JP3858200B2

JP3858200B2 - Method for purifying recombinant viral vectors containing therapeutic genes

Info

Publication number: JP3858200B2
Application number: JP52708196A
Authority: JP
Inventors: シャブラム，ポール，ダブリュー．; ジー．ヒュイゲ，ベナード; リウ，キアオドング; シェパード，エッチ．マイケル
Original assignee: キャンジインコーポレイテッド
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2016-03-06
Also published as: JP2006271396A; US5837520A; ZA961849B; JP2000510682A; EP1686180A2; AR001177A1; EP0813606A2; DE69636217D1; DK0813606T3; EP0813606B1; PT813606E; EP1686180A3; WO1996027677A3; ES2264801T3; WO1996027677A2; JP4182445B2; AU5421396A; ATE329045T1; DE69636217T2

Description

発明の背景
遺伝子療法による疾患の治療は、理論上の事から実際的な領域に移行した。最初の人間の遺伝子療法の試みは、１９９０年９月に開始され、そして、アデノシン・デアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子を、この酵素が欠損する患者のリンパ球に転移させることが含まれた。ＡＤＡ活性の不足は、免疫欠損を生じさせる。治療遺伝子を罹患した細胞に届けるための幾つかの方法において、ウイルスベクターは、特に有望であった。腫瘍サプレッサー遺伝子は、癌細胞を治療するために研究されている。そのような腫瘍サプレッサー遺伝子を含むウイルスベクターは、潜在的な治療物としてガン療法の分野において評価されている。最近、アデノウイルス・ベクターは、そのような腫瘍サプレッサー遺伝子と他の生体応答調節剤の産生のために有利なベクターとして、特に注意を払われた。ガン遺伝子療法の研究が臨床試験に移るにつれて、ますます多量の精製されたウイルスベクターが必要とされる。そのような試験のために適当な量のベクターを産生する際の一つの問題は、ウイルス粒子が産生される細胞溶菌液からの粒子の精製である。
とりわけ、これらのベクターの精製は、歴史的には、密度に基づく超遠心分離法を使用することにより実行された。この方法は、調査道具として使用するために有効であると判明したが、それは工業的規模の産生のための方法として実行可能ではない。新しい精製スキームを開発することができない限り、将来における物質の需要に合致させることは、禁止的費用をもたらすであろう。超遠心分離法に代わるもののうちの一つは、感染性ウイルス粒子の精製のためのクロマトグラフィー的技術である。
いろいろな植物ウイルスの精製のためのサイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィーの使用は、独自技術として、又は、増加密度勾配遠心分離法(augment density gradient centrifugation)〔アルブレヒトセン(Albrechtsen)ほか，J.Virological Methods 28:245-256(1990)；及びヘウィッシュ(Hewish)ほか，J.Virological Methods 7:223-228(1983)に対して示された。サイズ排除は、ウシ乳頭腫ウイルスに対する有望性を示し〔ジョルス(Hjorth)及びメレノ−ロペズ(Mereno-Lopez)，J.Virological Methods 5:151-158(1982)〕；そして、ダニ脳炎ウイルスの精製のための優れた方法であることが示された〔クロークス(Crooks)ほか，J.Chrom.502:59-68(1990)〕。サイズ排除クロマトグラフィーの使用は、普及するまでには至らなかったが、しかし、現在、組換え体レトロウイルスの大規模産生のために使用されている〔メント，エス．ジェイ．(Mento,S.J.)，ヴィアゲン，インコーポレーテッド(Viagene,Inc. ：１９９４ヴィリアムスブルクバイオプロセッシングコンファレンス(1994Williamsburg Bioprocessing Conference)で報告された)。アフィニティークロマトグラフィー（大部分はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用する）が、ウイルス起源の抗原の精製のための有効な方法であると報告された〔ナジャユー(Najayou)ほか，J.Virological Methods,32:67-77(1991)〕。ダイズ・モザイクウイルス（ｐＨ３を耐えぬくことができるウイルス）は、Ｍａｂアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収することができる〔ディアコ(Diaco)ほか，J.Gen.Virol.67:345-351(1986)〕。ファウラー(Fowler)〔J.Virological Methods,11:59-74(1986)〕は、エプシュタイン・バール(Epstein Barr)ウイルスを精製するために、アフィニティークロマトグラフィーと密度勾配遠心分離法を使用した。
アデノウイルスは大きく（約８０ｎｍの直径）、且つ幾分脆い。構造と機能との関係を扱っている大きい文献ベースが蓄積された〔総説としては、フィリプソン(Philipson)，Virology 15:263-268(1961)及びホルウィッツ(Horwitz)，Virology（第二版）レーヴン・プレス・リミテッド(Raven Press Ltd)，ニューヨーク(1990)参照〕。生きているアデノウイルスのクロマトグラフィー的精製については、前記文献の中では、殆ど何も報告されなかった。ハルナ(Haruna)ほか〔Virology 13:264-267(1961)〕は、タイプ１，３及び８アデノウイルスの精製のためにＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを使用することを報告し、そしてクレンペラー(Klemperer)及びパーラー(Pereir)〔Virology 9:536-545(1959)〕及びフィリプソン(Philipson)〔Virology 10:459-465(1960)は、他の種類のアデノウイルスで同じ方法を使用することは困難であると報告した。貧弱な分解能と貧弱な収量は、この方法が持つ重要な問題であり、この事が、大規模な産生における前記方法の使用を妨げた。
このように、アデノウイルス・ベクターのようなウイルスベクターを精製するためのクロマトグラフィー的方法に対する必要性が存在する。
発明の要約
遺伝子療法の成功した実例における一つの障害は、治療遺伝子を摘出するための精製されたウイルスベクターの入手可能性である。本発明は、治療遺伝子を含むウイルスベクターを含む細胞溶菌液を酵素処理し；第一の樹脂上で、酵素処理された細胞溶菌液をクロマトグラフィーに付し；そして、第一のカラムからの溶出液を、第二の樹脂上でクロマトグラフィーに付すこと：からなる三段階法を使用することにより、治療遺伝子を含むウイルスベクターを、治療の及び／又は予防の用途のために充分に精製することができるという、予想外で驚くべき発見により、前記の問題を解決する。治療遺伝子を有する、結果として得られる精製されたウイルスベクターは、クロマトグラフィー的処理の間及び後に、その感染性を保持し、そして、遺伝子転移を行なうことができる。本発明の精製方法を使用することにより初めて、治療遺伝子を含むクロマトグラフ的に精製されたウイルスベクターは、三日超遠心分離法(three day ultracentrifugation)を使用して精製されたウイルスベクターと同程度に純粋で且つ活性であることが判った。本発明の精製方法は、精製されたウイルスベクターの品質、一貫性、減少された工程時間、及び多量の試料を加工する能力を包含する、既存の方法を越える幾つかの利点を提供する。更に、この新しい精製スキームは、ビリオンの表面特性に基づくので、この新しい精製スキームは、異なる治療遺伝子で異なる内部ＤＮＡ構造物を含むビリオンにだけでなく、本発明の教示を使用する他のビリオンに広く適用できる。この破過時間精製方法(break-through purification method)は、遺伝子療法のバルクな商業化において重要な観点である。
したがって、本発明は、遺伝子療法の際に使用するための治療遺伝子を含むウイルスベクターの精製方法を提供する。一つの態様において、本発明は、治療遺伝子を含む組換え体ウイルスベクターの、細胞溶菌液からの精製方法であって、ａ）非被包性(unencapsulated)のＤＮＡとＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素的試薬を用いて前記溶菌液を処理し；ｂ）第一の樹脂上で、工程ａ）からの処理された溶菌液をクロマトグラフィーに付し；次いでｃ）第二の樹脂上で、工程ｂ）からの溶出液をクロマトグラフィーに付し；この場合、一方の樹脂はアニオン交換樹脂であり、そして、他方の樹脂は、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；immobilized metal ion chromatography）樹脂である、方法を含む。
別の態様において、疎水的相互作用クロマトグラフィー(hydrophobic interaction chromatography)樹脂で固定化金属イオン・クロマトグラフィー樹脂を代用してよく、及び／又はカチオン交換樹脂でアニオン交換樹脂を代用してよい。
別の態様において、酵素的に処理された細菌溶菌液は、三段階法に第四工程を加える濾過工程を経る。
より好ましい態様において、精製されているウイルスベクターは、治療遺伝子を含むアデノウイルス・ベクターである。更に一層好ましい態様において、アデノウイルス・ベクターは、腫瘍サプレッサー遺伝子を含む内部ＤＮＡ構造物を有する組換え体タイプ５のアデノウイルスである。
図の簡単な説明
図１：４°で、エッペンドルフ(Eppendorf)遠心分離機モデル５４１５ｃ中で、異なる速度で５分間遠心分離された粗感染細胞溶菌液の上澄からのＡＣＮ５３の回収。ＡＣＮ５３に対する分析は、分析的アニオン交換により行なった。
図２：ＡＣＮ５３感染細胞溶菌液成分の同定、並びに６０／２８０ｎｍ吸光度比を使用する二重波長紫外線吸光度による、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによる分離。
図３：ＤＥＡＥ精製の間の、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３対照及び宿主−細胞汚染物質保持時間。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の溶出は、ＤＥＡＥカラム上でクロマトグラフィーに付された非感染Ｈ２９３宿主細胞溶菌液ブランクの溶出と比較される。
図４：ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３分画プールのブチル−疎水的相互作用クロマトグラフィー(Butyl-Hydrophobic Interaction Chromatography)。半純粋のＤＥＡＥ精製されたＡＣＮ５３分画プールを、５０ｍＭトリス／ｐＨ８．０／３Ｍ硫酸アンモニウムの等容量と混合し、次いで、トソハース・ブチル−６５０Ｍ(TosoHaas Butyl-650M)カラム上に注射し、次いで、１．５〜０Ｍに減少する硫酸アンモニウム勾配で溶出した。
図５：ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３分画プールの固定化金属アフィニティー・クロマトグラフィー。半純粋のＤＥＡＥ精製されたＡＣＮ５３分画プールを、ＺｎＣｌ₂が投入された６．６×５０ｍｍトソハースＡＦキレート６５０Ｍ(TosoHaas AF chelate 650M)カラム上に注射し、次いで、直線状の０〜５００ｍＭグリシン勾配で溶出した。
図６：カラムクロマトグラフィー及びＣｓＣｌ−超遠心分離法から誘導されたＡＣＮ５３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ対照。試料は、８〜１６％勾配ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、次いで、分析のために銀で染色した。レーン２及び３は、各々、ＤＥＡＥ及びＩＺＡＣ溶出液プールである。レーン４〜６は、ロット間の一貫性を調べるための、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３ランの三つの異なるロット（ＣｓＣｌ−１，ＣｓＣｌ−２及びＣｓＣｌ−３）を順に示す。レーン７（ＣｓＣｌ−イオン交換処理されたロット）は、イオン交換処理されたロットを誘導したＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の試料が、リソースＱアニオン交換ＨＰＬＣカラム〔Resource Q，パーマシア(Pharmacia)〕上で精製される場合に回収されるＡＣＮ５３ピークを示す。レーン１及び８は、標準の分子量マーカーである。
図７：カラムクロマトグラフィー及びＣｓＣｌ−超遠心分離法から誘導されたＡＣＮ５３のウェスターン・ブロット(Western Blot)対照。先に記載された試料と同一の試料は、８〜１６％勾配ゲル上で電気泳動され、次いで、ＰＶＤＦ膜に移動された。このブロットを、最初に５μｇ／ｍｌシチムン(Cytimmune)ウサギ１ｇＧ抗アデノウイルスタイプ５抗体と共にインキュベートし、次いで、抗−ウサギ１ｇと結合したアマーシャムのカラシペルオキシダーゼ(Amersham's horseradish peroxidase)と共にインキュベートし、そして電気化学的検出を使用して展開した。
図８：Ｓａｏｓ−２細胞中のｐ５３遺伝子生成物の形質発現。クロマトグラフィー的に産生されたＡＣＮ５３の二つの異なるロットは、ｐ５３−ｎｕｌｌ・Ｓａｏｓ−２細胞への遺伝子転移を起こす能力に関して、ウェスターン・ブロットによって分析された。半純粋のＤＥＡＥ分画は、レーン７及び８に、最終生成物はレーン５及び６に示される。ｐ５３−発現ＳＷ４８０細胞は、正の対照として使用された；非感染Ｓａｏｓ−２細胞は、負の対照として使用された。
発明の詳細な説明
本発明は、
ａ）細胞溶菌液を非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を選択的に分解する酵素性薬剤で処理し；ｂ）段階ａ）からの処理された溶菌液に対し第１の樹脂上でクロマトグラフィーを行い；そしてｃ）段階ｂ）からの溶出液に対し第２の樹脂上でクロマトグラフィーを行うことからなり、上記樹脂の一方はアニオン交換樹脂であり、そして他方は固定化金属イオン親和性樹脂である、細胞溶菌液から治療遺伝子を含有する組換えウイルスベクターを精製する方法に関するものである。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスが複製不全であるように本来のゲノム内の遺伝子のいくつかまたは全てが除去された組換えウイルスを意味する。さらに、ウイルスベクターは、遺伝子治療のために所望のヒト細胞に治療遺伝子を移送するためにウイルスベクターが使用されるように、治療遺伝子をコードするＤＮＡを組換えウイルスゲノムが含有しているウイルスを意味する。代表的なベクターは哺乳類、特にヒトの細胞に感染するものを包含し、そしてレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスからなる群から選択されるウイルスから誘導される。レトロウイルスおよびアデノウイルスベクターが好ましい。アデノウイルスベクター、特に２型および５型アデノウイルスベクターが特に好ましい。組換え体５型アデノウイルスベクターが最も好ましい。
「治療遺伝子」は所望の治療効果を有する分子をコードする遺伝子またはその機能的な一部を意味する。例れば、その不在または突然変異のいずれかにより、病的な細胞成長または細胞の増殖における増加を引き起こす遺伝子。本明細書において使用されるような治療遺伝子はそのような不在または突然変異遺伝子に取って代わる。治療遺伝子は、遺伝子が染色体外の位置から細胞により発現されるらうに染色体外に留まるか、または内因性遺伝子と結合するように遺伝子が細胞のゲノム内に組み込まれ得る、いずれかによりそれらの治療効果を引き起こし得る。そのような遺伝子はＲｂ，Ｒｂ突然変異体，ｐ５３，ｐ５３突然変異体，ＤＣＣ，ＮＦ−１，ウイルム腫瘍，ＮＭ２３，ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，ＢＲＵＳＨ−１，ｐ５６，Ｈ−ＮＵＣ，甲状腺ホルモンレセプター遺伝子、レテン酸レセプター遺伝子，ｐ１３０，ｐ１０７およびｐ８５をコードする遺伝子からなる群から選択されるものを包含する腫瘍サプレッサー遺伝子を含む。他の遺伝子置換または補足戦略はアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、種々のサイトカイン、例えばγ−インターフェロン、α−インターフェロン、ＩＬ−２および他のホルモンをコードする遺伝子を包含する。
治療遺伝子はまた、リボザイムをコードするＤＮＡを包含すると理解される。そのようなＤＮＡ構築体は選択された正に作用する成長調節遺伝子、例えば（１）ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，ｃ−ｒａｓ，ＫｃおよびＪＥからなる群から選択されるが、それに限定されない腫瘍遺伝子または原（プロト）腫瘍遺伝子；（２）表皮成長因子、血小板誘導成長因子、トランスフェリンおよびインシュリンからなる群から選択されるが、それに限定されない成長因子レセプター遺伝子のＲＮＡに結合し、そして破壊するＲＮＡ酵素をコードする。
好ましい治療遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子であり、最も好ましい腫瘍サプレッサー遺伝子はＲｂ，Ｒｂ突然変異体，ｐ５３，ｐ５３突然変異体，ＢＲＵＳＨ−１，ｐ５６，ＢＲＣＡ−１，ＢＲＣＡ−２，ｐ１６およびｐ２１である。
「細胞溶菌液」という用語は、ベクター、好ましくはウイルスベクターを含有する宿主細胞等の細胞であって、該細胞はそれらの成長環境から取り出され、そして物理的または化学的手段によりそれらの細胞膜が破壊された細胞の集合体を意味する。
「酵素的薬剤」という用語は、非被包性ＤＮＡおよびＲＮＡを選択的に分解するが、組換えウイルスベクターをそれらが感染性ではなくなり、そして所望の標的細胞に治療遺伝子の無傷のコピーを移送することができなくなる程度まで分解しない化合物または混合物を意味する。そのような酵素性薬剤は一般的にはエンドヌクレアーゼまたはＤＮアーゼもしくはＲＮアーゼと呼ばれる１種またはそれ以上の酵素の組合せである。ベンゾナーゼ（登録商標，Benzonase）は好ましい酵素性試薬である。
「アニオン交換樹脂」という用語は不活性ポリマー支持体に共有結合により架橋結合した正に荷電した有機部分を意味する。代表的な有機部分は第一、第二、第三および第四アミノ基、例えばトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）および他の基、例えば約５ないし約９のｐＨ範囲内の正の形式電荷を既に有するか、または有するであろうポリエチレンイミン（ＰＥＩ）から引き出される。
同様に代表的な負に荷電した有機基はカルボキシメチル基およびスルホニルメチル基および約５ないし約９のｐＨ範囲内の負の形式電荷を有するか、または有するであろう他の基からなる群から選択される。
支持体材料は容易に誘導化され得、かつ、良好な機械的強さを有するものであるべきである。該材料は天然のポリマー物質、合成ポリマーもしくはコポリマー、または天然ポリマーと合成ポリマーの混合物であってよい。上記支持体は多孔性または非多孔性粒子、ビーズ、膜、ディスクまたはシート形状を採り得る。そのような支持体はシリカ、親水性ポリマー〔モノビーズ（登録商標，MonoBeads），ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー〕、架橋結合されたセルロース〔例えばセファセル（登録商標，Sephacel）〕、架橋結合されたデキストラン〔例えばセファデックス（登録商標，Sephadex）〕、架橋結合されたアガロース〔例えばセファロース（登録商標，Sepharose）〕、ポリスチレン、またはコポリマー、例えばポリスチレン−ジビニルベンゼンまたはオリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリトロルジメタクリレートから構成されるものであり、それにアクリルアミド誘導体の重合鎖がグラフト化されているもの（後者のコポリマーは「触手（テンタクル）」支持体として知られている）を包含する。
樹脂は伝統的な（重力）カラムクロマトグラフィーまたは放射状または軸方向の流れを用いる高圧液体クロマトグラフィー装置、流動床カラムにおいて、またはスラリー（バッチ）法において使用され得る。後者の方法において、樹脂はデカンテーションまたは遠心分離または濾過またはこれらの方法の組合せにより試料から分離される。ウイルスベクターは塩勾配、好ましくは塩化ナトリウムの勾配により上記樹脂から溶離されて精製され得る。
適当なアニオン交換樹脂の例はＤＥＡＥまたはＤＭＡＥのいずれかで誘導化されたフラクトゲル（登録商標，Fractogel）（イー．メルク，ギッブスタウン，ニュージャージー）樹脂；ＤＥＡＥ、ＤＭＡＥまたはＴＭＡＥで誘導化されたフラクトゲル（登録商標）ＥＭＤテンタクル樹脂；ＤＥＡＥまたはＱＡＥで誘導化されたトヨパール（登録商標，Toyopearl）（トーソーハース，モントゴメリービル，ペンシルバニア）樹脂；Ｑｕａｔ、ＤＥＡＥまたはＰＥＩで誘導化されたアクチ−ディスク（登録商標，Acti-Disk）（ホワットマン，クリフトン，ニュージャージー）支持体；ＤＥＡＥで誘導化されたセファロース（登録商標，Sepharose）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）樹脂；ＤＥＡＥで誘導化されたセファセル（登録商標，Sephacel）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）樹脂；ＤＥＡＥまたはＱＡＥで誘導化されたセファデックス（登録商標，Sephadex）樹脂を包含する。好ましいアニオン交換樹脂はＤＥＡＥ基で誘導化されており、そしてさらに好ましいカラムはフラクトゲル、トヨパールおよびストリームライン（登録商標，Streamline）（ファルマシア，ピスカタウェイ，ニュージャージー）ＤＥＡＥ樹脂である。
同様に、「カチオン交換樹脂」という用語は不活性ポリマー支持体に共有結合により架橋結合した負に荷電した有機部分を意味する。代表的な負に荷電した部分はカルボキシメチル（ＣＭ）およびスルホメチル（ＳＰ）基を包含する。約５．０ないし約９．０のｐＨ範囲内の負の形式電荷を既に有するか、または有するであろう他の有機部分はまたこの定義内に包含される。アニオン交換樹脂のための支持体および使用方法に対する上記記載はカチオン交換樹脂にも同様に当てはまる。適当な市販されて利用可能なカチオン交換樹脂の例は、ＣＭまたはＳＰ基のいずれかに共有結合したセファロース、セファセルおよびセファデックスを包含する。
「固定化金属イオン親和性（アフィニティ）クロマトグラフィー」（“ＩＭＡＣ”）樹脂は金属キレート化基と共有結合で架橋結合した不活性な天然または合成ポリマー支持体を意味する。金属キレート化基は形式的な（＋２）酸化状態で亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、カルシウムまたはマグネシウムイオンに結合することが当業界で知られているものである。そのような基はイミノ二酢酸（ＩＤＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基、Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸基、および誘導体例えばＮ−（メチル）、およびＮ−（ヒドロキシメチル）ＩＤＡ基を包含する。これらの基は標準的脂肪族エーテル結合および試薬、例えばビスオキシラン、エピクロロヒドリンおよび１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンにより天然または合成ポリマー支持体に架橋結合され得る。本発明の方法のために、キレート化基は上記金属（亜鉛が好ましい金属）のいずれかに結合され得る。用語「アニオン交換樹脂」に対して上記した化学的組成、物理的形態およびポリマー支持体の使用方法の記載はＩＭＡＣ樹脂にも同様に当てはまる。架橋結合されたアガロースおよび「触手」支持体が好ましい。ウイルスベクターは、高まる濃度の競合キレート化剤、例えばイミダゾール、ヒスタミン、グリシンまたは塩化アンモニウムを添加することによりＩＭＡＣカラムから溶離され得、また、使用されるｐＨ勾配の範囲の最大最小が約５ないし約９に留まりさえすれば、溶離剤のｐＨは高められても、低められてもよい。当該方法に使用され得る市販されて利用可能な製品の例はアクチ−ディスクＩＤＡカートリッジ（ホワットマン）、フラクトゲルＡＦキレート、およびトヨパールＡＦキレートＩＭＡＣ樹脂を包含する。
