JP3836888B2 - Chemically defined non-polymeric bond-hand platform molecules and their complexes - Google Patents

Description

【００１０】
あるいは、
【００１１】
【化９】

【００１２】
但し、存在する場合、G^[1]およびG^[2]は各々独立して、C、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-2000の、さらに好ましくは1-1000の鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝した鎖である。
【００１３】
さらに好ましくは、存在する場合、G^[2]は、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリグリコールから誘導される基であり、最も好ましくはG^[2]は、qが0から20の-(CH₂)_q-、rが0から300の-CH₂(CH₂OCH₂)_rCH₂-、および、sが1から4、さらに好ましくはsが3から4のC(CH₂0CH₂CH₂-)_s(OH)_4-sからなる群から選択される。
【００１４】
T^[1]として示されたn^[1]個の部分、および、T^[2]として示されたp^[2]×n^[2]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)NHNHR^SUB(ヒドラジド)、-NHNHR^SUB(ヒドラジン)、-C(=O)OH(カルボン酸)、-C(=O)OR^ESTER(活性エステル)、-C(=O)OC(=O)R^B(無水物)、-C(=O)X(酸ハライド)、-S(=O)₂X(スルホニルハライド)、-C(=NR^SUB)OR^SUB(イミデートエステル)、-NCO(イソシアネート)、-NCS(イソチオシアネート)、-OC(=O)X(ハロホルメート)、-C(=O)OC(=NR^SUB)NHR^SUB(カルボジイミド付加体)、-C(=O)H(アルデヒド)、-C(=O)R^B(ケトン)、-SH(スルフヒドリル、あるいはチオール)、-OH(アルコール)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、-R^ALKX(アルキルハライド)、-S(=O)₂OR^ALKX(アルキルスルホネート)、R¹R²が、-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)、-R^ALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００１５】
さらに好ましくは、T^[1]として示されたn^[1]個の部分、および、T^[2]として示されたp^[2]×n^[2]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、-R^ALKX(アルキルハライド)、-S(=O)₂OR^ALKX(アルキルスルホネート)、R¹R²が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)、-R^ALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００１６】
さらにより好ましくは、T^[1]として示されたn^[1]個の部分、および、T^[2]として示されたp^[2]×n^[2]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、R¹R²が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、および、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)からなる群から選択される。
【００１７】
最も好ましくは、T^[1]として示されたn^[1]個の部分の全て、および、T^[2]として示されたp^[2]×n^[2]個の部分の全ては、同じである。
【００１８】
式中の、
各Xは独立して、原子番号が16より大きく54未満のハロゲン(Cl=17,Br=35,I=53)、あるいは他の良好な脱離基(すなわち、この状況でハロゲンと同様に振舞う、アルキルあるいはアルキル置換のスルホネートあるいはスルフェート等、アリールあるいはアリール置換のスルホネートあるいはスルフェート等、の弱い塩基)である。
【００１９】
各R^ALKは独立して直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル基である。
【００２０】
各R^SUBは独立して、H、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００２１】
各R^ESTERは独立して、N-スクシンイミジル、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2,4,5-トリクロロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、シアノメチル等、あるいは、5-クロロ-8-キノロン-1-イル、1-ピペリジル、N-ベンゾトリアゾリル等、の様なその他の活性化基である。
【００２２】
各R^Bは独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-50の原子を含む基である。
【００２３】
存在する場合、L^[2]で示されるn^[2]個の部分は各々独立して、O、NR^SUBおよびSからなる群から選択される。
【００２４】
存在する場合、J^[2]で示されるn^[2]個の部分は各々独立して、C(=O)およびC(=S)からなる群から選択される。
【００２５】
n^[1]は、1から32であり、より好ましくはn^[1]は2から16であり、さらに好ましくはn^[1]は2から8であり、最も好ましくはn^[1]は2から4である。
【００２６】
n^[2]×p^[2]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n^[2]は、1から32であり、より好ましくはn^[2]は1から16であり、さらに好ましくはn^[2]は1から8であり、さらにより好ましくはn^[2]は1から4であり、最も好ましくはn^[2]は1から2である；
p^[2]は、1から8であり、より好ましくはp^[2]は1から4であり、最も好ましくはp^[2]は1から2である。
【００２７】
Z^[2]で示されるn^[2]個の部分は各々独立して、少なくともp^[2]個の官能基のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-200の原子を含む基である。
【００２８】
より好ましくは、Z^[2]として示されたn^[2]個の部分の全ては、同じである。
【００２９】
さらに好ましくは、Z^[2]として示されたn^[2]個の部分は各々独立して以下の群から選択される式で記述される。
【００３０】
【化１０】

【００３１】
【化１１】

【００３２】
あるいは、
【００３３】
【化１２】

【００３４】
但し式中、存在する場合、W^[3]、W^[4]、あるいはW^[5]として示されたn^[2]個の部分は各々独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００３５】
Y^[3]として示されたn^[2]個の部分、Y^[4]として示された2×n^[2]個の部分、およびY^[5]として示された2×n^[2]個の部分は各々独立して、少なくともp^[2]個の官能基(Y^[3]の場合)、あるいは、p^[2]/2個の官能基(Y^[4]およびY^[5]の場合、但しp^[2]/2は整数である)のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００３６】
より好ましくは、存在する場合、W^[3]として示されたn^[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH₂)_r、(CH₂CH₂O)_r、NR^SUB(CH₂CH₂O)_rCH₂CH₂、およびNR^SUB(CH₂)_rNR^SUBC(=O)である。
【００３７】
さらに好ましくは、Y^[3]で示されたn^[2]個の部分は各々独立して、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００３８】
最も好ましくは、Y^[3]で示されたn^[2]個の部分は各々独立して、C₆H₄(1,4-二置換フェニル)、C₆H₃(1,3,5,-三置換フェニル)、およびrが1から10である(CH₂)_rからなる群から選択される。
【００３９】
より好ましくは、存在する場合、W^[4]として示されたn^[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH₂)_rC(=O)、および(CH₂)_rNR^SUBC(=O)からなる群から選択される。
【００４０】
より好ましくは、Y^[4]として示された2×n^[2]個の部分は各々独立して、rが1から10、より好ましくはrが2から6で、qが1から10、より好ましくはqが1から3である、(CH₂)_r、(CH₂)_rNR^SUBC(=O)(CH₂)_q、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_q、(CH₂)_rNR^{SU B}C(=O)(CH₂)_qNR^SUBC(=O)(CH₂)_r、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_qNR^SUBC(=O)(CH₂)_r、(CH₂)_rNR^SUBC(=O)(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂、および、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂からなる群から選択される。
【００４１】
より好ましくは、存在する場合、W^[5]で示されたn^[2]個の部分は各々独立して、rが1から10である、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB、および(CH₂)_rNR^SUBC(=O)NR^SUBからなる群から選択される。
【００４２】
より好ましくは、Y^[5]で示された2×n^[2]個の部分は各々独立して、rが1から10でqが1から10である、(CH₂)_r、および(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_qからなる群から選択される。
【００４３】
狼瘡を治療するための、別の好ましい実施態様では、複合体は、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子、および、該プラットフォーム分子に各々結合し、そして、ヒトSLEの抗dsDNA自己抗体に対して顕著な結合活性を有する、複数の少なくとも約20塩基対のポリヌクレオチド二本鎖を含む。これらの好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド二本鎖は、実質的に長さが均一で、そして、二本鎖の一方の一本鎖が、直接に、あるいはリンカー分子を介して、の何れかで結合手プラットフォーム分子と結合されている。一般に、合成ポリヌクレオチドをリンカー分子と結合させ、次いで結合手プラットフォーム分子と結合させる。一般に、鎖中のリンカー分子が結合した位置から、少なくとも約20塩基対のペンダント鎖が各鎖に形成される様に、二本鎖の内のリンカーを含む鎖を、その一端で、あるいは一端の近傍(即ち、約5塩基対以内)で結合させる。次いで、第２の鎖を該第１の鎖にアニールし、二本鎖を形成する。従って、本発明の複合体は、以下の式で一般的に記述し得る：
[(PN)_n-リンカー]_m-結合手プラットフォーム分子
但し式中、nは少なくとも約20で、mは2-8であり、PNはn個のヌクレオチドを有する二本鎖ポリヌクレオチドである。
【００４４】
本発明に適したリンカー分子の例は、チオ-6炭素鎖ホスフェートであるHADの様な6個の炭素のチオール、およびチオ-6炭素鎖ホスホロチオエートであるHAD_pSである。本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子は、例えば、アミノ修飾したPEGと、3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイルクロライド(本明細書では以降「IA-DABAクロライド」と呼ぶ)；3-カルボキシプロピオンアミド-N,N-ビス-[(6'-N'-カルボベンジルオキシアミノヘキシル)アセトアミド] 4"-ニトロフェニルエステル(本明細書では以降「BAHA」と呼ぶ)；3-カルボキシプロピオンアミド-N,N-ビス-[(8'-N'-カルボベンジルオキシアミノ-3',6',-ジオキサオクチル)アセトアミド] 4"-ニトロフェニルエステル(本明細書では以降「BAHA_OX」と呼ぶ)とを反応させ；あるいは、PEG-ビス-クロロホルメートと、N,N-ジ[2-(6'-N'-カルボベンジルオキシアミノヘキサノアミド)エチル]アミン(本明細書では以降「AHAB」と呼ぶ)とを反応させることにより形成される。
【００４５】
本発明の複合体の二本鎖のヌクレオチド組成は、実質的に均一であり得る。本発明の複合体の二本鎖の長さは、20から50塩基対であり得る。本発明の複合体の二本鎖は、その端部あるいはその近傍で、結合手プラットフォーム分子に結合し得る。本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は、異なる塩基の2マーから4マーの、相補的な繰り返し単位から構成され得る。本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は：ポリ(CG):ポリ(CG)；ポリ(TA):ポリ(TA)；ポリ(CI):ポリ(CI)；ポリ(CA):ポリ(TG)；あるいは、ポリ(GA):ポリ(TC)；であり得る。
【００４６】
本発明の複合体においては、ポリヌクレオチド二本鎖は、(CA)₁₀:(TG)₁₀であり得、上記結合手プラットフォーム分子は、誘導体化されたトリエチレングリコールであり得る。この複合体においては、上記二本鎖と、上記結合手プラットフォーム分子との、モル比は、好ましくは2:1から8:1であり、さらに好ましくは4:1である。
【００４７】
本発明の複合体においては、ポリヌクレオチド二本鎖は、(CA)₁₀:(TG)₁₀であり得、上記結合手プラットフォーム分子は、誘導体化された1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタンであり得る。この複合体においては、上記二本鎖と、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタンとの、モル比は、好ましくは2:1から8:1であり、さらに好ましくは4:1である。
【００４８】
本発明の複合体は、ヒトSLE(全身性紅斑性狼瘡)の免疫寛容原であり得る。
【００４９】
本発明の複合体のポリヌクレオチド二本鎖は、B-DNAタイプの螺旋構造を有し得、そして、ヒトSLE(全身性紅斑性狼瘡)の抗dsDNA自己抗体に対して顕著な結合活性を有し得る。
【００５０】
本発明によれば、狼瘡の治療のための薬学的組成物は、薬学的に許容可能で注射可能な賦形剤と共に処方された、本発明の複合体を含み得る。狼瘡を患った個体を治療する方法は、治療を必要とする個体に、治療に有効な量のこの組成物を投与する工程を含み得る。
【００５１】
本発明の複合体を製造するための方法は：(a)各々が少なくとも約20塩基対の複数の一本鎖ポリヌクレオチドを、上記結合手プラットフォーム分子上に結合させる工程；および(b)相補的な一本鎖ポリヌクレオチドを、結合手プラットフォーム分子に結合したこの一本鎖ポリヌクレオチドとアニールさせ、上記二本鎖を形成する工程、を含み得る。この方法は、先ず、上記ポリヌクレオチド二本鎖をリンカー分子に結合し、そして次に、このリンカー分子を上記結合手プラットフォーム分子に結合する工程をさらに含み得る。
【００５２】
本発明の複合体の生物学的あるいは化学的分子は、免疫原のアナログであり得、ここで、(a)このアナログは、免疫原が特異的に結合するB細胞に、特異的に結合し、そして(b)この複合体はT細胞のエピトープを欠いているものであり得る。ここで、上記免疫原は、生物学的薬剤、アレルゲン、Rh溶血性疾患に関連したRh/D免疫原、男性不妊症に関連したα-精子、あるいは、リウマチ熱に関連した炭水化物複合体のような外来免疫原であり得る。あるいは、上記免疫原は、甲状腺炎、糖尿病、卒中、あるいは重症筋無力症に関連しているような自己免疫原であり得る。上記免疫原および上記アナログは、同じ化学種、例えば、ポリペプチドであり得る。あるいは、上記免疫原および上記アナログは、異なる化学種であり得る。
【００５３】
本発明によれば、抗体が媒介する疾患の治療のための薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアーと組合わされた、治療に有効な量の本発明の複合体を含み得る。
【００５４】
本発明によれば、免疫原に対して特異的なB細胞アネルギーを、個体中に誘起する方法は、有効な量の本発明の複合体を、例えば、上記の薬学的組成物の形態で、個体に投与する工程を含み得る。
【００５５】
本発明によれば、免疫原に対する応答で望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を有する個体を治療する方法は、治療に有効な量の本発明の複合体を、例えば上記の薬学的組成物の形態で、個体に投与する工程を含み得る。
【００５６】
本発明の複合体を製造する方法は：(a)T細胞のエピトープを欠いている上記の免疫原のアナログを、化学的に定義された上記結合手プラットフォーム分子と共有結合させ、複合体を形成する工程；および(b)この複合体を反応混合物中から回収する工程、を含み得る。ここで、上記免疫原は、生物学的薬剤、アレルゲン、男性不妊症に関連したα-精子、あるいは、Rh溶血性疾患に関連したRh/D免疫原のような外来免疫原であり得る。あるいは、上記免疫原は、甲状腺炎、糖尿病、卒中、重症筋無力症、あるいは、リウマチ熱に関連しているような自己免疫原であり得る。上記免疫原およびアナログは、同じ化学種であり得る。
【００５７】
驚くべきことに、本発明の化学的に定義された、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と、生物学的あるいは化学的な分子(非ハプテン)とからなる複合体を用いると、従来技術に記載されているポリマー性の担体に比べ、少なくとも約10倍から数100倍以上の免疫抑制という、予期されなかった結果が達成された。例えば、本明細書に記載したように、化学的に定義された、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を含む本発明の複合体を用いると、従来技術に記載されている定義の不明確な担体に比べ、少なくとも100倍の抗-dsDNA自己抗体の免疫抑制が達成された。
【００５８】
本発明のさらに別の局面は、(a)化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と、(b)二本鎖の一方の鎖の一端あるいは一端の近傍に位置する官能基により、該結合手プラットフォーム分子に、各々全てが結合された、複数のポリヌクレオチド二本鎖とからなり、ヒトSLEの免疫寛容原である、複合体である。
【００５９】
上記の複合体の薬学的組成物、および、薬学的に許容可能な製薬媒体は、本発明のさらに別の局面である。
【００６０】
本発明の別の局面は、治療を必要とする個体に、有効な量の上記の複合体を投与する工程を含む、SLEを治療する方法である。
【００６１】
本発明のさらに別の局面は、有効な量の上記の複合体を、個体に投与する工程を含む、個体中に、免疫原に対する特異的なB細胞アネルギーを誘起する方法である。
【００６２】
本発明の別の局面は、有効な量の上記の複合体を個体に投与する工程を含む、免疫原に応答して望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を治療する方法である。
【００６３】
本発明の別の局面は、生物学的あるいは化学的な分子を、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合させて、複合体を形成する工程を含む、上記の複合体を製造するための方法である。
【００６４】
本発明の別の局面は、各々が少なくとも約20ヌクレオチドの長さで、そして、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子上の官能基と反応する官能基をその一端あるいは一端の近傍に有する、複数の一本鎖ポリヌクレオチドを、反応させて複合体を形成する工程、および、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合された一本鎖ポリヌクレオチドと、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドとをアニールして、二本鎖DNAのペンダント鎖を形成する工程を含む、上記のSLEを治療するための複合体の製造方法である。
【００６５】
本発明のさらに別の局面は、以下の式の新規な、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子である：
【００６６】
【化１３】

【００６７】
あるいは、
【００６８】
【化１４】

【００６９】
但し、存在する場合、G^[6]およびG^[7]は各々独立して、C、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-2000の、より好ましくは1-1000の、鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝した鎖である。
【００７０】
さらに好ましくは、G^[6]およびG^[7]は各々、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリグリコールから誘導される基である。
【００７１】
最も好ましくは、G^[6]およびG^[7]は各々、qが0から20の-(CH₂)_q-、rが0から300の-CH₂(CH₂OCH₂)_rCH₂-、およびsが1から4の、より好ましくはsが3から4の、C(CH₂0CH₂CH₂-)_s(OH)_4-sからなる群から選択される。
【００７２】
T^[6]として示されたn^[6]×p^[6]個の部分、および、T^[7]として示されたp^[7]×n^[7]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)NHNHR^SUB(ヒドラジド)、NHNHR^SUB(ヒドラジン)、-C(=O)OH(カルボン酸)、-C(=O)OR^ESTER(活性エステル)、-C(=O)OC(=O)R^B(無水物)、-C(=O)X(酸ハライド)、-S(=O)₂X(スルホニルハライド)、-C(=NR^SUB)OR^SUB(イミデートエステル)、-NCO(イソシアネート)、-NCS(イソチオシアネート)、-OC(=O)X(ハロホルメート)、-C(=O)OC(=NR^SUB)NHR^SUB(カルボジイミド付加体)、-C(=O)H(アルデヒド)、-C(=O)R^B(ケトン)、-SH(スルフヒドリル、あるいはチオール)、-OH(アルコール)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、-R^ALKX(アルキルハライド)、-S(=O)₂OR^ALKX(アルキルスルホネート)、R¹R²が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)、-R^ALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００７３】
より好ましくは、T^[6]として示されたn^[6]×p^[6]個の部分、および、T^[7]として示されたn^[7]×p^[7]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、-R^ALKX(アルキルハライド)、-S(=O)₂OR^ALKX(アルキルスルホネート)、R¹R²が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)、-R^ALK-Hg-X(アルキル水銀)、および-S(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和スルホン)からなる群から選択される。
【００７４】
さらに好ましくは、T^[6]として示されたn^[6]×p^[6]個の部分、および、T^[7]として示されたn^[7]×p^[7]個の部分は各々独立して、-NHR^SUB(アミン)、-C(=O)CH₂X(ハロアセチル)、R¹R²が-C(=O)CH=CHC(=O)-である-NR¹R²(マレイミド)、-C(=O)CR^B=CR^B ₂(α,β-不飽和カルボニル)からなる群から選択される。
【００７５】
最も好ましくは、T^[6]として示されたn^[6]×p^[6]個の部分の全て、および、T^[7]として示されたn^[7]×p^[7]個の部分の全ては、同じである。
【００７６】
ここで式中、
各Xは、独立して、原子番号が16から54のハロゲン、あるいは良好な脱離基である。
【００７７】
各R^ALKは独立して、直鎖、分枝あるいは環状の(1-20C)のアルキル基である。
【００７８】
各R^SUBは独立して、H、直鎖、分枝、あるいは環状の(1-20C)のアルキル、(6-20C)のアリール、あるいは(7-30C)のアルキルアリールである。
【００７９】
各R^ESTERは独立して、N-スクシンイミジル、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2,4,5-トリクロロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、シアノメチル等、あるいは、5-クロロ-8-キノロン-1-イル、1-ピペリジル、N-ベンゾトリアゾリル等、の様なその他の活性化基である。
【００８０】
各R^Bは独立して、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-50の原子を含む基である。
【００８１】
n^[6]×p^[6]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n^[6]は、1から32であり、より好ましくはn^[6]は1から16であり、さらに好ましくはn^[6]は1から8であり、さらに好ましくはn^[6]は1から4であり、最も好ましくはn^[6]は1から2である；
p^[6]は、1から8であり、より好ましくはp^[6]は1から4であり、最も好ましくはp^[6]は1から2である。
【００８２】
n^[7]×p^[7]の積が、1より大きくかつ33未満という条件で、
n^[7]は、1から32であり、より好ましくはn^[7]は1から16であり、さらに好ましくはn^[7]は1から8であり、さらに好ましくはn^[7]は1から4であり、最も好ましくはn^[7]は1から2である；
p^[7]は、1から8であり、より好ましくはp^[7]は1から4であり、最も好ましくはp^[7]は1から2である。
【００８３】
Q^[6]で示されたn^[6]個の部分、および、Q^[7]で示された2×n^[7]個の部分は各々独立して、少なくともp^[6]個の(Q^[6]の場合)あるいはp^[7]/2個の(Q^[7]の場合、例えば、だしp^[7]/2は整数である)の官能基のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、C、H、N、O、Si、PおよびSからなる群から選択される1-100の原子を含む基である。
【００８４】
より好ましくは、Q^[6]として示されたn^[6]個の部分の全ては、同じである。
【００８５】
より好ましくは、Q^[7]として示された2×n^[7]個の部分の全ては同じである。
【００８６】
より好ましくは、Q^[6]として示されたn^[6]個の部分は各々独立して、rが1から10でqが1から10である、CH[(CH₂)_r(結合部位)]₂、およびCH[(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_q(結合部位)]₂からなる群から選択される。
【００８７】
より好ましくは、Q^[7]として示された2×n^[7]個の部分は各々独立して、rが1から10、より好ましくはrが2から6であり、qが1から10、より好ましくはqが1から3である、(CH₂)_r、(CH₂)_rNR^SUBC(=O)(CH₂)_q、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_q、(CH₂)_rNR^SUBC(=O)(CH₂)_qNR^SUBC(=O)(CH₂)_r、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂)_qNR^SUBC(=O)(CH₂)_r、(CH₂)_rNR^SUBC(=O)(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂、および、(CH₂)_rC(=O)NR^SUB(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂からなる群から選択される。
【００８８】
【発明の構成】
本明細書で使用する用語「結合手プラットフォーム分子」は、別個の多くの生物学的および/あるいは化学的な分子の結合を可能とする複数の部位を有する、化学的に定義された、非ポリマー性の、非免疫原性の分子を意味する。
【００８９】
本明細書で使用する用語「非免疫原性」は、前記結合手プラットフォーム分子の形容詞に用いられ、そして、前記結合手プラットフォーム分子が、単独で個体に投与された時に、免疫応答を実質的に引き起こさないことを意味する。
【００９０】
本明細書で使用する用語「個体」は、多くの哺乳類の種を意味し、ヒト、霊長類、マウス、および、ウシや羊の様な家畜、馬の様な競技用動物、および、犬や猫の様なペット等を含む。
【００９１】
本明細書で使用する用語「免疫原(immunogen)」は、動物に注入した時に、液性免疫応答を誘起する物質である。免疫原は、B細胞エピトープおよびT細胞エピトープの両方を有する。
【００９２】
本明細書で使用する用語、免疫原の「アナログ」は、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く分子の意味である。通常は、アナログは免疫原の断片であるか誘導体であるため、免疫原と同じ化学種に属するが(例えば、免疫原がポリペプチドで、アナログがポリペプチド)、化学的類似性は重要では無い。従って、上記の(a)および(b)の機能的特性を有するという条件で、アナログは免疫原と異なった化学種(例えば、免疫原が炭化水素で、アナログがポリペプチド)であり得る。アナログは、タンパク質、炭水化物、脂質、リポプロテイン、グリコプロテイン、リポポリサッカライド、核酸、あるいは他の化学的あるいは生物学的物質であり得る。
【００９３】
免疫原のアナログには、「ミモトープ」もまた含まれ得る。本明細書で使用する用語「ミモトープ」は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる、合成分子を意味する。抗体と特異的に結合するので、ミモトープは、免疫原の抗原決定部位を模倣していると考えられている。免疫原のアナログと同様に、ミモトープは、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く。
【００９４】
免疫原のアナログには「アプタマー」もまた含まれ得る。本明細書で使用する用語「アプタマー」は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる合成オリゴヌクレオチドを意味する。免疫原のアナログと同様にアプタマーは、(a)免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして(b)T細胞エピトープを欠く。
【００９５】
本明細書で使用する用語「B細胞アネルギー」は、抗体の産生および分泌にT細胞の補助を受けることを必要とするB細胞の応答の欠如を意味し、そして、これらに限定されないが、成熟および/あるいは未成熟B細胞のクローン欠損、および/あるいは、B細胞が抗体を産生する能力を欠如すること、を含む。本明細書で使用する用語「応答の欠如」は、免疫原に対する液性応答の治療的に有効な減少を意味する。定量的表現では、(抗体産生の減少で測定される)該減少は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、そして最も好ましくは100%である。
【００９６】
本明細書で使用する用語「抗体」は、その産生が、T細胞依存性の抗体を意味する。
【００９７】
本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子の価数は、該プラットフォーム分子に導入する分枝した基の数により、予め定め得る。適切な分枝した基は、一般に、ジアミノ酸、トリアミン、およびアミノ二酸から誘導される。ジアミノ酸およびアミノ二酸の例には、以下の式の化合物が含まれる：
【００９８】
【化１５】

【００９９】
本発明の複合体は、生物学的に安定である；即ち、数時間、数日、あるいは数カ月のオーダーのin vivoでの排泄半減期を示し、治療効果に寄与する。本発明の化学的に定義された結合手プラットフォーム分子はまた、実質的に非免疫原性であり(即ち、動物に投与した際に免疫原性を示さない、あるいは穏やかな免疫原性のみを示す)、与えた投与量で非毒性であり(即ち、治療薬として有用であるために十分な程度に非毒性)、そして好ましくは、定義された化学構造からなる。これらは、ポリヌクレオチド二本鎖の様な、複数の生物学的あるいは化学的分子が共有結合で結合し得る、非免疫原性で非毒性の多官能性基質を提供する。これらは通常、約200から約200,000の範囲の平均分子量を有し、一般には約200から約20,000である。これらは、分子量が大きく変動する化合物の混合物である従来技術のポリマーに比べ、均一である。特に好適で均一な本発明の結合手プラットフォーム分子の例は、約200から8,000の分子量を有する誘導体化した、2,2'-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)、トリエチレングリコール(TEG)、およびポリエチレングリコール(PEG)である。
【０１００】
生物学的あるいは化学的な分子の、化学的に定義されたプラットフォーム分子への結合は、多くの方法で行い得る。典型的には、生物学的あるいは化学的な分子、および、結合手プラットフォーム分子の官能基ならびに、1種類あるいはそれ以上の架橋剤を用いて行われる。
【０１０１】
結合手プラットフォーム分子にカップリングされる合成ポリヌクレオチド二本鎖は、少なくとも約20 bp、そして好ましくは20-50 bpからなる。本明細書に記載するポリヌクレオチドは、他にことわりが無い限りデオキシリボヌクレオチドであり、5'から3'方向に記載する。この二本鎖は、実質的に長さが均一であることが好ましい；即ち、母集団中の長さの変動が、塩基対の数で表した平均二本鎖長の約±20%、好ましくは±10%を超えない。ヌクレオチド組成もまた、実質的に均一であることが好ましい；即ち、塩基組成および塩基配列が、各二本鎖の間で約10%以上変動しない。ヌクレオチド組成は、各二本鎖で完全に均一であることが最も好ましい。
【０１０２】
円二色性(CD)スペクトルの解釈に基づくと、本発明の二本鎖は、B-DNAタイプの螺旋構造であると推測される。ただし、本発明がこの推測により限定されることは意図しない。より完全な分析に基づくならば、二本鎖は、Z-DNAおよび/あるいはA-DNAタイプの螺旋構造であるかも知れない。
【０１０３】
これらのポリヌクレオチド二本鎖は、天然のDNAから合成し得、あるいは化学的あるいは組み換えの技法で合成し得る。天然あるいは組み換えで産生されたより長鎖のdsDNAは、消化(例えば、酵素的消化、化学的消化、あるいは機械的剪断)され、そして、(例えば、アガロースゲルあるいはSephadex（登録商標）カラムで)分画されて、目的の長さのポリヌクレオチドを与え得る。
【０１０４】
あるいは、長さが約70塩基迄の相補的な一本鎖ポリヌクレオチド鎖の対は、一般的な手順で、市販されているDNA合成装置を用いて容易に調製され、次いでアニールされて、二本鎖を形成する。より長鎖の合成dsDNAは、化学的に製造した複数の短い鎖の酵素伸張(5'-ホスホリル化し、次にライゲーションする)により入手し得る。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、分子クローニングによっても製造し得る。例えば、目的の長さと配列のポリヌクレオチドは上述の様にして合成される。これらのポリヌクレオチドは、消化され、特定の制限酵素部位へライゲーションで挿入するための適切な末端を有し得る。得られた構築物は、標準的なクローニングベクター中に挿入し、そして該ベクターを形質転換により、適切な微生物/細胞に導入する。形質転換体は、標準マーカーにより確認され、そしてDNA複製に適した条件下で増殖させる。ポリヌクレオチドは、制限酵素での処理、および(例えば、アガロースゲルあるいはSephadex（登録商標）カラムによる)一般的なサイズ分画法により、他の微生物/細胞のDNAから単離し得る。
【０１０６】
あるいは、ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)技術により、ポリヌクレオチドを複製し得る。Saiki, R.K.ら、Science (1985) 230:1350；Sackiら、Science (1988) 239:487、Sambrookら、In Molecular Cloning Techniques: A Laboratory Manual, Vol 12, p 14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press (1989)などを参照。
【０１０７】
実施例に記載したアッセイにより、SLE抗血清に対する結合活性で、ポリヌクレオチドをスクリーニングし得る。結合活性をI₅₀(ヌクレオチドのモル濃度で表した、最大の半分の阻害をもたらすポリヌクレオチド濃度)で表現し得る、改変したFarrアッセイは、好適なアッセイである。約500 nM以下、好ましくは50 nM以下のI₅₀を有するポリヌクレオチド二本鎖は、顕著な結合活性を有するとみなされ、それゆえに、本発明の複合体の製造に有用である。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、その抗体結合活性が保持される様な様式で、化学的に定義された結合手プラットフォーム分子に結合される。これは、ポリヌクレオチドを、結合部位から鎖の自由(非結合)端までが少なくとも約20塩基対のペンダント鎖を形成する様に、ポリヌクレオチド鎖上の定められた位置で、結合手プラットフォーム分子と結合させることで行われる。
【０１０９】
特に好適な実施態様では、本発明の複合体のポリヌクレオチドは、その一端で、あるいは一端の近傍でリンカー分子とカップリングされる。このリンカー分子を、次に化学的に定義された結合手プラットフォーム分子とカップリングさせる。例えば以下の様にして、定義された二本鎖PNを結合手プラットフォーム分子と結合し得る。先ず、シトシン(C)とアデノシン(A)が交互に存在する約20の長さのヌクレオチドからなる一本鎖を用意する。次に、トリエチレングリコールの様な誘導体化したプラットフォーム分子上の4つの反応部位に、HADの様なリンカーを介して4本のCA鎖を共有結合させ得る。この結合手プラットフォーム分子は、ブロモアセチルの様な基を含む様に合成されている。この複合化の際、脱離基は硫黄で置換される。次に、チミジン(T)とグアノシン(G)が交互に存在する約20の長さのヌクレオチドからなる第二の一本鎖ヌクレオチド鎖を、前記のCA鎖とアニールさせ、構造式：
[(PN)₂₀-リンカー]₄-結合手プラットフォーム分子
の二本鎖鎖PN複合体を形成し得る。
【０１１０】
あるいは、他の好適な実施態様では、モルホリノブリッジを介して、ポリヌクレオチドの3'末端で、このポリヌクレオチドを結合手プラットフォーム分子にカップリングし得る。モルホリノ結合は、ポリヌクレオチドの一方の鎖の酸化された3'末端リボースを、誘導体化したプラットフォーム分子上のフリーのアミノ基と縮合させ、次に、この付加体を還元性の条件に曝すことにより、形成される。このカップリングには、誘導体化した結合手プラットフォーム分子が、少なくともこのプラットフォーム分子に結合させるポリヌクレオチド二本鎖の数と等しい数のアミノ基を有することが必要である。
【０１１１】
この様な複合体の合成は、二段階で行われる。第一の段階は、ポリヌクレオチド二本鎖の1つの鎖を、上記の縮合/還元反応を介して、誘導体化したプラットフォーム分子にカップリングする工程である。一本鎖ポリヌクレオチドを、過ヨウ素酸塩で処理し、3'末端のリボース基を酸化されたリボースに変換することで、酸化された3'末端リボースを形成する。この一本鎖ポリヌクレオチドを次に、pHが約6.0から8.0の誘導体化した結合手プラットフォーム分子の水溶液に、2-8℃で徐々に加える。ポリヌクレオチドとプラットフォーム分子とのモル比は、全ての複合反応で一般に、約2:1から約30:1の範囲、通常は約2:1から約8:1、そして、好ましくは約4:1から6:1である。
【０１１２】
このことと関連して、複合体は、巨大分子の様な非常に大きな分子量を有さないのが好ましい。特に、分子量が200,000よりも大きな繰り返し単位を有する巨大分子は、T-細胞依存性の免疫原であり得る。Dintzisら、J. Immun. (1983) 131:2196；およびJ. Immun. (1989) 143:1239を参照。縮合反応の間(一般に24-48時間の反応時間)あるいは後に、ソジウムシアノボロハイドライドの様な強力な還元剤を加え、モルホリノ基を形成する。次に、二本鎖の相補鎖をこの複合体に加え、そして、混合物を加熱し、そして徐冷し、両鎖をアニールさせる。この複合体は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーで精製し得る。
【０１１３】
上記のリボースを用いた方法に代わる１つの方法は、ポリヌクレオチドの上にアルデヒド基を形成し、そして、これらの基を、プラットフォーム分子の上の反応性官能基を介して、該ポリヌクレオチドとプラットフォーム分子とをカップリングさせるために用いることである。この反応は、ポリヌクレオチドの3'あるいは5'末端に結合させたgem-あるいはvicinal-ジオールは、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアルデヒドとし得、これをプラットフォーム分子のアミノ官能基と縮合し得ることを利用している。環状部分、例えば5-員環、にジオールが存在する場合、得られる縮合生成物は、窒素を有するヘテロ環式化合物、例えば、6-員のモルホリノあるいはピペリジノ環である。このイミノ縮合生成物は、例えば、ソジウムボロハイドライドあるいはソジウムシアノボロハイドライド等の適切な還元剤で還元することで安定化し得る。ジオールが非環状化合物の場合、得られる酸化生成物は、唯1個のアルデヒド基を有し、そしてこの縮合生成物は第２アミンである。
【０１１４】
他の方法は、アルキルアミノあるいはアルキルスルフヒドリル基を、適切なヌクレオチドの反応(例えば、ホスホアミダイト反応)を用いて、ポリヌクレオチドの3'あるいは5'の何れかの末端に導入する工程を含む。次に、この親核性基を使用して、例えば、アルキルアミン誘導体の場合、ジメチルスベリミデートの様な大過剰のホモ二官能性の架橋試薬と、あるいは、アルキルスルフヒドリル誘導体の場合、例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)あるいはスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)等の、過剰のヘテロ二官能性の架橋試薬と反応させ得る。過剰の架橋試薬を除去した後に、このポリヌクレオチド誘導体をプラットフォーム分子上のアミノ基と反応させる。あるいは、スルフヒドリル基は、マレイミド、あるいはα-ハロアセチル基、あるいは他の適切なMichael付加受容体の様なプラットフォーム分子上の親電子センターと反応させ得る。
【０１１５】
さらに別の方法では、修飾したヌクレオチドを用いる。標準的なDNA合成反応を用いて、好ましくは5'あるいは3'末端であるポリヌクレオチドの所望の位置に、適切なデオキシヌクレオシド誘導体を組み込み得る。次に、これらのヌクレオシド誘導体を、プラットフォーム分子上のアルキルアミノ基と、特異的にかつ直接反応させ得る。あるいは、アミン触媒のβ-脱離の様な、上記のジアルデヒドの反応で起こる副反応は、結合される鎖の3'末端に適切なヌクレオシド誘導体を導入することで防ぎ得る。この例は、リボースの5'メチレン伸張である；即ち、5'ヒドロキシメチル基の代わりに5' (2-ヒドロキシエチル)基を導入する。別の方法では、ホスホネート結合あるいはホスフィネート結合を、プラットフォーム分子と結合されるポリヌクレオチドの3'末端のジヌクレオチドに用いる。
【０１１６】
＜免疫原のアナログ＞
抗体が媒介する疾患に関与する免疫原は、アレルゲン、男性不妊症のα-精子、リウマチ熱の炭水化物複合体、新生児の溶血性疾患の赤血球Rh/D抗原、（治療用のタンパク質、ペプチド、および抗体、の様な個体にとって異物である天然の生物学的物質を含む）生物学的薬剤等、の様な外来の(個体にとって異物である)免疫原、あるいは、甲状腺炎(サイログロブリン)、卒中(カルジオリピン)、および重症筋無力症(アセチルコリンレセプター)、の様な自己免疫原(自己抗原)であり得る。
【０１１７】
この様な免疫原のアナログは、候補分子をスクリーニングして、これらが(a)免疫原に対する血清抗体に特異的に結合するか否か、および(b)T細胞エピトープを欠いているか否か、を調べることで確認し得る。血清抗体への特異的結合は、従来のイムノアッセイを用いて調べることが出来、そして、T細胞エピトープの存在あるいは欠如は、従来のT細胞活性化試験により調べることが出来る。その意味で、免疫原に対する血清抗体に「特異的に結合する」アナログは、該抗体に対する充分なアフィニティーを有している。さらにその意味で、T細胞エピトープの試験は、治療を意図する個体からのT細胞、あるいは標的の個体集団を代表する種々の患者からのT細胞を用いて、個々の目的に応じて行われることも理解される。T細胞エピトープの存在あるいは欠如は、実施例に記載された³H(トリチル化)チミジン取り込みアッセイを用いて調べ得る。T細胞エピトープの存在はまた、当分野で周知の方法により、T細胞由来のリンホカインの分泌を測定することで調べ得る。バックグラウンド以上に、統計的に有意なチミジンの取り込みを誘起しなかったアナログは、T細胞エピトープを欠くとみなされる。チミジン取り込みの定量的な量は、免疫原毎に異なり得る。一般に、約2-3未満の、さらに一般には約1-2未満の刺激指数(stimulation index)は、T細胞エピトープの欠如を示す。
【０１１８】
有用なアナログを確認するための、通常の第一段階は、スクリーニングされるべき候補の、パネルあるいはライブラリーの調製である。例えば、タンパク質あるいはペプチドのアナログの場合は、Geysenらの、Synthetic Peptides as Antigens; Ciba Symposium (1986) 119:131-149；Devlin らのScience (1990) 249:404-406；Scottらの、Science (1990) 249:386-390；およびCwirlaら、PNAS USA (1990) 87:6378-6382等に記載された様な、合成技術あるいは組み換え法で製造し得る。1つの合成方法では、各ペプチドが隣のペプチドと重複する様に、そして全ての鎖状のエピトープが表現される様に、約5から30アミノ酸のペプチドが合成される。これは、B細胞エピトープに予測される長さよりも1残基少なく、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方を重複させることで行われる。例えば、B細胞エピトープの最低要件が6-アミノ酸であると仮定されるならば、各ペプチドは、5-アミノ酸で隣のペプチドに重複しなければならない。この実施態様では、次に各ペプチドを、動物の免疫による、あるいは患者からの何れかの、天然の免疫原に対して製造された抗血清で、B細胞エピトープの存在に関してスクリーニングする。次に実施例に記載した様に、抗体結合活性を有する分子を、T細胞エピトープの存在に関してスクリーニングする。T細胞エピトープを欠く分子は、本発明のアナログとして有用である。
【０１１９】
免疫原の(単数あるいは複数の)T細胞エピトープが、既知であるか、あるいは同定され得るならば、候補アナログのランダムT細胞スクリーニングは不要である。その場合には、その(単数あるいは複数の)T細胞エピトープを、機能しない様に変化させ得る(例えば、そのエピトープの1あるいはそれ以上の成分を化学的に誘導化するかもしくは除去することで)、あるいは、例えばペプチドの場合の様に、合成法あるいは組み換え法等で、完全に除去し得る。
【０１２０】
ミモトープあるいはアプタマーは、従来の方法で合成し得、そして、他の免疫原のアナログと同じ方法でスクリーニングし得る。
【０１２１】
これらのアナログを、非免疫原性の結合手プラットフォーム分子とカップリングし、本発明の複合体を調製する。結合手プラットフォーム分子と、炭水化物、脂質、リポポリサッカライド、タンパク質、グリコプロテイン、薬剤、および目的物のアナログの様な、生物学的に活性な分子とからなる複合体は、本明細書で例示する化学反応を利用して合成される。好ましい合成法は、リンカー分子を生物学的分子上に、適切に選択された周知の方法で、組み込む方法である。
【０１２２】
アドリアマイシン(ドキソルビシン)の様な薬剤を結合手プラットフォーム分子に結合させる場合、糖のリング上のアミノ基が、活性エステルを含むプラットフォーム分子と反応し得る。アドリアマイシンはまた、ハロアセチル化したプラットフォームと結合させるために、チオール基を含む様に修飾し得る(Kaneko, T.ら、Bioconjugate Chemistry, 2:133 (1991))。
【０１２３】
オリゴサッカライドの様な炭水化物は、スルフヒドリルを含むリンカーを含む様に修飾し得る(Wood, S.J. and Wetzel, R.、Bioconjugate Chemistry, 3:391 (1992))。スルフヒドリル基はハロアセチル化プラットフォームに結合させるために用いられる。あるいは、炭水化物を酸化して、アルデヒドを生成し、これをNaCNBH₃の存在下に、アミノ化プラットフォームと反応させ得る。
【０１２４】
エタノールアミン基を含むグリコール脂質の様な脂質は、プラットフォーム分子上の活性カルボキシレートと反応させる。糖ユニットを含むリポポリサッカライドは、酸化してアルデヒドを生成し、これをNaCNBH₃の存在下にアミノ化プラットフォームと反応させて、還元アミノ化により複合体を形成する。
【０１２５】
Fab'抗体断片の様な別のタンパク質の場合には、タンパク質(Fab')上のスルフヒドリル基は、ハロアセチル基を介して、プラットフォームに結合する。グリコプロテインは、イミノチオレートを用いたチオールリンカーで修飾する。このチオールは、ハロアセチル基を含むプラットフォームと反応する。
【０１２６】
複合体が免疫寛容原として機能する能力、および、抗体の産生を特異的に抑制する能力は、実施例に記載したマウスのモデルで評価し得る。
【０１２７】
この複合体は通常、(例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内等)注射で投与する様に処方される。従って、これらは典型的には、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液等の様な薬学的に許容可能な水性キャリアーと組み合わせられる。複合体は通常、処方の約0.01重量%から10重量%を構成する。複合体は、SLEを引き起こす自己抗原に対する免疫寛容を少なくとも部分的に再確立するために充分な量で、個体に投与される。この様な量は、本明細書では、時に「治療に有効な」量とも呼ぶ。特定の場合の投与管理、即ち投与量、タイミング、および投与回数は、特定の個体、およびその個体の病歴により変化する。通常は、約1から1000 μg複合体/Kg体重で投与される。免疫寛容の状態を達成および/あるいは維持するためには、繰り返し投与が必要であり得る。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明、および本発明の従来技術に対する予期されない効果をさらに説明するものである。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものでは無い。
【０１２９】
【実施例】
（実施例１）
以下の反応式は、本発明の誘導体化した化学的に定義された結合手プラットフォーム分子を合成する方法を説明している。この実施例では以下の略号を使用する：
DMTr = 4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル；Tr = トリチル；Bz = ベンゾイル；Cp = デオキシシチジンモノホスフェート；CE = シアノエチル；CPG = 制御された有孔ガラス；DMF = ジメチルホルムアミド；DCC = ジシクロヘキシルカルボジイミド；TFA = トリフルオロ酢酸；CDI = カルボニルジイミダゾール；Ts = トシル(p-トルエンスルホニル)；DIPAT = ジイソプロピルアンモニウムテトラアゾリド；TBDMSCl = tert-ブチルジメチルシリルクロライド；TBAF = テトラブチルアンモニウムフルオライド；NMMO = N-メチルモルホリンオキサイド。
【０１３０】
【化１６】

