JP3842647B2 - Interleukin-1 receptor antagonist related molecule and use thereof - Google Patents

Description

当業者は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子の領域における変化が、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持しながら天然に存在する残基に代わって置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７７】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【００７８】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７９】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータプログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された予測性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、臨界数の構造が解明されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００８０】
二次構造を推定するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進化学的連鎖」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）が挙げられる。
【００８１】
好ましいＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合型糖鎖を除去する。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合型糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＩＬ−１ｒａ−Ｒ改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８２】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有しかつポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはこの配列からなるか、あるいは少なくとも１つのアミノ酸欠失を有しかつポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはこの配列からなる。関連する核酸分子はまた、ポリペプチドがカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有しかつさらにこのポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、含むかまたはこの配列からなる。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、そしてここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、含むかまたはこの配列からなる。
【００８３】
さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは他のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合してホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＩＬ−１ｒａ−Ｒ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは別のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドとは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。
【００８４】
融合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＩＬ１ｒａ−Ｒポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基である。ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有するリンカーまたはアダプター分子がまた、設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、誘合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号３６のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合する。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに相補的活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、および恐らく、胎盤移入のような機能を組み込み得る。同書。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８６】
【表２】

一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合し得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドフラグメント（例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合し得る。
【００８７】
得られるＩＬ−１ｒａ−Ｒ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００８８】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ １，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるために、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００９０】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求されるポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９１】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３ １９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ ６２比較行列）を参照のこと）。
【００９２】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：１２
Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００９３】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，前出；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：５０
Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９４】
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なａｌｇｏｒｉｔｈｍ、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ、ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ、およびｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の対の配列間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きなデータベースの配列との間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【００９５】
（核酸分子）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９６】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に記載されている。本発明は、本明細書中に記載され得るような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９７】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、同じ種由来のオーソログまたは関連する遺伝子を同定するためのプローブとして使用し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号３５のいずれかに記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られる誤った陽性の数を最小にする。
【００９８】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９９】
以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、多量に産生され得る。
【０１００】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、このｃＤＮＡのこれら２つのプライマー間の領域を増幅する。
【０１０１】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択される宿主細胞およびＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０３】
いくつかの場合において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成し得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０４】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じるように、宿主細胞機構と適合性である）。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
【０１０５】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０６】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ（これらには、市販の抗体が存在する））をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドから除去され得る。
【０１０７】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０８】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０９】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明かである。
【０１１０】
複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０１１１】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化され得るか、またはベクターの一部として市販で購入されるが、これはまた、本明細書中上記のような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１１２】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１３】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の染色体の連続的な生成の内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１４】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して、原核生物ベクターに使用して容易に合成され得る。
【０１１５】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子に対して同種（天然）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在を介した宿主細胞からのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの分泌は、分泌されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子の一部であり得る。
【０１１６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーのグループから選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１７】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいようないくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（これはまた、グリコシル化に影響し得る）を加え得る。最後のタンパク質産物は、１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１１８】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子に関してイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側およびポリ−Ａ転写終止配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１１９】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＩＬ−１ｒａ−Ｒプロモーター配列は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２０】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１２１】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２２】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子発現を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２ ：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）。
【０１２３】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシスに作用するエレメントである。エンハンサーは、相対的な方向非依存性および位置非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化について例示的に増強するエレメントである。エンハンサーは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０１２４】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がすでにベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２５】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２６】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ^ＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびにバキュロウイルス発現系のような哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のようなプラスミドが挙げられる。
【０１２７】
ベクターが構築され、そしてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅発現および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載される。
【０１２８】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを合成し、これは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合）収集され得るか、直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子に折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１２９】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびゲッ歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞菌株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が挙げられる。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１３０】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．，他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の菌株がまた本方法において使用され得る。
【０１３１】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３２】
さらに、望ましい場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３３】
グリコシル化ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳に得ることができる。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３４】
（ポリペプチド産生）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【０１３５】
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な構成物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出可能である。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３６】
宿主細胞によって産生されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲル移動アッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１３７】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３８】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、均質化、および／または超音波処理、続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の含有量を放出するように溶解され得る。
【０１３９】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内部および／または外部細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、溶解されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１４０】
いくつかの場合、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するのに必要であり得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４１】
封入体がＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４２】
溶液からのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがタグについて高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１４３】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド／ｐｏｌｙＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ § １０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９３）を参照のこと。
【０１４４】
さらに、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【０１４５】
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブな電気泳動を含む）、続くゲル溶出、および分取用等電集束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術を、増加した純度を達成するために組み合わせられ得る。
【０１４６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２；およびＳｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さないで合成され得る。化学的に合成されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化され得て、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４７】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを得る別の手段は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４８】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｚ．ｂｏｌ ３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、それぞれが、５’ランダム化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４９】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５０】
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）（「Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られている）に記載されており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方の分岐点に最終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現より生じる。
【０１５１】
これらの方法はまた、包括的なＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび全生物アッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、高スループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５２】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が、組換えおよび他の手段によって産生され得ることは、当業者によって理解される。
【０１５３】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対して特異性を有する分子を言及する。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＩＬ−１ＲＡ−Ｒポリペプチド選択的結合因子は、ＩＬ−１ＲＡ−Ｒポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【０１５４】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え；キメラ；ヒト化（例えば、ＣＤＲ移植化）；ヒト；単鎖；および／または二重特異的；ならびにそれらのフラグメント；改変体；または誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＩＬ−１ＲＡ−Ｒポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５５】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体力価についてアッセイする。
【０１５６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続的細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【０１５７】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、この重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種から誘導されるか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基有する。ヒト化は、例えば、当該分野（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−３６）で記載される方法を使用して、げっ歯類相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施され得る。
【０１５９】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと結合するヒト抗体がまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６連続するアミノ酸を有する）を用いて免疫化することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、完全に相補性ではない改変を有する）は、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得るために交雑される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６０】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらにより、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示を介した模倣免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの続く選択を処理する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レポーターについて、高い親和性および機能的なアンタゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１６１】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される材料および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６２】
本発明の抗−ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。この抗体は、使用されるアッセイ方法に対して、適切である親和性でＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと結合する。
【０１６３】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗−ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^９９Ｔｃ、 ^{１ １１}Ｉｎ、または^６７Ｇａ）；蛍光化合物または化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）；または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１６４】
競合結合アッセイは、標識した標準物質（例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド、またはその免疫学的に反応性な部分）の能力に依存し、限定された量の抗−ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体との結合に関して、試験サンプル検体（ＩＬ−１ｒａ−Ｒペプチド）と競合する。試験サンプル中のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの量は、抗体と結合する標準物質の量と反比例する。結合する標準物質の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、競合前または後に、代表的に不溶化され、その結果この抗体と結合する標準物質および検体は、結合しないままの標準物質および検体から好都合に分離され得る。
【０１６５】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を代表的にを含み、各々は、決定および／または定量されるタンパク質の異なる免疫部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支持体上に固定化される第１抗体によって代表的に結合され、その後、第２抗体が、この検体に結合され、従って不溶の３部の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な部分で標識されるか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１６６】
抗−ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボイメージングのために有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投与され得、宿主中で標識した抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物中で検出可能である任意の部分で標識され得る。
【０１６７】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１実施形態中で、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合アッセイは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得る抗−ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド抗体であり得、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性を阻害または排除する。アゴニストおよびアンタゴニスト抗体−ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６８】
本発明はまた、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ選択的結合因子（例えば、抗体）を含むキットおよび生物学的サンプル中でＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレベルを検出するために有用である他の試薬に関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキングの血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、および検出試薬を含み得る。
【０１６９】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションするための標識として作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡは、細胞サンプルまたは組織サンプルからまず抽出され、次いで、酵素標識されたｃＤＮＡを蛍光標識されたｃＤＮＡに変換する。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合される、標識されたｃＤＮＡの量を定量することによって視覚化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、高スループットの並行様式で定量され得る。
【０１７０】
この高スループット発現プロファイリングは、本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子に関連して広範の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない：治療のための標的として、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ疾患関連遺伝子の同定および確認；関連するＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子およびそのインヒビターの分子毒性；臨床試験のための代替マーカーの集団および産生の階層化；および高スループットスクリーニングにおいて、選択化合物の同定を援助することによって、関連するＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド小分子薬物探索を増強すること。
【０１７１】
（化学的誘導体）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、この開示が、本明細書中に記載されると、当業者によって調製され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学的な基の除去によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号３６、または他のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７２】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、幾つかの分子が、上記の分子量より多い、いくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７３】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレン、グリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７４】
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、もしくは配列番号３６、または他のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有する。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７５】
ポリペプチドのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペギル化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペギル化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。例えば、反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水安定性、またはモノＣ_１−Ｃ_１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７６】
別の実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン／ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド分子が得られる。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１７７】
一般に、本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１７８】
（遺伝子操作した非ヒト動物）
マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、天然のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子は分裂（すなわち「ノックアウト」）され、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するか、または完全に破壊される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１７９】
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の天然の形態または非相同性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子のいずれかが、動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０１８０】
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の１以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのプロモーターは、（例えば、相同的な組換え方法を使用することによって）活性化されるか、または活性化されず、１以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現のレベルを改変する。
【０１８１】
これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物での薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの量は、動物を薬物候補物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物での薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現により、疾患状態または病理学的状態を生じるか、または関連する。このような場合において、遺伝子の発現を減少させるための薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための能力を試験し得る。別の例において、ポリペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生により、疾患状態または病理学的状態を生じるか、または関連する。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少させるための薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための能力を試験し得る。
【０１８２】
（ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性の他の修飾因子についてのアッセイ）
いくつかの状態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの活性の修飾因子である分子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書中に記載されるように、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、インビボ様式またはインビトロ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８３】
「試験分子」とは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）ための能力について評価する分子を言う。最も一般的に、試験分子は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子発現に影響を与えることによって、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性を直接的に調節し得る。１実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０^−６Ｍ、好ましくは、約１０^−８Ｍ、より好ましくは、約１０^−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０^−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）でＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと結合する。
【０１８４】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、試験分子とＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドとの相互作用が可能な条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の範囲が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングされ得る。
【０１８５】
特定の実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得、これは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を調節する分子は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子、および発現のアンチセンス制御因子として作用する核酸分子を含む。
【０１８６】
一旦、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互作用する場合に、試験化合物が、同定されると、この分子は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１８７】
試験分子とＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１８８】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、結合パートナーに対するＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの結合の速度および／または速度を増加または減少させるために、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定化される。次いで、放射標識したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナー）および試験化合物は、このウェルに、一時に一方を（いずれかの順序で）または同時に添加され得る。インキュベーション後に、この壁を洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに結合する範囲を決定する。代表的に、分子は、濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上を欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルにＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーを固定化し、試験分子および放射標識したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをインキュベートし、そしてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合の範囲を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ１９９５）を参照のこと。
【０１８９】
放射性標識に対する代替として、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得、これらは、比色定量的に検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）に対する抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【０１９０】
ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーは、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固体相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムを通過する、試験分子および相補タンパク質を用いてカラム内に固定化され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドトその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９１】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合タンパク質とＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面に物理的に関係する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９２】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドとＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される。
【０１９３】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドとＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９４】
ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドとＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少される化合物はまた、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーＦのいずれかを発現する細胞および細胞系列を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞系列は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験化合物の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに特徴付けするために有利に使用され得る。
【０１９５】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物への薬物候補の実質的な影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメントなど）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９６】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１８）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ ＰＤＴを称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１９）（これは、腹腔内投与に続いて組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処置された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入に続いて、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９７】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＬ−ｌｒａ−Ｒ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子」は、本明細書中に規定されるような、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子およびＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの両方をいう。所望ならば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒタンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０１９８】
（ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定することを可能することが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定に実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
【０１９９】
（ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドまたはＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２００】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０１】
薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、味付け剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、表面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルビテート（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０またはｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０を参照のこと。
【０２０２】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０３】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理学的な生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり、おそらく非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充されている。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０４】
このＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的に）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内にある。
【０２０５】
処方成分が、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたは多少より低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０６】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子が、滅菌で、等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフィア、生体侵食（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）薬剤、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物に関係し、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御されたまたは持続された放出を提供し得る。ヒアルロン酸がまた、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２０７】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧体と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０８】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身分解が最小化される場合、胃腸管内で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、味付け剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーがまた、使用され得る。
【０２０９】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤は以下を含むが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１０】
さらなるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続または制御送達処方物中にＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食マイクロスフィアあるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性ミクロ粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２１１】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１２】
インビボ投与のために使用されるＩＬ−１ｒａ−Ｒの薬学的組成物は、代表的に滅菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に、またはそれに続いてのいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１３】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１５】
治療的に使用されるＩＬ−１ｒａ−Ｒの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される分子、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１６】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＩＬ−１ｒａ−Ｒ分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。組成物は、従って、組成物が、経時的な単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１７】
薬学的組成物の投与の経路は、例えば、以下のような公知の方法と一致する：経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介して；徐放性系によって；または移植デバイスによって。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２１８】
あるいはまたはさらに、組成物は、その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化される膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２１９】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から除去された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、または器官が引き続いて患者に移植して戻された後にＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの薬学的組成物に曝露される。
【０２２０】
他の場合において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、本明細書中に記載される方法を使用して、遺伝的に操作されて、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを発現および分泌する特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２２１】
本明細書中において議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドで処理することが、望ましくあり得る。このことは、このポリペプチドが細胞膜に対して透過性の形態である場合には、単離された細胞をこのポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２２２】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写に対してサイレントなＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２３】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−７８）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号および同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２４】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、このＤＮＡ配列に標的化ＤＮＡを結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的化ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されて、共有される相同領域を介して内因性ＤＮＡの他の断片とハイブリダイズし、そして従って、その内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる、ＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖に、変異または異なる配列あるいはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが結合される場合には、このオリゴヌクレオチドもまた、この組換えの結果としてその新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡのこの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、この移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２５】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）に、標的化ＤＮＡのこれらの断片を結合する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムにおいて、所望のＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近接性および方向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２２６】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写単位の産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結される）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２２７】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、得られたままの細胞において通常にはサイレントな（発現されていない）遺伝子を活性化すること（または発現させること）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現を増加させることを包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含し、その結果、このパターンは、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そしてその得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させる。
【０２２８】
細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同組換えが使用され得る、１つの方法は、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、その細胞の内在性ゲノムＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’側）に配置する工程を包含する。ゲノムＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置されたこの部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、その改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼは、このプラスミドを、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置するその組換え部位に組込む（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド産生を生じる、新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込む。
【０２２９】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、相同組換えを使用して細胞株のゲノムの他の位置に第２の組換え部位を導入することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、この二組換え部位細胞株に導入され、組換え事象（欠失、反転、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｘｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、その細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からの新規なまたは増加したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド産生を生じる、新しいかまたは改変された転写単位を作製する。
【０２３０】
細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こす工程、および／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、その細胞の内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２３１】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、代表的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的化配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）が、その内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）が、その内在性遺伝子に作動可能に連結される。この標的化配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、制御配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’側である。
【０２３２】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、この遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの断片が、合成され得るか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるそのネイティブのＤＮＡの適切な制限処理によって得られ得る。この断片は、細胞に挿入された際に、標的化配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの断片およびそれに結合した任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２３３】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド細胞治療（例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド産生細胞は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの天然の産生者である細胞であり得るか、またはそのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生する能力が、所望のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達しそしてその遺伝子の発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを投与されている患者における強力な免疫学的反応を最小化するために、外来種のポリペプチドの投与と共に生じ得る場合、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３４】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０２３５】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に回収可能である。このカプセルは、生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、このＤＮＡ配列は、哺乳動物宿主に移植された際にインビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結されている。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位への生きた細胞由来の分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するためのシステムは、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。ＰＣＴ公開ＷＯ９１／／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ ３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結され得るＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得るが、ただし、これは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同性組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を越える選択的優性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２３７】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、次いで、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に導入され得る（エキソビボまたはインビボのいずれか）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの方法は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２３８】
さらに他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の制御された発現のために含められ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して刺激される。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性タンパク質）を二量化する低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３９】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２４０】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダイマーを形成することによって、転写を活性化し、次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２４１】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核に転移し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含み、転写を開始する。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８、およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４２】
別の制御手段は、陽性テトラシクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異したｔｅｔレプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じた変異したｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４３】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）に記載される。
【０２４４】
インビボ遺伝子治療は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子を、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子の局所注射によって、またはその他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４１８−３５。例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能的プロモーターに作動可能に連結したＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびポリアデニル化配列に隣接するＡＡＶ逆末端反復を含む。
【０２４５】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、および乳頭腫ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処置されたヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載される。
【０２４６】
非ウイルス送達法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介送達（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を越える選択的優性を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制御系（安全性の指標）、細胞特異的結合因子（細胞ターゲッティングのため）、細胞特異的内部移行因子、およびベクターならびにベクター製造の方法による発現を増大する転写因子を含み得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、同第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）、同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、および同第４，９４５，０５０同第（生物学的に活性な粒子がある速度で細胞に噴霧され、それによりこの粒子がこの細胞の表面に浸透し、そしてこの細胞の内側に組み込まれるプロセスを記載する）、およびＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載される。
【０２４７】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子治療または細胞治療はさらに、同じか異なる細胞（単数または複数）における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることもまた企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、この細胞は、単一の移植可能デバイス（例えば、上記のカプセル化膜）に含められ得るか、あるいはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４８】
遺伝子治療による細胞における内在性ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を増加する手段は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドプロモーターに１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここでエンハンサーエレメントは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の転写活性を増加させるように働き得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択される−エンハンサーエレメントは、組織が選択されるという点で、プロモーター活性化を与えることが知られている。例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「オンに変わる」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。従って、付加される転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入される）。「相同性組換え構築物」として公知のこの構築物は、次いで、エキソビボまたはインビボノいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２４９】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現を減少するために使用され得る。このような改変は、典型的に、相同性組換え方法によって達成される。例えば、不活性化のために選択されたＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それにより対応するＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の転写を阻止し得る。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写活性化因子結合部位の欠失は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドプロモーター（調節されるＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子と同じかまたは関連の種由来）のすべてまたは関連の部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入によって変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性を減少するか、または完全に不活性にされる。この構築物（これはまた、典型的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブの（内在性）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む）は、直接かまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組込みは、相同性組換えによってであり、ここで、このプロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって、改変プロモーター領域に一体化するのを助け得る。
【０２５０】
（治療的用途）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、多数の疾患、障害または状態（本明細書中で引用されるものを含む）を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。
【０２５１】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド活性を調節し、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少するそれらの分子を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドと相互作用し、それによりその活性を調節する補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子）であり得る。強力なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの可溶性または膜結合形態のいずれかと反応する抗体を含む。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現を調節する分子は、典型的に、発現のアンチセンス制御因子として働き得るＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２５２】
例えば、本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、免疫系不全を含む、疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リウマチ様動脈炎、乾癬性関節炎、炎症性関節炎、変形性関節症、炎症性関節疾患、自己免疫疾患（自己免疫脈管炎を含む）、多発性硬化症、狼瘡、糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）、炎症性腸疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患、および骨折、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形手術、感染または他の疾患プロセスから生じる炎症状態。免疫系の不全によって影響を受ける他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５３】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、感染を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：らい病、ウイルス感染（例えば、肝炎またはＨＩＶ）、細菌感染（例えば、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ関連疾患、ｃｌｏｓｔｒｉｕｍ関連下痢を含む）、肺結核、急性熱性疾患、熱、肝臓の急性期反応、敗血症または敗血症ショック。感染を含む他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５４】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、体重障害を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肥満、食欲不振、悪液質（ＡＩＤＳ誘発性悪液質を含む）、筋障害（例えば、敗血症における筋肉タンパク質代謝）、および低血糖症。体重障害を含む他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５５】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、神経機能不全を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、神経毒性（例えば、ＨＩＶによって誘発されるような）、ＡＬＳ、脳損傷、ストレス、うつ病、痛覚および他の疼痛（癌関連疼痛を含む）、痛覚過敏、癲癇、学習障害および記憶障害、睡眠障害、ならびに末梢神経障害および中枢神経障害。他の神経学的障害は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５６】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、肺を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性もしくは慢性肺損傷（間質性肺疾患を含む）、急性呼吸疾患症候群、肺高血圧症、気腫、嚢胞性線維症、肺性線維症、および喘息。肺の他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５７】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、皮膚を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乾癬、湿疹および創傷治癒。他の皮膚の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５８】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、腎臓を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性および慢性糸球体腎炎。他の腎臓の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２５９】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、骨を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：骨粗鬆症、変形性関節症、骨形成不全症、パジェット病、歯周疾患、一時性顎関節疾患、および高カルシウム血症。他の骨の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２６０】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、血管系を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：出血または発作、出血性ショック、虚血（心臓虚血および大脳虚血、例えば、外傷、癲癇、出血または発作の結果としての脳損傷（これらの各々は、神経変性を生じ得る）を含む）、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、再狭窄、再灌流障害、および新脈管形成。他の血管系の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２６１】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、腫瘍細胞を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リンパ腫、骨肉腫、慢性および急性骨髄性白血病（ＣＭＬおよびＡＭＬ）、および他の白血病、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌、腫瘍転移、および放射線治療の副作用。他の腫瘍細胞を含む疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２６２】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、生殖器系を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不妊症、流産、早期分娩および早期産、ならびに子宮内膜症。他の生殖器系を含む疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２６３】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、眼を含む疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防するために使用され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炎症性眼疾患（例えば、角膜移植に関連し得る）、網膜変性、失明、黄斑変性、緑内障、ブドウ膜炎、および網膜ニューロパシー。他の眼の疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０２６４】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストはまた、疾患（例えば、急性膵炎、慢性疲労症候群、線維素血症、および川崎病（ＭＬＮＳ））を処置するために使用され得る。
【０２６５】
ＩＬ−１インヒビターは、ＩＬ−１に対する細胞性レセプターの活性化を特異的に防止し得る任意のタンパク質を含み、これは、多くの機構から生じ得る。このような機構は、ＩＬ−１産生のダウンレギュレーション、遊離ＩＬ−１の結合、ＩＬ−１のそのレセプターへの結合の妨害、ＩＬ−１レセプター複合体の形成（すなわち、ＩＬ−１レセプター補助タンパク質とのＩＬ−１レセプターの結合）の妨害、およびＩＬ−１のそのレセプターへの結合後のシグナル伝達の調節の妨害を含む。このようなインターロイキン−１インヒビターとしては、以下が挙げられる：本明細書中に記載されるような、ＩＬ−１ｒａ−Ｒのようなインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−１レセプターモノクローナル抗体（例えば、欧州特許第６２３６７４号）、可溶性ＩＬ−１レセプターのようなＩＬ−１結合タンパク質（例えば、米国特許第５，４９２，８８８号、同第５，４８８，０３２号、同第５，４６４，９３７号、同第５，３１９，０７１号、および同第５，１８０，８１２号）、抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０１９９７、ＷＯ９４／０２６２７、ＷＯ９０／０６３７１；米国特許第４，９３５，３４３号；および欧州特許第３６４７７８号、同第２６７６１１号および同第２２００６３号）、ＩＬ−１レセプター補助タンパク質およびそれらに対する抗体（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２３０６７）；インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）またはカスパーゼＩのインヒビター（これを使用して、ＩＬ−１βの産生および分泌を阻害し得る）、インターロイキン−１βプロテアーゼインヒビター、ならびにＩＬ−１のインビボ合成または細胞外放出を遮断する他の化合物およびタンパク質。
【０２６６】
例示的なＩＬ−１インヒビターは、以下において開示される：米国特許第５，７４７，４４４号、同第５，３５９，０３２号、同第５，６０８，０３５号、同第５，８４３，９０５号、同第５，３５９，０３２号、同第５，８６６，５７６号、同第５，８６９，６６０号、同第５，８６９，３１５号、同第５，８７２，０９５号、同第５，９５５，４８０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２１９５７、ＷＯ９６／０９３２３、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９６／４０９０７、ＷＯ９８／３２７３３、ＷＯ９８／４２３２５、ＷＯ９８／４４９４０、ＷＯ９８／４７８９２、ＷＯ９８／５６３７７、ＷＯ９９／０３８３７、ＷＯ９９／０６４２６、ＷＯ９９／０６０４２、ＷＯ９１／１７２４９、ＷＯ９８／３２７３３、ＷＯ９８／１７６６１、ＷＯ９７／０８１７４、ＷＯ９５／３４３２６、ＷＯ９９／３６４２６、およびＷＯ９９／３６４１５；欧州特許第５３４９７８号および同第８９４７９５；ならびに仏国特許出願ＦＲ ２７６２５１４。
【０２６７】
インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１の天然のインヒビターとして作用するヒトタンパク質である。好ましいレセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａならびにその改変体および誘導体を含む）、ならびに、その作成方法および使用方法は、米国特許第５，０７５，２２２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０８２８５、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９２／１６２２１、ＷＯ９３／２１９４６、ＷＯ９４／０６４５７、ＷＯ９４／２１２７５、ＷＯ９４／２１２３５、ＷＯ９４／２０５１７、ＷＯ９６／２２７９３、ＷＯ９７／２８８２８およびＷＯ９９／３６５４１；豪国特許第ＡＵ ９１７３６３６号；仏国特許第ＦＲ ２７０６７７２号；ならびに独国特許第ＤＥ ４２１９６２６号に記載される。このようなタンパク質には、グリコシル化ＩＬ−１レセプターアンタゴニストおよび非グリコシル化ＩＬ−１レセプターアンタゴニストが含まれる。
