 2,000 to about 20,000. The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) of the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer is preferably about 1.2 to 4.0. The degree of dispersion is particularly preferably about 1.5 to 3.5. The 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer can be synthesized according to a known production method, for example, the method described in JP-A No. 61-28521. The copolymer is preferably synthesized by non-catalytic dehydration polycondensation.
Preferable examples of the homopolymer of the α-hydroxycarboxylic acid include a homopolymer of lactic acid.
The weight average molecular weight of the lactic acid homopolymer is about 3,000 to about 20,000, preferably about 3,000 to about 14,000.
The lactic acid homopolymer can be synthesized according to a production method known per se, for example, the method described in JP-A No. 61-28521. The homopolymer is preferably synthesized by non-catalytic dehydration polycondensation.
[0016]
The above-mentioned 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer may be further mixed with polylactic acid and used. The polylactic acid may be any of D-form, L-form, and mixtures thereof, but those having D-form / L-form (mol / mol%) in the range of about 75/25 to about 20/80. Is preferred. The D-form / L-form (mol / mol%) is more preferably about 60/40 to about 25/75. The D-form / L-form (mol / mol%) is particularly preferably about 55/45 to about 25/75. The polylactic acid has a weight average molecular weight of about 1,500 to about 20,000, preferably about 1,500 to about 10,000. The polylactic acid is preferably dispersed at about 1.2 to about 4.0. The degree of dispersion is particularly preferably from about 1.5 to about 3.5.
As a method for producing polylactic acid, a method of ring-opening polymerization of lactide, which is a dimer of lactic acid, and a method of dehydrating polycondensation of lactic acid are known. In order to obtain a relatively low molecular weight polylactic acid used in the present invention, a method of directly dehydrating polycondensation of lactic acid is preferred. This method is described, for example, in JP-A No. 61-28521.
When the 2-hydroxybutyric acid-glycolic acid copolymer and polylactic acid are mixed and used, the mixing ratio is, for example, about 10/90 to about 90/10 (% by weight). The mixing ratio is preferably from about 20/80 to about 80/20. The mixing ratio is more preferably about 30/70 to 70/30.
[0017]
In the present specification, the weight average molecular weight means 9 kinds of weight average molecular weights of 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,050, 580, 162. The molecular weight in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography (GPC) using polystyrene as a reference substance. The number average molecular weight is also calculated by GPC measurement. The degree of dispersion is calculated from the weight average molecular weight and the number average molecular weight. For GPC measurement, GPC column KF804L x 2 (manufactured by Showa Denko) and RI monitor L-3300 (manufactured by Hitachi, Ltd.) were used, and chloroform was used as the mobile phase.
[0018]
The copolymer synthesized by the above-described non-catalytic dehydration polycondensation generally has a free carboxyl group at the terminal.
In the present invention, the biodegradable polymer preferably has a free carboxyl group at the terminal.
The biodegradable polymer having a free carboxyl group at the terminal is a biodegradable polymer in which the number average molecular weight determined by GPC measurement and the number average molecular weight determined by terminal group determination are almost the same.
The number average molecular weight determined by terminal group determination is calculated as follows.
About 1 to 3 g of biodegradable polymer is dissolved in a mixed solvent of acetone (25 ml) and methanol (5 ml), and the carboxyl group in this solution is converted to 0.05 N alcoholic potassium hydroxide using phenolphthalein as an indicator. The solution was rapidly titrated with stirring at room temperature, and the number average molecular weight determined by terminal group determination was calculated by the following formula.
Number average molecular weight by end group determination = 20,000 A / B
A: Mass of biodegradable polymer (g)
B: 0.05 N alcoholic potassium hydroxide solution added by the end of titration (ml)
For example, in a polymer synthesized from one or more α-hydroxy acids by a non-catalytic dehydration polycondensation method and having a free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight determined by GPC measurement and the number average molecular weight determined by terminal group determination are approximately Match. On the other hand, in a polymer synthesized from a cyclic dimer by a ring-opening polymerization method using a catalyst and having essentially no free carboxyl group at the terminal, the number average molecular weight by terminal group determination is the number average by GPC measurement. Greatly exceeds molecular weight. Due to this difference, a polymer having a free carboxyl group at the terminal can be clearly distinguished from a polymer having no free carboxyl group at the terminal.