【０１３１】
【化１７】

【０１３２】
【化１８】

【０１３３】
【化１９】

【０１３４】
【化２０】

【０１３５】
【化２１】

【０１３６】
【化２２】

【０１３７】
【化２３】

【０１３８】
【化２４】

【０１３９】
【化２５】

【０１４０】
(CA)₈、(CA)₁₀、(CA)₁₂および(CA)₁₆を、ジスルフィドリンカーで修飾するために用いられる試薬の合成を、次の反応式１１に記載する。
【０１４１】
【化２６】

【０１４２】
(CA)₂₅を、vicinal-ジオールリンカーで修飾するために用いられる試薬の合成を、次の反応式１２に記載する。
【０１４３】
【化２７】

【０１４４】
【化２８】

【０１４５】
（実施例２：化学的に定義された結合手プラットフォーム分子）
＜化合物１−[3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)安息香酸]＞
ヨード酢酸無水物2.93g(8.28mmol, 2.2当量)をN₂雰囲気下で室温にて3,5-ジアミノ安息香酸572mg(3.76mmol)の攪拌されたジオキサン(19mL)懸濁液に加えた。この混合物を攪拌し、20時間ホイルで覆い、そしてEtOAc(50mL)と1N HCl溶液(50mL)とで分けた。EtOAc層をブラインで洗浄し、MgSO₄で乾燥し、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して、褐色の固形物3.3gを得た。この物質をシリカゲルクロマトグラフィー(94/5/1 CH₂Cl₂/MeOH/HOAc)によって精製して、992mg(54%)の化合物１を白色の固形物として得た：NMR (DMSO) 3.84 (s, 4H), 7.91 (s, 2H), 8.14 (s, 1H), 10.56 (s, 2H)。
【０１４６】
＜化合物２−[3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイルクロライド]＞
SOCl₂ 117μL(1.6mmol, 190mg)を390mg(0.8mmol)の１のTHF(34mL)溶液に加えた。この混合物を、全ての固形物が溶解するまで（およそ30分間）N₂雰囲気下で還流し、透明な赤褐色の溶液を得た。この混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、減圧下で静置して粗製の化合物２を泡状固形物として得た。この泡状固形物を次の工程に直接用いた。
【０１４７】
＜化合物３−[α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコールのN,N'-ビス-(3,5-ビス-(ヨードアセトアミド)ベンゾイル)誘導体]＞
α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコール(0.16mmol, 3350g/mol, Sigma)570mgを風袋を量ったフラスコに入れた。トルエン(20mL)を加え、そして共沸蒸留によって水を除去した。残留物を減圧下で乾燥して、固形物549mgを得、そしてジイソプロピルエチルアミン89μL(0.64mmol)と共にTHF 4mLに溶解した。粗製の酸クロライドを無水THF 4mL中に溶解し、そしてN₂下で30秒間かけて混合物に加えた。混合物を室温で16時間攪拌し、そして0.1N HCl(25mL)とCH₂Cl₂(25mL)とで分けた。水層をCH₂Cl₂で再び抽出し、そして有機層を合わせて、H₂O 25mL、次いでNaHCO₃溶液50mLで洗浄した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、橙色のオイル784mgを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(9/1 CH₂Cl₂/MeOH)により、無色のオイル190mgを得た。このオイルを熱EtOH/Et₂Oから結晶化し、N₂圧力下で焼結ガラスフィルター上で集め、そして減圧下で乾燥して、177mgの化合物３を白色の固形物として得た：NMR (CDCl₃) 3.40 (bd m, 8H), 3.59 (bd s, (CH₂CH₂O)_n, 他の積分値に比べ極端に大きい積分値), 3.91 (s, 8H), 4.21 (m, 4H), 6.04 (bd m, 2H), 7.55 (bd m, 2H), 7.78 (bd s, 4H), 8.10 (bd s, 2H), 9.30 (bd m, 4H)：ヨードアセチル測定法(European Journal of Biochemistry (1984) 140:63-71) ：計算値：0.92mmol/g；実測値：0.96mmol/g。
【０１４８】
＜化合物４−[モノ-N-カルボベンジルオキシ-3,6-ジオキサ-1,8-ジアミノオクタン]＞
ベンジルクロロホルメート14.3mL(17.1g, 100mmol)のCH₂Cl₂(200mL)溶液を、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)29.0mL(29.6g, 200mmol)のCH₂Cl₂(100mL)溶液に、0℃で1時間かけて滴下した。この混合物を室温で24時間攪拌し、そして1N HClを水層が酸性(pH2未満)に留まるまで加えた。水層をCH₂Cl₂(50mLずつ)で3回洗浄し、そして1N NaOHでpHが13を越えるまで中和した。この塩基性の水層をCH₂Cl₂(75mLずつ)で5回抽出した。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、12.7g(45%)の化合物４を濃厚なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.82 (bd s, 2H), 3.30-3.60 (m, 12H), 5.10 (s, 2H), 5.75 (bd s, 1H), 7.20-7.40 (m, 5H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 41.1, 41.8, 66.5, 70.0, 70.2, 70.4, 73.5, 127.9, 128.0, 128.4, 136.9, 156.4。
【０１４９】
＜化合物５−[N-tert-ブチルオキシカルボニルイミノジ酢酸]＞
Garrigues, B.およびLazraq, E.M.Tetrahedron Letters (1986) 27, 1685-1686による報告と同様の手順で、この化合物を調製した。Et₃N 47mL(34.2g, 338mmol)を、イミノジ酢酸22.0g(169mmol)とジ-tert-ブチルジカルボネート36.8g(169mmol)との攪拌された50/50 ジオキサン/H₂O(169mL)溶液に、室温にて加えた。この混合物を24時間攪拌し、そして大部分のジオキサンをロータリーエバポレータで除去した。この混合物を1N HCl(350mL)と5つのEtOAc(100mLずつ)とで分けた。このEtOAc層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、白色の固形物を得た。ヘキサン/EtOAcで再結晶して、35.3g(90%)の化合物５を結晶として得た：m.p. 131-132℃ 融解(fused)；¹H NMR (DMSO) d 1.35 (s, 9H), 3.87 (s, 2H), 3.91 (s, 2H), 12.6 (bd s, 2H); ¹³C NMR (DMSO) d 27.9, 49.6, 79.6, 154.8, 171.2。
【０１５０】
＜化合物６＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド9.99g(48.5mmol)を、4.52g(19.4mmol)の化合物５とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)4.46g(38.8mmol)とのTHF(100mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を0℃で3時間攪拌し、そしてEt₃N 5.39mL(3.92g, 38.8mmol)と10.9g(38.7mmol)の化合物４とのTHF(83mL)溶液を加え、そしてこの混合物を5℃で17時間攪拌した。混合物を濾過して固形物を除去し、そして濾液を濃縮してオイルを得た。このオイルをEtOAc(400mL)と2つの1N HCl(100mLずつ)とで分けた。このEtOAc層を1N Na₂CO₃ 100mLずつで3回、およびブライン100mLで1回洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、14.2g(96%)の化合物６を濃厚なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.41 (s, 9H), 3.30-3.70 (m, 24H), 3.70-3.90 (m, 4H), 5.10 (s, 4H), 5.50 (bd s, 2H), 7.12 (bd s, 1H), 7.30-7.40 (m, 10H), 8.24 (bd s, 1H)。
【０１５１】
＜化合物７＞
トリフルオロ酢酸26.3mL(38.9g, 156mmol)を、14.2g(18.6mmol)の化合物６のCH₂Cl₂(111mL)溶液に加え、そしてこの混合物を室温で3時間攪拌した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して粘稠なオイルを得、そしてこのオイルをTHF 93mLに溶解した。溶液を0℃まで冷却し、そして無水コハク酸3.72g(37.2mmol)を加え、次いでEt₃N 5.18mL(3.76g, 37.2mmol)を加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で18時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして得られたオイルをCH₂Cl₂(300mL)と3つのH₂O(100mLずつ)とで分けた。このCH₂Cl₂層を乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。このオイルを、シリカゲルのクロマトグラフィー(9/1/0.1 EtOAc/MeOH/酢酸)で精製して、10.5g(74%)の化合物７を粘稠なオイルとして得た；¹H NMR (CDCl₃) d 2.50-2.60 (m, 4H), 3.30-3.60 (m, 24H), 3.88 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 5.07 (s, 4H), 5.77 (bd s, 2H), 7.20-7.30 (m, 10H), 7.91 (bd s, 2H), 8.88 (bd s, 1H); ¹³C (CDCl₃) d 27.7, 29.0, 39.4, 41.0, 52.9, 53.8, 66.5, 69.3, 69.8, 70.0, 70.1, 127.8, 128.1, 128.3, 136.7, 156.6, 169.1, 169.6, 173.3, 174.5。
【０１５２】
＜化合物８−[化合物７の4-ニトロフェニルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド1.61g(7.83mmol)を、3.98g(5.22mmol)の７と800mg(5.75mmol)の4-ニトロフェノールとのCH₂Cl₂(26mL)溶液に0℃で加えた。この混合物をN₂下で室温にて64時間攪拌した。混合物を0℃まで冷却し、HOAc 1mLを加え、そしてこの混合物を0℃で2時間保った。この固形物を濾過により除去し、そして濾液を濃縮した。この残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント、91/8/1〜84/15/1 CH₂Cl₂/IPA/HOAc)で精製して、2.58g(56%)の化合物８を粘稠なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.66 (t, 2H), 2.84 (t, 2H), 3.32-3.68 (m, 24H), 3.90 (bd s, 2H), 4.01 (bd s, 2H), 5.06 (s, 4H), 5.58 (bd m, 2H), 6.91 (bd m, 1H), 7.27 (d, 2H), 7.33 (s, 10H), 8.23 (d, 2H), 9.01 (bd m, 1H)。
＜化合物１０−[4-ニトロフェニルブロモアセテート]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド9.28g(45mmol)を、ブロモ酢酸5.0g(35.9mmol)と4-ニトロフェノール8.50g(61.1mmol)との攪拌されたEtOAc(180mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を5℃で16時間攪拌し、そして酢酸1mLを加えた。この混合物を室温で20分間攪拌し、次いで20分間冷凍機中に置いた。この固形物質を濾過によって除去し、そしてこの濾液を濃縮して、粘稠なオイルを得、そしてEt₂O/ヘキサンから結晶化して、7.73g(83%)の化合物１０を薄片として得た：m.p. 86-87℃；TLC Rf=0.63 (50/50/1 ヘキサン/EtOAc/HOAc)；¹H NMR (CDCl₃) d 4.13 (s, 2H), 7.36 (d, J=12Hz, 2H), 8.32 (d, J=12Hz, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 24.9, 122.1, 125.3, 155.5, 164.9; 分析値：C₈H₆BrNO₄に対する計算値：C, 36.95;H, 2.33; N, 5.39. 実測値：C, 37.24; H, 2.33; N, 5.42。
【０１５３】
＜化合物９＞
NaHCO₃ 300mg(3.57mmol)、次いで1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)162mg(1.09mmol)を、2.37g(2.68mmol)の化合物８のジオキサン(15mL)とH₂O(8mL)との溶液に加えた。この混合物を室温で24時間攪拌し、そして減圧下で濃縮して、元の容量のおよそ1/2とした。濃縮物をCH₂Cl₂(40mL)と飽和NaHCO₃溶液(40mL)とで分けた。このCH₂Cl₂層を次に0.5N HClずつで2回洗浄した。このCH₂Cl₂層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、2.8gのオイルを得た。この粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(3/6/1/ CH₂Cl₂/THF/MeOH)で精製して、940mg(59%)の化合物９をオイルとして得た：TLC R_f=0.21 (3/6/1 CH₂Cl₂/THF/MeOH)；¹H NMR (CDCl₃) d 2.45 (m, 4H), 2.59 (m, 4H), 3.25-3.55 (m, 60H), 3.87 (s, 4H), 4.05 (s, 4H), 5.07 (s, 8H), 5.62 (bd s, 4H), 6.78 (bd s, 2H), 7.34 (bd s, 20H), 8.56 (bd s, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 28.1, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 52.9, 53.9, 66.5, 69.4, 69.7, 69.9, 70.2, 125.3, 127.8, 128.3, 136.8, 156.5, 168.8, 169.4, 172.1, 173.5。
【０１５４】
＜化合物３４＞
10% Pdカーボン 110mgを、281mg(0.175mmol)の化合物９のEtOH(5mL)とシクロヘキセン(2mL)との溶液に窒素下で加え、そして得られる混合物を窒素下で2時間還流した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして減圧下で濃縮して、170mg(92%)の化合物３４をオイルとして得た。このオイルは、精製せずに次の工程で直接用いた；¹H NMR (CDCl₃) d 2.45 (m, 4H), 2.53 (m, 4H), 2.62 (m, 4H), 2.86 (m, 8H), 3.42-3.60 (m, 52H), 4.00 (s, 4H), 4.14 (s, 4H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 28.2, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 46.5, 48.6, 52.9, 53.8, 69.4, 69.7, 70.2, 72.4, 168.9, 169.5, 172.3, 173.8。
【０１５５】
＜化合物１１＞
NaHCO₃ 128mg(1.4mmol)および200mg(0.85mmol)の化合物１０を165mg(0.155mmol)の化合物３４のジオキサン(6mL)とH₂O(3mL)との溶液に加えた。得られた混合物を室温で24時間攪拌し、そして減圧下で濃縮した。この濃縮物をSephadex（登録商標） G-10(MeOH)のクロマトグラフィーで精製して、114mg(46%)の化合物１１を粘稠なオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C₁₈; グラジエント 15/85/0.1〜30/70/0.1 CH₃CN/H₂0/CF₃CO₂H, 50分, 225nm)で調製した：¹H NMR (CDCl₃) d 2.58 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.43-3.62 (m, 60H), 3.92 (s, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.16 (s, 4H); MS (FAB) m/e (相対強度) MNa+ 1605 (100), MH+ 1579 (1), 1581 (5), 1583 (7), 1585 (6), 1587 (2)。
【０１５６】
＜化合物１２−[モノ-N-カルボベンジルオキシ-1,6-ジアミノヘキサン]＞
ベンジルクロロホルメート21mL(25.7g, 150mmol)のジオキサン(200mL)溶液を、1,6-ヘキサンジアミン17.49g(150mmol)とKHCO₃ 19.58g(196mmol)とのジオキサン(100mL)とH₂O(300mL)との攪拌された溶液に0℃で滴下した。この混合物を室温で18時間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。この混合物を12N HClで酸性化し、そしてEt₂O 100mLずつで2回抽出した。水層を10N NaOHで中和し、そしてEt₂O 100mLずつで8回抽出した。この塩基性の抽出物を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、そして濃縮して、5.03g(13%)の粗製の化合物１２を半固形の残留物として得た：¹H NMR (DMSO) d 1.22-1.51 (m, 8H), 2.54 (t, 2H), 3.02 (d of t, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.30-7.48 (m, 5H)。
【０１５７】
＜化合物１３＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド918mg(4.45mmol)を、417mg(1.78mmol)の化合物５とNHS 409mg(3.56mmol)とのTHF(15mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を0℃で4.5時間攪拌し、そして1.02g(4.08mmol)の化合物１２のTHF(4mL)溶液を加えた。この混合物をN₂下で5℃にて18時間攪拌した。この濃縮物をEtOAc(30mL)と2つの1N HCl(30mLずつ)とで分けた。EtOAc層を合わせて、H₂O(30mL)および飽和NaHCO₃溶液(30mL)で連続して洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、粘稠な残留物1.48gを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(5/95 MeOH/CH₂Cl₂)で精製することにより、1.04g(84%)の化合物１３を粘着性の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.33 (m, 8H), 1.43 (s, 9H), 1.51 (m, 8H), 3.18 (m, 4H), 3.26 (m, 4H), 3.81 (s, 2H), 3.85 (s, 2H), 4.90 (bd s, 2H), 5.10 (s, 4H), 6.81 (bd s, 1H), 7.28-7.40 (m, 10H), 8.05 (bd s, 1H)。
【０１５８】
＜化合物１４＞
トリフルオロ酢酸14.9mLを、5.16g(7.45mmol)の化合物１３のCH₂Cl₂(14.9mL)溶液に加え、そして得られた混合物を室温で3時間攪拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、そしてTHF 57mLに再び溶解した。この混合物にEt₃N 2.07mL(1.51g, 14.9mmol)を加えた。この混合物に無水コハク酸1.5g(14.9mmol)を加え、次いでこの混合物を18時間攪拌した。混合物を1N HCl(75mL)と4つのCH₂Cl₂(75mLずつ)とで分けた。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、固形物を得た。CH₂Cl₂/EtOAc/ヘキサンから結晶化して、3.84g(74%)の化合物１４を白色の固形物として得た：m.p. 122℃；¹H NMR (MeOH) d 1.32 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 2.56 (m, 4H), 3.10 (t, 4H), 3.23 (m, 4H), 4.00 (s, 2H), 4.18 (s, 2H), 5.05 (s, 4H), 7.33 (m, 10H)。
【０１５９】
＜化合物１５−[化合物１４の4-ニトロフェニルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド887mg(4.30mmol)を、2.0g(2.87mmol)の化合物１４と4-ニトロフェノール438mg(3.15mmol)とのTHF(15mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を室温にして、18時間攪拌し、次いで0℃まで冷却した。次いで、酢酸200μLを加え、そしてこの混合物を0℃で1時間攪拌した。この固形物を濾過によって除去し、そして濾液を濃縮してオイルを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(92/8 CH₂Cl₂/IPA)によって精製し、そして得られた固形物をCH₂Cl₂/ヘキサンから再結晶して、1.52g(64%)の化合物１５を白色の固形物として得た：m.p. 65-68℃；¹H NMR (CDCl₃) d 1.30 (m, 8H), 1.47 (m, 8H), 2.71 (t, 2H), 2.90 (t, 2H), 3.17 (m, 4H), 3.25 (m, 4H), 3.92 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 4.86 (bd t, 1H), 4.95 (bd t, 1H), 5,09 (s, 4H), 6.28 (bd t, 1H), 7.23 (d, J=9Hz, 2H), 7.32 (m, 10H), 8.22 (d, J=9Hz, 2H), 8.95 (bd t, 1H)。
【０１６０】
＜化合物１６＞
830mg(0.99mmol)の化合物１５のジオキサン(7.5mL)溶液を、1,2-ビス-(2'-アミノエトキシ)エタン(Fluka)58μL(59mg, 0.40mmol)とNaHCO₃ 111mg(1.31mmol)とのH₂O(7.5mL)溶液に加えた。この混合物を室温で18時間攪拌した。混合物を1N HCl(50mL)とCH₂Cl₂(50mL)とで分けた。CH₂Cl₂層を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイル1.28gを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(84/15/1 CH₂Cl₂/MeOH/HOAc)によって精製することにより、670mgの化合物１６をロウ質の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.32 (m, 16H), 1.49 (m, 16H), 2.46 (m, 4H), 2.58 (m, 4H), 3.10-3.23 (m, 16H), 3.34 (m, 4H), 3.48 (m, 4H), 3.53 (s, 4H), 3.85 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.05 (s, 8H), 5.07 (重複する bd t, 2H), 5.15 (bd t, 2H), 7.30 (m, 20H), 7.40 (bd t, 2H), 8.60 (bd t, 2H)。
【０１６１】
＜化合物３５＞
613mg(0.41mmol)の化合物１６のEtOH(20.3mL)とシクロヘキセン(10.1mL)との溶液を攪拌し、そして窒素でパージした。10% Pdカーボン(Aldrich) 20mgを加え、そしてこの混合物を85℃の油浴で1.5時間加熱した。冷却時、この混合物を50/50 H₂O/アセトンを用いてケイソウ土を通して濾過して、フラスコおよびフィルターをリンスした。この濾液を減圧下で濃縮して、448mg(114%)の化合物３５をロウ質の固形物として得た：¹H NMR (D₂O) d 1.39 (m, 16H), 1.59 (m, 16H), 2.57 (t, 4H), 2.65 (t, 4H), 2.88 (t, 8H), 3.23 (t, 4H), 3.29 (t, 4H), 3.42 (t, 4H), 3.65 (t, 4H), 3.71 (s, 4H), 4.06 (s, 4H), 4.30 (s, 4H)。
【０１６２】
＜化合物１７＞
NaHCO₃ 546mg(6.50mmol)を、445mg(0.406mmol)の化合物３５のH₂O(9.5mL)溶液に加えた。得られた混合物に、838mg(3.25mmol)の化合物１０のジオキサン(14.4mL)溶液を加えた。この混合物を室温で7時間攪拌し、そして0.1N H₂SO₄(50mL)とCH₂Cl₂(50mL)とで分けた。CH₂Cl₂層を廃棄し、そして水層をCH₂Cl₂ 50mLずつで2回、9/1 CH₂Cl₂/MeOH 50mLずつで2回、4/1 CH₂Cl₂/MeOH 50mLで1回、および3/2 CH₂Cl₂/MeOH 50mLで1回抽出した。抽出物を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、固形物282mgを得た。EtOH/EtOAc/Et₂Oから結晶化することにより、143mg(24%)の化合物１７を白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃/MeOH) d 1.33 (m, 16H), 1.55 (m, 16H), 2.55 (m, 8H), 3.21 (m, 16H), 3.39 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.81 (s, 8H), 3.95 (s, 4H), 4.12 (s, 4H). 分析値：C₅₄H₉₄N₁₂0₁₄Br₄に対する計算値：C, 44.57; H, 6.51; N, 11.55; Br, 21.97. 実測値：C, 45.85; H, 6.49; N, 11.37; Br, 19.90。
【０１６３】
＜化合物１８−[1,5-ビス(N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサノアミド)-3-アザペンタン]＞
カルボニルジイミダゾール3.09g(19.0mmol)を、N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサン酸5.05g(19.0mmol)のEtOAc(25mL)溶液に室温で加えた。この混合物を15時間攪拌し、次いでジエチレントリアミン1.02mL(982mg, 9.52mmol)を加え、次いでEt₃N 2.65mL(1.93g, 19.0mmol)を加えた。得られた混合物を4時間攪拌し、そして固形の生成物を濾過により集めた。再結晶(MeOH/EtOAc)により、4.27g(75%)の化合物１８を微細粒固形物として得た：m.p. 132-133℃；¹H NMR (CDCl₃) d 1.33 (m, 4H), 1.52 (m, 4H), 1.64 (m, 4H), 2.18 (t, 4H), 2.73 (t, 4H), 3.16 (m, 4H), 3.35 (m, 4H), 4.96 (bd s, 2H), 5.09 (s, 4H), 6.13 (bd s, 2H), 7.33 (s, 10H)；分析値：C₃₂H₄₇N₅0₆に対する計算値：C, 64.29; H, 7.50; N, 11.72. 実測値：C, 63.54; H, 7.75; N, 11.91。
【０１６４】
＜化合物１９＞
トリエチレングリコール-ビス-クロロホルメート(Aldrich)657μL(880mg, 3.2mmol)を、4.86g(8.1mmol)の化合物１８のピリジン(162mL)溶液に20℃の水浴中で加えた。この混合物は直ちに沈澱物を形成した。この混合物を16時間攪拌し、そして得られた濁った黄色の溶液を減圧下で濃縮した。濃縮物をEtOAc(150mL)と2つの1N HCl(150mLずつ)とで分けた(水層が確実に酸性となるようにした)。水層を合わせて、2番目のEtOAc(150mL)で抽出した。EtOAc層を合わせて、乾燥し(MgSO4)、濾過し、そして濃縮した。得られた残留物を結晶化して(EtOAc/ヘキサン/CHCl₃)、1.92g(43%)の化合物１９を微黄色の微細な結晶として得た：m.p. 86-91℃；¹H NMR (CDCl₃) 1.31 (m, 8H), 1.52 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.20 (m, 8H), 3.20 (m, 8H), 3.39 (s, 16H), 3.62 (s, 4H), 3.68 (m, 4H), 4.26 (m, 4H), 5.08 (s, 8H), 5.32 (bd s, 4H), 7.31 (bd s, 4H), 7.37 (s, 20H)；¹³C NMR (CDCl₃) d 25.1, 26.2, 26.4, 29.6, 36.0, 36.2, 38.5, 38.8, 40.8, 64.5, 66.4, 69.1, 70.3, 128.0, 128.4, 136.7, 156.5, 156.9, 173.6；分析値：C₇₂H₁₀₄N₁₀0₁₈に対する計算値：C, 61.87; H, 7.50; N, 10.02. 実測値：C, 61.68; H, 7.63; N, 9.95。
【０１６５】
＜化合物３６＞
シクロヘキセン3.5mLを、800mg(0.57mmol)の化合物１９の無水EtOH(5mL)溶液に加えた。この溶液を窒素下で静置し、10% Pdカーボン500mgを加え、そして得られた混合物を2時間攪拌しながら還流した。冷却時、混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして濃縮して、500mg(100%)の化合物３６をオイルとして得た：¹H NMR (50/50 CDCl₃/CD₃OD) d 1.21 (m, 8H), 1.49 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.19 (t, J=7.4Hz, 8H), 2.67 (t, J=7.4Hz, 8H), 3.36 (bd s, 16H), 3.67 (s, 4H), 3.71 (m, 4H), 4.21 (m, 4H)。
【０１６６】
＜化合物２０＞
NaHCO₃ 3.9g(46.4mmol)を5.0g(5.8mmol)の化合物３６のジオキサン(37.5mL)とH₂O(12.5mL)との溶液に加えた。この混合物を氷浴中で0℃まで冷却し、そして4-ニトロフェニルブロモアセテート（化合物１０）8.7g(34.8mmol)を加えた。この混合物を0℃で1時間攪拌し、そして1N H₂SO₄ 50mLを穏やかに加えた。混合物をEtOAc(50mLずつ)で3回抽出した。EtOAc抽出物を廃棄し、そして水層を20/80 MeOH/CH₂Cl₂(50mLずつ)で6回抽出した。MeOH/CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(ステップグラジエント 9/1 CH₂Cl₂/MeOH次いで85/15/5 CH₂Cl₂/MeOH/THF)で精製して、3.62g(46%)の化合物２０を白色の固形物として得た：m.p. 66.0-70.5℃。分析試料を分取用HPLC(C₁₈逆相カラム、グラジエント 25/75/0.1〜35/65/0.1 CH₃CN/H₂O/CF₃CO₂H 50分間にわたって、225nm)で調製して、透明のオイルを得た。このオイルを減圧下で静置して白色の固形物を得た：m.p. 87-89℃；¹H NMR (CDCl₃) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.64 (m, 8H), 2.26 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (bd s, 16H), 3.66 (s, 4H), 3.70 (m, 4H), 3.89 (s, 8H), 4.19 (m, 4H)；¹³C NMR (CDCl₃) d 25.1, 26.2, 28.8, 29.0, 38.5, 39.1, 40.0, 47.8, 48.3, 64.7, 69.1, 70.3, 157.0, 166.3, 174.9；MS(FAB) m/e (相対強度) MH+ [1341(25), 1343(60), 1345(70), 1347(56), 1349(21)], 705.6(100)；分析値：C₄₈H₈₄N₁₀O₁₄Br₄に対する計算値：C, 42.86; H, 6.29; N, 9.27; Br, 23.77. 実測値：C, 42.15; H, 6.28; N, 9.87; Br, 25.33。
【０１６７】
＜化合物２１−[テトラキス-(2-シアノエトキシメチル)メタン]＞
報告された方法(Bruson, H.A., 米国特許第2,401607号;1946年6月4日)と同様にして、この化合物を調製した。アクリロニトリル27.3mL(21.8g, 411mmol)を、ペンタエリスリトール8.0g(58.8mmol)と40%水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム水溶液1.76mLとの攪拌されたH₂O(50mL)溶液に加えた。還流冷却器を備え付け、そして混合物をN₂雰囲気下で攪拌しながら、40℃で16時間、次いで60℃で24時間加熱した。冷却時、混合物を濃HCl 1mLで酸性化し、そして分液ロートに移した。底に沈澱したオイルを集め、そして水層をCH₂Cl₂ 40mLずつで3回抽出した。オイルおよび合わせた抽出物を、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイル23.5gを得た。ビスシアノエチルエーテルを、クーゲルロール(Khugelrhor)蒸留によって、110℃で0.25torrで除去した。ポット残留物をH₂O 1Lから結晶化して8.43g(41%)の化合物２１を白色の針状結晶として得た：m.p. 42.5℃[(Macromolecules 1991, 24, 1443-1444.)には 39-40℃と報告されている]；¹H NMR (CDCl₃) d 2.61 (t, J=6Hz, 8H), 3.50 (s, 8H), 3.6 (t, J=6Hz, 8H)。
【０１６８】
＜化合物２２−[テトラキス-(2-カルボキシエトキシメチル)メタン]＞
5.0g(14.35mmol)の化合物２１の濃HCl(21.5mL)溶液を75℃で3時間攪拌した。この間、白色の沈澱が生成した。減圧下でHCl水溶液を除去し、そして混合物をH₂O(25mLずつ)から2回濃縮した。得られた固形物質9.68gを、水酸化物の形態のDOW-1-X2樹脂床16.5cmを含有する内径45mmのカラム上に装填し、そしてカラムをH₂O 200mL、次いで1N HClで溶出した。TLC (80/20/1 CH₃CN/H₂O/HOAc)で示される、生成物を含有する画分を濃縮して、1.21g(21%)の２２をオイルとして得た：¹H NMR (D₂O) d 2.46 (t, J=6Hz, 8H), 3.22 (s, 8H), 3.55 (t, J=6Hz, 8H)。
【０１６９】
＜化合物２３＞
塩化チオニル3.71mL(6.06g, 50.8mmol)を、1.12g(2.85mmol)の化合物２２のTHF(7.0mL)溶液に加えた。この混合物を室温で3時間攪拌し、そして溶媒を減圧下で除去した。粗製の酸クロライドをTHF(7mL)に溶解した。次いで、この溶液にEt₃N 2.12mL(1.54g, 15.24mmol)を加えた。この混合物をN₂下で攪拌し、そして0℃まで冷却した。3.60g(12.74mmol)の化合物４のTHF(5mL)溶液を1分間かけて加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で5.5時間攪拌し、次いで、1N HCl(25mL)と4つのEtOAc(25mLずつ)とで分けた。EtOAc層を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイル3.46gを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(95/5 CH₂Cl₂/MeOH)によって精製することにより、1.26g(30%)の化合物２３を粘稠なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.40 (t, 8H), 3.29 (s, 8H), 3.35 (m, 16H), 3.48-3.77 (m, 48H), 5.12 (s, 8H), 5.60 (bd, 4H), 6.85 (bd, 4H), 7.34 (s, 20H)。
【０１７０】
＜化合物３７＞
シクロヘキセン 4.0mLおよび10% Pdカーボン 83mgを、N₂下で、142mg(0.093mmol)の化合物２３のEtOH(8.4mL)溶液に加えた。この混合物を90℃の油浴で3時間攪拌しながら還流し、そして、冷却時、ケイソウ土を通して濾過してCH₂Cl₂を用いてフィルターおよびフラスコを洗浄した。濾液を濃縮して70mg(78%)の化合物３７をオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.90 (t, 8H), 3.33 (s, 8H), 3.45 (t, 8H), 3.52-3.73 (m, 48H)。
【０１７１】
＜化合物２４＞
NaHCO₃ 40mg (0.48mmol)および104mg(0.40mmol)の化合物１０を、70mg(0.098mmol)の化合物３７のジオキサン(2mL)とH₂O(0.67mL)との溶液に加えた。この混合物を室温で17時間攪拌し、そして1N H₂SO₄ 0.5mLを加え、pHを4にする。混合物を濃縮し、そして濃縮物をG-10 Sephadex（登録商標）(MeOH)のクロマトグラフィーで精製した。生成物を含有する画分を減圧下で濃縮してオイル91mgを得た。HPLC (C₁₈, グラジエント 20/80/0.1〜35/65/0.1 CH₃CN/H₂O/CF₃CO₂H)によって粗製の生成物36mgを精製することにより、19mg(44%)の化合物２４をオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.50 (t, 8H), 3.31 (s, 8H), 3.36-3.72 (m, 56H), 3.91 (s, 8H);¹³C NMR (CDCl₃) d 28.8, 36.5, 39.7, 40.0, 67.2, 69.3, 69.5, 70.3, 166.6, 173.0. MS(FAB) m/e (相対強度) MH⁺ [1425(15), 1427(63), 1429(75), 1431(64), 1433(12)], 577(100)。
【０１７２】
＜化合物２５ａ−[PEG₃₃₅₀のビス-トシレート]＞
ピリジン6.47mLを、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したポリエチレングリコール(J.T. Baker、平均分子量 1モルあたり3350g) 16.75g(5.0mmol)のCH₂Cl₂ 40mL中の溶液に加えた。溶液を窒素下で静置し、そして0℃まで冷却した。塩化トシル7.63g(40mmol)のCH₂Cl₂(40mL)溶液を25分間かけて加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で16時間攪拌した。混合物を1N HCl 80mLと共に振盪し、そしてエマルジョンを含有するCH₂Cl₂層をH₂O 100mLで洗浄した。CH₂Cl₂層を、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮した。この残留物をCH₂Cl₂/Et₂Oから結晶化して、16.82g(92%)の化合物２５ａを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.50 (s, 6H), 3.48 (t, J=5Hz, 4H), 3.55-3.77 (m, 600Hより大きい, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.83 (t, J=5Hz, 4H), 7.44 (d, J=7Hz, 4H), 7.94 (d, J=7Hz, 4H)。
【０１７３】
＜化合物２６ａ−[ジアジド-PEG₃₃₅₀]＞
10.83g(2.96mmol)の化合物２５ａとNaN₃ 1.92g(29.6mmol)とのDMF(30mL)溶液を、N₂下で、120℃の油浴中で3時間加熱した。冷却時、この混合物をH₂O(100mL)とCH₂Cl₂(100mL)とで分けた。CH₂Cl₂層をCH₂Cl₂を用いて200mLまで希釈し、そして1N HCl 100mLで洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮した。得られたロウ質の固形物を再結晶(CH₂Cl₂/Et₂O)し、そして得られた固形物をシリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 98/2〜95/5 CH₂Cl₂/MeOH)でさらに精製して、4.75g(47%)の化合物２６ａをロウ質の固形物として得た：TLC Rf 0.41 (9/1 CH₂Cl₂)；¹H NMR (CDCl₃) d 3.35 (t, J=5Hz, 4H), 3.44 (t, J=5Hz, 2H), 3.54-3.77 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.79 (t, J=5Hz, 2H)。
【０１７４】
＜化合物２７ａ−[ジアミノ-PEG₃₃₅₀]＞
10% Pdカーボン(Aldrich)473mgを、4.75g(1.39mmol)の化合物２６ａのEtOH(140mL)溶液に加えた。この混合物を60psiのH₂下で30時間振盪した。反応が不完全であった(TLC, 9/1 CH₂Cl₂/MeOH)ため、さらに10% Pdカーボン473mgを加え、そしてこの混合物を60psiのH₂下でさらに5時間振盪した。次いで、混合物をケイソウ土を通して濾過し、減圧下で濃縮し、そして濃縮物を結晶化して(CH₂Cl₂/Et₂O)、4.03g(86%)の化合物２７ａを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.92 (t, 4H), 3.49 (t, 2H), 3.66 (t, 4H), 3.67 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.86 (t, 2H)。
【０１７５】
＜化合物２８−[化合物７のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド596mg(2.89mmol)を、1.84g(2.41mmol)の化合物７とNHS 278mg(2.41mmol)とのTHF(12mL)溶液にN₂下0℃で加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で16時間攪拌した。この混合物に酢酸250μLを加えた。室温で1時間攪拌を続けた。次いで、混合物を冷凍機中に2時間静置した。固形物を濾過によって除去し、そして濾液を濃縮して、2.27g(110%)の粗製の化合物２８を粘稠なオイルとして得た。化合物２８を分解しないように精製することは困難であったので、この化合物２８は、ジアミノ-PEGをアシル化するために直接用いた。
【０１７６】
＜化合物２９ａ＞
900mg(1.05mmol)の化合物２８のジオキサン(4.68mL)溶液を、877mg(0.26mmol)の化合物２７ａとNaHCO₃ 176mg(2.10mmol)とのH₂O(3.12mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を2時間攪拌し、次いで1N HCl(25mL)と2つのCH₂Cl₂(25mLずつ)とで分けた。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント, 95/5〜87/13 CH₂Cl₂/MeOH)によって精製することにより、695mg(55%)の化合物２９ａをロウ質の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.55 (bd, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.44-3.72 (m, およそ432H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 4H), 4.03 (s,
4H), 5.09 (s, 8H), 7.36 (s, 20H)。
【０１７７】
＜化合物３８ａ＞
シクロヘキセン7.1mLを、688mg(0.142mmol)の化合物２９ａのEtOH(14.2mL)溶液にN₂下で加えた。10% Pdカーボン284mgを加え、そして得られた混合物を2時間還流した。冷却時、混合物をケイソウ土を通してEtOHで濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮して550mg(90%)の化合物３８ａをロウ質の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.58 (m, 8H), 2.93 (m, 8H), 3.38-3.76 (m, およそ550H), 4.00 (s, 4H), 4.13 (s, 4H)。
【０１７８】
＜化合物３０ａ＞
268mg(1.04mmol)の化合物１０のジオキサン(4.65mL)溶液を、550mg(0.13mmol)の化合物３８ａとNaHCO₃ 175mg(2.08mmol)とのH₂O(3.11mL)溶液に0℃で加えた。この混合物を20時間攪拌し、そして1N H₂SO₄(50mL)と2つのCH₂Cl₂(50mLずつ)とで分けた。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）クロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、非晶質の固形物を得た。この固形物を結晶化して(EtOH/Et₂O)、378mg(61%)の化合物３０ａを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.59 (bd s, 8H), 3.38-3.82 (m, およそ500H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.88 (s, 8H), 3.98 (s, 4H), 4.10 (s, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.84mmol/g；実測値, 0.50mmol/g。
【０１７９】
＜化合物２５ｂ−[PEG₈₀₀₀のビス-トシレート]＞
トリエチルアミン2.3mL(16.5mmol)、次いでTsCl 3.15g(16.5mmol)を、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したPEG₈₀₀₀(Aldrich、平均分子量8000g/mmol) 12.0g(1.5mmol)のCH₂Cl₂ 30mL中の溶液に加えた。この混合物を室温で18時間攪拌し、そして1N HCl(50mLずつ)で4回、次いで飽和NaCl溶液(50mL)で1回抽出した。CH₂Cl₂層を乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして減圧下で濃縮して、ロウ質の固形物を得た。再結晶(CH₂Cl₂/Et₂O)により、11.0g(92%)の化合物２５ｂを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.38 (s, 6H), 3.40-3.89 (m, およそ800H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.14 (m, 4H), 7.34 (d, J=8.2Hz, 4H), 7.79 (d,
J=8.2Hz, 4H)。
【０１８０】
＜化合物２６ｂ−[PEG₈₀₀₀のジアジド]＞
NaN₃ 1.86g(28.6mmol)を、10.8g(1.3mmol)の化合物２５ｂの乾燥DMF(30mL)溶液に加えた。この混合物をN₂下で120℃にて2.5時間加熱した。冷却時、この混合物をCH₂Cl₂(240mL)と3つの0.5N HCl(50mLずつ)とで分けた。CH₂Cl₂層を飽和NaCl溶液(50mL)で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、固形物を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 2/98〜6/94 MeOH/CH₂Cl₂)で精製し、そして精製した生成物を再結晶(MeOH/Et₂O)することにより、6.95g(66%)の化合物２６ｂを白色の固形物として得た：TLC (Rf=0.33, 12/88 MeOH/CH₂Cl₂)；¹H NMR (CDCl₃) 3.39-3.86 (m)。
【０１８１】
＜化合物２７ｂ−[ジアミノ-PEG₈₀₀₀]＞
6.9g(0.86mmol)の化合物２６ｂのアンモニアで飽和したMeOH(150mL)溶液を窒素でパージした。10% Pdカーボン 1.5gを加え、そしてこの混合物を65psiのH₂下で振盪した。20時間後、TLC分析により、反応が不完全であることが示された。結果として、10% Pdカーボン200mgを加え、そして65psiのH₂下でさらに20時間振盪を続けた。この混合物をケイソウ土を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られたロウ質の固形物を再結晶して(MeOH/Et₂O)、6.0g(89%)の化合物２７ｂを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.96 (t, J=5.1Hz, 4H), 3.40-3.89 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値)。
【０１８２】
＜化合物２９ｂ＞
NaHCO₃ 221mg(2.63mmol)を、3.0g(0.375mmol)の化合物２７ｂの水(10mL)とジオキサン(3mL)との溶液に加えた。次いで、ジオキサン(10mL)に溶解した1.3g(1.51mmol)の化合物２８を加えた。この混合物を24時間攪拌し、次いで0.5N HCl(40mL)を加えた。この混合物をCH₂Cl₂(25mLずつ)で4回抽出した。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。MeOH/Et₂Oから結晶化することにより、2.0g(58%)の化合物２９ｂを得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.52 (m, 8H), 3.40-3.64 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.09 (s, 8H), 7.35 (s, 20H)。
【０１８３】
＜化合物３８ｂ＞
10% Pdカーボン123mgを、600mg(0.063mmol)の化合物２９ｂの無水EtOH(5mL)とシクロヘキセン(2.5mL)との溶液に、窒素下で加えた。この混合物を窒素下で2時間還流した。この反応混合物をケイソウ土を通して濾過し、エバポレートして549mg(97%)の化合物３８ｂを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.58 (m, 8H), 2.90 (m, 8H), 3.39-3.70 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.05 (s, 4H), 4.15 (s, 4H)。
【０１８４】
＜化合物３０ｂ＞
NaHCO₃ 100mg(1.2mmol)、次いで84mg(0.32mmol)の化合物１０を、529mg(0.059mmol)の化合物３８ｂのジオキサン(2mL)と水(5mL)との溶液に加えた。12時間攪拌後、この反応物を1N H₂SO₄で酸性化し、そしてCHCl₃(40mLずつ)で4回抽出した。CHCl₃層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、503mgの半固形の残留物を得た。この残留物を、G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製し、そして結晶化して(MeOH/Et₂O/ヘキサン)、215mg(39%)の化合物３０ｂを白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.58 (m, 8H), 3.35-3.70 (m, およそ700H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.89 (s, 8H), 4.01 (s, 4H), 4.16 (s, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.42mmol/g；実測値, 0.27mmol/g。
【０１８５】
＜化合物３１−[PEG₃₃₅₀-ビス-クロロホルメート]＞
乾燥ピリジン2滴、次いでトリホスゲン125mg(0.418mmol)を、共沸蒸留(トルエン)によって乾燥したポリエチレングリコール(J.T. Baker、平均分子量 1モルあたり3350g) 1.0g(0.249mmol)のCH₂Cl₂ 12mL中の溶液に加えた。この混合物を室温で20時間攪拌し、そして溶媒を減圧下でエバポレートして1.0g(100%)の化合物３１を白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 3.40-3.65 (m, およそ300H,
大きすぎて正確ではない積分値), 3.77 (m, 4H), 4.46 (m, 4H)。
【０１８６】
＜化合物３２＞
1.0g(0.25mmol)の化合物３１の5:1 CH₂Cl₂/ジオキサン(12mL)溶液を、600mg(1.0mmol)の化合物１８のジオキサン(10mL)とピリジン(1.5mL)との50℃の溶液に滴下した。得られた濁った溶液を72時間攪拌した。CH₂Cl₂(25mL)を加え、次いでこの混合物を濾過した。濾液をエバポレートし、そして半固形の残留物を、G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィーで精製した。得られた固形物を結晶化して(CH₂Cl₂/Et₂O)、829mg(75%)の化合物３２を微黄色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.30 (m, 8H), 1.40 (m, 8H), 1.61 (m, 8H), 2.18 (m, 8H), 3.17 (m, 8H), 3.40 (m, 16H), 3.62 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.15 (m, 4H), 5.07 (s, 8H), 7.33 (m, 20H)。
【０１８７】
＜化合物３９＞
10% Pdカーボン100mgを、300mg(0.065mmol)の化合物３２の無水EtOH(5mL)とシクロヘキセン(2mL)との溶液に窒素下で加えた。この混合物を窒素下で2時間還流した。この混合物をケイソウ土を通して濾過し、溶媒をエバポレートして237mg(90%)の化合物３９を白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.37 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.21 (m, 8H), 2.50 (m, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.64 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 4.19 (m, 4H)。
【０１８８】
＜化合物３３＞
NaHCO₃ 125mg(0.67mmol)および115mg(0.44mmol)の化合物１０を、225mg(0.055mmol)の３９のジオキサン(5mL)と水(5mL)との溶液に加えた。得られた黄色の溶液を室温で12時間攪拌した。次いで、この溶液をCH₂Cl₂(30mLずつ)で3回抽出した。水層を1N H₂SO₄で酸性化し、そしてCH₂Cl₂(30mLずつ)で3回抽出した。CH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、黄色のオイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製し、そして得られたオイルを再結晶して(EtOH/Et₂O)、182mg(73%)の化合物３３を白色の固形物として得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.22 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (m, 16H), 3.50-3.64 (m, およそ300H, 大きすぎて正確ではない積分値), 3.87 (s, 8H), 4.18 (m, 4H);ブロモアセチル測定法(European Journal of Biochemistry, 1984, 140, 63-71)：計算値, 0.87mmol/g；実測値, 0.73mmol/g. 分析値：C₁₉₁H₃₇₅O₈₇N₁₀Br₄に対する計算値：C, 50.84; H, 8.33; N, 3.09; Br, 7.05. 実測値：C, 51.98; H, 8.34; N, 2.45; Br,
10.19。
【０１８９】
＜化合物４０−[4-ニトロフェニルヨードアセテート]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド5.15g(25mmol)と4-ニトロフェノール2.92g(2.92mmol)とのEtOAc(100mL)溶液を、ヨード酢酸3.72g(20mmol)の0℃の溶液に加えた。この混合物を0℃で1時間、および室温で2時間攪拌した。固形物を濾過によって除去し、そして濾液を減圧下で濃縮した。得られた黄色の固形物を再結晶して(EtOAc/ヘキサン/痕跡量のHOAc)、4.82g(78%)の化合物４０を黄褐色の固形物として得た： ¹H NMR (CDCl₃) d 4.00 (s, 2H), 7.39 (d, 2H), 8.40 (m, 2H)。
【０１９０】
＜化合物４１＞
NaHCO₃ 103mg(1.22mmol)、次いで211mg(0.692mmol)の化合物４０を、110mg(0.104mmol)の化合物３４のジオキサン(5mL)とH₂O(5mL)との溶液に加えた。この混合物を18時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、140mg(87%)の化合物４１をオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C₁₈, グラジエント 20/80/0.1〜25/75/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA 60分間にわたって、225nm)で調製した：¹H NMR (CDCl₃) d 2.59 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.44-3.62 (m, 60H), 3.77 (s, 4H), 3.78 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 4.21 (s, 4H)。
【０１９１】
＜化合物４２＞
N-メトキシカルボニルマレイミド145mg(0.935mmol)を、171mg(0.161mmol)の化合物３４のジオキサン(8mL)と飽和NaHCO₃溶液(2mL)とH₂O(2mL)との溶液に0℃で、勢いよく攪拌しながら加えた(The Practice of Peptide Synthesis, M. BodanskyおよびA. Bodansky, Springer-Verlag, ニューヨーク, 1984, 29-31頁. Keller, O., Rudinger, J. Helv. Chim, Acta 1975, 58, 531.)。15分後、ジオキサン25mLを加え、冷却浴を除去し、そして室温で45分間攪拌を続けた。この混合物をCHCl₃(30mLずつ)で2回抽出し、そしてCHCl₃層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。G-10 Sephadex（登録商標）のクロマトグラフィー(MeOH)で精製することにより、103mg(45%)の化合物４２をオイルとして得た。分析試料を分取用HPLC(C₁₈, グラジエント 20/80/0.1〜25/75/0.1 CH₃CN/H₂O/TFA 65分間にわたって、225nm)で調製してオイルを得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.57 (m, 4H), 2.67 (m, 4H), 3.42-3.65 (m, 52H), 3.72 (m, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.17 (s, 4H), 6.74 (s, 4H), 6.75 (s, 4H)。
【０１９２】
＜化合物４３−[ヒドロキシメチル-トリス-(2-シアノエトキシメチル)メタン]＞ KOH 0.30g(5.41mmol)、次いでアクリロニトリル23mL(18.6g, 350mmol)を、ペンタエリスリトール6.8g(50mmol)のH₂O(50mL)溶液に加えた。この混合物を室温で16時間攪拌し、濃HCl溶液 1.5mLで酸性化し、そしてCH₂Cl₂(50mLずつ)で2回抽出した。このCH₂Cl₂層を合わせて、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、16.97gの液体を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(EtOAc)で精製することにより、8.49g(51%)の化合物４３を粘稠なオイルとして得た：TLC, Rf=0.15(EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃) d 2.62 (t, 6H), 3.54 (s, 6H), 3.68 (t, 6H), 3.70 (s, 2H)。
【０１９３】
＜化合物４４−[ヒドロキシメチル-トリス-(2-カルボキシメチルエトキシメチル)メタン]＞
HClで飽和したMeOH溶液78mLを、5.45g(15.6mmol)の化合物４３に加えた。この混合物を1時間還流状態で加熱し、そして冷却時、H₂O(100mL)と4つのEt₂O(100mLずつ)とで分けた。Et₂O層を合わせて、飽和NaHCO₃溶液(100mL)および飽和NaCl溶液(100mL)で順次洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、4.74gの粘稠な液体を得た。シリカゲルのクロマトグラフィーで精製することにより、3.05g(50%)の化合物４４をオイルとして得た：TLC, Rf=0.27 (80/20 EtOAc/ヘキサン);¹H NMR (CDCl₃) d 2.58 (t, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.61 (s, 2H), 3.69 (t, 6H), 3.70 (s, 9H);¹³C NMR (CDCl₃) d 34.8, 44.9, 51.6, 65.2, 66.9, 71.0, 172.1。
【０１９４】
＜化合物４５＞
560mg(1.4mmol)の化合物４４と1.69g(6.0mmol)の化合物４との混合物を、150℃で4時間窒素下で加熱した。この混合物をEtOAc(50mL)と1N HCl (25mL)とに分け、そしてHCl層をCH₂Cl₂(25mL)で抽出した。EtOAcおよびCH₂Cl₂の抽出層を合わせて、飽和NaHCO₃溶液で洗浄し、乾燥し(K₂CO₃)、濾過し、そして濃縮して、粘稠な残留物を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー(グラジエント 95/5〜90/10 CH₂Cl₂/MeOH)で精製することにより、300mg(19%)の化合物４５を粘稠なオイルとして得た：TLC, Rf=0.24 (90/10 CH₂Cl₂/MeOH); ¹H NMR (CDCl₃) d 2.40 (t, 6H), 3.38 (s, 6H), 3.39-3.48 (m, 12H), 3.52-3.67 (m, 32H), 5.13 (s, 6H), 5.62 (bd s, 3H), 6.80 (bd s, 3H), 7.40 (s, 15H)。
【０１９５】
＜化合物４６＞
10% Pdカーボン104mgを、308mg(0.269mmol)の化合物４５のEtOH(10.4mL)とシクロヘキセン(5.2mL)との溶液に窒素下で加えた。還流冷却器を取り付け、そしてこの混合物を85℃の油浴中で1.5時間加熱した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして濾液を濃縮して177mgの残留物を得た。この残留物をジオキサン 5.98mLに一部溶解した。得られた混合物を、386mg(1.49mmol)の化合物１０に加え、次いでこれをNaHCO₃ 251mg(2.99mmol)のH₂O(3.99mL)溶液に加えた。得られた混合物を窒素下で18時間攪拌し、そして1N HCl(25mL)と3つのCH₂Cl₂(25mLずつ)とで分けた。水層を3/1 CH₂Cl₂/MeOH(25mLずつ)で3回および1/1 CH₂Cl₂/MeOH(25mLずつ)で3回抽出した。最初の2回分のCH₂Cl₂抽出物を廃棄し、そして残りの抽出物を合わせて、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、102mgの粘稠なオイルを得た。HPLCで(C₁₈, 23/77/0.1 CH₃CN/H₂O/CF₃CO₂H, 234nm 検出)で精製することにより、43mg(14%)の化合物４６を粘稠なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 2.48 (t, 6H), 3.40 (s, 6H), 3.44-3.54 (m, 14H), 3.56-3.62 (m, 12H), 3.63 (s, 12H), 3.67 (t, 6H), 3.91 (s, 6H), 6.90 (t, 3H), 7.10 (t, 3H); MS (FAB) m/e (相対強度) MH⁺ [1103(17), 1105(42), 1107(41), 1109(18)], MNa⁺ [1125(38), 1127(100), 1129(99), 1131(39)]。
【０１９６】
＜化合物４７−[S-(6-ヒドロキシヘキシル)イソチオウロニウムクロライド]＞
チオ尿素11.1g(146mmol)を6-クロロヘキサノール16.6mL(20.0g, 146mmol)のエタノール(49mL)溶液に加え、そしてこの混合物を24時間還流した。混合物を0℃まで冷却し、そして生成物を結晶化した。この結晶を減圧濾過によって集め、そして乾燥して、28.4g(92%)の化合物４７を白色の固形物として得た：mp 122-124℃; ¹H NMR (DMSO) d 1.40 (m, 4H), 1.65 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.41 (t, 2H), 9.27および9.33 (重複した広幅シングレット, 4H); 分析値：C₇H₁₇ClN₂OSに対する計算値：C, 39.51; H, 8.06; N, 13.17; S, 15.07. 実測値：C, 39.69; H, 8.00; N, 13.01; S, 15.16。
【０１９７】
＜化合物４８−[6-メルカプトヘキサン-1-オール]＞
NaOHのペレット9.25gを、17.8mg(83.6mmol)の化合物４７のH₂O(120mL)とEtOH(120mL)との溶液に加えた。この混合物を4時間還流した。混合物をおよそ75mLになるまで注意深く濃縮し、そして濃縮物を減圧蒸留によって精製して、7.4g(66%)の化合物４８を得た：bp 95-105℃(5mmHg); ¹H NMR (CDCl₃) 1.41(m, 9H), 2.59 (dt, 2H), 3.69 (brd sと重複したt, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 24.5, 25.2, 28.0, 32.5, 33.9, 62.7; 分析値：C₆H₁₄OSに対する計算値：C, 53.68; H, 10.51; S, 23.89. 実測値：C, 53.35; H, 10.72; S, 23.60。
【０１９８】
＜化合物４９−[ビス-(6-ヒドロキシヘキシル)ジスルフィド]＞
I₂ 4.02g(15.8mmol)のMeOH(90mL)溶液を、4.26g(31.7mmol)の化合物４８のMeOH(10mL)とEt₃N(13.7mL (9.97g, 98.5mmol))との溶液にN₂雰囲気下で10分間かけて滴下し、そして氷浴で冷却した。冷却浴を除去し、そして混合物を雰囲気温度で4時間攪拌した。この混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン/EtOAc)で精製して、3.12g(73%)の化合物４９を淡黄色の固形物として得た：TLC R_f 0.18 (1:1 ヘキサン/EtOAc); mp 38-48℃; ¹H NMR (CDCl₃) 1.15-2.20 (m, 16H), 2.73 (t, 4H), 3.70 (t, 4H);分析値：C₁₂H₂₆S₂0₂に対する計算値：C, 54.09; H, 9.84; S, 24.06. 実測値：C, 54.85, H, 9.86; S, 24.11。
【０１９９】
＜化合物５０−[モノ-O-(4',4''-ジメトキシトリフェニルメチル)-ビス-(6-ヒドロキシヘキシル)ジスルフィド]＞
4,4'-ジメトキシトリフェニルメチルクロライド3.97g(11.7mmol)を、3.12g(11.7mmol)の化合物４９のピリジン(45mL)溶液に加えた。この混合物を雰囲気温度で16時間攪拌した。大部分のピリジンをロータリーエバポレーターで除去し、そして残留物を飽和NaHCO₃溶液(100mL)とEtOAc(100mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaCl溶液 50mLで洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(9:1 CH₂Cl₂/EtOAc)で精製することにより、2.84g(43%)の化合物５０を粘稠なオイルとして得た：TLC R_f 0.35 (9:1 CH₂Cl₂/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃) 1.41 (m, 8H). 1.65 (m, 8H), 2.70 (2つの重複したトリプレット, 4H), 3.08 (t, 2H), 3.65 (t, 2H), 3.81 (s, 6H), 6.85 (d, 4H), 7.32 (m, 7H), 7.47 (d, 2H); HRMS (FAB, M+), C₃₃H₄₄0₄S₂に対する計算値：568.2681. 実測値：568.2665。
【０２００】
＜化合物５１−[O-[14-(4',4''-ジメトキシトリフェニルメトキシ)-7,8-ジチオテトラデシル]-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]＞ O-シアノエチル-N,N,N',N'-テトラ-イソプロピルホスホロジアミダイト458mg(1.52mmol)のCH₂Cl₂(0.5mL)溶液を、771mg(1.36mmol)の化合物５０とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド116mg(0.68mmol)のCH₂Cl₂(6.8mL)溶液にN₂雰囲気下で加えた。混合物を4時間攪拌し、そしてNaHCO₃(25mL)とCH₂Cl₂(3×25mL)とで分けた。CH₂Cl₂層を合わせて、飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(Na₂CO₃)、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。25mmカラム中の塩基性のアルミナ(2"プラグ)を通して濾過し、9:1 CH₂Cl₂/Et₃Nで溶出することによって精製して、831mg(80%)の化合物５１を粘稠なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.25 (m, 12H), 1.45 (m, 8H), 1.70 (m, 8H), 2.72 (m, 6H), 3.09 (t, 2H), 3.65 (m, 4H), 3.87 (s, 6H), 3.91 (m, 2H), 6.89 (d, 4H), 7.35 (m, 7H), 7.49 (d, 2H); ³¹P NMR (15% H₃PO₄を内部標準として有するCDCl₃)147,69; HRMS (FAB, MH+), C₄₂H₆₂N₂O₅PS₂に対する計算値：769.3839, 実測値：769.3853。
【０２０１】
＜化合物５２−[トリチル-HADアルコール]＞
塩化トリチル60g(0.21mol)を、57g(0.21mol)の化合物４９のピリジン(60mL)溶液に加えた。この混合物を100℃で19時間攪拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして濾過した。濾液を塩化メチレン 300mLで希釈し、そして飽和炭酸水素ナトリウム 200mLで抽出した。有機層を、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント 9:1 ヘキサン：酢酸エチル〜3:1 ヘキサン：酢酸エチル)で精製することにより、55g(50%)の化合物５２を得た：¹H NMR (CDCl₃) δ 1.38 (m, 8H), 1.63 (m, 8H), 2.66 (m, 4H), 3.04 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 7.25 (m, 9H), 7.42 (m, 6H). HRMS (FAB, M+), C₃₁H₄₀O₂Sに対する計算値：508.2470. 実測値：508.2482。
【０２０２】
＜化合物５３−[トリチル HAD ホスホロアミダイト]＞
10g(19.7mmol)の化合物５２とジイソプロピルエチルアミン6.3mL(36.2mmol)との塩化メチレン(90mL)溶液に、アルゴン下で0℃にて、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト4.5mL(20.2mmol)をゆっくりと加えた。この混合物を90分間攪拌した後、反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム100mLずつで2回抽出した。この塩化メチレン溶液を、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。塩基性アルミナクロマトグラフィー(75:24:1, ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン)で精製することにより、11.3g(81%)の化合物５３をオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) δ 1.18 (m, 12H), 1.37 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.6 (m, 6H), 3.04 (t, 2H), 3.60 (m, 4H), 3.82 (m, 2H), 7.26 (m, 6H), 7.44 (m, 9H). HRMS (FAB, MH+), C₄₀H₅₈N₂O₃PS₂に対する計算値：709.3626. 実測値：709.3621。
【０２０３】
＜化合物５４−[O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-ヘキセノール]＞
イミダゾール15.66g(230mmol)とtert-ブチルジメチルシリルクロライド20.0g(130mmol)を、5-ヘキセン-1-オール12.47mL(10.4g, 104mmol)のDMF(104mL)溶液に加えた。この混合物を雰囲気温度で4時間攪拌し、そしてEtOAc(200mL)と飽和NaHCO₃溶液(100mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaHCO₃溶液100mL、飽和NaCl溶液100mLで洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、およそ容量100mLとした。減圧下で蒸留することにより、70.07g(90%)の化合物５４を得た：bp 130-143℃(100mmHg); ¹H NMR (CDCl₃) 0.11 (s, 6H), 0.95 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 2.11 (dt, 2H), 3.66 (t, 2H), 5.03 (m, 2H), 5.86 (m, 1H); ¹³C NMR (CDCl₃) -5.25, 18.40, 25.21, 26.01, 32.35, 33.60, 63.09, 114.40, 138.92; 分析値：C₁₂H₂₆OSiに対する計算値：C, 67.22; H, 12.22. 実測値：C, 66.96; H, 12.16。
【０２０４】
＜化合物５５−[1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
9.86g(46.0mmol)の化合物５４のアセトン(92mL)溶液に、N-メチルモルホリンオキサイド6.46g(55.2mmol)のH₂O(23mL)溶液を加えた。この混合物に、2.5%のOsO₄のtert-ブチルアルコール溶液443μl(溶液360mg, OsO₄ 9.0mg, 35μmol)および30% H₂O₂ 50μLを加えた。この混合物を16時間攪拌し、そして亜ジチオ酸ナトリウム474mgのH₂O(14mL)溶液を加えた。さらに0.5時間後、この混合物をセライトを通して濾過した。濾液をMgSO₄で乾燥し、150mLのブフナロート中の1"のシリカゲルを通して濾過し、EtOAc 250mLずつを用いて溶出した。生成物を含有する画分を濃縮して、11.0g(96%)の５５を粘稠なオイルとして得た：TLC R_f 0.2 (1:1 ヘキサン/EtOAc); ¹H NMR (CDCl₃) 0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.25 (m, 4H), 1.55 (m, 2H), 3.41 (dd, 2H), 3.62 (t, 2H), 3.71 (m, 1H); ¹³C NMR (CDCl₃) -5.23, 18.42, 21.91, 26.02, 32.68, 32.81, 63.16, 66.74, 72.24; HRMS (FAB, MH+), C₁₂H₂₉O₃Siに対する計算値：249.1886. 実測値：249.1889。
【０２０５】
＜化合物５６−[5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
塩化ベンゾイル6.18mL(7.48g, 53.2mmol)を、5.29g(21.3mmol)の５５のピリジン(106mL)溶液に加えた。この混合物を18時間攪拌し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。混合物を冷1N HCl(100mL)とEtOAc(100mL)とで分けた。水層のpHを調べて、確実に酸性にした。EtOAc層をH₂O 100mLおよび飽和NaCl 100mLで順次洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、10.33g(99%)の化合物５６を粘稠な黄色のオイルとして得た：TLC R_f 0.45 (1:4 EtOAc/ヘキサン); ¹H NMR (CDCl₃) d 0.05 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 1.59 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 3.14 (t, 2H), 4.49 (dd, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.54 (m, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H)。
【０２０６】
＜化合物５７−[5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1,5,6-ヘキサントリオール]＞
1N フッ化テトラブチルアンモニウム10.7mL(10.7mmol)のTHF溶液を、2.62g(5.36mmol)の５６のTHF(10.9mL)溶液に加えた。この混合物を16時間攪拌した。混合物を飽和NaHCO₃溶液(25mL)とEtOAc(3×25mL)とで分けた。EtOAc抽出物を合わせて、飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、粘稠なオイルを得た。このオイルをシリカゲルクロマトグラフィー(1:1 ヘキサン/EtOAc)で精製して、823mg(41%)の化合物５７を粘稠なオイルとして得た：R_f 0.14 (1:1 ヘキサン/EtOAc);¹H NMR (CDCl₃) d 1.58 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 3.68 (t, 2H), 4.52 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.56 (m, 1H), 7.46 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H); ¹³C NMR (CDCl₃) d 22.08, 31.20, 31.30, 32.88, 62.92, 66.17, 72.63, 128.93, 130.19, 130.57, 133.62, 166.72, 166.86; HRMS (FAB, MH+), C₂₀H₂₃O₅に対する計算値：343.1545. 実測値：343.1553。
【０２０７】
＜化合物５８−[O-[5,6-(ビス-O-ベンゾイルオキシ)-ヘキシル]-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]＞
O-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト989mg(3.28mmol)のCH₂Cl₂(2.0mL)溶液を、1.02g(2.98mmol)の５７とジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド255mg(1.49mmol)(ジイソプロピルアミンのアセトニトリル溶液とテトラゾールとを1:1のモル比で混合し、そして濃縮して、白色の固形物として調製した)とのCH₂Cl₂(14.9mL)溶液に加えた。この混合物を4時間攪拌し、次いでCH₂Cl₂(25mL)と冷飽和NaHCO₃溶液(25mL)とで分けた。CH₂Cl₂層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(Na₂SO₄)、濾過し、そして濃縮した。25mmカラム中の塩基性のアルミナ(2"プラグ)を通して濾過し、9:1 EtOAc/Et₃Nで溶出することにより精製して、1.5g(93%)の化合物５８を粘稠なオイルとして得た：¹H NMR (CDCl₃) d 1.19 (m, 12H), 1.62 (m, 2H), 1.73 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.62 (dd, 2H), 3.53-3.92 (m, 6H), 4.53 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.58 (m, 1H), 7.48 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 8.09 (m, 4H); ³¹P NMR (15% H₃PO₄を内部標準として有するCDCl₃) d 148.2; HRMS (FAB, MH+), C₂₉H₄₀O₆N₂Pに対する計算値：543.2624. 実測値：543.2619。
【０２０８】
＜化合物５９−[4(ヨードアセトアミド)安息香酸]＞
Weltman, J.K., 1983 Biotechniques 1:148-152に記載のようにして、この化合物を調製した。簡単に述べると、ヨード酢酸無水物708mg(2.0mmol)を、パラアミノ安息香酸137mg(1.0mmol)のジオキサン(10mL)溶液に加えた。この混合物を暗所で18時間攪拌し、そしてH₂O(25mL)とEtOAc(25mL)とで分けた。EtOAc層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、濾過し、そして濃縮して、桃色の固形物797mgを得た。ヘキサン/EtOAcから再結晶することにより、4-(ヨードアセトアミド)安息香酸221mg(72%)を白色の固形物として得た：mp 220-230℃; ¹H NMR (CDCl₃) d 3.86 (s, 2H), 7.68 (d, 2H), 7.91 (d, 2H), 10.60 (s, 1H)。
【０２０９】
＜化合物６０−[α,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコールの4-(ヨードアセトアミド)ベンゾイル誘導体]＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド188mg(0.909mmol)を、4-(ヨードアセトアミド)安息香酸185mg(0.606mmol)とα,ω-ビス-(N-2-アミノエチルカルバモイル)ポリエチレングリコール(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., トルエンとの共沸蒸留により乾燥)406mg(0.121mmol)とのTHF(2mL)溶液に加えた。この混合物を2時間攪拌し、次いで酢酸6滴を加えた。CH₂Cl₂ 10mLを加え、そして混合物を30分間冷凍機中に置いた。混合物を濾過して固形物を除去し、そして濾液を濃縮して粘稠な残留物を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(グラジエント 99/1〜96/4 CH₂Cl₂/MeOH)で精製することにより、固形物を得た。この固形物をMeOHを用いて粉砕して微黄白色の固形物292mgを得た：¹H NMR (CDCl₃) 3.48 (m, 8H), 3.63 (bd s, (CH₂CH₂O)_n, 大きすぎて積分不可能), 3.98 (s, 4H), 4.18 (bd m, 4H), 5.91 (bd m, 2H), 7.48 (bd m, 2H), 7.76 (d, 4H), 7.88 (d, 4H), 9.38 (bd m, 2H):ヨードアセチル測定法(European Journal of Biochemistry 1984, 140,
63-71): 計算値, 0.46mmol/g; 実測値, 0.37mmol/g。
【０２１０】
（実施例３：活性結合手プラットフォーム分子および複合体の調製）
生物学的分子または化学的分子と、結合手プラットフォーム分子との複合体を形成する方法は、多数ある。特定の方法には、生物学的分子または化学的分子に結合したチオールを用いて、結合手プラットフォーム分子上の反応性の「チオフィリック（イオウ親和性）」基と求核反応させて、チオエーテル結合を形成させる方法があるが、プラットフォーム分子上の反応基と、生物学的分子または化学的分子上の反応基との他の組合せも、生物学的分子または化学的分子を結合手プラットフォーム分子に共有結合的に結合させるために用いられ得る。表１に、相互反応基のいくつかの組合せを挙げる。与えられる方法のうちどれが優先的に行われるかは、生物学的分子または化学的分子の性質（溶解度、他の反応性基の存在など）により決定される。
【０２１１】
【表１】

