JP3849988B2

JP3849988B2 - Antifungal agent

Info

Publication number: JP3849988B2
Application number: JP17825595A
Authority: JP
Inventors: 英世山口; 茂安部; 隆文奥富
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2021-11-22
Also published as: JPH092970A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アゾール系抗真菌物質及びラクトフェリンを有効成分として含有し、低濃度で強い抗真菌作用を呈する抗真菌剤に関するものであり、更に詳しくは、本発明は、アゾール系抗真菌物質と哺乳動物の主として乳汁中に存在する生理活性蛋白質であるラクトフェリンとを併用することにより、従来のアゾール系抗真菌剤と比較してその有効成分の使用量を顕著に低減することを可能とすると共に、少用量で強い抗真菌効果が得られ、副作用が少なく、耐性菌の出現頻度を低下させることが可能な新規抗真菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
表在性真菌症は、起因菌の侵襲が表皮、毛髪、爪等の角化組織、口腔、膣等の皮膚に隣接する粘膜部位に限定される疾患と定義され、発生頻度が最も高い疾患である。代表的な表在性真菌症の一つとして知られている皮膚糸状菌症（白癬）の発症率は、全人口の１０％以上にも及び、しかもその再発又は再感染を反復する症例も多数認められ、その病態も足白癬、体部白癬、股部白癬等多様な病態が知られている。
【０００３】
他の代表的な表在性真菌症としては、カンジダ症が知られている。カンジダ症については、例えば、口腔カンジダ症、食道・腸管カンジダ症、外陰膣カンジダ症等の疾患が、カンジダ属真菌の侵襲によって惹起され、その他にも、腎盂腎炎、間擦疹、指間びらん症、爪囲爪炎、膀胱炎等のカンジダ症も多く知られている。また、腸管でのカンジダ属真菌の異常増殖がアトピー性皮膚炎の原因になっていることも報告されている（アレルギーの臨床、第１１巻、第７６８〜７７２ページ、１９９１年）。
【０００４】
一方、近年、重篤な深在性真菌症が急激に増加しているが、その背景には、広域抗生物質、抗癌剤、臓器移植における免疫抑制剤、経口避妊薬等多くの薬剤の投与及び高カロリー輸液、留置カテーテル等の使用、更には、エイズ疾患等易感染状態にある患者の急増等の問題があり、それらが、臨床上の大きな問題となっている。
【０００５】
従来、内用抗真菌剤として真菌症の治療に使用される抗真菌剤は、ポリエン系のアムホテリシンＢ、フルオロピリジン系のフルシトシン、イミダゾール系（アゾール系）のミコナゾール及びトリアゾール系（アゾール系）のフルコナゾールの４剤のみであったが、１９９３年９月にアゾール系のイトラコナゾールが市販された。
【０００６】
これらの抗真菌剤の対象となる病原真菌の種類と薬剤感受性は、それぞれの抗真菌剤によって異なるが、これらの対象となる病原真菌の種類は、例えば、カンジダ属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、トリコフィトン属、マラセチア属、コキディオイデス属等が代表的なものである。
【０００７】
アゾール系として総称される抗真菌物質は、イミダゾール環又はトリアゾール環を有し、生物活性においても類似の性状を示している。これらの抗真菌剤は、特に真菌細胞の小胞体に局在するエルゴステロール合成経路におけるステロール・Ｃ−１４脱メチル反応に対する反応障害が、その抗真菌活性の作用機序となっている点で共通している。
【０００８】
従来、もっぱら単独製剤として用いられているこのような内用抗真菌剤の使用の現状は、アゾール剤の占有率が大きい。アゾール剤がこのように常用されているのは、アムホテリシンＢ及びフルシトシンと比較して比較的安全性が高いこと、耐性菌が出現し難いこと等の利点によるものである。しかしながら、最大の占有率を有するフクコナゾール（アゾール系抗真菌剤）についても、カンジダ症及びクリプトコッカス症に対する有効率の高さに比較して、アスペルギルス症に対する有効率が低いことが報告されている（化学療法の領域、第１０巻、第１７〜２６ページ、１９９４年）。
【０００９】
一般にアゾール剤は静菌的に作用するので、患者の感染抵抗力が著しく低下している場合又は侵襲性の重篤な感染が惹起されている場合には奏効し難いとされている（化学療法の領域、第１０巻、第１７〜２６ページ、１９９４年）。このように、現在のアゾール剤には、殺菌的作用が存在しないため、比較的多量の薬剤の長期間投与が必要とされている（化学療法の領域、第１０巻、第１７〜２６ページ、１９９４年）。従って、このような抗真菌剤については、それらの長期大量投与による肝障害、腎障害、下痢、嘔吐等の副作用の発生が、臨床上問題とされており、更に、それらの長期投与によってもたらされる真菌症原因菌の薬剤耐性化の問題が危惧されている。
【００１０】
一方、ラクトフェリンは生体の有する抗菌性蛋白質であり、真菌類に対しても抗菌性を発揮することが知られている［インフェクション・アンド・イミュニティー(Infection and Immunity)、第６０巻、第４６０４〜４６１１ページ、１９９２年］。ラクトフェリンは、病原菌感染による急性炎症時などに生体内において多量に合成される生体蛋白質として重要な役割を有することが知られているが、例えば、ウシ・ラクトフェリンは、牛乳中にごく微量含まれる生理活性蛋白質の一つであって、その抗菌活性は、生体内における生理活性レベルのものであることから、例えば、従来のアゾール系抗真菌剤等の公知の抗菌剤と比較した場合には、その抗菌活性はほとんど比較にならない低いレベルのものと称しても過言ではない。従来、抗菌剤とラクトフェリンとの組み合わせとしては、ベータラクタム系抗生物質とウシ・ラクトフェリンとを含む医薬組成物について報告されている（特開平３−１８１４２１号公報）が、これは、あくまでベータラクタム系抗生物質に関するものであって、従来、アゾール系抗真菌剤がラクトフェリンとの関係で論じられた例は全くなく、また、アゾール系抗真菌剤とラクトフェリンとを組み合わせることにより抗真菌活性が増強されることについてはこれまで知られておらず、報告も皆無である。