さらに、ウイルスベクター、例えば５型アデノウイルスから誘導されるベクターのＤＥＡＥでの精製のための固定化金属親和性イオン樹脂に対する好ましい条件は、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、カルシウムおよびマグネシウムからなる群から選択される２価金属カチオンで荷電された樹脂を有し、そしてさらに、該樹脂はＩＤＡまたはＴＥＤ架橋結合されたアガロース樹脂、特に亜鉛イオンで荷電されたＩＤＡアガロース樹脂である。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（“ＨＩＣ”）は本発明の方法におけるＩＭＡＣ樹脂に取って代えられ得る。そのような樹脂は非極性基、例えば脂肪族エーテルを介して不活性ポリマー支持体に共有結合した低級アルキルまたはアリール基を有する。低級アルキル基、例えばメチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ネオペンチル基、およびオクチル基およびフェニル基は本発明の樹脂上の相互作用基の例である。ブチル基は好ましい相互作用基である。用語「アニオン交換樹脂」に対して上記した化学的組成、物理的形態および支持体の使用方法の記載はＨＩＣ樹脂にも当てはまる。架橋結合されたアガロース、ヒドロキシル化されたポリエーテル、親水性媒体およびシリカは好ましい支持体であり、架橋結合されたアガロースが最も好ましい。ウイルスベクターは低下する塩勾配（硫酸アンモニウムが好ましい塩である）によりＨＩＣ樹脂から溶離されて精製され得る。本発明のために有用な市販されて利用可能であるＨＩＣカラムの例は架橋結合されたアガロースカラム、例えばフェニル−、ブチル−およびオクチルセファロース、およびトヨパール（フェニル，プロピルおよびブチル）およびフラクトゲル（プロピルまたはフェニル）を包含する。
上記したように、本発明においてＩＭＡＣまたはＨＩＣ樹脂はアニオン交換樹脂の前または後に使用され得る。前に使用されるならば、ＨＩＣまたはＩＭＡＣ樹脂からの溶出液の塩濃度は、交換樹脂からのウイルス粒子の早期流出を防止するために、約４５０ミリモル未満まで希釈されるべきである。
「緩衝剤」または「緩衝化溶液」という用語は、それが溶液中に存在するならば、酸または塩基が添加された場合に溶液に生じるであろうｐＨの変化を低減または緩和する酸および塩基の混合物を意味する。一つの態様において、細胞溶菌液は緩衝化溶液中に維持される。適当な緩衝剤は約５．０と約９．０の間に得られる溶液のｐＨを維持し得るものである。そのような緩衝剤は市販されて利用可能であり、そしてホスフェート，ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ，ボレート，ＴＲＩＳ，ＢＥＳ，ＡＤＡ，ＡＣＥＳ，ＰＩＰＥＳ，ＭＯＰＳＯ，ＢＩＳ−ＴＲＩＳＰＲＯＰＡＮＥ，ＢＥＳ，ＴＥＳ，ＤＩＰＳＯ，ＴＡＰＳＯ，ＴＲＩＺＭＡ，ＨＥＰＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ，ＴＥＡ，ＥＰＰＳ，ＴＲＩＣＩＮＥ，ＧＬＹＣＹＬＧＬＹＣＩＮＥ，ＢＩＣＩＮＥ，ＴＡＰＳ等を包含する。好ましい緩衝剤はホスフェート，ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ，ボレートおよびＴＲＩＳを包含し、そしてＨＥＰＥＳが最も好ましい。
ウイルスベクター、例えば遺伝子治療に使用するための５型と呼ばれるアデノウイルスベクターを精製するためのクロマトグラフィーの使用は、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に代わる有効手段であることが示されている。この方法論には、品質、一貫性、処理時間の短縮、系の自動化および大量の粗製溶菌液の処理能等の種々の利点がある。本発明に記載された精製スキームはビリオンの表面の特徴に基づいて生成物を選択する。これらの特徴は、例えば構築体内に異なる治療遺伝子を有する異なる内部ＤＮＡ構築体で変化せず、それ故に、類似のクロマトグラフィー応答を導く。換言すれば、クロマトグラフィーはベクター内に挿入された治療遺伝子の性質により影響されない。
アニオン交換樹脂、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は当業者には公知の方法を用いて洗浄される。例えば、ＤＥＡＥはＮａＯＨで最初に、次にＨＣｌで、最後にＮａＣｌで処理される。ＩＺＡＣはＥＤＴＡで最初に、次にＮａＯＨ、ＨＣｌ、ＮａＣｌフラッシュをＨ₂Ｏと共に各段階の間に処理される。カラムは適当な結合条件を用いて適当な緩衝剤で平衡化される。カラムには、ＤＥＡＥのためのｐＨおよび塩濃度を調整し、そして固定化金属イオン親和性カラムのためのｐＨ、塩濃度および２価金属イオン濃度を調整することにより生成物が樹脂に結合するであろう緩衝剤中の試料が注入される。カラムは洗浄されて混入物が除去され、そして再利用され得る。
本発明の他の態様は、酵素性薬剤での処理後に細胞溶菌液を濾過する追加の段階を包含する。別の態様において、細胞溶菌液はそれを第１の樹脂に注入する（アプライする）前に約５．０と約９．０の間のｐＨにベンゾナーゼでの処理に先立ち緩衝化される。これらの態様はレトロウイルスまたはアデノウイルスのいずれかから誘導される組換えウイルスベクターの精製のために好ましく、そして特にベクターがアデノウイルスから誘導される場合が好ましく、そしてそのようなベクターは腫瘍サプレッサー遺伝子を含有する。
腫瘍サプレッサー遺伝子を含有するアデノウイルス誘導ベクターを精製するための他の態様は、処理後の緩衝化細胞溶菌液がアニオン交換樹脂上で最初にクロマトグラフィーが行われ、次いで固定化金属親和性樹脂上でクロマトグラフィーが行われる場合のものである。これらの条件は、組換えウイルスベクターが２型または５型のアデノウイルス、特に５型のアデノウイルスから誘導される場合に特に好ましい。
細胞溶菌液を処理するために使用される酵素性薬剤は１またはそれ以上の酵素であり、特に当業者には公知であるような、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼからなる群から選択されるもの、またはエンドヌクレアーゼの混合物である。この態様において使用するための好ましい酵素性薬剤はベンゾナーゼ（登録商標，Benzonase）、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を切断する組換え非特異的ヌクレアーゼである。
最後に、これまで記載したものの中の特に好ましい方法は、５型アデノウイルス誘導組換えウイルスベクターが野生型ｐ５３遺伝子を含有するゲノムを有する場合である。
実験の部
工程１
ＡＣＮ５３標準物質（ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３）
ＡＣＮ５３と命名されている標準組換えアデノウイルス５型はヒトサイトメガウイルスプロモータにより駆動される全長1.４−ｋｂのｐ５３ｃＤＮＡを持つＦ１をコードしている配列を持つ５型アデノウイルスから誘導されたベクターである（Ｗｉｌｌｓｅｔａｌ．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：１０７９−１０８８（１９９４））。ウイルスは、（Ｌａｖｅｒｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：５９８−６１４（１９７１））に記述されている３段階遠心分離法を下記のように変形したものである。感染した細胞を、凍結−解凍の３周期により溶菌しそしてＳｏｒｖａｌｌＲＣ−５Ｂ遠心分離機中、１５，０００rpmで４℃で１０分間にわたり遠心分離した。ペレットを廃棄し、上澄み液をＢｅｎｚｏｎａｓｅ^TMを使用して１３３Ｕ／ｍＬ、室温で３０分間にわたり処理した。次いで、処理した物質を、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ8.１中の1.２５ｇ／ｍＬと1.４０ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ非連続段階勾配上に層状に置き、ＳｏｒｖａｌｌＴＳＴ４１−１４ロータ中、３０，０００rpm、１０℃で７５分間にわたり遠心分離した。各々の管からのウイルスバンドを集め、1.３５ｇ／ｍＬＣｓＣｌ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ8.１）と混合し、ＢｅｃｋｍａｎＶＴｉ５０ロータ中、４５，０００rpm，１０℃で遠心分離した。各々の管からのウイルスバンドを集め、前と同様にして４５，０００rpmで更に４時間にわたり遠心分離した。この段階からの最後のウイルスプールを、スクロース２％と２ｍＭＭｇＣｌ₂を添加したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して広範囲に４℃で透析した。精製したウイルスプールをヒト胎芽腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））から購入）に、下記の工程２に記述の通り感染するのに使用した。
工程２
ＡＴＣＣ２９３細胞の増殖、採取と溶菌
ＡＴＣＣ２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）細胞をＣＯ₂インキュベータ中、1.５Ｌの下記の組成を持つ培養液中、ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ^TM（Ｎｕｎｃ，Ｒｕｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）中で培養した〔定義した１０％Ｈｙｃｌｏｎｅウシ血清を含むＤＭＥ高グルコース培養液、２ｍＭグルタミン（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎｔａＡｎａ，Ｃａｌｉｆｏｎｉａ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補填した。抗生物質は培養液に添加してない。〕。
ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ^TM接種、二日ないし二日半後に、細胞単層の約５０−６０％が合流した時に、細胞に新鮮培養液５００ｍＬに細胞当り５ないし１０感染単位を複数回感染（ＭＯＩ）で感染した。ウイルスを培養液に添加し、十分に攪拌し、ユニット中の細胞に導入した。
調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）１からの細胞単層がＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ^TMの表面からの剥離の徴候を示した時に（普通は感染後３ないし４日）、ゆっくりと出して細胞を採取し、ＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６中、１５００rpmで５分間にわたり遠心分離した。それらを血清を含まない培養液で一度洗浄し、再度ペレット化し、超遠心分離−誘導標準ウイルスの調製に使用するための２５ｍＬの５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ8.０／１５０ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ₂，２％スクロースに再懸濁した。実施例１ないし３を通して使用する予定の試料は、２５ｍＬの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ7.５／１５０ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ₂，２％スクロースに再懸濁した。細胞をこの時点で凍結−解凍の３周期により溶菌した。３回目の周期に続いて、細胞破片を、ＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６中、１５００rpm、４℃での５分間にわたる遠心分離により除いた。
工程３
組換えアデノウイルス粒子を含有する試料のウエスタンブロット分析
ＳＤＣ−ＰＡＧＥゲルを実施例３、工程Ｆに記載したのと同様に、銀染色したゲルに大体同じ量を添加して、実施した。次いでバンドを１００％メタノールで予湿潤しそしてＴｒｉｓ緩衝した生理食塩水（ＴＢＳ）中平衡させたＰＶＤＦ膜に移した。そのゲルもＴＢＳ中で平衡させた。タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ半乾燥移動装置を２５Ｖで３０分間使用してその膜に移した。次いでその膜を１％カゼイン／0.０１％窒化ナトリウムで一夜、４℃又は室温で１時間ブロックし、ＴＢＳで３回洗浄した。その膜を一番目の抗体（ＣｙｔｉｍｍｕｎｅｒａｂｂｉｔＩｇＧａ−アデノウイルス５型，ＬｅｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ：ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）５μｇ／ｍＬ（ＴＢＳ中）と共に１時間にわたり室温で保温した。一番目の保温に続いて、膜をＴＢＳで３回洗浄し２番目の抗体（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）Ｈｏｒｓｅｒｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇ）１μＬストック抗体／１ｍＬＴＢＳに希釈した）と共に室温で１時間保温した。最後の３回の洗浄をＴＢＳで実施しそして膜をＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ検出試薬と共に１分間保温し、暗所でいろいろの時間（いろいろの対照を選択するために数秒ないし数分）、ハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光し、そしてＸ線フィルム現像液中で現像した。
このウエスタンブロット分析を使用して、いろいろの精製状態にあるＡＣＮ５３のバンドパターンの間の相違を図７で見ることができる。
工程４
ＳＤＳ存在下の２６０ｎｍにおける吸光度による組換えアデノウイルス粒子数の測定
この測定のために、濃厚ウイルスをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中、0.１％ＳＤＳ中の１０中の１に希釈する。試料を１分間渦攪拌し、Ｅｐｅｎｄｏｒｆｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で１４，０００rpmで遠心分離し沈澱物を除いた。キュベットの合致する対を、ＰＢＳ緩衝液中0.１％ＳＤＳを使用して、島津ＵＶ１６０Ｕ分光光度計（ＳｉｍａｄｚｕＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ．）上にベースライン走査線を記載することによりブランクを決める。次いでＳＤＳ処理したウイルス試料を試料キュベット中に置きそして２２０ｎｍから３４０ｎｍまで走査した。３１０ないし３２０の間に吸光がある場合は、試料は濃過ぎるので更に希釈しそして再測定した。Ａ₂₅₀／Ａ₂₈₀比もこの走査から決め、そしてそれは粒子数を測定するために十分に純粋であることを確実にするためには1.２と1.３の間になければならない。もしこの条件が満たされるならば２６０ｎｍだけにおける吸光度はヴィリオン／ｍＬ数を計算するのに使用される。２６０ｎｍにおける吸光単位当り1.１×１０¹²粒子の変換係数（Ｍａｉｚｅｌｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３６：１１５−１２５（１９６８））は、粒子数を計算するのに約１０％の誤差で使用されていた。アニオン交換クロマトグラフィーだけにかけた試料（即ち、ＤＥＡＥ樹脂を使用する実施例１と２）の典型的な値は1.１４ないし1.１９の間であった。そのような試料を実施例３に記載したＩＺＡＣに処すると、その比は1.２２ないし1.２５の範囲にあった。
実施例１
未カプセル化核酸の溶菌
ヌクレアーゼ処理
感染した細胞の溶菌液は初めは宿主細胞とウイルスの両方の汚染物からなる。これらの汚染物のあるものは、クロマトグラフィーに先立って除かれる。特に宿主細胞、未カプセル化又は不完全ＡＣＮ５３核酸はＢｅｎｚｏｎａｓｅ^TMのようなヌクレアーゼを使用する工程のこの段階で酵素的に分解された。これは、二つの理由により工程の早期に実施されてよい。初期のＢｅｎｚｏｎａｓｅ^TM処理はアニオン交換樹脂における収率を良くする。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^TMを次の工程段階で除いた。その工程の間のＢｅｎｚｏｎａｓｅの存在は市販のＥＬＩＳＡキット（ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＤ）により測定し得る。
処理した溶菌液の清澄化は、遠心分離よりはむしろろ過により実施された。遅い回転を細胞破片を除くのに使用した（図１）。次に１番目のカラム上に乗せるための生成物を調製するためにろ過を使用した。使用したろ過材の型（即ち、組成と孔径）とその効果的な生成物回収は実施例３、工程Ａに記載されている定量アニオン交換測定法により評定された。
遠心分離の次は、ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｒｏｄｉｓｃ^TM0.８／0.２μｍの２段円筒ろ過器を通過するものであった。ＡＣＮ５３の回収は、ろ過に使用された孔径と膜の型に依存した。ポリスルホン酸、ＰＶＤＦ膜と酢酸セルロース膜を基材とする膜のようなろ過材が使用された。ポリスルホンとＰＶＤＦが好ましかった。
この段階での上澄み液を、ＭｇＣｌ₂２ｍＭ、スクロース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）及びβ−シクロデキストリン2.５％（ｗｔ／ｖｏｌ）にした。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^TM（ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）は最終濃度１００単位／ｍＬになるまで添加しそして１時間室温で保温した。処理した物質を、ＢｅｃｋｍａｎＴＪ−６中、３０００rpmでの１０分間にわたる遠心分離とＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｒｏｄｉｓｃ^TM0.８／0.２μｍのろ過器を通過するろ過により清澄化した。得られた上澄み液を実施例２用に採取した。
実施例２
アニオン交換クロマトグラフィー
全体を通して、ＤＥＡＥクロマトグラフィーの特性は一貫していることが見出され、そして高濃度溶菌液（３×１０¹²ＡＣＮ５３粒子／ｍＬ）による負荷試験は注入された体積と回収されたＡＣＮ５３ピーク領域の間で一次応答（ｌｉｎｅａｒｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示した。一次塩勾配（ｌｉｎｅａｒｓａｌｔｇｒａｄｉｅｎｔ）の導入によるＤＥＡＥカラムの溶離は３個の主要なピークを示した。これらピークの一番目は約0.５のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀比を持つタンパク質ピークであった。次はＡＣＮ５３ピーク（Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀＝1.２３）であり、それに続いて、勾配（グラジエント）の末端にＤＮＡ（Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀＝２）ピークがあった。同じピークが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液又はリン酸塩緩衝系のいずれでも得られた。ｐＨは変更できるが、ＨＥＰＥＳｐＨ７．５／ＮａＣｌ／スクロース／ＭｇＣｌ₂を使用してｐＨ7.５で操作するとより汚染の少ない物質がカラムに吸着される。ＤＥＡＥクロマトグラフィーは高程度の初期精製をもたらす。不動化金属イオン精製クロマトグラフィー段階はこれらの汚染物を除く。
カラム樹脂をその分離性能について、6.６×５０ｍｍ（1.７ｍＬ）の硼珪酸Ｏｍｎｉｆｉｔ^TMカラム（ＯｍｎｉｆｉｔＬｔｄ．，ケンブリッジ、イングランド）中で試験した。カラムはＰｅｒＳｅｐｔｉｖＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏｃａｄ^TM（ケンブリッジ、ＭＡ）クロマトグラフィーワークステーションで取り付けた。クロマトグラフィーはオンラインで、ｐＨ、電導度と２８０ｎｍと２６０ｎｍの二つの波長における光学密度について追跡、調査された。
アニオン交換樹脂は、１ｍＬ／分において、５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ7.５，３００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ₂，２％スクロースで平衡化された。５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ8.０（３０ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇＣｌ₂，２％スクロースを含む）も使用された。細胞溶菌液を充填した後、吸光度により追跡してベースラインまで洗浄し、溶離は２０カラム容積の３００−６００ｍＭ一次ＮａＣｌ勾配で実施し、0.５ｍＬのフラクションを採取した。将来の使用のために、次にカラムを２カラム容量の0.５ＭＮａＯＨ，1.５ＭＮａＣｌ洗浄液で清浄にし次に再平衡化した。
適当な対照保持時間を得るために、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８中で平衡化したＤＥＡＥカラム上に、２ｍＬ／分（３５０ｃｍ／ｈｒ）で、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３を、注入しそして１０分間（１1.７カラム容積の）０−1.５Ｍ一次ＮａＣｌ勾配で溶離した。1.２３のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀が検出された。このフラクション中に存在するタンパク質バンドはスロット−ブロット（ｓｌｏｔ−ｂｌｏｔ）分析上のＡｄ５ポリクロナール抗体と反応した。
幾つかのピークを、感染細胞溶菌液試料をＤＥＡＥカラム（図２）に適用した時に分割した。ピークの組成はＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀吸光比から推測した。例えば１番目のピークは、0.５のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀比を持つので主にタンパク質である。三番目のピークは２のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀比を持つので、この物質は核酸であることを暗示している。ＡＣＮ５３ウイルスピークは1.２３の比を持って二番目に溶離した。これらのピークの同定は、実験を一部変更しそして各々のピークをＳＤＳゲルに通すことにより確認した。上述の条件を使用する典型的な試験では、1.２３±0.８のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀比がウイルスピークの特性であることが見出された。
ＤＥＡＥクロマトグラフィーの精製能を評価するために、感染しなかったＡＴＣＣ−２９３細胞溶菌液とＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の両方をカラムに適用した（図３）。宿主細胞物質の殆どは負荷の間にカラムを通過するか又はＡＣＮ５３の保持時間より早い時間に溶離したというものの、小さいピークがＡＣＮ５３と同じ保持時間に溶離した。これらのデータから、ＡＣＮ５３ピークのウイルス性でない汚染物は、宿主細胞物質からであると期待される。汚染ピーク、即ち図３に示した細胞溶菌液試料中の最後に溶離するピークの検査は、約２のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀ｎｍ比であることを明らかにした。これは、そのピークは高い核酸含量を持ちそしてヌクレアーゼ処理により減少又は排除することが可能であることを示している。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ^TM前処理をした又はしないＤＥＡＥ操作は、その酵素がＡＣＮフラクションプール中の宿主細胞からの汚染物の量を減少することを示した。
実施例３
固定化金属親和性クロマトグラフィー
二価カチオンとして亜鉛原子を使用する（ＩＺＡＣ）固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、高い生成物の回収率を与え、またロードする前のＤＥＡＤ画分プールのあらゆる試料操作を必要としなかった。この方法によって除去される不純物は流出分ピーク中に溶出し、また生成物から良く溶解し、シンンプラープール基準に導く。ＩＺＡＣは再生可能で、またＤＥＡＥを伴って使用されたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロッド、Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀比および感染しない粒子に対する感染する粒子の比によって特定される、純粋なＡＣＮ５３を得ることが可能である２カラム精製プロトコルを与える。要約された全体のプロトコルは以下のようである。