【０２１２】
以下に記載の実施例は、種々の結合手プラットフォーム分子の合成方法、および上記分子と生物学的分子または化学的分子とを複合体化する方法を例示する。これらの実施例は、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが、表１中の相互反応基を用いて結合手プラットフォーム分子と複合体化する方法を示している。ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの他に、他の生物学的分子（タンパク質、薬剤など）もまた、結合手プラットフォーム分子と複合体化し得る。
【０２１３】
（組合せ１：プラットフォームのチオール−リガンドのチオフィリック基）
【０２１４】
【化２９】

【０２１５】
＜化合物Ａ＞
化合物３６（861mg、1.0mmol）およびNaHCO₃ 252mg（3.0mmol）を、1/1 ジオキサン/H₂O 20mLに溶解する。混合物を0℃に冷却し、そしてN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（Prochem Inc.）1.16g（5.0mmol）のジオキサン（40mL）溶液を、この混合物を攪拌しながら加える。1時間後、この混合物をCH₂Cl₂で抽出する。抽出物全量をMgSO₄で乾燥し、濾過し、濃縮する。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ａを得る。
【０２１６】
＜化合物Ｂ−４つのチオール基を有するプラットフォーム＞
Ａ 732mg（0.55mmol）のDMSO（7.3mL）溶液を、ヘリウムを吹き込んだpH10の緩衝液（100mM 炭酸ナトリウム、10mM NH₂OH）55mLに加える。この混合物をN₂ガス下におき、1時間攪拌して、約10mMのテトラチオールプラットフォームＢの溶液を得る。
【０２１７】
＜化合物Ｘ−ブロモアセチル化ペプチド＞
FMOC化学法を用いて、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で、標準固相法によりペプチドを合成する。FMOC（フルオレニルメトキシカルボニル）で保護されたアミノ酸を、アミノ末端に順次加える。最終工程は、N-ブロモアセチルアミノカプロン酸の結合を包含する。保護基を除去し、ペプチドをトリフルオロ酢酸で樹脂から取り外して、Ｘを得、これを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２１８】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体、Ｃ＞
テトラチオールプラットフォームＢの約10mmol溶液（pH10の緩衝液中）に、ブロモアセチル化ペプチドＸのDMSO溶液の過剰量を加える。ペプチド複合体Ｃを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２１９】
（組合せ２：プラットフォームのアミン−ペプチドの活性カルボキシレート）
【０２２０】
【化３０】

【０２２１】
＜化合物Ｙ−活性カルボキシレートを有するペプチド＞
TFAに安定な保護基（カルボキシル基にはベンジルエステル、アミノ基にはCBZ）を用いて、Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で標準固相法によりペプチドを合成する。アミノ末端に、アミノ酸残基を順次加える。ペプチドをTFAにより樹脂から取り外すことにより、カルボキシ末端に１つの遊離カルボキシル基を有し、他の全てのカルボキシルおよびアミンがブロックされているペプチドを得る。保護されたペプチドＹを、逆相HPLCにより精製する。
【０２２２】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｄ＞
化合物Ｙ（0.3mmol）をDMF 1mLに溶解し、この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド0.3mmolおよびHOBT（ヒドロキシベンゾトリアゾール） 0.3mmolを加える。この溶液を、テトラアミノプラットフォーム３６ 0.025mmolのDMF（1mL）溶液に加える。反応が完了すると、DMFを減圧下で除去し、粗製の完全に保護された複合体を得る。この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体１グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H₂下において振とうし、そして脱保護された複合体Ｄを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２２３】
（組合せ３：プラットフォームのアミン−オリゴヌクレオチドのアルデヒド）
【０２２４】
【化３１】

【０２２５】
＜オリゴヌクレオチド−プラットフォーム複合体Ｅ＞
NaIO₄（200mM）溶液の500μLアリコート（100μmol）を、ACT改変(CA)₂₅ 1.0g（全長400mg、25μmol）のH₂O（19.5mL）溶液に、暗所で、0℃で加える。この混合物を0℃で40分間おき、EtOH 50mLを加えた。この混合物を-20℃で30分間おき、2000RPMで５分間遠心分離する。上澄みを捨て、残ったペレットを減圧下で乾燥する。このペレットを、H₂O 3.3mLに溶解し、得られた溶液に、4.3mg（0.005mmol）の３６を100mMホウ酸ナトリウム(pH8.0）2.0mLに溶かした溶液を加える。得られた溶液に、ピリジン−ボラン複合体の200mM溶液（MeOH溶液）の250μL（50μmol）を加え、この混合物を37℃で４日間おく。この複合体Ｅは、イオン交換クロマトグラフィーで精製し得る。
【０２２６】
（組合せ４：プラットフォームの活性カルボキシレート−リガンドのアミン）
【０２２７】
【化３２】

【０２２８】
＜化合物Ｆ−４つのカルボン酸基を有するプラットフォーム＞
無水コハク酸（1.0g、10mmol）を、３６ 861mg（1.0mmol）およびNaHCO₃ 252mg（3.0mmol）を1/1 ジオキサン/H₂O 20mLに溶かした溶液に加え、この混合物を室温で16時間攪拌する。混合物を1N HClで酸性化し、濃縮する。この濃縮物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｆを得る。
【０２２９】
＜化合物Ｇ−４つのN-スクシンイミジルエステル基を有するプラットフォーム＞
Ｆ 126mg（0.1mmol）およびN-スクシンイミド46mg（0.4mmol）の無水THF（5mL）溶液を調製する。混合物を0℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド103mg（0.5mmol）を加える。この混合物が室温になるまで、数時間攪拌する。濾過により固形物を除去し、濾液を濃縮してＧを得る。このＧは、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し得る。
【０２３０】
＜化合物Ｚ−アミノ基を有するペプチド＞
Wang(p-アルコキシベンジル)樹脂上で標準固相法によりペプチドを合成する。リジンε−アミンはCBZ基として保護する。FMOC化学法を用いて、アミノ末端に、アミノ酸残基を順次加える。加える最後の残基は、N-FMOC-アミノカプロン酸である。トリフルオロ酢酸で樹脂から切断した後、FMOC基をピペリジンにより脱離し、遊離アミンリンカーを有するペプチドを得る。このペプチドＺを、逆相HPLCにより精製する。
【０２３１】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｈ＞
Ｚ 0.05mmolおよびEt₃N 0.1mmolのDMF（1mL）溶液を調製する。この溶液に、Ｇ 16.5mg（0.01mmol）のDMF（1mL）溶液を加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。保護基を除去するために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H₂下において振とうし、脱保護された複合体Ｈを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２３２】
（組合せ５：プラットフォームのイソチオシアネート−リガンドのアミン）
【０２３３】
【化３３】

【０２３４】
＜化合物Ｉ−４つのイソチオシアネート基を有するプラットフォーム＞
チオホスゲン（381μL、575mg、5.0mmol）を、３６ 861mg（1.0mmol）のTHF（10mL）溶液に加え、この混合物を、室温で、TLCによって反応が完了したことが確認されるまで攪拌する。この混合物を、塩化メチレンと5％NaHCO₃溶液との間で分液抽出にかける。この抽出物をMgSO₄で乾燥し、濾過し、濃縮する。生成物Ｉをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０２３５】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｊ＞
Ｚ 0.05mmolおよびEt₃N 0.1mmolのDMF（1mL）溶液を調製する。この溶液に、Ｉ 10.3mg（0.01mmol）のDMF（1mL）溶液を加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。保護基を脱離させるために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H₂下において振とうし、脱保護された複合体Ｊを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２３６】
（組合せ６：プラットフォームのクロロホルメート−リガンドのアミン）
【０２３７】
【化３４】

【０２３８】
＜化合物Ｋ−４つのヒドロキシル基を有するプラットフォーム＞
トリエチレングリコールビス-クロロホルメート205μL（275mg、1mmol）のCH₂Cl₂（5mL）溶液を、ジエタノールアミン497μL（525mg、5mmol）およびEt₃N 696μL（506mg、5mmol）のCH₂Cl₂（5mL）溶液に、0℃で加える。この混合物を室温になるまで温め、TLCにより反応が完了したことが示されるまで、これを攪拌する。この混合物を濃縮し、生成物Ｋをシリカゲルクロマトグラフィーにより分離する。
【０２３９】
＜化合物Ｌ−クロロホルメート基を有するプラットフォーム＞
ピリジン（100μL）、次いでトリホスゲン1.19g（4mmol）を、Ｋ 412mg（1mmol）のCH₂Cl₂（20mL）溶液に加える。この混合物を、室温で20時間攪拌し、溶媒を減圧下でエバポレートして、化合物Ｌを得る。
【０２４０】
＜ペプチド−プラットフォーム複合体Ｍ＞
Ｚ 1mmolのピリジン（10mL）溶液を、Ｌ 132mg（0.2mmol）の1/1 THF/ピリジン（5mL）溶液に加える。この混合物を、反応が完了するまで攪拌する。溶媒を減圧下で除去する。保護基を脱離するために、この複合体をMeOHに溶解し、そしてこの溶液を複合体1グラム当り100mgの10％Pdカーボンと共にParr水素添加装置中に置く。混合物を60psi H₂下において振とうし、脱保護された複合体Ｍを調製用逆相HPLCにより精製する。
【０２４１】
（実施例４：２つの異なる生物学的分子を含有する複合体の合成）
１種類よりも多くの生物学的活性基をプラットフォーム分子に複合体化することが有用であり得る。本実施例は、２つのマレイミド基（チオール含有ペプチドと反応する）および２つの活性化エステル基（遊離アミンを含有する薬剤と反応する）を含有するプラットフォームの調製を記載している。得られる複合体は、スキーム２０に示されるように、２つのペプチドおよび２つの薬剤分子を含有する。
【０２４２】
＜ヘテロ活性結合手プラットフォーム分子ベンジル6-アミノカプロン酸トシル酸塩Ｋの調製＞
6-アミノカプロン酸32mmol、p-トルエンスルホン酸51mmol、およびベンジルアルコール40mmolの混合物のトルエン（60mL）溶液を、Dean-Starkトラップを用いて還流し、水を除去する。反応が完了すると、混合物を冷却し、生成物を沈澱させる。濾過により固形物を集め、EtOH/Et₂0から再結晶化し、化合物Ｋを得る。
【０２４３】
＜化合物Ｌ＞
ジシクロヘキシルカルボジイミド（２当量）を、１当量の化合物５ および２当量のN-ヒドロキシスクシンイミドのTHF溶液に加える。この混合物を４時間攪拌し、化合物Ｋを2.2当量で加える。TLCにより反応が完了したことが示されるまで、この混合物を攪拌する。この混合物を濾過し、濃縮する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０２４４】
＜化合物Ｍ＞
化合物ＬをCH₂Cl₂で希釈したトリフルオロ酢酸で処理する。反応が完了すると、混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ酢酸塩として化合物Ｍを得る。
【０２４５】
＜化合物Ｎ＞
化合物（N-tert-ブチルオキシカルボニル-2,2'-ビス-(N-カルボベンジルオキシ-6-アミノヘキサノアミドエチル)アミン）をCH₂Cl₂で希釈したトリフルオロ酢酸で処理する。反応が完了すると、混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ酢酸塩として化合物Ｎを得る。
【０２４６】
＜化合物Ｏ＞
トリエチレングリコールビス-クロロクロロホルメート3.2mmolを、化合物Ｍ 4mmolおよび化合物Ｎ 4mmolのピリジン（162mL）溶液に、20℃水浴中で加える。この混合物をTLCによって反応が完了したことが示されるまで攪拌し、減圧下で濃縮する。この濃縮物をCH₂Cl₂に溶解し、続けて1N HCl溶液、5％NaHCO₃溶液、および飽和NaCl溶液の順で洗浄する。CH₂Cl₂層をMgSO₄で乾燥し、濾過し、濃縮する。この濃縮物をEtOH 10mLに溶解し、1M NaOH 10mLを加える。TLCにより反応がさらに起こらないことが示されるまで、この混合物を数時間攪拌する。混合物を1N HClでpH1にまで酸性化し、CH₂Cl₂で抽出する。CH₂Cl₂層をMgSO₄で乾燥し、濾過し、濃縮する。生成物Ｏをシリカゲルクロマトグラフィーにより分離する。
【０２４７】
＜化合物Ｐ＞
化合物ＯをEtOHに溶解し、そしてParr振とう装置中でＯ １グラム当り100mgの10％Pdカーボンで水素添加する。TLCにより、反応の完了を確認する。反応が完了すると、濾過により触媒を除去し、そして混合物を濃縮して、化合物Ｐを得る。
【０２４８】
＜化合物Ｑ＞
N-メトキシカルボニルマレイミド3mmolを、化合物Ｐ 1mmolをジオキサン20mLおよび飽和NaHCO₃ 5mLに溶かした溶液に、0℃で加える。この混合物を１時間攪拌し、1N HClで酸性化し、CH₂Cl₂で抽出する。CH₂Cl₂層をMgSO₄で乾燥し、濾過し、濃縮し、そして生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｑを得る。
【０２４９】
＜化合物Ｒ＞
DCC 2mmolを、Ｑ 1mmolおよびp-ニトロフェノール2mmolのCH₂Cl₂溶液に加え、混合物を16時間攪拌する。濾過により固形物を除去し、濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製してＲを得る。
【０２５０】
＜２つのペプチドおよび２つの薬剤分子を有する複合体、化合物Ｓ＞
チオール含有ペプチド２当量余りを、ヘテロ活性化プラットフォームＲ １当量のpH7.5リン酸緩衝液溶液に加える。混合物を1時間攪拌し、アミン含有薬剤２当量余りを加える。この複合体Ｓを、逆相HPLCまたはイオン交換クロマトグラフィー、またはそれらの組合せにより単離する。
【０２５１】
【化３５】

【０２５２】
（実施例５：複合体３-IIの合成および試験）
【０２５３】
【化３６】

【０２５４】
＜DMTr-5'-改変(CA)₁₀の調製＞
ポリヌクレオチドd-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)₁₀]を、DNAホスホルアミダイト合成のための製造者のプロトコルに従い、Milligen 8800 Prep Scale DNA合成機で調製した（図６参照）。この合成は、30.0μmol/gでヌクレオシドをローディングした、10gのDMTr-d-bzA-CPG支持体上で行った。最後のDMTrブロック基を、機械的プロトコルを用いて除去した。Milligen活性化剤溶液（Cat.No.MBS5040）45mLおよび化合物５１（反応スキーム１１参照） 0.385gを反応系に加え、この懸濁液をアルゴン吹き込みにより８分間混合した。混合物を通常の機械プロトコルにより酸化し、支持体に結合したポリヌクレオチドを濾過により採集し、空気乾燥し、そして濃アンモニア100mLで16時間、55℃で処理した。温度が下がると、混合物をGelman 10μポリプロピレンフィルターを通して濾過した。NaOHでpH12に調整した2mM NaCl 200mLで、フィルターを洗浄した。次いで、濾液を、初めに3M NaClで、次いで2mM NaClでpH12に平衡化されたQ-Sepharose（Pharmacia）を充填したAmiconクロマトグラフィーカラム（0.45×9.4 cm、150mL）に通した。カラムを直線グラジエント（2mM NaCl、pH12から1.3M NaCl、pH12まで）500mLで溶出し、次いで全てのU.V.吸光物質が現れるまで1.3M NaCl（pH12）で洗浄した。260nm吸光画分をポリアクリルアミド電気泳動によりさらに分析し、純粋生成物を含有する画分をプールする。このプール（120mL）を冷イソプロパノール240mLで処理し、-20℃で30分間保持した。モデルH-6000Aローターを用いるSorvall RC 3B遠心分離器で、3000rpm、４℃で15分間遠心分離を行い、これにより沈澱物を採集し、DMTr-5'-改変(CA)₁₀（14946 A₂₆₀ ユニット、498mg、62.2μM、20%(300μM CPGヌクレオシドに基づく)）を得た。
【０２５５】
＜Tr-5'-改変(CA)₁₀の合成＞
【０２５６】
【化３７】

【０２５７】
Tr-5'-改変(CA)₁₀の合成を、化合物５１を化合物５３（反応スキーム11に記載のように調製）に置き換えることにより、DMTr-5'-改変(CA)₁₀の合成のための上記の記載と同様にして行った。
【０２５８】
＜DMTr-5'-改変ポリヌクレオチドと化合物３(IA-DABA-PEG、反応スキーム１)との複合体化−複合体３-Iの調製＞
以下に示す複合体化の手順において、用いられる全ての緩衝液および溶液に充分なヘリウムを吹き込み、全ての反応容器を使用前にアルゴンでパージした。DMTr-5'-改変(CA)₁₀の11,568 A₂₆₀ ユニット（48.2μmol、260nmでの推定モル吸光度＝240,000）の水（7.7mL）溶液を、0.1M NaHCO₃ 1mLおよびトリブチルホスフィン210μL（876μmol、18倍過剰モル）を用いて、室温で0.5時間処理した。この懸濁液をときどき振とうした。懸濁液を3M NaCl 0.8mLおよび冷イソプロパノール16mLで処理した。-20℃で30分おいた後、この物質を3000rpmで20分間遠心分離した。得られたペレットを水2mL、3M NaCl 0.2mLに再び溶解し、イソプロパノール4mLで処理し、再び遠心分離した。ペレットを減圧下で短時間乾燥し、ヘリウムを吹き込んだ水2.8mLおよび0.1N NaHCO₃ 1mL中に溶解した。化合物３(IA-DABA-PEG) 6.7mgを加え、この混合物を暗所に室温で16時間おいた。最終容量6mLの反応混合物を、Sephacryl 200（Pharmacia）を詰めた 5×91(1800Ml)Pharmaciaカラムに通した。カラムを0.5M NaCl、0.1Mホウ酸ナトリウム（pH8.3）で溶出した。ぜん動性のポンプを用い、流速が約2mL／分になるように設定し、15mlの画分を集めた。この画分の260nmでの吸光度を測定した。さらに、この画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、純粋な複合体を含む画分をプールした。
【０２５９】
＜複合体３-Iのハイブリダイゼーション−複合体３-IIの調製＞
上記プールした画分は726 A₂₆₀ユニットを含む画分であった。当量の(TG)₁₀を加え、チューブを90℃で10分間加熱し、次いで1.5時間かけて室温にまで冷却した。等量のイソプロパノールを加え、この混合物を-20℃で3時間おいた。3000rpmで20分間遠心分離した後、ペレットを0.15 M NaCl、0.01Mクエン酸ナトリウム（pH6.8）に溶解した。53mgのハイブリッドを得た。この物質の一部を上記緩衝液で希釈し、二重らせんの融解温度（Tm）をCarey 3E分光光度計で測定した。この物質は、そのTmが73.4℃であり、濃色性は24.3％であった。生成物の10 A₂₆₀ ユニットの部分を、上記に記載のように過剰の(TG)₁₀でアニールした。この物質と同様に非アニール複合体および(TG)₁₀標準物とを、Rainin HPLC装置を用いShodex Protein KW 8025カラムでゲルパーミエーションHPLCにより分析した。カラムを、0.05M NaH₂PO₄（pH6.5）、0.5M NaClでイソクラティックに溶出した。溶出時間は12分であった。生成物の保持時間は6.9分であり、(TG)₁₀は9.2分であった。ピーク面積の比較により、この生成物の98.09％が二本鎖DNAであることが示された。この複合体は、図６の「複合体３-II」を示す構造により表される。
【０２６０】
（実施例６：PN-KLH複合体の調製）
PN-KLH複合体を、以下に示すスキームによって調製した：
【０２６１】
【化３８】

【０２６２】
＜ACT-改変(CA)₂₅の合成＞
自動化合成の最終工程として、化合物５８を(CA)₂₅に結合した。30.0μmol/gでヌクレオシドをローディングした、10gのDMT-d-bzA-CPG支持体より出発して、49の逐次工程を、dCおよびdAのホスホロアミダイドを交互に用いて行った。得られたd-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)₂₅]からDMTrブロック基を除去し、そして活性化剤溶液（Milligen、Cat. No. MBS5040）40mLおよび化合物５８ 800mgを反応混合物に加えた。懸濁液をアルゴン吹き込みにより8分間混合し、そして通常の酸化工程を行った。支持体に結合したポリヌクレオチドを反応容器から取り出し、空気乾燥し、そして濃アンモニア100mLで40時間、55℃で処理した。温度が下がると、混合物をGelman 10μmポリプロピレンフィルターを通して濾過し、次いで、濾液を通常のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。260nmで吸光度を示す画分をポリアクリルアミド電気泳動によりさらに分析し、純粋な生成物を含有する画分を合わせて、イソプロパノールで沈澱させ、ACT-改変(CA)₂₅ 510mg（31.9μmol、10%）を得た。
【０２６３】
＜一本鎖PN-KLH複合体の合成＞
NaIO₄処理したACT-改変(CA)₂₅ 100mg（2.5μmol）を50mM ホウ酸ナトリウム（pH8.0） 1.33mLに溶かした溶液に、KLH 31.3mg（0.208μmol）およびピリジンーボラン 2.0mg（31.8μmol）を加えた。この混合物を37℃で72時間おき、生成物をS-200でのクロマトグラフィーにより精製した。
【０２６４】
＜一本鎖PN-KLH複合体の(TG)₂₅とのハイブリダイゼーション＞
当量の(TG)₂₅を、一本鎖PN-KLH複合体に加え、チューブを90℃で10分間加熱し、次いで1.5時間かけて室温にまで冷却した。イソプロピルアルコールで沈澱させ、53mgのPN-KLHを得た；Tm（0.15 M NaCl、0.01Mクエン酸ナトリウム、pH6.8）73.4℃、31.1％濃色性；過剰の(TG)₁₀でアニールしたサンプル、非アニール複合体、および非アニール(TG)₁₀からなる標準物質に対するHPLCでの比較により、98％が二本鎖であることが確認された（Shodex Protein KW 8025カラム、0.05M NaH₂PO₄、pH6.5、0.5M NaCl）。この複合体は以下の式で表し得
KLH-[NH(CH₂)₅OPO₂・O-(CA)₂₅:(TG)₂₅]_-5
（KLHの分子量は10⁵であると推定される）、「PN-KLH」と称される。
【０２６５】
＜免疫寛容原としての複合体３-IIの試験＞
複合体３-IIを、免疫原の形態のポリヌクレオチドにより免疫化したマウスに免疫寛容を起こさせる能力について試験した。
【０２６６】
＜材料および方法＞
マウス：C57BL/6の雌マウス（６週齢）をJackson Laboratories（Bar Harbor、ME）から購入した。マウスは、国立衛生研究所(NIH)の改良法により飼育した。 免疫処置：Iversonの方法（Handbook of Experimental Immunology、第２巻のCellular Immunology、（D.M. Weir、L.A. Herzenberg、C. Blackwell、およびA. Herzenberg編、第４版、Blackwell Scientific Publications、Oxford）中のAssay for in vivo Adoptive Immune Response）に従って、ミョウバン沈降させたPN-KLH 100μgと、アジュバントとしてホルマリン固定百日咳菌2×10⁹とを、マウスの腹腔内に注射することにより、マウスを初回免疫した。このマウスを、生理食塩水に溶かした50μgのPN-KLHでブーストした（腹腔内）。
【０２６７】
PNのSRBCへの結合：ヒツジ赤血球細胞(SRBC)のオルシーバー溶液をColorado Serum Co.（Denver、CO）から購入し、２週間以内に用いた。このSRBCを、KippおよびMillerの方法（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、 W.H. Freeman and Co.（San Francisco）、103ページの「タンパク質複合赤血球細胞のECDIを用いる調製（改変）」）により、(CA)₂₅：(TG)₂₅（CA:GTからなる50マー）で被覆した。簡単に言えば、SRBCを冷生理食塩水で４回洗浄し、カルボジイミド10mgを含む0.01M NaCl、0.35Mマンニトール中のD-EK結合(CA)₂₅：(TG)₂₅ 2mgと混合し、４℃で30分間インキュベートした。被覆SRBCを冷平衡塩類溶液で２回洗浄し、10％(v/v)に再懸濁した。
【０２６８】
プラークアッセイ：抗PNプラーク形成細胞(pfc)の数を、カニンガム法（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、W.H. Freeman and Co.（San Francisco）、86ページの、Marbrook, J.、「液体マトリックス（スライド法）」）を用いて測定した。IgG pfcの数を、Henryによる記載（Selected Methods in Cellular Immunology、(1980)、B.B.MishellおよびS.M. Shiigi編、 W.H. FreemanおよびCo.、San Francisco、91ページの「IgMプラークの除去によるIgG応答の評価」）に基づき、ウサギ抗マウスIgGを用いてIgMプラークを除去することにより測定した。簡単に言えば、脾臓を採取し、単細胞懸濁液を平衡塩類溶液(BSS)中で調製した。ギニアピッグ血清をポリヌクレオチド被覆SRBCに加えて、最終希釈物が1:9ギニアピッグ血清となるようにし、そして充分量のウサギ抗マウスIgGを加えて、最終希釈物が1:100ウサギ抗マウスIgGとなるようにした。SRBC混合物と希釈脾臓細胞とを、マイクロタイターウェル中で等量で混合し、カニンガムチャンバーに移した。各脾臓を個別に３回試験した。チャンバーの端をパラフィンで封じ、チャンバーを37℃で１時間インキュベートした。プラークの数を、倒立顕微鏡下でチャンバーを観察して数えた。
【０２６９】
＜結果＞
アジュバントとしての百日咳（A&P）と一緒にミョウバン沈降PN-KLHでマウスを初回免疫し、７週間後に各グループ３匹ずつに分けた。このマウスを、PN-DABA-PEG、すなわち複合体３−IIの２倍ずつ濃度を変化させた希釈液で処理し（腹腔内）、５日後コントロールを含めてすべてのマウスを、生理食塩水に入れたPN-KLH 50μgでブーストした（腹腔内）。４日後、脾臓を採取し、IgG pfcの数を測定した。表２に示されるように、複合体３-IIを投与した試験体は、pfcの数がコントロールグループに比較して顕著な減少を示した。
【０２７０】
上記と同様の条件により、複合体3-IIおよびD-EK結合(PN)₅₀を用いてマウスを処理し、Farrアッセイにより抗dsPN抗体を測定した。結果を図１４に示す。LJP-105(D-EK結合(PN)₅₀)に比べて、LJP-249AおよびLJP-249B（複合体3-II)は、抗dsPN抗体を減少させる効果が著しく高かった。
【０２７１】
【表２】

【０２７２】
（実施例７：複合体２０-IIの調製および試験）
＜5'-改変(CA)₁₀の結合手プラットフォーム分子２０への複合体化−一本鎖複合体２０-Iの調製＞
トリ-n-ブチルホスフィン969μL（789mg、3.89mol）を、5'-改変(CA)₁₀ 918mg（0.14mmol）のH₂O（30mL）溶液にアルゴンガス下で加えた。この混合物を１時間攪拌し、次いで3M NaCl溶液2.4mLを加え、次にヘリウムを吹き込んで酸素をパージしたイソプロパノール42mLを加えた。混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、次いで3000rpmで30分間遠心分離した。上澄みを除去し、油状の残留物を、ヘリウムを吹き込んだH₂O 15.5mLに溶解した。3M NaCl 1.24mLおよびヘリウムを吹き込んだイソプロパノール21.7mLを、混合物に加えた。次いで、得られた混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、3000rpmで20分間遠心分離した。得られた油状のペレットを減圧下で18時間乾燥して、固形物を得た。この固形物を、ヘリウムを吹き込んだH₂O 6mLに溶解し、全容量は6.4mLとなった。260nmでのUV吸光度測定により、DNA量は863mgであった（pH7.5食塩加リン酸緩衝液での、吸光単位当り0.333mg）。この溶液を、50mL三口フラスコにアルゴンガス下で移した。フラスコの１つの口をアルゴンガスの導入口とし、他の２つには栓をした。ヘリウムを吹き込んだ1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.8）0.87mLとMeOH 0.97mLとH₂Oとを加えて、全容量を7.7mLに調整した。化合物２０の17.7mg/mL MeOH溶液1.9mL（33.63mg、0.025mmol）を、混合物に加えた。得られた混合物を、アルゴンガス下で20時間攪拌し、次いで0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム（pH7.5）、および10％MeOHを含有する溶液で100mLに希釈した。精製は、Fractogel（登録商標）でのクロマトグラフィーにより行った（平衡：0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOH：溶離グラジエント 0.5M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHから0.8M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHまで）。HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により示される、純粋な複合体２０ -Iを含む画分を、232mLの溶離液中に集めた。等量のイソプロパノールを加え、これを冷凍機中に-20℃で１時間おくことにより、生成物および塩を沈澱させた。H₂Oに対して透析し（2×100 vol）、335mgの複合体２０ -I（濃度10.47mg/mLで32mL、0.033mg/吸光単位(260nm)）を得た。
【０２７３】
＜二本鎖複合体２０-IIを形成するための、複合体２０-Iと(TG)₁₀とのアニーリング＞
複合体２０ -I 150mg（0.033mg/吸光単位(260nm)に基づき、濃度10.47mg/mLで 14.33mL）および(TG)₁₀ 157.5mg（0.033mg/吸光単位(260nm)に基づき、104.6mg/mLで1.50mL）を、50mLポリプロピレン遠心管に入れた。pH7.2 10×PBSを2.0mLおよびH₂Oを2.17mL加えることにより、濃度を15mg/mLに調整した。混合物を、90℃湯浴中におき、そして1.5時間かけて室温にまで冷却した。濃度は、260nmの吸光度（0.050mg/吸光単位）により、17.7mg/mLであると確認された；転移融解温度 67.5℃；濃色性 27％；重量オスモル濃度 346；pH7.2であった。複合体２０ -IIの最終の処方のために、pH7.2 1/2 × PBSを7.23mL加え、0.22μフィルターを通して濾過することにより、溶液を最終濃度12.7mg/mLおよび重量オスモル濃度299に希釈した。
【０２７４】
＜5'-改変(CA)_10-20の別の複合体化、一本鎖複合体２０-Iの調製＞
10当量のトリ-n-ブチルホスフィンを、5'-改変(CA)₁₀をHe吹き込み100mM酢酸ナトリウム（pH5）に溶かした10mg/mL溶液に加える。この混合物を1時間攪拌し、次いで1.4倍量のイソプロピルアルコール(IPA)で沈澱させる。混合物を冷凍機中に-20℃で1時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離する。上澄みを除去し、ペレットを、ヘリウムを吹き込んだIPAに10mg/mLで溶解する。混合物を冷凍機中に-20℃で１時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離する。ペレットを減圧下で18時間乾燥し、固形物を得る。この固形物の50mg/mL溶液を、ヘリウムを吹き込んだ100mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10）中で調製する。9/1 MeOH/H₂O中の40mg/mL溶液として、0.25当量の化合物２０を、この混合物に加える。この混合物を室温で３〜20時間攪拌し、希釈する（0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム（pH7.5）、10％MeOH）。Factogelのクロマトグラフィーにより精製を行う。（平衡：0.1M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOH：溶離グラジエント 0.5M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHから0.8M NaCl、0.05M リン酸ナトリウム、pH7.5、10％MeOHまで）。HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により示される、純粋な複合体２０ -Iを含む画分を集めた。等量のIPAを加え、これを冷凍機中に-20℃で１時間おくことにより、生成物および塩を沈澱させる。H₂Oに対して透析し（2×10 vol）、複合体２０ -Iを得る。
【０２７５】
＜二本鎖複合体２０-IIを形成するための、２０-Iの(TG)_10-20による別のアニーリング＞
アニーリングを90℃で行う代わりに70℃で行ったこと以外は、上記方法と実質的に同一である。
【０２７６】
＜5'-改変(CA)_10-20のさらに別の複合体化、一本鎖複合体２０-Iの調製＞
トリ-n-ブチルホスフィン 4.8mLを、Ar吹き込み100mM酢酸ナトリウム（pH5）104mLに7.75gの5'-改変(CA)₁₀を溶かした溶液にN₂ガス下で加えた。この混合物を1時間攪拌し、次いでIPA 232.5mLで沈澱させた。混合物を冷凍機中に-20℃で1.5時間おき、次いで3000rpmで20分間遠心分離し、そして-20℃で24時間おいて凍らせた。上澄みを除去し、ペレットをヘリウム吹き込み0.3M NaCl溶液170mLに溶解した。混合物をAr吹き込みIPA 232mLで再び沈澱させた。次いで混合物を冷凍機中に-20℃で２時間おき、3000rpmで20分間遠心分離し、そして-20℃で11時間おいた。上澄みを除去し、ペレットを減圧下で12時間乾燥し、固形物を得た。この固形物の溶液を、Ar吹き込み100mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH10）110mL中で調製した。9/1 MeOH/H₂O（4.4mL）溶液として、406mgの化合物２０を、この混合物に加えた。この混合物を室温で２時間攪拌した。得られた混合物は、高圧イオンクロマトグラフィーにより62％の２０ -Iを含有していることが示された。このクロマトグラフィーは、Waters Gen Pak Fax カラム（100×4 mm）、60℃、直線グラジエント 65％Ａ／35％Ｂから18％Ａ／82％Ｂ；Ａ＝0.05M NaH₂PO₄、pH7.5 1mM EDTA、10％MeOH(v/v)；Ｂ＝0.05M NaH₂PO₄、pH7.5、1M NaCl、1mM EDTA、10％MeOH(v/v)で行い、２０-Iは19.5分で溶出した。
【０２７７】
＜複合体２０-IIおよび非複合体コントロールの試験＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループに、それぞれ種々の投与量の複合体２０-II、または4.5nM HAD-AHAB-TEG（誘導体化した結合手プラットフォーム分子、AHAB-TEGにリンカーHADを接続、図７参照）、または18nM（4×4.5）(CA)₁₀:(TG)₁₀、または4.5nM HAD-AHAB-TEGと18nM (CA)₁₀:(TG)₁₀との混合物を腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。各グループに注射してブーストし、血清を採集して、実施例６に記載のアッセイを行った。抗PN応答の減少（百分率で表示）を図４に示す。これらのマウスの抗KLH応答は普通であり、図２に示される抗KLH応答とは顕著に異なるものではなかった。本実施例の結果から、抗PN応答は、(i)結合手プラットフォーム分子のみ、(ii)PNのみ、または(iii)この２つの混合物によって影響されなかったことが明らかである。PNは、免疫寛容を誘導するためには、非免疫原の結合手プラットフォーム分子と結合されなければならない。
【０２７８】
＜複合体２０-IIがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループを、種々の投与量の複合体２０-IIで、それぞれ腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。 ５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。結果を表３に示す。この結果から、この複合体によって、PN特異性IgG産生細胞の数が減少したことが明らかである。
【０２７９】
【表３】

【０２８０】
（実施例８：複合体の免疫寛容原としての試験）
＜複合体１７-IIの免疫寛容原としての試験＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループに、種々の投与量の複合体１７-IIを、それぞれ腹腔内投与した；そして、１つのグループには処理を行わなかった。 ５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、７日後、このマウスの採血を行った。血清を、PN濃度10^-8MでFarrアッセイにより抗PN抗体について分析した。抗PN応答の減少（百分率表示）を図１に示す。また、この血清を、ELISAアッセイを用いて抗KLH抗体についても分析した。この結果を、抗KLH血清の標準プールに比較した抗KLHの百分率として表し、図２に示す。図１中のデータにより、この複合体が抗PN応答を低減したことが示される。これらのマウスはすべて、抗KLH（プラットフォーム分子）応答は普通であった（図２参照）。
【０２８１】
＜種々の11シリーズの複合体の免疫寛容原としての試験＞
C57BL/6マウス/グループのグループを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、２つのグループに対し、それぞれ３つの異なる投与量の複合体１１-IV、複合体１１-II、複合体１１-VI、または複合体１１-VIIIを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。 これらの複合体は、図６に記載されており、上記の実施例７の方法に従って調製した。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、７日後、このマウスの採血を行った。血清を、PN濃度10^-8MでFarrアッセイにより抗PN抗体について分析した。抗PN応答の減少（百分率表示）を図３に示す。これらのマウスの抗KLH応答は、図２に示される抗KLH応答と顕著に異なるものではなかった。４つの複合体は全て、試験した全ての投与量で、抗PN応答を顕著に減少させた。
【０２８２】
＜複合体１１-IIがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループに対し、種々の投与量の複合体１１-IIを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。種々の投与量の複合体１１-IIによる実験の結果を表４に示す。この結果から、この複合体により、PN特異性IgG産生細胞の数が減少し、そして抗体力価の減少は、複合体に結合した血清抗体のクリアランスによるものではないことが明らかである。
【０２８３】
【表４】

