JP3837466B2

JP3837466B2 - Method for producing biodiesel (monoalkyl ester)

Info

Publication number: JP3837466B2
Application number: JP2001030066A
Authority: JP
Inventors: 治幸家藤; カミニ・エヌ・アール; 力藤井; 猛行黒須; 直人岡崎
Original assignee: National Research Institute of Brewing
Current assignee: National Research Institute of Brewing
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2001-02-06
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2021-02-06
Also published as: JP2002233393A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、石油ベースのディーゼル燃料と同じエンジンが使用可能であり、再生産可能にして公害の少ないバイオディーゼル燃料（以下、単にバイオディーゼルということもある）の効率的製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
今日、ディーゼルエンジン車の放出する微粒子、硫黄酸化物、窒素酸化物、一酸化炭素による大気汚染の深刻化に伴い、公害の少ない、きれいなガスを放出する代替燃料が求められるようになった。
一方、石油などの化石燃料の枯渇によるエネルギー危機が近い将来に起こることが確実視されており、植物油のような、天然の再生産可能な原料（バイオマス）から作られる燃料の生産が重要な課題となっている。
【０００３】
そうした状況の中、石油ベースのディーゼル燃料と同じエンジンが使用でき、排ガス放出量を大幅に削減することができる、再生産可能なバイオディーゼルが注目されてきた。
【０００４】
バイオディーゼルは、動植物油脂のアルコリシス（メタノリシス）によって生成する脂肪酸のメチルエステル（ＭＥ）に代表されるように、油脂中のグリセロールとアルコールとをエステル交換して得られるアルキルエステルを指称するものである。
【０００５】
現在、このバイオディーゼルの多くは化学的な合成により生産されているが、反応後の触媒除去、副産物グリセロール回収の困難さ、またその製造工程に多量のエネルギーを必要とすることなど、多くの問題をかかえている。
【０００６】
そこで、リパーゼ酵素を利用したバイオディーゼルの生産が注目されるようになった。通常、リパーゼは、油脂（トリグリセリド）を脂肪酸とグリセロールへ加水分解する反応を触媒するが、水分が制限された条件では、脂肪酸とアルコールをエステル結合させる逆反応を行わせることが可能である。さらに、トリグリセリドをメタノールなどの低級アルコールと共存させ、それにリパーゼを作用させることで、トリグリセリド中のグリセロールとメタノールなど低級アルコールをエステル交換させる方法も可能である。
【０００７】
トリグリセリド１分子は、３つの脂肪酸と１つのグリセロールからなることより、トリグリセリド１モルを完全にバイオディーゼル（モノアルキルエステル）とするには理論的に３モルの低級アルコールが必要である。
【０００８】
しかし、今まで試みられてきたリパーゼを用いたバイオディーゼル生産では、主にトリグリセライド１モルに対し、まず１モルの低級アルコールを加えてエステル化させ、その反応がほぼ終了した時点でさらに２モルのアルコールを１モルずつ順次加えていくなど多段仕込みにより行われてきた。これは一般に用いるリパーゼが低級アルコールで活性を失いやすいことより、１回に添加するアルコールの量を抑えながら順次追加して行こうとするものである。また、既知のリパーゼでは、水分含量が高い系、ヘキサンや石油エーテル等有機溶媒が存在する系においては、エステル化反応が妨害される、という工業化において特に問題となる欠点があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した欠点のない効率的なバイオディーゼル（モノアルキルエステル）の製造方法を新たに開発する目的でなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため各種検討の結果、バイオディーゼルの製造において、化学合成法よりもマイルドな酵素法に着目し、多数の酵母を自然界から分離し、その性質についての研究の過程において、クリプトコッカスエスピー・Ｓ−２が、α−アミラーゼ、キシラナーゼ等の酵素のほか、多量のリパーゼを生産分泌し、その酵素は中性からアルカリ性で強い油脂分解性を示すこと、さらに、本酵素は、ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサンなどの有機溶媒に安定であり、しかもトリグリセリドとメタノールとの共存下においてトリグリセリド中のグリセロールとメタノールをエステル交換し、脂肪酸のメチルエステルを生成すること、換言すれば油脂のメチルエステル化、つまりバイオディーゼルを生成することをはじめて見出した。
【００１１】
本発明は、上記新知見に基づいてなされたものであって、本酵素の理化学的性質を研究して本酵素が従来未知の新規酵素であることを確認しただけでなく、バイオディーゼルの製造にも成功し、遂に本発明を完成したものである。以下、本発明について詳述する。
【００１２】
本発明は、油脂（トリグリセリド）とアルコールの存在下、リパーゼを作用させることによりエステル化反応を効率的に行い、もってバイオディーゼルを製造する点を基本的技術思想とするものであって、リパーゼとしては、エステル交換反応を一段階で実施することができ、及び／又は、多量の水分の存在下でもエステル交換反応を実施できるものであればどのようなリパーゼを使用することも可能である。このようなリパーゼとしては、クリプトコッカス属由来のリパーゼが例示され、その理化学的性質は次のとおりである。
【００１３】
（１）作用
油脂分解性にすぐれ、トリグリセリドに作用して、グリセリンと脂肪酸に加水分解する。トリグリセリド中のグリセリンとアルコールをエステル交換する、換言すれば油脂のモノアルキルエステル化を触媒する。
【００１４】
（２）基質特異性
各脂肪酸のトリグリセライド及びオイルに対する基質特異性は、下記表１に示すとおりである。
【００１５】

【００１６】
本酵素は、トリグリセライドの内、トリブチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレインを効率よく分解する。一方トリアセチン、トリカプリン、トリラウリンは中程度、トリミリスチン、トリステアリンに対しては分解力が弱かった。
本酵素は、テストした全てのオイルに対し良好な分解活性を示し、特に米糠油、イワシ油をよく分解した。
【００１７】
（３）位置特異性
本酵素がトリオレインに作用する際の、分解の位置特異性を調べた。酵素反応により、オレイン酸と少量の１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレインとモノオレインは検出されなかった。
【００１８】
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
精製酵素の反応至適ｐＨは７．０であった。ｐＨ８．０においても高い活性を示した。またｐＨの安定性ではｐＨ５からｐＨ９において安定であり、弱酸性から弱アルカリ性まで広い範囲で機能するリパーゼであった。
【００１９】
（５）反応最適温度及び温度による失活の条件
反応最適温度は３７℃であった。しかし温度上昇による活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても７１％の活性を維持していた。
【００２０】
（６）阻害、活性化及び安定化
種々の有機溶媒を０、２．５、５．０、７．５、１０．０％の濃度で添加し、リパーゼの活性に与える効果を調査し、下記表２の結果を得た。その結果、本リパーゼは、ベンゼンを除く各種有機溶媒に安定であり、ＤＭＳＯ（dimethylsul foxide）、ジエチルエーテルによってはむしろ活性の上昇がみられ、ＤＭＳＯ７．５％の状態において６４．２％の活性上昇が見られた。
【００２１】

