JP3841556B2 - Immunological examination method and immunological examination kit - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便、迅速に且つ高精度、高感度で被検試料中の検査対象物の検出を行い得る免疫学的検査方法およびそのためのキットに関する。より詳細には、本発明は検出シグナルを増幅させる工程を含む免疫クロマトグラフ法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料等の免疫学的分析法において、迅速且つ簡便にその検査を行う方法として免疫クロマトグラフ法が挙げられる。この方法は、一般に以下のような工程を含む。すなわち、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基材からなる検査片の一端より、該検査対象物に特異的に結合し得る標識された抗体と被検試料との混合物を吸収させて展開すると、該混合物中で形成された標識抗体−検査対象物複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕捉される。したがって、該固定相に結合した標識抗体を測定することにより被検試料中の検査対象物を測定することができる。
【０００３】
また、上記免疫クロマトグラフ法の検出シグナルをより高感度で得るための方法として、特開平１０−０６２４１９号において、二種の標識抗体を用いる方法が開示されている。つまり、検査対象物と特異的に結合し得る抗体を標識した第一標識抗体と、該抗体に特異的に結合し得る二次抗体を標識した第二標識抗体とを、検査片中の被検試料滴下部と固定相（該検査対象物と特異的に結合し得る別の抗体が固定化されている）の間に標識相としてそれぞれ設置した（吸収させた）構成である。試料中の検査対象物は、第一標識抗体と複合体を形成した後、さらに第二標識抗体が第一標識抗体に結合して（被検物−第一標識抗体−第二標識抗体）の複合体を形成する。該免疫複合体は固定相上に固定化された抗体により捕捉される。したがって、固定相上で第二標識抗体により増幅させたシグナルが検出される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のシグナル増幅免疫クロマトグラフ法によってもまだ十分な検出感度が得られていないのが現状である。さらに、被検試料が糞便、尿、血液等の場合、前処理として試料を適当な緩衝液に懸濁する等の操作が必要となり、迅速性に欠けるといった問題点もある。したがって、本発明の目的は、免疫クロマトグラフ法に関し、より迅速に、且つ高感度で検査対象物を検出することが可能な免疫学的検査方法およびそのためのキットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく種々検討を重ねた結果、従来のシグナル増幅免疫クロマトグラフ法において十分な感度が得られないのは、二種の標識抗体による立体障害のために、検査対象物と固定相に固定化された第一の抗体との結合効率、すなわち検査対象物の固定相での捕捉率が低下すること、および／または吸水性基材上で二種の標識抗体を含む免疫複合体が目詰まりを起こすことによるのではないかと想到した。そこで本発明者らは、上記の免疫クロマトグラフ法において、第一および第二標識抗体を検査片から分離し、逆に被検試料を予め固定相と該検査片の一端との間に吸収させるか塗布しておき、該吸水性基材の該一端から第一標識抗体を含有する液を展開し、該吸水性基材上で形成される検査対象物と第一標識抗体との免疫複合体を、固定相に固定化された該検査対象物に特異的な抗体で捕捉した後、さらに第二標識抗体を含有する液を検査片に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体に第二標識抗体を結合させることにより、二種の標識抗体による立体障害や免疫複合体の目詰まりを生じないように工夫した。その結果、固定相上での検出シグナルが従来よりも効率よく増幅され、より高感度に検査対象物を検出できることを見出して、本発明を完成するに至った。また、本法によれば、被検試料の前処理を必要としないことから、従来よりも検出までに要する時間を短縮することができた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方法：
(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と、該固定相との間の任意の領域に被検試料を吸収させるかまたは塗布し、
(2) 該吸水性基材の該一端から、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液を吸収させて展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検出対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、
(5) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。
２．第一および第二標識免疫化学的成分中の標識物質が同一のものである上記１の方法。
３．検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）および該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含み、以下の工程を含む免疫学的検査方法に使用され得る免疫学的検査用キット：
(1) 該吸水性基材の一端と、該固定相との間の任意の領域に被検試料を吸収させるかまたは塗布し、
(2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識免疫化学的成分を含有する液を吸収させて展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 第二標識免疫化学的成分を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、
(5) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。
４．第一および第二標識免疫化学的成分中の標識物質が同一のものである上記３のキット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫学的検査方法の各工程において下記の反応、すなわち免疫複合体形成が行われる。
(1) 検査すべき被検試料を、固定相の前方に吸収させるか塗布する（図１Ａ）。
(2) 吸水性基材の一端（固定相よりも被検試料を吸収させるか塗布した箇所により近い方の端）から第一標識免疫化学的成分含有液を吸収させ展開すると（図１Ａ）、第一標識免疫化学的成分は液の移動とともに吸水性基材中を移動して、被検試料中の検査対象物と結合して免疫複合体を形成する（図１Ｂ）。
(3) 移動してきた免疫複合体は、固定相上で固定相に固定化された第一の免疫化学的成分とさらに結合し、新たに第一標識免疫化学的成分−検査対象物−第一の免疫化学的成分からなる免疫複合体を形成して固定相上に捕捉される（図１Ｃ）。
(4) さらに第二標識免疫化学的成分含有液を吸収させ展開すると（図１Ｄ）、第二標識免疫化学的成分は液の移動とともに吸水性基材中を移動して、固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分と結合する（図１Ｅ）。
(5) このように固定相に捕捉されることによって、第一および第二標識免疫化学的成分を構成する標識物質は一カ所に集合、結合して検出シグナルが増幅され、それによって検査対象物の存在をより高感度に検出することが可能となる（図１Ｅ）。
【０００８】
本発明の方法により検出され得る検査対象物は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反応）により第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分と結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得るものであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大腸菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物またはそれらに対する抗体、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチド等が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法において、固定相に固定化される第一の免疫化学的成分と、第一標識免疫化学的成分として用いる第二の免疫化学的成分は、いずれも抗原抗体反応により検査対象物と特異的に結合し得る物質であれば特に制限はない。検査対象物が抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハプテンなど）であれば、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗原と特異的に結合し得る抗体である。該抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また本発明における抗体とは、検査対象物との特異的親和性を保持する抗体の断片物、例えばＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆab、Ｆ(ab') 2 、ＶH 、ＶL 等も含むものとする。一方、検査対象物が抗体である場合には、第一および第二の免疫化学的成分は、該抗体と特異的に結合し得る抗原もしくは該抗体を抗原として特異的に結合し得る二次抗体である。第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学的成分は、検査対象物に応じてサンドイッチ法などで用いられる自体公知のものを適宜選択すればよい。また、該免疫化学的成分が抗体であれば、単離された検査対象物を感作抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調製することもできる。第一、第二および第三の免疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および第二の抗体は、用いる抗体の種類や検査対象物によっても異なるが、同一の抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることも、また、異なる抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもできる。より好ましくは、異なる抗原決定基を認識するものが使用される。