全粒子および感染する単位における段階ごとの回収率を実験セクションにおける表１および２に要約する。
固定化亜鉛親和性クロマトグラフィー（ＩＺＡＣ）系を、それぞれの段階後の水でのフラッシングを伴う１００ｍＭＥＤＴＡ１体積部および０．２ＭＮａＯＨ１体積部で連続してカラムを洗浄することにより、金属チャージすることに備えた。マトリクスを続いて亜鉛原子で、０．５μＬ／ｍＬ氷酢酸で酸性化されたＨ₂Ｏ中の１００ｍＭＺｎＣｌ₂の１カラムの体積を注入することによってチャージした。マトリクスをその後５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５／４５０ｍＭＮａＣｌ／２％スクロース／２ｍＭＭｇＣｌ₂中での平衡化の前に、水中で完全に洗浄した。試料のロードはあらゆる操作を必要とせず、ＤＥＡＥプール画分またはＣｓＣｌ誘導された物質はカラムに直接に注入された。ロード後、カラムを５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５／４５０ｍＭＮａＣｌ／２％スクロース／２ｍＭＭｇＣｌ₂から５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５／１５０ｍＭＮａＣｌ／２％スクロース／２ｍＭＭｇＣｌ₂への、１０カラム体積の減少するＮａＣｌ線形勾配液で洗浄した。溶出を、１０カラム体積以上が適用された０ないし５００ｍＭの線形グリシン勾配液（１５０ｍＭＮａＣｌ中）で行われた。
ＡＣＮ５３の金属親和性カラムとの相互作用は金属特有の性質（亜鉛原子が好まれる）を示し、チャージされていないカラム（亜鉛原子で前ロードされていないカラム）へのＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３の注入は生成物ピークの流出分へのシフトの結果となった。実施例２画分プールからのＩＺＡＣで精製されたＡＣＮ５３−ＤＥＡＥを図５に示す。ＩＺＡＣ画分プールの分析は４９ないし６５％の収率および１．２２ないし１．２５のＡ₂₆₀／Ａ₂₈₀比を生じた。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３、ＤＥＡＥ精製およびＤＥＡＥ／ＩＺＡＣ精製された物質のゲルおよびウエスタンブロット比較を図６および７に見ることができる。ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３およびＤＥＡＥ／ＩＺＡＣ物質はとても類似しており、またＤＥＡＥのみで精製された物質はこれらの基準よりも純粋でない。
異なるＩＺＡＣバッファおよび溶出系の効果を、ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３プールを半分に分けそして両方の半分をＩＺＡＣでＨＥＰＥＳｐＨ７．５およびＴｒｉｓｐＨ８バッファ系中で精製することによって評価した。ＩＺＡＣはまた分離に影響することのないスクロースおよびＭｇＣｌ₂の存在中でも行った。金属イオンとしての銅および溶出試薬としてのイミダゾールの使用もまた試験した（金属親和性クロマトグラフィーの一般的な批評について、Belew et. al. 1987、Kato et. al. 1986を見よ。）。様々な系、亜鉛／グリシン、亜鉛／イミダゾール、銅／グリシンおよび銅／イミダゾールの全てが金属親和性精製カラムで作用した。ＡＣＮ５３をｐＨ７からｐＨ９への勾配液を使用して溶出することができる。
Ａ：アニオン交換ＨＰＬＣによる組換えアデノウイルス粒子数についてのアッセイ
１ｍＬＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（Pharmacia, Piscataway, NJ）アニオン交換カラムを、様々な試料中のウイルス粒子の数を定量するために使用した。カラムを３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中で１ｍＬ／分の流速で、７１７プラスオートサンプラーおよび９９１発光ダイオード配列検出器（ＰＤＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ６２５クロマトグラフィー系で平衡化した。クロマトグラフィーは２１０から３００ｎｍへ走査するＰＤＡ検出器（Milford, MA）で監視した。標準線を、選択された吸光度、０．１％ＳＤＳ中のＡ₂₆₀で全粒子について評価された、ＣｓＣｌ精製されたＡＣＮ５３ビリオンを注入することによって作成した。
アッセイは注入された試料の体積と無関係であった。試料をロードした後、カラムを平衡化バッファの２カラム体積、続いて５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の３００から６００ｍＭへのＮａＣｌ線形勾配液１０カラム体積以上で洗浄した。勾配液の次に５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の６００ｍＭＮａＣｌでの２カラム体積の洗浄を行った。それぞれのクロマトグラフィー実行の後に、カラムを５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の１．５ＭＮａＣｌの２．６カラム体積で清浄し、そしてその後次の注入のために再平衡化した。カラムは粗試料の注入後は０．５ＮＮａＯＨの０．２５ないし１カラム体積の注入、続く１．５Ｍ塩での洗浄によって、より強く清浄した。ＮａＯＨの注入およびその後の勾配液の流出は清浄を達成するための便利な方法であった。アデノウイルス粒子の存在の全数を測定することにおける前記アッセイの使用を以下の表１に説明する。