【００２２】
このように、本リパーゼが有機溶媒に安定であることは特記すべきことである。リパーゼによるエステル交換反応やエステル合成は、有機溶媒とわずかな水の混在する系によりはじめてその反応が進行するが、一般にリパーゼはそのような有機溶媒と水の混在する系では不安定であることが問題であった。
【００２３】
ところが本リパーゼは、ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサンの存在によっても５０％以上の活性と安定性を示し、有機溶媒の存在下においても、エステル交換反応やエステル合成が可能であり、したがって油脂の抽出の際に抽出溶媒として使用された有機溶媒が残存する粗製油脂からも（精製することなく）バイオディーゼルを製造することができ、また、多量の水分の存在下でも本酵素は充分に活性を保持しており、これらの点からして、本酵素はバイオディーゼルの新規製造、特に工業的効率的製造の面から、きわめてすぐれている。
【００２４】
（７）リパーゼ活性の測定法
リパーゼ活性は、p-nitorophenyl laurate (p-NPL)を反応基質とした４１０nmの吸光度法にて測定した。また必要に応じ、オリーブオイルを基質とした滴定法にてリパーゼ活性を測定した。
【００２５】
（８）分子量
２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２６】
本酵素は、上記した理化学的性質からみて、従来既知のリパーゼにはこのようなタイプの酵素は見当らず、新規物質と認定し、これをリパーゼＣＳ２と命名した（なお、これをＣＳ２リパーゼということもある）。
【００２７】
本発明に係る新規酵素は、微生物、例えばクリプトコッカス属に属するＳ−２株（ＦＥＲＭＰ−１５１５５）（以下、ＣＳ２株ということもある）の培養物から分離、取得することができる。ここに創製分離された菌株は、新規酵素（リパーゼＣＳ２）を生産分泌できる点できわめて特徴的であり、これをクリプトコッカスエスピー．Ｓ−２（Cryptococcus sp. S-2）と命名し、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５１５５として寄託した。
【００２８】
本酵素は、ＣＳ２株を常法にしたがって培養し、培養物から抽出し、精製することにより取得することができる。例えば、ＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース１％）にて２５℃、４０時間前培養（５．４〜５．８×１０⁸ケ／ｍｌ）した菌体を通常の本培養への接種菌とする。
【００２９】
酵母エキス０．５％、ＫＨ₂ＰＯ₄１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１％、トリオレイン１％を基本とし、必要に応じ、窒素、炭素源、そして誘導物質を変化させたものを酵素生産培地とした。１００mlの酵素生産培地に、前培養した菌を１％(v/v)接種し、２５℃１００rpmの振とう培養にて、酵素の生産を行えばよい。トリオレインは添加しなくてもよいが、Cryptococcus sp. S-2によるリパーゼの生産はオリーブオイル、トリオレインなどの油脂を炭素源にすることでグルコース培地より約３倍のリパーゼ活性の分泌が見られ、油脂を炭素源にすることでリパーゼの生産は優位に高められる。油脂としては、上記のほかにイワシ油、大豆油、トリグリセリドから選ばれる少なくともひとつを使用すると好適である。
【００３０】
ＣＳ２株の培養は、酵母の培養と同様に実施すればよいが、上記のように炭素源として油脂を使用すると酵素の生産が上昇する。また、窒素源として酵母エキス、糖としてラクトースを使用しても、酵素の生産が上昇する。
【００３１】
ＣＳ２株を培養した後、本酵素を培養物から分離、精製する。その方法は常法にしたがえばよいが、例えば培養液を濃縮した後、クロマトグラフィー処理等既知の精製法を組み合わせて行えばよい。また、本酵素は、高度に精製することは必ずしも必要ではなく、例えば培養上清を限外ろ過して得た濃縮液をバイオディーゼルの製造に使用することが充分に可能である。
【００３２】
このようにして得られた本酵素（ＣＳ２リパーゼ）は、上記した特質を有するため、有機溶媒や多量の水分の存在下においてもエステル交換反応やエステル合成反応を触媒することができ、バイオディーゼル燃料の製造、特に工業的製造に利用できるだけでなく、油脂の加水分解という通常のリパーゼが有する性質も併有しており、医薬、化粧品、飲食品、洗剤、試薬その他の用途に広範に利用できることはもちろんのことである。
【００３３】
本発明を実施するには、油脂とアルコールの存在下において、リパーゼにより、油脂中のグリセロールとアルコールをエステル交換すればよく、例えば、油脂、アルコール、リパーゼを、必要あれば撹拌しながら、混合して反応させればよく、しかも、上記したようなリパーゼを使用すれば、アルコールを逐次添加する必要はなく、ワンステップで反応が行われるし、その際有機溶媒中や大量の水分が混在しても反応がスムーズに進行するという著効が奏される。
【００３４】
このように、本発明は酵母Cryptococcus sp. S-2の生産するリパーゼを使用することで、トリグリセリド１モルに対し、最初から３モルおよびそれ以上の低級アルコールを加えて反応させ、リパーゼによるバイオディーゼルの生産工程を単純化することを可能にしたものであって、アルコールを逐次添加する必要はなく、工業上非常に卓越したものである。
【００３５】
また一般にリパーゼは、水の多い状態では本来のトリグリセリドを加水分解する反応を起こし、その逆反応であるエステル化は水を厳しく制限した状態により初めてその反応が主となるものである。しかるにCryptococcus sp. S-2の生産するリパーゼは、通常のリパーゼではエステル化の妨げられる水分含量においてもその反応が進行していくという優れた性質を持つ。
エステル化反応では必然的に水が生じ、この生成水の蓄積によりリパーゼによるエステル化反応は妨げられることになるが、Cryptococcus sp. S-2リパーゼではそうした妨害はない。
【００３６】
また日本でバイオディーゼルの原料として好んで使われる家庭からの廃油などには水分を多く含むものも多いが、Cryptococcus sp. S-2リパーゼはこうした油脂においてもあまりその水分を気にすることなくバイオディーゼルの原料として用いることができる。
【００３７】
Cryptococcus sp. S-2リパーゼは、各種動植物油の中でも米糠油に対して特に高いエステル生産性を示す。米糠油は米の糠から得られる安価な油であり、我が国で豊富に生産できるものである。Cryptococcus sp. S-2リパーゼが米糠油に対して特に効率よくバイオディーゼルが生産できることは、米糠の有効利用に役立つものである。
【００３８】
通常のリパーゼはヘキサン、石油エーテルの存在でその活性低下がみられるが、Cryptococcus sp. S-2リパーゼはこれら有機溶媒の混在で逆にその活性の上昇がみられる。Cryptococcus sp. S-2リパーゼではトリグリセリドと低級アルコールのエステル化反応においてヘキサン、石油エーテルの混在でエステル化効率が向上するが、このことは米糠などから油脂を抽出する際に使用されるヘキサンや石油エーテルを完全に除去しない粗精製油脂を原料にすることでかえって効率よくバイオディーゼルの生産が可能であることを示すものであり、コストおよび生産工程上極めて有利な点である。
【００３９】
本発明の実施態様としては、下記の態様が例示される。
（１）リパーゼを使用した一段階でのバイオディーゼル製造法。
（２）水分含量の多い状態でのリパーゼによるバイオディーゼルの製造。
（３）酵母Cryptococcus sp. S-2のリパーゼを使用したバイオディーゼル製造方法。
（４）米糠油からのバイオディーゼル製造。
（５）ヘキサン、石油エーテルのほか既述した各種有機溶媒の混和する粗製油脂からのバイオディーゼル製造。
【００４０】
リパーゼを作用させる油脂としては、動物（魚類を含む）及び植物由来の油脂の１種又は２種以上がすべて使用可能であり、非限定例としては次のものが例示される。オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油、クルミ油、ゴマ油、ツバキ油、ピーナッツ油等の植物油。バター、豚脂、牛脂、羊脂、鳥脂、鶏油等の動物油。クジラ油、イワシ油、ニシン油、タラ肝油等の魚油。