【００１０】
第二標識免疫化学的成分として用いる第三の免疫化学的成分は、第一標識免疫化学的成分中の第二の免疫化学的成分に対して特異的に結合する免疫化学的成分であり、且つ固定化された第一の免疫化学的成分とは結合しない免疫化学的成分である。第三の免疫化学的成分は、間接免疫測定法で二次抗体として用いられる従来公知のものを適宜選択することができる。また、第二の免疫化学的成分を感作抗原として、公知の抗体作製技術を用いて調製することもできる。第一、第二および第三の免疫化学的成分がいずれも抗体であり、第三の抗体に抗ＩｇＧ抗体を用いる場合には、第一の抗体と第二の抗体の由来動物種は互いに異なるものであることが好ましい。
【００１１】
本発明において用いられる吸水性基材は、検査対象物を含有する被検試料、例えば、食品から抽出した溶液やその培養上清、便懸濁（溶解）液、血漿、血清、尿などを液体試料、あるいはこれらを適当な緩衝液によって希釈してなる希釈液、並びに第一標識免疫化学的成分、第二標識免疫化学的成分をそれぞれ含有する液を吸収できるものであれば特に限定されない。本発明においては、被検試料中の検査対象物が標識免疫化学的成分や固定相に固定化された第一の免疫化学的成分と十分な反応を行うための時間を確保できるような吸水性基材が好ましく用いられる。
【００１２】
吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述するように被検試料が固定相に到達するのに長時間を要し、その結果、迅速な測定を行うことができない。一方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合には、被検試料中の検査対象物が標識免疫化学的成分や固定相の第一免疫化学的成分と十分な反応を行うために必要な時間が不足するので、正確な測定を行うことが困難である。
【００１３】
したがって、本発明における吸水性基材の好ましい吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度である。
【００１４】
本発明の吸水性基材の好ましい具体例としては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などが挙げられる。これらの基材は適度な吸水速度を有するとともに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有するものである。
【００１５】
また、これらの基材の吸水性を調整するために、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意の接着手段によって接合して得られる連続した基材を用いることもできる。
【００１６】
本発明において、吸水性基材の形状は、被検試料を展開できる形状であれば特に限定されるものではなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状などが好ましい。
【００１７】
本発明において、固定相とは、検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が吸水性基材上に固定化された領域を意味する。第一の免疫化学的成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定化相の作製方法）も特に限定されるものではないが、従来から知られている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であり、特に、該免疫化学的成分が基材から脱離しにくいという点で共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が上記共有結合法のための官能基を有しないときは、例えば適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させることができる。また、第一の免疫化学的成分および親水性重合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製することもできる。上記親水性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。また、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エーテルなどを用いることができる。
【００１８】
本発明において、上記固定相と、被検試料液および第一標識免疫化学的成分含有液の混合物、並びに第二標識免疫化学的成分含有液の吸収が開始される部位（以下、吸液部という）との間の距離は特に限定されないが、好ましくは１〜６ｃｍ、より好ましくは３〜４ｃｍ程度である。距離があまりに遠すぎると、固定相まで被検試料が到達しなかったり、検出シグナル感度が強すぎたり、あるいは測定に時間がかかる等の問題を生じるおそれがある。一方、距離が近すぎると固定相の発色が均一ではなくまばらになったり、検出シグナル感度が低すぎるという問題を生じるおそれがある。
【００１９】
吸液部としては、被検試料や標識免疫化学的成分を含有する液の吸水性基材への移動を妨げるものでなければ特に限定されず、基材と兼用したものであっても、新たに不織布や織布等を該吸水性基材に接着させたものであってもよい。本発明において、検査対象物に特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が固定化された固定相、並びに吸液部を有する吸水性基材を、以下、本発明の免疫学的検査片または単に検査片という場合もある。
【００２０】
本発明の方法における第一標識免疫化学的成分は、検査対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものであり、また、第二標識免疫化学的成分は、該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る免疫化学的成分（第三の免疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。ここで用いられる標識物質は、免疫化学的測定法において常套的に使用されるいかなる標識物質であってもよく、例えば着色粒子、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）などが挙げられるが、効率のよい検出シグナルの増幅を達成するためには、第一および第二標識免疫化学的成分に使用される標識物質は同一のものであることが好ましい。本発明の方法では、迅速な検出を行う意味で、標識物質として着色粒子が好ましく使用される。着色粒子は肉眼で検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、金、銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブルーやスダンレッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックスなどを用いることができる。目視確認性の点からは、金コロイドや青、赤、緑もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスの使用が好ましく、また、分散安定性や検査対象物の検出感度の調節が容易であるなどの点を考慮すると、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体からなる着色ラテックスを使用することがさらに望ましい。
【００２１】
着色粒子の粒径は、検出の際の発色がよく且つ吸水性基材の吸水性を低下させない程度の該基材中での移動性を有するものであれば特に制限はないが、保存安定性や調製が容易であるなどの点から、好ましくは０．０１〜３μｍ、より好ましくは０．０５〜０．５μｍの範囲が例示される。粒径があまりに小さすぎると、１粒子あたりの着色の程度が少ないので、固定相に結合しても発色の程度が悪く目視確認性に劣るようになる。また、粒径が大きすぎると、着色粒子がわずかに凝集しただけで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させたり、非特異的発色を生じたりすることがある。
【００２２】
第二および第三の免疫化学的成分のそれぞれを、このような着色粒子で標識する方法としては、従来公知の方法、例えば共有結合法、物理的吸着法、イオン結合法等を使用することができるが、免疫化学的成分からの着色粒子の脱離がなく安定であるという点から共有結合法がより好ましく用いられる。
【００２３】
本発明の方法において、被検試料中の複数の検査対象物を検出するために、対応する複数の免疫化学的成分をそれぞれ別の着色粒子で標識することができるが、この際に用いられる着色粒子は同一色であっても異なる色であってもよい。同一色の着色粒子を用いる場合、各検査対象物にそれぞれ特異的に結合し得る免疫化学的成分を固定化した固定相を識別可能な程度に離して設置することが望ましい。