[0019]
The number average molecular weight by end group quantification is an absolute value, whereas the number average molecular weight by GPC measurement is various analysis, analysis conditions (for example, mobile phase type, column type, reference material, slice width selection, baseline Since it is a relative value that varies depending on the selection, etc., it is difficult to make a unique numerical value. For example, the fact that the number average molecular weight obtained by GPC measurement and the number average molecular weight obtained by end group quantification are almost equal to each other means The average molecular weight is in the range of about 0.5 to about 2 times the number average molecular weight measured by GPC. Preferably, it is within the range of about 0.8 times to about 1.5 times. In addition, the number average molecular weight determined by the end group determination greatly exceeds the number average molecular weight determined by the GPC measurement means that the number average molecular weight determined by the end group determination exceeds about twice the number average molecular weight determined by the GPC measurement.
[0020]
The sustained-release preparation of the present invention disperses or dissolves a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a physiologically active substance obtained by mixing a physiologically active substance and a water-soluble polyvalent metal salt in a biodegradable polymer. Manufactured by. Examples of the method for producing a sustained-release preparation include an underwater drying method, a phase separation method, a spray drying method, and a method equivalent thereto.
Below, the manufacturing method in the case of manufacturing a microcapsule as a sustained release formulation is described, for example.
[0021]
(I) Underwater drying method (o / w method)
In this method, first, an organic solvent solution of a biodegradable polymer is prepared. The organic solvent used in the production of the sustained-release preparation of the present invention preferably has a boiling point of 120 ° C. or lower. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (eg, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride), alcohols (ethanol, methanol), acetonitrile and the like. These may be mixed and used at an appropriate ratio. The organic solvent is preferably dichloromethane or acetonitrile. The organic solvent is particularly preferably dichloromethane. The concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution varies depending on the molecular weight of the biodegradable polymer and the type of the organic solvent, but is generally selected from about 0.01 to about 80% (w / w). It is. More preferably, it is about 0.1 to about 70% (w / w), particularly preferably about 1 to about 60%.
In the organic solvent solution of the biodegradable polymer thus obtained, a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal salt of a physiologically active substance is added and dissolved after lyophilization or vacuum drying as necessary. At this time, the amount of the composite added is such that the upper limit of the weight ratio of the composite: biodegradable polymer is up to about 1: 2, preferably up to about 1: 3.
Next, the organic solvent solution thus prepared is further added to the aqueous phase to form an o / w emulsion using a turbine type agitator and the like, and then the oil phase solvent is evaporated to produce microcapsules. . In this case, the aqueous phase volume is generally selected from about 1 to about 10,000 times the oil phase volume. More preferably, it is selected from about 2 times to about 5,000 times. Particularly preferably, it is selected from about 5 times to about 2,000 times.
An emulsifier may be added to the outer aqueous phase. The emulsifier may be any as long as it can generally form a stable o / w emulsion. Examples of the emulsifier include anionic surfactants, nonionic surfactants, polyoxyethylene castor oil derivatives, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, and hyaluronic acid. You may use these in combination suitably. The concentration of the emulsifier in the outer aqueous phase is preferably about 0.001% to 20% (w / w). It is more preferably about 0.01% to 10% (w / w), particularly preferably about 0.05% to 5% (w / w).
In the above o / w method, microcapsules may be produced by a method in which the complex is dispersed in an organic solvent solution of a biodegradable polymer, that is, the s / o / w method.
[0022]
(B) Underwater drying method (w / o / w method)
In this method, first, an organic solvent solution of a biodegradable polymer is produced. At this time, the concentration of the biodegradable polymer in the organic solvent solution varies depending on the molecular weight of the biodegradable polymer, the type of the organic solvent, etc., but is generally about 0.01 to about 80% (w / w). ). More preferably, it is about 0.1 to about 70% (w / w), particularly preferably about 1 to about 60%. An aqueous dispersion of the composite is used as the inner aqueous phase. The concentration of the complex in the aqueous dispersion is, for example, about 10% (w / v) to about 90% (w / v). The aqueous dispersion of the above complex is emulsified and dispersed in an organic solvent solution of a biodegradable polymer to produce a w / o emulsion. The emulsification operation is performed by a known dispersion method. The emulsification operation is performed using, for example, a turbine type agitator or a homogenizer. At this time, the upper limit of the weight ratio of the inner aqueous phase to the biodegradable polymer is set to about 1: 2, preferably about 1: 3. The ratio of the inner aqueous phase to the organic solvent solution of the biodegradable polymer is 1: 1,000 (v / v) to 1: 1 (v / v), preferably 1: 100 (v / v) to 1: 5 (v / v), particularly preferably 1:50 (v / v) to 1: 5 (v / v).