【００４１】
本発明において油脂のアルキルエステル化反応は有機溶媒や大量の水分の存在によって妨害を受けないので、油脂は精製されたものでなくても使用可能であり、これらを含有、付随してなる油脂、これらと油脂との混合物も使用可能である。したがって、固形油脂も溶媒に溶解して使用することができる。また、本発明方法は有機溶媒や水分の影響を受けないことから、どのような方法によって製造した油脂も適宜使用することが可能であって、例えば圧搾法、抽出法、溶出法等で製造した油脂が格別の精製工程を経ることなく適宜使用できる。
【００４２】
アルコールとしては、メタノール等の低級アルコールのほか各種のアルコールが適宜使用可能であって、その非限定例としては次のものが挙げられる：メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、アミルアルコール、ヘキシルアルコール等脂肪族アルコール；アリルアルコール、プロパルギルアルコール等の不飽和脂肪族アルコール；シクロヘキサノール、シクロペンタノール等の脂環式アルコール；ベンジルアルコール、シンナミルアルコール等の芳香族アルコール；その他の各種アルコール。
【００４３】
本発明を実施するには、油脂、アルコール、リパーゼを混合、インキュベートすればよく、しかも反応系に水分や有機溶媒が混在していても反応が特に阻害されることがなく、それどころかエステル化率が上昇する場合があることも確認されたところから、反応条件に格別の制限はなく、広範囲に適宜設定すればよいが、特に好適な反応条件は次のとおりである。
【００４４】
酵素量は３００〜５０００Ｕ、好ましくは５００〜３０００Ｕ、更に好ましくは１５００〜２５００Ｕであり、基質重量に対して水の量が５〜５００ｗｔ％存在しても反応は阻害されず、それどころか水分６０〜１００ｗｔ％の存在下ではエステル量の増加が認められ、アルコール量を油脂に対して１：１〜１：４の比率で使用した場合、水分量が少ない場合（例えば５０％以下の場合）、アルコール量の比率が低い方がエステル化率は高く、水分量が多い場合（例えば５０％以上の場合）、アルコールの比率が高い方がエステル化率が高いことが認められた。
【００４５】
更に反応条件に関しては、ｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃においては格別の反応阻害は認められず、反応ｐＨ及び反応温度は広範囲に選択することが可能である。反応時間も目的とするエステル化率が達成されるまで反応を継続する等適宜選択の域内であるが、一応の目安として５０〜２００時間程度で所期の目的が達成される。なお、反応は、５０〜３００ｒｐｍ程度で攪拌しながら行うのがよい。
【００４６】
また、本発明方法は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、石油エーテル、ベンゼンその他油脂抽出用有機溶媒のほか既述したような各種有機溶媒の存在によっても反応が阻害されないという特徴も有するものであって、３０％以下の場合には反応阻害が認められなかった。それどころか逆に、有機溶媒の種類によっては、例えばＤＭＳＯ、ｎ−ヘキサン、石油エーテルを５〜１５％添加した場合にはエステル化率の上昇が認められたことから、有機溶媒の添加によってエステル化率を高めることすら可能である。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００４７】
【実施例１】
酵母エキス０．５％、ラクトース０．５％、ＫＨ₂ＰＯ₄ １％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１％、トリオレイン１％からなるリパーゼ生産用培地に前培養したＣＳ２菌（ＦＥＲＭＰ−１５１５５）を１％（ｖ／ｖ）接種し、初期ｐＨ５．６、２５℃、１００ｒｐｍで１２０時間振とう培養した。
【００４８】
酵素の精製は次のようにして行った。酵母細胞を除いた培養液を８，０００rpm、１０min遠心分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂TSK-gel SP-5PWカラムによる高速液体クロマトグラフィ（ｐＨ７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ添加したものによるグラジエント溶出）によってリパーゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとなり、分子量はＤＳＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンであることが判明した。得られた酵素（ＣＳ２リパーゼ）の理化学的性質は、既述のとおりであった。
【００４９】
【実施例２】
酵母Cryptococcus sp. S-2をリパーゼ生産用培地（実施例１）で１２０時間、２５℃培養、得られた培養液を８，０００ｒｐｍで２０分遠心し、遠心上清をアミコン社の１０，０００分子量カット限外ろ過膜（ＹＭ−１０）にて濃縮し、酵素液を得た。
【００５０】
【実施例３】
Ａ：ＣＳ２リパーゼを用い、油脂とメタノールを反応させて油脂のメチルエステル化（メタノリシス）を行った。
【００５１】
（１）リパーゼ活性
リパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニル・ラウリン酸（ｐ−ＮＰＬ）を基質とした分光光度法により測定した。標準的な活性測定法のもとで、１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素を酵素活性１ユニットとした。
【００５２】
（２）メチルエステル化
油とメタノール９．６５ｇ／０．３５ｇ（ｍｏｌ／ｍｏｌ＝１／１）の混合物を初期基質とした。これに５００ＵのＣＳ２リパーゼを含む４ｍｌ酵素液を１００ｍｌの共栓付き三角フラスコ内で加えて反応混合物とし、３０℃、９６時間、１６０ｒｐｍにて振とうすることで反応を行った。２４時間ごとに試料を分取し、キャピラリーガスクロマトグラフにより、以下のように分析した。
【００５３】
（３）反応最適化研究
酵素量を５００〜２，５００Ｕ、基質重量に対する水の量を１３〜２００ｗｔ％、メタノール量を油に対して１：１〜１：４の範囲で変動させ反応条件を検討した。さらにｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃にて反応条件を検討した。また種々有機溶媒添加（１０％、ｗ／ｖ）の影響についても調べた。
【００５４】
（４）キャピラリーガスクロマトグラフ分析
一定時間毎に反応液より３００マイクロリットルの試料を独立して３回分取し、遠心後、その上清を得た。１５ｍｌの試験管のなかで、１００マイクロリットル上清に６０マイクロリットルのトリカプリンを内部標準、無水硫酸ナトリウムを脱水剤として、３．０ｍｌのヘキサンを添加し、よく攪拌混合した。それより１．０マイクロリットルの試料を取り、ＤＢ−５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×１５ｍ；Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｏｒｓｏｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるガラスクロマトグラム（島津製、ＧＣ−１７Ａ）にて反応物中のＭＥ（メチルエステル）、ＦＦＡ（遊離脂肪酸量）を測定した。インジェクターおよびディテクターの温度はそれぞれ２４５および２５０℃。カラムは１５０℃にて０．５分保持した後、２１０℃まで５℃／ｍｉｎ、それ以降３００℃まで１０℃／ｍｉｎの条件で昇温した。
【００５５】
Ｂ：実施例２で得た酵母クリプトコッカスエスピー．Ｓ−２由来の粗精製物をリパーゼとして用い、植物油のメチルエステルを行った。
【００５６】
本リパーゼを用いオリーブ油、菜種油、米糠油、大豆油、それぞれとメタノールのエステル化反応を調べた結果を表１に示す。反応条件は実験方法参照。３０℃、９６時間の反応で米糠油が２４．９％のエステル化率を示し、最も良好な結果を示した。このことより以降の実験は米糠油を基質油として使用することとした。
【００５７】