このような従来技術の情況から、前記アゾール系抗真菌剤等について、少量の使用で殺菌的作用を有する抗真菌剤、すなわち、副作用が少なく、かつ強い抗真菌作用を有する抗真菌剤の開発が待望されていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて新規な抗真菌剤について鋭意研究を行った結果、アゾール系抗真菌物質にラクトフェリンを添加することにより、アゾール系抗真菌剤が、従来の用量よりもはるかに少用量で、強い抗真菌活性を発揮することを見い出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明の目的は、少用量で有効であり、副作用が少なく、耐性菌の出現頻度が少ない抗真菌剤を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、アゾール系抗真菌物質１部（重量）に対してラクトフェリンが１００部〜３２，０００部（重量）の割合で含有する抗真菌剤であり、アゾール系抗真菌物質が、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ラノコナゾール、イトラコナゾール又はこれらの混合物であることを望ましい態様としてもいる。
【００１４】
次に本発明について詳述する。
本発明に使用するアゾール系抗真菌物質は、従来からアゾール系抗真菌剤として用いられているアゾール系抗真菌物質のいずれでもよいが、特に、クロトリマゾール、ケトコナゾール又はイトラコナゾールが好ましいものとして例示される。
【００１５】
本発明に用いられるラクトフェリン（lactoferrin ）は、牛乳、人乳、その他の乳から常法により調製したもの、遺伝子工学的に製造されるラクトフェリン相同標品等から調製したもの、又はその塩等を用いることができるが、その純度は９０％（重量。以下吸光度の表示を除き、特に断りのない限り同じ）以上であることが好ましく、純度９５％以上が特に好ましい。また金属を結合していないアポラクトフェリン、鉄、亜鉛等の金属を結合したホロラクトフェリンであってもよく、ラクトフェリンであれば、その種類は特に限定されない。
【００１６】
本発明の抗真菌剤は、後記する試験例から明らかなとおり、アゾール系抗真菌物質１部（重量。以下同じ）に対して少なくとも１００部、望ましくは２，０００〜３２，０００部、の割合でラクトフェリンが配合されている場合に、ラクトフェリンの併用効果が奏される。ラクトフェリンの配合量が１００部未満の場合は、ラクトフェリンの併用による抗真菌効果の増強が認められず、３２，０００部を超える場合は、ラクトフェリンの増加による抗真菌効果の増強が認められない。
【００１７】
本発明の抗真菌剤は、常法により、錠剤、顆粒剤、液剤、及び粉剤などに製剤化することが可能であり、公知の方法により経口剤、注射剤、膣剤、トローチ剤、軟膏、ローション剤等に加工することができ、これらを使用する場合、これに含有されている公知の抗真菌剤の投与方法と同様にして投与することができる。また、本発明の抗真菌剤の用量は、後記する試験例から明らかなとおり、従来のアゾール系抗真菌剤の用量の１／４又は１／１６以下であっても、従来のアゾール系抗真菌剤と同等又はそれ以上の抗真菌活性を有する、という、従来技術からは予期し得ない格別顕著な併用効果が得られる。本発明の抗真菌剤中の有効成分の含量は、アゾール系抗真菌物質が少なくとも３．１ｎｇ／ｍｌ、ラクトフェリンが少なくとも１０μｇ／ｍｌである。
ラクトフェリンは、食品として摂取されている牛乳等の一成分であり、また食品としても利用されるものであり、それ自体、全く毒性を示さず、本発明によれば、当該ラクトフェリンを併用することにより、副作用が問題とされる従来の抗真菌剤の使用量を顕著に低減することが可能であり、これにより、安全な抗真菌剤を提供することができる。上記抗真菌剤の使用量の低減効果は、ラクトフェリンを共存させた場合にはじめて得られるアゾール系抗真菌物質に特有のものであり、これまで報告されていない新規なものである。
【００１８】
次に試験例を示して本発明を更に詳述する。
試験例１
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてケトコナゾール（シグマ社製）を使用し、これをジメチルスルフォキサイド（ナカライテスク社製）に溶解した。ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）は蒸留水に溶解し、滅菌濾過を行った。
【００１９】
２）試験方法
試験管にサブロー・デキストロース・ブロス（１％ペプトン、２％グルコース）を試験培地として１ｍｌ秤取し、培地１ｍｌ当たり表１に示す濃度でケトコナゾールを添加し、対照試料（単用）とした。一方、前記ブロスを試験培地として１ｍｌ秤取し、試験薬剤として、培地１ｍｌ当たり１００μｇの割合でラクトフェリンを添加し、更に表１に示す濃度でケトコナゾールを添加し、試験試料（併用）とした。
【００２０】
試験菌としてカンジダ・アルビカンス（Candida albicans) ＴＩＭＭ１７６８株（帝京大学医真菌センターから入手）を寒天スラントから掻き取り、これを、最終菌濃度約１０⁵／ｍｌの割合で前記各試料に添加し、３７℃で１７時間培養し、のち６３０ｎｍで吸光度を測定し、菌の増殖率を判定した。
菌の増殖率の判定は、試験薬剤を添加しなかった試験管の示す吸光度を１００％としたとき、吸光度が２５％より大きい試験管を増殖（＋）、２５％以下の試験管を未増殖（−）と判定し、それを、表１に示した。
【００２１】
３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、ケトコナゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なケトコナゾール量は３．１ｎｇ／ｍｌ（対象試料の１／１６）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強し得ることを示す。尚、真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００２２】
【表１】