【００２４】
標識物質が酵素や蛍光物質の場合には、固定相の標識物質の検出は、ＥＩＡや蛍光抗体法（ＦＩＡ）で従来使用されている検出手段が適宜選択される。
【００２５】
第一標識免疫化学的成分含有液および第二標識免疫化学的成分含有液は、各標識免疫化学的成分を適当な分散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製される。標識免疫化学的成分を分散させる分散媒は、検査対象物と第一標識免疫化学的成分および第一標識免疫化学的成分と第二標識免疫化学的成分の抗原抗体反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応に適したｐＨおよび塩濃度を有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検出時の各標識免疫化学的成分濃度は０．００５〜５％、好ましくは０．０１〜０．５％の範囲である。濃度があまりに低すぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでなく過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグナルを不明瞭にする等の問題を生じる。なお、以下、標識免疫化学的成分含有液を単に標識免疫化学的成分液という。
【００２６】
本発明の免疫学的検査用キットは、本発明の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該キットは、少なくとも下記の内容を含むものである。
(a) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上のある領域に設けた吸水性基材
(b) 該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）
(c) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）
該吸水性基材、第一および第二標識免疫化学的成分の好ましい態様は、上記したような本発明の免疫学的検査方法において好ましく用いられるものである。
【００２７】
本発明のキットは、上記の内容物以外に、本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一および第二標識免疫化学的成分を分散させるのに好ましく使用される上記の緩衝液などが挙げられる。
【００２８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
実施例１ 免疫学的検査用キットの作製
（１）第一標識免疫化学的成分液の作製
青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径０．１μｍ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）１ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌヤギＩｇＧ抗大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.製、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応させた後、洗浄液としてホウ酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテックス粒子標識抗大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７抗体を作製した。得られたラテックス粒子標識抗体は、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に、固形分濃度２重量％となるように懸濁した。
【００３０】
（２）第二標識免疫化学的成分液の作製
上記（１）と同様にして、青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径０．１μｍ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）１ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.製、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中）１ｍｌを加えて１０℃で３時間反応させた後、洗浄液としてホウ酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて遠心分離洗浄を行い、青色着色ラテックス粒子標識抗ヤギＩｇＧ抗体を作製した。得られたラテックス標識抗体は、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）に、固形分濃度２重量％となるように懸濁した。
【００３１】
（３）検査片の作製
ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所に、１ｍｇ／ｍｌウサギＩｇＧ抗大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７抗体（Capricorn 社製、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中）０．５μｌを、ディスペンサーを用いてライン状に塗布した。このメンブレンを１重量％ウシ血清アルブミンおよび０．１重量％ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）からなる水溶液中に１０分間浸漬させた後、４０℃で２時間乾燥させた。
次いで、このメンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）に、ポリエステルフィルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせた。さらに、抗体塗布箇所反対端から０〜８ｍｍの箇所にポリエステル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）を貼り合わせて検査片を作製した。
【００３２】
実施例２ 免疫学的検査用キットによる大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７の検出
０．９重量％ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に大腸菌Ｏ−１５７：Ｈ７株を表１に示した各濃度で分散させた被検試料を調製した。この被検試料２μｌを実施例１の（３）で作製した免疫学的検査片の表面側に、抗体塗布箇所の反対側から１２〜２０ｍｍの部分に吸収させた。次いで、実施例１の（１）で作製した第一標識抗体液を、固形分濃度０．０２重量％となるように０．９重量％ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した後、該希釈液６０μｌを、検査片のポリエステル不織布部に滴下した。第一標識抗体液が被検試料と接触しさらに展開した後、実施例１の（２）で作製した第二標識抗体液を、固形分濃度０．０２重量％となるように０．９重量％ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液６０μｌを、上記ポリエステル不織布部に滴下し、２０分後に固定相上での発色の有無を目視観察した。その結果を表１に示す。比較例として、第二標識抗体を用いず、第一標識抗体のみを使用した場合の測定結果を並べて示している。
【００３３】
【表１】
【発明の効果】
本発明のキットを用いた免疫クロマトグラフ法は、被検試料を予め検査片に吸収させるか塗布しておき、そこにまず第一標識免疫化学的成分液を展開して、形成される検査対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該検査対象物に特異的な免疫化学的成分で捕捉した後、さらに第二標識免疫化学的成分液を検査片に展開して、固定相上に捕捉された免疫複合体に第二標識免疫化学的成分を結合させるので、二種の標識免疫化学的成分による立体障害や免疫複合体の目詰まりといった従来法において起こり得る検出上の問題点を回避することができ、その結果、より高感度に検査対象物を検出することができる。また、本法によれば、被検試料の前処理を必要としないことから、従来よりも検出までに要する時間を短縮することができ、より迅速な検査対象物の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫学的検査方法の原理を説明する模式図である。図１Ａ：被検試料の検査片への塗布および第一標識免疫化学的成分液の検査片への吸収・展開；図１Ｂ：被検試料中の検査対象物と第一標識免疫化学的成分との複合体形成；図１Ｃ：固定相上での検査対象物の捕捉；図１Ｄ：第二標識免疫化学的成分液の検査片への吸収・展開；図１Ｅ：第二標識免疫化学的成分の固定相への結合および検出シグナルの増幅[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunological test method capable of detecting a test object in a test sample simply, quickly, with high accuracy and high sensitivity, and a kit therefor. More specifically, the present invention relates to an immunochromatographic method including a step of amplifying a detection signal.