【０２６８】
具体的には、ＩＬ−１ｒａおよびその改変体の３つの代表的な形態が、５，０７５，２２２特許に開示されかつ記載される。これらのうち１つ目は、「ＩＬ−１ｉ」と呼ばれ、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）中の約５２ｍＭ ＮａＣｌにてＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラムから溶出する、およそ４．８の等電点を有する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける２２〜２３ｋＤの分子として特徴付けられる。２番目（ＩＬ−１ｒａβ）は、４８ｍＭ ＮａＣｌでＭｏｎｏＱカラムから溶出する、２２〜２３ｋＤのタンパク質として特徴付けられる。ＩＬ−１ｒａαおよびＩＬ−１ｒａβの両方がグリコシル化される。３番目（ＩＬ−１ｒａχ）は、４８ｍＭ ＮａＣｌでＭｏｎｏＱカラムから溶出する、２０ｋＤのタンパク質として特徴付けられ、そしてグルコシル化されていない。米国特許第５，０７５，２２２号はまた、これらのインヒビターのコードの原因である遺伝子を単離するための方法、この遺伝子を適切なベクターおよび細胞型でクローン化するための方法、ならびにこの遺伝子を発現させてこれらのインヒビターを産生するための方法を開示する。
【０２６９】
欠失、挿入および置換の多くの組合せ（本明細書中では個々にまたは集合的に「改変体（単数または複数）」）が、ＩＬ−１ｒａ−Ｒのアミノ酸配列内で成され得、但し、得られる分子は、生物学的に活性である（例えば、本明細書中に記載されるような疾患および障害の１つ以上に影響を及ぼす能力を有する）ことを、当業者は認識する。
【０２７０】
本発明により意図されるように、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、他の治療に対する補助物として、そしてまた処置される適応症に適切な他の薬学的組成物と共に投与され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド、および１つ以上の更なる治療または薬学的処方のうちのいずれかが、別々にか、続けてか、または同時に投与され得る。
【０２７１】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される疾患および障害の処置または予防のための１つ以上のＴＮＦインヒビターのいずれかと組合わせた（前処置、処置後、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。
【０２７２】
このようなＴＮＦインヒビターとしては、ＴＮＦのインビボ合成または細胞外放出を遮断する化合物およびタンパク質が挙げられる。特定の実施形態において、本発明は、以下の１つ以上のＴＮＦインヒビターのいずれかと組合わせた（前処置、処置後、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する：ＴＮＦ結合タンパク質（本明細書中で定義されるような、可溶性ＴＮＦレセプターＩ型および可溶性ＴＮＦレセプターＩＩ型（「ｓＴＮＦＲ」）、抗ＴＮＦ抗体、顆粒球コロニー刺激因子、サリドマイド、ＢＮ ５０７３０、テニダプ（ｔｅｎｉｄａｐ）、Ｅ ５５３１、チアパファント（ｔｉａｐａｆａｎｔ）ＰＣＡ ４２４８、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、パナビル（ｐａｎａｖｉｒ）、ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）、ＲＰ ７３４０１、ペプチドＴ、ＭＤＬ ２０１，４４９Ａ、（１Ｒ，３Ｓ）−Ｃｉｓ−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテン塩酸塩、（１Ｒ，３Ｒ）−ｔｒａｎｓ−１−（９−（２，６−ジアミノ）プリン］−３−アセトキシシクロペンタン、（１Ｒ，３Ｒ）−ｔｒａｎｓ−１−［９−アデニル）−３−アジドシクロペンタン塩酸塩および（１Ｒ，３Ｒ）−ｔｒａｎｓ−１−（６−ヒドロキシ−プリン−９−イル）−３−アジドシクロ−ペンタン。ＴＮＦ結合タンパク質は、当該分野で開示される（米国特許第５，１３６，０２１号；欧州特許第３０８３７８号、同第４２２３３９号、同第３９３４３８号、同第３９８３２７号、同第４１２４８６号、同第４１８０１４号、同第４３３９００号、同第４６４５３３号、同第５１２５２８号、同第５２６９０５号、同第５６８９２８号、同第４１７５６３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１３５７５、ＷＯ９１／０３５５３、ＷＯ９２／０１００２、ＷＯ９２／１３０９５、ＷＯ９２／１６２２１、ＷＯ９３／０７８６３、ＷＯ９３／２１９４６、ＷＯ９３／１９７７７、ＷＯ９４／０６４７６、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４；英国特許第ＧＢ ２２１８１０１号および同第２２４６５６９号；ならびに日本国特許出願第ＪＰ１２７，８００／１９９１）。
【０２７３】
例えば、欧州特許第３９３４３８号および同第４２２３３９号は、可溶性ＴＮＦレセプターＩ型（「ｓＴＮＦＲ−Ｉ」または「３０ｋＤａ ＴＮＦインヒビター」としても公知）および可溶性ＴＮＦレセプターＩＩ型（「ｓＴＮＦＲ−ＩＩ」または「４０ｋＤａ ＴＮＦインヒビター」としても公知）（集合的に「ｓＴＮＦＲ」と称する）ならびにその改変形態（例えば、フラグメント、機能的誘導体、および改変体）のアミノ酸配列および核酸配列を教示する。欧州特許第３９３４３８号および同第４２２３３９号はまた、インヒビターのコードの原因である遺伝子を単離するための方法、適切なベクターおよび細胞型でこの遺伝子をクローニングするための方法、ならびにこの遺伝子を発現させてインヒビターを産生するための方法を開示する。さらに、ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩの多価形態（すなわち、１より多くの活性部分を含む分子）もまた開示された。１つの実施形態において、多価形態は、少なくとも１つのＴＮＦインヒビターおよび別の部分を、任意の臨床的に受容可能なリンカー（例えば、ポリエチレングリコール）と化学的にカップリングすることにより（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１６２２１およびＷＯ９５／３４３２６）、ペプチドリンカーにより（Ｎｅｖｅら、１９９６、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、８：３６５−７０）、ビオチンへの化学的カップリングおよび次いでアビジンへの結合（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０３５５３）により、そして最後に、キメラ抗体分子を組合わせることにより（米国特許第５，１１６，９６４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０９６２２およびＷＯ９１／１６４３７；ならびに欧州特許第３１５０６２号）構築され得る。
【０２７４】
抗ＴＮＦ抗体としては、以下が挙げられる：ＭＡＫ １９５Ｆ Ｆａｂ抗体（Ｈｏｌｌｅｒら、１９９３、１ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １４７）、ＣＤＰ ５７１抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Ｒａｎｋｉｎら、１９９５、Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、３４：３３４−４２）、ＢＡＹ Ｘ １３５１マウス抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Ｋｉｅｆｔら、１９９５，７ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ９）；ＣｅｎＴＮＦ ｃＡ２抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９４、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１２５−２７；Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９４、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１０５−１０）。
【０２７５】
特定の実施形態において、本発明は、分泌または可溶性のヒトｆａｓ抗原またはその組換えバージョン（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２０２０６；Ｍｏｕｎｔｚら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：４８２９−３７；および欧州特許第５１０６９１号）と組合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２０２０６は、分泌ヒトｆａｓ抗原（ネイティブおよび組換え（Ｉｇ融合タンパク質を含む））、可溶性組換えヒトｆａｓ抗原のコードの原因である遺伝子を単離するための方法、適切なベクターおよび細胞型でこの遺伝子をクローン化するための方法、ならびにこの遺伝子を発現させてインヒビターを産生するための方法を開示する。欧州特許第５１０６９１号は、ヒトｆａｓ抗原（可溶性ｆａｓ抗原を含む）をコードする核酸、この核酸を発現するためのベクター、およびこのベクターでトランスフェクトされた形質転換体を教示する。非経口的に投与される場合、分泌または可溶性のｆａｓ抗原融合タンパク質の用量は、それぞれ一般的に、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。
【０２７６】
本明細書中に列挙される疾患および障害（リウマチ性疾患のような急性および慢性の炎症を含む）の現在の処置は、一般的に、疼痛および炎症の制御のための第１の系統の薬物の使用を包含し；これらの薬物は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される。二次的な処置は、コルチコステロイド（遅効性の抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）、または疾患改善（ＤＭ）薬を含む。以下の化合物に関する情報は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ （第１６版、１９９２）およびＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ（ＰＪＢ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ）に見出され得る。
【０２７７】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に列挙される疾患および障害（リウマチ性疾患のような急性および慢性の炎症ならびに移植片対宿主病を含む）の処置のためのＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドおよび１以上のＮＳＡＩＤのいずれかの使用に関する。ＮＳＡＩＤは、その抗炎症性作用が、少なくとも部分的に、プロスタグランジン合成の阻害による（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第７版、１９８５））。ＮＳＡＩＤは、以下の少なくとも９つのグループに特徴付けられ得る：（１）サリチル酸誘導体、（２）プロピオン酸誘導体、（３）酢酸誘導体、（４）フェナム酸誘導体、（５）カルボン酸誘導体、（６）酪酸誘導体、（７）オキシカム類、（８）ピラゾール類、および（９）ピラゾロン類。
【０２７８】
別の特定の実施形態にいおいて、本発明は、１つ以上のサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。このようなサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アセトアミノザロール（ａｃｅｔａｍｉｎｏｓａｌｏｌ）、アロキシプリン（ａｌｏｘｉｐｒｉｎ）、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、コリンマグネシウムトリサリチレート、サリチル酸マグネシウム、コリンサリチレート、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、エテルサレート（ｅｔｅｒｓａｌａｔｅ）、フェンドサール（ｆｅｎｄｏｓａｌ）、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、イミダゾールサリチレート、リジンアセチルサリチレート、メサラミン、モルホリンサリチレート、１−ナフチルサリチレート、オルサラジン、パルサルミド（ｐａｒｓａｌｍｉｄｅ）、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド（ｓａｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、サリチルアミド Ｏ−酢酸、サルサレート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジン。同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したサリチル酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７９】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のプロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。プロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、デキスインドプロフェン（ｄｅｘｉｎｄｏｐｒｏｆｅｎ）、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン（ｌｏｘｏｐｒｏｆｅｎ）、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したプロピオン酸誘導体もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８０】
なお別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の酢酸誘導体、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。酢酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン（ｄｅｌｍｅｔａｃｉｎ）、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパック、ロナゾラク、メチアジン酸（ｍｅｔｉａｚｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、オキサメタシン、オキシピナック（ｏｘｐｉｎａｃ）、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラク。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連した酢酸誘導体もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８１】
別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のフェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。フェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸（ｍｅｄｏｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸およびウフェナマート。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したフェナム酸誘導体もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８２】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。使用され得るカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は以下を含む：クリダナク、ジフルニサル、フルフェニサール、イノリジン（ｉｎｏｒｉｄｉｎｅ）、ケトロラクおよびチノリジン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したカルボン酸誘導体もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８３】
なお別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の酪酸誘導体、そのプロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。酪酸誘導体、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ブマジソン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連した酪酸誘導体もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８４】
別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のオキシカム、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。オキシカム、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシル−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミド。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したオキシカムもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８５】
なお別の特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾール、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。使用され得るピラゾール、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は以下を含む：ジフェナミゾールおよびエピリゾール。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したピラゾールもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８６】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾロン、そのプロドラッグエステル、または薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。使用され得るピラゾロン、そのプロドラッグエステル、および薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾンおよびチアゾリノブタゾン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したピラゾロン（ｐｙｒａｚａｌｏｎｅ）もまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８７】
別の特定の実施形態において、本発明は、以下のＮＳＡＩＤの１つ以上のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または処置と同時）、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する：ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリジネート（ｂｅｎｄａｚａｃ ｌｙｓｉｎａｔｅ）、ベンジダミン、ベプロジン（ｂｅｐｒｏｚｉｎ）、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラク、シプロカゾン、クロキシマート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド、ジフェンピラミド、ジフィサラミン（ｄｉｆｉｓａｌａｍｉｎｅ）、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールメシレート、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロカゾン、フォピルトリン（ｆｏｐｉｒｔｏｌｉｎｅ）、フォスフォサル、グアイメサール、グアイアゾレン（ｇｕａｉａｚｏｌｅｎｅ）、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｒｎ）、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リジンクロニキシネート（ｌｙｓｉｎ ｃｌｏｎｉｘｉｎａｔｅ）、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ぺリソキサール、クエン酸ぺリソキサール、ピフォキシム、ピプロキセン（ｐｉｐｒｏｘｅｎ）、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロカゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ（ｔｈｉｅｌａｖｉｎ Ｂ）、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプトアミド（ｔｒｙｐｔａｍｉｄ）および４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ １２７、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０のような会社コード番号によって登録されるようなＮＳＡＩＤ。ＮＳＡＩＤに対して類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したＮＳＡＩＤはまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８８】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、リウマチ性疾患、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性炎症を含む、本明細書中に列挙される疾患および障害の処置のための、１つ以上の副腎皮質ステロイド、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または処置と同時）、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。副腎皮質ステロイド、プロドラッグエステル、およびその薬学的に受容可能な塩は、以下に由来するヒドロコルチゾンおよび化合物を含む：２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンバレレート、ブデソニド、クロロプレドニゾロン、クロベタゾール、クロベタゾールプロピオネート、クロベタゾン、クロベタゾンブチレート、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルシノロンアセトニド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオコルトロンヘキサノエート、ジフルコルトロンバレレート、フルオロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンアセテート、ヒドロコルチゾンブチレート、ヒドロコルチゾンホスフェート、ヒドロコルチゾン２１−ナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾンメチルプレドニソロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドリアミノアセテート、プレドニゾロンナトリウムホスフェート、プレドニゾロンナトリウムスクシネート、プレドニゾロンナトリウム２１−ｍ−スルホベンゾエート、プレドニゾロン２１−ステアログリコレート、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾロン２１−トリメチルアセテート、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、プレドニリデン２１−ジエチルアミノアセテート、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロンヘキサアセトニドのようなヒドロコルチゾン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連した副腎皮質コルチコイドはまた、この群に含まれることが意図される。
【０２８９】
別の特定の実施形態において、本発明は、リウマチ性疾患、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性炎症を含む、本明細書中に列挙される疾患および障害の処置のための、１つ以上の遅効性の抗リウマチ性薬物（ＳＡＡＲＤ）または疾患改変抗リウマチ性薬物（ＤＭＡＲＤＳ）、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または処置と同時）、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、プロドラッグエステル、およびその薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アロキュプレイドナトリウム、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アウロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナール（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）ナトリウム、ブシラミン、カルシウム３−アウロチオ−２−プロパノール−１−スルホネート、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリット、キュプロキソリン、シクロホスホアミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、金ナトリウムチオマレート、金ナトリウムチオスルフェート）、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシクロロキンスルフェート、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリット、メリチン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル（ｍｏｆｅｔｉｌ）、ミオラル、ナイトロジェン・マスタード、Ｄ−ペニシルアミン、ピリジノール、イミダゾール（例えば、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０）、ラパマイシン、チオール、サイモポエチン、およびビンクリスチン。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤはまた、この群に含まれることが意図される。
【０２９０】
別の特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性炎症を含む、本明細書中に列挙される疾患および障害の処置のための、１つ以上のＣＯＸ２インヒビター、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または処置と同時）、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。ＣＯＸ２インヒビター、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩の例としては、例えば、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）が挙げられる。類似した鎮痛性特性および抗炎症性特性を有する構造的に関連したＣＯＸ２インヒビターはまた、この群に含まれることが意図される。
【０２９１】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性炎症を含む、本明細書中に記載される疾患および障害の処置のための、１つ以上の抗菌剤、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または処置と同時）、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用に関する。抗菌剤としては、例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよび他のβ−ラクタム、アミノ配糖体、アゾール、キロノン類、マクロライド、リファマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびポリミキシンの広範なクラスが挙げられる。ペニシリンは、以下を含むがこれらに限定されない：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロクサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、ヘタシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎｄａｎｙｌ）、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン（ｐｅｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、およびメシリナム。セファロスポリンおよび他のβ−ラクタムとしては、以下を含むがこれらに限定されない：セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム（ｃｅｒｕｒｏｘｉｍｅ）、セフォニシド、セフォラジン（ｃｅｆｏｒａｄｉｎｅ）、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン（ｃｅｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフォペラゾン（ｃｅｐｈｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナム。アミノ配糖体としては、以下を含むがこれらに限定されない：ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシン。アゾールとしては、フルコナゾールを含むがこれに限定されない。キノロン類としては、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンを含むがこれらに限定されない。マクロライドとしては、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシンおよびアジスロマイシンを含むがこれらに限定されない。リファマイシンとしては、リファンピンを含むがこれに限定されない。テトラサイクリンとしては、スピサイクリン（ｓｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ぺニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリン（ｓｅｎｏｃｉｃｌｉｎ）およびテトラサイクリンを含むがこれらに限定されない。スルホンアミドとしては、スルホニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾールおよびｃｏ−トリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキシサゾール）を含むがこれらに限定されない。リンコサミドとしては、クリンダマイシンおよびリンコマイシンを含むがこれらに限定されない。ポリミキシン（ポリペプチド）としては、ポリミキシンＢおよびコリスチンを含むがこれらに限定されない。
【０２９２】
ＩＬ−１ＲＡ−Ｆポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切であるように、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて（同時にかまたは引き続き）使用され得る。
【０２９３】
望ましくないレベルの１つ以上のＩＬ−１、ＩＬ−１ｒａ、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。望ましくないレベルとしては、過度のレベルのＩＬ−１、ＩＬ−１ｒａ、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド、および正常以下のレベルのＩＬ−１、ＩＬ−１ｒａ、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが挙げられる。
【０２９４】
（ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸およびＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２９５】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＩＬ−１ｒａ−Ｒ核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２９６】
他の方法はまた、１つ以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡに相補的でありかつ発現制御配列（三重らせん形成）またはＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が次いで、対応するＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、防止されるかまたは低減される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの減少または不在に関連する情報を提供する。
【０２９７】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの優性ネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡは、調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２９８】
さらに、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（生物学的に活性でも活性でなくても）は、免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、それに対して抗体が誘発され得る少なくとも１つのエピトープを含有する。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるように）は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体をまた使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む多数の疾患および障害を、予防、処置、または診断し得る。これらの抗体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を低減するかまたは遮断するように、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を増加し得る（ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
【０２９９】
本発明のＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、発現クローニングストラテジーを使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターをクローン化するために使用され得る。放射性標識（^１２５ヨウ素）されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドまたはアフィニティ／活性−タグ化ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合またはアルカリホスファターゼ融合）を、結合アッセイにおいて使用して、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞型または細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され得、哺乳動物発現ベクターにクローン化され、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３細胞）にトランスフェクトされて発現ライブラリーを生成する。放射性標識されるかまたはタグ化されたＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、次いで、アフィニティリガンドとして使用されて、このライブラリーから、その表面上にＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞のサブセットを同定および単離し得る。ＤＮＡは、次いでこれらの細胞から単離され得、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトされて二次発現ライブラリー（ここで、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞の画分は、元のライブラリーよりも何倍も高い）を作製し得る。この富化プロセスは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターを含有する単一の組換えクローンが単離されるまで繰り返し反復され得る。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプターの単離は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプター、抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドレセプター抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、そしてこれらは、本明細書中に記載される疾患または障害の１つ以上を、処置、予防、または診断するために使用され得る。
【０３００】
ヒトＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡの寄託（受託番号ＰＴＡ−１４２３を有する）を、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア ２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティ ブールバード １０８０１）にて２０００年２月２９日に行った。
【０３０１】
以下の実施例は、例示目的のみのために意図され、本発明の範囲をどちらにしても限定するとは解釈されるべきではない。
【０３０２】
（実施例１：ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド遺伝子のクローニング）
概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子をクローン化および分析するために使用した。
【０３０３】
ヒトＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、専有データベース（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）の検索を、クローンｓｈｏｓ１−００００３−ｄ１を問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列として使用して行った。この様式で同定された４２３ｂｐの配列は、アミノ酸レベルで問い合わせ配列に対して４１％同一性を共有することが見出された。この配列内の最も高い相同性の領域を使用して、ｃＤＮＡ供給源の同定およびｃＤＮＡクローンの生成のために、種々のＰＣＲストラテジーを使用して、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計した。
【０３０４】
多数のｃＤＮＡライブラリーを、２５μｌの全反応容積で、１０ｎｇのｃＤＮＡライブラリーテンプレートＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのアンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）：２３４９−９８（５’−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２０）および２３４９−９９（５’−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号２１）、ならびにＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含有する増幅反応で分析した。反応を、９５℃にて５分間を１サイクル；９５℃にて１５秒間、６３℃にて１５秒間、そして７２℃にて１分間を３０サイクル；および７２℃にて１０分間を１サイクルにて行った。予測されたサイズ（１５３ｂｐ）のＰＣＲ産物を、多数のｃＤＮＡライブラリー（ヒト胎児頭皮（オリゴ−ｄＴでプライムした（ｐｒｉｍｅｄ）もの）およびヒト胎盤（オリゴ−ｄＴでプライムしたものおよびランダムにプライムしたもの）を含む）において同定した。
【０３０５】
胎児頭皮よび胎盤のｃＤＮＡライブラリーを、以下のようにして調製した。全ＲＮＡを、ヒト胎児頭皮から、およびヒト胎盤から標準的なＲＮＡ抽出手順を使用して抽出し、そしてポリ−Ａ^＋ＲＮＡを、標準的な手順を使用してこの全ＲＮＡから選択した。ランダムにプライムされたかオリゴ−ｄＴでプライムされたｃＤＮＡを、このポリ−Ａ ^＋ ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングキット用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、製造者の示唆したプロトコルまたは他の適切な手順に従って合成した。得られたｃＤＮＡを、適切な制限酵素を用いて消化し、次いでｐＳＰＯＲＴ−１、または他の適切なクローニングベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を、標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして細菌性形質転換体を、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールのいずれかを含有する培養プレートで選択した。ｃＤＮＡライブラリーは、これらの形質転換体の全てまたはサブセットから構成された。
【０３０６】
５’ＲＡＣＥ反応および３’ＲＡＣＥ反応の両方を、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドについての全長ｃＤＮＡ配列を作成するために行った。ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドについてのｃＤＮＡ配列の５’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、５’ＲＡＣＥを、１０ｎｇのオリゴ−ｄＴ−プライムされたヒト胎児頭皮ｃＤＮＡライブラリーをｐＳＰＯＲＴ１ならびにプライマー１５７２−３６（５’−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−３’；配列番号２２）および２３４９−９９を使用して行った。反応を、９４℃にて１分間を１サイクル；９４℃にて５秒間そして７２℃にて５分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間そして７２℃にて３分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、そして７２℃にて３分間を２５サイクル；ならびに７２℃にて７分間を１サイクルで行った。入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを、５’ＲＡＣＥ増幅産物の一部およびプライマー２３２８−９１（５’−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号２３）および２３５１−４７（５’−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号２４）を使用して行った。入れ子式ＰＣＲを、９４℃にて１分間を１サイクル；９４℃にて５秒間および７２℃にて５分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間、そして７２℃にて３分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、そして７２℃にて３分間を２５サイクル；ならびに７２℃にて７分間を１サイクルで行った。
【０３０７】
ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドについてのｃＤＮＡ配列の３’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、３’ＲＡＣＥを、１０ｎｇのオリゴ−ｄＴでプライムされたヒト胎児頭皮ｃＤＮＡライブラリーを使用してｐＳＰＯＲＴＩならびにプライマー２３５１−４８（５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号２５）および２３２９−９３（５’−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号２６）を使用して行った。反応を９４℃にて１分間を１サイクル；９４℃にて５秒間および７２℃にて５分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、７０℃にて１０秒間、および７２℃にて３分間を５サイクル；９４℃にて５秒間、６８℃にて１０秒間、および７２℃にて３分間を２５サイクル；ならびに７２℃にて７分間を１サイクルで行った。入れ子式ＰＣＲを、３’ＲＡＣＥ増幅産物の一部およびプライマー２３６３−０４（５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号２７）および２３２９−９４（５’−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号２８）を使用して行った。入れ子式ＰＣＲを、９５℃にて１分間を１サイクル；９５℃にて３０秒間および６８℃にて１分間を３０サイクル；ならびに６８℃にて７分間を１サイクルで行った。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドについての全長ｃＤＮＡ配列を、５’ＲＡＣＥクローンおよび３’ＲＡＣＥクローンの得られた収集物からアセンブルした。
【０３０８】
ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドについてのｃＤＮＡ配列の５’部分を、ヒト胎盤Ｍａｒａｔｈｏｎ^ＴＭ ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のｃＤＮＡ配列を独立して単離することにより確認した。ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドについてのｃＤＮＡ配列の５’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、５’ＲＡＣＥを、１ｎｇのヒト胎盤ｃＤＮＡならびにプライマーＡＰ−１（５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号２９；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および２３５３−８７（５’−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号３０）を使用して行った。反応を、９４℃にて２分間を１サイクル；９４℃にて５秒間および７２℃にて１．５分間を５サイクル；９４℃にて５秒間および７０℃にて１．５分間を５サイクル；９４℃にて５秒間および６８℃にて１．５分間を２５サイクル；および８６℃にて７分間を１サイクルで行った。入れ子式ＰＣＲを、５’ＲＡＣＥ増幅産物の一部ならびにプライマーＡＰ−１および２３４９−５２（５’−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−３’；配列番号３１）を使用して行った。入れ子式ＰＣＲを、９４℃にて２分間を１サイクル；９４℃にて１０秒間および６８℃にて１．５分間を３０サイクル；および６８℃にて７分間を１サイクルで行った。
【０３０９】
ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドについての推定ｃＤＮＡ配列の配列分析は、この遺伝子が、１５２個のアミノ酸のタンパク質をコードする４５６ｂｐのオープンリーディングフレーム（図１Ａ〜１Ｂ）を含むことを示した。ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの配列改変体もまた同定された。この改変体の配列分析は、この改変体についての遺伝子もまた、１５２個のアミノ酸のタンパク質をコードする４５６ｂｐのオープンリーディングフレーム（図２Ａ〜２Ｂ）を含むことを示唆した。この改変体のヌクレオチド配列は、２つのヌクレオチド位置においてヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子と異なる。
【０３１０】
図４Ａ〜４Ｂは、以下のアミノ酸配列アラインメントを図示する：ヒトＩＬ−１α（ＩＬ−１ ａｌｐｈａ；配列番号７）、ヒトＩＬ−１β（ＩＬ−１ ｂｅｔａ；配列番号８）、ヒトＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；配列番号９）、ヒトＩＬ−１δ（ＩＬ−１ ｄｅｌｔａ；配列番号１０）、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号２）、ヒトＴａｎｇｏ−７７（Ｔａｎｇｏ−７７；配列番号１１）、ヒトＺｉｌｌａ４（Ｚｉｌｌａ４；配列番号１２）、ヒトＩＬ−１ζ（ＩＬ−１ ｚｅｔａ；配列番号１３）、ヒトＩＬ−１レセプターアンタゴニストβ（ＩＬ−１ＲＡ β；配列番号１４）、ヒトＳＰＯＩＬ ＩＩ（Ｓｐｏｉｌ ＩＩ；配列番号１５）、ヒトＩＬ−１ε（ＩＬ−１ ｅｐｓｉｌｏｎ；配列番号１６）、およびヒトＩＬ−ｌ１η（ＩＬ１ ｅｔａ；配列番号１７）。図５は、ＩＬ−１ｒａ遺伝子ファミリーの系統発生的関係を模式的に図示する。
【０３１１】
（実施例２：ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド遺伝子スプライス改変体（バリアント）のクローニング）
概して、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドスプライス改変体（バリアント）をコードする遺伝子をクローニングおよび分析するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載の材料および方法を用いた。
【０３１２】
ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのスプライス改変体をコードする全長ｃＤＮＡ配列を、以下のように調製したヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した。標準的ＲＮＡ抽出手順を用いて、総ＲＮＡをヒト胎盤から抽出し、そして標準的手順を用いてこの総ＲＮＡからポリ−Ａ ^＋ ＲＮＡを選択した。製造業者の示唆したプロトコールに従って、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、このポリ−Ａ^＋ＲＮＡから、オリゴ−ｄＴプライムしたｃＤＮＡを、合成した。得られたｃＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、次いで０．８％アガロースゲル上での電気泳動によって分画した。０．８〜１．６ｋｂのフラグメントを単離し、精製し、次いでｐＳＰＯＲＴ−１に連結した。連結（ライゲーション）産物を、標準的技術を用いてＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、そして細菌形質転換体を、アンピシリン含有培養プレート上で選択した。得られた形質転換体をプールして、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、そしてプラスミドＤＮＡを、このｃＤＮＡライブラリーの１２のプール（それぞれが約８０，０００コロニーを含有する）から調製した。
【０３１３】
１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、アンプライマー２３４９〜９８および２３４９〜９９（各、０．４μＭの濃度）、ならびにＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（すぐ使用できる）ＰＣＲビーズを含有する増幅反応物（総反応容積２５μｌ）中で、各ｃＤＮＡライブラリープールのそれぞれを、分析した。９４℃５分を１サイクル；９４℃３０秒、６５℃３０秒、および７２℃１分を３０サイクル；ならびに７２℃１０分を１サイクルで、反応を実施した。ｃＤＮＡライブラリープールをまた、１０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、アンプライマー２３４９〜５１（５’−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−３’；配列番号３２）および２３４９〜５２（各、０．４μＭの濃度）、ならびにＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（すぐ使用できる）ＰＣＲビーズを含有する増幅反応物（総反応容積２５μｌ）中で、分析した。９４℃５分を１サイクル；９４℃３０秒、６５℃３０秒、および７２℃１分を３０サイクル；ならびに７２℃１０分を１サイクルで、反応を実施した。次いで、これらの反応で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析した。
【０３１４】
３つのプール由来のプラスミドＤＮＡは、期待されるサイズを有するＰＣＲ産物を生成した。そして、これらの各々の陽性プール由来の３×１０^５クローンを、アンプライマー２３４９−９８および２３４９−９９を用いるＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによって生成したＰＣＲ産物（ｚｈｖｔ−０００３２９）の１つを、^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、プローブとして用いて、陽性のｃＤＮＡライブラリーのプールを再スクリーニングした。細菌コロニーを、（１５０ｍｍプレートあたり、約５０，０００で）プレートし、次いで、ニトロセルロースフィルター上に吊り上げた。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で６８℃３０分間、フィルターをプレハイブリダイズし、次いで、標識プローブを添加した同じ溶液中で、６８℃一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、このフィルターを、２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳ中で、室温で１０分間２回洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で、６８℃で３０分間２回洗浄した。次いで、強化スクリーンを有するオートラジオグラフィーに−８０℃で２時間フィルターを曝した。ｃＤＮＡライブラリープールの１つから、約１．２ｋｂのインサートを含有する陽性クローン（ＲＤＳ＃１９９９１８５０３）を、同定した。別のｃＤＮＡライブラリープールから、約０．８ｋｂのサイズのインサートを含有する第二の陽性クローン（ＲＤＳ＃１９９９１８５０１）を、同定した。これらのクローンの各々からプラスミドＤＮＡを調製し、そして配列を分析した。
【０３１５】
これらのクローンの１つについて予想されるｃＤＮＡ配列の配列分析によって、このｃＤＮＡが、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（実施例１を参照）の改変体をコードすることが示された。この改変体をコードする遺伝子は、１７１アミノ酸のタンパク質をコードする５１３ｂｐのオープンリーディングフレームを含む（図３）。
【０３１６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＣ０１６７２４，コンティグ．フラグメント７６６４９−９６３４２）を含有するヒトゲノムの配列分析により、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の最初のエキソン（実施例１を参照）が、Ｉｌ−１オメガ（Ｏｍｅｇａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｚ３０００５０）の最後のエキソンの４．１ｋｂ下流に存在するが示された。ゲノム中のこれらの２つの遺伝子の密接な近似により、本ポリペプチドは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子、またはその改変体（実施例１を参照）の第二のエキソン上のＩＬ−１オメガ（Ｏｍｅｇａ）の最初の２つのエキソンのスプライシング（または融合）から生じ得ることが示唆される。従って、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの改変体は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒスプライス改変体、融合タンパク質、などであり得る。ＩＬ−１Ｏｍｅｇａにおける第二エキソンおよびＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（またはその改変体）の第二エキソンの並列（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、シグナルペプチドとして機能するらしい、Ｎ末端を有するタンパク質をコードする配列を生じる。図６は、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（成熟（Ｍａｔｕｒｅ）ＣＳ３２９）と、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの配列改変体（成熟ＣＳ３２９改変体タンパク質）と、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのスプライス改変体（オメガ（Ｏｍｅｇａ）３２９タンパク質）との間の関係を図示する。
【０３１７】
（実施例３：マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド遺伝子のクローニング）
概して、マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載の材料および方法を用いた。
【０３１８】
マウスＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡを単離するために、７日齢マウス胚ｃＤＮＡライブラリーテンプレート、ならびにアンプライマー２５５７−９５（５’−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号３３）および２５５７〜９６（５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号３４）、ならびに標準的技術を用いて、ＰＣＲを実施した。
【０３１９】
マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定ｃＤＮＡ配列の配列分析によって、この遺伝子が、１５２アミノ酸のタンパク質をコードする４５６ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図７）。図８は、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ｈｕＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号２）およびマウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ｍｕＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号３６）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。図９Ａ〜９Ｉは、マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（配列番号３７）のゲノムヌクレオチド配列を例示する。エキソン１〜４のコード部分の位置を示す（下線）。
【０３２０】
（実施例４：ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡ発現）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡの発現を、１０ｎｇのｃＤＮＡライブラリーテンプレートＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのアンプライマー２３４９〜９８および２３４９〜９９、ならびにＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（すぐ使用できる）ＰＣＲビーズを含有する増幅反応物（総反応容積２５μｌ）中でのＰＣＲによって検討した。９５℃５分を１サイクル；９５℃１５秒、６３℃１５秒、および７２℃１分を３０サイクル；ならびに７２℃１０分を１サイクルで、反応を実施した。ヒト胎児頭皮、ヒト胎児眼、ヒト胆嚢、およびヒト胎盤を含む、多数のｃＤＮＡライブラリー中から、予期されたサイズ（１５３ｂｐ）のＰＣＲ産物を、同定した。ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡ発現をまた、アンプライマー２３４９〜５１および２３４９−５２、ならびにＴｉｔａｎシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって、胎児眼および胎児脾臓中で検出した。５５℃３０分を１サイクル；９４℃１５秒、６４℃１５秒、および６８℃５０秒（１サイクルについて２秒ずつ増加）を３０サイクル；ならびに６８℃７分を１サイクルで、これらの反応を実施した。
【０３２１】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡの発現を、ヒトおよびマウスのＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたノーザンブロット分析によって試験した。ブロットをまず、Ｐｒｅ−Ｈｙｂ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で６５℃で３０分間、プレハイブリダイズし、次いで、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜４７４に対応する、２５ｎｇの^３２Ｐ標識プローブを含有する同じ溶液中で、６５℃一晩プローブした。このプローブを、Ｒｅｄｉ Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて標識した。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で、１時間２回、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１時間２回、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で３０分間２回洗浄し、次いで２×ＳＳＣ中でリンスした。ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）中のノーザンブロットの一晩の曝露後、約１．６ｋｂの転写物を、マウスの骨格筋中で検出し（図１０Ａ）、そして約２．９ｋｂの転写物を、ヒトの膵臓および末梢血白血球中で検出した（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。同じプローブを用いたドットブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の分析において、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡをマウス骨格筋、顎下腺、および精巣上体中で検出した。
【０３２２】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化した。正常胚および成体マウス組織のパネルを４％パラホルムアミド中で固定し、パラフィンに包埋し、そして５μｍに切片化した。切片化した組織を、０．２Ｍ ＨＣｌ中で透過化処理し、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液、０．２％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ ポリＡ、２５μｇ／ｍｌ ポリＣおよび５０％ホルムアミド）中で１時間６０℃でプレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよび２×１０^４ｃｐｍ／μｌの^３３Ｐ−標識アンチセンスリボプローブ（ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子に相補的）を含有する同じ溶液中で６０℃で一晩ハイブリダイズする。標準的技術を用いて、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｃＤＮＡを含有するクローンのインビトロ転写によって、このリボプローブを得る。
【０３２３】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、４℃に３週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（矢状断面１つおよび冠状断面２つ）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲）、骨（大腿）、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗野かつ標準のイルミネーションによって同時に分析する。
【０３２４】
（実施例５：ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの生成）
（Ａ．細菌におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサート（挿入物）の存在を確認する。
【０３２５】
形質転換した宿主細胞を、導入前に、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。最終濃度３０ｎｇ／ｍＬへのＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０３２６】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中にホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３２７】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５に記載のように決定する。
【０３２８】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３２９】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現は、銀染色によって検出できる。あるいは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを、ペプチドタグに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として生成する。 ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得、またはＩＬ−１ｒａ−Ｒ融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０３３０】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現および精製）
リポフェクチンまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３ ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現構築物を導入する。
【０３３１】
生成されるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３ ＥＢＮＡクローニングのプールから大量の馴化培地を生成する。この細胞を５００ｃｍ Ｎｕｎｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｆｌａｓｋｓ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換える。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃に凍結する。
【０３３２】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通す。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードした。このカラムをＡ_２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌを用いてｐＨ７．２でＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを、カラムから溶出し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和する。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０３３３】
ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０３３４】
（実施例６：抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド抗体の生成）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＩＬ−１ｒａ−Ｒペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載の手順を含む。
【０３３５】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗原（例えば、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体産生について試験する。
【０３３６】
抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体を得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３３７】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対する抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成され、そして単離された全長ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを用いてＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔを免疫することによって得られた。粗ポリクローナル免疫血清を回収し、そして組み換えＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（図１１Ａ〜１１Ｂ、レーン１、４、および７）、組み換えＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体（図１１Ａ〜１１Ｂ、レーン２、５、および８）、および組み換えＩＬ−１ｒａ（図１１Ａ〜１１Ｂ；レーン３、６、および９）を用いる免疫沈澱分析に用いた。１０ｎｇ（図１１Ａ、レーン４〜６）もしくは０．６μｇ（図１１Ｂ、レーン７〜９）のいずれかの組み換えポリペプチドを、１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル上に直接ロードすること、またはゲル上にサンプルをロードする前に、０．２μｌの粗抗血清（図１１Ａ、レーン１〜３）を用いて１μｇの組み換えポリペプチドを免疫沈降することによって、ゲルを調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットし、そして粗抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒ血清の１：１０００希釈を用いて発色させ、続いて、ＨＲＰ結合体化プロテインＡおよびＥＣＬで検出した。図１１Ｂに示すゲルを、ブロッティング後、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに対する抗体は、膜固定ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドおよびＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体の両方を検出するが、ＩＬ−１ｒａは検出しないことが示された。溶液中で、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド改変体よりも効率的に認識された。
【０３３８】
（実施例７：トランスジェニックマウスにおけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの機能に関する情報である、病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、遍在性発現を生じることが期待される。
【０３３９】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、ＩＬ−１ｒａ−ＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、所望の配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。そしてこの配列は、発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込む。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＩＬ−１ｒａＲポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３４０】
連結（ライゲーション）後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性で選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートの存在および変異が存在しないことを確認する。ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド導入遺伝子を含有する直線フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０３４１】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚を、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ_２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の着床から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に取り込んだ導入遺伝子のＰＣＲ増幅でスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０３４２】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列に位置し、そしてＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド導入遺伝子の３’である）を用いて、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３４３】
（実施例８：トランスジェニックマウスにおけるＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルオロラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３４４】
肉眼解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０３４５】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体についての免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３４６】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０^６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を有する、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ^＋およびＭｇ^＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３４７】
（実施例９：ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの機能化）
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドが、ＩＬ−１、ＩＬ−１８または他のサイトカインに対する細胞応答に影響を与えるか否かを評価するために、以下の実験を行った。最初に、マウスの骨髄細胞を、以前に記載されたとおりのレトロウイルス感染（Ｙａｎら，１９９９，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：１４０９−１７）によってＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子で形質導入した。次いで、形質導入された骨髄を用いて、致死的に照射されたレシピエントマウスに移植した。造血が回復したら、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ形質導入マウスおよびコントロールマウス（すなわち、空のレトロウイルスベクターで形質導入したマウス）由来の骨髄および脾臓細胞を、一連の分析（ＦＡＣＳ分析（図１２）、コロニーアッセイ（図１３Ａ〜１３Ｂ）およびＩＬ−１２（図１４）またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８（図１５）のいずれかに応じたγ−インターフェロン産生を含む）に供した。
【０３４８】
このデータは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子の発現が、脾臓中の造血前駆体の特定のサブセット（最も顕著にはＧ−ＣＳＦはＧＭ−ＣＦＣを誘導した；ＳＣＦ／ＥｐｏはＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｍｉｘを誘導した；そしてＣＳＦ−１はＭ−ＣＦＣを誘導した）および骨髄中の造血前駆体の特定のサブセット（ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦはＧＭ−ＣＦＣを誘導した；ＳＣＦ／ＥｐｏはＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｍｉｘを誘導し、そしてＩＬ−３／ＥｐｏはＧＭ−ＣＦＣ／ＣＦＵ−Ｍｉｘを誘導した）の相対量および／またはサイトカイン応答に影響を与えることを示唆する。
【０３４９】
ＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの発現はまた、脾細胞上でのＣＤ４およびＮＫ１．１の表面発現の減少と、ならびに脾細胞がＩＬ−１２単独またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８に応じてγ−インターフェロンを産生する能力の減少と相関する。
【０３５０】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、改変および修飾が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、本願発明の範囲内に入る全てのこのような均等な改変物を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｂは、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】 図２Ａ〜２Ｂは、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子改変体のヌクレオチド配列（配列番号３）、およびこの改変体によりコードされるヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３】 図３は、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒスプライス改変体のヌクレオチド配列（配列番号５）、およびこのスプライス改変体によりコードされるヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４】 図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＩＬ−１α（ＩＬ−１＿ａｌｐｈａ；配列番号７）、ヒトＩＬ−１β（ＩＬ−１＿ｂｅｔａ；配列番号８）、ヒトＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ；配列番号９）、ヒトＩＬ−δ（ＩＬ−１＿ｄｅｌｔａ；配列番号１０）、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号２）、ヒトＴａｎｇｏ−７７（Ｔａｎｇｏ−７７；配列番号１１）、ヒトＺｉｌｌａ４（Ｚｉｌｌａ４；配列番号１２）、ヒトＩＬ−１ζ（ＩＬ−１＿ｚｅｔａ；配列番号１３）、ヒトＩＬ−１レセプターアンタゴニストβ（ＩＬ−１ＲＡ＿ｂｅｔａ；配列番号１４）、ヒトＳＰＯＩＬ ＩＩ（ｓｐｏｉｌ＿ＩＩ；配列番号１５）、ヒトＩＬ−１ε（ＩＬ−１＿ｅｐｓｉｌｏｎ；配列番号１６）、およびヒトＩＬ−１η（ＩＬ−１＿ｅｔａ；配列番号１７）のアミノ酸アライメントを示す。
【図５】 図５は、ＩＬ−ｒａ遺伝子ファミリーの系統学的相関を図で示す。
【図６】 図６は、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（Ｍａｔｕｒｅ ＣＳ３２９）と、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの配列改変体（Ｍａｔｕｒｅ ＣＳ３２９改変体タンパク質）と、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドのスプライス改変体（Ｏｍｅｇａ ３２９タンパク質）との間の相関を図で示す。
【図７】 図７は、マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３５）およびマウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
【図８】 図８は、ヒトＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ｈｕＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号２）と、マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒポリペプチド（ｍｕＩＬ−１ｒａ−Ｒ；配列番号３６）とのアミノ酸配列アライメントを示す。
【図９】 図９Ａ−９Ｉは、マウスＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子（配列番号３７）についてのゲノムヌクレオチド配列を示す。エキソン１−４のコード部分の位置を示す（下線）。
【図１０】 図１０Ａ−１０Ｃは、ノーザンブロット分析により検出される、マウス（図１０Ａ）およびヒト（図１０Ｂ−１０Ｃ）のＩＬ−１ｒａ−Ｒ ｍＲＮＡ発現を示す。
【図１１】 図１１Ａ〜１１Ｂは、抗ＩＬ−１ｒａ−Ｒ抗体を用いるウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１２】 図１２は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子を含むレトロウイルスベクターを用いて形質導入したマウス骨髄細胞を移植した、致死照射したレシピエントマウスから回収した脾細胞および骨髄細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。リンパ球の画分中の細胞の割合を、示された細胞表面マーカーを用いる標準的ＦＡＣＳ分析に供した細胞について示す。
【図１３Ａ】 図１３Ａは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子を含むレトロウィルスベクターを用いて形質導入したマウス骨髄細胞を移植した、致死照射したレシピエントマウスから回収した脾細胞および骨髄細胞で行われたコロニーアッセイの結果を示す。形質導入マウスおよびコントロールマウス由来の骨髄細胞および脾細胞を、標準的コロニーアッセイ条件下で培養し、そしてコロニーを１４日目に計数した。
【図１３Ｂ】 図１３Ｂは、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子を含むレトロウィルスベクターを用いて形質導入したマウス骨髄細胞を移植した、致死照射したレシピエントマウスから回収した脾細胞および骨髄細胞で行われたコロニーアッセイの結果を示す。形質導入マウスおよびコントロールマウス由来の骨髄細胞および脾細胞を、標準的コロニーアッセイ条件下で培養し、そしてコロニーを１４日目に計数した。
【図１４】 図１４は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子を含むレトロウィルスベクターを用いて形質導入したマウス骨髄細胞を移植した、致死照射したレシピエントマウスから回収した脾細胞におけるＩＬ−１２処置に対する応答としてのγ−インターフェロンの産生を示す。馴化培地のサンプルを、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間増殖させた培地（２×１０^６細胞／ウェル／ｍｌ）から取り出し、そしてＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより定量した。
【図１５】 図１５は、ＩＬ−１ｒａ−Ｒ遺伝子を含むレトロウィルスベクターを用いて形質導入したマウス骨髄細胞を移植した、致死照射したレシピエントマウスから回収した脾細胞におけるＩＬ−１２およびＩＬ−１８処置に対する応答としてのγ−インターフェロンの産生を示す。馴化培地のサンプルを、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間増殖させた培地（２×１０^６細胞／ウェル／ｍｌ）から取り出し、そしてＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより定量した。
【配列表】

[0001]
(Field of Invention)
The present invention relates to novel interleukin-1 receptor antagonist-related (IL-1ra-R) polypeptides and nucleic acid molecules encoding the same. The invention also relates to selective binding agents, vectors, host cells and methods for producing IL-1ra-R polypeptides. The invention further relates to pharmaceutical compositions and methods for the diagnosis, treatment, amelioration, and / or prevention of diseases, disorders, and conditions associated with IL-1ra-R polypeptides.