Ｂ：バッファ条件
バッファ条件の変化を７．０ないし８．０のｐＨ範囲における本研究のカラムクロマトグラフィーによるＡＣＮ５３の精製に使用した（例えば、Seth, Virology 68:1204-1206(1994)）。様々なｐＨ限界での崩壊についての調査を、崩壊についてＴＣＩＤ５０（後述の方法Ｃ）および分析的アニオン交換分析（上述の方法Ａ）によってアッセイすることによって行う。ＡＣＮ５３の生存率についてのバッファ塩濃度の効果は、イオン強度の急激な変化はウイルスの損失を導くことになることを示した。塩濃度は注意深く制御および監視されるべきである。
Ｃ：ＴＣＩＤ₅₀アッセイによる感染する組換えアデノウイルス粒子の測定
これらの実施例において教示される精製法の前、間および後の感染するアデノウイルスＴｙｐｅ５粒子の定量を、終点タイターアッセイ（組織培養感染率−５０％、略号ＴＣＩＤ₅₀）によって行う（Philipson, Virology 15:263-268(1961)を見よ。）。試薬、物質リストおよび説明はChemicon International, Inc(cat.#3130:"Adenovirus Direct Immunofluorescence Assay", Temecula, CA)から用いることができる。
ＡＴＣＣ２９３細胞を９６穴プレートに、完全ＭＥＭ（１０％子牛血清、１％グルタミン）培養液中にそれぞれの穴について１００μＬの５×１０⁵細胞／ｍＬをプレートする。個々のプレートにおいて、１：１０⁶に希釈されたウイルス試料の２５０μＬのアリコートを第一のカラムに添加し、そしてプレートにわたり連続して２倍に希釈する。一つの列をポジティブ制御（ＣｓＣｌ精製されたＡＣＮ５３）のために、一つの列をネガティブ制御のために保存する。それぞれの穴の１００μＬのアリコートをＡＴＣＣ−２９３種付けプレートにおける同一の位置へ移動し、３７℃で加湿インキュベーターにおいて２日間培養した。培養液をその後反転によってデカントし、そして細胞を５０％アセトン／５０％メタノールの添加で固定した。ＰＢＳでの洗浄後、固定された細胞を４５分間、キットの説明に従って製造されたＦＩＴＣラベルされたアンチ−ａｄ５抗体（Chemicon International #5016）と共に培養する。ＰＢＳでの洗浄後、プレートを蛍光顕微鏡（４９０ｎｍ励起、５２０ｎｍ放射）下で検査し、そしてラベルの存在について得点をつけた。タイターはTiterprint Analysisプログラム（Lynn, Bio Techniques, 12:880-881(1994)）を使用して定量した。本方法に従って行われたアッセイからの結果を以下の表２に説明し、該表は上述の表１からの値を使用して計算された比を包含する。

全ウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比は製造ごとに広範囲に変化することができる。ＣｓＣｌ誘導されたウイルスについての値は６０ないし８０の範囲である。粗溶解液または半精製画分におけるこの比の計算は、アニオン交換粒子アッセイ（実施例３［Ａ］を見よ。）によって可能とされた。分析的アニオン交換を使用して、理想的なウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比における変化を監視することができる。本発明の精製方法を使用して、粗溶解液および続いて精製される物質の全ウイルス粒子の感染するウイルス粒子に対する比を、超遠心分離を使用して得られたものと比較することができる。アッセイの誤差内において、これらの値は等価である。この基準により、クロマトグラフ精製にウイルスは良い耐性がある。他の基準、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッド分析（図６および７）により、クロマトグラフ精製は超遠心分離に基づいた方法より優れている。
Ｄ：Ｐ５３タンパク質の発現による感染する組換えアデノウイルス粒子についてのアッセイ
ウイルス製造物の活性をまたＳａｏｓ−２細胞、ｐ５３−ネガティブ骨肉腫細胞ラインにおけるｐ５３遺伝子生成物の発現についてアッセイすることによって試験した。Ｓａｏｓ−２細胞を６穴組織培養プレート中に５×１０⁵細胞／穴の濃度で培養液、２ｍＭＬ−グルタミンおよび１０％牛胎児血清を補充されたＫａｉｇｈｎ’ｓ栄養混合物Ｆ１２：ＤＭＥＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ（１：１混合物）３ｍＬ中に種付けした。細胞を加湿空気において、７±１％ＣＯ₂、３７℃で１６ないし２４時間培養した。使い終った培養液を除去し、そして１ｍＬの新鮮な培養液で置き換え、そして細胞を精製されたウイルスの２０、４０、または６０ＭＯＩで感染させた。１時間の培養後、さらなる２ｍＬの培養液を添加しそして８時間培養させた。細胞をその後一度Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＰＢＳで洗浄し、そして５０ｍＭｔｒｉｓ／０．５％ＮｏｒｉｄｅｔＰ−４０／２５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＥＤＴＡ／５ｍＭＮａＦ／５μｇ／ｍＬＬｅｕｐｅｐｔｉｎおよび５μｇ／ｍＬＡｐｒｏｔｉｎｉｎ／２ｍＭＰＭＳＦの２５０μＬの添加により溶解した。プレートを氷上で５分間培養し、その後溶解液を個々の１．７ｍＬマイクロ遠心分離チューブに移した。それらを４５秒間１４０００ｒｐｍでミクロヒュージ（microfuge）において回転降下し、そして上清をｐ５３タンパク質の存在についてウエスタンブロット分析によってプライマリーアンチ−ｐ５３モノクローナル抗体１８０１（Vector Laboratories, Burlingame, California）および羊アンチ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ並びにストレプトアビジン（streptavidin）−ＨＲＰ（Amersham）の１：１混合物でアッセイした。ｐ５３タンパク質バンドをＡｍｅｒｓｈａｍ’ｓＥＣＬ検出キットを使用して、製造者説明に従って検出した。前記アッセイの使用の結果を図８に示す。ｐ５３の発現は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって並びにＤＥＡＥおよびＩＺＡＣクロマトグラフィーの両方によってのみ精製されたＡＣＮ５３において見ることができる。（レーン５および６における低いレベルの発現は、これらの試料がＤＥＡＥ試料よりも低いＭＯＩで行われた事実のためである。）
Ｅ：宿主細胞タンパク質汚染物
宿主細胞汚染物をウエスタンブロッド分析によってＡＴＣＣ−２９３細胞成分に対して発生分化されたポリクローナル抗体を使用してアッセイした。ポリクローナル抗体を商業的に得、そして様々な２９３種の細胞抗原（HTI, Ramona, CA）に対して育成した。結果はＣｓＣｌまたはＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ精製の最終精製物は、検出可能な宿主細胞汚染物を含まないことを示した。半精製ＤＥＡＥ−ＡＣＮ５３の場合、精製プールにおいて見られる少量の免疫性汚染物、３本の主なバンドおよびいくつかの小さいものが存在した。宿主細胞汚染物の大部分はＤＥＡＥ段階の流出分中に回収される。ＡＣＮ５３でＤＥＡＥ段階において補助精製された汚染物を亜鉛親和性クロマトグラフィーによって除去し、そしてグリシン勾配液の挿入前にＩＺＡＣ流出画分中に回収した。
Ｆ：組換えアデノウイルス粒子を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析試料
クーマシー青着色のために、１００ないし２００μＬのアデノウイルス含有試料（約１×１０¹¹粒子／ｍＬ）を収集し、トリクロロ酢酸沈殿により、または透析および続くスピード−バック（speed-vac）における濃縮により脱塩する。試料をその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元バッファ（１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノール青、０．５％β−メルカプトエタノール）中で約３０μＬに再懸濁し、５分間煮沸しそして１ｍｍ×１０穴Ｎｏｖｅｘ８ないし１６％勾配Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅｍｉｎｉｇｅｌにロードした。試料を１．５時間１４０Ｖで電気泳動した。ゲルをその後４０％メタノール／１０％酢酸中で３０分間固定し、そしてその後クーマシーをＰｒｏ−Ｂｌｕｅ着色系（Integrated Separation Systems, Natick MA）で販売者の方法に従って着色した。
銀着色されるゲルに５ないし１５μＬの試料をロードした。試料を当体積の還元バッファと共に煮沸し、そしてクーマシー検出について記載したように電気泳動した。固定はゲルを１０％トリクロロ酢酸中で１時間処理し、続いて１８ｍｅｇｏｈｍに精製された水中で３回洗浄することにより行った。ゲルはＤａｉｉｃｈｉ銀着色キットで与えられた説明（Integrated Separation Systems）に従って着色された。
実施例ＩＶ
ベクターの感染性、治療的遺伝子の移動
ＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ−ＡＣＮ５３の評価は、ビリオンがＴＣＤＩＤ₅₀によって測定されたようにクロマト処理の間にそれらの感染性を保ち（表１、２）、そしてＳａｏｓ−２細胞におけるＰ５３タンパク質発現によってアッセイされたように遺伝子移動を生じることができるこを示している。このＤＥＡＥ−ＩＺＡＣ−ＡＣＮ５３のＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける比較は、ＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３において存在するより低分子量のタンパク質バンドが存在することを示している。異なるＣｓＣｌ−ＡＣＮ５３ロットの互いに横に並べた比較は、クロマトグラフィー的に生成された物質がとても良く合致するのに対して、いくらかのバッチ毎の変化性を示している。感染する粒子に対する全体の比および両方の種類の物質の吸収スペクトルは直接比較できる。クロマトグラフィー的に生成されたＡＣＮ５３の純度および活性についての評価は、１日の２カラム方法は３日の超遠心分離プロトコルに置き換わることができることを示している。
ＡＣＮ５３について上述で示されたような好ましい精製計画は、クロマトグラフィー段階の前に感染された細胞溶解液をＢｅｎｚｏｎａｓｅ^TMで処理するものである。清浄がその後０．８μｍおよび続く０．２μｍ膜を通るろ過段階によって行われる。もし必要ならば、大孔（例えば、５μｍ）前ろ過段階を、さらなる粘性懸濁のために追加することができる。ｐＨ７．５／３００ｍＭＮａＣｌへの調整がその後ＤＥＡＥカラムへのロードのための準備において行われる。Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀ｎｍ比によって、または特性発光ダイオード配列スペクトルによって検出されるような精製物ピークはプールされ、そして亜鉛−チャージされ等浸透圧に平衡化された金属親和性カラムに直接に注入される。バッファのイオン強度はその後、グリシン勾配液での生成物の溶出の前に、ほぼホスフェートバッファされた食塩水（およそ１５０ｍＭＮａＣｌ）に徐々に低下される。この物質がその後最終配合物へと透析される。 Background of the Invention
The treatment of disease by gene therapy has shifted from the theoretical to the practical domain. The first human gene therapy attempt was started in September 1990 and involved transferring the adenosine deaminase (ADA) gene to lymphocytes of patients deficient in this enzyme. Lack of ADA activity results in immune deficiency. Viral vectors have been particularly promising in some ways to deliver therapeutic genes to affected cells. Tumor suppressor genes have been studied to treat cancer cells. Viral vectors containing such tumor suppressor genes are being evaluated in the field of cancer therapy as potential therapeutics. Recently, adenoviral vectors have received particular attention as advantageous vectors for the production of such tumor suppressor genes and other biological response modifiers. As cancer gene therapy research moves into clinical trials, more and more purified viral vectors are needed. One problem in producing an appropriate amount of vector for such a test is the purification of the particles from the cell lysate from which the virus particles are produced.
In particular, purification of these vectors has historically been performed by using a density-based ultracentrifugation method. Although this method has proved effective for use as a research tool, it is not feasible as a method for industrial scale production. Unless new purification schemes can be developed, meeting future material demand will result in prohibitive costs. One alternative to ultracentrifugation is a chromatographic technique for the purification of infectious virus particles.
The use of size exclusion chromatography for the purification of various plant viruses can be accomplished either as a proprietary technique or by augmentation density gradient centrifugation (Albrechtsen et al., J. Biol. Virological Methods 28: 245-256 (1990); and Hewish et al., J. Virological Methods 7: 223-228 (1983). Size exclusion has shown promise for bovine papilloma virus (Hjorth and Mereno-Lopez, J. Virological Methods 5: 151-158 (1982)); and the purification of tick encephalitis virus It has been shown to be an excellent method for [Crooks et al., J. Chrom. 502: 59-68 (1990)]. The use of size exclusion chromatography has not been widespread, but is currently used for large-scale production of recombinant retroviruses [Ment, S .; Jay. (Mento, S.J.), Viagen, Inc. (reported at the 1994 Williamsburg Bioprocessing Conference). Affinity chromatography (mostly using monoclonal antibodies (Mabs)) has been reported to be an effective method for the purification of antigens of viral origin [Najayou et al., J. Virological Methods, 32: 67-77 (1991)]. Soybean mosaic virus (a virus that can tolerate pH 3) can be recovered using Mab affinity chromatography [Diaco et al., J. Gen. Virol. 67: 345-351 (1986) ]. Fowler [J. Virological Methods, 11: 59-74 (1986)] used affinity chromatography and density gradient centrifugation to purify Epstein Barr virus.
Adenoviruses are large (about 80 nm in diameter) and somewhat fragile. A large literature base has been accumulated dealing with the relationship between structure and function [for review, see Philipson, Virology 15: 263-268 (1961) and Horwitz, Virology (second edition) Raven (See Raven Press Ltd, New York (1990)). Little has been reported in the literature regarding chromatographic purification of live adenoviruses. Haruna et al. [Virology 13: 264-267 (1961)] reported the use of DEAE ion exchange chromatography for the purification of

type

1, 3 and 8 adenoviruses, and Klemperer and Pereir (Virology 9: 536-545 (1959)) and Philipson (Virology 10: 459-465 (1960)) found it difficult to use the same method with other types of adenoviruses. reported. Poor resolution and poor yield are important issues with this method, which has prevented its use in large scale production.
Thus, there is a need for a chromatographic method for purifying viral vectors such as adenoviral vectors.
Summary of invention
One obstacle in successful examples of gene therapy is the availability of purified viral vectors to extract therapeutic genes. The present invention involves enzymatic treatment of a cell lysate containing a viral vector containing a therapeutic gene; subjecting the enzyme-treated cell lysate to chromatography on a first resin; and elution from a first column Chromatography of the solution on a second resin: Purifying the viral vector containing the therapeutic gene sufficiently for therapeutic and / or prophylactic use by using a three-step method consisting of: An unexpected and surprising discovery that it can solve the above problems. The resulting purified viral vector with the therapeutic gene retains its infectivity during and after chromatographic processing and can undergo gene transfer. For the first time by using the purification method of the present invention, a chromatographically purified viral vector containing a therapeutic gene is comparable to a viral vector purified using a three day ultracentrifugation method. It was found to be pure and active. The purification method of the present invention offers several advantages over existing methods, including the quality, consistency, reduced process time of purified virus vectors, and the ability to process large volumes of samples. Furthermore, since this new purification scheme is based on the surface properties of virions, this new purification scheme is not only for virions containing different internal DNA constructs with different therapeutic genes, but also for other virions using the teachings of the present invention. Widely applicable. This break-through purification method is an important aspect in the bulk commercialization of gene therapy.
Thus, the present invention provides a method for purifying a viral vector containing a therapeutic gene for use in gene therapy. In one embodiment, the present invention provides a method for purifying a recombinant viral vector containing a therapeutic gene from a cell lysate, wherein a) selectively selects both unencapsulated DNA and RNA. Treating the lysate with an enzymatic reagent that degrades; b) on the first resin, subjecting the treated lysate from step a) to chromatography; and then c) on the second resin. The eluate from step b) is chromatographed; in this case one resin is an anion exchange resin and the other resin is an immobilized metal ion chromatography (IMAC) resin. Including a method.
In another embodiment, the immobilized metal ion chromatography resin may be substituted with a hydrophobic interaction chromatography resin and / or the anion exchange resin may be substituted with a cation exchange resin.
In another embodiment, the enzymatically treated bacterial lysate undergoes a filtration step that adds a fourth step to the three-step method.
In a more preferred embodiment, the purified viral vector is an adenoviral vector containing a therapeutic gene. In an even more preferred embodiment, the adenoviral vector is a recombinant type 5 adenovirus having an internal DNA construct containing a tumor suppressor gene.
Brief description of the figure
FIG. 1: Recovery of ACN53 from crude infected cell lysate supernatant centrifuged at 5 ° C. for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge model 5415c at 4 °. Analysis for ACN53 was performed by analytical anion exchange.
FIG. 2: Identification of ACN53 infected cell lysate components and separation by DEAE chromatography by dual wavelength UV absorbance using 60/280 nm absorbance ratio.
Figure 3: CsCl-ACN53 control and host-cell contaminant retention time during DEAE purification. The elution of CsCl-ACN53 is compared to the elution of an uninfected H293 host cell lysate blank chromatographed on a DEAE column.
FIG. 4: Butyl-Hydrophobic Interaction Chromatography of DEAE-ACN53 fraction pool. A semi-pure DEAE purified ACN53 fraction pool was mixed with an equal volume of 50 mM Tris / pH 8.0 / 3 M ammonium sulfate and then injected onto a TosoHaas Butyl-650M column, then Elute with an ammonium sulfate gradient decreasing to 1.5-0M.
FIG. 5: Immobilized metal affinity chromatography of DEAE-ACN53 fraction pool. Semi-pure DEAE purified ACN53 fraction pool₂Were injected onto a 6.6 × 50 mm TosoHas AF chelate 650M column and then eluted with a linear 0-500 mM glycine gradient.
FIG. 6: SDS-PAGE control of ACN53 derived from column chromatography and CsCl-ultracentrifugation. Samples were electrophoresed on 8-16% gradient polyacrylamide gels and then stained with silver for analysis.

Lanes

2 and 3 are DEAE and IZAC eluate pools, respectively. Lanes 4-6 show three different lots of CsCl-ACN53 runs (CsCl-1, CsCl-2 and CsCl-3) in order to check the consistency between lots. In lane 7 (CsCl-ion exchanged lot), a sample of CsCl-ACN53 derived from the ion exchanged lot is purified on a Resource Q anion exchange HPLC column [Resource Q, Pharmacia]. Shows the ACN53 peak recovered in some cases.