[0002]
[Prior art]
An immunochromatographic method is an example of a method for quickly and simply examining a biological sample or the like in an immunological analysis method. This method generally includes the following steps. That is, from one end of a test piece made of a water-absorbing substrate having a stationary phase on which an antibody that can specifically bind to the test object is immobilized, a labeled antibody that can specifically bind to the test object and the target When the mixture with the test sample is absorbed and developed, the labeled antibody-test object complex formed in the mixture binds to the immobilized antibody and is captured on the stationary phase. Therefore, the test object in the test sample can be measured by measuring the labeled antibody bound to the stationary phase.
[0003]
Moreover, as a method for obtaining a detection signal of the above immunochromatography method with higher sensitivity, JP-A-10-062419 discloses a method using two kinds of labeled antibodies. That is, a first labeled antibody labeled with an antibody that can specifically bind to a test object, and a second labeled antibody labeled with a secondary antibody that can specifically bind to the antibody are tested in a test piece. This is a configuration in which each is placed (absorbed) as a labeled phase between the sample dropping part and the stationary phase (another antibody capable of specifically binding to the test object is immobilized). After the test object in the sample forms a complex with the first labeled antibody, the second labeled antibody is further bound to the first labeled antibody (test object-first labeled antibody-second labeled antibody). Form a complex. The immune complex is captured by the antibody immobilized on the stationary phase. Therefore, a signal amplified by the second labeled antibody on the stationary phase is detected.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, at present, sufficient detection sensitivity has not been obtained even by the signal amplification immunochromatography method. Furthermore, when the test sample is feces, urine, blood, or the like, an operation such as suspending the sample in an appropriate buffer solution is necessary as a pretreatment, and there is a problem that it is not rapid. Accordingly, an object of the present invention relates to an immunochromatographic method, and is to provide an immunological test method and a kit therefor capable of detecting a test object more rapidly and with high sensitivity.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to achieve the above object, the present inventors have not obtained sufficient sensitivity in the conventional signal amplification immunochromatography method because of steric hindrance caused by two kinds of labeled antibodies. , The binding efficiency between the test object and the first antibody immobilized on the stationary phase, that is, the capture rate of the test object on the stationary phase is reduced, and / or two types of labels on the water-absorbing substrate It was thought that the immune complex containing the antibody may be due to clogging. Therefore, the present inventors separated the first and second labeled antibodies from the test piece in the immunochromatography method described above, and conversely absorbed the test sample in advance between the stationary phase and one end of the test piece. The liquid containing the first labeled antibody is developed from the one end of the water-absorbing substrate, and the immune complex of the test object and the first labeled antibody formed on the water-absorbing substrate. Is captured with an antibody specific to the test object immobilized on the stationary phase, and then a solution containing the second labeled antibody is further spread on the test piece, and the immune complex captured on the stationary phase is converted into the immune complex captured on the stationary phase. By binding the second labeled antibody, it was devised so as not to cause steric hindrance and clogging of immune complexes due to the two labeled antibodies. As a result, the present inventors have found that the detection signal on the stationary phase is amplified more efficiently than before and the test object can be detected with higher sensitivity, and the present invention has been completed. Moreover, according to this method, since the pretreatment of the test sample is not required, the time required for detection can be shortened compared with the conventional method.
[0006]
That is, the present invention is as follows.
1. An immunological test method comprising the following steps:
(1) Between one end of a water-absorbing substrate provided with a stationary phase immobilizing a first immunochemical component that can specifically bind to a test object in any region on the surface, and the stationary phase Absorb or apply the test sample to any area of
(2) A labeling substance (especially colored particles, especially colored latex particles or gold colloids) from the one end of the water-absorbing substrate to a second immunochemical component capable of specifically binding to the test object The liquid containing the labeled immunochemical component (first labeled immunochemical component) formed by binding the particles)
(3) The immunocomplex of the detection target formed on the water-absorbing substrate and the first labeled immunochemical component is bound to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capturing
(4) Binding a labeling substance (especially colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) to a third immunochemical component that can specifically bind to the second immunochemical component. A liquid containing a labeled immunochemical component (second labeled immunochemical component) is absorbed and developed on the water-absorbing substrate, and the first labeled immunochemical of the immunocomplex captured on the stationary phase Binding a second labeled immunochemical component to the component;
(5) The test object is detected by measuring the labeling substance on the stationary phase.