[0002]
(Background of the Invention)
Technological advances in the identification, cloning, expression, and manipulation of nucleic acid molecules and the decoding of the human genome have greatly accelerated the discovery of new therapeutic factors. Currently, fast nucleic acid sequencing technology can generate sequence information at an unprecedented rate and can be combined with computer analysis to enable collection of overlapping sequences and part of the entire genome as well as polypeptide coding regions To. Comparison of the deduced amino acid sequence to a database compilation of known amino acid sequences allows to determine the degree of homology to previously identified sequence and / or structural landmarks. Cloning and expression of the polypeptide coding region of a nucleic acid molecule provides a polypeptide product for structural and functional analysis. Manipulation of the nucleic acid molecule and encoded polypeptide can confer advantageous properties on the product for use as a therapeutic agent.
[0003]
Despite significant technological advances in genome research over the past decade, the potential for the development of new therapeutic agents based on the human genome is not yet widely understood. A number of genes that encode potentially advantageous polypeptide therapeutics or the polypeptides they encode (which may serve as “targets” to the therapeutic molecule) have not yet been identified.
[0004]
Accordingly, it is an object of the present invention to identify novel polypeptides and nucleic acid molecules encoding them that have diagnostic or therapeutic advantages.
[0005]
One of the most potent inflammatory cytokines discovered to date is interleukin-1 (IL-1). IL-1 is believed to be involved in many diseases and medical conditions. IL-1 is produced (but not exclusively) by cells of the macrophage / monocyte lineage and produced in two forms: IL-1 alpha (IL-1α) and IL-1 beta (IL-1β) Can be done. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) is a human protein that acts as a natural inhibitor of interleukin-1.
[0006]
(Summary of the Invention)
The present invention relates to novel IL-1ra-R nucleic acid molecules and encoded polypeptides.
[0007]
The present invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising:
(A) a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35;
(B) the nucleotide sequence of the DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423;
(C) a nucleotide sequence encoding the polypeptide represented by any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(D) a nucleotide sequence that hybridizes to the complement of any of (a)-(c) under moderately or highly stringent conditions; and
(E) a nucleotide sequence complementary to any of (a) to (c),
An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
[0008]
The present invention also provides an isolated nucleic acid molecule comprising:
(A) a nucleotide sequence encoding a polypeptide that is at least about 70% identical to the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, wherein: The encoded polypeptide has a nucleotide sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(B) the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35, the nucleotide sequence of the DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423, or the allele of (a) A nucleotide sequence encoding a variant or splice variant;
(C) the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35, encoding a polypeptide fragment of at least about 25 amino acid residues, DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423 , (A) or (b), wherein the polypeptide fragment is a polypeptide encoded by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 A region that has the activity of or is antigenic;
(D) the nucleotide sequence of any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35, comprising a fragment of at least about 16 nucleotides, a DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423, or (a) ~ (C) any region;
(E) a nucleotide sequence that hybridizes under moderate or highly stringent conditions to the complement of any of (a)-(d); and
(F) a nucleotide sequence complementary to any of (a) to (d),
An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
[0009]
The present invention further provides an isolated nucleic acid molecule comprising:
(A) a nucleotide sequence encoding a polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one conservative amino acid substitution, wherein said code A nucleotide sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(B) a nucleotide sequence encoding a polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one amino acid insertion, wherein A polypeptide is a nucleotide sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(C) a nucleotide sequence encoding a polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one amino acid deletion, wherein: A nucleotide sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(D) a nucleotide sequence encoding a polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having a C-terminal truncation and / or an N-terminal truncation, wherein: The encoded polypeptide has a nucleotide sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(E) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one modification selected from the group consisting of amino acid substitution, amino acid insertion, amino acid deletion, C-terminal truncation, and N-terminal truncation Wherein the encoded polypeptide is represented by any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. A nucleotide sequence having the activity of a polypeptide;
(F) the nucleotide sequence of any of (a)-(e) comprising a fragment of at least about 16 nucleotides;
(G) a nucleotide sequence that hybridizes under moderate or highly stringent conditions to the complement of any of (a)-(f); and
(H) a nucleotide sequence complementary to any of (a) to (e),
An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
[0010]
The present invention provides an isolated polypeptide comprising the following:
(A) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36; and
(B) the amino acid sequence encoded by the DNA insert in ATCC accession number PTA-1423,
An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
[0011]
The present invention also provides an isolated polypeptide comprising the following:
(A) an amino acid sequence for an ortholog of any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(B) an amino acid sequence that is at least about 70% identical to any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, wherein the polypeptide is SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having the activity of the polypeptide shown in any one of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(C) a fragment of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, comprising at least about 25 amino acid residues, wherein the fragment is SEQ ID NO: 2, a fragment having the activity or antigenicity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36; and
(D) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, the amino acid sequence encoded by the DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423, (a), or The amino acid sequence of the allelic variant or splice variant of (b),
An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
[0012]
The present invention further provides an isolated polypeptide comprising the following:
(A) the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one conservative amino acid substitution, wherein the polypeptide is SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence having the activity of the polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(B) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one amino acid insertion, wherein the polypeptide comprises SEQ ID NO: 2, An amino acid sequence having the activity of the polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(C) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one amino acid deletion, wherein the polypeptide is SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having the activity of the polypeptide shown in any one of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(D) the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having a C-terminal truncation and / or an N-terminal truncation, wherein the polypeptide is An amino acid sequence having the activity of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36; and
(E) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having at least one modification selected from the group consisting of amino acid substitution, amino acid insertion, amino acid deletion, C-terminal truncation, and N-terminal truncation Wherein the polypeptide is an amino acid having the activity of the polypeptide shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Array,
An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
[0013]
The present invention still further provides an isolated polypeptide comprising the following:
Arginine at position 2; Alanine, lysine or arginine at position 3; Serine at position 7; Lysine at position 8; Alanine, cysteine, lysine, threonine, or serine at position 9; Cysteine or phenylalanine at position 10; Arginine at position 13 Or tryptophan; serine at position 15; arginine at position 18; serine or threonine at position 19; threonine at position 21; serine at position 23; arginine at position 34; tyrosine, serine or arginine at position 37; Arginine, threonine, or serine; threonine at position 41; serine, phenylalanine, or alanine at position 43; alanine at position 44; serine or lysine at position 48; alanine, threonine, or phenylalanine at position 52; serine at position 53; Serine at position; Nine or tyrosine; lysine at position 65; phenylalanine at position 66; tyrosine at position 67; serine, tyrosine or phenylalanine at position 69; lysine or serine at position 73; threonine or arginine at position 78; Alanine at position 91; serine at position 96; lysine or arginine at position 97; lysine or serine at position 98; alanine at position 100; tyrosine at position 102; arginine or alanine at position 104; Arginine at position 108; lysine, threonine, or tryptophan at position 109; threonine or serine at position 110; serine at position 111; serine at position 114; serine at position 116; phenylalanine, cysteine, or tyrosine at position 117; No Syn; 123, serine or alanine; 126, cysteine, serine, or threonine; 136, serine; 138, phenylalanine or arginine; 141, threonine, arginine, or alanine; 142, lysine or tyrosine; 143 Tryptophan or threonine of position 145; alanine at position 145; threonine or serine at position 147; cysteine at position 151; and serine, cysteine, or phenylalanine at position 152; An isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 3, wherein the polypeptide is a polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6. Peptide activity An isolated polypeptide having sex is provided.
[0014]
The present invention still further provides an isolated polypeptide comprising the following:
Arginine at position 21; Alanine, lysine or arginine at position 22; Serine at position 26; Lysine at position 27; Alanine, cysteine, lysine, threonine or serine at position 28; Cysteine or phenylalanine at position 29; Arginine at position 32 Or tryptophan; serine at position 34; arginine at position 37; serine or threonine at position 38; threonine at position 40; serine at position 42; arginine at position 53; tyrosine, serine or arginine at position 56; Arginine, threonine, or serine; threonine at position 60; serine, phenylalanine, or alanine at position 62; alanine at position 63; serine or lysine at position 67; alanine, threonine, or phenylalanine at position 71; Serine of position; Alanine or tyrosine at position 7; Lysine at position 84; Phenylalanine at position 85; Tyrosine at position 86; Serine, tyrosine or phenylalanine at position 88; Lysine or serine at position 92; Threonine or arginine at position 97; Or alanine; alanine at position 110; serine at position 115; lysine or arginine at position 116; lysine or serine at position 117; alanine at position 119; tyrosine at position 121; arginine or alanine at position 123; Threonine at position 127; Arginine at position 127; Lysine, threonine or tryptophan at position 128; Threonine or serine at position 129; Serine at position 130; Serine at position 133; Serine at position 135; Phenylalanine, cysteine at position 136 Syn; tyrosine at position 140; serine or alanine at position 142; cysteine, serine or threonine at position 145; serine at position 155; phenylalanine or arginine at position 157; threonine, arginine or alanine at position 160; lysine at position 161 Or at least one amino acid substitution selected from the group consisting of tryptophan or threonine at position 162; alanine at position 164; threonine or serine at position 166; cysteine at position 170; and serine, cysteine, or phenylalanine at position 171 An isolated polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, whereinthe aboveThe polypeptide provides an isolated polypeptide having the activity of the polypeptide set forth in either SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6.
[0015]
Also provided are fusion polypeptides comprising an IL-1ra-R amino acid sequence.
[0016]
The invention also includes an expression vector comprising an isolated nucleic acid molecule as set forth herein, a recombinant host cell comprising a recombinant nucleic acid molecule as set forth herein, and IL-1ra- A method of producing an R polypeptide is provided, the method comprising culturing the host cell, optionally isolating the polypeptide so produced.
[0017]
Also included in the present invention are transgenic non-human animals comprising nucleic acid molecules encoding IL-1ra-R polypeptides. An IL-1ra-R nucleic acid molecule is produced in a manner that allows for expression of IL-1ra-R polypeptide and increased levels of IL-1ra-R polypeptide, which may include increased circulating levels. Introduced in. Alternatively, the IL-1ra-R nucleic acid molecule is introduced into the animal in a manner that inhibits expression of the endogenous IL-1ra-R polypeptide (ie, a transgenic animal carrying an IL-1ra-R polypeptide gene knockout). ). The transgenic non-human animal is preferably a mammal, more preferably a rodent (eg, rat or mouse).
[0018]
Derivatives of the IL-1ra-R polypeptides of the present invention are also provided.
[0019]
Further provided are selective binding agents (eg, antibodies and peptides) that can specifically bind to the IL-1ra-R polypeptides of the invention. Such antibodies and peptides may be agonistic or antagonistic.
[0020]
Also encompassed by the invention are pharmaceutical compositions comprising a nucleotide, polypeptide, or selective binding agent of the invention and one or more pharmaceutically acceptable formulations. The pharmaceutical composition is used to provide a therapeutically effective amount of a nucleotide or polypeptide of the invention. The invention also relates to methods of using this polypeptide, nucleic acid molecule, and selective binding agent.
[0021]
The IL-1ra-R polypeptides and IL-1ra-R nucleic acid molecules of the invention are for treating, preventing, ameliorating, and / or detecting diseases and disorders, including those listed herein. Can be used.
[0022]
The invention also provides a method for assaying a test molecule to identify a test molecule that binds to an IL-1ra-R polypeptide. The method includes contacting the IL-1ra-R polypeptide with a test molecule to determine the extent of binding of the test molecule to the polypeptide. The method further includes determining whether such a test molecule is an agonist or antagonist of the IL-1ra-R polypeptide. The invention further provides a method of testing the effect of a molecule on IL-1ra-R polypeptide expression or IL-1ra-R polypeptide activity.
[0023]
Methods of modulating the expression of IL-1ra-R polypeptides and levels of IL-1ra-R polypeptidesAdjustSave(Ie increase the level or decrease the level)A method is also encompassed by the present invention. One method involves administering to the animal a nucleic acid molecule encoding an IL-1ra-R polypeptide. In another method, a nucleic acid molecule comprising an element that modulates or regulates expression of an IL-1ra-R polypeptide can be administered. Examples of these methods include gene therapy, cell therapy, and antisense therapy, as further described herein.
[0024]
In another aspect of the invention, an IL-1ra-R polypeptide can be used to identify its receptor (“IL-1ra-R polypeptide receptor”). Various forms of “expression cloning” have been used extensively to clone receptors for protein ligands. See, for example, Simonsen and Rodish, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15: 437-41 and Tartaglia et al., 1995, Cell 83: 1263-71. Isolation of IL-1ra-R polypeptide receptors is useful for the identification or development of novel agonists and antagonists of the IL-1ra-R polypeptide signaling pathway. Such agonists and antagonists include soluble IL-1ra-R polypeptide receptors, anti-IL-1ra-R polypeptide receptor-selective binding agents (eg, antibodiesandDerivatives thereof), small molecules, and antisense oligonucleotides, any of which are useful for the treatment of one or more diseases or disorders, including those disclosed herein. obtain.
[0025]
(Detailed description of the invention)
The section headings used herein are:ConfigurationIt is for purposes only and should not be construed as limiting the content described. In this applicationQuoteAll references made are expressly incorporated herein by reference.
[0026]
(Definition)
The term “IL-1ra-R gene” or “IL-1ra-R nucleic acid molecule” or “IL-1ra-R polynucleotide” means any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35. A nucleotide sequence encoding the polypeptide shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, a nucleotide sequence of a DNA insert at ATCC Accession No. PTA-1423, And a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic acid molecule as defined herein.
[0027]
The term “IL-1ra-R polypeptide allelic variant” refers to some of the possible naturally occurring genes of a gene occupying a given locus in the chromosome of an organism or population of organisms.AlternativeOne of the forms.
[0028]
The term “IL-1ra-R polypeptide splice variant” refers to an RNA transcript of the IL-1ra-R polypeptide amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Of intron sequences in the productSelectiveA nucleic acid molecule (usually RNA) produced by processing.
[0029]
The term “isolated nucleic acid molecule” refers to (1) at least about 50 of the proteins, lipids, carbohydrates, or other substances that are naturally found together when the total nucleic acid is isolated from a source cell. Nucleic acid molecules of the invention isolated from a percentageOr, (2) a nucleic acid molecule of the invention in which the “isolated nucleic acid molecule” is not linked to all or part of the naturally linked polynucleotide.Or(3) the nucleic acid molecule of the present invention operably linked to a polynucleotide that is not naturally linkedOr no(4) refers to a nucleic acid molecule of the invention that does not naturally exist as part of a larger polynucleotide sequence. Preferably, an isolated nucleic acid molecule of the invention is any other contaminating nucleic acid molecule, or other contaminant found in the natural environment (which may be used in polypeptide production or therapeutic use, diagnostic Use, preventive use, or research useDisturb) Is not substantially included.
[0030]
The term “nucleic acid sequence” or “nucleic acid molecule” refers to a DNA or RNA sequence. The term includes molecules formed from any of the known base analogs of DNA and RNA, such as, but not limited to: 4-acetylcytosine, 8-hydroxy-N6-methyladenosine, aziridinyl- Cytosine, pseudoisocytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, Inosine, N6-iso-pentenyladenine, 1-methyladenine, 1-methyl pseudouracil, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguani , 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methyl adenine, 7-methylguanine, 5-MeTylaminomethyluracil, 5-methoxyamino-methyl-2-thiouracil, β-D-mannosylcuocin, 5′-methoxycarbonyl-methyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil- 5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid, oxybutoxocin, pseudouracil, cuocin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, N- Uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid, pseudouracil, cuocin, 2-thiocytosine, and 2,6-diaminopurine.
[0031]
The term “vector” is used to refer to any molecule (eg, nucleic acid, plasmid, or virus) used to transfer coding information into a host cell.
[0032]
The term “expression vector” refers to a vector that is suitable for transformation of a host cell and contains nucleic acid sequences that direct and / or control the expression of inserted heterologous nucleic acid sequences. Expression includes, but is not limited to, processes such as transcription, translation, and RNA splicing (if an intron is present).
[0033]
The term “operably linked” is used herein to refer to the arrangement of flanking sequences, where the flanking sequences thus described carry out their normal functions.ArrangementOrAssembleIs done. Thus, flanking sequences operably linked to a coding sequence may be capable of replication, transcription and / or translation of the coding sequence. For example, a coding sequence is operably linked to a promoter if the promoter can direct transcription of the coding sequence.HaveThe The flanking sequence need not be contiguous with the coding sequence so long as it functions correctly. Thus, for example, interveningTotranslationNot yetTranscribedRuArrayBut, Between the promoter sequence and the coding sequence, and the promoter sequence may still be considered “operably linked” to the coding sequence.
[0034]
The term “host cell” is used to refer to a cell that has been transformed or can be transformed with a nucleic acid sequence and then expresses a selected gene of interest. This term includes the progeny of the parent cell, regardless of whether the progeny is identical to the original parent in morphology or genetic structure as long as the selected gene is present.
[0035]
The term “IL-1ra-R polypeptide” refers to a polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, and related polypeptides. Related polypeptides include IL-1ra-R polypeptide fragments, IL-1ra-R polypeptide orthologs, IL-1ra-R polypeptide variants, and IL-1ra-R polypeptide derivatives, which are It retains at least one activity of the polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. The IL-1ra-R polypeptides can be mature polypeptides as defined herein and may or may not have an amino terminal methionine residue, depending on the method by which they are prepared. Also good.
[0036]
The term “IL-1ra-R polypeptide fragment” refers to the amino terminus (having a leader sequence or having a leader sequence) of the polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Not) and / or polypeptide at the carboxy terminus. The term “IL-1ra-R polypeptide fragment” also refers to the amino and / or carboxy terminus of an IL-1ra-R polypeptide ortholog, IL-1ra-R polypeptide derivative, or IL-1ra-R polypeptide variant. Refers to shortening or shortening of the amino and / or carboxy terminus of a polypeptide encoded by an IL-1ra-R polypeptide allelic variant or IL-1ra-R polypeptide splice variant. IL-1ra-R polypeptide fragments can result from alternative RNA splicing or in vivo protease activity. Membrane-bound forms of IL-1ra-R polypeptides are also contemplated by the present invention. In preferred embodiments, the shortening and / or deletion comprises about 10 amino acids, or about 20 amino acids, or about 50 amino acids, or about 75 amino acids, or about 100 amino acids, or more than about 100 amino acids. The polypeptide fragment thus generated comprises about 25 consecutive amino acids, or about 50 amino acids, or about 75 amino acids, or about 100 amino acids, or about 125 amino acids. Such IL-1ra-R polypeptide fragments can optionally include an amino terminal methionine residue. It will be appreciated that such fragments can be used, for example, to generate antibodies to IL-1ra-R polypeptides.
[0037]
The term “IL-1ra-R polypeptide ortholog” refers to another IL-1ra-R polypeptide amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. A species-derived polypeptide. For example, mouse and human IL-1ra-R polypeptides are considered orthologous to each other.
[0038]
The term “IL-1ra-R polypeptide modification” refers to the IL-1ra-R polypeptide amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36.(With or without leader sequence)As compared to one or more amino acid sequence substitutions, deletions (eg, internal deletions and / or IL-1ra-R polypeptide fragments), and / or additions (eg, internal additions and / or IL-1ra). -R fusion polypeptide) -containing IL-1ra-R polypeptide. Variants may be naturally occurring (eg, IL-1ra-R polypeptide allelic variants, IL-1ra-R polypeptide orthologs, and IL-1ra-R polypeptide splice variants) or artificially Can be built. Such an IL-1ra-R polypeptide variant has a corresponding nucleic acid molecule having a DNA sequence that changes from the DNA sequence shown in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35. Can be prepared from In preferred embodiments, the variant is 1-3, or 1-5, or 1-10, or 1-15, or 1-20, or 1-25, or 1-50, or 1-75, or It has 1 to 100, or more than 100 amino acid substitutions, insertions, additions, and / or deletions, where the substitutions can be conservative or non-conservative, or any combination thereof.
[0039]
The term “IL-1ra-R polypeptide derivative”As defined herein,The polypeptide, IL-1ra-R polypeptide fragment, IL-1ra-R polypeptide ortholog, or IL-1ra-R poly shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 Peptide variants are referred to and these are chemically modified. The term “IL-1ra-R polypeptide derivative” is also defined herein.likeA polypeptide encoded by an IL-1ra-R polypeptide allelic variant or an IL-1ra-R polypeptide splice variant, which is chemically modified.
[0040]
The term “mature IL-1ra-R polypeptide” refers to an IL-1ra-R polypeptide lacking a leader sequence. Mature IL-1ra-R polypeptides also have other modifications (eg, amino terminal (with or without leader sequence) and / or carboxy terminal proteolytic processing, smaller poly from larger precursors. Peptide cleavage, N-linked and / or O-linked glycosylation, etc.).
[0041]
The term “IL-1ra-R fusion polypeptide”As defined herein,Polypeptide, IL-1ra-R polypeptide fragment, IL-1ra-R polypeptide ortholog, IL-1ra-R polypeptide shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 A variant, or fusion of one or more amino acids (eg, a heterologous protein or peptide) at the amino terminus or carboxy terminus of an IL-1ra-R derivative. The term “IL-1ra-R fusion polypeptide” is also defined herein.likeRefers to the fusion of one or more amino acids at the amino terminus or carboxyl terminus of a polypeptide encoded by an IL-1ra-R polypeptide allelic variant or an IL-1ra-R polypeptide splice variant.
[0042]
The term “biologically active IL-1ra-R polypeptide” refers to at least one of the polypeptides comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Refers to an IL-1ra-R polypeptide having active characteristics. Furthermore, an IL-1ra-R polypeptide can have immunogenic activity; that is, the IL-1ra-R polypeptide comprises at least one epitope against which antibodies can be raised.
[0043]
The term “isolated polypeptide” refers to (1) from at least about 50% of a polypeptide, lipid, carbohydrate, or other substance that is naturally found together when isolated from a source cell.MinIsolated polypeptide of the present invention, (2) all or part of the polypeptide to which the “isolated polypeptide” naturally links (by covalent or non-covalent interaction)Do not connectThe polypeptide of the present invention, (3) operatively (by covalent or non-covalent interaction) to a polypeptide that is not naturally linked.LinkingThe polypeptide of the present invention or (4) the polypeptide of the present invention that does not exist in nature. Preferably, the isolated polypeptide is any other contaminating polypeptide or other contaminant found in the natural environment (which may be its therapeutic use, diagnostic use, prophylactic use, or research (Interfering with use) is not substantially included.
[0044]
The term “identity” refers to the relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules as determined by sequence comparison, as is known in the art. In the art, “identity” also refers to two or more nucleotides or two or more amino acid sequences, as the case may be.StringNucleic acid molecules as determined by agreement betweenBetweenOr polypeptideofDenotes the degree of sequence relatedness between. “Identity” is the match between the smaller of two or more sequences and the gap alignment (if any) focused by a particular mathematical model or computer program (ie, “algorithm”) Evaluate the same percentage of
[0045]
the term"Similarity"Is related to the concept, but in contrast to" identity "Similarity"Refers to a measure of relevance that includes both identical and conservative substitution matches. If two polypeptide sequences have, for example, 10/20 identical amino acids and the rest are all non-conservative substitutions,Percent identityandSimilarityAre both 50%. In the same example, if there are 5 more positions that are conservative substitutions,Percent identityRemains 50%,Percent similarityIs 75% (15/20). Thus, when there is a conservative substitution, between two polypeptidesPercent similarityIs between these two polypeptidesPercent identityHigher than.
[0046]
The term “naturally occurring” or “native” is found in nature and manipulated by humans when used in connection with biological materials such as nucleic acid molecules, polypeptides, host cells, and the like. The material that is not. Similarly, “non-naturally occurring” or “non-native” as used herein refers to materials that are not found in nature or that have been structurally modified or synthesized by humans.
[0047]
The terms “effective amount” and “therapeutically effective amount” are each used to support an observable level of one or more biological activities of an IL-1ra-R polypeptide as set forth herein. The amount of IL-1ra-R polypeptide or IL-1ra-R nucleic acid molecule.
[0048]
The term “pharmaceutically acceptable carrier” or “physiologically acceptable carrier” as used herein refers to IL-1ra-R polypeptide, IL-1ra- One or more formulation materials suitable for achieving or enhancing R nucleic acid molecule, or IL-1ra-R selective binding agent delivery.
[0049]
The term “antigen” refers to a molecule or portion of a molecule that can be bound by a selective binding agent (eg, an antibody) and further used in an animal to produce an antibody that can bind to an epitope of that antigen. . An antigen can have one or more epitopes.
[0050]
The term “selective binding agent” refers to a molecule or molecules that have specificity for an IL-1ra-R polypeptide. As used herein, the terms “specific” and “specificity” refer to selective binding agents.But, Refers to the ability to bind to a human IL-1ra-R polypeptide and not to a non-human IL-1ra-R polypeptide. However, the selective binding agent may also be an ortholog of a polypeptide as described in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 (ie, an interspecies variant thereof (eg, mouse IL It is understood that it can bind to -1ra-R polypeptide and rat IL-1ra-R polypeptide)).
[0051]
The term “transduction”Using, Usually the transfer of genes from one bacterium to another by phage. “Transduction” also refers to the acquisition and transmission of eukaryotic cell sequences by retroviruses.
[0052]
The term “transfection” is used to refer to the uptake of heterologous or exogenous DNA by a cell, and a cell is “transfected” when the exogenous DNA is introduced into the cell membrane. Numerous transfection techniquesButAre well known in the art and disclosed herein. For example, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, 1989; Davis et al. See Gene 13: 197. Such techniques can be used to introduce one or more exogenous DNA moieties into suitable host cells.
[0053]
As used herein, the term “transformation” refers to a change in the genetic characteristics of a cell, and a cell has been transformed when it has been modified to contain new DNA. For example, a cell is transformed when it is genetically modified from its native state. Following transfection or transduction, can DNA transformation be recombined with the cell's DNA by physically integrating into the cell's chromosomes, or can be temporarily maintained as an episomal element without being replicated? Or replicate independently as a plasmidIsobtain. A cell is considered stably transformed when the DNA replicates with cell division.
[0054]
(Relevance of nucleic acid molecules and / or polypeptides)
Related nucleic acid molecules include allelic or splice variants of any of the nucleic acid molecules of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 35, and any of the above nucleotide sequences It is understood to encompass sequences that are complementary. Related nucleic acid molecules also have one or more amino acid residue substitutions, modifications, additions and / or deletions compared to the polypeptide in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36. A nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising or consisting essentially of is included. Such related IL-1ra-R polypeptides can include, for example, addition and / or deletion of one or more N-linked or O-linked glycosylation sites, or addition and / or one or more cysteine residues. It may contain deletions.
[0055]
Related nucleic acid molecules also include at least about 25 contiguous amino acids of the IL-1ra-R polypeptide of either SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36, or at least about 50 amino acids, Or a fragment of an IL-1ra-R nucleic acid molecule encoding a polypeptide of at least about 75 amino acids, or at least about 100 amino acids, or at least about 125 amino acids, or more than 125 amino acid residues. Includes.
[0056]
In addition, related IL-1ra-R nucleic acid molecules can also be SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 35 under moderately or highly stringent conditions as defined herein. Including a nucleotide sequence that hybridizes to a fully complementary sequence of a molecule encoding any of the IL-1ra-R nucleic acid molecules or polypeptides, wherein the polypeptide comprises SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36, or a nucleic acid fragment as defined herein or a nucleic acid fragment encoding a polypeptide as defined herein. Hybridization probes can be prepared by screening cDNA, genomic DNA libraries, or synthetic DNA libraries for related sequences using the IL-1ra-R sequences provided herein. Regions of the DNA and / or amino acid sequence of IL-1ra-R polypeptide that exhibit significant identity to known sequences can be easily obtained using a sequence alignment algorithm as described herein. These regions can be used to design probes for screening.
[0057]
The term “highly stringent conditions” refers to conditions designed to allow hybridization of DNA strands whose sequences are very complementary and to eliminate hybridization of significantly mismatched DNA. Hybridization stringency is primarily determined by temperature, ionic strength, and concentration of denaturing agents (eg, formamide). Examples of “highly stringent conditions” for hybridization and washing are 0.015 M sodium chloride at 65-68 ° C., 0.0015 M sodium citrate or 0.015 M sodium chloride at 42 ° C., 0.0015 M Sodium citrate and 50% formamide. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al., Nucleic Acid Hybrid.
[0058]
More stringent conditions (eg, higher temperature, lower ionic strength, higher formamide or other denaturing agents) can also be used, but the rate of hybridization will be affected. Other agents may be included in the hybridization and wash buffers for the purpose of reducing non-specific and / or background hybridization. Examples are 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinyl pyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, NaDodSO₄, (SDS), ficoll, Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (or another non-complementary DNA) andDextran sulfateHowever, other suitable agents can also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8-7.4; however, at typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is nearly independent of pH. See Anderson et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach Chapter 4 (IRL Press Limited).
[0059]
Factors affecting the stability of the DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by those skilled in the art to accommodate these variables and to allow different sequence related DNAs to form hybrids. The melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:
T_m(° C.) = 81.5 + 16.6 (log [Na +]) + 0.41 (G + C%) -600 / N-0.72 (% formamide)
Where N is the length of the duplex formed, [Na +] is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or wash solution, and G + C%Is the percentage of (guanine + cytosine) bases in the hybrid. For incompletely matched hybrids, the melting temperature is lowered by about 1 ° C. for every 1% mismatch.
[0060]
The term “moderately stringent conditions” refers to conditions under which DNA duplexes with a higher degree of base pair mismatch can be formed than can occur under “highly stringent conditions”. Examples of representative “moderately stringent conditions” are 0.015 M sodium chloride at 50-65 ° C., 0.0015 M sodium citrate or 0.015 M sodium chloride at 37-50 ° C., 0.0015 M Sodium citrate and 20% formamide. Illustratively, “moderately stringent conditions” of 50 ° C. in 0.015 M sodium ion allows for a mismatch of about 21%.
[0061]
It will be appreciated by those skilled in the art that there is no absolute distinction between “highly stringent conditions” and “moderately stringent conditions”. For example, with 0.015M sodium ion (no formamide), the melting temperature of a perfectly matched length of DNA is about 71 ° C. With cleaning at 65 ° C (with the same ionic strength),about6% mismatchButPossibleNaThe ThanDistantly relatedTo capture the sequence, one skilled in the art can simply lower the temperature or increase the ionic strength.
[0062]
1M NaCl for oligonucleotide probes up to about 20 nt^*A good assessment of the melting temperature in is given by:
Tm = 2 ° C per AT base pair + 4 ° C per GC base pair
^*The sodium ion concentration in 6 × salt sodium citrate (SSC) is 1M. See Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes 683 (Brown and Fox, 1981).
[0063]
High stringency wash conditions for an oligonucleotide are usually at a temperature between 0 ° C. and 5 ° C. below the Tm of that oligonucleotide in 6 × SSC, 0.1% SDS.
[0064]
In another embodiment, the related nucleic acid molecules have a nucleotide sequence that is at least about 70 percent identical to the nucleotide sequence as shown in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35. A nucleotide sequence encoding or comprising a polypeptide that is at least about 70 percent identical to a polypeptide as set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 Contains or essentially consists of this. In preferred embodiments, the nucleotide sequence is about 75 percent, or about 80 percent, or about 85 relative to the nucleotide sequence as shown in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35. Percent, or about 90 percent, or about 95, 96, 97, 98, or 99 percent identical, or the nucleotide sequence is shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36 Encodes a polypeptide that is about 75 percent, or about 80 percent, or about 85 percent, or about 90 percent, or about 95, 96, 97, 98, or 99 percent identical to the polypeptide sequence as described. A related nucleic acid molecule encodes a polypeptide that possesses at least one activity of the polypeptide set forth in either SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36.
[0065]
Differences in the nucleic acid sequence are conservative in the amino acid sequence compared to the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36.ModificationAnd / or can result in non-conservative modifications.
[0066]
Conservative modifications to the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 36 (and corresponding modifications to the encoding nucleotide) are functional features of the IL-1ra-R polypeptide and A polypeptide having functional and chemical characteristics similar to the chemical characteristics is produced. In contrast, substantial alterations in the functional and / or chemical characteristics of IL-1ra-R polypeptides differ significantly in their effects on maintaining: Can be achieved by selecting substitutions in the amino acid sequence of either number 6 or SEQ ID NO: 36:ConformationOr the structure of the molecular backbone in the substitution region, such as a helix conformation, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the bulk of the side chain.
[0067]
For example, a “conservative amino acid substitution” is almost identical to the polarity and charge of an amino acid residue at that position.There is no influenceOr no effect at all,Non-nativeSubstitution of native amino acid residues by residues may be included. Furthermore, any native residue in the polypeptide can also be replaced by alanine, as previously described for “alanine scanning mutagenesis”.
[0068]
Conservative amino acid substitutions also include non-naturally occurring amino acid residues that are typically incorporated by chemical peptide synthesis rather than by synthesis in biological systems. These include peptidomimetics and other inverted or inverted forms of amino acid moieties.
[0069]
Naturally occurring residues can be divided into multiple classes based on common side chain properties:
1) Hydrophobicity: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) Neutral hydrophilicity: Cys, Ser, Thr;
3) Acidity: Asp, Glu;
4) Basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Residues that affect chain orientation: Gly, Pro; and
6) Aromatic: Trp, Tyr, Phe.
[0070]
For example, non-conservative substitutions can include exchanging a member of one of these classes for a member from another class. Such substituted residues can be introduced into regions of the human IL-1ra-R polypeptide that are homologous with non-human IL-1ra-R polypeptides, or into the non-homologous regions of the molecule.
[0071]
In making such changes, the hydropathic index of amino acids can be considered. Each amino acid is hydrophobicCharacteristicAnd based on charge characteristics, a hydropathic index has been assigned. The hydropathy index is: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9). ); Alanine (+1.8); glycine (−0.4); threonine (−0.7); serine (−0.8); tryptophan (−0.9); tyrosine (−1.3); (-1.6); histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine ( -3.9); and arginine (-4.5).
[0072]
The importance of the hydropathic amino acid index in identifying interactive biological functions for proteins is generally understood in the art (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105. -31). Certain amino acids,Other amino acids with similar hydropathic indices or scoresReplace withIt is known that it can be and still maintain similar biological activity. In making changes based on the hydropathic index, substitution of amino acids whose hydropathic index is within ± 2 is preferred, those within ± 1 are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more particularly preferred .
[0073]
Similar amino acid substitutions can be made effectively on the basis of hydrophilicity (in particular, the biologically functionally equivalent protein or peptide produced thereby can be used in immunological embodiments as in this case. Is also understood in the art. The largest local average hydrophilicity of a protein correlates with its immunogenicity and antigenicity, ie the biological properties of the protein, as governed by the hydrophilicity of its neighboring amino acids.
[0074]
The following hydrophilicity values were assigned to these amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+ 3.0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1) Serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (−0.4); proline (−0.5 ± 1); alanine (−0. 5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8) Tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). When making changes based on similar hydrophilicity values, amino acid substitutions with hydrophilicity values within ± 2 are preferred, those within ± l are particularly preferred, and those within ± 0.5 are preferred Even more particularly preferred. From the primary amino acid sequence, epitopes can also be identified based on hydrophilicity. These regions are also referred to as “epitope core regions”.
[0075]
Desired amino acid substitutions (whether conservative or non-conservative) can be determined by those skilled in the art at the time such substitutions are desired. For example, amino acid substitutions can be used to identify important residues of an IL-1ra-R polypeptide, or increase or decrease the affinity of an IL-1ra-R polypeptide described herein Can be. Exemplary amino acid substitutions are listed in Table I.
[0076]
[Table 1]

One skilled in the art can determine an appropriate variant of the polypeptide set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 using well-known techniques. In order to identify appropriate regions of a molecule that can be altered without destroying biological activity, one skilled in the art can target regions that are not considered important for activity. For example, if a similar polypeptide with similar activity, either from the same species or from another species, is known, the skilled artisan will determine the amino acid sequence of the IL-1ra-R polypeptide as such Can be compared to the polypeptide. Such a comparison can be used to identify residues and portions of the molecule that are conserved among similar polypeptides. Changes in the region of the IL-1ra-R molecule that are not conserved relative to such similar polypeptides have a significant adverse effect on the biological activity and / or structure of the IL-1ra-R polypeptide. It is understood that this is not the case. Those skilled in the art also maintain chemically active amino acids, even in relatively conserved regionsShiYet naturally occurring residueson behalfIt is known that it can be substituted (conservative amino acid residue substitution). Thus, even regions that may be important for biological activity or structure can be subjected to conservative amino acid substitutions without destroying biological activity or adversely affecting the polypeptide structure. .