【００２３】
試験例２
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてクロトリマゾール（シグマ社製）を用いたことを除き、試験例１と同一の方法により試料を調製した。
【００２４】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００２５】
３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなように、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、クロトリマゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なクロトリマゾール量は１２．５ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００２６】
【表２】

【００２７】
試験例３
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてイトリゾール（登録商標。ヤンセン協和社製）のカプセル５０から精製したイトラコナゾールを用いたことを除き、試験例１と同一の方法により試料を調製した。
【００２８】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００２９】
３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明らかなように、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、イトラコナゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なイトラコナゾール量は１２．５ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３０】
【表３】

【００３１】
試験例４
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてアスタット（登録商標。ツムラ社製）液から精製したラノコナゾールを用いたこと及びラノコナゾールの濃度を試験培地１ｍｌ当たり２００μｇとした試料を調製したことを除き、試験例１と同一の方法により試料を調製した。
【００３２】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００３３】
３）試験結果
この試験の結果は表４に示すとおりである。表４から明らかなように、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、ラノコナゾール単独では２００ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なラノコナゾール量は５０ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３４】
【表４】

【００３５】
試験例５
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてクロトリマゾール（シグマ社製）を用いたこと及びヒト・ラクトフェリン（シグマ社製）を用いたことを除き、試験例１と同一の方法により試料を調製した。
【００３６】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００３７】
３）試験結果
この試験結果は表５に示すとおりである。表５から明らかなように、ヒト・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、クロトリマゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ヒト・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なクロトリマゾール量は１２．５ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３８】
【表５】

【００３９】
試験例６
１）試料の調製
アゾール系抗真菌物質としてクロトリマゾール（シグマ社製）を用いたこと及びウシ・アポラクトフェリン（森永乳業社製）を用いたことを除き、試験例１と同一の方法により試料を調製した。
【００４０】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００４１】
３）試験結果
この試験の結果は表６に示すとおりである。表６から明らかなように、ウシ・アポラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、クロトリマゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・アポラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なクロトリマゾール量は３．１ｎｇ／ｍｌ（１／１６）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４２】
【表６】