2. The method according to 1 above, wherein the labeling substances in the first and second labeled immunochemical components are the same.
3. A water-absorbing substrate provided with a stationary phase in which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized in any region on the surface, and a first capable of specifically binding to the test object A labeled immunochemical component (first labeled immunochemical component) formed by binding a labeling substance (especially colored particles, especially colored latex particles or gold colloidal particles) to two immunochemical components and the second A labeled immunochemical component formed by binding a labeling substance (particularly colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) to a third immunochemical component capable of specifically binding to the immunochemical component of An immunological test kit that includes (second labeled immunochemical component) and can be used in an immunological test method including the following steps:
(1) The test sample is absorbed or applied to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase,
(2) From the one end of the water-absorbing base material, the liquid containing the first labeled immunochemical component is absorbed and developed,
(3) The immunocomplex of the test object and the first labeled immunochemical component formed on the water-absorbing substrate is bound to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capturing
(4) The liquid containing the second labeled immunochemical component is absorbed and developed on the water-absorbing substrate, and the second labeled immunochemical component of the immune complex captured on the stationary phase is second labeled. Bind immunochemical components,
(5) The test object is detected by measuring the labeling substance on the stationary phase.
4). 4. The kit according to 3 above, wherein the labeling substances in the first and second labeled immunochemical components are the same.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In each step of the immunological test method of the present invention, the following reaction, that is, immune complex formation is performed.
(1) The test sample to be examined is absorbed or applied in front of the stationary phase (FIG. 1A).
(2) When the first labeled immunochemical component-containing liquid is absorbed and developed from one end of the water-absorbing base material (the end closer to the coated phase where the test sample is absorbed or applied than the stationary phase) (FIG. 1A), The first labeled immunochemical component moves in the water-absorbing substrate as the liquid moves, and binds to the test object in the test sample to form an immune complex (FIG. 1B).
(3) The immune complex that has migrated further binds to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase on the stationary phase, and the first labeled immunochemical component-test object-first An immunocomplex composed of the following immunochemical components is formed and captured on the stationary phase (FIG. 1C).
(4) When the second labeled immunochemical component-containing liquid is further absorbed and developed (FIG. 1D), the second labeled immunochemical component moves through the water-absorbing substrate along with the movement of the liquid and is captured on the stationary phase. It binds to the first labeled immunochemical component of the resulting immune complex (FIG. 1E).
(5) By being captured by the stationary phase in this way, the labeling substances constituting the first and second labeled immunochemical components are gathered and bound together in one place, thereby amplifying the detection signal, thereby the test object. Can be detected with higher sensitivity (FIG. 1E).
[0008]
The test object that can be detected by the method of the present invention binds to the first immunochemical component and the second immunochemical component by an immunochemical reaction (ie, an antigen-antibody reaction) to form a sandwich immunocomplex. There is no particular limitation as long as it can be obtained. For example, microorganisms such as bacteria (especially pathogenic bacteria such as Escherichia coli O-157 and methicillin-resistant Staphylococcus aureus), actinomycetes, yeasts, fungi, viruses (especially HIV, HBV, HCV, etc.) or antibodies thereto, or tumors Examples include antigenic peptides in biological samples such as marker antigens.
[0009]
In the method of the present invention, both the first immunochemical component immobilized on the stationary phase and the second immunochemical component used as the first labeled immunochemical component are separated from the test object by antigen-antibody reaction. There is no particular limitation as long as it can bind specifically. If the test object is an antigen (eg, protein, peptide, hapten, etc.), the first and second immunochemical components are antibodies that can specifically bind to the antigen. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The antibody in the present invention includes antibody fragments that retain specific affinity with the test object, for example, H chain, L chain, Fab, F (ab ′) 2 , V H , VL, and the like. . On the other hand, when the test object is an antibody, the first and second immunochemical components include an antigen that can specifically bind to the antibody or a secondary antibody that can specifically bind using the antibody as an antigen. It is. The first immunochemical component and the second immunochemical component may be appropriately selected from those known per se used in the sandwich method or the like according to the test object. If the immunochemical component is an antibody, it can also be prepared using a known antibody production technique using the isolated test subject as a sensitizing antigen. When the first, second and third immunochemical components are all antibodies, the first antibody and the second antibody differ depending on the type of antibody used and the test object, but the same antigenic determinant is used. Two types of antibodies can be used, or two types of antibodies that recognize different antigenic determinants can be used. More preferably, those that recognize different antigenic determinants are used.
[0010]
The third immunochemical component used as the second labeled immunochemical component is an immunochemical component that specifically binds to the second immunochemical component in the first labeled immunochemical component, and An immunochemical component that does not bind to the immobilized first immunochemical component. As the third immunochemical component, a conventionally known one used as a secondary antibody in an indirect immunoassay can be appropriately selected. It can also be prepared using a known antibody production technique using the second immunochemical component as a sensitizing antigen. When the first, second and third immunochemical components are all antibodies, and the anti-IgG antibody is used as the third antibody, the animal species from which the first antibody and the second antibody are derived are different from each other. It is preferable.
[0011]
The water-absorbing substrate used in the present invention is a test sample containing a test object, for example, a solution extracted from food, a culture supernatant thereof, a stool suspension (dissolution) solution, plasma, serum, urine, etc. There is no particular limitation as long as it can absorb a sample, a diluted solution obtained by diluting these with an appropriate buffer, and a solution containing the first labeled immunochemical component and the second labeled immunochemical component, respectively. In the present invention, the water-absorbing property ensures sufficient time for the test object in the test sample to react sufficiently with the labeled immunochemical component or the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. A substrate is preferably used.