[0077]
In addition, one of ordinary skill in the art can review structure-function studies that identify residues in similar polypeptides that are important for activity or structure. In view of such comparisons, one can predict the importance of amino acid residues in IL-1ra-R polypeptides that correspond to amino acid residues important for activity or structure in similar polypeptides. Those skilled in the art will recognize such predicted important amino acid residues of IL-1ra-R polypeptides.Instead ofChemically similar amino acid substitutions can be selected.
[0078]
Those skilled in the art will also be familiar with similar polypeptides.ThreeDimensional structureAnd itsConstructionis connected withThe amino acid sequence can be analyzed. In view of such information, one skilled in the art can predict the alignment of amino acid residues of an IL-1ra-R polypeptide with respect to its three-dimensional structure. The person skilled in the artUpCan be selected so as not to cause abrupt changes to the amino acid residues predicted to be present. This is because such residues can be involved in important interactions with other molecules. In addition, one skilled in the art can generate test variants that include a single amino acid substitution at each amino acid residue. These variants can be screened using activity assays known to those skilled in the art. Such variants can be used to gather information about suitable variants. For example, changes to specific amino acid residues,DestructionActivity,UndesirableDecreaseActivityOrnot appropriateActivityThat causedIf they are found, variants with such changes are avoided. In other words, based on information gathered from such routine experimentation, one skilled in the art will recognize amino acids whose further substitutions should be avoided either alone or in combination with other mutations. Can be easily determined.
[0079]
A number of scientific publications have been devoted to the estimation of secondary structure. Mout, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 422-27; Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222-45; Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211-22; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Area Mol. Biol. 47: 45-48; Chou et al., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276; and Chou et al., 1979, Biophys. J. et al. 26: 367-84. In addition, computer programs are currently available to assist in the estimation of secondary structure. One method for estimating secondary structure is based on homology modeling. For example, having greater than 30% sequence identity or greater than 40% similarity,Two polypeptides or proteins often have similar structural topologies. Recent growth of the protein structure database (PDB) has been enhanced in secondary structure, including the number of possible folds in the structure of the polypeptide or proteinpredictionHave provided sex. Holm et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 244-47. There is a limited number of folds in a given polypeptide or protein, and oncecriticalNumber structure is solvedLightIn doing so, it has been suggested that structure predictions are dramatically more accurate (Brenner et al., 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 369-76).
[0080]
Further methods for estimating secondary structureAs“Threading” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-87; Shipl et al., 1996, Structure 4: 15-19), “Profile Analysis” (Bowie et al., 19991, Science, 253: 164-70; Gribskov et al., 1990, Methods Enzymol. 183: 146-59; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 4355-58), and “ Evolutionary linkage "(see Holm et al., Supra, and Brenner et al., Supra).Can be mentioned.
[0081]
Preferred IL-1ra-R polypeptide variants have a number and / or type of glycosylation sites compared to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Glycosylated variants that have been altered. In one embodiment, the IL-1ra-R polypeptide variant has a greater or lesser number of N than the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36.Combined typeContains a glycosylation site. NCombined typeThe glycosylation site is characterized by the sequence Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where the amino acid residue marked X can be any amino acid residue other than proline. Substitution of amino acid residues to create this sequence is NConjugated sugarProvides potential new sites for chain addition. Alternatively, substitutions that eliminate this sequence are NConjugated sugarRemove the strands. One or more N-linked glycosylation sites (typically naturally occurring glycosylation sites) have been eliminated and one or more new NJoinSite is created, NConjugated sugarStrand rearrangement is also provided. In further preferred IL-1ra-R variants, one or more cysteine residues are missing compared to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. Examples include cysteine variants that are missing or substituted with another amino acid (eg, serine). Cysteine variants are those where the IL-1ra-R polypeptide is biologically active, for example after isolation of insoluble inclusion bodies.To the three-dimensional structureUseful when it must be refolded. Cysteine variants generally have fewer cysteine residues than the native protein, and typically have the same number of cysteine residues, minimizing interactions resulting from unpaired cysteines.
[0082]
In another embodiment, related nucleic acid molecules have at least one amino acid insertion.AndThe polypeptide has the activity of the polypeptide of any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36TheWhether it contains a nucleotide sequence encoding the polypeptide of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36MockConsists of this sequence or has at least one amino acid deletionAndThe polypeptide is SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, orIsComprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide of any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having the activity of the polypeptide of any of SEQ ID NO: 36MaybeConsists of this array. Related nucleic acid molecules may also have a polypeptide having a carboxyl-terminal and / or amino-terminal truncation.AndMoreNikoWherein the polypeptide has the activity of the polypeptide set forth in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. A nucleotide sequence encoding the polypeptide according to any one of,IncludeBittenOr consist of this sequence. Related nucleic acid molecules also include amino acid substitutions, amino acid insertions, amino acid deletions, carboxyLeAt least one modification selected from the group consisting of a terminal truncation and an amino terminal truncation, and wherein the polypeptide is according to any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 A nucleotide sequence encoding the polypeptide of any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 having the activity of a polypeptide.,IncludeBittenOr consist of this sequence.
[0083]
Furthermore, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36'sA polypeptide comprising any amino acid sequenceOr other IL-1ra-R polypeptidesCan be fused to a homologous polypeptide to form a homodimer or can be fused to a heterologous polypeptide to form a heterodimer. Heterologous peptides and polypeptides include, but are not limited to: epitopes that allow detection and / or isolation of IL-1ra-R fusion polypeptides; transmembrane receptor proteins or portions thereof (eg, , Extracellular domains or transmembrane domains and intracellular domains); ligands or portions thereof that bind to transmembrane receptor proteins; catalytically active enzymes or portions thereof; polypeptides or peptides that promote oligomerization (eg, A leucine zipper domain); a polypeptide or peptide that increases stability (eg, an immunoglobulin constant region); and the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36 Polypeptide containingDoaOr have a different therapeutic activity than another IL-1ra-R polypeptide,Polypeptide.
[0084]
The fusion can be either the amino terminus or the carboxyl terminus of a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, or other IL1ra-R polypeptides. Can be made. The fusion may be direct without the use of a linker or adapter molecule, or via a linker or adapter molecule. The linker or adapter molecule can be one or more amino acid residues, typically from about 20 to about 50 amino acid residues. Has a cleavage site for DNA restriction endonuclease or proteaseLinker or adapter molecules thatDesigned to allow separation of fused parts. Once built, inviteTogetherIt is understood that the polypeptides can be derivatized according to the methods described herein.
[0085]
In a further embodiment of the invention, a polypeptide comprising an amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, or other IL-1ra-R polypeptide is a human IgG It fuses to one or more domains of the Fc region. The antibody comprises two functionally independent parts: a variable domain known as “Fab” that binds the antigen, and involved in effector functions such as complementary activation and attack by phagocytic cells. Constant domain known as "Fc". Fc has a long serum half-life, while Fab has a short life. Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31. When constructed with a therapeutic protein, the Fc domain may provide a longer half-life, or Fc receptor binding, protein A binding, complement binding, and possibly placental translocation.EnteringSuch functions can be incorporated. Ibid. Table II summarizes the use of certain Fc fusions known in the art.
[0086]
[Table 2]

In one example, the hinge region, CH2 region, and CH3 region of human IgG can be fused at either the amino or carboxyl terminus of the IL-1ra-R polypeptide using methods known to those skilled in the art. In another example, the hinge region, CH2 region, and CH3 region of human IgG are amino-terminal or carboxyl-terminal of an IL-1ra-R polypeptide fragment (eg, a putative extracellular portion of an IL-1ra-R polypeptide). In either case, it can be fused.
[0087]
The resulting IL-1ra-R fusion polypeptide can be purified by use of a protein A affinity column. Peptides and proteins fused to the Fc region were found to exhibit a substantially longer in vivo half-life than their unfused counterparts. Also, fusion to the Fc region allows for dimerization / multimerization of the fusion polypeptide. The Fc region can be a naturally occurring Fc region or can be altered to improve a particular quality such as therapeutic quality, circulation time, or reduced aggregation.
[0088]
The identity and similarity of related nucleic acid molecules and polypeptides can be readily calculated by known methods. Such methods include: Computational Molecular Biology (Edited by AM Rescue, Oxford University Press 1988); 1, AM Griffin and HG Griffin, Humana Press 1994); von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987); Sequence Analysis Primer (M. Gribskov and J. Develux eds. 198, M. StockJ. Applied Math. 48: 1073, but is not limited thereto.
[0089]
Preferred methods for determining identity and / or similarity are designed to give the greatest fit between the sequences tested. Methods for determining identity and similarity are described in publicly available computer programs. A preferred computer program method for determining identity and similarity between two sequences includes the GCG program package (GAP (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12: 387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Including, but not limited to, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (Altschul et al., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD); Altschul et al., 1990, supra). The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.
[0090]
A specific alignment scheme for aligning two amino acid sequences can result in a match of only a short region of these two sequences, and this small alignment region is even when there is no significant association between the two full-length sequences. May have very high sequence identity. Thus, in a preferred embodiment, the selected alignment method (GAP program) results in an alignment over at least 50 contiguous amino acids of the claimed polypeptide.
[0091]
For example, using the computer algorithm GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), two polypeptides whose percentage of sequence identity is to be determined are optimal matches of their respective amino acids (algorithm For the “fit span” determined by Gap opening penalty (which is calculated as 3 times the mean diagonal: “mean diagonal” is the mean of the diagonals of the comparison matrix used; The “corner” is the score or number assigned for each complete amino acid match by a particular comparison matrix) and the gap extension penalty (which is usually 0.1 times the cap opening penalty). A comparison matrix such as PAM 250 or BLOSUM 62 is used in combination with this algorithm. Standard comparison matrices are also used by this algorithm (Dayhoff et al., 5 Atlas of Protein Sequence and Structure (Appendix 3 1978) (PAM250 Comparison Matrix); Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89). : 10915-19 (see BLOSUM 62 comparison matrix).
[0092]
Preferred parameters for polypeptide sequence comparison include the following:
Algorithm: Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Mol. Biol. 48: 443-53;
Comparison matrix: BLOSUM 62 (Henikoff et al., Supra);
Gap Penalty: 12
Gap Length Penalty: 4
Threshold of Similarity: 0
This GAP program is useful with the above parameters. The above parameters are the default parameters for polypeptide comparisons (along with no penalty for end gaps) using the GAP algorithm.
[0093]
Preferred parameters for nucleic acid molecule sequence comparison include:
Algorithm: Needleman and Wunsch, supra;
Comparison matrix: matches = + 10, missmatch = 0
Gap Penalty: 50
Gap Length Penalty: 3
This GAP program is also useful with the above parameters. The above parameters are default parameters for nucleic acid molecule comparison.
[0094]
Other exemplary algorithms, such as gap opening penalty, compliance million, and others, including those described in Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. The particular choice to be made will be apparent to those skilled in the art and the particular comparison to be made (eg, DNA vs. DNA, protein vs. protein, protein vs. DNA); (In this case GAP or BestFit are generally preferred) or between one sequence and a large database sequence (in this case FASTA or BLASTA is preferred).
[0095]
(Nucleic acid molecule)
Nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of an IL-1ra-R polypeptide can be obtained in various ways (chemical synthesis, cDNA or genomic library screening, expression library screening, and / or PCR amplification of cDNA). But is not limited thereto).
[0096]
Recombinant DNA methods used herein are generally described by Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and / or Current Protocols in Molecular Bios And Wiley and Sons 1994). The present invention provides nucleic acid molecules as can be described herein, and methods for obtaining such molecules.
[0097]
When a gene encoding the amino acid sequence of IL-1ra-R polypeptide is identified from one species, a probe for identifying all or part of this gene, an ortholog from the same species or a related gene Can be used as This probe or primer can be used to screen cDNA from various tissue sources thought to express IL-1ra-R polypeptides. In addition, a portion of or all of the nucleic acid molecule having a sequence as set forth in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35 is used to screen a genomic library, and IL- A gene encoding the amino acid sequence of a 1ra-R polypeptide can be identified and isolated. Typically, moderate or high stringency conditions are used for screening to minimize the number of false positives resulting from this screening.
[0098]
Nucleic acid molecules encoding the amino acid sequence of IL-1ra-R polypeptide can also be identified by expression cloning using detection of positive clones based on the properties of the expressed protein. Typically, nucleic acid libraries are screened by binding antibodies or other binding partners (eg, receptors or ligands) to cloned proteins expressed and displayed on the host cell surface. The antibody or binding partner is modified with a detectable label to identify cells that express the desired clone.
[0099]
These polynucleotides can be produced and the encoded polypeptides can be expressed according to recombinant expression techniques performed according to the instructions set forth below. For example, by inserting a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of an IL-1ra-R polypeptide into an appropriate vector, one skilled in the art can readily generate large quantities of the desired nucleotide sequence. These sequences can then be used to generate detection probes or amplification primers. Alternatively, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of IL-1ra-R polypeptide can be inserted into an expression vector. By introducing the expression vector into a suitable host, the encoded IL-1ra-R polypeptide isProductionCan be done.
[0100]
Another method for obtaining a suitable nucleic acid sequence is the polymerase chain reaction (PCR). In this method, cDNA is prepared from poly (A) + RNA or total RNA using the enzyme reverse transcriptase. Two primers (typically complementary to two distinct regions of the cDNA encoding the amino acid sequence of the IL-1ra-R polypeptide) are then combined with a polymerase such as Taq polymerase in this cDNA. And the polymerase amplifies the region between the two primers of the cDNA.
[0101]
Another means of preparing nucleic acid molecules encoding the amino acid sequences of IL-1ra-R polypeptides is described in Engels et al., 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-34, chemical synthesis using methods well known to those skilled in the art. These methods include, among others, the phosphotriester, phosphoramidite, and H-phosphonate methods for nucleic acid synthesis. A preferred method for such chemical synthesis is a polymer-supported synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Typically, the DNA encoding the amino acid sequence of IL-1ra-R polypeptide is several hundred nucleotides long. Nucleic acids longer than about 100 nucleotides can be synthesized as several fragments using these methods. These fragments can then be ligated together to form the full length nucleotide sequence of the IL-1ra-R gene. Usually, the DNA fragment encoding the amino terminus of this polypeptide has an ATG, which encodes a methionine residue. This methionine may or may not exist in the mature form of the IL-1ra-R polypeptide, depending on whether the polypeptide produced in the host cell is designed to be secreted from that cell. Also good. Other methods known to those skilled in the art can be used as well.
[0102]
In certain embodiments, the nucleic acid variant comprises a codon that has been altered for optimal expression of the IL-1ra-R polypeptide in a given host cell. The particular codon change will depend on the host cell and IL-1ra-R polypeptide selected for expression. Such “codon optimization” can be performed by various methods (eg, by selecting preferred codons for use in genes that are highly expressed in a given host cell). A computer algorithm that incorporates a codon frequency table such as “Eco_high.Cod” for codon preference of highly expressed bacterial genes can be used, and the University of Wisconsin Package Version 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, WI). Other useful codon frequency tables include "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod", and .
[0103]
In some cases, it may be desirable to prepare nucleic acid molecules that encode IL-1ra-R polypeptide variants. Nucleic acid molecules encoding the variants can be generated using site-directed mutagenesis, PCR amplification, or other suitable method in which the primer has the desired point mutation (for a description of mutagenesis techniques, see Sambrook et al. , Supra, and Ausubel et al., Supra). Chemical synthesis using the method described by Engels et al., Supra, can also be used to prepare such variants. Other methods known to those skilled in the art can be used as well.
[0104]
(Vector and host cell)
A nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of an IL-1ra-R polypeptide is inserted into an appropriate expression vector using standard ligation techniques. The vector is typically selected to be functional in the particular host cell used (ie, the vector is compatible with the host cell machinery such that gene amplification and / or gene expression occurs). Is). A nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of an IL-1ra-R polypeptide can be amplified / expressed in prokaryotic host cells, yeast host cells, insect (baculovirus-based) host cells and / or eukaryotic host cells. The choice of host cell depends in part on whether the IL-1ra-R polypeptide is post-translationally modified (eg, glycosylated and / or phosphorylated). If so, yeast host cells, insect host cells, or mammalian host cells are preferred. For a review of expression vectors, see Meth. Enz. , Vol. 185 (D.V. Goeddel, ed., Academic Press 1990).
[0105]
Typically, expression vectors used in any host cell are for plasmid maintenance and for cloning and expression of foreign nucleotide sequences.ofContains an array. Such sequences (collectively referred to as “adjacent sequences”), in certain embodiments, typically comprise one or more of the following nucleotide sequences: promoter, one or more enhancer sequences, origin of replication. , Complete intron sequence including transcription termination sequence, donor and acceptor splice sites, sequence encoding leader sequence for polypeptide secretion, ribosome binding site, polyadenylation sequence, nucleic acid encoding expressed polypeptide A polylinker region for selection, as well as a selectable marker element. Each of these sequences is discussed below.
[0106]
Optionally, the vector can include a “tag” coding sequence (ie, an oligonucleotide molecule located at the 5 ′ or 3 ′ end of the IL-1ra-R polypeptide coding sequence); polyHis (eg, hexaHis),OrAnother “tag” (eg, FLAG, HA (hemagglutinin influenza virus))Ormyc (these includeThere are commercially available antibodies))Code. This tag is typically fused to the polypeptide upon expression of the polypeptide and can serve as a means for affinity purification of the IL-1ra-R polypeptide from the host cell. Affinity purification can be performed, for example, on the tag as an affinity matrix.DoIt can be achieved by column chromatography using antibodies. If necessary, the tag is subsequently removed from the purified IL-1ra-R polypeptide by various means such as using a specific peptidase for cleavage.GainThe
[0107]
The flanking sequences can be homologous (ie, from the same species and / or strain as the host cell) or heterologous (ie, host cell species orHost cellCan be from a species other than the strain), can be hybrid (ie, a combination of flanking sequences from more than one source), can be synthetic, or flanking sequences can be IL-1ra- It can be a native sequence that functions normally to regulate R polypeptide expression. Thus, the source of flanking sequences can be any prokaryotic or eukaryotic organism, any vertebrate or invertebrate organism, or any plant, provided that the flanking sequences are functional in the host cell machinery. And can be activated by host cell machinery.
[0108]
Flanking sequences useful for the vectors of the invention can be obtained by any of several methods well known in the art. Typically, flanking sequences useful herein, other than the IL-1ra-R gene flanking sequences, have been previously identified by mapping and / or restriction endonuclease digestion, and thus suitable restriction endonucleases Can be isolated from a suitable tissue source. In some cases, the full length nucleotide sequence of the flanking sequence may be known. Here, flanking sequences can be synthesized using the methods described herein for nucleic acid synthesis or cloning.
[0109]
If all or part of the flanking sequence is known, use PCR and / or screen genomic libraries with appropriate oligonucleotides and / or flanking sequence fragments from the same or another species By, The adjacent sequence isCan be obtained. If the flanking sequence is not known, a fragment of DNA containing the flanking sequence may be, for example, a size that may contain a coding sequence or another gene.DNAfragmentCan be isolated from Isolation may be restriction endonuclease digestion to produce the appropriate DNA fragment followed by isolation using agarose gel purification, Qiagen® column chromatography (Chatsworth, CA), or other known to those skilled in the art It can be achieved by the method. The selection of an appropriate enzyme to accomplish this purpose will be readily apparent to those skilled in the art.
[0110]
The origin of replication is typically part of a prokaryotic expression vector purchased commercially, and this origin serves for amplification of the vector in the host cell. Specific number of copiesToVector amplification may be important for optimal expression of IL-1ra-R polypeptide in some cases. If the selected vector does not contain an origin of replication site, it can be chemically synthesized based on known sequences and ligated into the vector. For example, the origin of replication from plasmid pBR322 (New England Biolabs, Beverly, Mass.) Is suitable for most gram-negative bacteria, and various origins (eg, SV40, polyoma, adenovirus, vesicular stomatitis virus (VSV). ) Or HPVOrPapillomaviruses such as BPV) in mammalian cellsCloning vectorUseful for. Generally, the origin of replication component is a mammalian expression vectorNot needed(For example, the SV40 origin is often used just because it contains the early promoter).
[0111]
A transcription termination sequence is typically located 3 'to the end of the polypeptide coding region and serves to terminate transcription. Usually, the transcription termination sequence in prokaryotic cells is a GC rich fragment followed by a poly-T sequence. This sequence can be easily cloned from a library or purchased commercially as part of a vector.But,this isAlsoCan be readily synthesized using methods for nucleic acid synthesis as described herein above.
[0112]
The selectable marker gene element encodes a protein necessary for the survival and growth of host cells grown in a selective culture medium. Representative selectable marker genes are (a) prokaryotesHostConfer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, tetracycline, or kanamycin;(B)Make up for deficiencies in auxotrophy of cells; or(C)It encodes a protein that supplies important nutrients that are not available from complex media. Preferred selectable markers are the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene, and the tetracycline resistance gene. A neomycin resistance gene can also be used for selection in prokaryotic and eukaryotic host cells.
[0113]
Other selection genes can be used to amplify the expressed gene. Amplification involves the production of proteins important for growth, whichChromosomalContinuous lifeWithinIt is a process that is repeated in tandem. Examples of suitable selectable markers for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase. Mammalian cell transformants are placed under selective pressure, where only transformants are uniquely adapted to survive with a selection gene present in the vector. Selection pressure is a level of transformed cells under conditions where the concentration of the selection factor in the medium changes continuously, thereby leading to amplification of both the selection gene and the DNA encoding IL-1ra-R polypeptide. Is imposed by culturing. As a result, increased amounts of IL-1ra-R polypeptide are synthesized from the amplified DNA.
[0114]
A ribosome binding site is usually required for translation initiation of mRNA, andShine DalgarnoSequence (prokaryotic) orKozakCharacterized by sequence (eukaryotes). This element is typically placed 3 'to the promoter of the expressed IL-1ra-R polypeptide and 5' to the coding sequence.Shine DalgarnoThe sequence is variable but is typically a polypurine (ie, high AG content). manyShine DalgarnoThe sequences have been identified and each is prokaryotic vector using the methods described herein.InIt can be easily synthesized using.
[0115]
A leader sequence, or signal sequence, can be used to direct the IL-1ra-R polypeptide from the host cell. Typically, the nucleotide sequence encoding the signal sequence is located in the coding region of the IL-1ra-R nucleic acid molecule or directly 5 'of the IL-1ra-R polypeptide coding region.TerminalLocated in. Many signal sequences have been identified and are functional in the selected host cellanySignal arrangementColumn, Can be used in combination with IL-1ra-R nucleic acid molecules. Thus, the signal sequence can be homologous (natural) or heterologous to the IL-1ra-R nucleic acid molecule. In addition, signal sequences can be chemically synthesized using the methods described herein. In most cases, the presence of a signal peptideThroughSecretion of the IL-1ra-R polypeptide from the host cell results in the removal of the signal peptide from the secreted IL-1ra-R polypeptide. The signal sequence can be a component of the vector or can be part of an IL-1ra-R nucleic acid molecule inserted into the vector.
[0116]
Nucleotide sequence encoding a native IL-1ra-R polypeptide signal sequence linked to an IL-1ra-R polypeptide coding region or a nucleotide sequence encoding a heterologous signal sequence linked to an IL-1ra-R polypeptide coding region Use of any of the sequences is within the scope of the inventioninclude. The selected heterologous signal sequence should be one that is recognized and processed (ie, cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native IL-1ra-R polypeptide signal sequence, the signal sequence is selected from, for example, the group of alkaline phosphatase, penicillinase, or heat stable enterotoxin II leader Replaced by sequence. For yeast secretion, the native IL-1ra-R polypeptide signal sequence can be replaced by a yeast invertase, alpha factor, or acid phosphatase leader. In mammalian cell expression, the native signal sequence issufficientHowever, other mammalian signal sequences may be suitable.
[0117]
Glycosylation is desirable in eukaryotic host cell expression systemslikeIn some cases, various to improve glycosylation or yieldPre-array(Presequence) can be manipulated. For example, the peptidase cleavage site of a particular signal peptide can be altered or pro-sequence(This can also affect glycosylation). The final protein product may have one or more additional amino acids associated with expression at position 1 (relative to the first amino acid of the mature protein), which may not be completely removed. For example, the final protein product can have one or two amino acid residues found at the peptidase cleavage site attached to the amino terminus. Alternatively, several enzyme cleavage sitesUse ofThe region where the enzyme is in the mature polypeptideTheCuttingYouA slightly shortened form of the desired IL-1ra-R polypeptide.
[0118]
In many cases, transcription of a nucleic acid molecule is increased by the presence of one or more introns in the vector; this is when the polypeptide is produced in a eukaryotic host cell (especially a mammalian host cell) This is especially true. The intron used can be naturally occurring within the IL-1ra-R gene, particularly when the gene used is a full-length genomic sequence or a fragment thereof. If the intron is not naturally present in the gene (for most cDNAs), the intron can be obtained from another source. The position of the intron with respect to the flanking sequences and the IL-1ra-R gene is generally important because the intron must be transcribed effectively. Thus, when the IL-1ra-R cDNA molecule is transcribed, the preferred position of the intron is 3 'to the transcription start site.And poly-A 5 'side of the transcription termination sequence. Preferably, the intron is one of the cDNAs so that it does not interfere with the coding sequence.SideOr otherside(That is, it is arranged on the 5 'side or 3' side). From any source (including viruses, prokaryotes and eukaryotes (plants or animals))anyAn intron can be used to carry out the invention provided that the intron is compatible with the host cell into which it is inserted. Synthetic intronsIn this specificationinclude. If desired, more than one intron can be used in the vector.
[0119]
The expression and cloning vectors of the present invention typically include a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to a molecule encoding an IL-1ra-R polypeptide. A promoter is a non-transcribed sequence that is located upstream (i.e., 5 ') with respect to the start codon of a structural gene (generally about 100 to 1000 bp) that controls transcription of the structural gene. Promoters are usually grouped into one of two classes (inducible promoters and constitutive promoters). Inducible promoters can be isolated from DNA under their control in response to some change in culture conditions (eg, the presence or absence of nutrients, or a change in temperature).IncreaseAdded levelTranscriptionTo start. On the other hand, constitutive promoters initiate the production of continuous gene products; that is, little or no control of genes for gene expression. A number of promoters (recognized by a variety of potential host cells) are well known. A suitable promoter is operably linked to the DNA encoding IL-1ra-R polypeptide by removing the promoter from the source DNA by restriction enzyme digestion and inserting the desired promoter sequence into the vector. A native IL-1ra-R promoter sequence can be used to direct the amplification and / or expression of an IL-1ra-R nucleic acid molecule. However, heterologous promoters are preferred if they allow higher production of large transcribed and expressed proteins compared to the native promoter and are compatible with the host cell system selected for use.
[0120]
ProkaryoticLivingSuitable promoters for use with physical hosts include β-lactamase and lactose promoter systems; alkaline phosphatase; tryptophan (trp) promoter system; and hybrid promoters (eg, tac promoter). Other known bacterial promoters are also suitable. These sequences have been published so that one skilled in the art can link them to the desired DNA using linkers or adapters required to provide any useful restriction sites. obtain.
[0121]
Suitable promoters for use with yeast hosts are also well known in the art. The yeast enhancerBothIs advantageously used. Suitable promoters for use with mammalian host cells are well known and include, but are not limited to, polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (eg, Adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus , Promoters derived from the genomes of viruses such as hepatitis B virus and most preferred simian virus 40 (SV40). Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters (eg, heat shock promoter and actin promoter).
[0122]
Additional promoters that may be of interest in controlling IL-1ra-R gene expression include, but are not limited to, the SV40 early promoter region (Bernoist and Chamber, 1981, Nature 290: 304-10); CMV Promoter; 3 'long of Rous sarcoma virusTerminalPromoters involved in the repeats (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97); herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1444-45); regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); prokaryotic expression vectors such as the β-lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad.Sci.U.S.A., 75: 3727-31); or tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80). 21-25). The following animal transcriptional control regions that exhibit tissue specificity and are utilized in transgenic animals are also of interest: elastase I gene control region active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38: Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); Region (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); an immunoglobulin gene control region active in lymphocytes (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44); in testis, breast, lymphocytes, and mast cells. Active mouseBreast cancerViral control region (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); albumin gene control region active in the liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76); active in the liver α-fetoprotein gene regulatory region (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); α1-antitrypsin active in the liver Gene regulatory region (Kelsey et al., 1987, Genes and Dev. 1: 161-71); β-globin gene regulatory region active in myeloid cells (Mogram et al., 1985, Na ure 315: 338-40; Kollias et al, 1986, Cell 46:. 89-94); active myelin in oligodendrocyte cells in the brainbasicProtein gene regulatory region (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12); Myosin light chain-2 gene regulatory region active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); and in the hypothalamus Active gonadotropin-releasing hormone gene regulatory region (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78).
[0123]
Enhancer sequences can be inserted into the vector so as to increase transcription of DNA encoding the IL-1ra-R polypeptide of the invention by higher eukaryotes. Enhancers are elements that act on the cis of DNA, usually about 10-300 bp in length, that act on promoters to increase transcription. Enhancer, relative directionIndependent and position-independent. These were found 5 'and 3' to the transcription unit. Several enhancer sequences available from mammalian genes are known (eg globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, virus-derived enhancers are used. The SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, polyoma enhancer, and adenovirus enhancer are exemplary enhancers for eukaryotic promoter activation. Enhancers can be spliced into the vector at the 5 'or 3' position relative to the IL-1ra-R nucleic acid molecule, but are typically placed 5 'to the promoter.
[0124]
The expression vectors of the present invention can be constructed from a starting vector such as a commercially available vector. Such vectors may or may not contain all desired flanking sequences. If one or more of the flanking sequences described herein are not already in the vector, these can be obtained individually and linked to the vector. The methods used to obtain each of the flanking sequences are well known to those skilled in the art.
[0125]
Preferred vectors for practicing the invention are vectors that are compatible with bacterial, insect, and mammalian host cells. Such vectors include, among others, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Pharmacia, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (PCT Publication No. WO 90/14363) and pFastBacDual (Gibco-BRL, Gland N It is done.
[0126]
Additional suitable vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids, or modified viruses, but it is understood that these vector systems must be compatible with the selected host cell. Such vectors include, but are not limited to, Bluescript® plasmid derivatives (high copy number ColEl-based phagemids, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA), PCR designed to clone Taq amplified PCR products. Cloning plasmids (eg TOPO^TM  TA Cloning® Kit, PCR2.1® plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, CA), and mammalian vectors such as baculovirus expression systems, yeast vectors or viral vectors (pBacPAK plasmid derivatives, Clontech, Palo Alto, CA)Plasmids likeIs mentioned.
[0127]
After the vector is constructed and the nucleic acid molecule encoding the IL-1ra-R polypeptide is inserted into the appropriate site of the vector, the complete vector is inserted into an appropriate host cell for amplified expression and / or polypeptide expression. obtain. Transformation of an expression vector for IL-1ra-R polypeptide into a selected host cell can be accomplished by transfection, infection, calcium chloride, electroporation, microinjection, lipofectin, DEAE-dextran method, or other known techniques. It can be achieved by a known method including a method such as The method chosen is partly a function of the type of host cell used. These and other suitable methods are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Supra.
[0128]
The host cell can be a prokaryotic host cell (eg, E. coli) or a eukaryotic host cell (eg, yeast cell, insect cell, or vertebrate cell). When the host cell is cultured under appropriate conditions, it synthesizes the IL-1ra-R polypeptide, which is subsequently collected from the culture medium (if the host cell secretes the polypeptide into the medium). Or is collected directly from the host cell producing the polypeptide (if the polypeptide is not secreted). The selection of the appropriate host cell can be achieved with a variety of expression levels, polypeptide modifications desirable or necessary for activity (eg, glycosylation or phosphorylation), and ease of folding into biologically active molecules. Depends on factors.
[0129]
Many suitable host cells are known in the art, and many are available from the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Examples include, but are not limited to, Chinese hamster ovary cells (CHO), CHO DHFR (−) cells (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. US. A. 97: 4216-20), human Examples include embryonic kidney (HEK) 293 or 293T cells, or mammalian cells such as 3T3 cells. Methods for selection and transformation, culture, amplification, screening, product production, and purification of suitable mammalian host cells are known in the art. Other suitable mammalian cell lines are the monkey COS-1 and COS-7 cell lines, and the CV-1 cell line. Further exemplary mammalian host cells include primate cell lines and rodent cell lines (including transformed cell lines). Normal diploid cells, cell strains derived from in vitro cultures of primary tissue, and primary explants are also suitable. Candidate cells may lack a selection gene, or may contain a selection gene that acts preferentially. Other suitable mammalian cell lines include, but are not limited to, mouse neuroblastoma N2A cells, HeLa, mouse L-929 cells, 3T3 lines derived from Swiss, Balb-c or NIH mice, BHK or Hak hamsters. Cell lines. Each of these cell lines is known and available by those skilled in the art of protein expression.
[0130]
Similarly, bacterial cells are useful as suitable host cells for the present invention. For example, E.I. Various strains of E. coli (eg, HB101, DH5α, DH10, and MC1061) are well known as host cells in the field of biotechnology. B. subtilis, Pseudomonas spp. , Other Bacillus spp. , Streptomyces spp. Various strains such as can also be used in the method.
[0131]
Many strains of yeast cells known to those skilled in the art are also available as host cells for expression of the polypeptides of the invention. Preferred yeast cells include, for example, Saccharomyces cervisaee and Pichia pastoris.
[0132]
Further, if desired, insect cell lines can be utilized in the methods of the invention. Such systems are described, for example, by Kitts et al. 1993, Biotechniques, 14: 810-17; Luclow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 564-72; and Luclow et al. 1993, J. et al. Virol. 67: 4566-79. Preferred insect cells are Sf-9 and Hi5 (Invitrogen).
[0133]
Transgenic animals can also be used to express glycosylated IL-1ra-R polypeptides. For example, transgenic milk-producing animals (eg, cows or goats) can be used to obtain the glucosylated polypeptides of the present invention in animal milk. Plants can also be used to produce IL-1ra-R polypeptides, however, in general, glycosylation that occurs in plants is different from that produced in mammalian cells, as human therapyApplicationCan result in glycosylation products that are not suitable for
[0134]
(Polypeptide production)
Host cells containing the IL-1ra-R polypeptide expression vector can be cultured using standard media well known to those of skill in the art. This medium usually contains all the nutrients necessary for cell growth and survival. E. Suitable media for culturing E. coli cells include, for example, Luria Broth (LB) and / or Territic Broth (TB). Suitable culture media for culturing eukaryotic cells include the Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI 1640), Minimal Essential Medium (MEM) and / or Dulbecco's Modified Eagle EM (DMDM). All can be supplemented with serum and / or growth factors as required for the particular cell line being cultured. A suitable medium for insect cells is Grace's medium supplemented with yeastate, lactalbumin hydrolyzate, and / or fetal calf serum as needed.
[0135]
Typically, constituents or other compounds useful for the selective growth of transfected or transformed cells are added to the medium as a supplement. The compound used can be detected by a selectable marker element present on the plasmid into which the host cell is transformed. For example, if the selectable marker element is kanamycin resistant, the compound added to the culture medium is kanamycin. Other compounds for selective growth include ampicillin, tetracycline, and neomycin.
[0136]
The amount of IL-1ra-R polypeptide produced by the host cell can be assessed using standard methods known in the art. Such methods include, but are not limited to, Western blot analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing gel electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC) separation, immunoprecipitation, and / or DNA binding gel migration assays. Such activity assays.
[0137]
If the IL-1ra-R polypeptide is designed to be secreted from the host cell, the majority of the polypeptide can be found in the cell culture medium. However, if the IL-1ra-R polypeptide is not secreted from the host cell, either in the cytoplasm and / or nucleus (for eukaryotic host cells) or in the cytosol (gramshadowPresent in the sex bacterial host cell).