Next, the w / o emulsion thus produced is further added to the aqueous phase to produce a w / o / w emulsion, and the oil phase solvent is evaporated to produce microcapsules. The specific operation conforms to the above (a).
[0023]
The sustained-release preparation used in the present invention is preferably in the form of fine particles. This is because the sustained-release preparation does not cause excessive pain to the patient when administered through a needle used for normal subcutaneous or intramuscular injection. The particle size of the sustained-release preparation is, for example, about 0.1 to 300 μm, preferably about 1 to 150 μm, particularly preferably about 2 to 100 μm, as an average particle size.
In the present specification, the particulate sustained-release preparation is sometimes referred to as a microcapsule.
Microcapsules are sometimes referred to as microspheres.
[0024]
The sustained-release preparation of the present invention is formulated into various dosage forms, for example, as microcapsules or using microcapsules as a raw material, and is administered parenterally (eg, an injection or implant for intramuscular, subcutaneous, organ, etc., Transmucosal agents for nasal cavity, rectum, uterus, etc.), oral preparations (eg, capsules (eg, hard capsules, soft capsules, etc.), solid preparations such as granules, powders, liquids such as suspensions, etc. ) And the like.
In the present invention, the sustained-release preparation is particularly preferably for injection. For example, when the sustained-release preparation is a microcapsule, the microcapsule is used as a dispersant (eg, a surfactant such as Tween 80 or HCO-60, a polysaccharide such as carboxymethylcellulose, sodium alginate, or hyaluronic acid), a preservative. A practical sustained-release preparation for injection can be obtained by using an aqueous suspension together with (eg, methylparaben, propylparaben, etc.), an isotonic agent (eg, sodium chloride, mannitol, sorbitol, glucose, etc.) and the like. In addition, sustained-release injections that can be used as oily suspensions by being dispersed with vegetable oils such as sesame oil and corn oil, or mixed with phospholipids such as lecithin, or medium-chain fatty acid triglycerides (eg, miglycol 812). Use as an agent.
[0025]
When the sustained-release preparation is, for example, a microcapsule, the particle size of the microcapsule may be in a range that satisfies the degree of dispersion and needle penetration when used as a suspension injection. A range of about 0.1 to about 300 μm is mentioned. The particle size is preferably in the range of about 1 to about 150 μm, particularly preferably about 2 to about 100 μm.
In order to make the above-mentioned microcapsules into a sterile preparation, there are a method of sterilizing the whole manufacturing process, a method of sterilizing with gamma rays, a method of adding a preservative, and the like.
[0026]
The sustained-release preparation of the present invention has low toxicity and can be safely used for mammals (eg, humans, cows, pigs, dogs, cats, mice, rats, rabbits, etc.).
The indication of the sustained-release preparation of the present invention varies depending on the physiologically active substance used. The sustained-release preparation of the present invention is an erythropoietin for treating or preventing diabetes when the physiologically active substance is, for example, insulin, and for treating or preventing renal cancer, hepatitis C or the like when it is interferon alpha. For treatment or prevention of anemia in some cases, for treatment or prevention of growth failure in the case of growth hormone, for neutropenia after cancer chemotherapy in the case of granulocyte colony stimulating factor Effective for treatment or prevention. When the physiologically active substance is erythropoietin, the sustained-release preparation of the present invention is also effective for promoting hematopoiesis for autologous blood transfusion.
The dosage of the sustained-release preparation varies depending on the type and content of the physiologically active substance, the duration of release, the target disease, the target animal, etc., but may be any effective amount of the physiologically active substance. The dose per one dose of the physiologically active substance can be appropriately selected from the range of about 0.0001 to 10 mg / kg body weight, preferably for one adult when the sustained-release preparation is a one-week preparation, for example. . More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.0005 to 1 mg / kg body weight.