【００５８】
（１）酵素量の（米糠油メチルエステル化に及ぼす）影響
次に、リパーゼ添加量を５００Ｕ〜２，０００Ｕの範囲で反応を行った。結果は図１のように、酵素量の増加に伴いエステル化率は向上し、２，０００Ｕにより３３％のエステル化率を示した。これは１分子内で３モルの脂肪酸を有する油脂に対し、１モルのメタノールを添加した際に得られるエステル率の最大限の値に相当する（図１）。
【００５９】
（２）水分の（米糠油メチルエステル化に及ぼす）影響
水分含量１３％、４８時間の条件で、メチルエステル含量（ＭＥ）は３１．５％であり、反応液中の９４．６％メタノールが消費されていた。水分が３０および５０％に増えるに伴い、４８時間目でのエステル生成量は８．９および１６．５％に減少したが、しかし表２に示すように９６時間後においてはその生成量にほとんど差はなくなった。一方、水分１３％及び５０％での９６時間後の遊離脂肪酸はそれぞれ２４．０、４２．１％と水分の多い方が増大する傾向が見られた。
【００６０】

【００６１】
（３）水分含量とメタノール添加量の（米糠油メチルエステル化に及ぼす）影響油脂を完全に脂肪酸エステルに変換するには少なくとも３モルのメタノールが必要である。しかしながら、例えばRhizopus oryzaeのリパーゼでは１モル以上のメタノールを含む反応系では酵素の不活性化が起きることより、エステル化反応では１モルずつのメタノールを順次追加してゆく方法を取る必要がある。
【００６２】
しかし、もし使用するリパーゼがメタノールを多くした時においても不活性化しないなら、最初からメタノール量を多くし、その添加回数を減らせた方が操作が簡単となる。
そこで油脂とメタノールの比率を１：１から１：４、また水の含量を基質重量に対して２０から２００％、それぞれ最初に一度に添加するワンステップ法により反応を行った。結果は図２に示すように、メタノール比が増加（１：１〜１：４）するに伴い、そして水分含量６０〜１００％範囲で増加するに伴い、メチルエステル量は増加した（図２）。
【００６３】
以上のことよりCryptococcus sp. S-2リパーゼでは最初から一度に多くのメタノールを添加して反応させることが可能であることが確認された。
また、Pseudomonas fluorescensやMucor mieheiなどの一般のリパーゼでは、反応液中に水分が加わるとエステル変換率の低下をまねくが、本リパーゼではある程度の量の水分が存在する方が変換率が良い、という反対の効果が観察された。
【００６４】
（４）ｐＨおよび温度の影響
基質の対する添加水分８０％の条件で、ｐＨのエステル化反応に与える影響を調べた。結果を図３に示すが、調べたｐＨ５から９の範囲において、ｐＨが上がるにつれ反応は低下した。しかし結果としてｐＨ調整をしないものの方が最も高いエステル変換を示した。これはｐＨ調整に使用する塩の存在が酵素反応に阻害的に働くことによると思われる。結果としてｐＨ調整は特にする必要がないことが示された（図３）。
【００６５】
温度の影響を図４に示す。２５、３０、３５、４０℃のなかで短期間（２４時間）では温度の低い方がより良好であるが、９６時間では３０℃がわずかばかり高い結果を得た（図４）。
【００６６】
（５）メタノール比
１モルの油脂は３モルの脂肪酸と１モルのグリセロールより構成されることから、理論的には油脂の完全なエステル化には３モルのアルコールが要求される。合成化学反応での油脂のエステル化では、エステル化効率を上げるため油脂１モルに対してアルコール６モルを使用する反応系も取られている。
そこで酵素を使用した我々の反応系においても、油脂とアルコール比を１：２から１：６の範囲で変化させ、反応を行った。結果を図５に示すが、１：３の時に比べ、１：４において１１．８％のエステル化率上昇（１２０時間目）がみられた。１：５では１：４以上の効果は見られず、１：６では減少した（図５）
【００６７】
以上の結果を総合して、油脂とメタノールの比を１：４、水分を基質の８０％、リパーゼ活性２，０００Ｕ、１２０時間、３０℃の条件が最良の条件の１例であることを見出した。
【００６８】
（６）有機溶媒の添加効果
ＤＭＳＯ、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、石油エーテルを各１０％量添加し、有機溶媒のエステル化反応に及ぼす影響を見た。結果を表３に示す。ＤＭＳＯ、ｎ−ヘキサン、石油エーテルを添加することで４．８％から７．０％のエステル化率上昇が見られた。
このことは、植物から油脂を抽出するときにｎ−ヘキサンなどの有機溶媒が使われるが、それら有機溶媒をいくらか含有する安価な粗精製油脂を原料とすることで、むしろ高い効率でエステルが得られるメリットが得られる。
【００６９】