【０２８４】
（実施例９：HADpS-(CA)₁₀-複合体２０-IVの調製）
5'末端にリンカーを結合するホスホロチオエートを有する改変ポリヌクレオチドを調製した。20マーの(CA)₁₀の合成およびHADリンカーのポリヌクレオチドへの付加を、以下に記載することを除いて、実施例５の方法に従って行った。最終の酸化工程において、ヨウ素溶液を、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド（Glen Reseach, Sterling, VA）の0.05M アセトニトリル溶液に置き換えた。イオウ化処理は、製造者の指示に従って行った。アンモニア処理および精製は、実施例５と同様にして行った。ポリヌクレオチドのAHAB-TEG結合手プラットフォームへの複合体化は、実施例５の方法に従って行った。
【０２８５】
＜複合体２０-IVの免疫寛容原としての試験＞
PNの5'ホスフェートは酵素分解を受け易いので、末端ホスフェートの酸素分子のうち１つをイオウで置換した（従って、HAD_pSという名とする）。C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス５匹/グループのグループを、種々の投与量の複合体２０-IVで腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。グループにブースター注射を行い、血清を採集して、上記のアッセイを行った。抗PN応答の減少（百分率表示）を示す結果を図５に示す。これらのマウスの抗KLH応答（データは示さず）は普通であり、図２に示される抗KLH応答と顕著に異なるものではなかった。これらの結果は、この複合体が抗PN応答を顕著に減少させたことを示す。
【０２８６】
＜複合体２０-IVがPN特異性抗体産生細胞の数の減少をもたらすこと＞
C57BL/6マウスを、PN-KLHおよびA&Pで免疫化した。３週間後、マウス３匹/グループのグループに対し、種々の投与量の複合体２０-IVを腹腔内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたPN-KLHを腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、PN特異性のIgG産生細胞の数についてアッセイした。この結果を表５に示す。この結果から、この複合体により、PN特異性IgG産生細胞の数が減少したことが明らかである。
【０２８７】
【表５】

【０２８８】
（実施例10：LJP394、複合体２０−IIでのBXSBマウスの処理）
＜マウス処理プロトコル＞
６〜９週齢の雄BXSBマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me）をLa Jolla Pharmaceutical facilityで飼育した。食物および水は随意に与えた。実験に使用する前に、動物を１週間休ませた。最初の複合体処理を行う前に、初期の血液サンプルを得、そして初期体重を測定した。複合体の処理は７〜９週齢で開始し、59日から150日まで１週間に２回腹腔内投与を行った。動物の採血を定期的に行い、その抗DNA抗体力価を決定した。
【０２８９】
＜IgG抗DNA抗体産生に対するアッセイ＞
各マウスから得た血清サンプルを、抗DNA抗体の存在をELISAにより評価した。Falcon Probind 96ウェルマイクロタイトレーションアッセイプレート（Becton Dickerson, Oxnard, CA）を、50μg/mLの濃度の(PN)₅₀-D-EK（D-グルタミン酸およびD-リジンのコポリマー）100μL／ウェルで、４℃で一晩被覆した。このプレートを、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないPBSおよび0.05％Tween20（洗浄緩衝液）で、M96V plate washer（ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA）を用いて２回洗浄した。プレートを、１％ゼラチン（Norland Products, Inc, New Brunswick, NJ）を含有するPBSおよび0.05％Tween 20により、室温で1時間遮断した。血清サンプルまたは標準物を加える前に、プレートを洗浄緩衝液で２回洗浄した。血清サンプルおよび標準物を、１％ゼラチンを有するPBS、0.05％Tween 20、および10％ヤギ血清を含む希釈液として調製した。プレートを37℃で60〜90分間、血清サンプルを用いてインキュベートし、次いでウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。ビオチニル化ヤギ抗マウスIgG（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を、10％ヤギ血清を含む遮断溶液で1/1000に希釈した。プレートを37℃で１時間インキュベートし、４回洗浄した。基質となるOPD（Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)）を加えた。OD 450nmでのELISAプレートリーダーにより最も高い標準物の最高読み取り値が約１ ODユニットになるまで、プレートを暗所中でインキュベートした（Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）。反応を3M HCl 50μLで中断し、プレートを490nmで読み取った。各マイクロタイトレーションプレートにはリファレンスの陽性血清が含まれており、各アッセイからの陽性ウェルはこのリファレンスの時間曲線の95％範囲内の感度であった。後に採血した血液では、陽性サンプルのいくつかがリファレンスカーブを超過した。しかし、ほとんどの希釈マウス血清サンプルは、リファレンスカーブ範囲内にあった。正常のコントロール陰性血清による、顕著な結合は観察されなかった。結果を図１５に示す。
【０２９０】
（実施例11：メリチンペプチドおよび複合体の調製）
メリチン分子は、26のアミノ酸からなり、ミツバチ毒の主成分の１つである。ミツバチ毒感受性個体の３分の１は、メリチン特異性抗体を有する。メリチンは、数種のマウス系統（Balb/c、CAF1）では、高い免疫原性を有する。応答マウス系統のメリチン特異性抗体の多く（＞80％）は、メリチンのC末端の７つのペプチドであるＢ細胞エピトープに結合する。
【０２９１】
＜メリチン＞
【０２９２】
【表６】

【０２９３】
＜Ｔ細胞を刺激するメリチンペプチド＞
【０２９４】
【表７】

【０２９５】
＜ペプチド合成＞
メリチンペプチドは、グリシン樹脂（Advanced ChemTech #SG5130）あるいはその等価物（Advanced ChemTech、2500 Seventh Street Road、Louisville、KY）上で標準的なFmoc化学法により調製した。各結合工程では、2.3M過剰のアミノ酸誘導体を用いた。結合の完了は、ブロモフェノールブルーでモニターし、ニンヒドリンで確認した。
【０２９６】
＜複合体に用いられるメリチンペプチド＞
【０２９７】
【表８】

【０２９８】
ペプチドをチオエーテル結合により結合手プラットフォーム分子に結合させるために必要なので、システインを加えた。ペプチドを、合成後に逆相HPLCにより精製し、凍結乾燥により乾燥した。次いで、適度な量のペプチドを、各複合体化に対して秤量した。
【０２９９】
＜予め形成されたジスルフィド結合の還元(トリブチルホスフィン法)＞
全ての緩衝液にヘリウムを吹き込んだ。ペプチドを、最少容量（約10〜20mg/mL）の0.05M NaHCO₃（pH8.25）に溶解した。0.7Mトリブチルホスフィン（TBP；MW＝202.32g/モル；d - 0.812g/mL）の1mL溶液は、TBP 174.4μLをイソプロパノール(iPrOH) 825.6μLに加えることにより調製した。次いで、上記のように調製したペプチド溶液に、TBPを(1:1)の当量で加え、充分に混合し、次いで時々攪拌してTBPを溶液中に溶解および／または分散させながら、30分から1時間反応させた。HPLCにより、還元が完了したことを確認した。
【０３００】
＜結合手プラットフォーム分子＃３または＃６０へのペプチドの複合体化＞
全ての緩衝液にヘリウムを吹き込んだ。ポリエチレングリコール(PEG)誘導体＃３または＃６０を、最少容量（約20mg/mL）の0.05M NaHCO₃（pH8.25）に溶解した。PEG誘導体のヨードアセチル基当り、約3当量のペプチドを用いた。p-アミノ安息香酸(PABA) -PEG（ヨードアセチル基２個；MW＝約4100g/モル）では、PABA-PEG各当量について６当量のペプチドを用いた。ジアミノ安息香酸(DABA) -PEG（ヨードアセチル基４個；MW＝約4300g/モル）では、DABA-PEG各当量について12当量のペプチドを用いた。還元したペプチド溶液にPEG溶液を加え、暗所で少なくとも1時間反応させた。ペプチド複合体を調製用HPLCで精製した。プールおよび凍結乾燥を行う前に、15％トリシンゲルを用いる電気泳動により画分を確認した。
【０３０１】
【表９】

【０３０２】
＜マウスリンパ節増殖アッセイ＞
雌のBalb/cマウス（６〜８週齢；Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine）を得て、La Jolla Pharmaceutical animal facilityで、国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育した。食物および水は随意に与えた。Balb/cマウスを、完全フロイントアジュバント(CFA)（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）に入れたメリチン50μgで、各後ろ足の裏に免疫処置した。7日後、膝窩リンパ節を無菌状態で採取した。50メッシュふるいスクリーンを通して細胞を細かくすることにより、リンパ節を穏やかに分離した。単細胞懸濁物を、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むRPMI-1640（Irvine Scientific、Irvine、CA）中で洗浄した。丸底96ウェルCorningマイクロタイトレーションプレートの４つ組のウェル中で、10％ウシ胎児血清を補充したRPMI培地において、5×10⁵個の細胞を、10、1.0、または0.1μg/mLの、メリチンまたはメリチンペプチドで培養した。陽性コントロールウェルにおける細胞を、100または50 U/mLのマウスインターロイキン２(IL-2)、1μg/mLのPHA（フィトヘマグルチニン）で培養した。陰性コントロールウェルは、RPM-1640および10％FCS中にリンパ節細胞を有した。細胞を、5％CO₂の37℃インキュベーター中で、4日間培養した。各ウェルを、1μCiの[³H]チミジン（ICN Biochemicals、Costa Mesa、CA）で、さらに18時間パルスした。半自動式細胞捕集器（Scatron、Sterling、VA）により、グラスファイバーフィルターマット上に、細胞を集めた。[³H]チミジンの取り込みを、液体シンチレーションにより測定した。結果は、1分間当りの平均カウントで表した。
【０３０３】
＜インビボプロトコル＞
Balb/cマウスを、CFA中のメリチン4μgを腹腔内に投与することにより、初回免疫した。１カ月後、潜在免疫寛容原または調合緩衝液を腹腔内投与した。3日後、全てのマウスに対して、不完全フロイントアジュバント(ICF)（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO）に入れたメリチン4μgの腹腔内注射を行った。10日後に、100〜200μLの血液を、後眼窩静脈叢から採集した。血清サンプルを、抗ペプチドまたは抗メリチンIgG抗体についてアッセイした。
【０３０４】
＜IgG抗メリチンまたは全抗メリチン抗体に対するアッセイ＞
個々のマウスの血清サンプルについて、連続して、抗メリチン抗体の存在についてELISAにより評価した。Falcon Probind 96ウェルマイクロタイトレーションプレートを、食塩加リン酸緩衝液(PBS)（pH7.2）に入れたメリチンまたはメリチンペプチド10μg/mLにより、４℃で一晩、予備被覆した。このプレートを、PBS、0.02％Tween-20、および１％ゼラチン（Norland Products Inc., New Brunswick、NJ）を含有する洗浄溶液で２回洗浄した。プレートを、５％ゼラチンを含有するPBS 200μLにより、37℃で１時間遮断した。血清サンプルを、５％ゼラチンを含有するPBSの希釈液として調製した。サンプルを、1:100から1:1000に希釈して試験した。37℃で１時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄した。エキストラアビジンパーオキシダーゼ（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）を、５％ゼラチンを含有するPBSで1:1000で希釈した。このプレートを、37℃で１時間インキュベートし、次いで５回洗浄した。ウェルをο-フェニレンジアミン(OPD)（Sigma Chemical Co.、St Louis、MO）により、暗所で15〜30分間展開させ、反応を3M HClで中断した。光学濃度(OD)を、マイクロプレートリーダー（Bio-tek Instrument、Winooski、VT）上で450nmで測定した。
【０３０５】
＜抗体産生細胞アッセイ＞
セルロースマイクロタイトレーションプレート（Millipore Co.、Bedford、MA）を、IgG抗体(ELISA)アッセイについて上記で示したように調製した。しかし、上記IgG抗体アッセイで血清サンプルをウェルに加える時点で、脾臓細胞（5×10⁵/ウェル）を血清の代わりに加え、一晩インキュベートした。ELISAアッセイの残りの工程は、上記と同様にして行った。
【０３０６】
＜Ｔ細胞エピトープ＞
メリチンで感作したマウスから得たＴ細胞は、全メリチン分子およびC末端メリチンペプチド３、４、および５に応答して、Ｔ細胞増殖を示した（図８）。しかし、C末端ペプチド１および２は、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。メリチンペプチド２および５をPEGに複合体化した。メリチンペプチド２と同様に、メリチンペプチド２のPEG複合体もまた、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。
【０３０７】
＜メリチンで初回免疫しブーストしたマウスを免疫寛容にするメリチン複合体化ペプチドによる実験＞
上記の複合体（10mg/kg、200μg/マウス）で処理したマウスは、調合緩衝液で処理したコントロールBalb/cマウスに比較して、顕著に低いレベルの抗メリチンペプチド２抗体を有し（図９）、また低いレベルの抗メリチン抗体を有していた（図１０）。緩衝液コントロールまたは上記の複合体で処理したマウス由来の脾臓細胞を、抗メリチン抗体または抗メリチンペプチド２抗体を産生する抗体産生細胞の能力について、可溶性ELISAアッセイでの測定によりアッセイした。図１１に示すように、複合体で処理したグループにおける抗メリチンペプチド２抗体産生細胞のレベルは、調合緩衝液を投与したコントロールグループにおけるレベルよりも、顕著に低い値であった。複合体４（Ｔ細胞エピトープを含むペプチド５の複合体）で処理したマウスは、処理マウスにおいてペプチド５に対する抗体の力価を低下させなかった。従って、Ｔ細胞エピトープを含む複合体は、免疫寛容原ではない（図１２）。事実、応答を低下させるよりもむしろ、抗ペプチド抗体のレベルはわずかに上昇し得る。
【０３０８】
（実施例12：メリチンで初回免疫しブーストしたマウスを免疫寛容にするメリチンペプチド複合体によるさらなる実験）
雌のC57BL/6マウス（５〜８週齢）をThe Jackson Laboratory、Bar Harbor、MEから購入した。国立衛生研究所のガイドラインに従って、動物を維持し、取り扱った。
【０３０９】
＜免疫処置プロトコル＞
ミョウバン沈降メリチン5μgおよびアジュバントとして百日咳菌(B. pertussis)（Michigan Department of Public Health、Lansing、MI）2×10⁹を、マウスに腹腔内注射した。このマウスに対し、PBSに入れたメリチン5μgを腹腔内投与してブーストした。
【０３１０】
＜pfcアッセイ＞
ヒツジ赤血球細胞(SRBC)（Colorado Serum Co.、Denver、Colorado）を、カルボジイミドを用いてメリチンペプチド２と複合体化した。新鮮SRBC（2週齢未満）を、冷生理食塩水で4回およびマンニトール（0.35M マンニトール、0.01M NaCl）で１回洗浄した。このSRBCを、10％(v/v)濃度となるようにマンニトール中に懸濁した。メリチンペプチド＃３ 30μgを含有するマンニトール 100μLを、10％SRBCの1mLアリコートに加え、次いでこれを氷中で10分間インキュベートした。次いで、1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド HCl (EDCI)の100mg/mL溶液 100μLを加えて、氷中で30分間インキュベートした。SRBCを平衡塩類溶液(BSS)（Irvine Scientific Co., Irvine、CA）で２回洗浄し、10％(v/v)になるように再懸濁した。凍結乾燥ギニアピッグ補体（GIBCO、New York、NY）をBSSで再構成し、次いでBSSで1:3に希釈した。希釈ギニアピッグ補体 1mLを複合体化SRBC 3mLに加えた。ウサギ抗マウスIgGを加え、ウサギ抗血清の1:100の最終希釈液を得た。この濃度は、IgG pfcの最大数を増加させる一方、全てのIgG pfcを阻害するように予め決定した。この補体／抗マウスIgG／SRBC溶液と、１匹のマウスから採取したマウス脾臓細胞の細胞懸濁液とを、等量で混合した。混合物を各50μLずつ、カニンガムスライドのチャンバー（スライド当り３チャンバー）に移した。次いで、端をパラフィンで封じ、37℃で１時間インキュベートした。チャンバー当りのプラークの数を、解剖顕微鏡を用いて数えた。コントロールとして非複合体化SRBCを用いた、各脾臓懸濁液のアッセイを行った。生細胞の数を、各脾臓細胞懸濁液において測定した。脾臓細胞10⁶個当りのpfcの数を各チャンバーについて測定し、３つ組の平均を算出した。非複合体化SRBCでのpfc数を複合体化SRBCでのpfc数から引いて、ペプチド特異性pfcの数を測定した。
【０３１１】
＜pfc測定のための最適時間の決定＞
マウスをメリチンで初回免疫した。感作マウスのグループ（グループ当りマウス３匹）を、２、４、６、および８日目にメリチンでブーストした。10日目に、マウスを殺し、それらの脾臓を採取した。細胞懸濁液を調製し、ペプチド特異性pfcの数の測定のためにアッセイした。pfcの最適数は、６日後メリチンブーストで得られた。
【０３１２】
＜PEG複合体でのペプチドの方向が免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響しないこと＞
PEG複合体のペプチド方向が、免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響するかどうかを決定するために、２つの異なる免疫寛容原を構成した。ペプチドを、そのC末端を通じて、結合手プラットフォーム分子３に共有結合させ、メリチン複合体３を生成した。メリチンで初回免疫したマウスのグループ（３／グループ）を、異なる複合体または生理食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロールマウスを含めた全てのマウスを、メリチン5μgでブーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を採取し、ペプチド特異性pfcの数を測定した。表１０に示すように、両方向共に、親タンパク質メリチンで初回免疫しブーストしたマウスにおいて、ペプチド特異性pfc／10⁶脾臓細胞の数を減少させる効果があった。
【０３１３】
【表１０】

【０３１４】
＜PEG複合体当りのペプチド数が免疫寛容を誘導する複合体の能力に影響すること＞
PEG分子に対してのペプチドの比率が重要であるかどうかを決定するために、３つの異なる複合体（PEG複合体当りのペプチド数がそれぞれ異なる）を構成した。複合体１は、PEG複合体当り２個のペプチドのみを有した。別の複合体は、PEG複合体当り４個のペプチドを有した（複合体２）。３番目の複合体は、PEG複合体当り８個のペプチドを有した（複合体５）。メリチンで初回免疫したマウスのグループ（３／グループ）を、複合体または生理食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロールマウスを含めた全てのマウスを、メリチン5μgでブーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を採取し、ペプチド特異性pfcの数を測定した。表１１に示すように、複合体１（PEG分子当り２個のペプチドを含む）は、親タンパク質メリチンで初回免疫しブーストしたマウスにおいて、ペプチド特異性pfc／10⁶脾臓細胞の数を減少させるのに有効ではなかった。この結果は、メリチン複合体２および５は、ともに免疫寛容原として有効であったことをしめす。しかし、複合体５（８個のペプチドを含む）は、複合体２（結合手プラットフォーム分子当り４個のペプチドを含む）よりも少ない投与量で有効であった。
【０３１５】
【表１１】

【０３１６】
以上に記載されたように、本発明は、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子、ならびに、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子および生物学的または化学的分子を含む複合体を提供する。生物学的分子としては、ヒト狼瘡の抗dsDNA自己抗体に対して著しい結合活性を有する、少なくとも20塩基対からなるポリヌクレオチド二本鎖が含まれる。
【０３１７】
ポリヌクレオチド化学、複合体化学、免疫学、および関連分野の当業者に明らかである、本発明の実施のための上記態様の改変は、添付した特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０３１８】
【配列表】
【０３１９】
【配列番号：１】

【０３２０】
【配列番号：２】

【０３２１】
【配列番号：３】

【０３２２】
【配列番号：４】

【０３２３】
【配列番号：５】

【０３２４】
【配列番号：６】

【０３２５】
【配列番号：７】

【０３２６】
【配列番号：８】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)₂₀-BAHA]-EDDA(複合体17-II)で処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。3つの希釈系列の血清を、10^-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験し、そしてデータは抗-PN抗体の減少百分率で表した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図２】図２は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)₂₀-BAHA]-EDDA(複合体17-II)で処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-KLH応答を示している。抗-KLH抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で調べた。結果を、抗血清の標準プールの百分率で表した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図３】図３は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の[(PN)₁₆-BAHA_OX]-EDDA(複合体11-IV)、[(PN)₂₀-BAHA_OX]-EDDA(複合体11-II)、[(PN)₂₄-BAHA_OX]-EDDA(複合体11-VI)、あるいは[(PN)₃₂-BAHA_OX]-EDDA(複合体11-VIII)の何れかで処理し、PN-KLHのブースター注射を行い、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10^-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図４】図４は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の(PN)₂₀-HAD_p-AHAB-TEG(複合体20-II)で、あるいはHAD-AHABのみで、あるいはPNのみまたは各々の混合物で、処理し、次いでPN-KLHでブースターし、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10^-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。減少率百分率を計算し、このデータを示した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図５】図５は、PN-KLHで初回免疫し、図に示した投与量の(PN)₂₀-HAD_pS-AHAB-TEG(複合体20-IV)で処理し、次いでPN-KLHでブースターし、そして5日後に採血したマウスの、抗-PN応答を示している。血清を、10^-8 Mで放射標識したPNを用いたFarrアッセイで試験した。1グループには、5匹のマウスを用いた。
【図６】図６は、複合体3-I、3-II、11-I、11-II、11-IV、11-VI、11-VIII、17-I、17-II、20-I、20-II、20-III、および20-IVのための、誘導体化した結合手プラットフォーム分子、および、ポリヌクレオチドを該結合手プラットフォーム分子と結合するリンカーの構造を示している。
【図７】図７は、誘導体化した結合手プラットフォーム分子「HAD-AHAB-TEG」の構造を示している。
【図８】図８はメリチンペプチド類で誘起したT細胞増殖のレベルを比較している。
【図９】図９は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで産生された、抗-(メリチンペプチド2)抗体のレベルを比較している。
【図１０】図１０は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで産生された、抗-(メリチン)抗体のレベルを比較している。
【図１１】図１１は、メリチンペプチド複合体で処理したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中との、抗-(メリチンペプチド2)抗体-産生細胞のレベルを比較している。
【図１２】図１２は、T細胞エピトープを含むペプチド#5の複合体であるメリチンペプチド複合体4が、免疫寛容原ではないことを図示している。
【図１３】図１３は、本発明に含まれるメリチン複合体を図示している。
【図１４】図１４は、本発明の複合体(LJP-249AおよびLJP-249B(複合体3-II))で達成された、抗-dsPN抗体の減少百分率の増加と、D-EKおよびポリヌクレオチド(PN)₅₀を含む従来技術の複合体(LJP-105)でのそれとの比較を図示している。
【図１５】図１５は、本発明の複合体LJP-394、複合体20-IIで処理した雄のBXSBマウスの循環血清中の抗-DNA IgG抗体の抑制を示している。ELISAアッセイで、D-EKに結合させた(PN)₅₀に対するIgG抗体を測定した。各グループの各8個体のマウスからの血清を個々にアッセイした。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to biological or chemical molecules such as polynucleotides used to treat diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE, also referred to herein simply as “lupus”), an autoimmune disease. It relates to a complex comprising a chemically defined non-polymeric bond platform molecule that is coupled. The present invention also relates to chemically defined non-polymeric bond platform molecules themselves.
[0002]
[Prior art]
A number of compounds have been used in the preparation of conjugates that are tolerated as biologically useful molecular carriers. For example, Benacerraf, Katz, and their collaborators,D-GL ", which isD-EK "D-Glutamic acid /D-Research and publication of the induction of specific immune tolerance using random copolymers of lysine and haptens and various antigens. See U.S. Pat. No. 4,191,668 and U.S. Pat. No. 4,220,565.
[0003]
Other researchers are studying complexes of nucleosides or DNA with other carriers. Borel et al. (Science (1973)182: 76) evaluates the ability of syngeneic mouse IgG-nucleoside complexes to reduce antibody responses to denatured DNA in young mice of the NZB strain. In another independent study, Parker et al. (J. Immunol. (1974)113: 292) Poly-D-The effect of denatured DNA complexed with lysine and / or cyclophosphamide on the progression of the above symptoms in NZB mice was evaluated.
[0004]
In a later report, Borel et al. (Ann. NY Acad. Sci. (1986)475: 296-306) describes an oligonucleotide-immunoglobulin complex. Borel et al. (J. Clin. Invest. (1988)82: 1901-1907, and U.S. Pat.No. 4,650,675) used a complex of human immunoglobulin conjugated to DNA.in in vitroThe research in is described. Dintzis et al. US Pat. No. 5,126,131 also relates to a complex comprising a carrier and a molecule involved in the immune response.
[0005]
Other references describe complexes between non-immune polymers and immunogens. (Saiki et al.Scand. J. Immun. (1982)16: 191-200; Sehon,Prog. Allergy (1982)32: 161-202; Wilkinson et al.J. Immunol. (1987) 139: 326-331; Borel et al.,J. Immunol. Methods (1990)126See: 159-168. )
In our US Patent Application No. 07 / 914,869, US Patent No. 5,162,515, and US Patent Application No. 07 / 652,658,DA complex comprising a polymeric carrier such as -EK, polyethylene glycol, poly-D-lysine, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone and the like and an immunoglobulin is described.
[0006]
To summarize the above prior art, the present inventors have found that compounds with unclear definitions or compounds having many non-specific binding sites are only used as the binding platform molecules of the complex. Think. Because the bond, the position of the binding site, and the number of binding sites of such compounds are unpredictable and fluctuate greatly, prior art complexes made of such compounds can be produced reproducibly. And the reported activity shows a wide variation range.
[0007]
SUMMARY OF THE INVENTION
In contrast to the prior art described above, the present inventors have developed a complex comprising a chemically defined non-polymeric bond platform molecule. The valence of the platform molecule is predetermined and each binding site can be used for binding biological or chemical molecules. The bond platform molecules of the present invention are defined in chemical structure, valence, homogeneity, and have defined functional groups for efficient binding with appropriate biological and / or chemical molecules. Yes.
[0008]
Accordingly, the present invention in one aspect relates to a chemically defined non-polymeric bond platform molecule and a complex comprising a biological and / or chemical molecule. Examples of biological and / or chemical molecules suitable for attachment to chemically defined non-polymeric bond platform molecules to form the complexes of the invention include carbohydrates, drugs, lipids, Lipopolysaccharides, peptides, proteins, glycoproteins, single-stranded or double-stranded oligonucleotides and their chemical analogs, immunogen analogs, haptens, mimotopes, aptamers, and the like. Chemically defined non-polymeric bond platform molecules suitable for use in the present invention include, but are not limited to, biocompatible, non-antigenic carbon-based compounds of the formula Derivatives thereof.
[0009]
[Chemical 8]

[0010]
Or
[0011]
[Chemical 9]

[0012]
However, if present, G^[1]And G^[2]Each independently contains 1 to 2000, more preferably 1 to 1000 chain atoms selected from the group consisting of C, N, O, Si, P and S, in a straight chain, branched or plural A branched chain.
[0013]
More preferably, if present, G^[2]Is a group derived from polyalcohol, polyamine, or polyglycol, most preferably G^[2]-(CH with q from 0 to 20₂)_q-, -CH from 0 to 300₂(CH₂OCH₂)_rCH₂-And C (CH with s of 1 to 4, more preferably s of 3 to 4₂0CH₂CH₂-)_s(OH)_4-sSelected from the group consisting of
[0014]
T^[1]N shown as^[1]Pieces and T^[2]Indicated as p^[2]Xn^[2]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) NHNHR^SUB(Hydrazide), -NHNHR^SUB(Hydrazine), -C (= O) OH (carboxylic acid), -C (= O) OR^ESTER(Active ester), -C (= O) OC (= O) R^B(Anhydride), -C (= O) X (acid halide), -S (= O)₂X (sulfonyl halide), -C (= NR^SUB) OR^SUB(Imidate ester), -NCO (isocyanate), -NCS (isothiocyanate), -OC (= O) X (haloformate), -C (= O) OC (= NR^SUB) NHR^SUB(Carbodiimide adduct), -C (= O) H (aldehyde), -C (= O) R^B(Ketone), -SH (sulfhydryl or thiol), -OH (alcohol), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), -R^ALKX (alkyl halide), -S (= O)₂OR^ALKX (alkyl sulfonate), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide), -C (= O) CR^B= CR^B ₂(α, β-unsaturated carbonyl), -R^ALK-Hg-X (alkylmercury) and -S (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated sulfone).
[0015]
More preferably, T^[1]N shown as^[1]Pieces and T^[2]Indicated as p^[2]Xn^[2]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), -R^ALKX (alkyl halide), -S (= O)₂OR^ALKX (alkyl sulfonate), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide), -C (= O) CR^B= CR^B ₂(α, β-unsaturated carbonyl), -R^ALK-Hg-X (alkylmercury) and -S (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated sulfone).
[0016]
Even more preferably, T^[1]N shown as^[1]Pieces and T^[2]Indicated as p^[2]Xn^[2]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide) and -C (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated carbonyl).
[0017]
Most preferably, T^[1]N shown as^[1]All parts and T^[2]Indicated as p^[2]Xn^[2]All of the parts are the same.
[0018]
In the formula,
Each X is independently a halogen with an atomic number greater than 16 and less than 54 (Cl = 17, Br = 35, I = 53), or other good leaving group (ie, behaves like a halogen in this situation) , Weak bases such as alkyl or alkyl-substituted sulfonates or sulfates, aryl or aryl-substituted sulfonates or sulfates, and the like.
[0019]
Each R^ALKIs independently a linear, branched, or cyclic (1-20C) alkyl group.
[0020]
Each R^SUBIs independently H, linear, branched, or cyclic (1-20C) alkyl, (6-20C) aryl, or (7-30C) alkylaryl.
[0021]
Each R^ESTERIs independently N-succinimidyl, p-nitrophenyl, pentafluorophenyl, tetrafluorophenyl, pentachlorophenyl, 2,4,5-trichlorophenyl, 2,4-dinitrophenyl, cyanomethyl, or 5-chloro- Other activating groups such as 8-quinolone-1-yl, 1-piperidyl, N-benzotriazolyl and the like.
[0022]
Each R^BIs independently a group containing 1-50 atoms selected from the group consisting of C, H, N, O, Si, P and S.
[0023]
L if present^[2]N indicated by^[2]Each part is independently O, NR^SUBAnd S are selected.
[0024]
J if present^[2]N indicated by^[2]Each of the portions is independently selected from the group consisting of C (= O) and C (= S).
[0025]
n^[1]Is from 1 to 32, more preferably n^[1]Is from 2 to 16, more preferably n^[1]Is 2 to 8, most preferably n^[1]Is 2 to 4.
[0026]
n^[2]× p^[2]If the product of is greater than 1 and less than 33,
n^[2]Is from 1 to 32, more preferably n^[2]Is 1 to 16, more preferably n^[2]Is 1 to 8, even more preferably n^[2]Is 1 to 4, most preferably n^[2]Is 1 to 2;
p^[2]Is 1 to 8, more preferably p^[2]Is 1 to 4, most preferably p^[2]Is 1 to 2.
[0027]
Z^[2]N indicated by^[2]Each part is independently at least p^[2]1-200 selected from the group consisting of C, H, N, O, Si, P, and S, containing a binding site for one functional group on an alkyl, alkenyl, or aromatic carbon atom Is a group containing the atoms of
[0028]
More preferably, Z^[2]N shown as^[2]All of the parts are the same.
[0029]
More preferably, Z^[2]N shown as^[2]Each of the parts is independently described by a formula selected from the following group:
[0030]
[Chemical Formula 10]

[0031]
Embedded image

[0032]
Or
[0033]
Embedded image

[0034]
However, if present, W^[3], W^[Four]Or W^[Five]N shown as^[2]Each of the moieties is independently a group containing 1-100 atoms selected from the group consisting of C, H, N, O, Si, P and S.
[0035]
Y^[3]N shown as^[2]Pieces, Y^[Four]Shown as 2 × n^[2]Pieces, and Y^[Five]Shown as 2 × n^[2]Each part is independently at least p^[2]Functional groups (Y^[3]) Or p^[2]/ 2 functional groups (Y^[Four]And Y^[Five]Where p^[2]Selected from the group consisting of C, H, N, O, Si, P, and S, containing the binding site for (/ 2 is an integer) on an alkyl, alkenyl, or aromatic carbon atom A group containing 1-100 atoms.
[0036]
More preferably, if present, W^[3]N shown as^[2]Each of the moieties is independently, r is 1 to 10, (CH₂)_r, (CH₂CH₂O)_r, NR^SUB(CH₂CH₂O)_rCH₂CH₂, And NR^SUB(CH₂)_rNR^SUBC (= O).
[0037]
More preferably, Y^[3]N indicated by^[2]Each of the moieties is independently a linear, branched, or cyclic (1-20C) alkyl, (6-20C) aryl, or (7-30C) alkylaryl.
[0038]
Most preferably, Y^[3]N indicated by^[2]Each piece is independently C₆H_Four(1,4-disubstituted phenyl), C₆H_Three(1,3,5, -trisubstituted phenyl), and r is 1 to 10 (CH₂)_rSelected from the group consisting of
[0039]
More preferably, if present, W^[Four]N shown as^[2]Each of the moieties is independently, r is 1 to 10, (CH₂)_rC (= O), and (CH₂)_rNR^SUBSelected from the group consisting of C (= O).
[0040]
More preferably, Y^[Four]Shown as 2 × n^[2]Each of the moieties is independently r from 1 to 10, more preferably r from 2 to 6, q from 1 to 10, more preferably q from 1 to 3,₂)_r, (CH₂)_rNR^SUBC (= O) (CH₂)_q, (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_q, (CH₂)_rNR^{SU B}C (= O) (CH₂)_qNR^SUBC (= O) (CH₂)_r, (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_qNR^SUBC (= O) (CH₂)_r, (CH₂)_rNR^SUBC (= O) (CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂, And (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂Selected from the group consisting of
[0041]
More preferably, if present, W^[Five]N indicated by^[2]Each of the moieties is independently, r is 1 to 10, (CH₂)_rC (= O) NR^SUB, And (CH₂)_rNR^SUBC (= O) NR^SUBSelected from the group consisting of
[0042]
More preferably, Y^[Five]2 × n indicated by^[2]Each of the moieties is independently, r is 1 to 10 and q is 1 to 10,₂)_r, And (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_qSelected from the group consisting of
[0043]
In another preferred embodiment for treating lupus, the complex is a chemically defined non-polymeric bond platform molecule, and each binds to the platform molecule and human SLE anti-dsDNA. A plurality of at least about 20 base pair polynucleotide duplexes having significant binding activity to autoantibodies. In these preferred embodiments, the polynucleotide duplex is substantially uniform in length and one of the duplexes is either directly or via a linker molecule. It is bound to the bond platform molecule. In general, a synthetic polynucleotide is attached to a linker molecule and then attached to a bond platform molecule. Generally, the chain containing the linker in the duplex is attached at one end or at one end so that a pendant chain of at least about 20 base pairs is formed on each chain from the position where the linker molecule is attached in the chain. Bind in the vicinity (ie within about 5 base pairs). The second strand is then annealed to the first strand to form a duplex. Thus, the complex of the present invention can be generally described by the following formula:
[(PN)_n-Linker]_m-Bonded hand platform molecules
Where n is at least about 20, m is 2-8, and PN is a double-stranded polynucleotide having n nucleotides.
[0044]
Examples of linker molecules suitable for the present invention include 6 carbon thiols such as HAD, which is a thio-6 carbon chain phosphate, and HAD, which is a thio-6 carbon chain phosphorothioate._pS. The chemically defined bond platform molecules of the present invention include, for example, amino-modified PEG and 3,5-bis- (iodoacetamido) benzoyl chloride (hereinafter referred to as “IA-DABA chloride”). 3-carboxypropionamide-N, N-bis-[(6′-N′-carbobenzyloxyaminohexyl) acetamide] 4 ”-nitrophenyl ester (hereinafter referred to as“ BAHA ”); Carboxypropionamide-N, N-bis-[(8′-N′-carbobenzyloxyamino-3 ′, 6 ′,-dioxaoctyl) acetamide] 4 ”-nitrophenyl ester (hereinafter referred to as“ BAHA_OXOr PEG-bis-chloroformate and N, N-di [2- (6′-N′-carbobenzyloxyaminohexanoamido) ethyl] amine (herein) Then, it is called “AHAB”).
[0045]
The double stranded nucleotide composition of the complex of the invention can be substantially uniform. The duplex length of the complex of the present invention can be 20 to 50 base pairs. The duplex of the complex of the present invention can bind to the bond platform molecule at or near its end. The polynucleotide duplex of the complex of the present invention may be composed of 2 to 4 mer complementary repeat units of different bases. The polynucleotide duplex of the complex of the present invention is: poly (CG): poly (CG); poly (TA): poly (TA); poly (CI): poly (CI); poly (CA): poly ( TG); or poly (GA): poly (TC);
[0046]
In the complex of the present invention, the polynucleotide duplex is (CA)._Ten: (TG)_TenAnd the bond platform molecule can be derivatized triethylene glycol. In this complex, the molar ratio of the duplex to the bond platform molecule is preferably 2: 1 to 8: 1, more preferably 4: 1.
[0047]
In the complex of the present invention, the polynucleotide duplex is (CA)._Ten: (TG)_TenAnd the bond platform molecule can be derivatized 1,2-bis- (2′-aminoethoxy) ethane. In this complex, the molar ratio of the double strand to 1,2-bis- (2′-aminoethoxy) ethane is preferably 2: 1 to 8: 1, more preferably 4: 1.
[0048]
The complex of the present invention may be an immunotolerant of human SLE (systemic lupus erythematosus).
[0049]
The polynucleotide duplex of the complex of the present invention may have a B-DNA type helical structure and has a significant binding activity against anti-dsDNA autoantibodies of human SLE (systemic lupus erythematosus). Can do.
[0050]
According to the present invention, a pharmaceutical composition for the treatment of lupus may comprise a complex of the present invention formulated with a pharmaceutically acceptable and injectable excipient. A method of treating an individual suffering from lupus may comprise administering to the individual in need of treatment a therapeutically effective amount of this composition.
[0051]
A method for producing a complex of the invention comprises: (a) binding a plurality of single stranded polynucleotides, each of at least about 20 base pairs, onto the bond platform molecule; and (b) complementary. Annealing a single-stranded polynucleotide with the single-stranded polynucleotide attached to the bond platform molecule to form the double strand. The method may further comprise the steps of first binding the polynucleotide duplex to a linker molecule and then binding the linker molecule to the bond platform molecule.
[0052]
The biological or chemical molecule of the complex of the present invention may be an immunogen analog, wherein (a) the analog specifically binds to B cells to which the immunogen specifically binds. And (b) the complex may lack a T cell epitope. Here, the immunogen may be a biological agent, allergen, Rh / D immunogen associated with Rh hemolytic disease, α-sperm associated with male infertility, or a carbohydrate complex associated with rheumatic fever. Can be a foreign immunogen. Alternatively, the immunogen can be an autoimmune such as that associated with thyroiditis, diabetes, stroke, or myasthenia gravis. The immunogen and the analog can be the same chemical species, eg, a polypeptide. Alternatively, the immunogen and the analog can be different chemical species.
[0053]
According to the present invention, a pharmaceutical composition for the treatment of an antibody mediated disease may comprise a therapeutically effective amount of a complex of the present invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
[0054]
According to the present invention, a method of inducing an B cell anergy specific for an immunogen in an individual comprises an effective amount of a complex of the present invention, for example in the form of a pharmaceutical composition as described above. Administering to the individual may be included.
[0055]
In accordance with the present invention, a method of treating an individual having an antibody-mediated disease in which unwanted antibodies are produced in response to an immunogen comprises a therapeutically effective amount of a complex of the present invention, eg, a pharmacological agent as described above. Administering to an individual in the form of a functional composition.
[0056]
The method of producing the complex of the present invention includes: (a) covalently binding an immunogen analog lacking a T cell epitope with the chemically defined bond platform molecule. And (b) recovering the complex from the reaction mixture. Here, the immunogen may be a foreign agent such as a biological agent, allergen, alpha-sperm associated with male infertility, or Rh / D immunogen associated with Rh hemolytic disease. Alternatively, the immunogen may be an autoimmune such as that associated with thyroiditis, diabetes, stroke, myasthenia gravis, or rheumatic fever. The immunogen and analog can be the same chemical species.
[0057]
Surprisingly, the use of a complex of the present invention, a chemically defined non-polymeric bond platform molecule and a biological or chemical molecule (non-hapten), is described in the prior art. Unexpected results were achieved with at least about 10 to several hundred times more immunosuppression compared to the polymeric carriers that have been described. For example, as described herein, a chemically defined non-polymeric hand platform molecule containing a complex of the present invention can be used to define an ambiguous carrier as defined in the prior art. Compared with, at least 100-fold immunosuppression of anti-dsDNA autoantibodies was achieved.
[0058]
Yet another aspect of the present invention provides: (a) a chemically defined non-polymeric bond platform molecule and (b) a functional group located at or near one end of one strand of the duplex. A complex consisting of a plurality of polynucleotide duplexes, all of which are each bound to the binding platform molecule, and is an immunotolerant of human SLE.
[0059]
Pharmaceutical compositions of the above conjugates and pharmaceutically acceptable pharmaceutical media are yet another aspect of the present invention.
[0060]
Another aspect of the invention is a method of treating SLE comprising administering to an individual in need of treatment an effective amount of the above complex.
[0061]
Yet another aspect of the present invention is a method of inducing specific B cell anergy against an immunogen in an individual comprising administering to the individual an effective amount of the complex described above.
[0062]
Another aspect of the invention is a method of treating an antibody mediated disease wherein unwanted antibodies are produced in response to an immunogen comprising the step of administering to an individual an effective amount of the above complex. .
[0063]
Another aspect of the present invention provides a complex as described above, comprising the step of binding a biological or chemical molecule to a chemically defined bond platform molecule to form a complex. It is a method.
[0064]
Another aspect of the invention is that each is at least about 20 nucleotides in length and has a functional group at or near one end thereof that reacts with a functional group on a chemically defined bond platform molecule. Reacting a plurality of single stranded polynucleotides to form a complex, and a single stranded polynucleotide complementary to a single stranded polynucleotide bound to a chemically defined bond platform molecule; Is a method for producing a complex for treating SLE, comprising the step of forming a pendant strand of double-stranded DNA.
[0065]
Yet another aspect of the invention is a novel, chemically defined non-polymeric bond platform molecule of the formula:
[0066]
Embedded image