The dosage of the sustained-release preparation can be appropriately selected from the range of about 0.0005 to 50 mg / kg body weight per adult, preferably once per adult. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.0025 to 10 mg / kg body weight. The number of doses should be selected as appropriate according to the type and content of the physiologically active substance, dosage form, duration of release, target disease, target animal, etc. once a week, once every two weeks, once every four weeks, etc. it can.
The preparation of the present invention is stored at room temperature or in a cold place, preferably in a cold place. The normal temperature or cold place here is defined in the Japanese Pharmacopoeia. That is, normal temperature means 15 to 25 ° C., and cold place means 15 ° C. or less.
[0027]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but these examples do not limit the present invention.
Reference example 1
0.5 g porcine insulin (27.3 U / mg, Diosins, The Netherlands)) dissolved in 22 ml of 100 mM sodium hydroxide solution and 1 g zinc acetate (dihydrate) dissolved in 10 ml distilled water The prepared solutions were mixed and left at room temperature for 1 hour. Centrifugation was performed at about 3,000 rpm (05PR-22, Hitachi, Ltd.) and the supernatant was discarded. This was again dispersed in distilled water and further centrifuged. After discarding the supernatant, a small amount of distilled water was added and freeze-dried to obtain about 1 g of crude porcine insulin zinc salt as a dry powder.
In order to examine the insulin content in the obtained powder, the powder was extracted by shaking with a 50 mM EDTA solution containing 30% acetonitrile for 3 hours and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). As a result, 47.6 mg of porcine insulin was contained per 100 mg of dry powder.
[0028]
Reference example 2
To a mixed solution of 168 ml of 40% aqueous potassium hydroxide and 1,000 ml of ethyl ether, 104 g of nitrosoethylurea was added little by little with stirring with ice cooling. The resulting yellow ether layer was separated and dried by adding granular potassium hydroxide. Subsequently, potassium hydroxide was removed to obtain about 900 ml of a diazoethane solution.
130 g of a lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol / mol%)) having a weight average molecular weight of about 5,800 was dissolved in 1,900 ml of methylene chloride, and cooled with stirring. The above-mentioned diazoethane solution was added dropwise under ice cooling, followed by stirring at room temperature for 2 hours. After leaving overnight, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was vacuum-dried at room temperature to obtain 131 g of ethyl ester of lactic acid-glycolic acid copolymer.
[0029]
Reference example 3
9.98, 29.43, 49.88, 69.84, 79.81 or 99.77 μg in a solution of 1 mg of human growth hormone (Biotechnology General, USA) dissolved in 0.9 ml of distilled water An aqueous solution of zinc acetate (dihydrate) dissolved in 100 μl of distilled water was mixed. The molar ratio of zinc / growth hormone is 1, 3, 5, 7, 8, 10 respectively. When this molar ratio was 5, about 60% of the growth hormone was precipitated, and when it was 7 or more, almost 100% of the growth hormone was precipitated.
[0030]
Example 1
To 200 ml of interferon alpha aqueous solution (containing 40 billion international units), 1 ml of zinc acetate (dihydrate) aqueous solution (200 mg / ml) and 1 ml of 1N sodium hydroxide were added and mixed, and then allowed to stand at 4 ° C. overnight. . After centrifugation at 3,000 rpm, the insoluble complex was collected and lyophilized to obtain about 200 mg of crude interferon alpha zinc salt.
1.5 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 50/50, molecular weight 5800, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 1.5 g of ethyl ester of lactic acid-glycolic acid copolymer obtained in Reference Example 2 200 mg of the above-mentioned crude interferon alpha zinc salt was added to a solution of 4 ml of dichloromethane dissolved in dichloromethane, followed by stirring with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an s / o emulsion. The obtained s / o emulsion was poured into 700 ml of a 0.1% (w / w) polyvinyl alcohol (EG-40, Nippon Synthetic Chemical) aqueous solution that had been adjusted to 18 ° C. in advance, and a turbine homomixer was used. An s / o / w emulsion was used at 6,000 rpm. This s / o / w emulsion was stirred at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, and the oil phase was solidified. Subsequently, centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi), and the supernatant was discarded. The resulting residue was again dispersed in distilled water and further centrifuged. To the collected microcapsules, 50 mg of D-mannitol was added, and a small amount of distilled water was added to redisperse. Then, the dispersion was freeze-dried to obtain powdery microcapsules.