【００７０】
【発明の効果】
本発明により、きわめて効率的にわずか１工程でバイオディーゼル燃料を製造することが可能となった。また本発明によれば、反応系に有機溶剤や多量の水分が混在していても油脂のエステル化がスムースに進行することから、廃食用油等廃油又はその混合物もバイオディーゼル化することが可能となり、これらを河川等に廃棄する必要がなくなり、廃液処理法として、環境保全の面からも本発明は卓越している。
【図面の簡単な説明】
【図１】米糠油のメタノリシスに及ぼす酵素量の影響を示す。
【図２】米糠油のメタノリシスに及ぼす水分含量とメタノール濃度の累加的影響を示す。
【図３】米糠油のメタノリシスに及ぼすｐＨの影響を示す。
【図４】メチルエステル化反応に及ぼす温度の影響を示す。
【図５】米糠油のメタノリシスに及ぼすメタノールとのモル比の影響を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for efficiently producing biodiesel fuel (hereinafter sometimes simply referred to as biodiesel) that can use the same engine as petroleum-based diesel fuel and is reproducible and has low pollution.
[0002]
[Prior art]
Today, with the increasing air pollution caused by particulates, sulfur oxides, nitrogen oxides, and carbon monoxide emitted by diesel engine vehicles, alternative fuels that emit clean gases with less pollution have come to be demanded.
On the other hand, the energy crisis due to the depletion of fossil fuels such as oil is sure to occur in the near future, and the production of fuel made from natural reproducible raw materials (biomass) such as vegetable oil is an important issue It has become.
[0003]
Under such circumstances, reproducible biodiesel has attracted attention because it can use the same engine as petroleum-based diesel fuel and can significantly reduce exhaust emissions.
[0004]
Biodiesel refers to an alkyl ester obtained by transesterifying glycerol and alcohol in fats and oils, as represented by methyl ester (ME) of fatty acids produced by alcoholysis (methanolysis) of animal and vegetable fats and oils. .
[0005]
Currently, most of this biodiesel is produced by chemical synthesis, but there are many problems such as catalyst removal after reaction, difficulty in recovering by-product glycerol, and the production process requires a lot of energy. Have
[0006]
Therefore, biodiesel production using lipase enzyme has attracted attention. Usually, lipase catalyzes the reaction of hydrolyzing fats and oils (triglycerides) into fatty acids and glycerol, but under conditions where moisture is restricted, it is possible to carry out a reverse reaction in which fatty acids and alcohols are ester-bonded. Furthermore, it is possible to transesterify glycerol in triglyceride with lower alcohol such as methanol by allowing triglyceride to coexist with lower alcohol such as methanol and allowing lipase to act on it.
[0007]
Since one molecule of triglyceride is composed of three fatty acids and one glycerol, theoretically, three moles of lower alcohol is required to make one mole of triglyceride completely into biodiesel (monoalkyl ester).
[0008]
However, in biodiesel production using lipase that has been tried so far, mainly 1 mol of triglyceride is esterified by first adding 1 mol of lower alcohol, and when the reaction is almost completed, an additional 2 mol of It has been carried out by multistage charging such as adding alcohol one by one in order. This is because the lipase generally used tends to lose its activity with a lower alcohol, so that the lipase is added sequentially while suppressing the amount of alcohol added at one time. In addition, the known lipase has a disadvantage that is particularly problematic in industrialization in which the esterification reaction is hindered in a system having a high water content and a system in which an organic solvent such as hexane or petroleum ether is present.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made for the purpose of newly developing an efficient method for producing biodiesel (monoalkyl ester) without the above-mentioned drawbacks.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to achieve the above object, the present inventors have focused on a milder enzyme method than the chemical synthesis method in the production of biodiesel, separated a large number of yeasts from the natural world, and studied their properties. In the process, Cryptococcus sp. S-2 produces and secretes a large amount of lipase in addition to enzymes such as α-amylase and xylanase, and the enzyme exhibits neutral to alkaline and strong oil degradability. Enzymes are stable in organic solvents such as diethyl ether, chloroform, and hexane, and in the presence of triglycerides and methanol, transesterify glycerol and methanol in triglycerides to produce methyl esters of fatty acids. To make methyl ester of oil and fat, that is, to produce biodiesel It found Umate.
[0011]
The present invention has been made on the basis of the above-mentioned new findings, and has not only confirmed that the enzyme is a novel enzyme that has not been previously studied by studying the physicochemical properties of the enzyme, but also for the production of biodiesel. Succeeded and finally completed the present invention. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0012]
The present invention has a basic technical idea of efficiently performing an esterification reaction by allowing lipase to act in the presence of fats and oils (triglycerides) and alcohol, thereby producing biodiesel. Any lipase can be used as long as the transesterification can be carried out in one step and / or the transesterification can be carried out even in the presence of a large amount of water. Examples of such lipases include lipases derived from the genus Cryptococcus, and their physicochemical properties are as follows.
[0013]
(1) Action
It has excellent oil and fat degradability, acts on triglycerides, and hydrolyzes into glycerin and fatty acids. It transesterifies glycerin and alcohol in triglycerides, in other words, catalyzes the monoalkyl esterification of fats and oils.
[0014]
(2) Substrate specificity
The substrate specificity of each fatty acid for triglyceride and oil is as shown in Table 1 below.
[0015]

[0016]
This enzyme efficiently degrades tributyrin, tricaprylin, tripalmitin, and triolein among triglycerides. On the other hand, triacetin, tricaprin, and trilaurin were moderate, and their degradation power was weak against trimyristin and tristearin.
This enzyme showed good degradation activity for all tested oils, especially rice bran oil and sardine oil.
[0017]
(3) Position specificity
The position specificity of degradation when this enzyme acts on triolein was examined. The enzyme reaction produced oleic acid and a small amount of 1,2 (2,3) -diolein, and 1,3-diolein and monoolein were not detected.
[0018]
(4) Optimum pH and stable pH range
The optimum reaction pH of the purified enzyme was 7.0. High activity was also exhibited at pH 8.0. In terms of pH stability, the lipase was stable at pH 5 to pH 9, and functioned in a wide range from weak acidity to weak alkalinity.
[0019]
(5) Reaction optimum temperature and temperature deactivation conditions
The optimum reaction temperature was 37 ° C. However, the deactivation of the activity due to the temperature rise was slow, and the activity of 71% was maintained even after heat treatment at 60 ° C. for 30 minutes.
[0020]
(6) Inhibition, activation and stabilization
Various organic solvents were added at concentrations of 0, 2.5, 5.0, 7.5, and 10.0%, and the effects on the activity of lipase were investigated. The results shown in Table 2 below were obtained. As a result, this lipase is stable in various organic solvents except benzene, and the activity is increased by DMSO (dimethylsulfoxide) and diethyl ether, and the activity increased by 64.2% in the state of DMSO 7.5%. It was observed.
[0021]