Lanes

1 and 8 are standard molecular weight markers.
FIG. 7: Western Blot control of ACN53 derived from column chromatography and CsCl-ultracentrifugation. Samples identical to those previously described were electrophoresed on an 8-16% gradient gel and then transferred to a PVDF membrane. The blot was first incubated with 5 μg / ml Cytimmune rabbit 1 gG anti-adenovirus type 5 antibody, then incubated with Amersham's horseradish peroxidase conjugated with anti-rabbit 1 g and electrochemical Deployed using automatic detection.
FIG. 8: Expression of p53 gene product in Saos-2 cells. Two different lots of chromatographically produced ACN53 were analyzed by Western blot for the ability to undergo gene transfer to p53-null Saos-2 cells. The semi-pure DEAE fraction is shown in

lanes

7 and 8, and the final product is shown in

lanes

5 and 6. p53-expressing SW480 cells were used as positive controls; uninfected Saos-2 cells were used as negative controls.
Detailed Description of the Invention
The present invention
a) treating the cell lysate with an enzymatic agent that selectively degrades both non-encapsulated DNA and RNA; b) chromatography the treated lysate from step a) on a first resin. And c) chromatographing the eluate from step b) on a second resin, one of the resins being an anion exchange resin and the other being an immobilized metal ion affinity resin. The present invention relates to a method for purifying a recombinant viral vector containing a therapeutic gene from a cell lysate.
The term “viral vector” means a recombinant virus in which some or all of the genes in the original genome have been removed such that the virus is replication defective. In addition, the viral vector may be a virus containing a recombinant viral genome containing DNA encoding the therapeutic gene, such that the viral vector is used to transfer the therapeutic gene to a desired human cell for gene therapy. means. Exemplary vectors include those that infect mammalian, particularly human cells, and are derived from viruses selected from the group consisting of retroviruses, adenoviruses, herpesviruses and avipoxviruses. Retroviral and adenoviral vectors are preferred. Adenoviral vectors, particularly type 2 and type 5 adenoviral vectors are particularly preferred. A recombinant type 5 adenovirus vector is most preferred.
“Therapeutic gene” means a gene encoding a molecule having a desired therapeutic effect or a functional part thereof. For example, a gene that causes an increase in pathological cell growth or proliferation, either by its absence or mutation. A therapeutic gene as used herein replaces such absent or mutated genes. Therapeutic genes remain in the chromosome so that the gene is expressed by the cell from an extrachromosomal location, or the gene can be integrated into the genome of the cell so that it binds to the endogenous gene. Can cause effects. Such genes are Rb, Rb mutant, p53, p53 mutant, DCC, NF-1, Wilm tumor, NM23, BRCA-1, BRCA-2, BRUSH-1, p56, H-NUC, thyroid hormone Tumor suppressor genes including those selected from the group consisting of receptor genes, retinoic acid receptor genes, genes encoding p130, p107 and p85. Other gene replacement or supplemental strategies include genes encoding adenosine deaminase (ADA), thymidine kinase (TK), various cytokines such as γ-interferon, α-interferon, IL-2 and other hormones.
A therapeutic gene is also understood to include DNA encoding a ribozyme. Such DNA constructs are selected from the group consisting of selected positive acting growth regulatory genes, eg (1) c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc and JE A growth factor receptor gene RNA selected from, but not limited to, the group consisting of, but not limited to, oncogenes or proto-oncogenes; (2) epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, transferrin and insulin Encodes an RNA enzyme that binds to and breaks down.
A preferred therapeutic gene is a tumor suppressor gene, and most preferred tumor suppressor genes are Rb, Rb mutant, p53, p53 mutant, BRUSH-1, p56, BRCA-1, BRCA-2, p16 and p21.
The term “cell lysate” is a cell, such as a host cell containing a vector, preferably a viral vector, which is removed from their growth environment and their cell membranes are removed by physical or chemical means. It means an aggregate of destroyed cells.
The term “enzymatic agent” selectively degrades non-encapsulated DNA and RNA, but makes the recombinant viral vector non-infectious and transfers an intact copy of the therapeutic gene to the desired target cell Means a compound or mixture that does not decompose to the extent that it cannot be made. Such enzymatic agents are generally endonucleases or a combination of one or more enzymes called DNases or RNases. Benzonase (registered trademark, Benzonase) is a preferred enzymatic reagent.
The term “anion exchange resin” means a positively charged organic moiety covalently crosslinked to an inert polymer support. Exemplary organic moieties include primary, secondary, tertiary and quaternary amino groups such as trimethylaminoethyl (TMAE), diethylaminoethyl (DEAE), dimethylaminoethyl (DMAE) and other groups such as about 5 to about Extracted from polyethyleneimine (PEI) that already has or will have a positive formal charge in the pH range of 9.
Similarly, representative negatively charged organic groups are from the group consisting of carboxymethyl and sulfonylmethyl groups and other groups that have or will have a negative formal charge in the pH range of about 5 to about 9. Selected.
The support material should be easily derivatized and have good mechanical strength. The material may be a natural polymeric material, a synthetic polymer or copolymer, or a mixture of natural and synthetic polymers. The support can take the form of porous or non-porous particles, beads, membranes, disks or sheets. Such supports include silica, hydrophilic polymers [MonoBeads, Pharmacia, Piscataway, NJ], cross-linked cellulose [eg, Sephacel®], cross-linked dextran [ Eg Sephadex®), cross-linked agarose [eg Sepharose®], polystyrene or copolymers, eg polystyrene-divinylbenzene or oligoethylene glycol, glycidyl methacrylate and pentaerythrol dimethacrylate In which polymer chains of acrylamide derivatives are grafted (the latter copolymer is known as a “tentacle” support).
The resin can be used in traditional (gravity) column chromatography or high pressure liquid chromatography equipment using radial or axial flow, fluidized bed columns, or in slurry (batch) processes. In the latter method, the resin is separated from the sample by decantation or centrifugation or filtration or a combination of these methods. Viral vectors can be purified by eluting from the resin with a salt gradient, preferably a sodium chloride gradient.
Examples of suitable anion exchange resins are Fractogel® (E. Merck, Gibbstown, NJ) resin derivatized with either DEAE or DMAE; Fractogel (registered trademark) with DEAE, DMAE or TMAE Trademark) EMD Tentacle resin; DEAE or QAE derivatized Toyopearl (Toyohers, Montgomeryville, Pennsylvania) resin; Quat, DEAE or PEI derivatized Acti-disc (registered trademark, Acti) -Disk) (Whatman, Clifton, NJ) support; DEAE-derivatized Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) resin; DEAE-derivatized Sephacel (registered trademark, S) ephacel) (Pharmacia, Piscataway, NJ) resins; including DEAE or QAE derivatized Sephadex resins. Preferred anion exchange resins are derivatized with DEAE groups, and more preferred columns are fructogel, Toyopearl and Streamline (Pharmacia, Piscataway, NJ) DEAE resin.
Similarly, the term “cation exchange resin” means a negatively charged organic moiety covalently crosslinked to an inert polymer support. Exemplary negatively charged moieties include carboxymethyl (CM) and sulfomethyl (SP) groups. Other organic moieties that already have or will have a negative formal charge in the pH range of about 5.0 to about 9.0 are also included within this definition. The above description for supports and methods of use for anion exchange resins applies equally to cation exchange resins. Examples of suitable commercially available cation exchange resins include Sepharose, Sephacel and Sephadex covalently linked to either CM or SP groups.
"Immobilized metal ion affinity chromatography" ("IMAC") resin means an inert natural or synthetic polymer support covalently crosslinked with a metal chelating group. Metal chelating groups are those known in the art to bind to zinc, nickel, copper, cobalt, calcium or magnesium ions in a formal (+2) oxidation state. Such groups include iminodiacetic acid (IDA) groups, tris (carboxymethyl) ethylenediamine (TED) groups, N- (hydroxyethyl) ethylenediaminetriacetic acid groups, and derivatives such as N- (methyl) and N- (hydroxymethyl). ) Includes the IDA group. These groups can be cross-linked to natural or synthetic polymer supports by standard aliphatic ether linkages and reagents such as bisoxirane, epichlorohydrin and 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane. For the method of the present invention, the chelating group can be bound to any of the above metals (metals where zinc is preferred). The description of chemical composition, physical form and use of the polymer support above for the term “anion exchange resin” applies equally to IMAC resins. Cross-linked agarose and “tentacle” supports are preferred. Viral vectors can be eluted from the IMAC column by adding increasing concentrations of competing chelating agents such as imidazole, histamine, glycine or ammonium chloride, and the maximum and minimum range of pH gradient used is about 5 to about As long as it stays at 9, the pH of the eluent may be raised or lowered. Examples of commercially available products that can be used in the method include Acti-Disk IDA cartridges (Whatman), fructogel AF chelate, and Toyopearl AF chelate IMAC resin.
Furthermore, preferred conditions for the immobilized metal affinity ion resin for purification by DEAE of viral vectors, eg vectors derived from type 5 adenovirus, are from the group consisting of cobalt, nickel, copper, zinc, calcium and magnesium. It has a resin charged with a selected divalent metal cation, and the resin is further an IDA or TED cross-linked agarose resin, in particular an IDA agarose resin charged with zinc ions.
Hydrophobic interaction chromatography (“HIC”) can be substituted for the IMAC resin in the method of the present invention. Such resins have a lower alkyl or aryl group covalently bonded to the inert polymer support through a nonpolar group, such as an aliphatic ether. Lower alkyl groups such as methyl, propyl, n-butyl, neopentyl, and octyl and phenyl are examples of interacting groups on the resin of the present invention. A butyl group is a preferred interactive group. The description of chemical composition, physical form and use of the support above for the term “anion exchange resin” also applies to the HIC resin. Cross-linked agarose, hydroxylated polyether, hydrophilic medium and silica are preferred supports, with cross-linked agarose being most preferred. Viral vectors can be purified by elution from the HIC resin with a decreasing salt gradient (ammonium sulfate is the preferred salt). Examples of commercially available HIC columns useful for the present invention are cross-linked agarose columns such as phenyl-, butyl- and octyl sepharose, and Toyopearl (phenyl, propyl and butyl) and fructogels (propyl or Phenyl).
As mentioned above, in the present invention, the IMAC or HIC resin can be used before or after the anion exchange resin. If used before, the salt concentration of the eluate from the HIC or IMAC resin should be diluted to less than about 450 millimoles to prevent premature efflux of virus particles from the exchange resin.
The term “buffering agent” or “buffered solution” refers to acids and bases that, if present in solution, reduce or mitigate pH changes that would occur in solution when acid or base is added. Means a mixture of In one embodiment, the cell lysate is maintained in a buffered solution. Suitable buffering agents are those that can maintain the pH of the resulting solution between about 5.0 and about 9.0. Such buffers are commercially available and can be used as phosphate, MES, HEPES, MOPS, borate, TRIS, BES, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, BIS-TRIS PROPANE, BES, TES, DIPSO, TAPSO, TRIZMA, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, TRICINE, GLYCYLGLYCINE, BICINE, TAPS, etc. are included. Preferred buffering agents include phosphate, MES, HEPES, MOPS, borate and TRIS, with HEPES being most preferred.
The use of chromatography to purify viral vectors, eg, adenoviral vectors called type 5 for use in gene therapy, has been shown to be an effective alternative to cesium chloride density gradient ultracentrifugation. This methodology has various advantages such as quality, consistency, reduced processing time, system automation and the ability to process large amounts of crude lysate. The purification scheme described in the present invention selects products based on virion surface characteristics. These characteristics do not change with different internal DNA constructs with different therapeutic genes in the construct, for example, and therefore lead to similar chromatographic responses. In other words, chromatography is not affected by the nature of the therapeutic gene inserted into the vector.
The anion exchange resin, immobilized metal ion affinity chromatography resin, cation exchange resin and hydrophobic interaction chromatography resin are washed using methods known to those skilled in the art. For example, DEAE is treated first with NaOH, then with HCl, and finally with NaCl. IZAC is EDTA first, then NaOH, HCl, NaCl flush with H₂O and processed during each stage. The column is equilibrated with a suitable buffer using suitable binding conditions. The column adjusts the pH and salt concentration for DEAE, and the product binds to the resin by adjusting the pH, salt concentration and divalent metal ion concentration for the immobilized metal ion affinity column. A sample in a buffer will be injected. The column can be washed to remove contaminants and reused.
Another aspect of the invention includes the additional step of filtering the cell lysate after treatment with the enzymatic agent. In another embodiment, the cell lysate is buffered prior to treatment with benzonase to a pH between about 5.0 and about 9.0 before injecting (applying) it to the first resin. These embodiments are preferred for the purification of recombinant viral vectors derived from either retroviruses or adenoviruses, and are particularly preferred when the vectors are derived from adenoviruses, and such vectors are tumor suppressor genes Containing.
Another embodiment for purifying an adenovirus-derived vector containing a tumor suppressor gene is that the treated buffered cell lysate is first chromatographed on an anion exchange resin and then on an immobilized metal affinity resin. In which chromatography is performed. These conditions are particularly preferred when the recombinant viral vector is derived from a type 2 or type 5 adenovirus, particularly a type 5 adenovirus.
The enzymatic agent used to treat the cell lysate is one or more enzymes, particularly those selected from the group consisting of RNases and DNases, as known to those skilled in the art, or It is a mixture of endonucleases. Preferred enzymatic agents for use in this embodiment are Benzonase®, a recombinant non-specific nuclease that cleaves both RNA and DNA.
Finally, a particularly preferred method among those described so far is when the type 5 adenovirus-derived recombinant viral vector has a genome containing the wild type p53 gene.
Experimental part
Process 1
ACN53 reference material (CsCl-ACN53)
A standard recombinant adenovirus type 5, designated ACN53, was derived from a type 5 adenovirus having a sequence encoding F1 with a full length 1.4-kb p53 cDNA driven by a human cytomegalovirus promoter. Vectors (Willset al. Human Gene Therapy 5: 1079-1088 (1994)). The virus is (Laver et al.,Virology 45: 598-614 (1971)) is a modification of the three-stage centrifugation method described below. Infected cells were lysed by three freeze-thaw cycles and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. in a Sorvall RC-5B centrifuge. Discard the pellet and remove the supernatant from Benzonase^TMAnd processed at 133 U / mL at room temperature for 30 minutes. The treated material was then layered on a 1.25 g / mL and 1.40 g / mL CsCl discontinuous step gradient in 10 mM Tris pH 8.1 and 30,000 rpm, 10 ° C. in a Sorvall TST 41-14 rotor. For 75 minutes. The virus band from each tube was collected, mixed with 1.35 g / mL CsCl (10 mM Tris pH 8.1), and centrifuged at 45,000 rpm, 10 ° C. in a Beckman VTi 50 rotor. Viral bands from each tube were collected and centrifuged at 45,000 rpm for an additional 4 hours as before. The final virus pool from this stage was sucrose 2% and 2 mM MgCl 2₂Dialyzed extensively at 4 ° C. against phosphate buffered saline (PBS) supplemented with The purified virus pool was used to infect human embryonic kidney 293 cells (purchased from ATCC (American Type Culture Collection)) as described in Step 2 below.
Process 2
Growth, collection and lysis of ATCC293 cells
ATCC293 (ATCC CRL 1573) cells were transformed into CO₂In the incubator, 1.5 L of the culture medium having the following composition, Cell Factory^TM(Nunc, Ruskilde, Denmark) [DME high glucose medium containing 10% Hyclone bovine serum defined, 2 mM glutamine (Irvine Scientific, Santa Ana, California), supplemented with 1 mM sodium pyruvate (Irvine Scientific) . Antibiotics are not added to the culture. ].
Cell Factory^TMTwo to two and a half days after inoculation, when approximately 50-60% of the cell monolayers merged, the cells were infected with 500 mL of fresh culture medium with multiple infections (MOI) of 5-10 infectious units per cell. Virus was added to the culture, stirred well and introduced into the cells in the unit.
Cell monolayer from Preparation 1 is Cell Factory^TMCells were harvested slowly and harvested when they showed signs of detachment from the surface (usually 3-4 days after infection) and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes in Beckman TJ-6. They are washed once with serum-free medium, pelleted again and 25 mL of 50 mM Tris buffer pH 8.0 / 150 mM NaCl, 2 mM MgCl for use in preparation of ultracentrifugation-derived standard virus₂, Resuspended in 2% sucrose. Samples intended to be used throughout Examples 1-3 are 25 mL of 50 mM HEPES buffer pH 7.5 / 150 mM NaCl, 2 mM MgCl.₂, Resuspended in 2% sucrose. Cells were lysed at this point by three cycles of freeze-thaw. Following the third cycle, cell debris was removed by centrifugation in Beckman TJ-6 at 1500 rpm, 4 ° C. for 5 minutes.
Process 3
Western blot analysis of samples containing recombinant adenovirus particles
SDC-PAGE gels were run in the same manner as described in Example 3, Step F, with approximately the same amount added to the silver stained gel. The band was then transferred to a PVDF membrane pre-wet with 100% methanol and equilibrated in Tris buffered saline (TBS). The gel was also equilibrated in TBS. The protein was transferred to the membrane using a Bio-Rad semi-dry transfer apparatus at 25 V for 30 minutes. The membrane was then blocked with 1% casein / 0.01% sodium nitride overnight at 4 ° C. or room temperature for 1 hour and washed 3 times with TBS. The membrane was incubated with the first antibody (Cytimmune rabbit IgGa-adenovirus type 5, Lee Biotechnology Research: San Diego, Calif.) 5 μg / mL (in TBS) for 1 hour at room temperature. Following the first incubation, the membranes were washed 3 times with TBS and second antibody (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) 1 μL stock with 1 μL TBS diluted in 1 hour with 1 ml TBS antibody in a horseradish peroxidase conjugated conjugated-rabbit Ig) Incubated for 1 hour. The last three washes were performed with TBS and the membrane was incubated with Amersham ECL detection reagent for 1 minute, various times in the dark (seconds to minutes to select different controls), hyperfilm (Hyperfilm) -ECL (Amersham) exposure and development in X-ray film developer.
Using this Western blot analysis, the difference between the band patterns of ACN53 in various purification states can be seen in FIG.
Process 4
Determination of the number of recombinant adenovirus particles by absorbance at 260nm in the presence of SDS
For this measurement, the concentrated virus is diluted to 1 in 10 in 0.1% SDS in phosphate buffered saline (PBS). The sample was vortexed for 1 minute and centrifuged at 14,000 rpm in an Eppendorf microfuge to remove the precipitate. Matched pairs of cuvettes are blanked by writing a baseline scan line on a Shimadzu UV160U spectrophotometer (Simadzu Scientific Instrument, Columbia, MD.) Using 0.1% SDS in PBS buffer. . The SDS treated virus sample was then placed in a sample cuvette and scanned from 220 nm to 340 nm. If there was an absorbance between 310 and 320, the sample was too dark and was further diluted and remeasured. A₂₅₀/ A₂₈₀The ratio is also determined from this scan, and it must be between 1.2 and 1.3 to ensure that it is pure enough to measure particle number. If this condition is met, the absorbance at 260 nm only is used to calculate the virion / mL number. 1.1 × 10 per unit of absorbance at 260 nm¹²Particle conversion coefficient (Maizel et al.,Virology 36: 115-125 (1968)) was used with an error of about 10% to calculate the number of particles. Typical values for samples subjected only to anion exchange chromatography (ie Examples 1 and 2 using DEAE resin) were between 1.14 and 1.19. When such samples were subjected to IZAC as described in Example 3, the ratio was in the range of 1.22 to 1.25.
Example 1
Lysis of unencapsulated nucleic acids
Nuclease treatment
Infected cell lysates initially consist of both host cell and viral contaminants. Some of these contaminants are removed prior to chromatography. In particular, host cells, unencapsulated or incomplete ACN53 nucleic acids are^TMIt was enzymatically degraded at this stage of the process using nucleases such as This may be done early in the process for two reasons. Early Benzonase^TMThe treatment improves the yield in the anion exchange resin. Benzonase^TMWas removed in the next process step. The presence of Benzonase during the process can be measured by a commercially available ELISA kit (American International Chemical, Natick, MD).
Clarification of the treated lysate was performed by filtration rather than centrifugation. Slow rotation was used to remove cell debris (Figure 1). Filtration was then used to prepare the product for mounting on the first column. The type of filter media used (ie, composition and pore size) and its effective product recovery was assessed by the quantitative anion exchange assay described in Example 3, Step A.
Following centrifugation, Gelman Sciences's Acrodisc^TMIt passed through a 0.8 / 0.2 μm two-stage cylindrical filter. The recovery of ACN53 was dependent on the pore size and membrane type used for filtration. Filter media such as membranes based on polysulfonic acid, PVDF membranes and cellulose acetate membranes were used. Polysulfone and PVDF were preferred.
The supernatant liquid at this stage is added to MgCl₂2 mM, sucrose 2% (wt / vol) and β-cyclodextrin 2.5% (wt / vol). Benzonase^TM(American International Chemical, Inc.) was added to a final concentration of 100 units / mL and incubated at room temperature for 1 hour. Treated material was centrifuged in Beckman TJ-6 at 3000 rpm for 10 minutes and Gelman Sciences Acrodisc.^TMClarified by filtration through a 0.8 / 0.2 μm filter. The resulting supernatant was collected for Example 2.
Example 2
Anion exchange chromatography
Throughout, the characteristics of DEAE chromatography were found to be consistent and high concentration lysates (3 × 10¹²A loading test with ACN53 particles / mL) showed a linear response between the injected volume and the recovered ACN53 peak area. Elution of the DEAE column with the introduction of a linear salt gradient showed three major peaks. The first of these peaks is about 0.5 A₂₆₀/ A₂₈₀It was a protein peak with a ratio. Next is the ACN53 peak (A₂₆₀/ A₂₈₀= 1.23), followed by DNA (A₂₆₀/ A₂₈₀= 2) There was a peak. The same peak was obtained with either HEPES, Tris buffer or phosphate buffer system. pH can be changed but HEPES pH 7.5 / NaCl / sucrose / MgCl₂When used at pH 7.5, less contaminated material is adsorbed to the column. DEAE chromatography provides a high degree of initial purification. The immobilized metal ion purification chromatography step removes these contaminants.
6.6 × 50 mm (1.7 mL) borosilicate Omnifit for separation performance of column resin^TMTested in a column (Omnifit Ltd., Cambridge, England). Column is PerSeptiv Biosystems Biocad^TM(Cambridge, MA) Mounted on a chromatography workstation. Chromatography was tracked and investigated online for pH, conductivity and optical density at two wavelengths of 280 nm and 260 nm.
Anion exchange resin is 50 mM HEPES, pH 7.5, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl at 1 mL / min.₂, Equilibrated with 2% sucrose. 50 mM Tris buffer pH 8.0 (30 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, Containing 2% sucrose). After filling with cell lysate, it was followed by absorbance and washed to baseline, elution was performed with 20 column volumes of 300-600 mM primary NaCl gradient and 0.5 mL fractions were collected. For future use, the column was then cleaned with 2 column volumes of 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl wash and then re-equilibrated.
In order to obtain an appropriate control retention time, CsCl-ACN53 was injected at 2 mL / min (350 cm / hr) onto a DEAE column equilibrated in 50