[0067]
Or
[0068]
Embedded image

[0069]
However, if present, G^[6]And G^[7]Are each independently 1-2000 selected from the group consisting of C, N, O, Si, P and S, more preferably 1-1000, including chain atoms, straight chain, branched or multiple It is a branched chain.
[0070]
More preferably, G^[6]And G^[7]Are groups derived from polyalcohols, polyamines, or polyglycols.
[0071]
Most preferably, G^[6]And G^[7]Are each-(CH₂)_q-, -CH from 0 to 300₂(CH₂OCH₂)_rCH₂-, And s is from 1 to 4, more preferably s is from 3 to 4, C (CH₂0CH₂CH₂-)_s(OH)_4-sSelected from the group consisting of
[0072]
T^[6]N shown as^[6]× p^[6]Pieces and T^[7]Indicated as p^[7]Xn^[7]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) NHNHR^SUB(Hydrazide), NHNHR^SUB(Hydrazine), -C (= O) OH (carboxylic acid), -C (= O) OR^ESTER(Active ester), -C (= O) OC (= O) R^B(Anhydride), -C (= O) X (acid halide), -S (= O)₂X (sulfonyl halide), -C (= NR^SUB) OR^SUB(Imidate ester), -NCO (isocyanate), -NCS (isothiocyanate), -OC (= O) X (haloformate), -C (= O) OC (= NR^SUB) NHR^SUB(Carbodiimide adduct), -C (= O) H (aldehyde), -C (= O) R^B(Ketone), -SH (sulfhydryl or thiol), -OH (alcohol), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), -R^ALKX (alkyl halide), -S (= O)₂OR^ALKX (alkyl sulfonate), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide), -C (= O) CR^B= CR^B ₂(α, β-unsaturated carbonyl), -R^ALK-Hg-X (alkylmercury) and -S (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated sulfone).
[0073]
More preferably, T^[6]N shown as^[6]× p^[6]Pieces and T^[7]N shown as^[7]× p^[7]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), -R^ALKX (alkyl halide), -S (= O)₂OR^ALKX (alkyl sulfonate), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide), -C (= O) CR^B= CR^B ₂(α, β-unsaturated carbonyl), -R^ALK-Hg-X (alkylmercury) and -S (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated sulfone).
[0074]
More preferably, T^[6]N shown as^[6]× p^[6]Pieces and T^[7]N shown as^[7]× p^[7]Each part is independently -NHR^SUB(Amine), -C (= O) CH₂X (haloacetyl), R¹R²-NR where -C (= O) CH = CHC (= O)-¹R²(Maleimide), -C (= O) CR^B= CR^B ₂Selected from the group consisting of (α, β-unsaturated carbonyl).
[0075]
Most preferably, T^[6]N shown as^[6]× p^[6]All parts and T^[7]N shown as^[7]× p^[7]All of the parts are the same.
[0076]
Where
Each X is independently a halogen having an atomic number of 16 to 54 or a good leaving group.
[0077]
Each R^ALKIs independently a linear, branched or cyclic (1-20C) alkyl group.
[0078]
Each R^SUBIs independently H, linear, branched, or cyclic (1-20C) alkyl, (6-20C) aryl, or (7-30C) alkylaryl.
[0079]
Each R^ESTERIs independently N-succinimidyl, p-nitrophenyl, pentafluorophenyl, tetrafluorophenyl, pentachlorophenyl, 2,4,5-trichlorophenyl, 2,4-dinitrophenyl, cyanomethyl, or 5-chloro- Other activating groups such as 8-quinolone-1-yl, 1-piperidyl, N-benzotriazolyl and the like.
[0080]
Each R^BIs independently a group containing 1-50 atoms selected from the group consisting of C, H, N, O, Si, P and S.
[0081]
n^[6]× p^[6]If the product of is greater than 1 and less than 33,
n^[6]Is from 1 to 32, more preferably n^[6]Is 1 to 16, more preferably n^[6]Is 1 to 8, more preferably n^[6]Is 1 to 4, most preferably n^[6]Is 1 to 2;
p^[6]Is 1 to 8, more preferably p^[6]Is 1 to 4, most preferably p^[6]Is 1 to 2.
[0082]
n^[7]× p^[7]If the product of is greater than 1 and less than 33,
n^[7]Is from 1 to 32, more preferably n^[7]Is 1 to 16, more preferably n^[7]Is 1 to 8, more preferably n^[7]Is 1 to 4, most preferably n^[7]Is 1 to 2;
p^[7]Is 1 to 8, more preferably p^[7]Is 1 to 4, most preferably p^[7]Is 1 to 2.
[0083]
Q^[6]N indicated by^[6]Pieces and Q^[7]2 × n indicated by^[7]Each part is independently at least p^[6](Q^[6]Or p)^[7]/ 2 (Q^[7]In this case, for example, stock p^[7](2 is an integer) from the group consisting of C, H, N, O, Si, P, and S, containing a binding site for a functional group on an alkyl, alkenyl, or aromatic carbon atom A group containing 1-100 atoms selected.
[0084]
More preferably, Q^[6]N shown as^[6]All of the parts are the same.
[0085]
More preferably, Q^[7]Shown as 2 × n^[7]All of the parts are the same.
[0086]
More preferably, Q^[6]N shown as^[6]Each of the moieties is independently CH [(CH₂)_r(Binding site)]₂, And CH [(CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_q(Binding site)]₂Selected from the group consisting of
[0087]
More preferably, Q^[7]Shown as 2 × n^[7]Each of the moieties is independently r is 1 to 10, more preferably r is 2 to 6, q is 1 to 10, more preferably q is 1 to 3,₂)_r, (CH₂)_rNR^SUBC (= O) (CH₂)_q, (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_q, (CH₂)_rNR^SUBC (= O) (CH₂)_qNR^SUBC (= O) (CH₂)_r, (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂)_qNR^SUBC (= O) (CH₂)_r, (CH₂)_rNR^SUBC (= O) (CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂, And (CH₂)_rC (= O) NR^SUB(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂Selected from the group consisting of
[0088]
[Structure of the invention]
As used herein, the term “joint platform molecule” is a chemically defined, non-polymeric having multiple sites that allow the attachment of many separate biological and / or chemical molecules. Means non-immunogenic molecules.
[0089]
As used herein, the term “non-immunogenic” is used as an adjective of the joint platform molecule and substantially reduces the immune response when the joint platform molecule is administered alone to an individual. It means not to cause.
[0090]
As used herein, the term “individual” refers to many mammalian species, including humans, primates, mice, and domestic animals such as cattle and sheep, sport animals such as horses, Includes pets such as cats.
[0091]
The term “immunogen” as used herein is a substance that elicits a humoral immune response when injected into an animal. The immunogen has both a B cell epitope and a T cell epitope.
[0092]
As used herein, the term “analog” of an immunogen refers to a molecule that (a) specifically binds to an antibody to which the immunogen specifically binds and (b) lacks a T cell epitope. Usually, an analog is a fragment or derivative of an immunogen, so it belongs to the same chemical species as the immunogen (for example, the immunogen is a polypeptide and the analog is a polypeptide), but chemical similarity is not important . Thus, the analog may be a different chemical species than the immunogen (eg, the immunogen is a hydrocarbon and the analog is a polypeptide), provided that it has the functional properties of (a) and (b) above. Analogs can be proteins, carbohydrates, lipids, lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, nucleic acids, or other chemical or biological substances.
[0093]
Immunogen analogs can also include “mimotopes”. The term “mimotope” as used herein means a synthetic molecule that competitively prevents an antibody from binding to an immunogen. Mimotopes are thought to mimic the antigenic determinant sites of immunogens because they bind specifically to antibodies. Like immunogen analogs, mimotopes (a) specifically bind to antibodies to which the immunogen specifically binds, and (b) lack T cell epitopes.
[0094]
Immunogen analogs can also include “aptamers”. The term “aptamer” as used herein means a synthetic oligonucleotide that competitively prevents an antibody from binding to an immunogen. Like immunogen analogs, aptamers specifically bind (a) antibodies to which the immunogen specifically binds, and (b) lack T cell epitopes.
[0095]
As used herein, the term “B cell anergy” refers to the lack of a B cell response that requires T cell assistance for antibody production and secretion, and is not limited to, but mature And / or clonal deletion of immature B cells, and / or lack of ability of B cells to produce antibodies. The term “lack of response” as used herein means a therapeutically effective decrease in the humoral response to the immunogen. In quantitative terms, the decrease (as measured by a decrease in antibody production) is at least 50%, preferably at least 75%, and most preferably 100%.
[0096]
The term “antibody” as used herein refers to an antibody whose production is T cell dependent.
[0097]
The valency of the chemically defined bond platform molecule of the present invention can be predetermined by the number of branched groups introduced into the platform molecule. Suitable branched groups are generally derived from diamino acids, triamines, and amino diacids. Examples of diamino acids and amino diacids include compounds of the following formula:
[0098]
Embedded image