[0022]
Thus, it should be noted that the lipase is stable in organic solvents. The transesterification reaction and ester synthesis by lipase proceed only in a system in which an organic solvent and a slight amount of water are mixed, but lipase is generally unstable in a system in which such an organic solvent and water are mixed. It was a problem.
[0023]
However, this lipase exhibits 50% or more activity and stability even in the presence of diethyl ether, chloroform, and hexane, and transesterification and ester synthesis are possible even in the presence of an organic solvent. Biodiesel can also be produced (without purification) from crude oils and fats in which the organic solvent used as the extraction solvent remains, and the enzyme has sufficient activity even in the presence of a large amount of water. In view of these points, the present enzyme is excellent in terms of new production of biodiesel, particularly in terms of industrially efficient production.
[0024]
(7) Measuring method of lipase activity
The lipase activity was measured by an absorbance method at 410 nm using p-nitorophenyl laurate (p-NPL) as a reaction substrate. If necessary, the lipase activity was measured by a titration method using olive oil as a substrate.
[0025]
(8) Molecular weight
22 kDa (SDS-PAGE)
[0026]
In view of the physicochemical properties described above, this type of enzyme was not found in the conventionally known lipases, and this enzyme was identified as a new substance and named lipase CS2 (this is called CS2 lipase) There is also.)
[0027]
The novel enzyme according to the present invention can be isolated and obtained from a culture of a microorganism, for example, an S-2 strain (FERM P-15155) (hereinafter sometimes referred to as CS2 strain) belonging to the genus Cryptococcus. The strain created and isolated here is very characteristic in that it can produce and secrete a novel enzyme (lipase CS2). This strain is referred to as Cryptococcus sp. It was named S-2 (Cryptococcus sp. S-2) and was deposited as FERM P-15155 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0028]
This enzyme can be obtained by culturing the CS2 strain according to a conventional method, extracting from the culture and purifying. For example, pre-culture (5.4 to 5.8 × 10 6) at 25 ° C. in a YM medium (yeast extract 0.3%, malt extract 0.5%, peptone 0.5%, glucose 1%). ⁸ Cell / ml) is used as an inoculum for normal main culture.
[0029]
Yeast extract 0.5%, KH ₂ PO _Four 1% MgSO _Four ・ 7H ₂ The enzyme production medium was based on O 1% and triolein 1%, and the nitrogen, carbon source, and inducer were changed as required. A 100 ml enzyme production medium may be inoculated with 1% (v / v) of the pre-cultured bacteria, and the enzyme may be produced by shaking culture at 25 ° C. and 100 rpm. Triolein may not be added, but the production of lipase by Cryptococcus sp. S-2 reveals about three times the secretion of lipase activity from glucose medium by using oils such as olive oil and triolein as carbon sources. In addition, the production of lipase is significantly enhanced by using fats and oils as a carbon source. In addition to the above, it is preferable to use at least one selected from sardine oil, soybean oil, and triglyceride as the fat.
[0030]
The culture of the CS2 strain may be carried out in the same manner as the yeast culture. However, when oils and fats are used as the carbon source as described above, enzyme production increases. In addition, even when yeast extract is used as the nitrogen source and lactose is used as the sugar, enzyme production increases.
[0031]
After culturing the CS2 strain, the enzyme is separated from the culture and purified. The method may be according to a conventional method. For example, after concentrating the culture solution, a known purification method such as chromatography may be combined. In addition, it is not always necessary to highly purify the present enzyme. For example, a concentrated solution obtained by ultrafiltration of the culture supernatant can be used for the production of biodiesel.
[0032]
Since the present enzyme (CS2 lipase) thus obtained has the above-mentioned properties, it can catalyze transesterification and ester synthesis reactions in the presence of an organic solvent and a large amount of water. It can be used not only for the production of foods, especially for industrial production, but also has the property of normal lipase, namely the hydrolysis of fats and oils, and can be widely used for medicine, cosmetics, food and drink, detergents, reagents and other uses. Of course.
[0033]
In order to carry out the present invention, glycerol and alcohol in fats and oils may be transesterified with lipase in the presence of fats and alcohols. For example, fats, alcohols and lipases are mixed with stirring if necessary. In addition, if the lipase as described above is used, it is not necessary to add alcohol sequentially, and the reaction is performed in one step, in which an organic solvent or a large amount of moisture is mixed. Also has a remarkable effect that the reaction proceeds smoothly.
[0034]
In this way, the present invention uses the lipase produced by the yeast Cryptococcus sp. S-2 to react with 1 mol of triglyceride by adding 3 mol and more lower alcohol from the beginning, and biodiesel by lipase. It is possible to simplify the production process of the present invention, and it is not necessary to add alcohol successively, which is very excellent in industry.
[0035]
In general, lipase undergoes a reaction to hydrolyze the original triglyceride in a state where water is abundant, and esterification, which is the reverse reaction, is the main reaction only when water is severely restricted. However, the lipase produced by Cryptococcus sp. S-2 has an excellent property that the reaction proceeds even at a water content in which esterification is hindered by ordinary lipases.
In the esterification reaction, water is inevitably produced, and this accumulation of water prevents the lipase esterification reaction, but the Cryptococcus sp. S-2 lipase does not have such interference.
[0036]
In addition, many of the waste oil from households that are favorably used as raw materials for biodiesel in Japan contain a lot of water, but Cryptococcus sp. S-2 lipase can be used in such fats and oils as well. It can be used as a raw material for diesel.
[0037]
Cryptococcus sp. S-2 lipase exhibits particularly high ester productivity with respect to rice bran oil among various animal and vegetable oils. Rice bran oil is an inexpensive oil obtained from rice bran and can be produced abundantly in Japan. The ability of Cryptococcus sp. S-2 lipase to produce biodiesel particularly efficiently with respect to rice bran oil is useful for effective utilization of rice bran.
[0038]
Normal lipase shows a decrease in its activity in the presence of hexane and petroleum ether, while Cryptococcus sp. S-2 lipase shows an increase in its activity when mixed with these organic solvents. Cryptococcus sp. S-2 lipase improves esterification efficiency by mixing hexane and petroleum ether in the esterification reaction of triglyceride and lower alcohol. This is because hexane and petroleum used for extracting fats and oils from rice bran, etc. This shows that it is possible to produce biodiesel more efficiently by using crudely refined fats and oils that do not completely remove ether, which is extremely advantageous in terms of cost and production process.
[0039]
As embodiments of the present invention, the following modes are exemplified.
(1) One-stage biodiesel production method using lipase.
(2) Production of biodiesel by lipase with a high water content.
(3) A method for producing biodiesel using lipase of yeast Cryptococcus sp. S-2.
(4) Biodiesel production from rice bran oil.
(5) Biodiesel production from crude fats and oils mixed with hexane, petroleum ether and various organic solvents described above.
[0040]