[0031]
Example 2
Lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 75/25 (mol / mol%), weight average molecular weight 13,585, number average molecular weight 4,413, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3.6 g with dichloromethane 6. 6 g (5 ml) was added and dissolved. Also, 420 mg of the crude porcine insulin zinc salt obtained in Reference Example 1 (containing 200 mg of porcine insulin) was dispersed in 6.6 g (5 ml) of dichloromethane, and both were mixed and then stirred for about 10 seconds with a homogenizer (Polytron). An s / o emulsion was obtained. The obtained s / o emulsion was poured into 800 ml of a 0.1% (w / w) aqueous solution of polyvinyl alcohol (EG-40, manufactured by Nippon Gosei Kagaku), which had been adjusted to 18 ° C., and a turbine homomixer was used. An s / o / w emulsion was used at 6,000 rpm. This s / o / w emulsion was stirred at room temperature for 3 hours to volatilize dichloromethane, and the oil phase was solidified. Subsequently, centrifugation was performed at about 2,000 rpm (05PR-22, Hitachi), and the supernatant was discarded. The resulting residue was again dispersed in distilled water and further centrifuged. To the collected microcapsules, 50 mg of D-mannitol was added, and a small amount of distilled water was added to redisperse. The dispersion was freeze-dried to obtain powdered microcapsules (approximately 3 grams recovered).
In order to examine the insulin content in the obtained microcapsules, extraction was performed by shaking with a 50 mM EDTA solution containing 30% acetonitrile for 3 hours, and quantification was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). As a result, 6.2 mg of insulin was contained per 100 mg of microcapsules.
[0032]
Example 3
Erythropoietin injection (Espo TM 1 ml of zinc chloride was added little by little to injection solution 3000 (manufactured by Sankyo Co., Ltd.) 8 ml (containing 12000 international units) and left at room temperature for 1 hour. The resulting mixed solution was centrifuged at 3,000 rpm, and the precipitate was dispersed again in distilled water, and then the precipitate was obtained by further centrifugation. A small amount of distilled water was added to the precipitate and freeze-dried to obtain 60 mg of a mixture of a crude erythropoietin zinc salt and a crude albumin zinc salt as a powder.
In a solution of 0.5 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 50/50, molecular weight 14000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) dissolved in 1.5 ml of dichloromethane, the aforementioned crude erythropoietin zinc salt and crude albumin zinc 60 mg of a mixture with salt was added and stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an s / o emulsion. Subsequently, 152 mg of powdery microcapsules was obtained in the same manner as in Example 1.
[0033]
Example 4
Human growth hormone (genotropin TM 16 IU (manufactured by Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in 1 ml of distilled water, 100 μl of an aqueous zinc chloride solution (10 mg / ml) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. The obtained mixed liquid was centrifuged, and the precipitate was dispersed again in distilled water, and then the precipitate was obtained by further centrifugation. A small amount of distilled water was added to the precipitate and freeze-dried to obtain 5.6 mg of crude human growth hormone zinc salt as a powder. The aforementioned crude human growth hormone zinc salt in a solution of 0.5 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 75/25, molecular weight 9,800, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) dissolved in 1.5 ml of dichloromethane. 5.6 mg was added and stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an s / o emulsion. Subsequently, 121 mg of powdery microcapsules were obtained in the same manner as in Example 1.
[0034]
Example 5
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) injection solution [Filgrastin Neupogen (trade name), Amgen, USA] 10 ml (3 × 10 8 After neutralizing with a dilute aqueous sodium hydroxide solution, 1 ml of an aqueous zinc chloride solution (10 mg / ml) was added and left at room temperature for 1 hour. The obtained mixed liquid was centrifuged, and the precipitate was dispersed again in distilled water, and then the precipitate was obtained by further centrifugation. A small amount of distilled water was added to the precipitate and freeze-dried to obtain 4 mg of coarse granulocyte colony-stimulating factor zinc salt as a powder.