[0138]
For IL-1ra-R polypeptides located in the host cytoplasm and / or nucleus (for eukaryotic host cells) or in the cytosol (for bacterial host cells), intracellular material (grams)shadow(Including inclusion bodies for sex bacteria) can be extracted from the host cells using any standard technique known to those skilled in the art. For example, host cells can be lysed to release periplasm / cytoplasmic content by French press, homogenization, and / or sonication followed by centrifugation.
[0139]
When the IL-1ra-R polypeptide forms inclusion bodies in the cytosol, the inclusion bodies can often be bound to the inner and / or outer cell membranes and are therefore mainly found in the pellet material after centrifugation. . The pellet material can then be treated at the pH limit, or at the alkaline pH in the presence of a reducing agent such as dithiothreitol, or at the acidic pH in the presence of triscarboxyethylphosphine, the surfactant, guanidine. Can be treated with chaotropic agents such as guanidine derivatives, urea, or urea derivatives to release, disrupt and dissolve the inclusion bodies. The lysed IL-1ra-R polypeptide can then be analyzed using gel electrophoresis, immunoprecipitation, and the like. If it is desired to isolate an IL-1ra-R polypeptide, isolation is described herein and in Marston et al. , 1990, Meth. Enz. 182: 264-75, and can be achieved using standard methods.
[0140]
In some cases, an IL-1ra-R polypeptide may not be biologically active upon isolation. Various methods for “refolding”, that is, converting the polypeptide to its tertiary structure and generating disulfide linkages can be used to replicate biological activity. Such methods involve exposing the dissolved polypeptide to a certain pH (usually above 7) and the presence of a specific concentration of chaotropic agent. The choice of chaotropic agent is very similar to the options used for inclusion body lysis, but usually the chaotropic agent is used at low concentrations and is not necessarily the same as the chaotropic agent used for lysis. In many cases, the refolding / oxidation solution also includes a reducing agent, or a specific ratio of reducing agent and its oxidized form, to produce a specific redox potential and result in the formation of cysteine bridges in the protein Enable. Some of the commonly used redox pairs include cysteine / cystamine, glutathione (GSH) / dithiobis GSH, copper (II) chloride, dithiothreitol (DTT) / dithian DTT, and 2,2-mercaptoethanol (bME). ) / Dithio-b (ME). In many cases, a co-solvent may be used or may be necessary to increase the efficiency of refolding, and more common reagents used for this purpose include glycerol, various molecular weights Examples include polyethylene glycol and arginine.
[0141]
If inclusion bodies are not formed to a significant extent in the expression of IL-1ra-R polypeptide, the polypeptide is found primarily in the supernatant after centrifugation of the cell homogenate. The polypeptide can be further isolated from the supernatant using methods as described herein.
[0142]
Purification of IL-1ra-R polypeptide from solution can be accomplished using a variety of techniques. The polypeptide is a tag such as hexahistidine (IL-1ra-R polypeptide / hexaHis) or other small peptide (eg FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) or myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) ) That carboxyLeWhen synthesized to contain at either the terminus or the amino terminus, the column matrix can be purified in one step by passing the solution through an affinity column with high affinity for the tag.
[0143]
For example, polyhistidine binds with great affinity and specificity for nickel. Thus, a nickel affinity column (eg, Qiagen® nickel column) can be used for the purification of IL-1ra-R polypeptide / polyHis. See, eg, Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et al., Eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1993).
[0144]
Furthermore, IL-1ra-R polypeptides can be purified through the use of monoclonal antibodies that can specifically recognize and bind to IL-1ra-R polypeptides.
[0145]
Other suitable means for purification include, but are not limited to affinity chromatography, immunoaffinity chromatography, ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, HPLC, electrophoresis (including native electrophoresis), Subsequent gel elution and preparative isoelectric focusing ("Isoprime" machine / technique, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). In some cases, two or more purification techniques can be combined to achieve increased purity.
[0146]
IL-1ra-R polypeptides are also described in Merrifield et al. , 1963, J. et al. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Houghten et al. , 1985, Proc Natl Acad. Sci. USA 82: 5132; and Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co. 1984), and prepared by chemical synthesis methods (eg, solid phase peptide synthesis) using techniques known in the art. Can be done. Such polypeptides can be synthesized with or without a methionine at the amino terminus. Chemically synthesized IL-1ra-R polypeptides are theseReferencesCan be oxidized using the method described in 1 to form disulfide bonds. A chemically synthesized IL-1ra-R polypeptide has biological activity comparable to the corresponding IL-1ra-R polypeptide, either recombinantly produced or purified from a natural source. It is expected, and can therefore be used interchangeably with recombinant or natural IL-1ra-R polypeptides.
[0147]
Another means of obtaining IL-1ra-R polypeptides is by purification from biological samples such as source tissues and / or fluids in which the IL-1ra-R polypeptide is naturally found. Such purification can be performed using methods for protein purification as described herein. During purification, the presence of IL-1ra-R polypeptide can be monitored, for example, using antibodies prepared against recombinantly produced IL-1ra-R polypeptide or peptide fragments thereof.
[0148]
Many additional methods for producing nucleic acids and polypeptides are known in the art and can be used to produce polypeptides having specificity for IL-1ra-R polypeptides. . For example, Roberts et al. , 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 12297-303. This describes the production of a fusion protein between the mRNA and its encoded peptide. Roberts, 1999, Curr. Opin. Chez. See also bol 3: 268-73. In addition, US Pat. No. 5,824,469 describes a method for obtaining oligonucleotides that can perform a specific biological function. This procedure involves generating a heterogeneous pool of oligonucleotides, each 5 'randomAnd a central pre-selected sequence and a 3 'randomized sequence. The resulting heterogeneous pool has the desired biologicalfunctionIntroduced into a population of cells that do not exhibit A subpopulation of cells is then screened for those exhibiting a predetermined biological function. From that subpopulation, oligonucleotides that can perform the desired biological function are isolated.
[0149]
U.S. Pat. Nos. 5,763,192; 5,814,476; 5,723,323; and 5,817,483 describe processes for producing peptides or polypeptides. Describe. This is accomplished by producing stochastic genes or fragments thereof and then introducing these genes into a host cell that produces one or more proteins encoded by the stochastic genes. The host is then screened to identify those clones that produce a peptide or polypeptide having the desired activity.
[0150]
Another method for producing peptides or polypeptides is described in Athersys, Inc. PCT / US98 / 20094 (WO 99/15650), filed by A., known as “Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery” (RAGE-GD), which process is described in-situ recombination method. By activation of endogenous gene expression or gene overexpression. For example, endogenous gene expression is activated or increased by incorporating regulatory sequences into target cells that can activate gene expression by non-homologous or aberrant recombination. This target DNA is first subjected to radiation and then a gene promoterButInserted. This promoter is in front of the geneForkTo begin transcription of the gene. This results from the expression of the desired peptide or polypeptide.
[0151]
These methods areAlsoCan be used to generate a comprehensive IL-1ra-R polypeptide expression library, which can be followed by various assays (eg, biochemical assays, cellular assays, etc.).TsuSei and whole organism assays (eg, plants, mice, etc.))HighCan be used for throughput phenotypic screeningBe understood.
[0152]
(Synthesis)
Nucleic acids and polypeptide molecules described hereinButIt will be appreciated by those skilled in the art that it can be produced by recombinant and other means.
[0153]
(Selective joinfactor)
The term “selective binding agent” refers to a molecule that has specificity for one or more IL-1ra-R polypeptides. Suitable selective binding agents include, but are not limited to, antibodies and derivatives thereof, polypeptides, and small molecules. Suitable selective binding agents can be prepared using methods known in the art. Exemplary IL-1RA-R polypeptide selective binding agents of the invention are capable of binding specific portions of an IL-1RA-R polypeptide, thereby allowing the polypeptide to become an IL-1ra-R polypeptide receptor. Inhibits binding.
[0154]
Selective binding agents such as antibodies and antibody fragments that bind to IL-1ra-R polypeptides are within the scope of the invention. This antibody may be polyclonal, including monospecific polyclonal; monoclonal (MAb); recombinant; chimeric; humanized (eg, CDR grafted); human; single chain;HeavySpecific; andThemFragment; variant; alsoInviteIt can be a conductor. Antibody fragments include antibodies that bind to an epitope on IL-1RA-R polypeptideOnePart. Examples of such fragments include Fab and F (ab ') fragments produced by enzymatic cleavage of full length antibodies. Other binding fragments include those produced by recombinant DNA technology (eg, expression of a recombinant plasmid containing a nucleic acid sequence encoding an antibody variable region).
[0155]
IL-1ra-R polypeptideAgainstPolyclonal antibodies are generally IL-1ra-Produced in animals (eg rabbits or mice) by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of R polypeptide and adjuvant. IL-1raIt may be useful to link the -R polypeptide to a carrier protein, which protein is immunized in the species to be immunized, such as keyhole limpet hemocyanin, serum, albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor. Primitive. Aggregating agents such as alum are also used to enhance the immune response. After immunization, the animal is bled and the serum isAntiIL-1ra-R antibodytiterAssay for.
[0156]
To IL-1ra-R polypeptideAgainstMonoclonal antibodies are produced using any method provided to produce antibody molecules by continuous cell lines in culture. Examples of suitable methods for preparing monoclonal antibodies include the hybridoma method of Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97, and the human B cell hybridoma method (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987)). Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies that react with IL-1ra-R polypeptides are also provided by the present invention.
[0157]
The monoclonal antibodies of the invention can be modified for use as therapeutic agents. One embodiment is a “chimeric” antibody, wherein a portion of the heavy chain (H) and / or light chain (L) is derived from a particular species, orAnotherThe rest of the chain is derived from another species, or is the specific antibody class or sub-class, while being identical or homologous to the corresponding sequence in the antibody belonging to that antibody class or subclass. It is identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to a subclass. These antibody fragments are also included so long as the antibody fragments exhibit the desired biological activity.U.S. Pat. No. 4,816,567;Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-55See
[0158]
In another embodiment, a monoclonal antibody of the invention is a “humanized” antibody. Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. See U.S. Pat. Nos. 5,585,089 and 5,693,762. Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced from a source that is non-human. Humanization uses, for example, the methods described in the art (Jones et al., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36). do it,RodentPerformed by replacing at least a portion of the complementary determining region (CDR) with the corresponding region of a human antibody.GainThe
[0159]
Human antibodies that bind to an IL-1ra-R polypeptide are also encompassed by the present invention. Using transgenic animals (eg, mice) that are capable of producing a repertoire of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin products, such antibodies can be expressed as IL-1ra-R polypeptide antigens ( Ie at least6 stationsContinuedDoWith amino acids) and, if necessary, coupled to a carrier. See, for example, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. 90: 2551-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. See 7:33. In one method, such a transgenic animal disables the endogenous loci encoding heavy and light chain immunoglobulins herein and converts human heavy and light chain proteins.The genetic locus to encodeProduced by inserting into its genome. Then a partially modified animal (this animal isNot completely complementaryBreakStrangeHave a desired immune system modificationStrangeallAnimals withTo getCrossIs done. When an immunogen is administered, these transgenic animals have a human (eg, not mouse) amino acid sequence that is immunospecific for these antigens.OKAntibody containing the variable region). See, for example, PCT application numbers PCT / US96 / 05929 and PCT / US93 / 06926. Further methods are described in US Pat. No. 5,545,807, PCT application numbers PCT / US91 / 245 and PCT / GB89 / 01207, and European Patents 546073B1 and 546073A1. Human antibodies can also be produced by expression of recombinant DNA in host cells or expression in hybridoma cells as described herein.
[0160]
In an alternative embodiment, human antibodies can also be produced from phage display libraries (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Bio.l. 227: 381; Marks et al., 1991, J. MoI. Mol. Biol. 222: 581). These allow the antibody repertoire on the surface of the filamentous bacteriophagePresentationMimic immune selection through and subsequent selection of phage by binding to the selected antigen. One such technique is described in PCT Application No. PCT / US98 / 17364, which uses such an approach for high affinity and functional for MPL- and msk-reporters. The isolation of antagonist antibodies is described.
[0161]
Chimeraantibody, CDR-grafted antibodies, and humanized antibodies are typically produced by recombinant methods. The nucleic acid encoding the antibody is introduced into a host cell and is described herein.materialAnd expressed using procedures. In preferred embodiments, the antibody is in a mammalian host cell (eg, a CHO cell).ProductionIs done. Monoclonal (eg, human) antibodies can be produced by expression of recombinant DNA in host cells or expression in hybridoma cells, as described herein.
[0162]
The anti-IL-1ra-R antibodies of the present invention may be any known assay method (eg, competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and for the detection and quantification of IL-1ra-R polypeptides, and Immunoprecipitation assay) (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)). This antibody binds to the IL-1ra-R polypeptide with an affinity that is appropriate for the assay method used.
[0163]
For diagnostic applications, in certain embodiments, the anti-IL-1ra-R antibody can be labeled with a detectable moiety. The detectable moiety can be any moiety that can produce a detectable signal, either directly or indirectly. For example, the detectable moiety can be a radioisotope (eg,³H,¹⁴C,³²P,³⁵S,¹²⁵I,⁹⁹Tc, ^{1 11}In, or⁶⁷Ga); fluorescent compound or chemical fluorescent compound (fluorescein isothiocyanate, rhodamine, or luciferin);Or an enzyme (alkaline phosphatase, β-galactosidase, orHorseradishPeroxidase) (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).
[0164]
Competitive binding assays are performed using labeled standardsmaterial(Eg, IL-1ra-R polypeptide, or immunologicallyreactionDepending on the ability of the sex moiety, it competes with the test sample analyte (IL-1ra-R peptide) for binding to a limited amount of anti-IL-1ra-R antibody. The amount of IL-1ra-R polypeptide in the test sample is determined by the standard that binds to the antibody.materialInversely proportional to the amount of. Standard to joinmaterialIn order to facilitate the determination of the amount ofInsolubleAndas a resultStandards that bind to this antibodymaterialAnd specimens remain unbound standardsmaterialAnd can be conveniently separated from the analyte.
[0165]
The sandwich assay uses two antibodiesTheTypicallyIncludingEach is determined and / or quantifiedRutaMay bind to different immune parts or epitopes of the protein. In a sandwich assay, the test sample analyte is placed on a solid support.FixedTypically bound by the first antibody to be bound, after which the second antibody is bound to this analyte,Therefore not goodA three-part composite of solution is formed. See, for example, US Pat. No. 4,376,110. The second antibody itself can be labeled with a detectable moiety (direct sandwich assay) or measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable moiety.(Indirect sandwich assay). For example, one type of sandwich assay is an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), where the detectable moiety is an enzyme.
[0166]
Selective binding agents, including anti-IL-1ra-R antibodies, are also useful for in vivo imaging. An antibody labeled with a detectable moiety can be administered to an animal, preferably in the bloodstream, and the presence and location of the labeled antibody in the host is assayed. The antibody can be labeled with any moiety that is detectable in an animal, either by nuclear magnetic resonance, radiology, or other detection means known in the art.
[0167]
The selective binding agents of the invention, including antibodies, can be used as therapeutic agents. These therapeutic agents are generally agonists or antagonists, which are, IOf L-1ra-R polypeptideAt least oneEither increases or decreases the biological activity, respectively. In one embodiment, an antagonist antibody of the invention can specifically bind to an IL-1ra-R polypeptide and can inhibit or eliminate the functional activity of an IL-1ra-R polypeptide in vivo or in vitro.AntiBody or a binding fragment thereof. In preferred embodiments, the selective binding agent (eg, antagonist antibody) is at least about 50%, and preferably at least about 80%.%,Inhibits the functional activity of the IL-1ra-R polypeptide. In another embodiment, the selective binding assay is an anti-IL-1ra-R polypeptide that can interact with an IL-1ra-R polypeptide binding partner (ligand or receptor).antibodyAndGainThis inhibits or eliminates IL-1ra-R polypeptide activity in vitro or in vivo. Selective binding agents, including agonist and antagonist antibodies-IL-1ra-R polypeptide antibodies, are identified by screening assays well known in the art.
[0168]
The present invention also includes kits containing IL-1ra-R selective binding agents (eg, antibodies) and other useful for detecting IL-1ra-R polypeptide levels in biological samples.reagentAbout. like thisreagentIs, InspectionAvailable signs,Blocking serum,Positive and negative control samples and detectionreagentCan be included.
[0169]
(Microarray)
DNA microarray technology can be utilized in accordance with the present invention.Be understood. A DNA microarray is a small, high-density array of nucleic acids placed on a solid support (eg, glass). Each cell or element in this array has a complementary nucleic acid sequence (For example,containing multiple copies of a single nucleic acid species that act as labels for hybridization to the mRNA. Expression profiles using DNA microarray technologyFilingMRNA in the cellsampleOr organizationsampleFromFirstExtracted and then convert enzyme-labeled cDNA to fluorescently labeled cDNAYouThe This material is hybridized to the microarray and unbound cDNA is removed by washing. The expression of the individual genes shown on this array is thentargetNucleic acid contentFor childIt is visualized by quantifying the amount of labeled cDNA that is specifically bound. In this method, the expression of thousands of genes is obtained from a single sample of biological material,HighIt can be quantified in a parallel manner of throughput.
[0170]
thisHighThroughput expression profileFilingHas a wide range of applications in relation to the IL-1ra-R molecules of the present invention, including but not limited to: IL-1ra-R disease as a target for therapy Identification and confirmation of related genes; molecular toxicity of related IL-1ra-R molecules and their inhibitors; alternative for clinical trialsmarkerPopulation and production stratification; andHighRelated IL-1ra-R polypeptide small molecule drugs by assisting in the identification of selected compounds in throughput screeningsearchStrengthening.
[0171]
(Chemical derivatives)
Chemically modified derivatives of IL-1ra-R polypeptides are described in this disclosure herein.WhenCan be prepared by one skilled in the art. IL-1ra-R polypeptide derivatives are modified in different ways, either in the type or position of the molecule that is naturally associated with the polypeptide. Derivatives can include molecules formed by the removal of one or more naturally bound chemical groups. A polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, or other IL-1ra-R polypeptides can be modified by covalent attachment of one or more polymers. . For example, the selected polymer is typically water soluble so that the bound protein does not precipitate in an aqueous environment (eg, a physiological environment). Mixtures of polymers are included within the scope of suitable polymers. Preferably,End productPreparation ofobjectFor therapeutic use, the polymer is pharmaceutically acceptable.
[0172]
Each of the polymers can have any molecular weight and can be branched or unbranched. Each of the polymers typically has an average molecular weight between about 2 kDa and about 100 kDa (this term “about” is used in the preparation of water soluble polymers)Some moleculesIndicating a slightly higher weight than the above molecular weight). The average molecular weight of each polymer is preferably between about 5 kDa and about 50 kDa, more preferably between about 12 kDa and about 40 kDa, and most preferably between about 20 kDa and about 35 kDa.
[0173]
Suitable water soluble polymers or mixtures thereof include, but are not limited to: N-linked or O-linked carbohydrates, sugars, phosphates, polyethylenes, glycols (PEG) (which are mono- (C₁-C₁₀), Alkoxy- or aryloxy-polyethylene glycol, including forms of PEG used to derive proteins), monomethoxy-polyethylene glycol, dextran (eg, low molecular weight (eg, about 6 kD dextran) ), Cellulose, or other carbohydrate-based polymers, poly- (N-vinylpyrrolidine) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropyleneoxyDo/ Ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol (eg glycerol), andPolyVinyl alcohol. Bifunctional cross-linking molecules that can be used to prepare covalently linked IL-1ra-R polypeptide multimers are also included in the present invention.
[0174]
In general, chemical inductionBodyCan be performed under any suitable conditions used to react proteins with activated polymer molecules. Methods for preparing chemical derivatives of a polypeptide include the following steps: (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, or other IL-1ra-R poly Reacting a polypeptide with an activated polymer molecule (eg, a reactive ester or aldehyde derivative of a polymer molecule) under conditions in which a polypeptide comprising any amino acid sequence of the peptide binds to one or more polymer molecules And (b) obtaining a reaction product. Optimal reaction conditions are determined based on known parameters and the desired result. For example, the greater the ratio of polymer molecules to protein, the greater the proportion of bound polymer molecules. In one embodiment, the IL-1ra-R polypeptide derivative has an amino-terminal single polymer molecular moiety. See, for example, US Pat. No. 5,234,784.
[0175]
The pegylation of a polypeptide can be specifically performed using any pegylation reaction known in the art. Such reactions are described, for example, in the following references: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; European Patent Nos. 0154316 and 0401384; and US Pat. No. 4,179, 337. For example, pegylation can be performed via an acylation reaction or an alkylation reaction with a reactive polyethylene glycol molecule (or a similar reactive water-soluble polymer) as described herein. For the acylation reaction, the selected polymer has a single reactive ester group. For reductive alkylation, the selected polymer has a single reactive aldehyde group. For example, reactive aldehydeIsPolyethylene glycol propionaldehyde, which is waterStabilityOr Mono C₁-C₁₀Alkoxy or its aryloxy derivatives (see US Pat. No. 5,252,714).
[0176]
In another embodiment, the IL-1ra-R polypeptide can be chemically linked to biotin. The biotin / IL-1ra-R polypeptide molecule can then be conjugated to avidin, resulting in a tetravalent avidin / biotin / IL-1ra-R polypeptide molecule. IL-1ra-R polypeptides may also be dinitrophenol (DNP) orbirdThe resulting conjugate can be covalently bound to nitrophenol (TNP), and precipitate with anti-DNP or anti-TNP-IgM to form a 10-valent decameric conjugate.
[0177]
In general, conditions that can be alleviated or modulated by administration of an IL-1ra-R polypeptide derivative of the invention include those described herein for IL-1ra-R polypeptides. However, the IL-1ra-R polypeptide derivatives disclosed herein may have additional activity, enhanced or decreased biological activity, or other properties (eg, increased or decreased) when compared to non-derivatized molecules. May have a reduced half-life).
[0178]
(Gene engineered non-human animal)
Also included within the scope of the present invention are non-human animals such as mice, rats, or other rodents; rabbits, goats, sheep, or other domestic animals, where natural IL-1ra-R poly The gene encoding the peptide is disrupted (ie, “knocked out”) and the expression level of the IL-1ra-R polypeptide is significantly reduced or completely destroyed. Such animals can be prepared using techniques and methods as described in US Pat. No. 5,557,032.
[0179]
The present invention further includes non-human animals such as mice, rats, or other rodents; rabbits, goats, sheep, or other domestic animals, wherein the native or non-natural form of the IL-1ra-R gene of this animal Any of the homologous IL-1ra-R genes are overexpressed by the animal, thereby creating a “transgenic” animal. Such transgenic animals can be prepared using well-known methods such as those described in US Pat. No. 5,489,743 and PCT Publication No. WO 94/28122.
[0180]
The invention further includes non-human animals, wherein the promoter of one or more IL-1ra-R polypeptides of the invention is activated (eg, by using homologous recombination methods). Or is not activated, altering the level of expression of one or more IL-1ra-R polypeptides.
[0181]
These non-human animals can be used for drug candidate screening. In such screening, the influence of drug candidates on animals can be measured. For example, the drug candidate may decrease or increase the expression of the IL-1ra-R gene. In certain embodiments, the amount of IL-1ra-R polypeptide produced can be measured after exposing an animal to a drug candidate. Further, in certain embodiments, the actual effects of drug candidates on animals can be detected. For example, overexpression of a particular gene results in or is associated with a disease state or pathological state. In such cases, the ability of drug candidates to reduce gene expression or the ability to prevent or inhibit pathological conditions can be tested. In another example, the production of a specific metabolite, such as a fragment of a polypeptide, results in or is associated with a disease state or pathological state. In such cases, the ability of drug candidates to reduce the production of such metabolites or the ability to prevent or inhibit pathological conditions may be tested.
[0182]
Assay for other modifiers of IL-1ra-R polypeptide activity
In some situations, it may be desirable to identify a molecule (eg, agonist or antagonist) that is a modulator of the activity of an IL-1ra-R polypeptide. Natural or synthetic molecules that modulate IL-1ra-R polypeptides can be identified using one or more screening assays, as described herein. Such molecules can be administered by injection, or oral delivery, implantation device, etc., either in an in vivo or in vitro manner.
[0183]
“Test molecule” refers to a molecule that evaluates its ability to modulate (ie, increase or decrease) the activity of an IL-1ra-R polypeptide. Most commonly, the test molecule interacts directly with the IL-1ra-R polypeptide. However, the test molecule can also undergo IL-1ra-, eg, by affecting IL-1ra-R gene expression or by binding to an IL-1ra-R polypeptide binding partner (eg, a receptor or ligand). R polypeptide activity can be directly modulated. In one embodiment, the test molecule is at least about 10^-6M, preferably about 10^-8M, more preferably about 10^-9M, and even more preferably about 10^-10It binds to IL-1ra-R polypeptide with an affinity constant of M.
[0184]
Methods for identifying compounds that interact with an IL-1ra-R polypeptide are encompassed by the present invention. In certain embodiments, the IL-1ra-R polypeptide is incubated with the test molecule under conditions that allow the test molecule to interact with the IL-1ra-R polypeptide, and the extent of the interaction is measured. The Test molecules can be screened in substantially purified form or in a crude mixture.
[0185]
In certain embodiments, the IL-1ra-R polypeptide agonist or antagonist is a protein, peptide, carbohydrate, lipid, orLowIt can be a molecular weight molecule, which interacts with the IL-1ra-R polypeptide and modulates its activity. A molecule that modulates expression of an IL-1ra-R polypeptide is complementary to a nucleic acid encoding an IL-1ra-R polypeptide, or a nucleic acid sequence that directs or controls expression of an IL-1ra-R polypeptide Nucleic acid molecules that are complementary to and nucleic acid molecules that act as antisense regulators of expression.
[0186]
Once a test compound is identified once it interacts with an IL-1ra-R polypeptide, the molecule can be further evaluated for the ability to increase or decrease IL-1ra-R polypeptide activity. Measurement of the interaction of a test molecule with an IL-1ra-R polypeptide can be performed in several forms, including cell-based binding assays, membrane binding assays, liquid phase assays, and immunoassays. It is done. In general, a test molecule is incubated with an IL-1ra-R polypeptide for a specified period of time, and IL-1ra-R polypeptide activity is determined by one or more assays to measure biological activity.
[0187]
The interaction of the test molecule with the IL-1ra-R polypeptide can also be assayed directly using polyclonal or monoclonal antibodies in an immunoassay. Alternatively, modified forms of IL-1ra-R polypeptide comprising an epitope tag as described herein can be used in solution and immunoassays.
[0188]
In the case where an IL-1ra-R polypeptide exhibits biological activity through interaction with a binding partner (eg, a receptor or ligand), various in vitro assays can be performed using the corresponding binding partner (selective binding agent). , Receptor, or ligand) can be used to measure binding of IL-1ra-R polypeptide. These assays can be used to screen test molecules to increase or decrease the rate and / or rate of binding of IL-1ra-R polypeptide to a binding partner. In one assay, IL-1ra-R polypeptide is present in the wells of a microtiter plate.Fixed toIs done. The radiolabeled IL-1ra-R polypeptide binding partner (eg, iodinated IL-1ra-R polypeptide binding partner) and the test compound are then placed in this well one at a time (in any order). Or they can be added simultaneously. Following incubation, the walls are washed and a scintillation counter is used to count the radioactivity to determine the extent to which the binding partner binds to the IL-1ra-R polypeptide. Typically, molecules are tested over a range of concentrations, and a series of control wells that lack one or more of the test assays can be used for accuracy of evaluation of results. An alternative to this method is reversing the process of reversing the protein “position” (ie, microtiter plate wells).InIL-1ra-R polypeptide binding partnerImmobilizationAnd incubating the test molecule and the radiolabeled IL-1ra-R polypeptide and determining the extent of IL-1ra-R polypeptide binding). See, eg, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 18 (Edited by Ausubel et al., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995).
[0189]
As an alternative to radioactive labeling, the IL-1ra-R polypeptide or its binding partner can be conjugated with biotin, and the presence of the biotinylated protein can then be determined by enzyme (eg, horseradish peroxidase (HRP) or alkaline). Phosphatase (AP))Result inDetected using combined streptavidinWhich can be detected colorimetrically orAlternatively, it can be detected by fluorescent tagging of streptavidin. Antibodies to IL-1ra-R polypeptides or IL-1ra-R polypeptide binding partners (which are conjugated to biotin) are also suitable for incubation of complexes with enzyme-linked streptavidin linked to AP or HRP. It can then be used for detection purposes.
[0190]
The IL-1ra-R polypeptide or IL-1ra-R polypeptide binding partner can be immobilized by attachment to agarose beads, acrylic beads, or other types of such inert solid phase substrates. The substrate-protein complex can be placed in a solution containing a complementary protein and a test compound. After incubation, these beads can be precipitated by centrifugation, and the amount of binding between the IL-1ra-R polypeptide and its binding partner is assessed using the methods described herein. obtain. Alternatively, the substrate-protein complex can be immobilized in the column using test molecules and complementary proteins that pass through the column. Complex formation between the IL-1ra-R polypeptide and its binding partner can then be assessed using any of the techniques described herein (eg, radiolabeling or antibody binding). .
[0191]
Another in vitro assay useful for identifying test molecules that increase or decrease the formation of complexes between an IL-1ra-R polypeptide binding protein and an IL-1ra-R polypeptide binding partner is surface plasmon resonance. A detector system (eg, BIAcore assay system (Pharmacia, Piscataway, NJ)). The BIAcore system is utilized as specified by the manufacturer. This assay essentially involves the sharing of either IL-1ra-R polypeptide or IL-1ra-R polypeptide binding partner to a dextran-coated sensor chip (which is present in the detector). Includes bonds. The test compound and other complementary proteins can then be injected into the chamber containing the sensor chip, either simultaneously or sequentially. The amount of complementary protein that binds can be assessed based on the change in mass of the molecule physically related to the dextran coat side of the sensor chip, which change in mass is measured by the detector system.
[0192]
In some cases, two or more test compounds together for their ability to increase or decrease the formation of a complex between an IL-1ra-R polypeptide and an IL-1ra-R polypeptide binding partner It may be desirable to evaluate. In these cases, the assays described herein can be readily modified by adding such additional test compounds either simultaneously with or following the first test compound. The remainder of the steps in this assay are described herein.
[0193]
In vitro assays (eg, those described herein) have identified a number of compounds for their effect on the formation of complexes between IL-1ra-R polypeptides and IL-1ra-R polypeptide binding partners. It can be advantageously used for screening. These assays can be automated to screen compounds generated in phage display, synthetic peptides, and chemical synthesis libraries.
[0194]
A compound that increases or decreases the formation of a complex between an IL-1ra-R polypeptide and an IL-1ra-R polypeptide binding partner may also be an IL-1ra-R polypeptide or an IL-1ra-R polypeptide Cells and cell lines expressing any of the binding partners F can be used to screen in cell culture. Cells and cell lines can be obtained from any mammal, but are preferably derived from humans or other primate, canine or rodent sources. The binding of the IL-1ra-R polypeptide to the cell expressing the IL-1ra-R polypeptide binding partner at its surface is assessed in the presence or absence of the test compound, and the extent of binding is determined by For example, it can be determined by flow cytometry using a biotinylated antibody against an IL-1ra-R polypeptide binding partner. Cell culture assays can be advantageously used to further characterize compounds that are scored positive in the protein binding assays described herein.
[0195]
Cell cultures can also be used to screen for the effects of drug candidates. For example, a drug candidate can decrease or increase the expression of the IL-1ra-R gene. In certain embodiments, the amount of IL-1ra-R polypeptide or IL-1ra-R polypeptide fragment produced can be measured after exposure of the cell culture to the drug candidate. In certain embodiments, substantial effects of drug candidates on cell culture can be detected. For example, overexpression of a particular gene can have a particular effect on cell culture. In such cases, the ability of a drug candidate to increase or decrease gene expression or its ability to prevent or inhibit a particular effect on cell culture can be tested. In other examples, the production of specific metabolites (such as fragments of a polypeptide, etc.) can cause or be associated with a disease or pathological condition. In such cases, the ability of drug candidates to reduce the production of such metabolites in cell culture can be tested.
[0196]
(Internalization protein)
The tat protein sequence (from HIV) can be used to internalize proteins into cells. For example, Falwell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 664-68. For example, the sequence of 11 amino acids of the HIV tat protein (YGRKRKKRKRQRR; SEQ ID NO: 18) (referred to as "protein transduction domain", or TAT PDT) Have been described as mediating delivery across the cytoplasmic and nuclear membranes of cells. Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72; and Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4: 1449-52. In these procedures, the FITC construct (FITC-labeled G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SEQ ID NO: 19) Penetrating the tissue following administration) is prepared, and the binding of such constructs to cells is detected by fluorescence cytometric separation (FACS) analysis. Cells treated with the tat-β-gal fusion protein show β-gal activity. Following injection, the expression of such constructs can be detected in many tissues (liver, kidney, lung, heart and brain tissue). It is believed that such constructs undergo some degree of denaturation to enter the cell and as such may require refolding following transfer into the cell.
[0197]
Thus, it is understood that the tat protein sequence can be used to internalize the desired polypeptide into the cell. For example, using a tat protein sequence, an IL-1ra-R antagonist (eg, an anti-IL-lra-R selective binding agent, a small molecule, a soluble receptor, or an antisense oligonucleotide) Can be administered intracellularly to inhibit the activity of As used herein, the term “IL-1ra-R molecule” refers herein toRegulationRefers to both IL-1ra-R nucleic acid molecules and IL-1ra-R polypeptides. If desired, the IL-1ra-R protein itself can also be internally administered to cells using these procedures. See also Strauss, 1999, Science 285: 1466-67.
[0198]
(Identification of cell sources using IL-1ra-R polypeptides)
In accordance with certain embodiments of the invention, it may be useful to be able to determine the source of a particular cell type associated with an IL-1ra-R polypeptide. For example, it may be useful to determine the origin of a disease or pathological condition as an aid in selecting an appropriate treatment. In particular embodiments, a nucleic acid encoding an IL-1ra-R polypeptide is used as a probe to screen a cell described herein by screening the nucleic acid of the cell using such a probe. Can be identified. In other embodiments, anti-IL-1ra-R polypeptide antibodies can be used to test for the presence of IL-1ra-R polypeptide in cells, and thus such cells are described herein. Can be determined.
[0199]
(IL-1ra-R polypeptide composition and administration)
Therapeutic compositions are within the scope of the present invention. Such an IL-1ra-R polypeptide pharmaceutical composition comprises a pharmaceutical agent selected so that a therapeutically effective amount of an IL-1ra-R polypeptide or IL-1ra-R nucleic acid molecule is compatible with the mode of administration. Or in a mixture with a physiologically acceptable prescription drug. A pharmaceutical composition comprises a therapeutically effective amount of one or more IL-1ra-R polypeptide selective binding agents and a pharmaceutically or physiologically acceptable prescription drug selected to be compatible with the mode of administration. In a mixture of
[0200]
Acceptable formulation materials are preferably non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used.
[0201]
The pharmaceutical composition modifies, maintains or permeates, for example, pH, osmotic pressure, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, sterility, stability, rate of dissociation or release, adsorption, or penetration of the composition. Formulation materials for storage may be included. Suitable formulation materials include, but are not limited to: amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine), antibacterial agents, antioxidants (eg, ascorbic acid, sodium sulfite, Or sodium hydrogen-sulfite), buffers (eg, borate, bicarbonate, Tris-HCl, citrate, phosphate, or other organic acids), bulking agents (eg, mannitol) Or glycine), chelating agents (ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)), complexing agents (eg caffeine, polyvinylpyrrolidone, β-cyclodextrin, or hydroxypropyl-β-cyclodextrin), fillers, monosaccharides, two Sugars, and other carbohydrates ( For example, glucose, mannose or dextrin), protein (eg, serum albumin, gelatin, or immunoglobulin), colorant, flavoring and diluent, emulsifier, hydrophilic polymer (eg, polyvinylpyrrolidone), low molecular weight polypeptide, salt Forming counterion (eg sodium), preservative (eg benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide), solvent (eg glycerin) , Propylene glycol, or polyethylene glycol), sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol), suspending agents, surfactants or wetting agents (eg, pulling)BPEG; sorbitan ester; polysorbate (eg, polysorbate 20 or polysorbate 80); triton; tromethamine; lecithin; cholesterol or tyloxapol), stability enhancer (eg, sucrose or sorbitol), tonicity Degree enhancing agents (eg, alkali metal halides (preferably sodium chloride or potassium chloride), or mannitol, sorbitol), delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants. See Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990).