mM Tris pH

8, and 0 min for 10 min (11.7 column volumes). Elute with a -1.5M primary NaCl gradient. 1.23 A₂₆₀/ A₂₈₀Was detected. The protein band present in this fraction reacted with the Ad5 polyclonal antibody on slot-blot analysis.
Several peaks were resolved when the infected cell lysate sample was applied to the DEAE column (Figure 2). The peak composition is A₂₆₀/ A₂₈₀Estimated from the extinction ratio. For example, the first peak is 0.5 A₂₆₀/ A₂₈₀It is mainly protein because it has a ratio. The third peak is 2 A₂₆₀/ A₂₈₀This ratio implies that this substance is a nucleic acid. The ACN53 virus peak eluted second with a ratio of 1.23. The identity of these peaks was confirmed by modifying the experiment and passing each peak through an SDS gel. In a typical test using the conditions described above, an A of 1.23 ± 0.8₂₆₀/ A₂₈₀The ratio was found to be characteristic of the virus peak.
In order to evaluate the purification ability of DEAE chromatography, both uninfected ATCC-293 cell lysate and CsCl-ACN53 were applied to the column (FIG. 3). Although most of the host cell material passed through the column during loading or eluted earlier than the retention time of ACN53, a small peak eluted at the same retention time as ACN53. From these data, the non-viral contaminant of the ACN53 peak is expected to be from host cell material. Examination of the contamination peak, ie the last eluting peak in the cell lysate sample shown in FIG.₂₆₀/ A₂₈₀It was revealed that the ratio was nm. This indicates that the peak has a high nucleic acid content and can be reduced or eliminated by nuclease treatment. Benzonase^TMDEAE manipulations with or without pretreatment showed that the enzyme reduced the amount of contaminants from host cells in the ACN fraction pool.
Example 3
Immobilized metal affinity chromatography
Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) using zinc atoms as divalent cations (IZAC) gives high product recovery and does not require any sample manipulation of the DEAD fraction pool prior to loading It was. Impurities removed by this method elute in the effluent peak and dissolve well from the product, leading to the Simpler pool standard. IZAC is reproducible and when used with DEAE, SDS-PAGE gels and Western blots, A₂₆₀/ A₂₈₀A two-column purification protocol is provided that is capable of obtaining pure ACN53 as specified by the ratio and the ratio of infecting particles to uninfected particles. The overall protocol summarized is as follows:

Table 1 and 2 in the experimental section summarize the recovery by step for all particles and infectious units.
Metal charge the immobilized zinc affinity chromatography (IZAC) system by washing the column successively with 1 volume of 100 mM EDTA and 1 volume of 0.2 M NaOH with flushing with water after each step. Prepared for. The matrix was subsequently acidified with zinc atoms and acidified with 0.5 μL / mL glacial acetic acid.₂100 mM ZnCl in O₂Was charged by injecting a volume of one column. The matrix is then washed with 50 mM HEPES pH 7.5 / 450 mM NaCl / 2% sucrose / 2 mM MgCl₂Wash thoroughly in water before equilibration in. Sample loading did not require any manipulation, and the DEAE pool fraction or CsCl derived material was injected directly into the column. After loading, the column was loaded with 50 mM HEPES pH 7.5 / 450 mM NaCl / 2% sucrose / 2 mM MgCl₂To 50 mM HEPES pH 7.5 / 150 mM NaCl / 2% sucrose / 2 mM MgCl₂To 10 column volumes of decreasing NaCl linear gradient. Elution was performed with a 0 to 500 mM linear glycine gradient (in 150 mM NaCl) to which more than 10 column volumes were applied.
The interaction of ACN53 with the metal affinity column shows metal-specific properties (zinc atoms are preferred) and injection of CsCl-ACN53 into uncharged columns (columns not preloaded with zinc atoms) is generated This resulted in a shift of the product peak to the runoff. Example 2 IZAC purified ACN53-DEAE from the fraction pool is shown in FIG. Analysis of the IZAC fraction pool showed 49-65% yield and 1.22-1.25 A₂₆₀/ A₂₈₀Yielded a ratio. A gel and Western blot comparison of CsCl-ACN53, DEAE purified and DEAE / IZAC purified material can be seen in FIGS. CsCl-ACN53 and DEAE / IZAC materials are very similar, and materials purified with DEAE alone are less pure than these standards.
The effects of different IZAC buffers and elution systems were evaluated by splitting the DEAE-ACN53 pool in half and purifying both halves in HEPES pH 7.5 and Tris pH 8 buffer systems with IZAC. IZAC also does not affect the separation sucrose and MgCl₂Went even in the presence of. The use of copper as the metal ion and imidazole as the elution reagent was also tested (see Belew et. Al. 1987, Kato et. Al. 1986 for a general review of metal affinity chromatography). Various systems, zinc / glycine, zinc / imidazole, copper / glycine and copper / imidazole all worked on the metal affinity purification column. ACN53 can be eluted using a gradient from pH 7 to pH 9.
A: Assay for the number of recombinant adenovirus particles by anion exchange HPLC
A 1 mL Resource Q (Pharmacia, Piscataway, NJ) anion exchange column was used to quantify the number of virus particles in the various samples. The column was equilibrated in a Waters 625 chromatography system equipped with a 717 plus autosampler and 991 light emitting diode array detector (PDA) at a flow rate of 1 mL / min in 300 mM NaCl, 50 mM HEPES, pH 7.5. Chromatography was monitored with a PDA detector (Milford, Mass.) Scanning from 210 to 300 nm. A standard line is selected for absorbance at A in 0.1% SDS.₂₆₀Made by injecting CsCl-purified ACN53 virions, evaluated for all particles.
The assay was independent of the volume of sample injected. After loading the sample, the column was washed with 2 column volumes of equilibration buffer, followed by 10 column volumes of 300 to 600 mM NaCl linear gradient in 50 mM HEPES, pH 7.5. The gradient was followed by two column volume washes with 600 mM NaCl in 50 mM HEPES, pH 7.5. After each chromatographic run, the column was cleaned with 2.6 column volumes of 1.5 M NaCl in 50 mM HEPES, pH 7.5, and then re-equilibrated for the next injection. The column was cleaned more strongly after injection of the crude sample by injection of 0.25 to 1 column volume of 0.5N NaOH followed by a wash with 1.5M salt. Injection of NaOH and subsequent spilling of the gradient was a convenient way to achieve cleaning. The use of the assay in measuring the total number of adenovirus particles present is illustrated in Table 1 below.