[0099]
The complexes of the invention are biologically stable; ie, on the order of hours, days, or months.in vivoIt shows the elimination half-life of urine and contributes to the therapeutic effect. The chemically defined hand platform molecules of the invention are also substantially non-immunogenic (i.e., not immunogenic when administered to animals, or only mild immunogenicity). ), Is non-toxic at a given dose (ie, non-toxic enough to be useful as a therapeutic agent) and preferably consists of a defined chemical structure. These provide non-immunogenic and non-toxic multifunctional substrates to which multiple biological or chemical molecules, such as polynucleotide duplexes, can be covalently linked. These usually have an average molecular weight in the range of about 200 to about 200,000, generally from about 200 to about 20,000. They are more uniform than prior art polymers, which are a mixture of compounds that vary greatly in molecular weight. Examples of particularly preferred and uniform bond platform molecules of the invention are derivatized 2,2′-ethylenedioxydiethylamine (EDDA), triethylene glycol (TEG), and polyethylene having a molecular weight of about 200 to 8,000. Glycol (PEG).
[0100]
The binding of biological or chemical molecules to chemically defined platform molecules can be accomplished in a number of ways. Typically, this is done using biological or chemical molecules and functional groups of the bond platform molecules and one or more crosslinkers.
[0101]
The synthetic polynucleotide duplex coupled to the bond platform molecule consists of at least about 20 bp, and preferably 20-50 bp. Unless otherwise stated, the polynucleotides described herein are deoxyribonucleotides and are written in the 5 ′ to 3 ′ direction. The duplex is preferably substantially uniform in length; that is, the length variation in the population is about ± 20% of the average duplex length expressed in base pairs, preferably Does not exceed ± 10%. The nucleotide composition is also preferably substantially uniform; that is, the base composition and base sequence do not vary by more than about 10% between each duplex. Most preferably, the nucleotide composition is completely uniform in each duplex.
[0102]
Based on the interpretation of the circular dichroism (CD) spectrum, the duplex of the present invention is presumed to be a B-DNA type helical structure. However, it is not intended that the present invention be limited by this assumption. Based on a more complete analysis, the duplex may be a Z-DNA and / or A-DNA type helical structure.
[0103]
These polynucleotide duplexes can be synthesized from natural DNA or can be synthesized by chemical or recombinant techniques. Longer dsDNA produced naturally or recombinantly is digested (eg, enzymatic, chemical, or mechanical sheared) and fractionated (eg, on an agarose gel or Sephadex® column). To give a polynucleotide of the desired length.
[0104]
Alternatively, pairs of complementary single stranded polynucleotide strands up to about 70 bases in length can be readily prepared using a commercially available DNA synthesizer, followed by annealing, followed by a general procedure. Forms a chain. Longer synthetic dsDNA can be obtained by multiple short-strand enzymatic extensions (5'-phosphorylated and then ligated) that are chemically produced.
[0105]
Polynucleotides can also be produced by molecular cloning. For example, a polynucleotide of the desired length and sequence is synthesized as described above. These polynucleotides can be digested and have appropriate ends for insertion by ligation into specific restriction enzyme sites. The resulting construct is inserted into a standard cloning vector and the vector is introduced into the appropriate microorganism / cell by transformation. Transformants are identified by standard markers and are grown under conditions suitable for DNA replication. Polynucleotides can be isolated from DNA of other microorganisms / cells by treatment with restriction enzymes and common size fractionation methods (eg, by agarose gels or Sephadex® columns).
[0106]
Alternatively, the polynucleotide can be replicated by polymerase chain reaction (PCR) technology. Saiki, R.K.Science (1985)230: 1350; Sacki et al.Science (1988)239: 487, Sambrook et al.In Molecular Cloning Techniques: A Laboratory Manual, Vol 12, p 14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press (1989).
[0107]
The polynucleotides can be screened for binding activity against SLE antisera by the assays described in the Examples. Binding activity I₅₀A modified Farr assay, which can be expressed as (polynucleotide concentration resulting in half-maximal inhibition, expressed in terms of molar concentration of nucleotides) is a preferred assay. I of about 500 nM or less, preferably 50 nM or less₅₀Polynucleotide duplexes having a are considered to have significant binding activity and are therefore useful in the production of the complexes of the invention.
[0108]
The polynucleotide is bound to a chemically defined bond platform molecule in such a way that its antibody binding activity is retained. This allows the polynucleotide to be attached at a defined position on the polynucleotide chain so that a pendant strand of at least about 20 base pairs is formed from the binding site to the free (non-binding) end of the chain. This is done by combining them.
[0109]
In a particularly preferred embodiment, the polynucleotide of the complex of the invention is coupled to a linker molecule at or near one end thereof. This linker molecule is then coupled to a chemically defined bond platform molecule. For example, a defined double-stranded PN can be bound to a bond platform molecule as follows. First, a single strand consisting of about 20 nucleotides in length where cytosine (C) and adenosine (A) are present alternately is prepared. Next, four CA chains can be covalently attached to four reactive sites on a derivatized platform molecule such as triethylene glycol via a linker such as HAD. This bond platform molecule has been synthesized to include groups such as bromoacetyl. During this conjugation, the leaving group is replaced with sulfur. Next, a second single-stranded nucleotide chain consisting of about 20 nucleotides in which thymidine (T) and guanosine (G) are alternately present is annealed with the CA chain, and the structural formula:
[(PN)₂₀-Linker]_Four-Bonded hand platform molecules
Of double stranded PN complexes.
[0110]
Alternatively, in other preferred embodiments, the polynucleotide can be coupled to the bond platform molecule at the 3 ′ end of the polynucleotide via a morpholino bridge. Morpholino linkage is accomplished by condensing the oxidized 3'-terminal ribose of one strand of the polynucleotide with a free amino group on the derivatized platform molecule and then exposing the adduct to reducing conditions. ,It is formed. This coupling requires that the derivatized bond platform molecule has at least as many amino groups as the number of polynucleotide duplexes attached to the platform molecule.
[0111]
The synthesis of such a complex is performed in two steps. The first step is to couple one strand of the polynucleotide duplex to the derivatized platform molecule via the condensation / reduction reaction described above. Single stranded polynucleotides are treated with periodate to convert the 3 ′ terminal ribose group to oxidized ribose to form an oxidized 3 ′ terminal ribose. This single stranded polynucleotide is then gradually added at 2-8 ° C. to an aqueous solution of derivatized bond platform molecules having a pH of about 6.0 to 8.0. The molar ratio of polynucleotide to platform molecule is generally in the range of about 2: 1 to about 30: 1, usually about 2: 1 to about 8: 1 and preferably about 4: 1 for all conjugation reactions. To 6: 1.
[0112]
In this connection, the complex preferably does not have a very large molecular weight like a macromolecule. In particular, macromolecules having a repeating unit with a molecular weight greater than 200,000 can be T-cell dependent immunogens. Dintzis et al.J. Immun. (1983)131: 2196; andJ. Immun. (1989)143: 1239. During or after the condensation reaction (generally 24-48 hours of reaction time) or after, a strong reducing agent such as sodium cyanoborohydride is added to form a morpholino group. Next, a double stranded complementary strand is added to the complex, and the mixture is heated and allowed to cool to anneal both strands. This complex can be purified by gel permeation chromatography.
[0113]
One alternative to the ribose-based method described above is the formation of aldehyde groups on the polynucleotide, and these groups are attached to the polynucleotide and platform via a reactive functional group on the platform molecule. It is used to couple molecules. This reaction was attached to the 3 'or 5' end of the polynucleotide.gem-Orvicinal-The diol can be oxidized with sodium periodate to give an aldehyde, which can be condensed with the amino function of the platform molecule. When a diol is present in a cyclic moiety, such as a 5-membered ring, the resulting condensation product is a nitrogen-containing heterocyclic compound, such as a 6-membered morpholino or piperidino ring. This imino condensation product can be stabilized by reduction with a suitable reducing agent such as sodium borohydride or sodium cyanoborohydride. When the diol is an acyclic compound, the resulting oxidation product has only one aldehyde group and the condensation product is a secondary amine.
[0114]
Another method involves introducing an alkylamino or alkylsulfhydryl group at either the 3 ′ or 5 ′ end of the polynucleotide using an appropriate nucleotide reaction (eg, a phosphoramidite reaction). This nucleophilic group is then used, for example, in the case of alkylamine derivatives, a large excess of homobifunctional cross-linking reagents such as dimethylsuberimidate, or in the case of alkylsulfhydryl derivatives, for example It can be reacted with an excess of a heterobifunctional cross-linking reagent such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) or succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB). After removing excess cross-linking reagent, the polynucleotide derivative is reacted with an amino group on the platform molecule. Alternatively, the sulfhydryl group can be reacted with an electrophilic center on the platform molecule such as a maleimide, or α-haloacetyl group, or other suitable Michael addition receptor.
[0115]
Yet another method uses modified nucleotides. A standard DNA synthesis reaction can be used to incorporate an appropriate deoxynucleoside derivative at the desired position of the polynucleotide, preferably at the 5 'or 3' end. These nucleoside derivatives can then be reacted specifically and directly with alkylamino groups on the platform molecule. Alternatively, side reactions that occur in the above-mentioned dialdehyde reactions, such as amine-catalyzed β-elimination, can be prevented by introducing an appropriate nucleoside derivative at the 3 ′ end of the chain to be bound. An example of this is the 5 ′ methylene extension of ribose; ie, introducing a 5 ′ (2-hydroxyethyl) group in place of the 5 ′ hydroxymethyl group. Another method uses a phosphonate bond or phosphinate bond for the dinucleotide at the 3 ′ end of the polynucleotide to be bound to the platform molecule.
[0116]
<Immunogen analogs>
Immunogens involved in antibody-mediated diseases include allergens, male infertility α-sperm, rheumatic carbohydrate complexes, erythrocyte Rh / D antigens in neonatal hemolytic disease (therapeutic proteins, peptides, and Foreign immunogens such as biological agents (including natural biological substances that are foreign to the individual such as antibodies), or thyroiditis (thyroglobulin), stroke ( Cardiolipin), and autoimmune (autoantigen) such as myasthenia gravis (acetylcholine receptor).
[0117]
Such immunogen analogs are screened for candidate molecules to determine whether (a) they specifically bind to serum antibodies to the immunogen and (b) whether they lack a T cell epitope, It can be confirmed by examining. Specific binding to serum antibodies can be determined using conventional immunoassays, and the presence or absence of T cell epitopes can be determined by conventional T cell activation tests. In that sense, an analog that “specifically binds” to a serum antibody to an immunogen has sufficient affinity for the antibody. In that sense, T cell epitopes should be tested for individual purposes using T cells from individuals intended for treatment or from various patients representing the target population. Is also understood. The presence or absence of T cell epitopes is described in the examples^ThreeIt can be examined using an H (tritylated) thymidine incorporation assay. The presence of T cell epitopes can also be determined by measuring secretion of T cell-derived lymphokines by methods well known in the art. Analogs that did not elicit statistically significant thymidine incorporation above background are considered to lack T cell epitopes. The quantitative amount of thymidine incorporation can vary from immunogen to immunogen. Generally, a stimulation index of less than about 2-3, and more generally less than about 1-2, indicates a lack of T cell epitopes.
[0118]
The usual first step to identify useful analogs is the preparation of a panel or library of candidates to be screened. For example, in the case of a protein or peptide analog, Geysen et al.Synthetic Peptides as Antigens; Ciba Symposium (1986)119: 131-149; Devlin et al.Science (1990)249: 404-406; Scott et al.Science (1990) 249: 386-390; and Cwirla et al.PNAS USA (1990)87: 6378-6382 etc., and can be produced by synthetic techniques or recombinant methods. In one synthesis method, peptides of about 5 to 30 amino acids are synthesized so that each peptide overlaps with the next peptide and so that all chained epitopes are expressed. This is done by overlapping both the carboxyl and amino termini by one residue less than the length expected for the B cell epitope. For example, if the minimum requirement for B cell epitopes is assumed to be 6-amino acids, each peptide must overlap with the next peptide by 5-amino acids. In this embodiment, each peptide is then screened for the presence of B cell epitopes with antisera raised against the natural immunogen, either by animal immunization or from the patient. The molecules with antibody binding activity are then screened for the presence of T cell epitopes as described in the Examples. Molecules lacking T cell epitopes are useful as analogs of the invention.
[0119]
If the immunogen T cell epitope (s) are known or can be identified, random T cell screening of candidate analogs is not necessary. In that case, the T cell epitope (s) can be altered so as not to function (e.g., by chemically derivatizing or removing one or more components of the epitope). Alternatively, for example, as in the case of peptides, they can be completely removed by synthetic methods or recombinant methods.
[0120]
Mimotopes or aptamers can be synthesized by conventional methods and screened in the same manner as other immunogen analogs.
[0121]
These analogs are coupled with non-immunogenic coupling platform molecules to prepare the complexes of the invention. Exemplified herein are conjugates consisting of a binding platform molecule and a biologically active molecule, such as carbohydrates, lipids, lipopolysaccharides, proteins, glycoproteins, drugs, and analogs of interest. It is synthesized using a chemical reaction. A preferred synthesis method is one in which the linker molecule is incorporated onto the biological molecule by a well-known and appropriately selected method.
[0122]
When an agent such as adriamycin (doxorubicin) is attached to the bond platform molecule, the amino group on the sugar ring can react with the platform molecule containing the active ester. Adriamycin can also be modified to include a thiol group for coupling to a haloacetylated platform (Kaneko, T. et al.Bioconjugate Chemistry,2: 133 (1991)).
[0123]
Carbohydrates such as oligosaccharides can be modified to include linkers that contain sulfhydryls (Wood, S.J. and Wetzel, R.,Bioconjugate Chemistry,Three: 391 (1992)). Sulfhydryl groups are used to attach to haloacetylated platforms. Alternatively, the carbohydrate is oxidized to produce an aldehyde, which is converted to NaCNBH_ThreeCan be reacted with an amination platform in the presence of
[0124]
Lipids such as glycol lipids containing ethanolamine groups are reacted with active carboxylates on the platform molecule. Lipopolysaccharide containing sugar units is oxidized to produce aldehyde, which is then converted to NaCNBH._ThreeIs reacted with an amination platform in the presence of to form a complex by reductive amination.
[0125]
In the case of another protein, such as a Fab ′ antibody fragment, the sulfhydryl group on the protein (Fab ′) binds to the platform via a haloacetyl group. Glycoproteins are modified with a thiol linker using iminothiolate. This thiol reacts with a platform containing a haloacetyl group.
[0126]
The ability of the complex to function as an immunotolerogen and the ability to specifically suppress antibody production can be assessed in the mouse model described in the Examples.
[0127]
This complex is usually formulated to be administered by injection (eg, intraperitoneally, intramuscularly, intravenously, etc.). Thus, they are typically combined with a pharmaceutically acceptable aqueous carrier such as saline, Ringer's solution, dextrose solution, and the like. The composite typically constitutes about 0.01% to 10% by weight of the formulation. The complex is administered to the individual in an amount sufficient to at least partially reestablish immune tolerance to the self antigen that causes SLE. Such amounts are sometimes referred to herein as “therapeutically effective” amounts. Administration of a particular case, i.e., dosage, timing, and number of administrations, will vary depending on the particular individual and the individual's medical history. Usually administered at about 1-1000 μg complex / Kg body weight. Repeated administration may be necessary to achieve and / or maintain a state of immune tolerance.
[0128]
The following examples further illustrate the unexpected effects of the present invention and the prior art of the present invention. These examples do not limit the scope of the invention.
[0129]
【Example】
(Example 1)
The following reaction scheme illustrates a method for synthesizing the derivatized chemically defined bond platform molecules of the present invention. The following abbreviations are used in this example:
DMTr = 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl; Tr = trityl; Bz = benzoyl; Cp = deoxycytidine monophosphate; CE = cyanoethyl; CPG = controlled porous glass; DMF = dimethylformamide; DCC = dicyclohexylcarbodiimide; TFA = trifluoroacetic acid; CDI = carbonyldiimidazole; Ts = tosyl (p-toluenesulfonyl); DIPAT = diisopropylammonium tetraazolide; TBDMSCl = tert-butyldimethylsilyl chloride; TBAF = tetrabutylammonium fluoride; NMMO = N -Methylmorpholine oxide.
[0130]
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[0131]
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[0139]
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[0140]
(CA)₈, (CA)_Ten, (CA)₁₂And (CA)₁₆The synthesis of the reagents used to modify the compound with a disulfide linker is described in the following Reaction Scheme 11.
[0141]
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[0142]
(CA)_{twenty five}The synthesis of the reagents used to modify the vicinal-diol linker is described in Scheme 12 below.
[0143]
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[0144]
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[0145]
(Example 2: chemically defined bond platform molecule)
<Compound 1- [3,5-bis- (iodoacetamido) benzoic acid]>
Iodoacetic anhydride 2.93g (8.28mmol, 2.2eq) N₂To a stirred dioxane (19 mL) suspension of 572 mg (3.76 mmol) 3,5-diaminobenzoic acid at room temperature under atmosphere. The mixture was stirred, covered with foil for 20 hours, and partitioned between EtOAc (50 mL) and 1N HCl solution (50 mL). The EtOAc layer is washed with brine and MgSO_Four, Filtered and concentrated on a rotary evaporator to give 3.3 g of a brown solid. This material was chromatographed on silica gel (94/5/1 CH₂Cl₂/ MeOH / HOAc), 992 mg (54%) of compound1Was obtained as a white solid: NMR (DMSO) 3.84 (s, 4H), 7.91 (s, 2H), 8.14 (s, 1H), 10.56 (s, 2H).
[0146]
<Compound 2- [3,5-bis- (iodoacetamido) benzoyl chloride]>
SOCl₂ 117 μL (1.6 mmol, 190 mg) of 390 mg (0.8 mmol)1Was added to a THF (34 mL) solution. Mix this mixture until all solids are dissolved (approximately 30 minutes)₂Refluxed under atmosphere to give a clear reddish brown solution. The mixture is concentrated on a rotary evaporator and left under reduced pressure to give the crude compound2Was obtained as a foamy solid. This foamy solid was used directly in the next step.
[0147]
<Compound 3- [N, N′-bis- (3,5-bis- (iodoacetamido) benzoyl) derivative of α, ω-bis- (N-2-aminoethylcarbamoyl) polyethylene glycol]>
570 mg of α, ω-bis- (N-2-aminoethylcarbamoyl) polyethylene glycol (0.16 mmol, 3350 g / mol, Sigma) was placed in a tared flask. Toluene (20 mL) was added and water was removed by azeotropic distillation. The residue was dried under reduced pressure to give 549 mg of solid and dissolved in 4 mL of THF with 89 μL (0.64 mmol) of diisopropylethylamine. The crude acid chloride is dissolved in 4 mL anhydrous THF and N₂Added to the mixture under 30 seconds. The mixture was stirred at room temperature for 16 h and 0.1N HCl (25 mL) and CH₂Cl₂(25 mL). CH₂Cl₂Extract again with and combine the organic layers with H₂O 25 mL, then NaHCO_ThreeWashed with 50 mL of solution. Organic layer Na₂SO_Four, Filtered and concentrated to give 784 mg of an orange oil. Silica gel chromatography (9/1 CH₂Cl₂/ MeOH) gave 190 mg of a colorless oil. Heat this oil with EtOH / Et₂Crystallized from O and N₂177 mg of compound collected on a sintered glass filter under pressure and dried under reduced pressure3Was obtained as a white solid: NMR (CDCl_Three) 3.40 (bd m, 8H), 3.59 (bd s, (CH₂CH₂O)_n, 3.91 (s, 8H), 4.21 (m, 4H), 6.04 (bd m, 2H), 7.55 (bd m, 2H), 7.78 (bd s, 4H ), 8.10 (bd s, 2H), 9.30 (bd m, 4H): Iodoacetyl measurement method (European Journal of Biochemistry (1984)140: 63-71): Calculated value: 0.92 mmol / g; Found: 0.96 mmol / g.
[0148]
<Compound 4- [Mono-N-carbobenzyloxy-3,6-dioxa-1,8-diaminooctane]>
14.3 mL (17.1 g, 100 mmol) of benzyl chloroformate in CH₂Cl₂(200 mL) The solution was added 29.0 mL (29.6 g, 200 mmol) of 1,2-bis- (2′-aminoethoxy) ethane (Fluka) in CH.₂Cl₂(100 mL) was added dropwise at 0 ° C. over 1 hour. The mixture was stirred at room temperature for 24 hours and 1N HCl was added until the aqueous layer remained acidic (less than pH 2). CH₂Cl₂Washed 3 times (in 50 mL portions) and neutralized with 1N NaOH until pH exceeded 13. This basic aqueous layer is CH₂Cl₂Extracted 5 times (75 mL each). CH₂Cl₂The layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to 12.7 g (45%) of compound4Was obtained as a thick oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.82 (bd s, 2H), 3.30-3.60 (m, 12H), 5.10 (s, 2H), 5.75 (bd s, 1H), 7.20-7.40 (m, 5H);¹³C NMR (CDCl_Threed) 41.1, 41.8, 66.5, 70.0, 70.2, 70.4, 73.5, 127.9, 128.0, 128.4, 136.9, 156.4.
[0149]
<Compound 5- [N-tert-butyloxycarbonyliminodiacetic acid]>
Garrigues, B. and Lazraq, E.M.Tetrahedron Letters (1986)27, 1685-1686, and the compound was prepared in a similar procedure. Et_ThreeN 47 mL (34.2 g, 338 mmol) was added to a stirred 50/50 dioxane / H of 22.0 g (169 mmol) of iminodiacetic acid and 36.8 g (169 mmol) of di-tert-butyl dicarbonate.₂To a solution of O (169 mL) at room temperature. The mixture was stirred for 24 hours and most of the dioxane was removed on a rotary evaporator. The mixture was partitioned between 1N HCl (350 mL) and 5 EtOAc (100 mL each). The EtOAc layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to a white solid. 35.3 g (90%) of compound recrystallized from hexane / EtOAc5Was obtained as crystals: m.p. 131-132 ° C. fused;¹H NMR (DMSO) d 1.35 (s, 9H), 3.87 (s, 2H), 3.91 (s, 2H), 12.6 (bd s, 2H);¹³C NMR (DMSO) d 27.9, 49.6, 79.6, 154.8, 171.2.
[0150]
<Compound 6>
Dicyclohexylcarbodiimide 9.99g (48.5mmol), 4.52g (19.4mmol) compound5And N-hydroxysuccinimide (NHS) 4.46 g (38.8 mmol) in THF (100 mL) was added at 0 ° C. The mixture was stirred at 0 ° C. for 3 hours and Et_ThreeN 5.39 mL (3.92 g, 38.8 mmol) and 10.9 g (38.7 mmol) compound4In THF (83 mL) was added and the mixture was stirred at 5 ° C. for 17 h. The mixture was filtered to remove solids and the filtrate was concentrated to give an oil. The oil was partitioned between EtOAc (400 mL) and two 1N HCl (100 mL each). This EtOAc layer was washed with 1N Na₂CO_Three Wash three times with 100 mL portions and once with 100 mL brine and dry (MgSO_Four), Filtered and concentrated to yield 14.2 g (96%) of compound6Was obtained as a thick oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.41 (s, 9H), 3.30-3.70 (m, 24H), 3.70-3.90 (m, 4H), 5.10 (s, 4H), 5.50 (bd s, 2H), 7.12 (bd s, 1H), 7.30-7.40 (m, 10H), 8.24 (bd s, 1H).
[0151]
<Compound 7>
26.3 mL (38.9 g, 156 mmol) of trifluoroacetic acid was converted to 14.2 g (18.6 mmol) of compound6CH₂Cl₂(111 mL) solution was added and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated on a rotary evaporator to give a viscous oil and this oil was dissolved in 93 mL of THF. The solution was cooled to 0 ° C. and 3.72 g (37.2 mmol) of succinic anhydride was added followed by Et._ThreeN 5.18 mL (3.76 g, 37.2 mmol) was added. The cooling bath was removed and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours. The solvent is removed under reduced pressure and the resulting oil is added to CH₂Cl₂(300mL) and 3 H₂Partitioned with O (100 mL each). This CH₂Cl₂The layer is dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to an oil. The oil was purified by chromatography on silica gel (9/1 / 0.1 EtOAc / MeOH / acetic acid) to yield 10.5 g (74%) of compound7Was obtained as a viscous oil;¹H NMR (CDCl_Three) d 2.50-2.60 (m, 4H), 3.30-3.60 (m, 24H), 3.88 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 5.07 (s, 4H), 5.77 (bd s, 2H), 7.20 -7.30 (m, 10H), 7.91 (bd s, 2H), 8.88 (bd s, 1H);¹³C (CDCl_Threed 27.7, 29.0, 39.4, 41.0, 52.9, 53.8, 66.5, 69.3, 69.8, 70.0, 70.1, 127.8, 128.1, 128.3, 136.7, 156.6, 169.1, 169.6, 173.3, 174.5.
[0152]
<Compound 8- [4-nitrophenyl ester of Compound 7]>
1.61 g (7.83 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide was added to 3.98 g (5.22 mmol) of7CH and 800 mg (5.75 mmol) 4-nitrophenol₂Cl₂(26 mL) was added to the solution at 0 ° C. N this mixture₂Under stirring at room temperature for 64 hours. The mixture was cooled to 0 ° C., 1 mL of HOAc was added and the mixture was kept at 0 ° C. for 2 hours. The solid was removed by filtration and the filtrate was concentrated. This residue was chromatographed on silica gel (gradient 91/8/1 to 84/15/1 CH₂Cl₂/ IPA / HOAc), 2.58 g (56%) of compound8Was obtained as a viscous oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.66 (t, 2H), 2.84 (t, 2H), 3.32-3.68 (m, 24H), 3.90 (bd s, 2H), 4.01 (bd s, 2H), 5.06 (s, 4H), 5.58 ( bd m, 2H), 6.91 (bd m, 1H), 7.27 (d, 2H), 7.33 (s, 10H), 8.23 (d, 2H), 9.01 (bd m, 1H).
<Compound 10- [4-Nitrophenylbromoacetate]>
9.28 g (45 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide was added at 0 ° C. to a stirred EtOAc (180 mL) solution of 5.0 g (35.9 mmol) of bromoacetic acid and 8.50 g (61.1 mmol) of 4-nitrophenol. The mixture was stirred at 5 ° C. for 16 hours and 1 mL of acetic acid was added. The mixture was stirred at room temperature for 20 minutes and then placed in a freezer for 20 minutes. The solid material is removed by filtration, and the filtrate is concentrated to give a viscous oil and Et.₂7.73 g (83%) of compound crystallized from O / hexane10Was obtained as a flake: m.p. 86-87 ° C .; TLC Rf = 0.63 (50/50/1 hexane / EtOAc / HOAc);¹H NMR (CDCl_Three) d 4.13 (s, 2H), 7.36 (d, J = 12Hz, 2H), 8.32 (d, J = 12Hz, 2H);¹³C NMR (CDCl_Three) d 24.9, 122.1, 125.3, 155.5, 164.9; analysis value: C₈H₆BrNO_FourCalculated for: C, 36.95; H, 2.33; N, 5.39. Found: C, 37.24; H, 2.33; N, 5.42.
[0153]
<Compound 9>
NaHCO_Three 300 mg (3.57 mmol), then 1,2-bis- (2′-aminoethoxy) ethane (Fluka) 162 mg (1.09 mmol), 2.37 g (2.68 mmol) of compound8Dioxane (15 mL) and H₂To the solution with O (8 mL). The mixture was stirred at room temperature for 24 hours and concentrated under reduced pressure to approximately 1/2 of the original volume. Concentrate CH₂Cl₂(40 mL) and saturated NaHCO_ThreePartitioned with solution (40 mL). This CH₂Cl₂The layer was then washed twice with 0.5N HCl each time. This CH₂Cl₂The layer is washed with saturated NaCl solution and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 2.8 g of oil. This crude product was chromatographed on silica gel (3/6/1 / CH₂Cl₂940 mg (59%) of compound9Was obtained as an oil: TLC R_f= 0.21 (3/6/1 CH₂Cl₂/ THF / MeOH);¹H NMR (CDCl_Three) d 2.45 (m, 4H), 2.59 (m, 4H), 3.25-3.55 (m, 60H), 3.87 (s, 4H), 4.05 (s, 4H), 5.07 (s, 8H), 5.62 (bd s , 4H), 6.78 (bd s, 2H), 7.34 (bd s, 20H), 8.56 (bd s, 2H);¹³C NMR (CDCl_Threed 28.1, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 52.9, 53.9, 66.5, 69.4, 69.7, 69.9, 70.2, 125.3, 127.8, 128.3, 136.8, 156.5, 168.8, 169.4, 172.1, 173.5.
[0154]
<Compound 34>
10% Pd carbon 110 mg, 281 mg (0.175 mmol) of compound9To a solution of EtOH (5 mL) and cyclohexene (2 mL) was added under nitrogen and the resulting mixture was refluxed under nitrogen for 2 h. Upon cooling, the mixture was filtered through diatomaceous earth and concentrated under reduced pressure to give 170 mg (92%) of compound34Was obtained as an oil. This oil was used directly in the next step without purification;¹H NMR (CDCl_Three) d 2.45 (m, 4H), 2.53 (m, 4H), 2.62 (m, 4H), 2.86 (m, 8H), 3.42-3.60 (m, 52H), 4.00 (s, 4H), 4.14 (s, 4H);¹³C NMR (CDCl_Threed 28.2, 30.3, 31.1, 39.4, 41.1, 46.5, 48.6, 52.9, 53.8, 69.4, 69.7, 70.2, 72.4, 168.9, 169.5, 172.3, 173.8.
[0155]
<Compound 11>
NaHCO_Three 128 mg (1.4 mmol) and 200 mg (0.85 mmol) compounds10165 mg (0.155 mmol) of compound34Dioxane (6 mL) and H₂To a solution with O (3 mL). The resulting mixture was stirred at room temperature for 24 hours and concentrated under reduced pressure. This concentrate was purified by chromatography on Sephadex® G-10 (MeOH) to yield 114 mg (46%) of compound11Was obtained as a viscous oil. Analytical sample for preparative HPLC (C₁₈; Gradient 15/85 / 0.1 to 30/70 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂0 / CF_ThreeCO₂H, 50 min, 225 nm):¹H NMR (CDCl_Three) d 2.58 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.43-3.62 (m, 60H), 3.92 (s, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.16 (s, 4H); MS (FAB) m / e (relative strength) MNa + 1605 (100), MH + 1579 (1), 1581 (5), 1583 (7), 1585 (6), 1587 (2).
[0156]
<Compound 12- [mono-N-carbobenzyloxy-1,6-diaminohexane]>
A solution of benzyl chloroformate (21 mL, 25.7 g, 150 mmol) in dioxane (200 mL) was mixed with 17.49 g (150 mmol) of 1,6-hexanediamine and KHCO._Three 19.58 g (196 mmol) with dioxane (100 mL) and H₂To a stirred solution of O (300 mL) was added dropwise at 0 ° C. The mixture was stirred at room temperature for 18 hours and then cooled to 0 ° C. The mixture is acidified with 12N HCl and Et₂Extracted twice with 100 mL each of O. Neutralize aqueous layer with 10N NaOH and Et₂Extracted 8 times with 100 mL each. The basic extracts are combined and dried (Na₂SO_FourAnd concentrated to 5.03 g (13%) of the crude compound12Was obtained as a semi-solid residue:¹1 H NMR (DMSO) d 1.22-1.51 (m, 8H), 2.54 (t, 2H), 3.02 (d of t, 2H), 5.05 (s, 2H), 7.30-7.48 (m, 5H).
[0157]
<Compound 13>
918 mg (4.45 mmol) dicyclohexylcarbodiimide, 417 mg (1.78 mmol) compound5And a solution of NHS 409 mg (3.56 mmol) in THF (15 mL) at 0 ° C. The mixture was stirred at 0 ° C. for 4.5 hours and 1.02 g (4.08 mmol) of compound12Of THF (4 mL) was added. N this mixture₂Under stirring at 5 ° C. for 18 hours. The concentrate was partitioned between EtOAc (30 mL) and two 1N HCl (30 mL each). Combine the EtOAc layers and add H₂O (30 mL) and saturated NaHCO_ThreeWash successively with solution (30 mL) and dry (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 1.48 g of a viscous residue. Silica gel chromatography (5/95 MeOH / CH₂Cl₂) To give 1.04 g (84%) of compound13Was obtained as a sticky solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.33 (m, 8H), 1.43 (s, 9H), 1.51 (m, 8H), 3.18 (m, 4H), 3.26 (m, 4H), 3.81 (s, 2H), 3.85 (s, 2H) 4.90 (bd s, 2H), 5.10 (s, 4H), 6.81 (bd s, 1H), 7.28-7.40 (m, 10H), 8.05 (bd s, 1H).
[0158]
<Compound 14>
14.9 mL of trifluoroacetic acid, 5.16 g (7.45 mmol) of compound13CH₂Cl₂(14.9 mL) was added to the solution and the resulting mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure and redissolved in 57 mL of THF. Et into this mixture_ThreeN 2.07 mL (1.51 g, 14.9 mmol) was added. To this mixture was added 1.5 g (14.9 mmol) of succinic anhydride and the mixture was then stirred for 18 hours. Mix the mixture with 1N HCl (75 mL) and 4 CH₂Cl₂(75 mL each). CH₂Cl₂The layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give a solid. CH₂Cl₂3.84 g (74%) of the compound crystallized from / EtOAc / hexane14Was obtained as a white solid: m.p. 122 ° C .;¹H NMR (MeOH) d 1.32 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 2.56 (m, 4H), 3.10 (t, 4H), 3.23 (m, 4H), 4.00 (s, 2H), 4.18 ( s, 2H), 5.05 (s, 4H), 7.33 (m, 10H).
[0159]
<Compound 15- [4-nitrophenyl ester of Compound 14]>
Dicyclohexylcarbodiimide 887 mg (4.30 mmol) to 2.0 g (2.87 mmol) of compound14And 4-nitrophenol 438 mg (3.15 mmol) in THF (15 mL) was added at 0 ° C. The mixture was brought to room temperature and stirred for 18 hours, then cooled to 0 ° C. Then 200 μL of acetic acid was added and the mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour. The solid was removed by filtration and the filtrate was concentrated to give an oil. Silica gel chromatography (92/8 CH₂Cl₂/ IPA) and the solid obtained is CH₂Cl₂1.52 g (64%) of the compound recrystallized from hexane15Was obtained as a white solid: m.p. 65-68 ° C .;¹H NMR (CDCl_Three) d 1.30 (m, 8H), 1.47 (m, 8H), 2.71 (t, 2H), 2.90 (t, 2H), 3.17 (m, 4H), 3.25 (m, 4H), 3.92 (s, 2H) , 4.08 (s, 2H), 4.86 (bd t, 1H), 4.95 (bd t, 1H), 5,09 (s, 4H), 6.28 (bd t, 1H), 7.23 (d, J = 9Hz, 2H ), 7.32 (m, 10H), 8.22 (d, J = 9Hz, 2H), 8.95 (bd t, 1H).
[0160]
<Compound 16>
830 mg (0.99 mmol) of compound15Of dioxane (7.5 mL) with 1,2-bis- (2′-aminoethoxy) ethane (Fluka) 58 μL (59 mg, 0.40 mmol) and NaHCO_Three H with 111 mg (1.31 mmol)₂To the O (7.5 mL) solution. The mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Mix the mixture with 1N HCl (50 mL) and CH₂Cl₂(50 mL). CH₂Cl₂Dry the layer (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to give 1.28 g of a viscous oil. Silica gel chromatography (84/15/1 CH₂Cl₂670 mg of compound by purification by (MeOH / HOAc)16Was obtained as a waxy solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.32 (m, 16H), 1.49 (m, 16H), 2.46 (m, 4H), 2.58 (m, 4H), 3.10-3.23 (m, 16H), 3.34 (m, 4H), 3.48 (m, 4H), 3.53 (s, 4H), 3.85 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.05 (s, 8H), 5.07 (overlapping bd t, 2H), 5.15 (bd t, 2H), 7.30 (m, 20H), 7.40 (bd t, 2H), 8.60 (bd t, 2H).
[0161]
<Compound 35>
613 mg (0.41 mmol) of compound16A solution of EtOH (20.3 mL) and cyclohexene (10.1 mL) was stirred and purged with nitrogen. 20 mg of 10% Pd carbon (Aldrich) was added and the mixture was heated in an 85 ° C. oil bath for 1.5 hours. When cooling, this mixture is 50/50 H₂The flask and filter were rinsed by filtration through diatomaceous earth using O / acetone. The filtrate was concentrated under reduced pressure to yield 448 mg (114%) of compound35Was obtained as a waxy solid:¹H NMR (D₂O) d 1.39 (m, 16H), 1.59 (m, 16H), 2.57 (t, 4H), 2.65 (t, 4H), 2.88 (t, 8H), 3.23 (t, 4H), 3.29 (t, 4H ), 3.42 (t, 4H), 3.65 (t, 4H), 3.71 (s, 4H), 4.06 (s, 4H), 4.30 (s, 4H).
[0162]
<Compound 17>
NaHCO_Three 546 mg (6.50 mmol), 445 mg (0.406 mmol) of compound35H₂To the O (9.5 mL) solution. To the resulting mixture, 838 mg (3.25 mmol) of compound10Of dioxane (14.4 mL) was added. The mixture is stirred at room temperature for 7 hours and 0.1 N H₂SO_Four(50mL) and CH₂Cl₂(50 mL). CH₂Cl₂Discard the layer and CH₂Cl₂ 2 in 50mL, 9/1 CH₂Cl₂/ MeOH 2 times with 50mL each, 4/1 CH₂Cl₂1/50 mL of MeOH, and 3/2 CH₂Cl₂Extracted once with 50 mL of MeOH. Combine the extracts and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to give 282 mg of a solid. EtOH / EtOAc / Et₂143 mg (24%) of the compound by crystallization from O17Was obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three/ MeOH) d 1.33 (m, 16H), 1.55 (m, 16H), 2.55 (m, 8H), 3.21 (m, 16H), 3.39 (m, 4H), 3.55 (m, 4H), 3.81 (s, 8H), 3.95 (s, 4H), 4.12 (s, 4H). Analytical value: C₅₄H₉₄N₁₂0₁₄Br_FourCalculated for: C, 44.57; H, 6.51; N, 11.55; Br, 21.97. Found: C, 45.85; H, 6.49; N, 11.37; Br, 19.90.
[0163]
<Compound 18- [1,5-bis (N-carbobenzyloxy-6-aminohexanoamido) -3-azapentane]>
Carboninediimidazole (3.09 g, 19.0 mmol) was added to a solution of N-carbobenzyloxy-6-aminohexanoic acid (5.05 g, 19.0 mmol) in EtOAc (25 mL) at room temperature. The mixture was stirred for 15 hours, then 1.02 mL (982 mg, 9.52 mmol) diethylenetriamine was added followed by Et_ThreeN 2.65 mL (1.93 g, 19.0 mmol) was added. The resulting mixture was stirred for 4 hours and the solid product was collected by filtration. 4.27 g (75%) of compound by recrystallization (MeOH / EtOAc)18Was obtained as a finely divided solid: m.p. 132-133 ° C .;¹H NMR (CDCl_Three) d 1.33 (m, 4H), 1.52 (m, 4H), 1.64 (m, 4H), 2.18 (t, 4H), 2.73 (t, 4H), 3.16 (m, 4H), 3.35 (m, 4H) , 4.96 (bd s, 2H), 5.09 (s, 4H), 6.13 (bd s, 2H), 7.33 (s, 10H); analysis value: C₃₂H₄₇N_Five0₆Calculated for: C, 64.29; H, 7.50; N, 11.72. Found: C, 63.54; H, 7.75; N, 11.91.
[0164]
<Compound 19>
657 μL (880 mg, 3.2 mmol) of triethylene glycol-bis-chloroformate (Aldrich) to 4.86 g (8.1 mmol) of compound18To a solution of pyridine (162 mL) in a 20 ° C. water bath. This mixture immediately formed a precipitate. The mixture was stirred for 16 hours and the resulting cloudy yellow solution was concentrated under reduced pressure. The concentrate was partitioned between EtOAc (150 mL) and two 1N HCl (150 mL each) to ensure that the aqueous layer was acidic. The aqueous layers were combined and extracted with a second EtOAc (150 mL). The EtOAc layers were combined, dried (MgSO4), filtered and concentrated. The obtained residue was crystallized (EtOAc / hexane / CHCl_Three), 1.92 g (43%) of compound19Was obtained as slightly yellow fine crystals: m.p. 86-91 ° C .;¹H NMR (CDCl_Three1.31 (m, 8H), 1.52 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.20 (m, 8H), 3.20 (m, 8H), 3.39 (s, 16H), 3.62 (s, 4H), 3.68 (m, 4H), 4.26 (m, 4H), 5.08 (s, 8H), 5.32 (bd s, 4H), 7.31 (bd s, 4H), 7.37 (s, 20H);¹³C NMR (CDCl_Three) d 25.1, 26.2, 26.4, 29.6, 36.0, 36.2, 38.5, 38.8, 40.8, 64.5, 66.4, 69.1, 70.3, 128.0, 128.4, 136.7, 156.5, 156.9, 173.6; analysis value: C₇₂H₁₀₄N_Ten0₁₈Calculated for: C, 61.87; H, 7.50; N, 10.02. Found: C, 61.68; H, 7.63; N, 9.95.
[0165]
<Compound 36>