[0012]
When the water-absorbing substrate is inferior in water absorption, it takes a long time for the test sample to reach the stationary phase as described later, and as a result, rapid measurement cannot be performed. On the other hand, if the water-absorbing substrate is too water-absorbing, it is necessary for the test object in the test sample to react sufficiently with the labeled immunochemical component or the first immunochemical component of the stationary phase. Therefore, it is difficult to perform accurate measurement because of a lack of time.
[0013]
Therefore, the preferable degree of water absorption of the water-absorbing substrate in the present invention is that one end of the water-absorbing substrate cut into a strip having a width of 5 mm is immersed in water, and the water absorption distance after 1 minute is 0.5 to It is about 5 cm.
[0014]
Preferable specific examples of the water-absorbing substrate of the present invention include nonwoven fabric, filter paper, glass fiber cloth, glass filter, nitrocellulose filter, and porous material. These base materials have an appropriate water absorption rate and, when the labeling substance is colored particles, have an advantage such as excellent visual confirmation when the colored particles are combined and colored.
[0015]
Moreover, in order to adjust the water absorption of these base materials, the surface of the base material can be coated or impregnated with a hydrophilic polymer or a surfactant. Furthermore, in the present invention, a base material made of the same material may be used as the water-absorbing base material, or a continuous base material obtained by joining materials made of different materials by any bonding means may be used. it can.
[0016]
In the present invention, the shape of the water-absorbing substrate is not particularly limited as long as it allows the specimen to be developed. For example, a rectangular sheet shape (piece shape) or a rod shape is preferable.
[0017]
In the present invention, the stationary phase means a region where a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized on a water-absorbing substrate. The method for immobilizing the first immunochemical component on the water-absorbing substrate (method for preparing the immobilized phase) is not particularly limited, but is based on a conventionally known physical adsorption method or covalent bond method. In particular, the covalent bond method is preferred in that the immunochemical component is not easily detached from the substrate. When the water-absorbing substrate does not have a functional group for the covalent bonding method, for example, a substrate is prepared using a polymer having an appropriate functional group, so that the water-absorbing substrate does not impair the water-absorbing property. Can be attached. Alternatively, the stationary phase can be prepared by applying a solution containing the first immunochemical component and the hydrophilic polymer to the water-absorbing substrate and then immersing the solution in a coagulation solvent for coagulating the hydrophilic polymer. . As the hydrophilic polymer, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, hydroxyethylcellulose and the like are used. As the coagulation solvent, acetone, ethanol, methanol, ether or the like can be used.
[0018]
In the present invention, the stationary phase, a mixture of the test sample solution and the first labeled immunochemical component-containing solution, and a site where absorption of the second labeled immunochemical component-containing solution is started (hereinafter referred to as a liquid absorbing part) ) Is not particularly limited, but is preferably 1 to 6 cm, more preferably about 3 to 4 cm. If the distance is too far, the test sample may not reach the stationary phase, the detection signal sensitivity may be too strong, or the measurement may take a long time. On the other hand, if the distance is too close, the stationary phase may not be uniform in color, and the detection signal sensitivity may be too low.
[0019]
The liquid-absorbing part is not particularly limited as long as it does not hinder the movement of the liquid containing the test sample or the labeled immunochemical component to the water-absorbing base material. A non-woven fabric or woven fabric may be bonded to the water-absorbing substrate. In the present invention, a stationary phase on which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized, and a water-absorbing substrate having a liquid-absorbing part are hereinafter referred to as an immunological test of the present invention. It may be a piece or simply a test piece.
[0020]
The first labeled immunochemical component in the method of the present invention is obtained by binding a labeling substance to an immunochemical component (second immunochemical component) that can specifically bind to the test object, The second labeled immunochemical component is obtained by binding a labeling substance to an immunochemical component (third immunochemical component) that can specifically bind to the second immunochemical component. The labeling substance used here may be any labeling substance conventionally used in immunochemical measurement methods, such as colored particles, enzymes (alkaline phosphatase, peroxidase, etc.), fluorescent substances (FITC, rhodamine, etc.). In order to achieve efficient amplification of the detection signal, the labeling substances used for the first and second labeled immunochemical components are preferably the same. In the method of the present invention, colored particles are preferably used as a labeling substance in the sense of rapid detection. The colored particles are not particularly limited as long as they can be detected with the naked eye. For example, colloidal particles made of metals such as gold, silver, and copper, represented by Sudan Blue, Sudan Red IV, Sudan III, Oil Orange, Quinizarin Green, etc. Colored latex obtained by coloring latex with pigments or dyes can be used. From the viewpoint of visual confirmation, it is preferable to use colloidal gold or colored latex colored blue, red, green or orange, and it is easy to adjust the dispersion stability and detection sensitivity of the test object. In view of the above, it is more desirable to use a colored latex made of a water-dispersed polymer colored in blue, red or the like.
[0021]
The particle size of the colored particles is not particularly limited as long as it has good color development upon detection and has mobility in the base material that does not decrease the water absorption of the water-absorbent base material, but storage stability In view of ease of preparation and the like, a range of preferably 0.01 to 3 μm, more preferably 0.05 to 0.5 μm is exemplified. If the particle size is too small, the degree of coloring per particle is small, so that even if it is bonded to the stationary phase, the degree of color development is poor and the visual confirmation is poor. On the other hand, if the particle size is too large, the colored particles may be slightly agglomerated to cause clogging of the water-absorbent base material, resulting in a decrease in water absorption or non-specific color development.