【００４３】
試験例７
１）試料の調製
ウシ・鉄飽和ラクトフェリン（森永乳業社製）を用いたことを除き、試験例６と同一の方法により試料を調製した。
【００４４】
２）試験方法
試験例１と同一の方法によって試験を行った。
【００４５】
３）試験結果
この試験の結果は表７に示すとおりである。表７から明らかなように、ウシ・鉄飽和ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、クロトリマゾール単独では５０ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・鉄飽和ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なクロトリマゾール量は１２．５ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４６】
【表７】

【００４７】
試験例８
１）試料の調製
ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を用いたこと及びクロトリマゾールの濃度を試験培地１ｍｌ当たり２００μｇとした試料を調製したことを除き、試験例６と同一の方法により試料を調製した。
【００４８】
２）試験の方法
試験菌としてトリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes)ＴＩＭＭ１１８９株（帝京大学医真菌センターから入手）の胞子を寒天スラントから掻き取り、これを、最終胞子濃度約１０⁴／ｍｌの割合で試験培地に添加し、２７℃で４日間培養したことを除き、試験例１と同様の方法によって試験した。
【００４９】
３）試験結果
この試験の結果は表８に示すとおりである。表８から明らかなように、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌ単独では菌の増殖を抑制し得なかった。一方、クロトリマゾール単独では２００ｎｇ／ｍｌで菌の増殖を抑制したが、ウシ・ラクトフェリン１００μｇ／ｍｌが共存することによって、菌の増殖を抑制するのに必要なクロトリマゾール量は５０ｎｇ／ｍｌ（１／４）にまで低減した。このことは、ラクトフェリンを共存させることによって、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減できる程度に抗真菌活性を増強できることを示す。真菌及びラクトフェリンの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５０】
【表８】