As fats and oils on which lipase acts, one or more of fats and oils derived from animals (including fish) and plants can be used, and the following are exemplified as non-limiting examples. Vegetable oils such as olive oil, rapeseed oil, soybean oil, rice bran oil, walnut oil, sesame oil, camellia oil, peanut oil. Animal oils such as butter, tallow, beef tallow, sheep tallow, bird tallow and chicken oil. Fish oil such as whale oil, sardine oil, herring oil, cod liver oil.
[0041]
In the present invention, the alkyl esterification reaction of fats and oils is not hindered by the presence of an organic solvent or a large amount of water, so that the fats and oils can be used even if they are not purified, and fats and oils containing and accompanying them, Mixtures of these with fats and oils can also be used. Therefore, solid fats can also be used by dissolving in a solvent. In addition, since the method of the present invention is not affected by the organic solvent or moisture, the fats and oils produced by any method can be used as appropriate. Oils and fats can be used as appropriate without going through a special purification step.
[0042]
As the alcohol, various alcohols other than lower alcohols such as methanol can be used as appropriate, and non-limiting examples thereof include the following: methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, butyl alcohol, Aliphatic alcohols such as isobutyl alcohol, s-butyl alcohol, t-butyl alcohol, amyl alcohol and hexyl alcohol; unsaturated aliphatic alcohols such as allyl alcohol and propargyl alcohol; alicyclic alcohols such as cyclohexanol and cyclopentanol; benzyl Aromatic alcohols such as alcohol and cinnamyl alcohol; other various alcohols.
[0043]
In order to carry out the present invention, it is only necessary to mix and incubate oils, fats, alcohols and lipases, and even if water and organic solvents are mixed in the reaction system, the reaction is not particularly hindered. Since it has been confirmed that the reaction temperature may increase, the reaction conditions are not particularly limited and may be appropriately set over a wide range, but particularly preferable reaction conditions are as follows.
[0044]
The amount of the enzyme is 300 to 5000 U, preferably 500 to 3000 U, more preferably 1500 to 2500 U. Even if the amount of water is 5 to 500 wt% with respect to the substrate weight, the reaction is not inhibited, but rather the water is 60 to 100 wt. % Increase in the amount of ester is observed, and when the amount of alcohol is used in a ratio of 1: 1 to 1: 4 with respect to fats and oils, when the amount of water is small (for example, 50% or less), the amount of alcohol The lower the ratio, the higher the esterification rate, and the higher the water content (for example, 50% or more), the higher the alcohol ratio, the higher the esterification rate.
[0045]
Further, regarding the reaction conditions, no particular inhibition of reaction was observed at pH 5-9 and temperature 25-40 ° C., and the reaction pH and reaction temperature can be selected over a wide range. Although the reaction time is within a suitably selected range such as continuing the reaction until the desired esterification rate is achieved, the intended purpose is achieved in about 50 to 200 hours as a temporary guide. The reaction is preferably carried out with stirring at about 50 to 300 rpm.
[0046]
The method of the present invention is characterized in that the reaction is not inhibited by the presence of various organic solvents as described above in addition to dimethyl sulfoxide (DMSO), diethyl ether, n-hexane, petroleum ether, benzene and other organic solvents for oil and fat extraction. In the case of 30% or less, reaction inhibition was not observed. On the contrary, depending on the type of the organic solvent, for example, when DMSO, n-hexane and petroleum ether were added at 5 to 15%, an increase in the esterification rate was observed. Can even be increased.
Examples of the present invention will be described below.
[0047]
[Example 1]
Yeast extract 0.5%, Lactose 0.5%, KH ₂ PO _Four 1% MgSO _Four ・ 7H ₂ Inoculated with 1% (v / v) CS2 bacteria (FERM P-15155) in a lipase production medium consisting of 1% O and 1% triolein and shaken for 120 hours at initial pH 5.6, 25 ° C., 100 rpm. Cultured at last.
[0048]
The enzyme was purified as follows. The culture solution excluding the yeast cells was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes, filtered through a 0.45 μm membrane filter, and concentrated by ultrafiltration. The lipase was purified by high performance liquid chromatography (gradient elution with pH 7.0 phosphate buffer and 0.5% NaCl added thereto) on a cation exchange resin TSK-gel SP-5PW column. The activity was 17.1 times and the yield was 11.4%. It became a single band on SDS-PAGE, and the molecular weight was found to be 22 kDalton by DSS-PAGE. The physicochemical properties of the obtained enzyme (CS2 lipase) were as described above.
[0049]
[Example 2]
The yeast Cryptococcus sp. S-2 was cultured in a lipase production medium (Example 1) for 120 hours at 25 ° C., and the resulting culture was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes, and the centrifuged supernatant was 10,000 from Amicon. It concentrated with the molecular weight cut ultrafiltration membrane (YM-10), and obtained the enzyme liquid.
[0050]
[Example 3]
A: Using CS2 lipase, fats and oils were reacted with methanol to carry out methyl esterification (methanolysis) of the fats and oils.
[0051]
(1) Lipase activity
The lipase activity was measured by spectrophotometry using p-nitrophenyl lauric acid (p-NPL) as a substrate. Under a standard activity measurement method, an enzyme that produces 1 micromole of p-nitrophenol was defined as 1 unit of enzyme activity.
[0052]
(2) Methyl esterification
A mixture of oil and methanol 9.65 g / 0.35 g (mol / mol = 1/1) was used as the initial substrate. A 4 ml enzyme solution containing 500 U of CS2 lipase was added to this in a 100 ml conical stoppered Erlenmeyer flask to make a reaction mixture, and the reaction was carried out by shaking at 30 ° C. for 96 hours at 160 rpm. Samples were collected every 24 hours and analyzed by capillary gas chromatograph as follows.
[0053]
(3) Reaction optimization research
Reaction conditions were examined by varying the amount of enzyme in the range of 500 to 2,500 U, the amount of water relative to the substrate weight in the range of 13 to 200 wt%, and the amount of methanol in the range of 1: 1 to 1: 4 with respect to the oil. Furthermore, reaction conditions were investigated at pH 5-9 and temperature 25-40 degreeC. The influence of various organic solvent additions (10%, w / v) was also examined.
[0054]
(4) Capillary gas chromatograph analysis
A sample of 300 microliters was independently taken from the reaction solution at regular intervals, and the supernatant was obtained after centrifugation. In a 15 ml test tube, 3.0 ml of hexane was added to 100 microliter supernatant using 60 microliters of tricaprin as an internal standard and anhydrous sodium sulfate as a dehydrating agent, and mixed well with stirring. A 1.0-microliter sample was taken from the sample, and the reaction product was measured on a glass chromatogram (Shimadzu, GC-17A) using a DB-5 capillary column (0.25 mm × 15 m; J & W Scientific, Forsom, CA, USA). The ME (methyl ester) and FFA (free fatty acid content) were measured. The injector and detector temperatures are 245 and 250 ° C., respectively. The column was held at 150 ° C. for 0.5 minutes, and then heated up to 210 ° C. at 5 ° C./min, and thereafter up to 300 ° C. at 10 ° C./min.
[0055]
B: Yeast cryptococcus sp. Obtained in Example 2. Using the crude purified product derived from S-2 as lipase, methyl ester of vegetable oil was performed.
[0056]
Table 1 shows the results of examining the esterification reaction of olive oil, rapeseed oil, rice bran oil, soybean oil, and methanol with this lipase. See experimental method for reaction conditions. Rice bran oil showed an esterification rate of 24.9% in a reaction at 30 ° C. for 96 hours, showing the best results. From this, the experiment after that decided to use rice bran oil as the base oil.
[0057]