[0202]
The optimal pharmaceutical composition will be determined by one skilled in the art depending upon, for example, the intended route of administration, delivery format and desired dosage. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Such compositions can affect the physical state, stability, rate of in vivo release, and rate of in vivo clearance of the IL-1ra-R molecule.
[0203]
The primary vehicle or carrier in a pharmaceutical composition can be either aqueous or non-aqueous in nature. For example, a suitable vehicle or carrier for infusion is water, physiological saline solution, or artificial cerebrospinal fluid, presumably common in compositions for parenteral administrationotherRefilled with materials. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin is a further exemplary vehicle. Other exemplary pharmaceutical compositions include Tris buffer at about pH 7.0-8.5 or acetate buffer at about pH 4.0-5.5, which further includes sorbitol or suitable substitutes. Can be included. In one embodiment of the invention, the IL-1ra-R polypeptide composition mixes a selected composition having the desired degree of purity with any prescription drug (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). Can be prepared for storage in the form of a lyophilized cake or an aqueous solution. In addition, the IL-1ra-R polypeptide product can be formulated as a lyophilizate using appropriate excipients such as sucrose.
[0204]
The IL-1ra-R polypeptide pharmaceutical composition may be selected for parenteral delivery. Alternatively, these compositions can be selected for delivery via inhalation or gastrointestinal tract (eg, orally). The preparation of such pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of the art.
[0205]
The formulation ingredients are present in concentrations acceptable at the site of administration. For example, a buffer is used to maintain the composition at a physiological pH or somewhat lower pH (typically within a pH range of about 5 to about 8).
[0206]
When intended for parenteral administration, a therapeutic composition for use in the present invention comprises a pyrogen-free parenterally containing the desired IL-1ra-R molecule in a pharmaceutically acceptable vehicle. It can be in the form of a possible aqueous solution. A particularly suitable vehicle for parenteral injection is sterile distilled water, where the IL-1ra-R molecule is formulated as a sterile, isotonic solution and stored appropriately. Yet another preparation involves formulating a desired molecule with a drug (eg, injectable microspheres, bio-erodible drugs, polymer compounds (polylactic acid or polyglycolic acid), beads or liposomes). This provides a controlled or sustained release of the product that can then be delivered via cumulative injectionCan. Hyaluronic acid can also be used and this can have the effect of promoting a sustained duration in the circulation. Other suitable means for introduction of the desired molecule include implantable drug delivery devices.
[0207]
In one embodiment, the pharmaceutical composition can be formulated for inhalation. For example, the IL-1ra-R polypeptide can be formulated as a dry powder for inhalation. An inhalation solution of an IL-1ra-R polypeptide or nucleic acid molecule can also be formulated with a nebulizer for aerosol delivery. In yet another embodiment, the solution can be nebulized. Pulmonary administration is further described in PCT Publication No. WO94 / 20069, which describes pulmonary delivery of chemically modified proteins.
[0208]
It is also contemplated that certain formulations can be administered orally. In one embodiment of the invention, the IL-1ra-R polypeptide administered in this manner is accompanied by a carrier conventionally used in the preparation of solid dosage forms (eg tablets or capsules), or Can be prescribed without it. For example, capsules can be used when the bioavailability is maximized and pre-systemic degradation is minimized.At the innerIt can be designed to release the active part of the formulation. Additional agents are included to facilitate absorption of the IL-1ra-R polypeptide.GainThe Diluents, flavorings, low melting point waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, tablet disintegrating agents, and binders may also be used.
[0209]
Another pharmaceutical composition may contain an effective amount of IL-1ra-R polypeptide in a mixture with non-toxic excipients that are suitable for the manufacture of tablets. Solutions can be prepared in unit dosage form by dissolving the tablets in sterile water or another suitable vehicle. Suitable excipients include, but are not limited to: an inert diluent (calcium carbonate, sodium carbonate or sodium bicarbonate, lactose or calcium phosphate); or a binder (eg starch, gelatin or gum arabic) Or a lubricant (eg, magnesium stearate, stearic acid or talc).
[0210]
Additional IL-1ra-R polypeptide pharmaceutical compositions will be apparent to those of skill in the art and include formulations comprising IL-1ra-R polypeptide in sustained or controlled delivery formulations. Techniques for formulating various other sustained or controlled delivery means such as liposome carriers, bioerodible microspheres or porous beads and accumulating injections are also known to those skilled in the art. See, for example, PCT / US93 / 00829, which describes controlled release of porous polymeric microparticles for delivery of pharmaceutical compositions.
[0211]
Further examples of sustained release preparations include semipermeable polymer matrices in the form of molded articles (eg, films or microcapsules). Sustained release matrices include polyesters, hydrogels, polylactides (US Pat. No. 3,773,919 and European Patent No. 058881), copolymers of L-glutamic acid and γ ethyl-L-glutamate (Sidman et al., 1983, Biopolymers). 22: 547-56), poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105). Ethylene vinyl acetate (Langer et al., Supra) or poly-D (-)-3-hydroxybutyric acid (European Patent No. 1339398). Sustained release compositions can also include liposomes, which can be prepared by any of several methods known in the art. See, eg, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-92; and European Patent Nos. 036676, 088046, and 143949.
[0212]
The IL-1ra-R pharmaceutical composition used for in vivo administration typically must be sterile. This can be achieved by filtration through sterile filtration membranes. If the composition is lyophilized, sterilization using this method can be performed either prior to or subsequent to lyophilization and reconstitution. Compositions for parenteral administration can be stored in lyophilized form or in solution. In addition, parenteral compositions are generally placed in a container having a sterile access port (eg, a vial having a stopper pierceable by an intravenous solution bag or hypodermic needle).
[0213]
Once the pharmaceutical composition is formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations can be stored either in a ready-to-use form or in a form that requires reconstitution prior to administration (lyophilized form).
[0214]
In certain embodiments, the present invention relates to kits for generating single dose dosage units. The kits can each include both a first container having a dry protein and a second container having an aqueous formulation. Also included within the scope of the present invention are kits that include single and multi-chambered pre-filled syringes (eg, liquid syringes and dispersion syringes).
[0215]
The effective amount of IL-1ra-R pharmaceutical composition used therapeutically will depend, for example, on the nature and purpose of the treatment. The skilled artisan will know the appropriate dosage level for treatment, and therefore the molecule delivered, the indication that the IL-1ra-R molecule is being used, the route of administration, and the patient size (weight, body surface, or organ). It is understood that it varies depending, in part, on the size and state (age and general health). Thus, the clinician can titer the dosage and modify the route of administration to obtain the optimal therapeutic effect. Typical dosages can range from about 0.1 μg / kg to about 100 mg / kg or more, depending on the factors described above. In other embodiments, dosages can range from 0.1 μg / kg to about 100 mg / kg; or from 1 μg / kg to about 100 mg / kg; or from 5 μg / kg to about 100 mg / kg.
[0216]
The frequency of dosing will depend on the pharmacokinetic parameters of the IL-1ra-R molecule in the formulation used. Typically, the clinician will administer the composition until a dosage is reached that achieves the desired effect. The composition is therefore a compositionButAdministered as a single dose over time, as two or more doses (which may or may not contain the same amount of the desired molecule), or as a continuous infusion through an implantation device or catheter obtain. Further improvements in appropriate dosages are routinely made by those of ordinary skill in the art and are within the scope of tasks routinely practiced by them. Appropriate dosages can be ascertained through the use of appropriate dose-response data.
[0217]
The route of administration of the pharmaceutical composition is:For example,Consistent with known methods such as: orally; intravenous, intraperitoneal, intracerebral (intramaternal), intraventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, or intralesional routes Via injection by; by sustained release systems; or by implantation device. If desired, these compositions can be administered by bolus injection, can be administered continuously by infusion, or can be administered by an implantation device.
[0218]
Alternatively or additionally, the composition can be administered locally via implantation of a membrane, sponge, or other suitable material onto which the desired molecule is absorbed or encapsulated. If an implantation device is used, the device can be implanted into any suitable tissue or organ, and delivery of the desired molecule can be via diffusion, timed release bolus or continuous administration.
[0219]
In some cases, it may be desirable to use IL-1ra-R polypeptide pharmaceutical compositions in an ex vivo manner. In such instances, the cells, tissues, or organs removed from the patient are treated with IL-1ra-R polypeptide after the cells, tissues, or organs are subsequently transplanted back into the patient.Pharmaceutical compositionBe exposed to.
[0220]
In other cases, the IL-1ra-R polypeptide is genetically engineered using the methods described herein to express certain cells that express and secrete the IL-1ra-R polypeptide. Can be delivered by implantation. Such cells can be animal or human cells and can be autologous, xenogeneic, or exogenous cells. If necessary, the cells can be immortalized. To reduce the chance of an immunological response, the cells can be encapsulated to avoid infiltration of surrounding tissue. The encapsulating material is typically a biocompatible semi-permeable polymeric enclosure or membrane that allows for the release of the protein product, but not the patient's immune system or other tissues from the surrounding tissue. Due to harmful factorsRuPrevent cell destruction.
[0221]
As discussed herein, treating an isolated cell population (eg, stem cells, lymphocytes, erythrocytes, chondrocytes, neurons, etc.) with one or more IL-1ra-R polypeptides. May be desirable. This meansThis polypeptide isIf in a form that is permeable to the cell membrane, it can be achieved by directly exposing the isolated cells to the polypeptide.
[0222]
Further embodiments of the invention provide cells and methods (eg, homologous recombination and / or other methods) for both in vitro production of therapeutic polypeptides and production and delivery of therapeutic polypeptides by gene therapy or cell therapy. Recombinant production method). Homologous recombination and other methods of recombination can be used to modify cells that contain IL-1ra-R genes that are normally silent to transcription (ie, underexpressed genes), thereby treating Cells expressing an effective amount of IL-1ra-R polypeptide can be produced.
[0223]
Homologous recombination is a technique originally developed to target genes and induce or correct mutations in transcriptionally active genes. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol. 36: 301. Basic techniques introduce specific mutations into specific regions of the mammalian genome (Thomas et al., 1986, Cell 44: 419-28; Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503-12; Doetschman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8583-87), or to correct specific mutations in a defective gene (Doetschman et al., 1987, Nature 330: 576-78). ,It has been developed. Exemplary homologous recombination techniques are described in US Pat. No. 5,272,071; European Patent Nos. 993051 and 505500; PCT / US90 / 07642, and PCT Publication No. WO 91/09955). .
[0224]
The DNA sequence to be inserted into the genome by homologous recombination isTo this DNA sequencetargetConversionDNAJoinThus, it can be directed to a specific region of the gene of interest. This targetConversionDNA is a nucleotide sequence that is complementary (homologous) to a region of genomic DNA. Target complementary to a specific region of the genomeConversionSmall pieces of DNA may be lost during the DNA replication processTo parentsIn contact with the chain. This is inserted into the cellWith other fragments of endogenous DNA via a shared homologous regionHybridize, ThatTherefore,ThatRecombines with other fragments of endogenous DNAIs a general characteristic of DNA. This complementary strandIn, Mutated or different sequencesOrOligonucleotide containing additional nucleotidesAre combinedin case of,This oligonucleotide alsoAs a result of this recombinationThatIt will be incorporated into the newly synthesized chain. As a result of the proofreading function,thisNew sequences can serve as templates. Therefore,thisThe transferred DNA is integrated into the genome.
[0225]
A region of DNA that can interact with or regulate the expression of an IL-1ra-R polypeptide (eg, flanking sequences)In,targetConversionThese fragments of DNAJoin. For example, a promoter / enhancer element, suppressor, or exogenous transcriptional regulatory element is present in the genome of the intended host cell.LeaveA DN encoding the desired IL-1ra-R polypeptideA'sEnough to affect transcriptionProximity and directionIn the direction, it is inserted. The control element is the DNA present in this host cell genome.partTo control. Thus, expression of the desired IL-1ra-R polypeptide is not due to transfection of DNA encoding the IL-1ra-R gene itself, but rather to a recognizable signal for transcription of the IL-1ra-R gene. A target associated with a DNA regulatory segment providing an endogenous gene sequence havingConversionIt can be achieved by the use of DNA (including a region homologous to the endogenous gene of interest).
[0226]
In an exemplary method, expression of a desired target gene in a cell (ie, a desired endogenous cellular gene) is at least a regulatory sequence, an exon, and via homologous recombination into the cell genome at a preselected site. Altered by the introduction of DNA containing a splice donor site. These components are the new transferunitIntroduced into chromosomal (genomic) DNA in such a way as to actually produce (wherein regulatory sequences, exons, and splice donor sites present in the DNA construct are operably linked to the endogenous gene)Is) As a result of the introduction of these components into the chromosomal DNA, the expression of the desired endogenous gene is altered.
[0227]
As described herein, altered gene expression isGetIn intact cellsNormallySilent (not expressed) geneTheactivationTo do(Or to expressthing), As well as the expression of genes that are not expressed at physiologically significant levels in the cells as obtainedTheincreaseLettingIs included. This embodiment further includes the step of changing the pattern of regulation or induction, so thatPatternIs different from the regulatory or induction pattern that occurs in the as-obtained cells, andThatReduce (including exclusion) the expression of genes expressed in the as-obtained cells.
[0228]
Phases to increase or cause the production of IL-1ra-R polypeptide from the cellular endogenous IL-1ra-R geneSame groupReplacement can be used1One method uses homologous recombination initially to recombine sequences from a site-specific recombination system (eg, Cre / loxP, FLP / FRT) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5: 521-2; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225: 890-900),ThatEndogenous of cellsgenomeUpstream of the IL-1ra-R polypeptide coding region (ie, 5 '~ side) Is included. Located just upstream of the genomic IL-1ra-R polypeptide coding regionThis partA plasmid containing a recombination site homologous to, along with the appropriate recombinase enzyme,ThatIntroduced into the modified cell line. This recombinase isthisPlasmidTheLocated immediately upstream of the genomic IL-1ra-R polypeptide coding region of this cell line through the recombination site of this plasmid.ThatIncorporate into the recombination site (Baubonis and Sauer, 1993, Nucleic Acids Res. 21: 2025-29; O'Gorman et al., 1991, Science 251: 1351-55). Any known to increase transcriptionadjacentWhen a sequence (eg, enhancer / promoter, intron, translation enhancer) is properly placed in this plasmid, a new or increased IL-1ra-R polypeptide from the cell's endogenous IL-1ra-R gene. ProduceNewIn a manner that creates a tannery or modified transcription unitIncorporate.
[0229]
A further method using a cell line in which a site-specific recombination sequence is placed immediately upstream of the endogenous genomic IL-1ra-R polypeptide coding region of the cell is:Using homologous recombinationIntroduce a second recombination site elsewhere in the cell line genomeRukoIt is.ThenAppropriateRecombinaseenzymeBut thisIntroduced into two recombination site cell lines and recombinationEvent(Deletion,Inversion, And metastasis) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5: 521-27; Sauer, 1993, Methods Enxymol., 225: 890-900),ThatProduces new or increased IL-1ra-R polypeptide production from the cellular endogenous IL-1ra-R geneNewShika or modified transcriptionunitIs made.
[0230]
Further approaches to increase or cause expression of IL-1ra-R polypeptide from the cellular endogenous IL-1ra-R gene are new or increased from the cellular endogenous IL-1ra-R gene. Increase or cause expression of gene (s) (eg, transcription factors) in a manner that results in production of the IL-1ra-R polypeptideProcess,andAnd / or gene (s) (eg, transcriptional repressor)-). This method involves the non-naturally occurring polypeptide (eg, a polypeptide comprising a site-specific DNA binding domain fused to a transcription factor domain).ThatIntroducing into the cell such that production of new or increased IL-1ra-R polypeptide from the endogenous IL-1ra-R gene of the cell occurs.
[0231]
The present invention further relates to DNA constructs useful in methods of altering target gene expression. In certain embodiments, representative DNA constructs include: (a) one or more targetsConversionArray, (b)AdjustmentSequences, (c) exons, and (d) unpaired splice donor sites. Targets in DNA constructsConversionThe array isTo target genes in cellsElements (a) to (d)Set ofAs a result, these elements (b) to (d)But,ThatIt is operably linked to the sequence of the endogenous target gene. In another embodiment, the DNA construct comprises: (a) one or more targetsConversionArray, (b)AdjustmentSequence, (c) exon, (d) splice donor site, (e) intron, and (f) splice acceptor site. Where the targetConversionThe array is directed to the incorporation of elements (a) to (f) so that these elements (b) to (f)But,ThatOperably linked to an endogenous gene.thistargetConversionThe sequence is homologous to a preselected site of cellular chromosomal DNA where homologous recombination occurs. In this construct, exons are generally 3 'of the regulatory sequence.~ sideAnd the splice donor site is the 3 'of this exon~ sideIt is.
[0232]
Where the sequence of a particular gene is known (eg, the nucleic acid sequence of an IL-1ra-R polypeptide described herein)thisDNA complementary to a selected region of the geneFragmentSynthesizedGainOr otherwise, for example, at a specific recognition site bound to the region of interestThatProper restriction of native DNAprocessingCan be obtained. thisfragmentIs the target when inserted into a cellConversionServes as a sequence and hybridizes to homology regions within its genome. If this hybridization occurs during DNA replication, the DNAfragmentAnd any additional sequences attached to it,OkazakiIt acts as a fragment and is incorporated into the newly synthesized daughter strand of DNA. Accordingly, the present invention includes a nucleotide encoding an IL-1ra-R polypeptide, the nucleotide comprising a targetConversionCan be used as an array.
[0233]
IL-1ra-R polypeptide cell therapy (eg, transplantation of cells that produce IL-1ra-R polypeptide) is also contemplated. This embodiment includes the step of transplanting cells capable of synthesizing and secreting a biologically active form of IL-1ra-R polypeptide. Such an IL-1ra-R polypeptide producing cell is a natural product of IL-1ra-R polypeptide.Producer ofCan be cells that are alsoHasoThe ability to produce any IL-1ra-R polypeptide is desired.IL-1ra-RIt can be a recombinant cell that has been augmented by transformation with a gene encoding a polypeptide or a gene that increases the expression of an IL-1ra-R polypeptide. Such modifications deliver genesAnd its geneCan be achieved by a suitable vector to promote the expression and secretion of. In order to minimize the strong immunological response in patients receiving IL-1ra-R polypeptides,OutpatientOccurs with administration of certain polypeptidesGainIn some cases, it is preferred that the natural cell producing the IL-1ra-R polypeptide is of human origin and produces a human IL-1ra-R polypeptide. Similarly, a recombinant cell producing IL-1ra-R polypeptide is preferably transformed with an expression vector comprising a gene encoding human IL-1ra-R polypeptide.
[0234]
Transplant cells soak in surrounding tissuesJunCan be encapsulated to avoid Human or non-human animal cells can be biocompatible, semipermeable polymer inclusions or membranes (which allow the release of IL-1ra-R polypeptide, but the patient's immune systemAccording toOr it can be transplanted into the patient in the form of preventing cell destruction by other harmful factors from surrounding tissues). Alternatively, the patient's own cells transformed to produce IL-1ra-R polypeptide ex vivo can be implanted directly into the patient without such encapsulation.
[0235]
Techniques for encapsulating live cells are known in the art, and the preparation of encapsulated cells and their transplantation into patients can be routinely accomplished. For example, Baetge et al. (PCT Publications WO 95/05452 and PCT / US94 / 09299) describe membrane capsules containing cells that have been genetically engineered for effective delivery of biologically active molecules. This capsule is biocompatible and easilyRecoveryIs possible. This capsule,LivingEncapsulate cells transfected with a recombinant DNA molecule containing a DNA sequence that encodes a physically active moleculeHowever, this DNA sequence is operably linked to a promoter that is not subject to down regulation in vivo when transplanted into a mammalian host.. This deviceTo specific sites within the recipientA molecule derived from a living cellSendingProvide us. See also U.S. Pat. Nos. 4,892,538; 5,011,472; and 5,106,627. A system for encapsulating living cells is described in PCT Publication WO 91/10425 (Aebischer et al.). PCT releaseWO91 // 10470 (Aebischer et al.); Winn et al., 1991, Exper. Neurol. 113: 322-29; Aebischer et al., 1991, Exper. Neurol. 111: 269-75; and Tresco et al., 1992, ASAIO 38: 17-23.
[0236]
In vivo and in vitro gene therapy delivery of IL-1ra-R polypeptides is also envisioned. An example of gene therapy technology is constitutive orGuidanceUsing the IL-1ra-R gene (either genomic DNA, cDNA and / or synthetic DNA) encoding an IL-1ra-R polypeptide that can be operably linked to a sex promoter, a “gene therapy DNA construct” Is to form. This promoter is homozygous or heterozygous for the endogenous IL-1ra-R gene.RituHowever, it is active in the cell or tissue type into which the construct is inserted. Other components of the gene therapy DNA construct are optionally DNA molecules designed for site-specific integration (eg, endogenous sequences useful for homologous recombination), tissue-specific promoters, enhancers. Or silencers, DNA molecules that can provide selective dominance over parental cells, DNA molecules useful as labels for identifying transformed cells, negative selection systems, cell-specific binding agents (eg, for cell targeting ),Cell specific internalizationfactor, Transcription factors that increase expression from the vector, and factors that allow the production of the vector.See.
[0237]
The gene therapy DNA construct can then be introduced into cells using viral or non-viral vectors (ex vivo or in vivo).ofeither). One method for introducing a gene therapy DNA construct is by use of a viral vector as described herein. Certain vectors (eg, retroviral vectors) deliver the DNA construct to the chromosomal DNA of the cell, and the gene can be integrated into the chromosomal DNA. Other vectors function as episomes and gene therapy DNA constructs remain in the cytoplasm.
[0238]
In still other embodiments,AdjustmentElements can be included for controlled expression of the IL-1ra-R gene in target cells. Such elements are stimulated in response to appropriate effectors. In this way, therapeutic polypeptides can be expressed as desired. One conventional control means is a small molecule dimerizer or rapalog that dimerizes a chimeric protein (eg, a DNA binding protein or a transcriptionally active protein) that includes a small molecule binding domain and a domain that can initiate a biological process. ) (See PCT publications WO 96/41865, WO 97/31898 and WO 97/31899). Protein dimerization can be used to initiate transgene transcription.
[0239]
An alternative regulatory technique uses a method in which proteins expressed from the gene of interest are stored inside the cell as aggregates or clusters. The gene of interest isEndoplasmic reticulumExpressed as a fusion protein containing a conditional aggregation domain that results in retention of the aggregated protein in. The stored protein is stable and inactive inside the cell. However, the protein can be released by administering a drug that removes the conditional aggregation domain (eg, a small molecule ligand), thereby destroying the aggregate or cluster, so that the protein is secreted from the cell. Can be done. See Aridor et al., 2000, Science 287: 816-17 and Rivera et al., 2000, Science 287: 826-30.
[0240]
Other suitable control means or gene switches include, but are not limited to, the systems described herein. Mifepristone (RU486) is used as a progesterone antagonist. Binding of the modified progesterone receptor ligand binding domain to the progesterone antagonist activates transcription by forming a dimer of two transcription factors, which then leads to the nucleus and binds to DNA. This ligand binding domain is modified to eliminate the ability of the receptor to bind to the natural ligand. Modified steroid hormone receptor systems are further described in US Pat. No. 5,364,791 and PCT publications WO 96/40911 and WO 97/10337.
[0241]
Yet another control system uses ecdysone (Drosophila steroid hormone) that binds to and activates the ecdysone receptor (cytoplasmic receptor). This receptor then translocates to the nucleus and binds to a specific DNA response element (a promoter from an ecdysone responsive gene). The ecdysone receptor contains a transactivation domain, a DNA binding domain, and a ligand binding domain and initiates transcription. The ecdysone system is further described in US Pat. No. 5,514,578 and PCT publications WO 97/38117, WO 96/37609, and WO 93/03162.
[0242]
Another control means uses a positive tetracycline-controllable transactivator. This system involves a mutated tet repressor protein DNA binding domain (reverse tetracycline linked to a polypeptide that activates transcription.AdjustmentA mutated tetR-4 amino acid change that resulted in a transactivator protein, ie it binds to the tet operator in the presence of tetracycline). Such systems are described in US Pat. Nos. 5,464,758, 5,650,298, and 5,654,168.
[0243]
Additional expression control systems and nucleic acid constructs are described in US Pat. Nos. 5,741,679 and 5,834,186 (Innovir Laboratories Inc.).
[0244]
In vivo gene therapy involves the gene encoding an IL-1ra-R polypeptide, by local injection of IL-1ra-R nucleic acid molecules, orOtherIt can be achieved by introduction into the cell by an appropriate viral or non-viral delivery vector. Hefti, 1994, Neurobiology 25: 1418-35. For example, a nucleic acid molecule encoding an IL-1ra-R polypeptide can be included in an adeno-associated virus (AAV) vector for delivery to a target cell (eg, Johnson, PCT Publication WO 95/34670; PCT Application PCT / See US 95/07178. A recombinant AAV genome is typically an AAV inverted terminal repeat flanked by a DNA sequence encoding a IL-1ra-R polypeptide and a polyadenylation sequence operably linked to a functional promoter. including.
[0245]
Alternative suitable viral vectors include retrovirus, adenovirus, herpes simplex virus, lentivirus, hepatitis virus, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alphavirus, coronavirus, rhabdovirus, paramyxovirus, and papillomavirus VectorIs not limited to. US Pat. No. 5,672,344 describes an in vivo virus-mediated gene comprising a recombinant neurotrophic HSV-1 vectorImportDescribe the system. US Pat. No. 5,399,346 provides an example of a process for providing a therapeutic protein to a patient by delivery of human cells treated in vitro to insert a DNA segment encoding the therapeutic protein. Additional methods and materials for the implementation of gene therapy techniques are described in US Pat. Nos. 5,631,236 (including adenoviral vectors), 5,672,510 (including retroviral vectors), 635,399 (including retroviral vectors expressing cytokines).
[0246]
Non-viral delivery methods include lipoSeoMediationImport, Naked DNA delivery (direct injection), receptor-mediated delivery (ligand-DNA complex), electroporation, calcium phosphate precipitation, and microparticle bombardment (eg, gene gun). Gene therapy materials and methods also include inducible promoters, tissue-specific enhancer-promoters, DNA sequences designed for site-specific integration, DNA sequences that can provide selective dominance over parental cells, transformed Depending on label to identify cells, negative selection and expression control systems (safety indicators), cell-specific binding factors (for cell targeting), cell-specific internalization factors, and vectors and methods of vector production It may contain transcription factors that increase expression. Such additional methods and materials for the implementation of gene therapy techniques are described in US Pat. Nos. 4,970,154 (including electroporation technology), US Pat. No. 5,679,559 (Lipo for gene delivery). Describes protein-containing systems), 5,676,954 (LipoSeoNo. 5,593,875 (describes a method for calcium phosphate transfection), and 4,945,050 (biologically active particles are transferred to cells at a certain rate). Spraying, which describes the process by which the particles penetrate the surface of the cell and are incorporated inside the cell), and PCT Publication WO 96/40958 (NuclearIncluding ligands).
[0247]
It is also contemplated that IL-1ra-R gene therapy or cell therapy may further include delivery of one or more additional polypeptides in the same or different cell (s). Such cells can be introduced separately into the patient, the cells can be included in a single implantable device (eg, the encapsulating membrane described above), or the cells can be separately separated by viral vectors. Can be modified.
[0248]
A means of increasing the expression of endogenous IL-1ra-R polypeptide in cells by gene therapy is to insert one or more enhancer elements into the IL-1ra-R polypeptide promoter, wherein the enhancer element is Can act to increase the transcriptional activity of the IL-1ra-R gene. The enhancer element used is selected based on the tissue in which it is desired to activate the gene—enhancer elements are known to confer promoter activation in that the tissue is selected. For example, if the gene encoding IL-1ra-R polypeptide is “turned on” in T cells, the lck promoter enhancer element can be used. Thus, the functional portion of the added transcription element can be inserted into a fragment of DNA containing the IL-1ra-R polypeptide promoter using standard cloning techniques (and optionally vector and / or Or 5 'and / or 3' flanking sequences). This construct, known as a “homologous recombination construct”, can then be introduced into the desired cells either ex vivo or in vivo.
[0249]
Gene therapy also modifies IL-1ra-R polypeptide expression by altering the nucleotide sequence of the endogenous promoter.DecreaseCan be used to Such modification is typically accomplished by homologous recombination methods. For example, the IL-1ra-R gene selected for inactivationPromoterDNA molecules, including all or part, can be engineered to remove and / or replace fragments of the promoter that regulate transcription. For example, the TATA box and / or binding site of a transcriptional activator of a promoter can be deleted using standard molecular biology techniques; such a deletion can inhibit promoter activity; Can block the transcription of the corresponding IL-1ra-R gene. Deletion of the TATA box or transcriptional activator binding site in the promoter can cause all or related portions of the IL-1ra-R polypeptide promoter (from the same or related species as the regulated IL-1ra-R gene) Can be achieved by generating one or more TATA boxes and / or transcription activator binding site nucleotides by substitution, deletion and / or insertion of one or more nucleotides. Mutated. As a result, the TATA box and / or activator binding site decreases activity, orPerfectInactivated. This construct, which also typically contains at least about 500 bases of DNA corresponding to native (endogenous) 5 'and 3' DNA sequences adjacent to the modified promoter segment, is directlyOrOr via viral vectors as described herein, to appropriate cells (ex vivo or in vivoofEither). Typically, integration of this construct into the genomic DNA of the cell is by homologous recombination, where the 5 ′ and 3 ′ DNA sequences of this promoter construct are obtained by hybridization to endogenous chromosomal DNA. May help integrate into the modified promoter region.
[0250]
(Therapeutic use)
IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists thereof are numerous diseases, disorders or conditions (cited herein).thingCan be used to treat, diagnose, recover or prevent.
[0251]
IL-1ra-R polypeptide agonists and antagonists modulate IL-1ra-R polypeptide activity and increase or decrease at least one activity of the mature form of IL-1ra-R polypeptideThose moleculesincluding. An agonist or antagonist can be a cofactor (eg, protein, peptide, carbohydrate, lipid or low molecular weight molecule) that interacts with and thereby modulates the activity of an IL-1ra-R polypeptide. Potent polypeptide agonists or antagonists include antibodies that react with either soluble or membrane-bound forms of IL-1ra-R polypeptides that include some or all of the extracellular domain of the protein. Molecules that modulate IL-1ra-R polypeptide expression typically include nucleic acids encoding IL-1ra-R polypeptides that can serve as antisense regulators of expression.
[0252]
For example, the IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions, including immune system failure. Examples of such diseases include, but are not limited to: rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, inflammatory arthritis, osteoarthritis, inflammatory joint disease, autoimmune disease (autoimmune pulse Tuberculosis), multiple sclerosis, lupus, diabetes (eg, insulin diabetes), inflammatory bowel disease, transplant rejection, graft-versus-host disease, and fractures, sprains, cartilage damage, trauma, plastic surgery, infection or Inflammatory conditions that arise from other disease processes. Other diseases that are affected by immune system failure are encompassed within the scope of the present invention.
[0253]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent a disease, disorder or condition including infection. Examples of such diseases include, but are not limited to: leprosy, viral infection (eg, hepatitis or HIV), bacterial infection (eg, clostridium-related disease, clostrium-related diarrhea), pulmonary tuberculosis Acute febrile disease, fever, acute reaction of the liver, sepsis or septic shock. Other diseases including infection are encompassed within the scope of the present invention.
[0254]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate, or prevent diseases, disorders, or conditions, including weight disorders. Examples of such diseases include, but are not limited to: obesity, anorexia, cachexia (including AIDS-induced cachexia), myopathy (eg, muscle protein metabolism in sepsis), And hypoglycemia. Other diseases including weight disorders are included within the scope of the present invention.
[0255]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate, or prevent a disease, disorder, or condition that includes neurological dysfunction. Examples of such diseases include, but are not limited to: Alzheimer's disease, Parkinson's disease, neurotoxicity (eg, as induced by HIV), ALS, brain injury, stress, depression, Nociception and other pain (including cancer-related pain), hyperalgesia, epilepsy, learning and memory disorders, sleep disorders, and peripheral and central neuropathy. Other neurological disorders are encompassed within the scope of the present invention.
[0256]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the lung. Examples of such diseases include, but are not limited to: acute or chronic lung injury (including interstitial lung disease), acute respiratory disease syndrome, pulmonary hypertension, emphysema, cystic fibers Disease, pulmonary fibrosis, and asthma. Other diseases of the lung are included within the scope of the present invention.
[0257]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the skin. Examples of such diseases include, but are not limited to, psoriasis, eczema and wound healing. Other skin disorders are included within the scope of the present invention.
[0258]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the kidney. Examples of such diseases include, but are not limited to, acute and chronic glomerulonephritis. Other renal diseases are encompassed within the scope of the present invention.
[0259]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving bone. Examples of such diseases include, but are not limited to: osteoporosis, osteoarthritis, osteogenesis imperfecta, Paget's disease, periodontal disease, temporary temporomandibular joint disease, and hypercalcemia . Other bone diseases are encompassed within the scope of the present invention.
[0260]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the vasculature. Examples of such diseases include, but are not limited to: bleeding or stroke, hemorrhagic shock, ischemia (heart ischemia and cerebral ischemia, eg, trauma, epilepsy, bleeding or stroke results As brain damage (each of these results in neurodegenerationGain)), Atherosclerosis, congestive heart failure, restenosis, reperfusion injury, and angiogenesis. Other vascular diseases are encompassed within the scope of the present invention.
[0261]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent a disease, disorder or condition involving tumor cells. Examples of such diseases include, but are not limited to: lymphoma, osteosarcoma, chronic and acute myeloid leukemia (CML and AML), and other leukemias, multiple myeloma, lung cancer, breast cancer , Tumor metastases, and side effects of radiation therapy. Diseases involving other tumor cells are encompassed within the scope of the present invention.
[0262]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the reproductive system. Examples of such diseases include, but are not limited to, infertility, miscarriage, premature labor and premature birth, and endometriosis. Diseases involving other reproductive systems are encompassed within the scope of the present invention.
[0263]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention can also be used to treat, diagnose, ameliorate or prevent diseases, disorders or conditions involving the eye. Examples of such diseases include, but are not limited to: inflammatory eye diseases (eg, which may be associated with corneal transplantation), retinal degeneration, blindness, macular degeneration, glaucoma, uveitis, and networkMembraneNeuropathy. Other eye diseases are included within the scope of the present invention.
[0264]
The IL-1ra-R nucleic acid molecules, polypeptides, and agonists and antagonists of the present invention are also used to treat diseases such as acute pancreatitis, chronic fatigue syndrome, fibrinemia, and Kawasaki disease (MLNS). Can be done.
[0265]
IL-1 inhibitors include any protein that can specifically prevent activation of cellular receptors for IL-1,ManyCan arise from this mechanism. Such mechanisms include down-regulation of IL-1 production, free IL-1 binding, interference of IL-1 binding to its receptor, IL-1 receptor complexFormation of(Ie IL-1 receptorauxiliaryBinding of IL-1 receptor to protein)ofOf signal transduction following interference and binding of IL-1 to its receptorAdjustmentIncluding jamming. Such interleukin-1 inhibitors include the following: interleukin-1 receptors such as IL-1ra-R, as described herein.Antagonist, anti-IL-1 receptor monoclonalAntibodies (eg, European Patent No. 623694), IL-1 binding proteins such as soluble IL-1 receptor (eg, US Pat. Nos. 5,492,888, 5,488,032, Nos. 464,937, 5,319,071, and 5,180,812.issue), Anti-IL-1 monoclonal antibody (eg, PCT publication)numberWO95 / 01997, WO94 / 02627, WO90 / 06371; US Pat. No. 4,935,343; and European Patents 364778, 267611, and 220063), IL-1 receptorauxiliaryProteins and antibodies against them (eg PCT publication)numberWO 96/23067); interleukin-1β converting enzyme (ICE) or inhibitors of caspase I (using this, IL-1βofProduction and secretion), interleukin-1β protease inhibitors, and other compounds and proteins that block in vivo synthesis or extracellular release of IL-1.