【００５１】
【実施例】
次に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
ケトコナゾール（シグマ社製）１ｍｇに対してウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）１０ｇの割合で混合し、内服用抗真菌剤を製造した。
【００５２】
実施例２
注射用水（大塚製薬社製）１０ｍｌに、ケトコナゾール（シグマ社製）１ｍｇ、ヒト・ラクトフェリン（シグマ社製）１ｇ及び塩化ナトリウム（和光純薬社製）１００ｍｇの割合で溶解し、ｐＨを７に調整し、濾過滅菌し、１ｍｌずつアンプルに充填し、注射用の抗真菌剤１０本を得た。
【００５３】
実施例３
ウシ・アポラクトフェリン（森永乳業社製）１０ｇ、パラオキシ安息香酸メチル（ナカライテスク社製）０．１ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル（ナカライテスク社製）０．１ｇ、プロピレングリコール（ナカライテスク社製）１２ｇ、精製水２７．８ｇを加温しながら撹袢溶解した。別に予め、クロトリマゾール（シグマ社製）５ｍｇ、白色ワセリン（ナカライテスク社製）２５ｇ、ステアリルアルコール（ナカライテスク社製）２０ｇ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ナカライテスク社製）４ｇ、モノステアリン酸グリセリン（ナカライテスク社製）１ｇを加温しながら撹袢混合した溶液を前記溶液に添加し、ホモミキサーを用いて乳化し、Ｏ／Ｗ型クリームを調製し、１０ｇずつアルミチューブに充填し、外用抗真菌剤１０個を得た。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明は、アゾール系抗真菌物質及びラクトフェリンを有効成分として含有する抗真菌剤であり、本発明により奏せられる効果は次のとおりである。
１）本発明の抗真菌剤は、少用量で強い抗真菌効果を有するので、種々の真菌症の治療剤として使用できる。
２）本発明の抗真菌剤は、消化管内でのカンジダ菌の異常増殖の阻止手段としても、安全に使用できる。
３）本発明の抗真菌剤は、副作用が少なく、耐性菌の出現頻度が低下する。
４）本発明によれば、抗真菌作用を示さない低濃度レベルのラクトフェリンの併用で、アゾール系抗真菌剤の使用量を顕著に低減することができる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an antifungal agent containing an azole antifungal substance and lactoferrin as active ingredients and exhibiting a strong antifungal action at a low concentration. More specifically, the present invention relates to an azole antifungal substance and a mammal. By using in combination with lactoferrin, which is a physiologically active protein mainly present in the milk of animals, it is possible to significantly reduce the amount of active ingredient used compared to conventional azole antifungal agents, The present invention relates to a novel antifungal agent capable of obtaining a strong antifungal effect at a small dose, having few side effects, and reducing the appearance frequency of resistant bacteria.
[0002]
[Prior art]
Superficial mycosis is defined as a disease in which the invasion of the causative fungus is limited to a mucosal site adjacent to the skin, such as the keratinized tissue such as the epidermis, hair, and nails, oral cavity, and vagina. is there. The incidence of dermatophytosis (ringworm) known as one of the typical superficial mycoses is more than 10% of the total population, and there are many cases of repeated recurrence or reinfection. Various pathological conditions such as tinea pedis, body tinea, and tinea rotata are known.
[0003]
As another representative superficial mycosis, candidiasis is known. Regarding candidiasis, for example, oral candidiasis, esophageal / intestinal candidiasis, vulvovaginal candidiasis, etc. are caused by invasion of Candida fungi. There are many known candidiasis such as onychonitis and cystitis. It has also been reported that abnormal growth of Candida fungi in the intestinal tract causes atopic dermatitis (clinical allergy, volume 11, pages 768-772, 1991).
[0004]
On the other hand, severe deep mycosis has been increasing rapidly in recent years. The background is the administration of many drugs such as broad-spectrum antibiotics, anticancer drugs, immunosuppressants in organ transplants, oral contraceptives, etc. There are problems such as the use of calorie infusions, indwelling catheters, and the like, as well as the rapid increase in the number of patients who are easily infected such as AIDS disease, and these are major clinical problems.
[0005]
Conventional antifungal agents used for the treatment of mycosis as antifungal agents for internal use are polyene-based amphotericin B, fluoropyridine-based flucytosine, imidazole-based (azole-based) miconazole and triazole-based (azole-based) fluconazole. However, in September 1993, azole-based itraconazole was marketed.
[0006]
The types and drug susceptibility of these antifungal agents vary depending on the antifungal agent, but the types of these pathogenic fungi are, for example, Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Typical examples include the genus Phyton, the genus Malassezia, and the genus Kokidioides.
[0007]
Antifungal substances collectively referred to as azoles have an imidazole ring or a triazole ring, and show similar properties in biological activity. These antifungal agents are common in that the reaction mechanism for sterol / C-14 demethylation in the ergosterol synthesis pathway localized in the endoplasmic reticulum of fungal cells is the mechanism of action of the antifungal activity. is doing.
[0008]
Conventionally, the use of such an antifungal agent for internal use, which has been used exclusively as a single preparation, occupies a large proportion of azole agents. The azole agent is commonly used in this way because of advantages such as relatively high safety compared to amphotericin B and flucytosine, and resistance bacteria hardly appearing. However, it has been reported that fukuconazole (azole antifungal agent) having the largest occupancy rate has a low effective rate for aspergillosis compared to the high effective rate for candidiasis and cryptococcosis (Chemicals) The area of therapy, Vol. 10, pp. 17-26, 1994).
[0009]
In general, azole drugs act bacteriostatically, and are therefore difficult to respond when the patient's resistance to infection is significantly reduced or when an invasive serious infection is induced (chemotherapy). , Volume 10, pages 17-26, 1994). Thus, since the present azole drugs do not have a bactericidal action, it is necessary to administer a relatively large amount of the drug for a long period of time (chemotherapy area, Vol. 10, pages 17 to 26, (1994). Therefore, the occurrence of side effects such as liver damage, renal damage, diarrhea, and vomiting due to long-term administration of such antifungal agents has been regarded as a clinical problem, and further, they are brought about by their long-term administration. There is concern about the problem of drug resistance of mycosis-causing bacteria.
[0010]
On the other hand, lactoferrin is an antibacterial protein possessed by living bodies and is known to exert antibacterial properties against fungi [Infection and Immunity, Vol. 60, 4604-4611. Page, 1992]. Lactoferrin is known to have an important role as a biological protein that is synthesized in large amounts in vivo during acute inflammation due to infection with pathogenic bacteria. For example, bovine lactoferrin is a physiological protein that is contained in a very small amount in milk. Since it is one of the active proteins and its antibacterial activity is at a physiologically active level in vivo, for example, when compared with known antibacterial agents such as conventional azole antifungal agents, It is no exaggeration to say that antibacterial activity has a low level that is hardly comparable. Conventionally, as a combination of an antibacterial agent and lactoferrin, a pharmaceutical composition containing a beta-lactam antibiotic and bovine lactoferrin has been reported (JP-A-3-181421). There are no examples of antibiotics related to azole antifungals that have been discussed in relation to lactoferrin, and the combination of azole antifungals and lactoferrin enhances antifungal activity. Nothing has been known about this, and there are no reports.