B: Buffer condition
Changes in buffer conditions were used for purification of ACN53 by column chromatography in this study in the pH range of 7.0 to 8.0 (eg, Seth,Virology 68: 1204-1206 (1994)). Investigations for decay at various pH limits are performed by assaying for decay by TCID50 (Method C below) and analytical anion exchange analysis (Method A above). The effect of buffer salt concentration on ACN53 viability indicated that a rapid change in ionic strength would lead to virus loss. Salt concentration should be carefully controlled and monitored.
C: TCID₅₀Assay of infectious recombinant adenovirus particles by assay
The quantification of infecting adenovirus Type 5 particles before, during and after the purification methods taught in these examples was determined using an endpoint titer assay (tissue culture infection rate -50%, abbreviation TCID).₅₀) (Philipson,Virology 15: 263-268 (1961). ). Reagents, substance lists and descriptions can be used from Chemicon International, Inc (cat. # 3130: “Adenovirus Direct Immunofluorescence Assay”, Temecula, Calif.).
ATCC293 cells in 96-well plates, 100 μL of 5 × 10 5 for each well in complete MEM (10% calf serum, 1% glutamine) culture medium.^FivePlate cells / mL. 1:10 in individual plates⁶Add a 250 μL aliquot of the diluted virus sample to the first column and serially dilute 2 fold across the plate. One row is saved for positive control (CsCl purified ACN53) and one row for negative control. A 100 μL aliquot of each hole was transferred to the same position on the ATCC-293 seeding plate and cultured at 37 ° C. in a humidified incubator for 2 days. The culture was then decanted by inversion and the cells were fixed with the addition of 50% acetone / 50% methanol. After washing with PBS, the fixed cells are incubated for 45 minutes with FITC-labeled anti-ad5 antibody (Chemicon International # 5016) prepared according to the kit instructions. After washing with PBS, the plates were examined under a fluorescence microscope (490 nm excitation, 520 nm emission) and scored for the presence of the label. Titer is a titerprint analysis program (Lynn,Bio techniques, 12: 880-881 (1994)). The results from assays performed according to this method are set forth in Table 2 below, which includes ratios calculated using the values from Table 1 above.

The ratio of total virus particles to infecting virus particles can vary widely from production to manufacture. Values for CsCl induced viruses range from 60-80. Calculation of this ratio in the crude lysate or semi-purified fraction was made possible by the anion exchange particle assay (see Example 3 [A]). Analytical anion exchange can be used to monitor changes in the ratio of ideal virus particles to infected virus particles. Using the purification method of the present invention, the ratio of crude lysate and subsequently purified material to total virus particles to infecting virus particles can be compared to that obtained using ultracentrifugation. . Within the assay error, these values are equivalent. By this criterion, the virus has good resistance to chromatographic purification. By other criteria, SDS-PAGE and Western blot analysis (FIGS. 6 and 7), chromatographic purification is superior to methods based on ultracentrifugation.
D: Assay for infectious recombinant adenovirus particles by expression of P53 protein
Viral product activity was also tested by assaying for expression of p53 gene product in Saos-2 cells, p53-negative osteosarcoma cell line. Saos-2 cells were placed in 6-well tissue culture plates at 5 × 10^FiveSeed in 3 mL of Kaifn's nutrient mixture F12: DME High Glucose (1: 1 mixture) supplemented with 2 mM L-glutamine and 10% fetal bovine serum at cell / well concentration. Cells in humidified air, 7 ± 1% CO₂The cells were cultured at 37 ° C. for 16 to 24 hours. The spent media was removed and replaced with 1 mL of fresh media and the cells were infected with 20, 40, or 60 MOI of purified virus. After 1 hour of culture, an additional 2 mL of culture was added and allowed to grow for 8 hours. The cells were then washed once with Dulbecco's-PBS and 250 μL of 50 mM tris / 0.5% Noridet P-40 / 250 mM NaCl / 5 mM EDTA / 5 mM NaF / 5 μg / mL Leupeptin and 5 μg / mL Aprotin / 2 mM PMSF Dissolved by addition. Plates were incubated on ice for 5 minutes, after which the lysate was transferred to individual 1.7 mL microcentrifuge tubes. They are spun down in a microfuge at 14000 rpm for 45 seconds and the supernatants are primary anti-p53 monoclonal antibody 1801 (Vector Laboratories, Burlingame, California) and sheep anti-mouse IgG by Western blot analysis for the presence of p53 protein. Assayed with a 1: 1 mixture of HRP as well as streptavidin-HRP (Amersham). The p53 protein band was detected using the Amersham's ECL detection kit according to the manufacturer's instructions. The results of using the assay are shown in FIG. The expression of p53 can be seen in ACN53 purified only by DEAE chromatography and by both DEAE and IZAC chromatography. (The low level expression in

lanes

5 and 6 is due to the fact that these samples were performed at a lower MOI than the DEAE samples.)
E: Host cell protein contaminant
Host cell contaminants were assayed using polyclonal antibodies developed and differentiated against ATCC-293 cell components by Western blot analysis. Polyclonal antibodies were obtained commercially and raised against various 293 cell antigens (HTI, Ramona, CA). The results showed that the final purified product of CsCl or DEAE-IZAC was free of detectable host cell contaminants. In the case of semi-purified DEAE-ACN53, there was a small amount of immune contaminants found in the purified pool, three main bands and several small ones. Most of the host cell contaminants are recovered in the effluent of the DEAE stage. Contaminants co-purified with ACN53 in the DEAE step were removed by zinc affinity chromatography and collected in the IZAC effluent fraction prior to insertion of the glycine gradient.
F: SDS-PAGE analysis sample containing recombinant adenovirus particles
For Coomassie blue coloring, a sample containing 100-200 μL of adenovirus (approximately 1 × 10¹¹Particles / mL) is collected and desalted by trichloroacetic acid precipitation or by dialysis and subsequent concentration in a speed-vac. Samples were then in SDS-PAGE reducing buffer (125 mM Tris-HCL, pH 6.8, 20% glycerol, 4% (w / v) SDS, 0.005% bromophenol blue, 0.5% β-mercaptoethanol). Resuspended in approximately 30 μL, boiled for 5 minutes, and loaded onto a 1 mm × 10 well Novex 8-16% gradient Tris-Glycine minigel. Samples were electrophoresed at 140V for 1.5 hours. The gel was then fixed in 40% methanol / 10% acetic acid for 30 minutes and then the Coomassie was colored with the Pro-Blue coloring system (Integrated Separation Systems, Natick MA) according to the vendor's method.
A 5-15 μL sample was loaded onto the silver colored gel. Samples were boiled with an equal volume of reducing buffer and electrophoresed as described for Coomassie detection. Fixing was performed by treating the gel in 10% trichloroacetic acid for 1 hour, followed by washing 3 times in water purified to 18 megohm. The gel was colored according to the instructions given in the Daiichi silver coloring kit (Integrated Separation Systems).
Example IV
Vector infectivity, therapeutic gene transfer
DEAE-IZAC-ACN53 is evaluated by virions using TCCID₅₀Keeping their infectivity during chromatography as measured by (Tables 1, 2) and showing that gene transfer can occur as assayed by P53 protein expression in Saos-2 cells Yes. Comparison of this DEAE-IZAC-ACN53 in SDS-PAGE to CsCl-ACN53 shows that there is a lower molecular weight protein band present in CsCl-ACN53. A side-by-side comparison of the different CsCl-ACN53 lots shows some batch-to-batch variability, whereas the chromatographically produced material matches very well. The overall ratio to infecting particles and the absorption spectra of both types of substances can be directly compared. Evaluation of chromatographically produced ACN53 for purity and activity shows that the two-column method per day can replace the three-day ultracentrifugation protocol.
A preferred purification scheme such as that described above for ACN53 is to remove the infected cell lysate prior to the chromatography step with Benzonase.^TMIs to be processed. Cleaning is then performed by a filtration step through a 0.8 μm and subsequent 0.2 μm membrane. If necessary, a large pore (eg 5 μm) prefiltration step can be added for further viscous suspension. Adjustment to pH 7.5 / 300 mM NaCl is then made in preparation for loading onto the DEAE column. A₂₆₀/ A₂₈₀Purified peaks as detected by nm ratio or by characteristic light emitting diode array spectra are pooled and injected directly onto a metal affinity column that is zinc-charged and equilibrated to isotonic pressure. The ionic strength of the buffer is then gradually reduced to approximately phosphate buffered saline (approximately 150 mM NaCl) prior to elution of the product with a glycine gradient. This material is then dialyzed into the final formulation.

Claims

A method for purifying a recombinant viral vector containing a therapeutic gene from a cell lysate, comprising a) treating the cell lysate with an enzymatic agent that selectively degrades both non-encapsulated DNA and RNA;
b) chromatography of the treated lysate from step a) with a first resin; and c) chromatography of the eluate from step b) with a second resin, Wherein one resin is an anion exchange resin and the other is an immobilized metal ion affinity resin.

The method according to claim 1, wherein the first resin is an anion exchange resin and the second resin is an immobilized metal affinity resin.

The method of claim 2 comprising the additional step of filtering the treated lysate from step (a).

4. The method of claim 3, comprising the additional step of buffering the pH of the cell lysate between about 5.0 and about 9.0 prior to application to the first resin.

The method of claim 4, wherein the recombinant viral vector is a retrovirus.

The method according to claim 4, wherein the recombinant viral vector is an adenovirus.

The method according to claim 6, wherein the therapeutic gene contained in the recombinant adenovirus vector is a tumor suppressor gene.

8. The method of claim 7, wherein the recombinant adenoviral vector is a type 2 or type 5 adenovirus.

9. The method of claim 8, wherein the recombinant adenoviral vector is a type 5 adenovirus.

The method according to claim 9, wherein the tumor-suppressor gene is a wild-type p53 gene.

4. A process according to claim 3, wherein the anion exchange resin is selected from the group consisting of DEAE, TMAE, DMAE, QAE and PEI.

The method according to claim 11, wherein the anion exchange resin is a DEAE resin.

4. The method of claim 3, wherein the immobilized metal affinity resin is charged with a divalent cation of a metal selected from the group consisting of cobalt, nickel, copper, zinc, calcium and magnesium.

The method according to claim 13, wherein the immobilized metal affinity resin is a TED or IDA resin.

The method according to claim 14, wherein the immobilized metal affinity resin is an IDA- (crosslinked agarose) resin.

The process according to claim 15, wherein the divalent cation is zinc.

2. The method of claim 1, wherein the enzymatic agent that selectively degrades both non-encapsulated DNA and RNA is one or more enzymes.

18. The method of claim 17, wherein the one or more enzymes are endonucleases.

The method according to claim 18, wherein the enzyme is benzonase.

A method for purifying a recombinant viral vector containing a therapeutic gene from a cell lysate;
a) treating the cell lysate with an enzymatic agent that selectively degrades both non-encapsulated DNA and RNA;
b) chromatography of the treated lysate from step a) with a first resin; and c) chromatography of the eluate from step b) with a second resin. One resin is an anion exchange resin and the other is a hydrophobic interaction chromatography resin; or one resin is a cation exchange resin and the other is a hydrophobic interaction chromatography resin or an immobilized metal ion affinity. A method that is one of the functional resins.

21. The method of claim 20, wherein one resin is an anion exchange resin and the other is a hydrophobic interaction chromatography resin.

The method of claim 21, wherein the first resin is an anion exchange resin and the second resin is a hydrophobic interaction chromatography resin.

The method according to claim 20, wherein one resin is a cation exchange resin and the other is an immobilized metal ion affinity resin.

21. The method of claim 20, wherein one resin is a cation exchange resin and the other is a hydrophobic interaction chromatography resin.