[0266]
Exemplary IL-1 inhibitors are disclosed below: US Pat. Nos. 5,747,444, 5,359,032, 5,608,035, 5,843,905. No. 5,359,032, No. 5,866,576, No. 5,869,660, No. 5,869,315, No. 5,872,095, No. 5 , 955, 480; PCT publishednumberWO 98/21957, WO 96/09323, WO 91/17184, WO 96/40907, WO 98/32733, WO 98/42325, WO 98/44940, WO 98/47892, WO 98/56377, WO 99/03638, WO 99/06426, WO 99/06042, WO 91 / 17249, WO 98/32733, WO 98/17661, WO 97/08174, WO 95/34326, WO 99/36426, and WO 99/36415; European Patent Nos. 534978 and 894795;AndFrench patent application FR 2762514.
[0267]
Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) is a human protein that acts as a natural inhibitor of interleukin-1. Preferred receptor antagonists (including IL-1ra and variants and derivatives thereof) and methods for making and using them are described in US Pat. No. 5,075,222; PCT PublicationnumberWO 91/08285, WO 91/17184, WO 92/16221, WO 93/21946, WO 94/06457, WO 94/21275, WO 94/21235, WO 94/20517, WO 96/22793, WO 97/28828andWO 99/36541; Australian Patent No. AU 9173636; French Patent FR 2706772;AndIt is described in German patent DE 4219626. Such proteins include glycosylated IL-1 receptor antagonists and non-glycosylated IL-1 receptor antagonists.
[0268]
Specifically, ILThree representative forms of -1ra and its variants are disclosed and described in the 5,075,222 patent. The first of these is called “IL-1i” and is eluted from the MonoQ FPLC column with about 52 mM NaCl in Tris buffer (pH 7.6).Do,aboutCharacterized as a 22-23 kD molecule in SDS-PAGE with an isoelectric point of 4.8EtIt is. The second (IL-1raβ) elutes from the MonoQ column with 48 mM NaClDoCharacterized as a 22-23 kD protein. Both IL-1raα and IL-1raβ are glycosylated. The third (IL-1raχ) is eluted from the MonoQ column with 48 mM NaCl.DoCharacterized as a 20 kD protein, And not glucosylated. US Pat. No. 5,075,222 also describes a method for isolating the gene responsible for the coding of these inhibitors, a method for cloning this gene in an appropriate vector and cell type, and the gene Are disclosed to produce these inhibitors.
[0269]
Lack ofMany combinations of deletions, insertions and substitutions (in this specification individually orTogether"Variant (s)") can be made within the amino acid sequence of IL-1ra-R, provided that the resulting molecule is biologically active (eg, as used herein). Those skilled in the art will recognize that they have the ability to affect one or more of the diseases and disorders as described.
[0270]
According to the present inventionIntentionAs such, IL-1ra-R polypeptides may beAuxiliary forTreated as and alsoIndicationSuitable forotherIt can be administered with a pharmaceutical composition. Any of the IL-1ra-R polypeptide and one or more additional treatments or pharmaceutical formulations may be administered separately, sequentially or simultaneously.
[0271]
In certain embodiments, the present invention is combined with any one or more TNF inhibitors (pre-treatment, post-treatment, or simultaneous treatment) for the treatment or prevention of the diseases and disorders described herein. ) The use of IL-1ra-R polypeptides.
[0272]
Such TNF inhibitors include compounds and proteins that block in vivo synthesis or extracellular release of TNF. In certain embodiments, the present invention provides the following:One or moreTNF inhibitorNoisyRegarding the use of IL-1ra-R polypeptide in combination with either (pre-treatment, post-treatment or simultaneous treatment): TNF-binding protein (soluble TNF receptor type I and soluble TNF, as defined herein) Receptor type II ("sTNFR"), Anti-TNF antibody, granulocyte colony stimulating factor, thalidomide, BN 50730,Tenidap (tenidap), E 5531,Chiapafant (tiapafant)PCA 4248,Nimesulide (nimeside),Panaville (panavir),Rolipram (rolipram), RP 73401, peptide T, MDL 201,449A, (1R, 3S) -Cis-1- [9- (2,6-diamidineNopLinil)] -3-Hydroxy-4-cyclopenTeHydrochloride, (1R, 3R) -trans-1- (9- (2,6-Diamino) purine] -3-acetoxycyclopenta,(1R, 3R) -trans-1- [9-adenyl) -3-azidocyclopentane hydrochloridesaltAnd (1R, 3R) -trans-1- (6-hydroxy-purin-9-yl) -3-azidocyclo-pentane. TNF binding proteins are disclosed in the art (US Pat. No. 5,136,021; European Patent Nos. 308378, 422339, 393438, 398327, 41246, No. 41814, No. 43333900, No. 464533, No. 51528, No. 526905, No. 568828, No. 417563; PCT publishednumberWO90 / 13575, WO91 / 03553, WO92 / 01002, WO92 / 13095, WO92 / 16221, WO93 / 07863, WO93 / 21946, WO93 / 19777, WO94 / 06476, PCT application number PCT / US97 / 12244; British Patent GB 2218101 No. and No. 2246469; and Japanese patent applicationJP127, 800/1991).
[0273]
For example, European Patent Nos. 393438 and 422339 disclose soluble TNF receptor type I ("sTNFR-I" or "30 kDa  Also known as "TNF inhibitors") and soluble TNF receptor type II ("sTNFR-II" or "40 kDa  Also known as “TNF inhibitor”)Together(Referred to as “sTNFR”) and itsModificationAmino acid and nucleic acid sequences in the form (eg, fragments, functional derivatives, and variants) are taught. EP 393438 and 422339 also describe a method for isolating the gene responsible for the inhibitor's code, a method for cloning this gene in appropriate vectors and cell types,AndMethods for expressing this gene to produce inhibitors are disclosed. further,sOf TNFR-I and sTNFR-IIMultivalentForm (ie, 1MoreActive part ofMinMolecules) have also been disclosed. In one embodiment,MultivalentThe form is obtained by chemically coupling at least one TNF inhibitor and another moiety with any clinically acceptable linker (eg, polyethylene glycol) (PCT publication).numberWO92 / 16221 and WO95 / 34326), by peptide linker(Neve et al., 1996, Cytokine, 8: 365-70), chemical coupling to biotin and then binding to avidin (PCT publication).numberWO 91/03553) and finally the chimeric antibody componentChild(US Pat. No. 5,116,964; PCT publication)numberWO 89/09622 and WO 91/16437; and European Patent No. 315062).
[0274]
Anti-TNF antibodies include the following: MAK 195F Fab antibody (Holler et al., 1993,1st International Symposium on Cytokines in Bone Marlow Transplantation 147), CDP 571Anti-TNF monoclonal antibody (Rakin et al., 1995, Br. J. Rheumatol., 34: 334-42), BAY X 1351 mouse anti-tumor necrosis factor monoclonal antibody (Kieft et al., 1995, 7th European Congress of Biobiology 9) CenTNF cA2 anti-TNF monoclonal antibody (Elliot et al., 1994, Lancet, 344: 1125-27; Elliot et al., 1994, Lancet, 344: 1105-10).
[0275]
In certain embodiments, the present invention provides a secreted or soluble human fas antigen or a recombinant version thereof (PCT publication).numberWO 96/20206; Mountz et al., 1995, J. MoI. Immunol. 155: 4829-37; and European Patent No. 510691) (pretreatment,rearplacePlaceOr simultaneous treatment) relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. PCT Publication No. WO96 / 20206 is a secreted human fas antigen (native and recombinant(Contains Ig fusion protein)), A method for isolating the gene responsible for the coding of the soluble recombinant human fas antigen, a method for cloning this gene in an appropriate vector and cell type,AndMethods for expressing this gene to produce inhibitors are disclosed. EP 510691 describes human fas antigen(Including soluble fas antigen)Nuclear codeAcidA vector for expressing the nucleic acid of the present invention, and a transformant transfected with the vectorTeach. When administered parenterally, the dose of secreted or soluble fas antigen fusion protein is generally about 1 μg / kg to about 100 μg / kg, respectively.
[0276]
Current treatments of the diseases and disorders listed herein (including acute and chronic inflammation such as rheumatic diseases) generally involve the first line of drugs for the control of pain and inflammation These drugs are classified as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Secondary treatment is corticosteroids (slowEffectIncludes sex anti-rheumatic drugs (SAARDs) or disease ameliorating (DM) drugs. Information about the following compounds can be found in The Merck Manual of Diagnostics and Therapies (16th Edition, 1992) and Pharmaprojects (PJB Publications Ltd).
[0277]
In certain embodiments, the invention provides for the diseases and disorders listed herein (acute and chronic inflammation such as rheumatic diseases).AndIL-1ra-R polypeptides for the treatment of graft-versus-host disease)And one or more NSAIDsAbout the use of. NSAID isIts anti-inflammatory actionAt least partially in inhibiting prostaglandin synthesisAccording(Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (7th edition, 1985)). NSAID is the followingat leastIt can be characterized in nine groups: (1) salicylic acid derivatives, (2) propionic acid derivatives, (3) acetic acid derivatives, (4) phenamic acid derivatives, (5) carboxylic acid derivatives, (6) butyric acid derivatives, (7 ) Oxicams, (8) pyrazoles, and (9) pyrazolones.
[0278]
In another specific embodiment, the present invention relates to one or more salicylic acid derivatives, prodrug esters thereof, or pharmaceutically acceptable salts.One ofCombined with (pretreatment,rearplacePlaceOr simultaneous treatment) relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Such salicylic acid derivatives, their prodrug esters, and pharmaceutically acceptable salts include: AcetaminoTheAcetaminosol, aloxiprin, aspirin, benolylate, bromosaligenin, calcium acetylsalicylate, cholinemagnesium trisalicylate, magnesium salicylate, choline salicylate, diflusinal, ethersalate, ethersalate-Fendosal, gentiTheAcid, glycol salicylate, imidazolic salicylate,TheAcetyl salicylate, mesalamine, morpholine salicylate, 1-naphthyl salicylate, olsalazine,LeSalsalimide, phenyl acetylsalicylate, phenyl salicylate, saLaCetamide, salicylamide O-acetic acid, salsalate, sodium salicylate and sulfasalazine. Structurally related salicylic acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoAlso thisgroupIt is intended to be included in
[0279]
In a further specific embodiment, the present invention provides one or more propionic acid derivatives,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Propionic acid derivatives,ThatProdrug esters, andMedicineChemically acceptable salts include: aluminoprofen, benoxaprofen, bucloxic acid, carprofen, dexSuiDexprofenfen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofen, flurbiprofen, fluroprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminum, ibuprofaxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loxoprofen, miroprofen , Naproxen, naproxen sodium, oxaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, protidic acid, pyridoxiprofen, suprofen, thiaprofenic acid and thioxaprofen. Structurally related propionic acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0280]
In yet another specific embodiment, the present invention provides one or more acetic acid derivatives,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Acetic acid derivatives,ThatProdrug esters, andMedicineThe pharmaceutically acceptable salts include: acemetacin, alcropheNakuAMuPhenac, bufexamac, synmethacin, clopirak, delmethacin, diclofenac potassium, diclofenac sodium, etodolac, felbinac, fenclofenac, fenchlorac, fenclozic acid, fentiazak, flofenac, glucametacin, ibufenac, indomethacin, isofenac Methazinic acid, oxametacin, oxypinac, pimetacin, progouritacin, sulindac, tarmetacin, thiaramide, thiopinac, tolmethine, tolmetine sodium, didomethacin and zomepirac. Structurally related acetic acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0281]
In another specific embodiment, the present invention provides one or more fenamic acid derivatives,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Phenamic acid derivatives,ThatProdrug esters, andMedicineThe pharmaceutically acceptable salts include: enfenamic acid, etofenamate, flufenamic acid, isonixin, meclofenamic acid, meclofenaMuic acidSodium, medfenamic acid, mefenamic acid, niflumic acid, talniflumate, telofenamate, tolfenamic acid and ufenamate. Structurally related phenamic acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0282]
In a further specific embodiment, the present invention provides one or more carboxylic acid derivatives,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides.Can be usedCarboxylic acid derivatives,ThatProdrug esters, andMedicinePharmaceutically acceptable saltContains: Cridanac, diflunisal, flufenisal, inoridine, ketorolaKuoAnd tinolidine. Structurally related carboxylic acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0283]
In additionanotherIn certain embodiments, the present invention provides one or more butyric acid derivatives,ThatIn combination with either a prodrug ester, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Butyric acid derivatives,ThatProdrug esters, andMedicineThe pharmaceutically acceptable salts include: bumadison, butibufen, FenbufenAnd xembucin. Structurally related butyric acid derivatives with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0284]
In another specific embodiment, the present invention provides one or more oxycarbons.Mu,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides. Oxicam,ThatProdrug esters, andMedicineThe pharmaceutically acceptable salts include: droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam and 4-hydroxyLe-1,2-benzothiazine 1,1-dioxide 4- (N-phenyl) -carboxamide. Structurally related oxicams with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0285]
Yet anotherspecificIn embodiments, the present invention provides one or more pyrazoles,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides.Can be usedPyrazole,ThatProdrug esters, andMedicinePharmaceutically acceptable saltContains: Difenamisole and epirizole. Structurally related pyrazoles with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesAlsoIt is also intended to be included in this group.
[0286]
In a further specific embodiment, the present invention provides one or more pyrazolones,ThatProdrug ester, alsoIs medicineIn combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (in frontplaceAfterplacePlaceOrsimultaneousplacePlace)It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides.Can be usedPyrazolone,ThatProdrug esters, andMedicineThe pharmaceutically acceptable salts include: apazone, azapropazone, benzpiperilone, feprazone, mofebutazone, morazon, oxyphenbutazone, phenylbutazone, pipebzone, propylphenazone, ramifenazone, sukibzone and thiazolinobutazone. Structurally related pyrazolones with similar analgesic and anti-inflammatory properties(Pyrazalone)It is also intended to be included in this group.
[0287]
In another specific embodiment, the invention relates to the use of an IL-1ra-R polypeptide in combination (pre-treatment, post-treatment or simultaneously with treatment) with any one or more of the following NSAIDs: Acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrine, anitrazafen, anthrafenine, bendazac, bendazac lysinate, benzidamine, beprozin, broperamol, Bucolome, buphezolac, cyprocazone, cloximate, dazidamine, deboxameth, detomidine, difenpyramide, difenpyramide, difisalamine, ditazole, emorphazone, fanetizole mesile , Fenflumizole, fructophenine, flumisole, flunixin, fluprocazone, fopirtoline, fofosal, guaiazalene, isonixinn, lefetamine HCl, leflunizole, c ), Mesecrazone, nabumetone, nictindol, nimesulide, orgothein, olpanoxin, oxaceptol, oxapadol, paranyline, perisoxal, perisoxal citrate, pifoxime, piproxen, pyrazolac, pirfenidone, procazone Elabin B (thielavin B), thyflamizole, thymegadine, lectin, torpador, tryptamide, tryptamide, and 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, BW540C, BIN540C, BIN540C , FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI 6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoyl-1-inDaCarboxylic acids), NSAIDs as registered by company code numbers such as TVX2706, U60257, UR2301 and WY41770. Structurally related NSAIDs having analgesic and anti-inflammatory properties similar to NSAIDs are also intended to be included in this group.
[0288]
In yet another specific embodiment, the present invention relates to diseases and disorders listed herein, including acute and chronic inflammation, such as rheumatic diseases, graft versus host disease, and multiple sclerosis. IL-1ra-R in combination with one or more corticosteroids, prodrug esters, or pharmaceutically acceptable salts thereof (pre-treatment, post-treatment or simultaneously with treatment) for the treatment of It relates to the use of polypeptides. Corticosteroids, prodrug esters, and pharmaceutically acceptable salts thereof include hydrocortisone and compounds derived from: 21-acetoxypregnenolone, alclomelazone, algestone, amsinonide, beclomethasone, betamethasone, betamethasone valerate, Budesonide, chloroprednisolone, clobetasol, clobetasol propionate, clobetasone, clobetasone butyrate, crocortron, clopredonol, corticosterone, cortisone, cortibazole, deflazacon, desonide, desoxymelazone, dexamethasone, diflorazone, diflucortron , Diflupredonate, enoxolone, fluazacort, fluchloronide, flumethasone, flumethasone pivalate, flucinolone Tonido, flunisolide, fluocinonide, fluocinolone acetonide, fullOkorChin butyl, fluocortron, fluocortron hexanoate, diflucortron valerate, fluoromeGRon, full peroloneacetate, Fluprednidene acetate, fluprednisolone, flurandenolide, formocoattal, halcinonide, halomethasone, halopredon acetate, hydrocortamate, hydrocortisone, hydrocortisone acetate, hydrocortisone butyrate, hydrocortisone phosphate, hydrocortisone 21-sodiumTheCuccinate, hydrocortisone tebutate, madipredone, medrizone, meprednisone methylprednisolone, mometasone furoate, parameterzone, prednisolone, prednisolone, prednisolone 21-diedriaminoacetate, prednisolone sodium phosphate, prednisolone sodiumTheCuccinate, prednisolone sodium 21-m-sulfobenzoD, Prednisolone 21-stearoglycolate, prednisoloneTebutate,Prednisolone 21-trimethylacetate, prednisone, prednival, predonidene, prednylidene 21-diethylaminoacetate, thixoKortoHydrocortisone, such as leu, triamcinolone, triamcinolone acetonide, triamcinolone benetonide, and triamcinolone hexaacetonide. Structurally related adrenocortical corticoids with similar analgesic and anti-inflammatory properties are also intended to be included in this group.
[0289]
In another specific embodiment, the present invention relates to the diseases and disorders listed herein, including acute and chronic inflammation, such as rheumatic diseases, graft-versus-host disease, and multiple sclerosis. In combination with one or more slow-acting anti-rheumatic drugs (SAARDs) or disease modifying anti-rheumatic drugs (DMARDS), prodrug esters, or pharmaceutically acceptable salts thereof for treatment (treatment Before, after treatment or simultaneously with treatment), relates to the use of IL-1ra-R polypeptide. SAARDs or DMARDs, prodrug esters, and pharmaceutically acceptable salts thereof include: allocladido sodium, auranofin, aurothioglucose, aurothioglycanide, azathioprine, brequinar sodium, bucillamine , Calcium 3-aurothio-2-propanol-1-sulfonate, chlorambucil, chloroquine, clobzalit, cuproxoline, cyclophosphoamide, cyclosporine, dapsone, 15-deoxyspergualin, diacerein, glucosamine, gold salt (eg, cycloquine gold Salt, gold sodium thiomalate, gold sodium thiosulfate), hydroxychloroquine, hydroxychloroquine sulfate, hydroxyurea, kebzone, levamizo , Lobenzalit, melittin, 6-mercaptopurine, methotrexate, mizoribine, mycophenolate mofetil, myoral, nitrogen mustard, D-penicylamine, pyridinol, imidazole (eg SKNF86002 and SB203580), rapamycin, thiol, thymopoietin And vincristine. Structurally related SAARDs or DMARDs with similar analgesic and anti-inflammatory properties are also intended to be included in this group.
[0290]
In another specific embodiment, the present invention relates to one or more COX2 inhibitors, prodrug esters, or pharmaceuticals thereof for the treatment of the diseases and disorders listed herein, including acute and chronic inflammation. Relates to the use of IL-1ra-R polypeptides in combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (before treatment, after treatment or simultaneously with treatment). COX2 inhibitor, prodrug ester,OrExamples of pharmaceutically acceptable salts include celecoxib, for example. Structurally related COX2 with similar analgesic and anti-inflammatory propertiesInhibitorAre also intended to be included in this group.
[0291]
In yet another specific embodiment, the invention provides one or more antibacterial agents, prodrug esters, or the like, for the treatment of the diseases and disorders described herein, including acute and chronic inflammation. It relates to the use of IL-1ra-R polypeptides in combination with any of the pharmaceutically acceptable salts (before treatment, after treatment or simultaneously with treatment). Antibacterial agents include, for example, a broad class of penicillins, cephalosporins and other β-lactams, aminoglycosides, azoles, kilonons, macrolides, rifamycin, tetracyclines, sulfonamides, lincosamides and polymyxins. Is mentioned. Penicillin includes, but is not limited to, penicillin G, penicillin V, methicillin, naphthilin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, floxacillin, ampicillin, ampicillin / sulbactam, amoxiline, amoxiline / clavulanic acid, hetacillin, c , Bacampicillin, carbenicillin, carbenicillin indanyl, ticarcillin, ticarcillin / clavulanic acid, azurocillin, mezlocillin, piperacillin, and mecillinum. Cephalosporins and other β-lactams include, but are not limited to: cephalotin, cefapirin, cephalexin, cefradine, cefazolin, cefadroxyl, cefaclor, cefamandole, cefotetan, cefoxitin, ceruloxime, cefoniside , Ceforazine, cefixime, cefotaxime, moxalactam, ceftizoxime, cetriaxone, cefoperazone, ceftazidime, imipenem and aztreonam. Aminoglycosides include, but are not limited to, streptomycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, kanamycin and neomycin. An azole includes, but is not limited to, fluconazole. Quinolones include, but are not limited to, nalidixic acid, norfloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, sparfloxacin and temafloxacin. Macrolides include, but are not limited to, erythromycin, spiramycin and azithromycin. Rifamycin includes but is not limited to rifampin. Examples of tetracycline include spiccycline, chlortetracycline, chromocycline, demeclocycline, deoxycycline.),Guamecycline, limecycline, meclocycline, metacycline, minocycline, oxytetracycline, penimePisaThese include, but are not limited to, iclin, pipercycline, lolitetracycline, sancycline, senocycline and tetracycline. Sulfonamides include sulfonylamides and sulfamethones.KissaSol, sulfacetamide, sulfadiazine, sulfisoxazole and co-trimoxazole (trimethoprim / sulfamethoxysazole). Lincosamides include but are not limited to clindamycin and lincomycin. Polymyxin (polypeptide) includes, but is not limited to, polymyxin B and colistin.
[0292]
An agonist or antagonist of IL-1RA-F polypeptide function is combined with one or more cytokines, growth factors, antibiotics, anti-inflammatory agents and / or chemotherapeutic agents as appropriate to the condition being treated ( Can be used simultaneously or subsequently).
[0293]
Other diseases caused or mediated by undesirable levels of one or more IL-1, IL-1ra, or IL-1ra-R polypeptides are included within the scope of the present invention. Undesirable levels include excessive levels of IL-1, IL-1ra, or IL-1ra-R polypeptide, and subnormal levels of IL-1, IL-1ra, or IL-1ra-R polypeptide. Can be mentioned.
[0294]
(IL-1ra-R nucleic acid and IL-1ra-R polypeptideUse of)
The nucleic acid molecules of the invention, including nucleic acid molecules that themselves do not encode biologically active polypeptides, can be used to map the chromosomal location of the IL-1ra-R gene and related genes. Mapping can be performed by techniques known in the art, such as PCR amplification and in situ hybridization.
[0295]
An IL-1ra-R nucleic acid molecule (including a nucleic acid molecule that itself does not encode a biologically active polypeptide) is qualitative for the presence of an IL-1ra-R nucleic acid molecule in a mammalian tissue or body fluid sample. Alternatively, it can be useful as a hybridization probe in a diagnostic assay for testing either quantitatively.
[0296]
Other methods can also be used where it is desired to inhibit the activity of one or more IL-1ra-R polypeptides. Such inhibition is also caused by nucleic acid molecules that are complementary to the expression control sequence (triple helix formation) or IL-1ra-R mRNA and hybridize to the expression control sequence (triple helix formation) or IL-1ra-R mRNA. Can be done. For example, antisense DNA or RNA molecules, which have a sequence that is complementary to at least a portion of the IL-1ra-R gene, can be introduced into the cell. Antisense probes can be designed by available techniques using the sequences of the IL-1ra-R gene disclosed herein. Typically, each such antisense molecule is complementary to the start site (5 'end) of each selected IL-1ra-R gene. If the antisense molecule then hybridizes to the corresponding IL-1ra-R mRNA, translation of the mRNA is prevented or reduced. Antisense inhibitors provide information related to the decrease or absence of IL-1ra-R polypeptide in a cell or organism.
[0297]
Alternatively, gene therapy can be used to create dominant negative inhibitors of one or more IL-1ra-R polypeptides. In this situation, DNA encoding a variant polypeptide of each selected IL-1ra-R polypeptide can be prepared and using any of the viral or non-viral methods described herein. And can be introduced into the patient's cells. Each such variant is typically designed to compete with an endogenous polypeptide in its biological role.
[0298]
In addition, IL-1ra-R polypeptide (whether biologically active or not)IsThese polypeptides can be used as immunogens, ie these polypeptides contain at least one epitope against which antibodies can be elicited. Selective binding agents that bind to IL-1ra-R polypeptides (as described herein) can be used for in vivo and in vitro diagnostic purposes, such as body fluid samples Or includes, but is not limited to, use in a labeled form to detect the presence of IL-1ra-R polypeptide in a cell sample. These antibodies can also be used to prevent, treat, or diagnose a number of diseases and disorders, including those listed herein. These antibodies can bind to the IL-1ra-R polypeptide or bind to the polypeptide to reduce or block at least one activity characteristic of the IL-1ra-R polypeptide. At least one activity characteristic of the 1ra-R polypeptide may be increased (including by increasing the pharmacokinetics of the IL-1ra-R polypeptide).
[0299]
The IL-1ra-R polypeptides of the present invention can be used to clone IL-1ra-R polypeptide receptors using expression cloning strategies. Radioactive label (¹²⁵Iodine) IL-1ra-R polypeptide or affinity / activity-tagged IL-1ra-R polypeptide (eg, Fc fusion or alkaline phosphatase fusion) is used in binding assays to produce IL-1ra-R poly A cell type or cell line or tissue expressing the peptide receptor can be identified. RNA isolated from such cells or tissues can be converted to cDNA, cloned into a mammalian expression vector, and transfected into a mammalian cell (eg, COS or 293 cell) to produce an expression library. Generate. The radiolabeled or tagged IL-1ra-R polypeptide is then used as an affinity ligand from this library of cells expressing IL-1ra-R polypeptide receptor on its surface. Subsets can be identified and isolated. DNA can then be isolated from these cells and transfected into mammalian cells to obtain a secondary expression library (where the fraction of cells expressing the IL-1ra-R polypeptide receptor is the original Many times higher than the library). This enrichment process can be repeated iteratively until a single recombinant clone containing the IL-1ra-R polypeptide receptor is isolated. Isolation of IL-1ra-R polypeptide receptors is useful for identifying or developing novel agonists and antagonists of the IL-1ra-R polypeptide signaling pathway. Such agonists and antagonists include soluble IL-1ra-R polypeptide receptors, anti-IL-1ra-R polypeptide receptor antibodies, small molecules or antisense oligonucleotides, and are described herein as One or more of the described diseases or disorders can be used to treat, prevent, or diagnose.
[0300]
Deposit of cDNA encoding human IL-1ra-R polypeptide (with accession number PTA-1423) was published in American Type Culture Collection (ATCC) (Virginia 20110-2209, Manassas, University Boulevard 10801) 2000 I went on 29th of March.
[0301]
The following examples are intended for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.
[0302]
(Example 1: Cloning of human IL-1ra-R polypeptide gene)
In general, materials and methods as described in Sambrook et al. (Supra) were used to clone and analyze genes encoding human IL-1ra-R polypeptides.
[0303]
To isolate a cDNA sequence encoding a human IL-1ra-R polypeptide, a search of a proprietary database (Amgen, Thousand Oaks, CA) was used, using clone shos1-00003-d1 as the query sequence. went. The 423 bp sequence identified in this manner was found to share 41% identity to the query sequence at the amino acid level. Using the region of highest homology within this sequence, gene-specific oligonucleotides were designed using various PCR strategies for identification of cDNA sources and generation of cDNA clones.
[0304]
Multiple cDNA libraries were transferred to 10 ng c in a total reaction volume of 25 μl.DNALibraryTemplate DNA,Respectively10 pmolUnprimer(Amplimer): 2349-98 (5'-C-A-C-A-C-G-C-T-C-A-C-C-T-T-C-T-T-T-C -C-A-G-3 '; SEQ ID NO: 20) and 2349-99 (5'-T-A-A-A-A-C-T-T-G-G-T-A-C-G- G-G-C-T-G-A-G-G-G-3 ′; SEQ ID NO: 21), and Ready-To-Go PCR beads (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) (Pharmacia, Piscataway, NJ) Were analyzed in an amplification reaction containing Reaction, 95 ° C for 5 minutes in 1 cycle; 95 ° C for 15 seconds, 63 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 1 minute in 30 cycles; and 72 ° C for 10 minutes in 1 cycle went. PCR products of the expected size (153 bp) were generated from a number of cDNA libraries (human fetal scalp (primed with oligo-dT) and human placenta (oligo-primed and randomly primed) )).
[0305]
A fetal scalp and placenta cDNA library was prepared as follows. Total RNA is extracted from human fetal scalp and from human placenta using standard RNA extraction procedures and poly-A⁺RNA was selected from this total RNA using standard procedures. Randomly primed or oligo-dT primed cDNA isA ⁺ From RNA, the manufacturer suggested protocol using the Superscript Plasmid System (Gibco-BRL) for cDNA synthesis and plasmid cloning kitsOr other appropriate procedureWas synthesized according to The resulting cDNA is digested with appropriate restriction enzymes and then ligated into pSPORT-1, or other suitable cloning vectordid. The ligation product is purified using standard techniques. E. coli were transformed and bacterial transformants were selected on culture plates containing either ampicillin, tetracycline, kanamycin, or chloramphenicol. The cDNA library was composed of all or a subset of these transformants.
[0306]
Both 5'RACE and 3'RACE reactions were performed to generate full-length cDNA sequences for IL-1ra-R polypeptides. To isolate the cDNA sequence corresponding to the 5 'end of the cDNA sequence for IL-1ra-R polypeptide, 5'RACE was added to 10 ng oligo.-DT-The primed human fetal scalp cDNA library was transformed into pSPORT1 and primers 1572-36 (5'-GTGTGTG)−G-A-A-T-G-T-G-A-G-C-G-G-A-T-A-A-C-3 ′; SEQ ID NO: 22) and 2349-99 were used. I went. Reaction, 1 cycle at 94 ° C for 1 cycle; 5 cycles at 94 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 5 minutes; 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 3 minutes 5 cycles; 68 ° C. for 5 seconds, 68℃For 10 seconds at 72 ° C. and 3 cycles at 72 ° C. for 25 cycles; and 72 ° C. for 7 minutes in one cycle. Nested PCR was performed using a portion of the 5 ′ RACE amplification product and primer 2328-91 (5′-C-T-A-T-G-A-C-C-A-T-G-A-T. -T-A-C-G-C-C-A-A-G-C-3 '; SEQ ID NO: 23) and 2351-47 (5'-G-C-T-G-T-A-C- T-G-G-C-T-G-C-T-G-G-G-G−C-3 '; SEQ ID NO: 24). Nested PCR is 94℃1 cycle at 94 ° C; 5 cycles at 94 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 5 minutes; 5 cycles at 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 3 minutes; 25 cycles of 94 ° C. for 5 seconds, 68 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes; and 72 ° C. for 7 minutes in one cycle.
[0307]
To isolate the cDNA sequence corresponding to the 3 ′ end of the cDNA sequence for the IL-1ra-R polypeptide, 3′RACE was used with a human fetal scalp cDNA library primed with 10 ng oligo-dT. PSPORTI and primer 2351-48 (5'-C-C-T-T-C-A-G-G-C-T-T-G-A-G-G-G-C-T-G-C-T -G-3 '; SEQ ID NO: 25) and 2329-93 (5'-CGGGCGCCTCTCTCTCGTAT) T-A-C-G-C-3 ′; SEQ ID NO: 26)usingwent. Reaction is 1 cycle at 94 ° C for 1 minute; 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 5 minutes; 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 3 minutes 5 cycles; 94 ° C for 5 seconds,6825 cycles of 10 seconds at ° C and 3 minutes at 72 ° C; and 7 minutes at 72 ° C in one cycle. Nested PCR was performed using a portion of 3 ′ RACE amplification product and primer 2363-04 (5′-C-C-T-G-G-C-T-G-G-T-T-C-C-T- GT-GT−G-G-C-3 ′; SEQ ID NO: 27) and 2329-94 (5′-T-G-G-G-G-A-A-A-G-G-G-G-G-G-A-T -G-T-G-C-T-G-3 '; SEQ ID NO: 28). Nested PCR, 1 cycle at 95 ° C for 1 minute; 30 seconds at 95 ° C and 6830 cycles of 1 minute at ° C; and 7 cycles of 68 ° C for 7 minutes. Full length cDNA sequences for IL-1ra-R polypeptides were assembled from the resulting collection of 5'RACE and 3'RACE clones.
[0308]
The 5 'portion of the cDNA sequence for the IL-1ra-R polypeptide is replaced with human placenta Marathon.^TM  The cDNA sequence from the cDNA library (Clontech) was confirmed by independent isolation. To isolate the cDNA sequence corresponding to the 5 ′ end of the cDNA sequence for IL-1ra-R polypeptide, 5′RACE was isolated from 1 ng human placental cDNA as well as primer AP-1 (5′-C—C— A-T-C-C-T-A-A-T-A-C-G-A-C-T-C-A-C-T-A-T-A-G-G-G-C- 3 ′; SEQ ID NO: 29; Clontech) and 2353-87 (5′-C-C-T-T-G-G-T-G-A-G-C-T-G-T-A-C-T -G-G-C-T−G-3 '; SEQ ID NO: 30). Reaction, 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes; 5 cycles at 94 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 1.5 minutes; 5 cycles at 94 ° C for 5 seconds and 70 ° C for 1.5 minutes;25 cycles of 94 ° C. for 5 seconds and 68 ° C. for 1.5 minutes; and 86 ° C. for 7 minutes in one cycle. Nested PCR was performed using a portion of the 5 ′ RACE amplification product and primers AP-1 and 2349-52 (5′-C-C-G-G-G-G-C-A-C-A-C-A- G-G-A-A-C-C-A-3 ′; SEQ ID NO: 31). Nested PCR, 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes; 30 cycles at 94 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 1.5 minutes; and 68One cycle was performed for 7 minutes at ° C.
[0309]
Sequence analysis of the deduced cDNA sequence for human IL-1ra-R polypeptide shows that this gene has 152 amino acids.ProteinIt was shown to contain a 456 bp open reading frame (FIGS. 1A-1B) encoding. Sequence variants of human IL-1ra-R polypeptide have also been identified. Sequence analysis of this variant shows that the gene for this variant also has 152 amino acidsProteinIt was suggested to contain a 456 bp open reading frame encoding (Figures 2A-2B). The nucleotide sequence of this variant differs from the human IL-1ra-R gene at two nucleotide positions.
[0310]
4A-4B illustrate the following amino acid sequence alignment: human IL-1α (IL-1 alpha; SEQ ID NO: 7), human IL-1β (IL-1 beta; SEQ ID NO: 8), human IL-1 receptor antagonist (IL-1RA; SEQ ID NO: 9), human IL-1 δ (IL-1 delta; SEQ ID NO: 10), human IL-1ra-R polypeptide (IL-1ra-R; SEQ ID NO: 2), human Tango-77 (Tango-77; SEQ ID NO: 11), human Zilla4 (Zilla4; SEQ ID NO: 12) , Human IL-1ζ (IL-1 zeta; SEQ ID NO: 13), human IL-1 receptor antagonist β (IL-1RA) β; SEQ ID NO: 14), human SPOIL II (Spoil) II; SEQ ID NO: 15), human IL-1ε (IL-1 epsilon; SEQ ID NO: 16), and human IL-11 (IL1) eta; SEQ ID NO: 17). FIG. 5 shows IL-1ra1 schematically illustrates the phylogenetic relationship of gene families.