From such a state of the prior art, with regard to the azole antifungal agent, etc., there has been development of an antifungal agent having a bactericidal action with a small amount of use, that is, an antifungal agent having few side effects and having a strong antifungal action. It was long-awaited.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
As a result of intensive studies on a novel antifungal agent in view of the above-mentioned conventional technology, the present inventors have added lactoferrin to an azole antifungal substance, so that the azole antifungal agent is more than the conventional dose. It was found that the antifungal activity was exerted at a much smaller dose, and the present invention was completed.
[0012]
An object of the present invention is to provide an antifungal agent which is effective at a small dose, has few side effects, and has a low appearance frequency of resistant bacteria.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
This invention which solves the said subject is an antifungal agent which lactoferrin contains in the ratio of 100 parts-32,000 parts (weight) with respect to 1 part (weight) of azole antifungal substance, and an azole antifungal substance but are even desirable embodiment that the clotrimazole, ketoconazole, lanoconazole, itraconazole or a mixture thereof.
[0014]
Next, the present invention will be described in detail.
The azole antifungal substance used in the present invention may be any of the azole antifungal substances conventionally used as azole antifungal agents, but clotrimazole, ketoconazole or itraconazole are particularly preferred as examples. The
[0015]
The lactoferrin used in the present invention is prepared from milk, human milk or other milk by a conventional method, prepared from a lactoferrin homologous product produced by genetic engineering, or a salt thereof. However, the purity is preferably 90% (weight, hereinafter the same unless otherwise indicated), particularly preferably 95% or more. Moreover, the apolactoferrin which has not couple | bonded the metal, hololactoferrin which couple | bonded metals, such as iron and zinc, may be sufficient, and if it is lactoferrin, the kind will not be specifically limited.
[0016]
The ratio of the antifungal agent of the present invention is at least 100 parts, preferably 2,000 to 32,000 parts, based on 1 part (weight, the same applies hereinafter) of the azole antifungal substance, as will be apparent from the test examples described later. When lactoferrin is blended, the combined effect of lactoferrin is exerted. When the blending amount of lactoferrin is less than 100 parts, the enhancement of the antifungal effect by the combined use of lactoferrin is not recognized, and when it exceeds 32,000 parts, the enhancement of the antifungal effect by the increase of lactoferrin is not recognized.
[0017]
The antifungal agent of the present invention can be formulated into tablets, granules, liquids, powders and the like by conventional methods, and oral, injection, vaginal, troche, ointment, ointment, It can be processed into a lotion or the like, and when these are used, they can be administered in the same manner as the administration methods of known antifungal agents contained therein. The dose of the antifungal agent of the present invention is not less than 1/4 or 1/16 of the dose of the conventional azole antifungal agent, as is apparent from the test examples described below. It is possible to obtain a particularly concomitant combination effect that is not expected from the prior art, that the antifungal activity is equal to or higher than that of an agent. The content of the active ingredient in the antifungal agent of the present invention is at least 3.1 ng / ml for azole antifungal substances and at least 10 μg / ml for lactoferrin.
Lactoferrin is a component of milk or the like that is ingested as a food, and is also used as a food, and as such, does not exhibit toxicity at all, and according to the present invention, by using the lactoferrin together It is possible to significantly reduce the amount of the conventional antifungal agent in which side effects are a problem, thereby providing a safe antifungal agent. The effect of reducing the amount of the antifungal agent used is unique to an azole antifungal substance obtained only when lactoferrin coexists, and is a novel one that has not been reported so far.
[0018]
Next, the present invention will be described in more detail with reference to test examples.
Test example 1
1) Preparation of sample Ketoconazole (manufactured by Sigma) was used as an azole antifungal substance, and this was dissolved in dimethyl sulfoxide (manufactured by Nacalai Tesque). Bovine lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was dissolved in distilled water and sterile filtered.
[0019]
2) Test method 1 ml of Sabouraud dextrose broth (1% peptone, 2% glucose) is weighed into a test tube as a test medium, ketoconazole is added at a concentration shown in Table 1 per ml of the medium, and a control sample (single use) It was. On the other hand, 1 ml of the broth was weighed as a test medium, lactoferrin was added as a test drug at a rate of 100 μg per 1 ml of the medium, and ketoconazole was added at the concentrations shown in Table 1 to prepare test samples (combined use).
[0020]
Candida albicans TIMMM1768 strain (obtained from Teikyo University Medical Mycology Center) was scraped from the agar slant as a test bacterium and added to each sample at a final bacterial concentration of about 10 ⁵ / ml. After culturing at 0 ° C. for 17 hours, the absorbance was measured at 630 nm, and the growth rate of the bacteria was determined.
The growth rate of the bacteria is determined by multiplying (+) the test tube having an absorbance greater than 25% when the absorbance indicated by the test tube to which the test drug is not added is 100%, and ungrowing the test tube having 25% or less. It was determined as (−) and shown in Table 1.
[0021]
3) Test results The results of this test are shown in Table 1. As is clear from Table 1, bovine lactoferrin 100 μg / ml alone could not suppress the growth of bacteria. On the other hand, ketoconazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml, but coexisting with 100 μg / ml of bovine lactoferrin, the amount of ketoconazole necessary to suppress the growth of the bacteria was 3.1 ng / ml (target sample) 1/16). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the use amount of the azole antifungal agent can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. In addition, although it tested by changing the kind of fungi and lactoferrin, the substantially same result was obtained.
[0022]
[Table 1]