[0058]
(1) Effect of enzyme amount (on rice bran oil methyl esterification)
Next, the reaction was carried out with a lipase addition amount in the range of 500 U to 2,000 U. As a result, as shown in FIG. 1, the esterification rate improved with an increase in the amount of enzyme, and the esterification rate was 33% with 2,000 U. This corresponds to the maximum value of the ester ratio obtained when 1 mol of methanol is added to an oil having 3 mol of fatty acid in one molecule (FIG. 1).
[0059]
(2) Effect of moisture (on rice bran oil methyl esterification)
Under conditions of a moisture content of 13% and 48 hours, the methyl ester content (ME) was 31.5%, and 94.6% methanol in the reaction solution was consumed. As the water content increased to 30 and 50%, the amount of ester produced at 48 hours decreased to 8.9 and 16.5%, but as shown in Table 2, after 96 hours, the amount of produced ester was almost unchanged. The difference is gone. On the other hand, the free fatty acids after 96 hours at 13% and 50% moisture were 24.0 and 42.1%, respectively, and there was a tendency for the higher moisture content to increase.
[0060]

[0061]
(3) Effect of water content and amount of methanol added (on rice bran oil methyl esterification) At least 3 moles of methanol are required to completely convert the oil to fatty acid ester. However, for example, in the case of Rhizopus oryzae lipase, enzyme inactivation occurs in a reaction system containing 1 mol or more of methanol. Therefore, it is necessary to take a method of sequentially adding 1 mol of methanol in the esterification reaction.
[0062]
However, if the lipase used does not inactivate even when the amount of methanol is increased, the operation becomes easier if the amount of methanol is increased from the beginning and the number of additions is reduced.
Therefore, the reaction was carried out by a one-step method in which the ratio of fat / methanol to methanol was 1: 1 to 1: 4, and the water content was 20 to 200% based on the substrate weight. As shown in FIG. 2, as the methanol ratio increased (1: 1 to 1: 4), and the water content increased in the range of 60 to 100%, the amount of methyl ester increased (FIG. 2). .
[0063]
From the above, it was confirmed that Cryptococcus sp. S-2 lipase can be reacted by adding a large amount of methanol at once from the beginning.
In addition, in general lipases such as Pseudomonas fluorescens and Mucor miehei, when water is added to the reaction solution, the ester conversion rate decreases. The opposite effect was observed.
[0064]
(4) Effect of pH and temperature
The effect of pH on the esterification reaction was examined under the condition of 80% added water with respect to the substrate. The results are shown in FIG. 3, and in the range of pH 5 to 9 examined, the reaction decreased as the pH increased. However, as a result, the one without pH adjustment showed the highest ester conversion. This seems to be due to the presence of the salt used for pH adjustment inhibiting the enzyme reaction. As a result, it was shown that there was no need for pH adjustment (FIG. 3).
[0065]
The influence of temperature is shown in FIG. Of the 25, 30, 35, and 40 ° C., the lower temperature was better in the short period (24 hours), but in 96 hours, 30 ° C. was slightly higher (FIG. 4).
[0066]
(5) Methanol ratio
Since 1 mol of fat is composed of 3 mol of fatty acid and 1 mol of glycerol, theoretically 3 mol of alcohol is required for complete esterification of the fat. In the esterification of fats and oils in a synthetic chemical reaction, a reaction system using 6 moles of alcohol per mole of fats and oils is also taken in order to increase esterification efficiency.
Therefore, even in our reaction system using an enzyme, the reaction was carried out by changing the ratio of oil and fat to alcohol in the range of 1: 2 to 1: 6. The results are shown in FIG. 5, and an esterification rate increase (120 hours) of 11.8% was observed at 1: 4 compared to 1: 3. 1: 5 did not show an effect of 1: 4 or more, and 1: 6 decreased (FIG. 5).
[0067]
By combining the above results, it was found that the ratio of fat / methanol to methanol was 1: 4, moisture was 80% of the substrate, lipase activity was 2,000 U, 120 hours, and 30 ° C. was one example of the best conditions. It was.
[0068]
(6) Effect of adding organic solvent
DMSO, diethyl ether, n-hexane, and petroleum ether were added in amounts of 10% each, and the effect on the esterification reaction of an organic solvent was observed. The results are shown in Table 3. Addition of DMSO, n-hexane and petroleum ether showed an increase in esterification rate from 4.8% to 7.0%.
This means that when extracting fats and oils from plants, organic solvents such as n-hexane are used, but by using inexpensive crude oils and fats that contain some of these organic solvents, esters can be obtained with rather high efficiency. Benefits that can be obtained.
[0069]

[0070]
【The invention's effect】
The present invention has made it possible to produce biodiesel fuel very efficiently in just one step. Furthermore, according to the present invention, even when an organic solvent or a large amount of water is mixed in the reaction system, the esterification of fats and oils proceeds smoothly, so it is possible to biodiesel waste oil such as waste cooking oil or a mixture thereof. Therefore, it is not necessary to dispose of them in rivers and the like, and the present invention is excellent from the viewpoint of environmental conservation as a waste liquid treatment method.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of enzyme amount on methanolysis of rice bran oil.
FIG. 2 shows the cumulative effect of water content and methanol concentration on methanolysis of rice bran oil.
FIG. 3 shows the effect of pH on the methanolysis of rice bran oil.
FIG. 4 shows the effect of temperature on the methyl esterification reaction.
FIG. 5 shows the effect of the molar ratio with methanol on the methanolysis of rice bran oil.

Claims

The biodiesel manufacturing method characterized by performing fats and oils esterification reaction using lipase CS2 which has the following physicochemical properties in presence of fats and alcohols.
(1) Action It has oil and fat decomposability, acts on triglycerides, and hydrolyzes to glycerin and fatty acids. Catalyze the esterification reaction of fats and oils in the presence of fats and alcohols.
(2) Substrate specificity Decomposes tribtilin, tricaprylin, tripalmitin and triolein well.
(3) Regiospecificity When acting on triolein, oleic acid and a small amount of 1,2 (2,3) -diolein are produced, and 1,3-diolein and monoolein are not detected.
(4) Optimal pH and stable pH range Optimal pH: 7.0
Stable pH range: 5-9
(5) Reaction optimum temperature and conditions for deactivation by temperature Reaction optimum temperature: 37 ° C
Conditions for deactivation due to temperature: Deactivation due to temperature rise is moderate, and the activity is maintained even after heat treatment at 60 ° C. for 30 minutes.
(6) Stability to organic solvent, activation It is stable to organic solvent, and its activity is increased by dimethyl sulfoxide and diethyl ether.
(7) Molecular weight 22 kDa (SDS-PAGE)
(8) Cryptococcus sp. Produced by S-2 (Cryptococcus sp. S-2) (FERM P-15155).

The method for producing biodiesel according to claim 1, wherein the esterification reaction of fats and oils is performed in one stage.

The method for producing biodiesel according to any one of claims 1 to 2, wherein the esterification reaction of fats and oils is performed regardless of the presence of moisture.

The method according to claim 1, wherein vegetable oil is used as the fat.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein a fat or oil mixed with waste oil or an organic solvent is used as the fat or oil.