[0311]
Example 2: Human IL-1ra-R polypeptide geneSplice variant (variant)Cloning)
In general, human IL-1ra-R polypeptidesspliceTo clone and analyze genes encoding variantsInThe materials and methods described in Sambrook et al. (Supra) were used.
[0312]
Of human IL-1ra-R polypeptidespliceFull-length cDNA encoding the variantArrayWas isolated from a human placenta cDNA library prepared as follows. Total RNA is extracted from human placenta using standard RNA extraction procedures, and poly- from this total RNA using standard procedures.A ⁺ RNA was selected. Using the Superscript Plasmid System for the cDNA Synthesis and Plasmid Cloning Kit (Gibco-BRL) according to the manufacturer's suggested protocol, this poly-A⁺From RNA, oligo-dT primed cDNA was synthesized. The resulting cDNA was digested with NotI and then fractionated by electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The 0.8-1.6 kb fragment was isolated, purified and then ligated to pSPORT-1. The ligation product is obtained from E. coli using standard techniques. E. coli were transformed and bacterial transformants were selected on ampicillin-containing culture plates. The resulting transformants are pooled to obtain a cDNA library.ProductionAnd thenPlasmidDNA was prepared from 12 pools of this cDNA library, each containing about 80,000 colonies.
[0313]
In an amplification reaction (total reaction volume 25 μl) containing 10 ng template DNA, unprimers 2349-98 and 2349-99 (each at a concentration of 0.4 μM), and Ready-to-Go (ready to use) PCR beads In each cDNA library poolEach ofWere analyzed. The reaction was carried out in one cycle of 94 ° C. for 5 minutes; 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute; and 72 ° C. for 10 minutes in one cycle. The cDNA library pool was also transferred to 10 ng of template DNA, unprimers 2349-51 (5′-A-A-G-A-G-G-C-C-A-C-A-C-G-C-T. -TC-AC-CC-TCTC-3 '; SEQ ID NO: 32) and 2349-52 (each at a concentration of 0.4 [mu] M), and Ready-to-Go (ready to use ) Analysis in amplification reactions containing PCR beads (total reaction volume 25 μl). The reaction was carried out in one cycle of 94 ° C. for 5 minutes; 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute; and 72 ° C. for 10 minutes in one cycle. The PCR products obtained from these reactions were then analyzed on an agarose gel.
[0314]
Plasmid DNA from the three pools produced a PCR product with the expected size. And 3 x 10 from each of these positive pools⁵Clones were screened by PCR using unprimers 2349-98 and 2349-99. One of the PCR products generated by PCR (zhvt-000329)³²Labeled with P-dCTP and used as a probe, the pool of positive cDNA libraries was rescreened. Bacterial colonies were plated (at about 50,000 per 150 mm plate) and then lifted onto nitrocellulose filters. Filters were prehybridized in ExpressHyb hybridization solution (Clontech) for 30 minutes at 68 ° C and then hybridized overnight at 68 ° C in the same solution to which the labeled probe was added. After hybridization, the filter was washed twice in 2 × SSC and 0.05% SDS for 10 minutes at room temperature and then in 0.1 × SSC and 0.1% SDS for 2 minutes at 68 ° C. Washed twice. The filter was then exposed to autoradiography with an intensifying screen at −80 ° C. for 2 hours. From one of the cDNA library pools, a positive clone (RDS # 199918503) containing an approximately 1.2 kb insert was identified. A second positive clone (RDS # 199918501) containing an insert of approximately 0.8 kb in size was identified from another cDNA library pool. Plasmid DNA was prepared from each of these clones and sequence analyzed.
[0315]
Sequence analysis of the expected cDNA sequence for one of these clones showed that this cDNA encodes a variant of human IL-1ra-R polypeptide (see Example 1). The gene encoding this variant contains a 513 bp open reading frame encoding a 171 amino acid protein (FIG. 3).
[0316]
Sequence analysis of the human genome containing the IL-1ra-R gene (Genbank accession number AC016724, contig. Fragment 66649-96342) revealed that the first exon of the IL-1ra-R gene (see Example 1) was Il-1 It was shown to be 4.1 kb downstream of the last exon of Omega (Genbank accession number Z300050). Due to the close approximation of these two genes in the genome, the polypeptide becomes IL-1 omega (Omega) on the second exon of the IL-1ra-R gene, or a variant thereof (see Example 1). It is suggested that it may result from splicing (or fusion) of the first two exons of Accordingly, a variant of IL-1ra-R polypeptide is IL-1ra-R.spliceIt can be a variant, a fusion protein, and the like. The juxtaposition of the second exon in IL-1Omega and the second exon of the IL-1ra-R gene (or a variant thereof) results in a sequence encoding an N-terminal protein that appears to function as a signal peptide. FIG. 6 shows a human IL-1ra-R polypeptide (Mature CS329), a sequence variant of human IL-1ra-R polypeptide (mature CS329 variant protein), and a human IL-1ra-R polypeptide. ofspliceThe relationship between the variants (Omega 329 protein) is illustrated.
[0317]
(Example 3: Cloning of mouse IL-1ra-R polypeptide gene)
In general, for cloning and analyzing genes encoding mouse IL-1ra-R polypeptidesInThe materials and methods described in Sambrook et al. (Supra) were used.
[0318]
To isolate cDNA encoding mouse IL-1ra-R polypeptide, a 7 day old mouse embryo cDNA library template was used.G, As well as the unprimer 2557-95 (5′-A-A-G-C-C-T-T-T-T-C-T-T-C-T-T-T-T-C-C-C -T-C-A-G-T-G-3 '; SEQ ID NO: 33) and 2557-96 (5'-T-G-C-C-A-T-T-A-A-T- PCR was performed using G-T-A-A-C-A-C-G-G-T-C-A-C-A-G-3 ′; SEQ ID NO: 34), as well as standard techniques. .
[0319]
Sequence analysis of the deduced cDNA sequence of mouse IL-1ra-R polypeptide showed that this gene contained a 456 bp open reading frame encoding a 152 amino acid protein (FIG. 7). FIG. 8 illustrates an amino acid sequence alignment of human IL-1ra-R polypeptide (huIL-1ra-R; SEQ ID NO: 2) and mouse IL-1ra-R polypeptide (muIL-1ra-R; SEQ ID NO: 36). . 9A-9I illustrate the genomic nucleotide sequence of the mouse IL-1ra-R gene (SEQ ID NO: 37). The position of the code part of exons 1 to 4 is indicated (underlined).
[0320]
(Example 4: IL-1ra-R mRNA expression)
Expression of IL-1ra-R mRNA was performed using an amplification reaction containing 10 ng of cDNA library template DNA, 10 pmol of unprimers 2349-98 and 2349-99, and Ready-to-Go (ready to use) PCR beads ( It was examined by PCR in a total reaction volume of 25 μl). The reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes in one cycle; 95 ° C. for 15 seconds, 63 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 1 minute for 30 cycles; and 72 ° C. for 10 minutes for 1 cycle. Human fetal scalp, human fetal eye, humangall bladderA PCR product of the expected size (153 bp) was identified from among a number of cDNA libraries, including human placenta. IL-1ra-R mRNA expression was also detected in fetal eyes and fetal spleen by RT-PCR using amperes 2349-51 and 2349-52 and the Titan system (Boehringer). 1 cycle of 55 ° C for 30 minutes; 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 64 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 50 seconds (incremented by 2 seconds per cycle); and 68 ° C for 7 minutes in 1 cycle, Carried out.
[0321]
Expression of IL-1ra-R mRNA was examined by Northern blot analysis using human and mouse RNA blots (Clontech). The blot was first prehybridized in Pre-Hyb solution (Amersham) for 30 minutes at 65 ° C., and then 25 ng, corresponding to nucleotides 1-474 of the cDNA sequence encoding IL-1ra-R polypeptide.³²Probing overnight at 65 ° C. in the same solution containing the P-labeled probe. The probe was labeled using Redi Prime II kit (Pharmacia). After hybridization, blots were washed twice for 1 hour in 6 × SSC and 0.1% SDS, twice for 1 hour in 2 × SSC and 0.1% SDS.,Washed twice in 0.2 × SSC and 0.1% SDS for 30 minutes and then rinsed in 2 × SSC. HosHoImageroAfter overnight exposure in Northern blots (imager), an approximately 1.6 kb transcript was detected in mouse skeletal muscle (FIG. 10A), and an approximately 2.9 kb transcript was detected in human pancreas and peripheral Detection was in blood leukocytes (FIGS. 10B and 10C). In analysis of a dot blot (Clontech) using the same probe, IL-1ra-R mRNA was detected in mouse skeletal muscle, submandibular gland, and epididymis.
[0322]
IL-1ra-R mRNA expression was localized by in situ hybridization. A panel of normal embryos and adult mouse tissue was fixed in 4% paraformamide, embedded in paraffin, and sectioned at 5 μm. Sectioned tissue was permeabilized in 0.2 M HCl, digested with proteinase K, and acetylated with triethanolamine and acetic anhydride. Sections were mixed with hybridization solution (300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 1 × Denhart solution, 0.2% SDS, 10 mM DTT, 0.25 mg / ml tRNA, 25 μg / ml poly A,25 μg / ml poly C and 50% formamide) for 1 hour at 60 ° C., then 10% dextran and 2 × 10⁴cpm / μl³³Hybridize overnight at 60 ° C. in the same solution containing a P-labeled antisense riboprobe (complementary to the human IL-1ra-R gene). This riboprobe is obtained by in vitro transcription of clones containing human IL-1ra-R cDNA using standard techniques.
[0323]
Following hybridization, sections are rinsed in hybridization solution, treated with RNase A to digest unhybridized probe, and then washed in 0.1 × SSC at 55 ° C. for 30 minutes. The sections are then immersed in NTB-2 emulsion (Kodak, Rochester, NY), exposed to 4 ° C. for 3 weeks, developed, and counterstained with hematoxylin and eosin. Histomorphology and hybridization signals were determined for brain (1 sagittal and 2 coronal), gastrointestinal tract (esophagus, stomach, duodenum, jejunum, ileum, proximal colon, and distal colon), pituitary, liver Lung, heart, spleen, thymus, lymph node, kidney, adrenal gland, bladder, pancreas, salivary gland, male and female genital organs (female ovary, fallopian tube, and uterus; and maleTestis,Analyze simultaneously by dark and standard illumination for epididymis, prostate, seminal vesicles and vas deferens), BAT and WAT (subcutaneous, perirenal), bone (thigh), skin, breast, and skeletal muscle.
[0324]
Example 5: Production of IL-1ra-R polypeptide
(A. Expression of IL-1ra-R polypeptide in bacteria)
PCR is used to amplify the template DNA sequence encoding the IL-1ra-R polypeptide. This PCR uses primers corresponding to the 5 'and 3' ends of this sequence. The amplified DNA product can be modified to include a restriction enzyme site to allow insertion into the expression vector. The PCR product is gel purified and inserted into an expression vector using standard recombinant DNA methodology. A representative vector such as pAMG21 (ATCC No. 98113) containing a gene encoding the lux promoter and kanamycin resistance is digested with BamHI and NdeI for directional cloning of the inserted DNA. The ligated mixture was electroporated by E. coli. E. coli host strains are transformed and transformants are selected for kanamycin resistance. Plasmid DNA from the selected colonies is isolated and subjected to DNA sequencing to confirm the presence of the insert.
[0325]
Transformed host cells are incubated at 30 ° C. in 2 × YT medium containing 30 μg / mL kanamycin before introduction. Gene expression is induced by addition of N- (3-oxohexanoyl) -dl-homoserine lactone to a final concentration of 30 ng / mL followed by 6 hours incubation at 30 ° C or 37 ° C. Expression of IL-1ra-R polypeptide in cultureCentrifugeBacterial pellet resuspension and lysisSolution,As well as by analysis of host cell proteins by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
[0326]
Inclusion bodies containing IL-1ra-R polypeptide are purified as follows. Bacterial cells are pelleted by centrifugation and resuspended in water. The cell suspension is lysed by sonication and pelleted by centrifugation at 195,000 × g for 5-10 minutes. The supernatant is discarded and the pellet is washed and transferred to a homogenizer. The pellet is homogenized in 5 mL of Percoll solution (75% liquid Percoll and 0.15 M NaCl), then diluted and centrifuged at 21,600 × g for 30 minutes until uniformly suspended. Gradient fractions containing inclusion bodies are collected and pooled. Isolated inclusion bodies are analyzed by SDS-PAGE.
[0327]
E. A single band on an SDS polyacrylamide gel corresponding to the IL-1ra-R polypeptide produced by E. coli was excised from the gel, and the N-terminal amino acid sequence was essentially analyzed by Matsudaira et al., 1987, J. MoI. Biol. Chem. 262: 10-35.
[0328]
B. Expression of IL-1ra-R polypeptide in mammalian cells
PCR is used to amplify the template DNA sequence encoding the IL-1ra-R polypeptide. This PCR uses primers corresponding to the 5 'and 3' ends of this sequence. The amplified DNA product can be modified to include a restriction enzyme site to allow insertion into the expression vector. The PCR product is gel purified and inserted into an expression vector using standard recombinant DNA methodology. A typical expression vector containing Epstein-Barr virus origin of replication, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for expression of IL-1ra-R polypeptide in 293-EBNA-1 cells. Amplified and gel purified PCR products are ligated into the pCEP4 vector and introduced into 293-EBNA cells by lipofectin. Transfected cells are selected in 100 μg / mL hygromycin and the resulting drug resistant cultures are grown to confluence. The cells are then cultured for 72 hours in serum-free medium. Conditioned media is removed and IL-1ra-R polypeptide expression is analyzed by SDS-PAGE.
[0329]
IL-1ra-R polypeptide expression can be detected by silver staining. Alternatively, IL-1ra-R polypeptide is generated as a fusion protein with an epitope tag (eg, an IgG constant domain or FLAG epitope) that can be detected by Western blot analysis using an antibody against the peptide tag. IL-1ra-R polypeptide is excised from SDS-polyacrylamide gelGetAlternatively, the IL-1ra-R fusion protein is purified by affinity chromatography on the epitope tag and subjected to N-terminal amino acid sequence analysis as described herein.
[0330]
C. Expression and purification of IL-1ra-R polypeptide in mammalian cells
The IL-1ra-R polypeptide expression construct is introduced into 293 EBNA cells or CHO cells using either the lipofectin or calcium phosphate protocols.
[0331]
To perform functional studies on the IL-1ra-R polypeptide produced, a large amount of conditioned medium is generated from a pool of hygromycin-selected 293 EBNA cloning. The cells are cultured in 500 cm Nunc Triple Flaks until they are 80% confluent and then switched to serum-free medium one week before harvesting the medium. Conditioned medium is collected and frozen at −20 ° C. until purification.
[0332]
Conditioned medium is purified by affinity chromatography as described below. The medium is thawed and then passed through a 0.2 μm filter. The protein G column was equilibrated to pH 7.0 with PBS and then filtered media was loaded. This column is A₂₈₀Wash with PBS until absorption reaches baseline. The IL-1ra-R polypeptide is eluted from the column with 0.1 M Glycine-HCl at pH 7.2 and immediately neutralized with 1 M Tris-HCl at pH 8.5. Fractions containing IL-1ra-R polypeptide were pooled, dialyzed in PBS and stored at -70 ° C.
[0333]
For factor Xa cleavage of the human IL-1ra-R polypeptide-Fc fusion polypeptide, the affinity chromatographically purified protein was purified from 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl.₂Dialyze at pH 8.0. Restriction protease factor Xa is added to the dialyzed protein at 1/100 (w / w) and the sample is digested overnight at room temperature.
[0334]
(Example 6: Production of anti-IL-1ra-R polypeptide antibody)
Antibodies against IL-1ra-R polypeptides can be obtained by immunizing with purified proteins or IL-1ra-R peptides produced by biological or chemical synthesis. Suitable procedures for generating antibodies include those described in Hudson and Bay, Practical Immunology (2nd edition, Blackwell Scientific Publicization).
[0335]
In one procedure for antibody production, an animal (typically a mouse or rabbit) is injected with IL-1ra-R antigen (eg, IL-1ra-R polypeptide) and for hybridoma production. Sufficient serum titer determined by ELISAlevelAnimals with are selected. The spleen of the immunized animal is collected and prepared as a single cell suspension from which the spleen cells are collected. Spleen cells are fused to mouse myeloma cells (eg, Sp2 / 0-Ag14 cells), first incubated in DMEM (containing 200 U / mL penicillin, 200 μg / mL streptomycin sulfate, and 4 mM glutamine), then HAT selection medium ( Incubate in hypoxanthine, aminopterin and thymidine). After selection, tissue culture supernatant is removed from each fusion well and tested for anti-IL-1ra-R antibody production by ELISA.
[0336]
Anti-IL-1ra-RantibodyAnother procedure can also be used to obtain This procedure includes, for example, immunization of transgenic mice carrying the human Ig locus for production of human antibodies, and screening of synthetic antibody libraries (eg, libraries generated by mutagenesis of antibody variable domains). is there.
[0337]
Antibodies against IL-1ra-R polypeptides are described in E.I. It was obtained by immunizing New Zealand White rabbit with the full-length IL-1ra-R polypeptide produced and isolated in E. coli. Crude polyclonal immune serum was collected and recombinant IL-1ra-R polypeptide (FIGS. 11A-11B, lanes 1, 4, and 7), recombinant IL-1ra-R polypeptide variants (FIGS. 11A-11B, lane 2). 5, and 8) and recombinant IL-1ra (FIGS. 11A-11B; lanes 3, 6, and 9) were used for immunoprecipitation analysis. Either 10 ng (FIG. 11A, lanes 4-6) or 0.6 μg (FIG. 11B, lanes 7-9) of recombinant polypeptide loaded directly onto an 18% Tris-Glycine gel, or sample on the gel Gels were prepared by immunoprecipitation of 1 μg of recombinant polypeptide with 0.2 μl of crude antiserum (FIG. 11A, lanes 1-3). After SDS-PAGE separation, the gel was blotted onto a PVDF membrane and coarseAntiUsing a 1: 1000 dilution of IL-1ra-R serumColorFollowed by HRP-conjugated protein A and ECLsodetectiondid. The gel shown in FIG. 11B was stained with Gelcode Blue (Pierce) after blotting. Antibodies against IL-1ra-R polypeptide have been shown to detect both membrane-fixed IL-1ra-R polypeptide and IL-1ra-R polypeptide variants, but not IL-1ra. In solution, the IL-1ra-R polypeptide was recognized more efficiently than the IL-1ra-R polypeptide variant.
[0338]
(Example 7: Expression of IL-1ra-R polypeptide in transgenic mice)
To evaluate the biological activity of IL-1ra-R polypeptide, a construct encoding an IL-1ra-R polypeptide / Fc fusion protein is prepared under the control of a liver-specific ApoE promoter. Delivery of this construct is expected to produce pathological changes that are information regarding the function of the IL-1ra-R polypeptide. Similarly, a construct containing the full length IL-1ra-R polypeptide is prepared under the control of the β-actin promoter. By delivery of this construct,HenExpected to produce sexual expression.
[0339]
To generate these constructs, PCR is used to amplify the template DNA sequence that encodes the IL-1ra-R polypeptide. This PCR uses primers corresponding to the 5 'and 3' ends of the desired sequence. This sequence then incorporates a restriction enzyme site to allow insertion of the amplification product into the expression vector. Following amplification, the PCR product is gel purified, digested with appropriate restriction enzymes, and ligated into an expression vector using standard recombinant DNA techniques. For example, amplified IL-1raR polypeptide sequences can be obtained from Graham et al., 1997, Nature Genetics, 17: 272-74 and Ray et al., 1991 Genes Dev. 5: 2265-73, which can be cloned into an expression vector under the control of the human β-actin promoter.
[0340]
After ligation, the reaction mixture is used to E. coli host strains are transformed by electroporation and transformants are selected for drug resistance. Plasmid DNA from selected colonies is isolated and subjected to DNA sequencing to confirm the presence of the appropriate insert and the absence of mutations. The IL-1ra-R polypeptide expression vector is purified through two rounds of CsCl density gradient centrifugation, cleaved with the appropriate restriction enzyme, and the linear fragment containing the IL-1ra-R polypeptide transgene is gelled. Purify by electrophoresis. The purified fragment is resuspended in 5 mM Tris (pH 7.4) and 0.2 mM EDTA at a concentration of 2 mg / mL.
[0341]
Single cell embryos from BDF1 × BDF1 mating mice are injected as described (PCT Publication No. WO 97/23614). Embryo with CO₂Culture overnight in an incubator and transfer 15-20 2-cell embryos to the fallopian tubes of pseudopregnant CD1 female mice. Offspring obtained from implantation of microinjected embryos are screened by PCR amplification of the transgene incorporated into the genomic DNA sample as follows. Ear sections are digested overnight at 55 ° C. in 20 mL ear buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, and 500 mg / mL proteinase K). The sample is then diluted with 200 mL TE and 2 mL ear sample is used in a PCR reaction with appropriate primers.
[0342]
At 8 weeks of age, transgenic founder animals and control animals are sacrificed for necropsy and pathological analysis. A portion of the spleen is removed and total cellular RNA is isolated from the spleen using a Total RNA Extraction Kit (Qiagen) and transgene expression is determined by RT-PCR. RNA recovered from the spleen was superscripted as follows:^TMConvert to cDNA using Preamplification System (Gibco-BRL). Appropriate primers (located in the expression vector sequence and 3 'of the IL-1ra-R polypeptide transgene) are used to prime cDNA synthesis from the transgene transcript. 10 mg total spleen RNA from transgenic founder animals and controls is incubated with 1 mM primers for 10 minutes at 70 ° C. and placed on ice. The reaction was then added to 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl.₂Supplement with 10 mM each dNTP, 0.1 mM DTT, and 200 U SuperScriptII reverse transcriptase. After incubation at 42 ° C. for 50 minutes, the reaction is stopped by heating at 72 ° C. for 15 minutes and digested with 2 U RNase H for 20 minutes at 37 ° C. The sample is then amplified by PCR using primers specific for the IL-1ra-R polypeptide.
[0343]
Example 8: Biological activity of IL-1ra-R polypeptide in transgenic mice
Prior to euthanasia, the transgenic animals are weighed, anesthetized with isofluorane, and bled by cardiac puncture. Samples are subjected to hematology and serum chemistry analysis. X-rays are taken after final exsanguination. meatEyesightDuring autopsy, the major internal organs are subjected to gravimetric analysis.
[0344]
meatEyesightAfter autopsy, tissues (ie, liver, spleen, pancreas, stomach, entire gastrointestinal tract, kidney, reproductive organs, skin and mammary gland, bone, brain, heart, lung, thymus, trachea, esophagus, thyroid, adrenal gland, bladder, lymph nodes And skeletal muscle) and are fixed for histological examination in 10% buffered Zn-formalin. After fixation, the tissue is processed in a paraffin block and 3 mm sections are obtained. All sections are stained with hematoxylin and eosin and then subjected to histological analysis.
[0345]
Spleens, lymph nodes and Peer plaques from both transgenic and control mice are subjected to immunohistological analysis for B cell specific antibodies and T cell specific antibodies as follows. Formalin-fixed paraffin-embedded sections are deparaffinized and hydrated in deionized water. Sections are quenched with 3% hydrogen peroxide, blocked with Protein Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA) and incubated in rat monoclonal anti-mouse B220 and CD3 (Harlan, Indianapolis, IN). Antibody binding is detected with biotinylated rabbit anti-rat immunoglobulin and peroxidase-conjugated streptavidin (BioGenex, San Ramon, Calif.) Using DAB (BioTek, Santa Barbara, Calif.) As a chromogen. Sections are counterstained with hematoxylin.
[0346]
After necropsy, MLN and sections of spleen and thymus from transgenic animals and control littermates are removed. A single cell suspension is prepared by gently crushing this tissue against the bottom of a 100 mm nylon cell strainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) using the flat end of a syringe. Cells are washed twice, counted and then approximately 1 × 10 6 from each tissue⁶Cells are incubated for 10 minutes with 0.5 μg CD16 / 32 (FcγIII / II) Fc block in a 20 μL volume. Samples were then conjugated to FITC or PE, monoclonal antibodies against CD90.2 (Thy-1.2), CD45R (B220), CD11b (Mac-1), Gr-1, CD4 or CD8 (PharMingen, 100 μL volume of PBS (Ca) with 0.5 μg antibody from San Diego, Calif.)⁺And Mg⁺Stain for 30 minutes at 2-8 ° C. in 0.1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide. Following antibody binding, cells are washed and then analyzed by flow cytometry on a FACScan (Becton Dickinson).
[0347]
Example 9: Functionalization of IL-1ra-R polypeptide
In order to evaluate whether IL-1ra-R polypeptides affect cellular responses to IL-1, IL-18 or other cytokines, the following experiment was performed. Initially, mouse bone marrow cells were transduced with the IL-1ra-R gene by retroviral infection as previously described (Yan et al., 1999, Exp. Hematol. 27: 1409-17). The transduced bone marrow was then used to transplant into lethally irradiated recipient mice. Once hematopoiesis is restored, bone marrow and spleen cells from IL-1ra-R-transduced and control mice (ie, mice transduced with an empty retroviral vector) were analyzed in a series of analyzes (FACS analysis (FIG. 12), colonies). It was subjected to the assay (FIGS. 13A-13B) and γ-interferon production depending on either IL-12 (FIG. 14) or IL-12 + IL-18 (FIG. 15).
[0348]
This data indicates that the expression of IL-1ra-R gene is a specific subset of hematopoietic progenitors in the spleen (most notably G-CSF induced GM-CFC; SCF / Epo was BFU-E / CFU- And CSF-1 induced M-CFC) and a specific subset of hematopoietic progenitors in the bone marrow (IL-3 and G-CSF induced GM-CFC; SCF / Epo BFU- It suggests that E / CFU-Mix is induced and IL-3 / Epo affects the relative amount and / or cytokine response of GM-CFC / CFU-Mix).
[0349]
IL-1ra-R polypeptide expression also reduced CD4 and NK1.1 surface expression on splenocytes, and splenocytes expressed γ-interferon in response to IL-12 alone or IL-12 + IL-18. Correlates with decreased ability to produce.
[0350]
Although the invention has been described with reference to preferred embodiments, it will be understood that variations and modifications will occur to those skilled in the art. Therefore, it is intended that the appended claims cover all such equivalent variations that fall within the scope of the invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A-1B shows the nucleotide sequence of the human IL-1ra-R gene (SEQ ID NO: 1) and the deduced amino acid sequence of the human IL-1ra-R polypeptide (SEQ ID NO: 2).
2A-2B shows the nucleotide sequence of a human IL-1ra-R gene variant (SEQ ID NO: 3) and the deduced amino acid sequence of the human IL-1ra-R polypeptide encoded by this variant (FIG. SEQ ID NO: 4) is shown.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the human IL-1ra-R splice variant (SEQ ID NO: 5) and the deduced amino acid sequence of the human IL-1ra-R polypeptide encoded by this splice variant (sequence) Number 6).
4A-4B are human IL-1α (IL-1_alpha; SEQ ID NO: 7), human IL-1β (IL-1_beta; SEQ ID NO: 8), human IL-1 receptor antagonist (IL-1RA; sequence) No. 9), human IL-δ (IL-1_delta; SEQ ID NO: 10), human IL-1ra-R polypeptide (IL-1ra-R; SEQ ID NO: 2), human Tango-77 (Tango-77; SEQ ID NO: 11) ), Human Zilla4 (Zilla4; SEQ ID NO: 12), human IL-1ζ (IL-1_zeta; SEQ ID NO: 13), human IL-1 receptor antagonist β (IL-1RA_beta; SEQ ID NO: 14), human SPOIL II (soil_II; sequence) No. 15), human IL-1ε (IL-1_epsilon; SEQ ID NO: 16), and human The amino acid alignment of IL-1η (IL-1_eta; SEQ ID NO: 17) is shown.
FIG. 5 graphically illustrates the phylogenetic correlation of the IL-ra gene family.
FIG. 6 shows human IL-1ra-R polypeptide (Mature CS329), human IL-1ra-R polypeptide sequence variant (Mature CS329 variant protein) and human IL-1ra-R polypeptide. The correlation between the peptide splice variant (Omega 329 protein) is shown graphically.
FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the mouse IL-1ra-R gene (SEQ ID NO: 35) and the deduced amino acid sequence of the mouse IL-1ra-R polypeptide (SEQ ID NO: 36).
FIG. 8 shows human IL-1ra-R polypeptide (huIL-1ra-R; SEQ ID NO: 2) and mouse IL-1ra-R polypeptide (muIL-1ra-R; SEQ ID NO: 36). Amino acid sequence alignment is shown.
FIGS. 9A-9I show the genomic nucleotide sequence for the mouse IL-1ra-R gene (SEQ ID NO: 37). Code of exon 1-4portionIndicates the position (underlined).
Figures 10A-10C are Northern blots.analysisShows IL-1ra-R mRNA expression in mice (FIG. 10A) and human (FIGS. 10B-10C) detected by.
FIGS. 11A-11B show the results of Western blot analysis using anti-IL-1ra-R antibodies.
FIG. 12 shows the use of a retroviral vector containing the IL-1ra-R gene.TransductionThe result of the FACS analysis of the spleen cell and the bone marrow cell collect | recovered from the recipient mouse | mouth to which the mouse | mouth bone marrow cell transplanted was lethally irradiated is shown. lymphballThe percentage of cells in these fractions is shown for cells subjected to standard FACS analysis using the indicated cell surface markers.
FIG. 13A shows the use of a retroviral vector containing the IL-1ra-R gene.TransductionThe results of a colony assay performed on spleen cells and bone marrow cells collected from lethal irradiated recipient mice transplanted with cultured mouse bone marrow cells are shown. Bone marrow and splenocytes from transduced and control mice were cultured under standard colony assay conditions and colonies were counted on day 14.
FIG. 13B shows the use of a retroviral vector containing the IL-1ra-R gene.TransductionThe results of a colony assay performed on spleen cells and bone marrow cells collected from lethal irradiated recipient mice transplanted with cultured mouse bone marrow cells are shown. Bone marrow and splenocytes from transduced and control mice were cultured under standard colony assay conditions and colonies were counted on day 14.
FIG. 14 shows the use of a retroviral vector containing the IL-1ra-R gene.TransductionFor IL-12 treatment in splenocytes harvested from lethal irradiated recipient mice transplanted with cultured mouse bone marrow cellsAs a responseThe production of γ-interferon is shown. Conditioned media samples were grown for 48 hours in the presence of IL-12 (1 ng / ml) (2 × 10⁶Cells / well / ml) and IFN-γ was quantified by ELISA.
FIG. 15 shows the use of a retroviral vector containing the IL-1ra-R gene.TransductionAgainst IL-12 and IL-18 treatment in splenocytes harvested from lethal irradiated recipient mice transplanted with cultured mouse bone marrow cellsAs a responseThe production of γ-interferon is shown. A sample of conditioned medium was grown for 48 hours in the presence of IL-12 (1 ng / ml) and IL-18 (10 ng / ml) (2 × 10⁶Cells / well / ml) and IFN-γ was quantified by ELISA.
[Sequence Listing]

Claims (39)

An isolated nucleic acid molecule comprising:
(A) the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 35;
(B) the nucleotide sequence of the DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423;
(C) a nucleotide sequence encoding the polypeptide represented by any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36;
(D) a nucleotide sequence that hybridizes to the complement of any of (a) to (c) under moderate or highly stringent conditions, wherein the nucleotide sequence is of (a) to (c) A nucleotide sequence that encodes a polypeptide having the function of a polypeptide encoded by any nucleotide sequence, wherein the function is to modulate cytokine content and / or response; and (e) (a)-( a nucleotide sequence complementary to any of c),
An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:   A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 1.   A host cell comprising the vector of claim 2.   4. The host cell according to claim 3, which is a eukaryotic cell.   4. The host cell according to claim 3, which is a prokaryotic cell.   A process for producing an IL-1ra-R polypeptide comprising culturing a host cell according to claim 3 under conditions suitable for expressing the polypeptide, and optionally, Isolating said polypeptide from the culture.   A polypeptide produced by the process of claim 6.   7. The process of claim 6, wherein the nucleic acid molecule is a promoter DNA for a native IL-1ra-R polypeptide operably linked to DNA encoding the IL-1ra-R polypeptide. A process comprising promoter DNA other than   A process for determining whether a compound inhibits IL-lra-R polypeptide activity or IL-lra-R polypeptide production comprising the steps of any of claims 3, 4 or 5 Exposing the cell of the description to the compound and measuring IL-1ra-R polypeptide activity or IL-1ra-R polypeptide production in the cell. An isolated polypeptide comprising:
(A) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36; and (b) the amino acid sequence encoded by the DNA insert in ATCC Accession No. PTA-1423,
An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:   An isolated polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of claim 1, wherein the polypeptide is any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. An isolated polypeptide having the activity of the indicated polypeptide.   11. An antibody or fragment thereof that specifically binds to the polypeptide of claim 10.   The antibody or fragment thereof according to claim 12, which specifically binds to a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36, or a fragment thereof.   The antibody of claim 12, which is a humanized antibody.   The antibody according to claim 12, which is a human antibody or a fragment thereof.   The antibody according to claim 12, which is a polyclonal antibody or a fragment thereof.   The antibody according to claim 12, which is a monoclonal antibody or a fragment thereof.   The antibody according to claim 12, which is a chimeric antibody or a fragment thereof.   The antibody according to claim 12, which is a CDR-grafted antibody or a fragment thereof.   The antibody according to claim 12, which is an anti-idiotype antibody or a fragment thereof.   The antibody of claim 12, which is a variable region fragment.   The antibody of claim 21, wherein the variable region fragment is a Fab fragment or a Fab 'fragment.   An antibody or fragment thereof comprising at least one complementarity determining region having specificity for a polypeptide having the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36.   The antibody of claim 12 conjugated to a detectable label. 13. The antibody of claim 12, which antagonizes a biological activity of an IL-1ra-R polypeptide. An antibody produced by immunizing a non-human animal with a polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 36. A hybridoma that produces an antibody capable of binding the polypeptide of claim 1.   A method for detecting or quantifying the amount of IL-1ra-R polypeptide using the anti-IL-1ra-R antibody or fragment according to claim 12.   A polypeptide comprising a derivative of the polypeptide of claim 10, wherein the polypeptide is covalently modified with a water-soluble polymer.   30. The polypeptide of claim 29, wherein the water soluble polymer is polyethylene glycol, monomethoxy polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly- (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene. A polypeptide selected from the group consisting of an oxide / ethylene oxide copolymer, a polyoxyethylated polyol, and polyvinyl alcohol.   A viral vector comprising the nucleic acid molecule of claim 1.   A fusion polypeptide comprising the polypeptide of claim 10 fused to a heterologous amino acid sequence.   33. The fusion polypeptide of claim 32, wherein the heterologous amino acid sequence is an IgG constant domain or a fragment thereof. A kit for detecting an IL-1ra-R polypeptide for a pathological condition or susceptibility to a pathological condition in a subject, the kit comprising:
(A) an IL-1ra-R polypeptide selective binding agent that binds to a polypeptide of claim 10 or a polypeptide encoded by the nucleic acid of claim 1 in a sample; and (b) use. Instructions to show how,
A kit comprising: The device, the following:
A membrane suitable for transplantation; and (b) a cell encapsulated within the membrane, wherein the cell secretes the protein of claim 10;
With
The device wherein the membrane is permeable to the protein and impermeable to substances harmful to the cells. A method for identifying a compound that binds to an IL-1ra-R polypeptide comprising:
(A) contacting the polypeptide of claim 10 with a compound; and (b) determining the extent of binding of the IL-1ra-R polypeptide to the compound;
Including the method.   38. The method of claim 36, further comprising determining the activity of the polypeptide when bound to the compound.   A transgenic non-human mammal comprising the nucleic acid molecule of claim 1, wherein the transgenic non-human mammal is selected from the group consisting of mouse, rat, rabbit, goat and sheep. Human mammal.   39. A process for determining whether a compound inhibits IL-1ra-R polypeptide activity or IL-1ra-R polypeptide production, wherein the transgenic mammal of claim 38 is exposed to the compound. And measuring IL-1ra-R polypeptide activity or IL-1ra-R polypeptide production in said mammal.

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