[0023]
Test example 2
1) Preparation of sample A sample was prepared by the same method as in Test Example 1 except that clotrimazole (manufactured by Sigma) was used as the azole antifungal substance.
[0024]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0025]
3) Test results The results of this test are shown in Table 2. As apparent from Table 2, bovine lactoferrin 100 μg / ml alone could not suppress the growth of the bacteria. On the other hand, clotrimazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml, but coexistence of 100 μg / ml of bovine lactoferrin resulted in a clotrimazole amount of 12.5 ng / ml required to suppress the growth of the bacteria. Reduced to ml (1/4). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0026]
[Table 2]

[0027]
Test example 3
1) Preparation of Sample A sample was prepared in the same manner as in Test Example 1 except that itraconazole purified from Itrisol (registered trademark, manufactured by Janssen Kyowa Co., Ltd.) capsule 50 was used as the azole antifungal substance.
[0028]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0029]
3) Test results The results of this test are shown in Table 3. As is clear from Table 3, bovine lactoferrin 100 μg / ml alone could not inhibit the growth of bacteria. On the other hand, itraconazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml, but the presence of 100 μg / ml of bovine lactoferrin allowed the amount of itraconazole necessary to suppress the growth of bacteria to be 12.5 ng / ml (1 / Reduced to 4). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0030]
[Table 3]

[0031]
Test example 4
1) Preparation of sample Tests except that anoconazole purified from ASTAT (registered trademark, manufactured by Tsumura Corporation) solution was used as an azole antifungal substance and a sample having a concentration of 200 μg per 1 ml of test medium was prepared. Samples were prepared by the same method as Example 1.
[0032]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0033]
3) Test results The results of this test are shown in Table 4. As is clear from Table 4, bovine lactoferrin 100 μg / ml alone could not suppress the growth of bacteria. On the other hand, lanoconazole alone suppressed the growth of bacteria at 200 ng / ml, but the presence of 100 μg / ml of bovine lactoferrin allowed the amount of lanconazole necessary to suppress the growth of bacteria to be 50 ng / ml (1/4). Reduced to. This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0034]
[Table 4]

[0035]
Test Example 5
1) Sample preparation A sample was prepared by the same method as in Test Example 1 except that clotrimazole (manufactured by Sigma) was used as an azole antifungal substance and human lactoferrin (manufactured by Sigma) was used. did.
[0036]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0037]
3) Test results The test results are shown in Table 5. As is clear from Table 5, 100 μg / ml of human lactoferrin alone could not suppress the growth of bacteria. On the other hand, clotrimazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml, but the presence of 100 μg / ml human lactoferrin allowed the amount of clotrimazole necessary to suppress the growth of bacteria to be 12.5 ng / ml. Reduced to ml (1/4). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0038]
[Table 5]

[0039]
Test Example 6
1) Preparation of sample The sample was prepared in the same manner as in Test Example 1 except that clotrimazole (manufactured by Sigma) was used as an azole antifungal substance and bovine apolactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry) was used. Was prepared.
[0040]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0041]
3) Test results The results of this test are shown in Table 6. As is clear from Table 6, bovine apolactoferrin 100 μg / ml alone could not inhibit the growth of bacteria. On the other hand, clotrimazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml, but coexistence of 100 μg / ml of bovine apolactoferrin, the amount of clotrimazole necessary to suppress the growth of the bacteria was 3.1 ng. / Ml (1/16). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0042]
[Table 6]