Cyclohexene 3.5mL, 800mg (0.57mmol) compound19To a solution of absolute EtOH (5 mL). The solution was allowed to stand under nitrogen, 500 mg of 10% Pd carbon was added, and the resulting mixture was refluxed with stirring for 2 hours. Upon cooling, the mixture is filtered through diatomaceous earth and concentrated to give 500 mg (100%) of compound36Was obtained as an oil:¹H NMR (50/50 CDCl_Three/ CD_ThreeOD) d 1.21 (m, 8H), 1.49 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.19 (t, J = 7.4Hz, 8H), 2.67 (t, J = 7.4Hz, 8H), 3.36 ( bd s, 16H), 3.67 (s, 4H), 3.71 (m, 4H), 4.21 (m, 4H).
[0166]
<Compound 20>
NaHCO_Three 3.9 g (46.4 mmol) to 5.0 g (5.8 mmol) of compound36Dioxane (37.5 mL) and H₂To a solution with O (12.5 mL). The mixture is cooled to 0 ° C. in an ice bath and 4-nitrophenyl bromoacetate (compound10) 8.7 g (34.8 mmol) was added. The mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour and 1N H₂SO_Four 50 mL was added gently. The mixture was extracted 3 times with EtOAc (50 mL portions). The EtOAc extract is discarded and the aqueous layer is 20/80 MeOH / CH.₂Cl₂Extracted 6 times (50 mL each). MeOH / CH₂Cl₂Combine the layers and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated. The residue was chromatographed on silica gel (step gradient 9/1 CH₂Cl₂/ MeOH then 85/15/5 CH₂Cl₂/ MeOH / THF) to yield 3.62 g (46%) of compound20Was obtained as a white solid: m.p. 66.0-70.5 ° C. Analytical sample for preparative HPLC (C₁₈Reversed phase column, gradient 25/75 / 0.1 to 35/65 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂O / CF_ThreeCO₂H for 50 minutes at 225 nm) to give a clear oil. The oil was allowed to stand under reduced pressure to give a white solid: m.p. 87-89 ° C .;¹H NMR (CDCl_Three) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.64 (m, 8H), 2.26 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (bd s, 16H), 3.66 (s, 4H ), 3.70 (m, 4H), 3.89 (s, 8H), 4.19 (m, 4H);¹³C NMR (CDCl_Three) d 25.1, 26.2, 28.8, 29.0, 38.5, 39.1, 40.0, 47.8, 48.3, 64.7, 69.1, 70.3, 157.0, 166.3, 174.9; MS (FAB) m / e (relative strength) MH + [1341 (25), 1343 (60), 1345 (70), 1347 (56), 1349 (21)], 705.6 (100); analysis value: C₄₈H₈₄N_TenO₁₄Br_FourCalculated for: C, 42.86; H, 6.29; N, 9.27; Br, 23.77. Found: C, 42.15; H, 6.28; N, 9.87; Br, 25.33.
[0167]
<Compound 21- [Tetrakis- (2-cyanoethoxymethyl) methane]>
This compound was prepared analogously to the reported method (Bruson, H.A., US Pat. No. 2,401607; June 4, 1946). Acrylonitrile (27.3 mL, 21.8 g, 411 mmol) was stirred with pentaerythritol 8.0 g (58.8 mmol) and 40% benzyltrimethylammonium hydroxide aqueous solution 1.76 mL.₂To the O (50 mL) solution. Equipped with a reflux condenser and the mixture was N₂With stirring under atmosphere, the mixture was heated at 40 ° C. for 16 hours and then at 60 ° C. for 24 hours. Upon cooling, the mixture was acidified with 1 mL of concentrated HCl and transferred to a separatory funnel. Collect the oil that has settled to the bottom, and₂Cl₂ Extracted 3 times with 40 mL each. The oil and the combined extracts are dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 23.5 g of oil. Biscyanoethyl ether was removed by Khugelrhor distillation at 110 ° C. and 0.25 torr. Pot residue to H₂8.43 g (41%) of compound crystallized from O 1L21Was obtained as white needles: m.p. 42.5 ° C [(Macromolecules 1991, 24, 1443-1444.) Reported as 39-40 ° C];¹H NMR (CDCl_Three) d 2.61 (t, J = 6Hz, 8H), 3.50 (s, 8H), 3.6 (t, J = 6Hz, 8H).
[0168]
<Compound 22- [Tetrakis- (2-carboxyethoxymethyl) methane]>
5.0 g (14.35 mmol) of compound21Of concentrated HCl (21.5 mL) was stirred at 75 ° C. for 3 h. During this time, a white precipitate formed. The aqueous HCl solution was removed under reduced pressure and the mixture was washed with H₂Concentrated twice from O (25 mL each). 9.68 g of the resulting solid material is loaded onto a 45 mm ID column containing 16.5 cm of a DOW-1-X2 resin bed in the form of hydroxide and the column is H₂Eluted with 200 mL O and then 1N HCl. TLC (80/20/1 CH_ThreeCN / H₂The fraction containing the product, designated O / HOAc), was concentrated to give 1.21 g (21%)22Was obtained as an oil:¹H NMR (D₂O) d 2.46 (t, J = 6Hz, 8H), 3.22 (s, 8H), 3.55 (t, J = 6Hz, 8H).
[0169]
<Compound 23>
Thionyl chloride 3.71 mL (6.06 g, 50.8 mmol) was converted into 1.12 g (2.85 mmol) of compound.22To a THF (7.0 mL) solution. The mixture was stirred at room temperature for 3 hours and the solvent was removed under reduced pressure. The crude acid chloride was dissolved in THF (7 mL). This solution is then_ThreeN 2.12 mL (1.54 g, 15.24 mmol) was added. N this mixture₂Stirred under and cooled to 0 ° C. 3.60 g (12.74 mmol) of compound4Of THF (5 mL) was added over 1 min. The cooling bath was removed and the mixture was stirred at room temperature for 5.5 hours, then partitioned between 1N HCl (25 mL) and 4 EtOAc (25 mL each). The EtOAc layers were combined, washed with brine and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 3.46 g of a viscous oil. Silica gel chromatography (95/5 CH₂Cl₂/ MeOH) to give 1.26 g (30%) of compound23Was obtained as a viscous oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.40 (t, 8H), 3.29 (s, 8H), 3.35 (m, 16H), 3.48-3.77 (m, 48H), 5.12 (s, 8H), 5.60 (bd, 4H), 6.85 (bd, 4H), 7.34 (s, 20H).
[0170]
<Compound 37>
Cyclohexene 4.0mL and 10% Pd carbon 83mg, N₂Under 142 mg (0.093 mmol) of compound23To a solution of EtOH (8.4 mL). The mixture is refluxed with stirring in an oil bath at 90 ° C. for 3 hours and, on cooling, filtered through diatomaceous earth and washed with CH.₂Cl₂Was used to wash the filter and flask. Concentrate the filtrate to 70 mg (78%) of the compound37Was obtained as an oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.90 (t, 8H), 3.33 (s, 8H), 3.45 (t, 8H), 3.52-3.73 (m, 48H).
[0171]
<Compound 24>
NaHCO_Three 40 mg (0.48 mmol) and 104 mg (0.40 mmol) compounds1070 mg (0.098 mmol) of compound37Dioxane (2 mL) and H₂To a solution with O (0.67 mL). The mixture is stirred at room temperature for 17 hours and 1N H₂SO_Four Add 0.5 mL and bring the pH to 4. The mixture was concentrated and the concentrate was purified by chromatography on G-10 Sephadex® (MeOH). Fractions containing product were concentrated under reduced pressure to give 91 mg of oil. HPLC (C₁₈, Gradient 20/80 / 0.1 to 35/65 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂O / CF_ThreeCO₂19 mg (44%) of the compound by purifying 36 mg of the crude product by H)24Was obtained as an oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.50 (t, 8H), 3.31 (s, 8H), 3.36-3.72 (m, 56H), 3.91 (s, 8H);¹³C NMR (CDCl_Three) d 28.8, 36.5, 39.7, 40.0, 67.2, 69.3, 69.5, 70.3, 166.6, 173.0. MS (FAB) m / e (relative strength) MH⁺ [1425 (15), 1427 (63), 1429 (75), 1431 (64), 1433 (12)], 577 (100).
[0172]
<Compound 25a- [PEG₃₃₅₀Bis-tosylate] ＞
6.47 mL of pyridine was dried by azeotropic distillation (toluene) polyethylene glycol (J.T. Baker, average molecular weight 3350 g / mol) 16.75 g (5.0 mmol) of CH₂Cl₂ Added to the solution in 40 mL. The solution was left under nitrogen and cooled to 0 ° C. Tosyl chloride 7.63 g (40 mmol) CH₂Cl₂(40 mL) solution was added over 25 minutes. The cooling bath was removed and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Shake the mixture with 80 mL of 1N HCl and CH containing emulsion.₂Cl₂Layer H₂Washed with 100 mL O. CH₂Cl₂The layer is dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated. This residue is CH₂Cl₂/ Et₂16.82 g (92%) of compound crystallized from O25aWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.50 (s, 6H), 3.48 (t, J = 5Hz, 4H), 3.55-3.77 (m, greater than 600H, too large and inaccurate integral value), 3.83 (t, J = 5Hz, 4H) , 7.44 (d, J = 7Hz, 4H), 7.94 (d, J = 7Hz, 4H).
[0173]
<Compound 26a- [diazide-PEG₃₃₅₀] ＞
10.83 g (2.96 mmol) of compound25aAnd NaN_Three A solution of 1.92 g (29.6 mmol) in DMF (30 mL) is added to N₂Under heating in an oil bath at 120 ° C. for 3 hours. When cooling, mix this mixture with H₂O (100 mL) and CH₂Cl₂(100 mL). CH₂Cl₂CH layer₂Cl₂Diluted to 200 mL and washed with 100 mL of 1N HCl, dried (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated. The resulting waxy solid is recrystallized (CH₂Cl₂/ Et₂O) and the resulting solid was chromatographed on silica gel (gradient 98 / 2-95 / 5 CH₂Cl₂Further purification with 4.75 g (47%) of compound26aWas obtained as a waxy solid: TLC Rf 0.41 (9/1 CH₂Cl₂);¹H NMR (CDCl_Three) d 3.35 (t, J = 5Hz, 4H), 3.44 (t, J = 5Hz, 2H), 3.54-3.77 (m, approximately 300H, too large and inaccurate integral value), 3.79 (t, J = 5Hz , 2H).
[0174]
<Compound 27a- [diamino-PEG₃₃₅₀] ＞
10% Pd carbon (Aldrich) 473 mg, 4.75 g (1.39 mmol) compound26aTo a solution of EtOH (140 mL). This mixture is 60 psi H₂Shake for 30 hours under. The reaction was incomplete (TLC, 9/1 CH₂Cl₂/ MeOH), an additional 473 mg of 10% Pd carbon is added, and the mixture is added to 60 psi H₂Shake for a further 5 hours. The mixture is then filtered through diatomaceous earth, concentrated under reduced pressure, and the concentrate crystallized (CH₂Cl₂/ Et₂O), 4.03 g (86%) of compound27aWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.92 (t, 4H), 3.49 (t, 2H), 3.66 (t, 4H), 3.67 (m, approximately 300H, too large and inaccurate integral value), 3.86 (t, 2H).
[0175]
<Compound 28- [N-hydroxysuccinimidyl ester of Compound 7]>
596 mg (2.89 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide, 1.84 g (2.41 mmol) of compound7And NHS 278 mg (2.41 mmol) in THF (12 mL) solution₂Added at 0 ° C under. The cooling bath was removed and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. To this mixture was added 250 μL of acetic acid. Stirring was continued for 1 hour at room temperature. The mixture was then left in the refrigerator for 2 hours. The solid was removed by filtration and the filtrate was concentrated to give 2.27 g (110%) of the crude compound28Was obtained as a viscous oil. Compound28This compound was difficult to purify so as not to decompose28Was used directly to acylate diamino-PEG.
[0176]
<Compound 29a>
900 mg (1.05 mmol) of compound28Solution of dioxane (4.68 mL) in 877 mg (0.26 mmol) of compound27aAnd NaHCO_Three H with 176 mg (2.10 mmol)₂To a solution of O (3.12 mL) at 0 ° C. The mixture was stirred for 2 hours, then 1N HCl (25 mL) and 2 CH.₂Cl₂(25 mL each). CH₂Cl₂Combine the layers and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to a viscous oil. Silica gel chromatography (gradient, 95 / 5-87 / 13 CH₂Cl₂695 mg (55%) of the compound29aWas obtained as a waxy solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.55 (bd, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.44-3.72 (m, approximately 432H, too large and inaccurate integral value), 3.89 (s, 4H), 4.03 (s,
4H), 5.09 (s, 8H), 7.36 (s, 20H).
[0177]
<Compound 38a>
7.1 mL of cyclohexene, 688 mg (0.142 mmol) of compound29aN in EtOH (14.2 mL) solution₂Added below. 284 mg of 10% Pd carbon was added and the resulting mixture was refluxed for 2 hours. Upon cooling, the mixture was filtered through diatomaceous earth with EtOH and the filtrate was concentrated under reduced pressure to give 550 mg (90%) of the compound38aWas obtained as a waxy solid:¹H NMR (CDCl_Threed 2.58 (m, 8H), 2.93 (m, 8H), 3.38-3.76 (m, approximately 550H), 4.00 (s, 4H), 4.13 (s, 4H).
[0178]
<Compound 30a>
268 mg (1.04 mmol) of compound10Of dioxane (4.65 mL) in 550 mg (0.13 mmol) of compound38aAnd NaHCO_Three H with 175 mg (2.08 mmol)₂To the O (3.11 mL) solution was added at 0 ° C. The mixture is stirred for 20 hours and 1N H₂SO_Four(50mL) and 2 CH₂Cl₂(50 mL each). CH₂Cl₂Combine the layers and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to an oil. Purification by G-10 Sephadex® chromatography (MeOH) gave an amorphous solid. Crystallize this solid (EtOH / Et₂O), 378 mg (61%) of compound30aWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.59 (bd s, 8H), 3.38-3.82 (m, approximately 500H, too large and inaccurate integral value), 3.88 (s, 8H), 3.98 (s, 4H), 4.10 (s, 4H); Bromoacetyl measurement method (European Journal of Biochemistry, 1984,14063-71): calculated, 0.84 mmol / g; found, 0.50 mmol / g.
[0179]
<Compound 25b- [PEG₈₀₀₀Bis-tosylate] ＞
2.3 mL (16.5 mmol) of triethylamine followed by 3.15 g (16.5 mmol) of TsCl was dried by azeotropic distillation (toluene).₈₀₀₀(Aldrich, average molecular weight 8000 g / mmol) 12.0 g (1.5 mmol) of CH₂Cl₂ Added to the solution in 30 mL. The mixture was stirred at room temperature for 18 hours and extracted four times with 1N HCl (50 mL portions) and then once with saturated NaCl solution (50 mL). CH₂Cl₂Dry the layer (Na₂SO_Four), Filtered, and concentrated under reduced pressure to give a waxy solid. Recrystallization (CH₂Cl₂/ Et₂O), 11.0 g (92%) of the compound25bWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.38 (s, 6H), 3.40-3.89 (m, approximately 800H, too large and inaccurate integral value), 4.14 (m, 4H), 7.34 (d, J = 8.2Hz, 4H), 7.79 (d ,
J = 8.2Hz, 4H).
[0180]
<Compound 26b- [PEG₈₀₀₀Diazide] ＞
NaN_Three 1.86 g (28.6 mmol) of 10.8 g (1.3 mmol) of compound25bTo a dry DMF (30 mL) solution. N this mixture₂Under heating at 120 ° C. for 2.5 hours. When cooling, mix this mixture with CH₂Cl₂(240 mL) and 3 0.5N HCl (50 mL each). CH₂Cl₂Wash the layer with saturated NaCl solution (50 mL) and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to give a solid. Chromatography on silica gel (gradient 2 / 98-6 / 94 MeOH / CH₂Cl₂) And the purified product is recrystallized (MeOH / Et₂O) to give 6.95 g (66%) of compound26bWas obtained as a white solid: TLC (Rf = 0.33, 12/88 MeOH / CH₂Cl₂);¹H NMR (CDCl_Three) 3.39-3.86 (m).
[0181]
<Compound 27b- [Diamino-PEG₈₀₀₀] ＞
6.9 g (0.86 mmol) of compound26bA solution of MeOH (150 mL) saturated with ammonia was purged with nitrogen. Add 1.5 g of 10% Pd carbon and add this mixture to 65 psi H₂Shake down. After 20 hours, TLC analysis indicated that the reaction was incomplete. As a result, 200 mg of 10% Pd carbon is added and 65 psi of H₂The shaking was continued for an additional 20 hours. The mixture was filtered through diatomaceous earth and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The resulting waxy solid is recrystallized (MeOH / Et₂O), 6.0 g (89%) of compound27bWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.96 (t, J = 5.1Hz, 4H), 3.40-3.89 (m, approximately 700H, too large and inaccurate integral value).
[0182]
<Compound 29b>
NaHCO_Three 221 mg (2.63 mmol) to 3.0 g (0.375 mmol) of compound27bTo a solution of water (10 mL) and dioxane (3 mL). Then 1.3 g (1.51 mmol) of compound dissolved in dioxane (10 mL)28Was added. The mixture was stirred for 24 hours and then 0.5N HCl (40 mL) was added. CH this mixture₂Cl₂Extracted 4 times (25 mL each). CH₂Cl₂The layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to an oil. MeOH / Et₂2.0 g (58%) of the compound by crystallization from O29bGot:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.52 (m, 8H), 3.40-3.64 (m, approximately 700H, too large and inaccurate integral value), 3.89 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 5.09 (s, 8H), 7.35 (s, 20H).
[0183]
<Compound 38b>
10% Pd carbon 123mg, 600mg (0.063mmol) compound29bTo a solution of anhydrous EtOH (5 mL) and cyclohexene (2.5 mL) was added under nitrogen. The mixture was refluxed for 2 hours under nitrogen. The reaction mixture was filtered through diatomaceous earth and evaporated to 549 mg (97%) of compound38bWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.58 (m, 8H), 2.90 (m, 8H), 3.39-3.70 (m, approximately 700H, too large and inaccurate integral value), 4.05 (s, 4H), 4.15 (s, 4H).
[0184]
<Compound 30b>
NaHCO_Three 100 mg (1.2 mmol), then 84 mg (0.32 mmol) of compound10529 mg (0.059 mmol) of the compound38bTo a solution of dioxane (2 mL) and water (5 mL). After stirring for 12 hours, the reaction was diluted with 1N H₂SO_FourAcidify with, and CHCl_ThreeExtracted 4 times (40 mL each). CHCl_ThreeThe layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 503 mg of a semi-solid residue. The residue was purified by chromatography on G-10 Sephadex® (MeOH) and crystallized (MeOH / Et₂O / hexane), 215 mg (39%) of compound30bWas obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.58 (m, 8H), 3.35-3.70 (m, approximately 700H, too large and inaccurate integral value), 3.89 (s, 8H), 4.01 (s, 4H), 4.16 (s, 4H); Bromo Acetyl measurement method (European Journal of Biochemistry, 1984,14063-71): Calculated, 0.42 mmol / g; found, 0.27 mmol / g.
[0185]
<Compound 31- [PEG₃₃₅₀-Bis-chloroformate] ＞
2 drops of dry pyridine, then 125 mg (0.418 mmol) of triphosgene, polyethylene glycol (J.T. Baker, average molecular weight 3350 g / mole) dried by azeotropic distillation (toluene) 1.0 g (0.249 mmol) of CH₂Cl₂ Added to the solution in 12 mL. The mixture was stirred at room temperature for 20 hours and the solvent was evaporated under reduced pressure to give 1.0 g (100%) of compound.31Was obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 3.40-3.65 (m, approx. 300H,
Integration value too large and not accurate), 3.77 (m, 4H), 4.46 (m, 4H).
[0186]
<Compound 32>
1.0 g (0.25 mmol) of compound315: 1 CH₂Cl₂/ Dioxane (12 mL) solution, 600 mg (1.0 mmol) of compound18Was added dropwise to a 50 ° C. solution of dioxane (10 mL) and pyridine (1.5 mL). The resulting cloudy solution was stirred for 72 hours. CH₂Cl₂(25 mL) was added and the mixture was then filtered. The filtrate was evaporated and the semi-solid residue was purified by chromatography on G-10 Sephadex®. The resulting solid was crystallized (CH₂Cl₂/ Et₂O), 829 mg (75%) of compound32Was obtained as a slightly yellow solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.30 (m, 8H), 1.40 (m, 8H), 1.61 (m, 8H), 2.18 (m, 8H), 3.17 (m, 8H), 3.40 (m, 16H), 3.62 (m, approx. 300H , Too large and inaccurate integral value), 4.15 (m, 4H), 5.07 (s, 8H), 7.33 (m, 20H).
[0187]
<Compound 39>
100 mg of 10% Pd carbon, 300 mg (0.065 mmol) of compound32To a solution of anhydrous EtOH (5 mL) and cyclohexene (2 mL) was added under nitrogen. The mixture was refluxed for 2 hours under nitrogen. The mixture is filtered through diatomaceous earth and the solvent is evaporated to yield 237 mg (90%) of compound39Was obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.37 (m, 8H), 1.48 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.21 (m, 8H), 2.50 (m, 8H), 3.39 (m, 16H), 3.64 (m, approx. 300H , Too large and not accurate), 4.19 (m, 4H).
[0188]
<Compound 33>
NaHCO_Three 125 mg (0.67 mmol) and 115 mg (0.44 mmol) compounds10225 mg (0.055 mmol)39To a solution of dioxane (5 mL) and water (5 mL). The resulting yellow solution was stirred at room temperature for 12 hours. This solution is then added to CH₂Cl₂Extracted 3 times (30 mL each). 1N H water layer₂SO_FourAcidify with and CH₂Cl₂Extracted 3 times (30 mL each). CH₂Cl₂The layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give a yellow oil. Purification by G-10 Sephadex® chromatography (MeOH) and recrystallization of the resulting oil (EtOH / Et₂O), 182 mg (73%) of compound33Was obtained as a white solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.35 (m, 8H), 1.55 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.22 (m, 8H), 3.28 (m, 8H), 3.42 (m, 16H), 3.50-3.64 (m, 300H, integral value too large and not accurate), 3.87 (s, 8H), 4.18 (m, 4H); Bromoacetyl measurement (European Journal of Biochemistry, 1984,140, 63-71): Calculated value, 0.87 mmol / g; Actual value, 0.73 mmol / g. Analytical value: C₁₉₁H₃₇₅O₈₇N_TenBr_FourCalculated for: C, 50.84; H, 8.33; N, 3.09; Br, 7.05. Found: C, 51.98; H, 8.34; N, 2.45; Br,
10.19.
[0189]
<Compound 40- [4-Nitrophenyliodoacetate]>
A solution of 5.15 g (25 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide and 2.92 g (2.92 mmol) of 4-nitrophenol in EtOAc (100 mL) was added to a solution of 3.72 g (20 mmol) of iodoacetic acid at 0 ° C. The mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour and at room temperature for 2 hours. The solid was removed by filtration and the filtrate was concentrated under reduced pressure. Recrystallize the resulting yellow solid (EtOAc / hexane / trace amount of HOAc) to yield 4.82 g (78%) of compound40Was obtained as a tan solid:¹H NMR (CDCl_Three) d 4.00 (s, 2H), 7.39 (d, 2H), 8.40 (m, 2H).
[0190]
<Compound 41>
NaHCO_Three 103 mg (1.22 mmol) followed by 211 mg (0.692 mmol) compound40110 mg (0.104 mmol) of compound34Dioxane (5 mL) and H₂To a solution with O (5 mL). The mixture was stirred for 18 hours and then concentrated under reduced pressure. 140 mg (87%) of the compound by purification on Sephadex® chromatography (MeOH)41Was obtained as an oil. Analytical sample for preparative HPLC (C₁₈, Gradient 20/80 / 0.1 to 25/75 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂O / TFA was prepared at 225 nm for 60 minutes:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.59 (m, 4H), 2.65 (m, 4H), 3.44-3.62 (m, 60H), 3.77 (s, 4H), 3.78 (s, 4H), 4.02 (s, 4H), 4.21 (s, 4H).
[0191]
<Compound 42>
N-methoxycarbonylmaleimide 145 mg (0.935 mmol), 171 mg (0.161 mmol) of compound34Dioxane (8 mL) and saturated NaHCO_ThreeSolution (2 mL) and H₂To a solution with O (2 mL) was added at 0 ° C. with vigorous stirring (The Practice of Peptide Synthesis, M. Bodansky and A. Bodansky, Springer-Verlag, New York, 1984, pp. 29-31. Keller, O., Rudinger,J. Helv. Chim, Acta 1975,58, 531.). After 15 minutes, 25 mL of dioxane was added, the cooling bath was removed, and stirring was continued at room temperature for 45 minutes. This mixture is mixed with CHCl_ThreeExtract twice with (30 mL each) and CHCl_ThreeThe layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to an oil. G-10 Sephadex® chromatography (MeOH) to purify 103 mg (45%) of compound42Was obtained as an oil. Analytical sample for preparative HPLC (C₁₈, Gradient 20/80 / 0.1 to 25/75 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂O / TFA was prepared at 225 nm for 65 minutes to give an oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.57 (m, 4H), 2.67 (m, 4H), 3.42-3.65 (m, 52H), 3.72 (m, 8H), 4.03 (s, 4H), 4.17 (s, 4H), 6.74 (s, 4H), 6.75 (s, 4H).
[0192]
<Compound 43- [hydroxymethyl-tris- (2-cyanoethoxymethyl) methane]> KOH 0.30 g (5.41 mmol), then acrylonitrile 23 mL (18.6 g, 350 mmol) were added to pentaerythritol 6.8 g (50 mmol) H₂To the O (50 mL) solution. The mixture is stirred at room temperature for 16 hours, acidified with 1.5 mL of concentrated HCl solution, and CH.₂Cl₂Extracted twice (50 mL each). This CH₂Cl₂The layers are combined and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 16.97 g of liquid. 8.49 g (51%) of the compound by purification by chromatography on silica gel (EtOAc)43Was obtained as a viscous oil: TLC, Rf = 0.15 (EtOAc);¹H NMR (CDCl_Three) d 2.62 (t, 6H), 3.54 (s, 6H), 3.68 (t, 6H), 3.70 (s, 2H).
[0193]
<Compound 44- [hydroxymethyl-tris- (2-carboxymethylethoxymethyl) methane]>
78 mL of MeOH saturated with HCl, 5.45 g (15.6 mmol) of compound43Added to. The mixture is heated at reflux for 1 hour and when cooled, H₂O (100 mL) and 4 Et₂Partitioned with O (100 mL each). Et₂Combine the O layers with saturated NaHCO_ThreeWash sequentially with solution (100 mL) and saturated NaCl solution (100 mL), and dry (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 4.74 g of a viscous liquid. 3.05 g (50%) of the compound purified by chromatography on silica gel44Was obtained as an oil: TLC, Rf = 0.27 (80/20 EtOAc / hexane);¹H NMR (CDCl_Three) d 2.58 (t, 6H), 3.43 (s, 6H), 3.61 (s, 2H), 3.69 (t, 6H), 3.70 (s, 9H);¹³C NMR (CDCl_Threed 34.8, 44.9, 51.6, 65.2, 66.9, 71.0, 172.1.
[0194]
<Compound 45>
560 mg (1.4 mmol) of compound44And 1.69 g (6.0 mmol) of compound4And the mixture was heated at 150 ° C. for 4 hours under nitrogen. The mixture was partitioned between EtOAc (50 mL) and 1N HCl (25 mL) and the HCl layer was separated into CH.₂Cl₂(25 mL). EtOAc and CH₂Cl₂Combine the extracted layers of_ThreeWash with solution and dry (K₂CO_Three), Filtered and concentrated to give a viscous residue. Chromatography on silica gel (gradient 95 / 5-90 / 10 CH₂Cl₂/ MeOH) to give 300 mg (19%) of the compound45Was obtained as a viscous oil: TLC, Rf = 0.24 (90/10 CH₂Cl₂/ MeOH);¹H NMR (CDCl_Three) d 2.40 (t, 6H), 3.38 (s, 6H), 3.39-3.48 (m, 12H), 3.52-3.67 (m, 32H), 5.13 (s, 6H), 5.62 (bd s, 3H), 6.80 (bd s, 3H), 7.40 (s, 15H).
[0195]
<Compound 46>
10% Pd carbon 104mg, 308mg (0.269mmol) compound45To a solution of EtOH (10.4 mL) and cyclohexene (5.2 mL) was added under nitrogen. A reflux condenser was attached and the mixture was heated in an 85 ° C. oil bath for 1.5 hours. Upon cooling, the mixture was filtered through diatomaceous earth and the filtrate was concentrated to give 177 mg of residue. This residue was partially dissolved in 5.98 mL of dioxane. The resulting mixture was dissolved in 386 mg (1.49 mmol) of compound10And then add this to NaHCO_Three 251 mg (2.99 mmol) H₂To the O (3.99 mL) solution. The resulting mixture was stirred under nitrogen for 18 hours and 1N HCl (25 mL) and 3 CH.₂Cl₂(25 mL each). 3/1 CH water layer₂Cl₂3 times with 1 / MeOH (25 mL each) and 1/1 CH₂Cl₂Extracted 3 times with / MeOH (25 mL each). First two CHs₂Cl₂Discard the extracts and combine the remaining extracts and dry (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to give 102 mg of a viscous oil. (C₁₈, 23/77 / 0.1 CH_ThreeCN / H₂O / CF_ThreeCO₂43 mg (14%) of the compound46Was obtained as a viscous oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 2.48 (t, 6H), 3.40 (s, 6H), 3.44-3.54 (m, 14H), 3.56-3.62 (m, 12H), 3.63 (s, 12H), 3.67 (t, 6H), 3.91 ( s, 6H), 6.90 (t, 3H), 7.10 (t, 3H); MS (FAB) m / e (relative intensity) MH⁺ [1103 (17), 1105 (42), 1107 (41), 1109 (18)], MNa⁺ [1125 (38), 1127 (100), 1129 (99), 1131 (39)].
[0196]
<Compound 47- [S- (6-hydroxyhexyl) isothiouronium chloride]>
11.1 g (146 mmol) of thiourea was added to a solution of 16.6 mL (20.0 g, 146 mmol) of 6-chlorohexanol in ethanol (49 mL) and the mixture was refluxed for 24 hours. The mixture was cooled to 0 ° C. and the product crystallized. The crystals were collected by vacuum filtration and dried to yield 28.4 g (92%) of compound47Was obtained as a white solid: mp 122-124 ° C;¹H NMR (DMSO) d 1.40 (m, 4H), 1.65 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.41 (t, 2H), 9.27 and 9.33 (overlapping wide singlets, 4H); Analytical value: C₇H₁₇ClN₂Calculated for OS: C, 39.51; H, 8.06; N, 13.17; S, 15.07. Found: C, 39.69; H, 8.00; N, 13.01; S, 15.16.
[0197]
<Compound 48- [6-Mercaptohexane-1-ol]>
NaOH pellet 9.25g, 17.8mg (83.6mmol) compound47H₂To a solution of O (120 mL) and EtOH (120 mL) was added. The mixture was refluxed for 4 hours. The mixture is carefully concentrated to approximately 75 mL and the concentrate is purified by vacuum distillation to yield 7.4 g (66%) of compound48Obtained: bp 95-105 ° C (5mmHg);¹H NMR (CDCl_Three) 1.41 (m, 9H), 2.59 (dt, 2H), 3.69 (t, 3H overlapping with brd s);¹³C NMR (CDCl_Three) d 24.5, 25.2, 28.0, 32.5, 33.9, 62.7; analysis value: C₆H₁₄Calculated for OS: C, 53.68; H, 10.51; S, 23.89. Found: C, 53.35; H, 10.72; S, 23.60.
[0198]
<Compound 49- [Bis- (6-hydroxyhexyl) disulfide]>
I₂ A solution of 4.02 g (15.8 mmol) in MeOH (90 mL) was added to 4.26 g (31.7 mmol) of compound.48MeOH (10 mL) and Et_ThreeN in solution with N (13.7 mL (9.97 g, 98.5 mmol))₂Added dropwise over 10 minutes under atmosphere and cooled in an ice bath. The cooling bath was removed and the mixture was stirred at ambient temperature for 4 hours. The mixture was concentrated on a rotary evaporator and purified by silica gel chromatography (1: 1 hexane / EtOAc) to give 3.12 g (73%) of compound49Was obtained as a pale yellow solid: TLC R_f 0.18 (1: 1 hexane / EtOAc); mp 38-48 ° C;¹H NMR (CDCl_Three) 1.15-2.20 (m, 16H), 2.73 (t, 4H), 3.70 (t, 4H); analysis value: C₁₂H₂₆S₂0₂Calculated for: C, 54.09; H, 9.84; S, 24.06. Found: C, 54.85, H, 9.86; S, 24.11.
[0199]
<Compound 50- [mono-O- (4 ′, 4 ″ -dimethoxytriphenylmethyl) -bis- (6-hydroxyhexyl) disulfide]>
3,4'-dimethoxytriphenylmethyl chloride 3.97g (11.7mmol), 3.12g (11.7mmol) compound49In pyridine (45 mL). The mixture was stirred at ambient temperature for 16 hours. Most of the pyridine is removed on a rotary evaporator and the residue is saturated NaHCO 3_ThreePartitioned between solution (100 mL) and EtOAc (100 mL). The EtOAc layer was washed with 50 mL of saturated NaCl solution and dried (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated to an oil. Silica gel chromatography (9: 1 CH₂Cl₂/ EtOAc) to give 2.84 g (43%) of compound50Was obtained as a viscous oil: TLC R_f 0.35 (9: 1 CH₂Cl₂/ EtOAc);¹H NMR (CDCl_Three1.41 (m, 8H). 1.65 (m, 8H), 2.70 (two overlapping triplets, 4H), 3.08 (t, 2H), 3.65 (t, 2H), 3.81 (s, 6H), 6.85 (d , 4H), 7.32 (m, 7H), 7.47 (d, 2H); HRMS (FAB, M +), C₃₃H₄₄0_FourS₂Calculated for: 568.2681. Found: 568.2665.
[0200]
<Compound 51- [O- [14- (4 ', 4' '-dimethoxytriphenylmethoxy) -7,8-dithiotetradecyl] -O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite] > O-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetra-isopropylphosphorodiamidite 458 mg (1.52 mmol) of CH₂Cl₂(0.5 mL) solution of 771 mg (1.36 mmol) of compound50And 116 mg (0.68 mmol) diisopropylammonium tetrazolide in CH₂Cl₂(6.8mL) N in solution₂Added under atmosphere. The mixture is stirred for 4 hours and NaHCO_Three(25mL) and CH₂Cl₂(3 × 25 mL). CH₂Cl₂The layers are combined, washed with saturated NaCl solution and dried (Na₂CO_Three), Filtered and concentrated to an oil. Filter through basic alumina (2 "plug) in a 25mm column, 9: 1 CH₂Cl₂/ Et_Three831 mg (80%) of compound purified by eluting with N51Was obtained as a viscous oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.25 (m, 12H), 1.45 (m, 8H), 1.70 (m, 8H), 2.72 (m, 6H), 3.09 (t, 2H), 3.65 (m, 4H), 3.87 (s, 6H) , 3.91 (m, 2H), 6.89 (d, 4H), 7.35 (m, 7H), 7.49 (d, 2H);³¹P NMR (15% H_ThreePO_FourWith CDCl as internal standard_Three147,69; HRMS (FAB, MH +), C₄₂H₆₂N₂O_FivePS₂Calculated for: 769.3839, found: 769.3853.
[0201]
<Compound 52- [Trityl-HAD alcohol]>
Trityl chloride 60g (0.21mol), 57g (0.21mol) compound49To a solution of pyridine (60 mL). The mixture was stirred at 100 ° C. for 19 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and filtered. The filtrate was diluted with 300 mL of methylene chloride and extracted with 200 mL of saturated sodium bicarbonate. Organic layer, Na₂SO_Four, Filtered and concentrated to an oil. Purification by silica gel chromatography (gradient 9: 1 hexane: ethyl acetate to 3: 1 hexane: ethyl acetate) gave 55 g (50%) of the compound52Got:¹H NMR (CDCl_Three) δ 1.38 (m, 8H), 1.63 (m, 8H), 2.66 (m, 4H), 3.04 (t, 2H), 3.62 (t, 2H), 7.25 (m, 9H), 7.42 (m, 6H) . HRMS (FAB, M +), C₃₁H₄₀O₂Calculated for S: 508.2470. Found: 508.2482.
[0202]
<Compound 53- [Trityl HAD phosphoramidite]>
10 g (19.7 mmol) of compound52Slowly add 4.5 mL (20.2 mmol) of 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoramidite to a solution of 6.3 mL (36.2 mmol) and diisopropylethylamine in methylene chloride (90 mL) at 0 ° C. under argon. It was. After stirring the mixture for 90 minutes, the reaction mixture was extracted twice with 100 mL each of saturated sodium bicarbonate. This methylene chloride solution is mixed with Na₂SO_Four, Filtered and concentrated to an oil. 11.3 g (81%) of the compound by purification with basic alumina chromatography (75: 24: 1, hexane: ethyl acetate: triethylamine)53Was obtained as an oil:¹H NMR (CDCl_Three) δ 1.18 (m, 12H), 1.37 (m, 8H), 1.62 (m, 8H), 2.6 (m, 6H), 3.04 (t, 2H), 3.60 (m, 4H), 3.82 (m, 2H) , 7.26 (m, 6H), 7.44 (m, 9H). HRMS (FAB, MH +), C₄₀H₅₈N₂O_ThreePS₂Calculated for: 709.3626. Found: 709.33621.
[0203]
<Compound 54- [O- (tert-butyldimethylsilyl) -5-hexenol]>
15.66 g (230 mmol) of imidazole and 20.0 g (130 mmol) of tert-butyldimethylsilyl chloride were added to a solution of 12.47 mL (10.4 g, 104 mmol) of 5-hexen-1-ol in DMF (104 mL). The mixture was stirred at ambient temperature for 4 hours and EtOAc (200 mL) and saturated NaHCO._ThreePartitioned with solution (100 mL). EtOAc layer with saturated NaHCO_ThreeWash with 100 mL solution, 100 mL saturated NaCl solution and dry (MgSO_Four), Filtered and concentrated to a volume of approximately 100 mL. 70.07 g (90%) of the compound by distillation under reduced pressure54Obtained: bp 130-143 ° C. (100 mmHg);¹H NMR (CDCl_Three) 0.11 (s, 6H), 0.95 (s, 9H), 1.48 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 2.11 (dt, 2H), 3.66 (t, 2H), 5.03 (m, 2H), 5.86 (m, 1H);¹³C NMR (CDCl_Three) -5.25, 18.40, 25.21, 26.01, 32.35, 33.60, 63.09, 114.40, 138.92; analysis value: C₁₂H₂₆Calculated for OSi: C, 67.22; H, 12.22. Found: C, 66.96; H, 12.16.
[0204]
<Compound 55- [1-O- (tert-butyldimethylsilyl) -1,5,6-hexanetriol]>
9.86 g (46.0 mmol) of compound54In acetone (92 mL) was added 6.46 g (55.2 mmol) of N-methylmorpholine oxide in H₂O (23 mL) solution was added. To this mixture, 2.5% OsO_Four443 μl of tert-butyl alcohol solution (solution 360 mg, OsO_Four 9.0mg, 35μmol) and 30% H₂O₂ 50 μL was added. The mixture was stirred for 16 hours and 474 mg of sodium dithionite H₂O (14 mL) solution was added. After another 0.5 h, the mixture was filtered through celite. The filtrate is MgSO_Four, Filtered through 1 "silica gel in 150 mL of buchner funnel and eluted with 250 mL portions of EtOAc. The product containing fractions were concentrated to 11.0 g (96%) of55Was obtained as a viscous oil: TLC R_f 0.2 (1: 1 hexane / EtOAc);¹H NMR (CDCl_Three) 0.05 (s, 6H), 0.89 (s, 9H), 1.25 (m, 4H), 1.55 (m, 2H), 3.41 (dd, 2H), 3.62 (t, 2H), 3.71 (m, 1H);¹³C NMR (CDCl_Three) -5.23, 18.42, 21.91, 26.02, 32.68, 32.81, 63.16, 66.74, 72.24; HRMS (FAB, MH +), C₁₂H₂₉O_ThreeCalculated for Si: 249.1886. Found: 249.1889.
[0205]
<Compound 56- [5,6- (bis-O-benzoyl) -1-O- (tert-butyldimethylsilyl) -1,5,6-hexanetriol]>
Benzoyl chloride 6.18mL (7.48g, 53.2mmol), 5.29g (21.3mmol)55To a solution of pyridine (106 mL). The mixture was stirred for 18 hours and concentrated on a rotary evaporator. The mixture was partitioned between cold 1N HCl (100 mL) and EtOAc (100 mL). The pH of the aqueous layer was checked to ensure acidity. EtOAc layer to H₂Wash sequentially with 100 mL O and 100 mL saturated NaCl, and dry (MgSO_Four), Filtered and concentrated to 10.33 g (99%) of compound56Was obtained as a viscous yellow oil: TLC R_f 0.45 (1: 4 EtOAc / hexane);¹H NMR (CDCl_Three) d 0.05 (s, 6H), 0.88 (s, 9H), 1.59 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 3.14 (t, 2H), 4.49 (dd, 1H), 4.59 (dd, 1H) , 5.54 (m, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H).
[0206]
<Compound 57- [5,6- (bis-O-benzoyl) -1,5,6-hexanetriol]>
A THF solution of 10.7 mL (10.7 mmol) of 1N tetrabutylammonium fluoride was added to 2.62 g (5.36 mmol) of THF.56To a THF (10.9 mL) solution. The mixture was stirred for 16 hours. The mixture is saturated NaHCO_ThreePartitioned between solution (25 mL) and EtOAc (3 × 25 mL). The EtOAc extracts were combined, washed with saturated NaCl solution and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to a viscous oil. This oil was purified by silica gel chromatography (1: 1 hexane / EtOAc) to give 823 mg (41%) of compound57Was obtained as a viscous oil: R_f 0.14 (1: 1 hexane / EtOAc);¹H NMR (CDCl_Three) d 1.58 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 3.68 (t, 2H), 4.52 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.56 (m, 1H) , 7.46 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H);¹³C NMR (CDCl_Three) d 22.08, 31.20, 31.30, 32.88, 62.92, 66.17, 72.63, 128.93, 130.19, 130.57, 133.62, 166.72, 166.86; HRMS (FAB, MH +), C₂₀H_{twenty three}O_FiveCalculated for: 343.1545. Found: 343.1553.
[0207]
<Compound 58- [O- [5,6- (bis-O-benzoyloxy) -hexyl] -O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropyl phosphoramidite]>
O-cyanoethyl-N, N, N ', N'-tetraisopropyl phosphorodiamidite 989 mg (3.28 mmol) CH₂Cl₂(2.0 mL) solution of 1.02 g (2.98 mmol)57And diisopropylammonium tetrazolide 255 mg (1.49 mmol) (diisopropylamine in acetonitrile and tetrazole were mixed in a 1: 1 molar ratio and concentrated to prepare a white solid).₂Cl₂(14.9 mL) was added to the solution. The mixture is stirred for 4 hours and then CH₂Cl₂(25 mL) and cold saturated NaHCO_ThreePartitioned with solution (25 mL). CH₂Cl₂The layer is washed with saturated NaCl solution and dried (Na₂SO_Four), Filtered and concentrated. Filter through basic alumina (2 "plug) in a 25mm column, 9: 1 EtOAc / Et_ThreePurified by eluting with N to give 1.5 g (93%) of compound58Was obtained as a viscous oil:¹H NMR (CDCl_Three) d 1.19 (m, 12H), 1.62 (m, 2H), 1.73 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.62 (dd, 2H), 3.53-3.92 (m, 6H), 4.53 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.58 (m, 1H), 7.48 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 8.09 (m, 4H);³¹P NMR (15% H_ThreePO_FourWith CDCl as internal standard_Three) d 148.2; HRMS (FAB, MH +), C₂₉H₄₀O₆N₂Calculated for P: 543.2624. Found: 543.2619.
[0208]
<Compound 59- [4 (iodoacetamido) benzoic acid]>
Weltman, J.K., 1983Biotechniques This compound was prepared as described in 1: 148-152. Briefly, 708 mg (2.0 mmol) iodoacetic anhydride was added to a solution of 137 mg (1.0 mmol) paraaminobenzoic acid in dioxane (10 mL). The mixture is stirred in the dark for 18 hours and H₂Partitioned between O (25 mL) and EtOAc (25 mL). The EtOAc layer was washed with saturated NaCl solution and dried (MgSO_Four), Filtered and concentrated to give 797 mg of a pink solid. Recrystallization from hexane / EtOAc gave 221 mg (72%) of 4- (iodoacetamido) benzoic acid as a white solid: mp 220-230 ° C .;¹H NMR (CDCl_Three) d 3.86 (s, 2H), 7.68 (d, 2H), 7.91 (d, 2H), 10.60 (s, 1H).
[0209]
<Compound 60- [4- (iodoacetamido) benzoyl derivative of α, ω-bis- (N-2-aminoethylcarbamoyl) polyethylene glycol]>
188 mg (0.909 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide was added to 185 mg (0.606 mmol) of 4- (iodoacetamido) benzoic acid and α, ω-bis- (N-2-aminoethylcarbamoyl) polyethylene glycol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., Dried by azeotropic distillation with toluene) and added to a solution of 406 mg (0.121 mmol) in THF (2 mL). The mixture was stirred for 2 hours and then 6 drops of acetic acid was added. CH₂Cl₂ 10 mL was added and the mixture was placed in the freezer for 30 minutes. The mixture was filtered to remove solids and the filtrate was concentrated to give a viscous residue. Silica gel chromatography (gradient 99/1 ~ 96/4 CH₂Cl₂/ MeOH) to give a solid. This solid was triturated with MeOH to give 292 mg of a pale yellowish white solid:¹H NMR (CDCl_Three) 3.48 (m, 8H), 3.63 (bd s, (CH₂CH₂O)_n, Too large to integrate), 3.98 (s, 4H), 4.18 (bd m, 4H), 5.91 (bd m, 2H), 7.48 (bd m, 2H), 7.76 (d, 4H), 7.88 (d , 4H), 9.38 (bd m, 2H): Iodoacetyl measurement method (European Journal of Biochemistry 1984,140,
63-71): calculated, 0.46 mmol / g; found, 0.37 mmol / g.
[0210]
Example 3: Preparation of active binding hand platform molecules and complexes
There are many ways to form a complex of a biological or chemical molecule and a bond platform molecule. Certain methods include thiol binding to a reactive “thiophilic” group on a bond platform molecule using a thiol bound to a biological or chemical molecule to form a thioether bond. Other combinations of reactive groups on the platform molecule and reactive groups on the biological or chemical molecule can also share the biological or chemical molecule with the bond platform molecule It can be used for binding. Table 1 lists some combinations of interacting groups. Which of the given methods is preferentially performed is determined by the nature of the biological or chemical molecule (solubility, presence of other reactive groups, etc.).
[0211]
[Table 1]