[0022]
As a method for labeling each of the second and third immunochemical components with such colored particles, a conventionally known method such as a covalent bond method, a physical adsorption method, an ion binding method, or the like may be used. However, the covalent bond method is more preferably used from the viewpoint that the colored particles are not detached from the immunochemical component and are stable.
[0023]
In the method of the present invention, in order to detect a plurality of test objects in a test sample, a plurality of corresponding immunochemical components can be labeled with different colored particles. The particles may be the same color or different colors. When using colored particles of the same color, it is desirable that the stationary phase on which an immunochemical component capable of specifically binding to each test object is immobilized be separated so as to be distinguishable.
[0024]
When the labeling substance is an enzyme or a fluorescent substance, detection means conventionally used in EIA or fluorescent antibody method (FIA) are appropriately selected for detection of the stationary phase labeling substance.
[0025]
The first labeled immunochemical component-containing liquid and the second labeled immunochemical component-containing liquid are prepared by dispersing (dissolving) each labeled immunochemical component in an appropriate dispersion medium (solvent). The dispersion medium for dispersing the labeled immunochemical component may be any medium that does not inhibit the antigen-antibody reaction between the test object and the first labeled immunochemical component, and the first labeled immunochemical component and the second labeled immunochemical component. Although there is no particular limitation, preferably a buffer solution having a pH and salt concentration suitable for the antigen-antibody reaction, for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, etc., is appropriately selected and used. can do. The concentration of each labeled immunochemical component at the time of signal detection is 0.005 to 5%, preferably 0.01 to 0.5%. If the concentration is too low, the number of particles bound to the stationary phase is small and the detection sensitivity is deteriorated. On the other hand, if the concentration is too high, not only is it uneconomical, but excessive labeling substances remain other than the stationary phase, causing problems such as obscure the stationary phase signal. Hereinafter, the labeled immunochemical component-containing solution is simply referred to as labeled immunochemical component solution.
[0026]
The immunological test kit of the present invention can be preferably used for the immunological test method of the present invention. The kit includes at least the following contents.
(a) A water-absorbing substrate provided with a stationary phase in which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized in a certain region on the surface
(b) A labeled immunochemical component (first labeled immunochemical component) formed by binding a labeling substance to a second immunochemical component capable of specifically binding to the test object
(c) A labeled immunochemical component obtained by binding a labeling substance to a third immunochemical component that can specifically bind to the second immunochemical component (second labeled immunochemical component)
Preferred embodiments of the water-absorbing substrate and the first and second labeled immunochemical components are preferably used in the immunological test method of the present invention as described above.
[0027]
In addition to the above contents, the kit of the present invention may contain additional contents that can be preferably used in the immunological test method of the present invention. For example, the above-mentioned buffer solution preferably used for dispersing the first and second labeled immunochemical components.
[0028]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these examples do not limit the scope of the present invention.
[0029]
Example 1 Preparation of immunological test kit (1) Preparation of first labeled immunochemical component liquid Blue colored carboxylated polystyrene latex particle dispersion (solid content concentration 5% by weight, average particle size 0.1 μm, 0. 3 ml of 01M borate buffer (pH 8), 1 ml of water-soluble carbodiimide (1 mg / ml, 0.01 M borate buffer (pH 8)) and 1 mg / ml goat IgG anti-E. Coli O-157: H7 antibody (Kirkegaard 1 ml of Perry Laboratories Inc., 0.01M borate buffer (pH 8) was added and reacted at 10 ° C. for 3 hours, followed by centrifugal washing using borate buffer (pH 8) as the washing solution. A blue colored latex particle labeled anti-E. Coli O-157: H7 antibody was prepared. The obtained latex particle-labeled antibody was suspended in 0.01M borate buffer (pH 8) so that the solid content concentration was 2% by weight.
[0030]
(2) Preparation of second labeled immunochemical component liquid In the same manner as in (1) above, a blue colored carboxylated polystyrene latex particle dispersion (solid content concentration 5% by weight, average particle diameter 0.1 μm, 0.01M boron) 3 ml of acid buffer (pH 8), 1 ml of water-soluble carbodiimide (1 mg / ml, 0.01 M borate buffer (pH 8)) and 2 mg / ml rabbit anti-goat IgG antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., After adding 1 ml of 0.01M borate buffer (pH 8) and reacting at 10 ° C. for 3 hours, centrifugal washing using borate buffer (pH 8) as a washing solution is carried out, and the blue colored latex particle labeled anti-label A goat IgG antibody was produced. The obtained latex labeled antibody was suspended in 0.01 M borate buffer (pH 8) so that the solid content concentration was 2% by weight.
[0031]
(3) Preparation of test piece 1 mg / ml rabbit IgG anti-E. Coli O-157: H7 antibody (manufactured by Capricorn, 0.1 M phosphate buffer) at a position 30 mm from one end of a nitrocellulose membrane (pore size 8 μm, 6 mm × 60 mm) 0.5 μl of the solution (in pH 7.4) was applied in a line using a dispenser. This membrane was immersed in an aqueous solution consisting of 1% by weight bovine serum albumin and 0.1% by weight polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 10 minutes and then dried at 40 ° C. for 2 hours. I let you.
Next, a polyester film (100 μm thickness) was bonded to the back side of this membrane (opposite to the antibody application surface) using spray glue. Furthermore, a polyester non-woven fabric (6 mm × 8 mm, thickness 2.5 mm) was bonded to a location of 0 to 8 mm from the opposite end of the antibody application location to prepare a test piece.