[0043]
Test Example 7
1) Preparation of sample A sample was prepared by the same method as in Test Example 6 except that bovine / iron saturated lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was used.
[0044]
2) Test method A test was performed in the same manner as in Test Example 1.
[0045]
3) Test results The results of this test are shown in Table 7. As apparent from Table 7, bovine / iron-saturated lactoferrin 100 μg / ml alone could not inhibit the growth of bacteria. On the other hand, clotrimazole alone suppressed the growth of bacteria at 50 ng / ml. However, coexistence of 100 μg / ml of bovine / iron-saturated lactoferrin allowed the amount of clotrimazole necessary to suppress the growth of bacteria to be 12. Reduced to 5 ng / ml (1/4). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0046]
[Table 7]

[0047]
Test Example 8
1) Preparation of sample The sample was prepared in the same manner as in Test Example 6 except that bovine lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) was used and a sample having a clotrimazole concentration of 200 μg per 1 ml of the test medium was prepared. Prepared.
[0048]
2) Test method The spores of Trichophyton mentagrophytes TIMM1189 strain (obtained from Teikyo University Medical Fungal Center) were scraped from the agar slant as the test bacteria, and the final spore concentration was about 10 ⁴ / ml. In the same manner as in Test Example 1 except that it was added to the test medium at a rate of 5% and cultured at 27 ° C. for 4 days.
[0049]
3) Test results The results of this test are shown in Table 8. As is apparent from Table 8, bovine lactoferrin 100 μg / ml alone could not inhibit the growth of the bacteria. On the other hand, clotrimazole alone suppressed bacterial growth at 200 ng / ml, but coexistence of 100 μg / ml bovine lactoferrin allowed the amount of clotrimazole necessary to suppress bacterial growth to be 50 ng / ml ( Reduced to ¼). This shows that the antifungal activity can be enhanced to the extent that the amount of azole antifungal used can be significantly reduced by the coexistence of lactoferrin. Tests were performed with different fungal and lactoferrin types, but similar results were obtained.
[0050]
[Table 8]

[0051]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited at all by the following examples.
Example 1
An antifungal agent for internal use was produced by mixing 10 mg of bovine lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) with 1 mg of ketoconazole (manufactured by Sigma).
[0052]
Example 2
In 10 ml of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), 1 mg of ketoconazole (manufactured by Sigma), 1 g of human lactoferrin (manufactured by Sigma) and 100 mg of sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were dissolved, and the pH was adjusted to 7. The solution was sterilized by filtration and filled into ampoules 1 ml at a time to obtain 10 antifungal agents for injection.
[0053]
Example 3
10 g bovine apolactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.), 0.1 g methyl paraoxybenzoate (manufactured by Nacalai Tesque), 0.1 g propyl paraoxybenzoate (manufactured by Nacalai Tesque), 12 g propylene glycol (manufactured by Nacalai Tesque), 27.8 g of purified water was stirred and dissolved while heating. Separately, 5 mg of clotrimazole (manufactured by Sigma), 25 g of white petrolatum (manufactured by Nacalai Tesque), 20 g of stearyl alcohol (manufactured by Nacalai Tesque), 4 g of polyoxyethylene hydrogenated castor oil (manufactured by Nacalai Tesque), monostearic acid A solution obtained by stirring and mixing 1 g of glycerin (manufactured by Nacalai Tesque) is added to the above solution and emulsified using a homomixer to prepare an O / W type cream, and 10 g each is filled into an aluminum tube, Ten antifungal agents for external use were obtained.
[0054]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention is an antifungal agent containing an azole antifungal substance and lactoferrin as active ingredients, and the effects exhibited by the present invention are as follows.
1) Since the antifungal agent of the present invention has a strong antifungal effect at a small dose, it can be used as a therapeutic agent for various mycoses.
2) The antifungal agent of the present invention can be used safely as a means for preventing abnormal growth of Candida in the digestive tract.
3) The antifungal agent of the present invention has few side effects and the appearance frequency of resistant bacteria decreases.
4) According to the present invention, the use amount of an azole antifungal agent can be remarkably reduced by using a low concentration of lactoferrin that does not exhibit antifungal activity.

Claims

An antifungal agent comprising lactoferrin in a ratio of 100 parts to 32,000 parts (weight) with respect to 1 part (weight) of an azole antifungal substance .

The antifungal agent according to claim 1, wherein the azole antifungal substance is clotrimazole, ketoconazole, lanoconazole, itraconazole or a mixture thereof.