The above-mentioned coarse granulocyte colony-stimulating factor was added to a solution obtained by dissolving 0.5 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 50/50, molecular weight 8,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 1.5 ml of dichloromethane. 4 mg of zinc salt was added and stirred with a homogenizer (Polytron) for about 30 seconds to obtain an s / o emulsion. Next, 110 mg of powdered microcapsules were obtained in the same manner as in Example 1.
[0035]
Example 6
After dissolving human insulin (human recombinant insulin, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5.21 mg (26 U / mg) in 57 mM hydrochloric acid aqueous solution 0.63 ml, 0.05N sodium hydroxide aqueous solution 0.35 ml was added to adjust the pH. Near neutral human insulin solution was obtained. To the human insulin solution, 0.2 ml of an aqueous zinc acetate solution (20 mg / ml) was added and left at 4 ° C. overnight. The obtained mixed liquid was centrifuged at about 3,000 rpm, and the precipitate was dispersed again in distilled water, and then the precipitate was obtained by further centrifugation. A small amount of distilled water was added to the precipitate and freeze-dried to obtain 11 mg of crude human insulin zinc salt as a powder.
11 mg of the aforementioned crude human insulin zinc salt in a solution of 0.5 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 50/50, molecular weight 6,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) dissolved in 1.5 ml of dichloromethane. And stirred for about 30 seconds with a homogenizer (Polytron) to obtain an s / o emulsion. Subsequently, 105 mg of powdery microcapsules was obtained in the same manner as in Example 1.
[0036]
Comparative example
0.9 g of lactic acid-glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid ratio = 50/50, molecular weight 6,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 1.5 ml of dichloromethane. To this solution, 100 mg of human insulin containing almost no zinc (zinc content of 0.0001% (w / w) or less) was added, mixed with a vortex mixer, stirred for about 10 seconds with a homogenizer (Polytron), and an s / o emulsion. Got. Subsequently, 470 mg of powdery microcapsules was obtained in the same manner as in Example 1.
In order to examine the insulin content in the obtained microcapsules, extraction was performed by shaking with a 50 mM EDTA solution containing 30% acetonitrile for 3 hours, and quantification was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). As a result, 8.7 mg of insulin was contained per 100 mg of microcapsules.
[0037]
Experimental example 1
323 mg of the powdered microcapsules obtained in Example 2 was dispersed in 1 ml of a dispersion medium for injection (5 mg of carboxymethylcellulose, 1 mg of polysorbate 80, 50 mg of mannitol dissolved in 1 ml of distilled water), and 6 weeks old. It was subcutaneously administered to the back of male SD rats (insulin dosage: about 20 mg per animal). After administration, blood was collected from the tail over time, and the porcine insulin concentration in the serum was measured by an enzyme immunological technique (EIA) (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). As a result, active porcine insulin was detected in the serum for 1 week or longer after administration.
[0038]
Experimental example 2
70 mg of the microcapsules obtained in Example 4 were dispersed in 0.5 ml of a dispersion medium for injection (5 g of carboxymethyl cellulose, 2 g of polysorbate 80 and 50 g of mannitol dissolved in 1 L of distilled water), and 6 weeks old male It was subcutaneously administered to the back of SD rats (growth hormone dose: about 3 mg per animal). After administration, blood was collected from the tail over time, and the concentration of growth hormone in the serum was measured by radioimmunoassay (RIA). As a result, active growth hormone was detected in serum for 1 week or longer after administration.
[0039]
Comparative experiment example
154.7 mg of the powdered microcapsules obtained in the comparative example was dispersed in 1.75 ml of a dispersion medium for injection (dissolved 5 mg carboxymethylcellulose, 1 mg polysorbate 80, 50 mg mannitol per 1 ml distilled water), 6 Weekly male SD rats were subcutaneously administered to the back (insulin dose: about 44 mg per animal). After administration, blood was collected from the tail over time, and the human insulin concentration in the serum was measured by an enzyme immunological technique (EIA). As a result, almost no insulin was detected in the serum after the first day after administration.
[0040]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the sustained release formulation which raised the encapsulation efficiency of a bioactive substance and suppressed the initial leak after administration is obtained. In addition, the sustained-release preparation of the present invention can be released slowly while maintaining the biological activity of the physiologically active substance after in vivo administration. Furthermore, the physiologically active substance in the sustained-release preparation is kept stable for a long period of time, and there is little loss of biological activity.
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