[0032]
Example 2 Detection of Escherichia coli O-157: H7 by an immunological test kit Table 1 shows Escherichia coli O-157: H7 strain in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9 wt% NaCl. Test samples dispersed at various concentrations were prepared. 2 μl of this test sample was absorbed on the surface of the immunological test piece prepared in (3) of Example 1 in a portion of 12 to 20 mm from the opposite side of the antibody application site. Next, the 0.1-M phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9 wt% NaCl so that the first labeled antibody solution prepared in (1) of Example 1 has a solid concentration of 0.02 wt%. Then, 60 μl of the diluted solution was dropped on the polyester nonwoven fabric portion of the test piece. After the first labeled antibody solution comes into contact with the test sample and further developed, the second labeled antibody solution prepared in (2) of Example 1 is 0.9 weight so that the solid content concentration becomes 0.02 wt%. 60 μl of a solution diluted with 0.1% NaCl-containing 0.1M phosphate buffer (pH 7.4) was dropped onto the polyester nonwoven fabric portion, and the presence or absence of color development on the stationary phase was visually observed after 20 minutes. The results are shown in Table 1. As a comparative example, the measurement results when only the first labeled antibody is used without using the second labeled antibody are shown side by side.
[0033]
[Table 1]
【The invention's effect】
In the immunochromatography method using the kit of the present invention, a test sample is preliminarily absorbed or applied to a test piece, and a first labeled immunochemical component liquid is first developed there, and a test object to be formed After capturing the immunocomplex of the product and the first labeled immunochemical component with the immunochemical component specific to the test object immobilized on the stationary phase, the second labeled immunochemical component solution is further added. Since the second labeled immunochemical component is bound to the immunocomplex that is spread on the test piece and captured on the stationary phase, conventional steric hindrance or clogging of the immune complex due to the two labeled immunochemical components Detection problems that may occur in the method can be avoided, and as a result, the inspection object can be detected with higher sensitivity. Further, according to the present method, since pretreatment of the test sample is not required, the time required for detection can be shortened compared to the conventional method, and the inspection object can be detected more quickly.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the principle of an immunological test method of the present invention. FIG. 1A: Application of test sample to test piece and absorption / development of first labeled immunochemical component liquid on test piece; FIG. 1B: Test target and first labeled immunochemical component in test sample Fig. 1C: Capture of test object on stationary phase; Fig. 1D: Absorption / development of second labeled immunochemical component liquid to test piece; Fig. 1E: Second labeled immunochemical component Binding to stationary phase and amplification of detection signal
Claims (8)
(1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた吸水性基材の一端と、該固定相との間の任意の領域に被検試料を吸収させるかまたは塗布し、
(2) 該吸水性基材の該一端から、該検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第一標識免疫化学的成分）を含有する液を吸収させて展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検出対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 該第二の免疫化学的成分と特異的に結合し得る第三の免疫化学的成分に標識物質を結合してなる標識免疫化学的成分（第二標識免疫化学的成分）を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、
(5) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。An immunological test method comprising the following steps:
(1) Between one end of a water-absorbing substrate provided with a stationary phase immobilizing a first immunochemical component that can specifically bind to a test object in any region on the surface, and the stationary phase Absorb or apply the test sample to any area of
(2) A labeled immunochemical component (first labeled immunochemistry) formed by binding a labeling substance from the one end of the water-absorbing substrate to a second immunochemical component that can specifically bind to the test object. Absorb the liquid containing
(3) The immunocomplex of the detection target formed on the water-absorbing substrate and the first labeled immunochemical component is bound to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capturing
(4) Contains a labeled immunochemical component (second labeled immunochemical component) formed by binding a labeling substance to a third immunochemical component that can specifically bind to the second immunochemical component. A liquid is absorbed onto the water-absorbing substrate and developed, and a second labeled immunochemical component is bound to the first labeled immunochemical component of the immunocomplex captured on the stationary phase;
(5) The test object is detected by measuring the labeling substance on the stationary phase.
(1) 該吸水性基材の一端と、該固定相との間の任意の領域に被検試料を吸収させるかまたは塗布し、
(2) 該吸水性基材の該一端から、第一標識免疫化学的成分を含有する液を吸収させて展開し、
(3) 該吸水性基材上で形成される検査対象物と第一標識免疫化学的成分との免疫複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、
(4) 第二標識免疫化学的成分を含有する液を該吸水性基材に吸収させて展開し、該固定相上に捕捉された免疫複合体の第一標識免疫化学的成分に第二標識免疫化学的成分を結合させ、
(5) 該固定相上の標識物質を測定することにより該検査対象物を検出する。A water-absorbing substrate provided with a stationary phase in which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized in any region on the surface, and a first capable of specifically binding to the test object A labeled immunochemical component (first labeled immunochemical component) formed by binding a labeling substance to a second immunochemical component and a third immunochemical component capable of specifically binding to the second immunochemical component An immunological test kit that includes a labeled immunochemical component (second labeled immunochemical component) formed by binding a labeling substance to a component and can be used in an immunological test method including the following steps:
(1) The test sample is absorbed or applied to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase,
(2) From the one end of the water-absorbing base material, the liquid containing the first labeled immunochemical component is absorbed and developed,
(3) The immunocomplex of the test object and the first labeled immunochemical component formed on the water-absorbing substrate is bound to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capturing
(4) The liquid containing the second labeled immunochemical component is absorbed and developed on the water-absorbing substrate, and the second labeled immunochemical component of the immune complex captured on the stationary phase is second labeled. Bind immunochemical components,
(5) The test object is detected by measuring the labeling substance on the stationary phase.
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