[0212]
The examples described below illustrate methods for synthesizing various bond platform molecules and for complexing the molecules with biological or chemical molecules. These examples show how peptides and oligonucleotides can be complexed with a bond platform molecule using the reactive groups in Table 1. In addition to peptides and oligonucleotides, other biological molecules (proteins, drugs, etc.) can also be complexed with the bond platform molecules.
[0213]
(Combination 1: Thiophilic group of platform thiol-ligand)
[0214]
Embedded image

[0215]
<Compound A>
Compound36(861 mg, 1.0 mmol) and NaHCO_Three 252 mg (3.0 mmol) of 1/1 dioxane / H₂O Dissolve in 20 mL. The mixture is cooled to 0 ° C. and a solution of 1.16 g (5.0 mmol) of N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (Prochem Inc.) in dioxane (40 mL) is added with stirring of the mixture. After 1 hour, the mixture was washed with CH₂Cl₂Extract with Total amount of extract is MgSO_Four, Filtered and concentrated. The crude product is purified by silica gel chromatography,AGet.
[0216]
<Compound B-4 platform having two thiol groups>
A A 732 mg (0.55 mmol) solution of DMSO (7.3 mL) was added to a pH 10 buffer solution (100 mM sodium carbonate, 10 mM NH).₂OH) Add to 55 mL. N this mixture₂Place under gas and stir for 1 hour, about 10 mM tetrathiol platformBA solution of
[0217]
<Compound X-bromoacetylated peptide>
Peptides are synthesized by standard solid phase method on Wang (p-alkoxybenzyl) resin using FMOC chemistry method. Amino acids protected with FMOC (fluorenylmethoxycarbonyl) are added sequentially to the amino terminus. The final step involves the coupling of N-bromoacetylaminocaproic acid. Removing the protecting group, removing the peptide from the resin with trifluoroacetic acid,XThis is purified by preparative reverse phase HPLC.
[0218]
<Peptide-platform complex, C>
Tetrathiol platformBAbout 10 mmol solution of bromoacetylated peptide in pH 10 bufferXAdd an excess of DMSO solution. Peptide complexCIs purified by preparative reverse phase HPLC.
[0219]
(Combination 2: Platform Carboxyl-Peptide Active Carboxylate)
[0220]
Embedded image

[0221]
<Compound Y-peptide having active carboxylate>
Peptides are synthesized by standard solid phase method on Wang (p-alkoxybenzyl) resin using TFA-stable protecting groups (benzyl ester for carboxyl group and CBZ for amino group). Amino acid residues are added sequentially to the amino terminus. Removal of the peptide from the resin with TFA yields a peptide having one free carboxyl group at the carboxy terminus and all other carboxyls and amines blocked. Protected peptideYIs purified by reverse phase HPLC.
[0222]
<Peptide-Platform Complex D>
CompoundY(0.3 mmol) is dissolved in 1 mL of DMF, and 0.3 mmol of diisopropylcarbodiimide and 0.3 mmol of HOBT (hydroxybenzotriazole) are added to this solution. This solution is added to the tetraamino platform36 Add to 0.025 mmol DMF (1 mL) solution. When the reaction is complete, DMF is removed under reduced pressure to yield a crude, fully protected complex. The complex is dissolved in MeOH and the solution is placed in a Parr hydrogenator with 100 mg of 10% Pd carbon per gram of complex. Mix the mixture to 60 psi H₂Shake down and deprotected complexDIs purified by preparative reverse phase HPLC.
[0223]
(Combination 3: Platform amine-oligonucleotide aldehyde)
[0224]
Embedded image

[0225]
<Oligonucleotide-Platform Complex E>
NaIO_Four500 μL aliquots (100 μmol) of (200 mM) solution were converted to ACT modified (CA)_{twenty five} 1.0 g (total length 400 mg, 25 μmol) of H₂Add to O (19.5 mL) solution in the dark at 0 ° C. The mixture was placed at 0 ° C. for 40 minutes and 50 mL of EtOH was added. The mixture is left at -20 ° C. for 30 minutes and centrifuged at 2000 RPM for 5 minutes. Discard the supernatant and dry the remaining pellet under reduced pressure. This pellet₂Dissolve in 3.3 mL of O and add 4.3 mg (0.005 mmol) to the resulting solution.36Is added to 2.0 mL of 100 mM sodium borate (pH 8.0). To the resulting solution is added 250 μL (50 μmol) of a 200 mM solution of pyridine-borane complex (MeOH solution) and the mixture is left at 37 ° C. for 4 days. This complexECan be purified by ion exchange chromatography.
[0226]
(Combination 4: platform active carboxylate-ligand amine)
[0227]
Embedded image

[0228]
<Compound F-4 platform having four carboxylic acid groups>
Succinic anhydride (1.0 g, 10 mmol),36  861 mg (1.0 mmol) and NaHCO_Three 252 mg (3.0 mmol) 1/1 dioxane / H₂O is added to a solution in 20 mL and the mixture is stirred at room temperature for 16 hours. The mixture is acidified with 1N HCl and concentrated. The concentrate is purified by silica gel chromatography,FGet.
[0229]
<Compound G-4 Platform having two N-succinimidyl ester groups>
F A solution of 126 mg (0.1 mmol) and 46 mg (0.4 mmol) of N-succinimide in anhydrous THF (5 mL) is prepared. The mixture is cooled to 0 ° C. and 103 mg (0.5 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide is added. Stir for several hours until the mixture is at room temperature. Remove solids by filtration and concentrate the filtrateGGet. thisGCan be purified by silica gel chromatography.
[0230]
<Compound with Compound Z-Amino Group>
Peptides are synthesized by standard solid phase method on Wang (p-alkoxybenzyl) resin. Lysine ε-amine is protected as a CBZ group. Add amino acid residues sequentially to the amino terminus using FMOC chemistry. The last residue added is N-FMOC-aminocaproic acid. After cleavage from the resin with trifluoroacetic acid, the FMOC group is eliminated with piperidine to obtain a peptide having a free amine linker. This peptideZIs purified by reverse phase HPLC.
[0231]
<Peptide-Platform Complex H>
Z 0.05mmol and Et_ThreeN Prepare 0.1 mmol DMF (1 mL) solution. In this solution,G Add 16.5 mg (0.01 mmol) of DMF (1 mL) solution. The mixture is stirred until the reaction is complete. To remove the protecting group, the complex is dissolved in MeOH and the solution is placed in a Parr hydrogenator with 100 mg of 10% Pd carbon per gram of complex. Mix the mixture to 60 psi H₂Shake down and deprotected complexHIs purified by preparative reverse phase HPLC.
[0232]
(Combination 5: Platform isothiocyanate-ligand amine)
[0233]
Embedded image

[0234]
<Compound I-4 platform having four isothiocyanate groups>
Thiophosgene (381 μL, 575 mg, 5.0 mmol)36  A solution of 861 mg (1.0 mmol) in THF (10 mL) is added and the mixture is stirred at room temperature until the reaction is complete by TLC. This mixture was diluted with methylene chloride and 5% NaHCO._ThreeSeparation with the solution is performed. Extract this extract with MgSO_Four, Filtered and concentrated. ProductIIs purified by silica gel chromatography.
[0235]
<Peptide-Platform Complex J>
Z 0.05mmol and Et_ThreeN Prepare 0.1 mmol DMF (1 mL) solution. In this solution,I Add 10.3 mg (0.01 mmol) of DMF (1 mL) solution. The mixture is stirred until the reaction is complete. To remove the protecting group, the complex is dissolved in MeOH and the solution is placed in a Parr hydrogenator with 100 mg of 10% Pd carbon per gram of complex. Mix the mixture to 60 psi H₂Shake down and deprotected complexJIs purified by preparative reverse phase HPLC.
[0236]
(Combination 6: Platform chloroformate-amine amine)
[0237]
Embedded image

[0238]
<Compound K-4 Platform Having Four Hydroxyl Groups>
Triethylene glycol bis-chloroformate 205μL (275mg, 1mmol) CH₂Cl₂(5 mL) solution of diethanolamine 497 μL (525 mg, 5 mmol) and Et_ThreeN 696 μL (506 mg, 5 mmol) CH₂Cl₂(5 mL) Add to solution at 0 ° C. The mixture is warmed to room temperature and stirred until TLC shows the reaction is complete. Concentrate this mixture to produce the productKAre separated by silica gel chromatography.
[0239]
<Platform having compound L-chloroformate group>
Pyridine (100 μL), then triphosgene 1.19 g (4 mmol)K  412 mg (1 mmol) CH₂Cl₂(20 mL) Add to solution. The mixture is stirred at room temperature for 20 hours and the solvent is evaporated under reduced pressure to give the compoundLGet.
[0240]
<Peptide-Platform Complex M>
Z 1 mmol of pyridine (10 mL) solutionL Add to a solution of 132 mg (0.2 mmol) 1/1 THF / pyridine (5 mL). The mixture is stirred until the reaction is complete. The solvent is removed under reduced pressure. To remove the protecting group, the complex is dissolved in MeOH and the solution is placed in a Parr hydrogenator with 100 mg of 10% Pd carbon per gram of complex. Mix the mixture to 60 psi H₂Shake down and deprotected complexMIs purified by preparative reverse phase HPLC.
[0241]
Example 4: Synthesis of a complex containing two different biological molecules
It may be useful to conjugate more than one type of biologically active group to the platform molecule. This example describes the preparation of a platform containing two maleimide groups (reacting with a thiol-containing peptide) and two activated ester groups (reacting with a drug containing a free amine). The resulting complex contains two peptides and two drug molecules as shown in Scheme 20.
[0242]
<Preparation of Heteroactive Bonded Hand Platform Molecule Benzyl 6-Aminocaproate Tosylate K>
A toluene (60 mL) solution of a mixture of 32 mmol of 6-aminocaproic acid, 51 mmol of p-toluenesulfonic acid and 40 mmol of benzyl alcohol is refluxed using a Dean-Stark trap to remove water. When the reaction is complete, the mixture is cooled and the product is precipitated. Collect solids by filtration, EtOH / Et₂Compound recrystallized from 0KGet.
[0243]
<Compound L>
Dicyclohexylcarbodiimide (2 equivalents) to 1 equivalent of compound5 And 2 equivalents of N-hydroxysuccinimide in THF. The mixture is stirred for 4 hours to give the compoundKIs added in 2.2 equivalents. The mixture is stirred until the reaction is complete by TLC. The mixture is filtered and concentrated. The product is purified by silica gel chromatography.
[0244]
<Compound M>
CompoundLCH₂Cl₂Treat with trifluoroacetic acid diluted in When the reaction is complete, the mixture is concentrated under reduced pressure to give the compound as the trifluoroacetate salt.MGet.
[0245]
<Compound N>
Compound (N-tert-butyloxycarbonyl-2,2'-bis- (N-carbobenzyloxy-6-aminohexanoamidoethyl) amine) is converted to CH₂Cl₂Treat with trifluoroacetic acid diluted in When the reaction is complete, the mixture is concentrated under reduced pressure to give the compound as the trifluoroacetate salt.NGet.
[0246]
<Compound O>
Triethylene glycol bis-chlorochloroformate 3.2mmol, compoundM 4mmol and compoundN To a 4 mmol solution of pyridine (162 mL) in a 20 ° C. water bath. The mixture is stirred until reaction is complete by TLC and concentrated under reduced pressure. This concentrate is CH₂Cl₂Dissolved in, followed by 1N HCl solution, 5% NaHCO_ThreeWash the solution first and then the saturated NaCl solution. CH₂Cl₂Layer MgSO_Four, Filtered and concentrated. Dissolve the concentrate in 10 mL EtOH and add 10 mL 1M NaOH. The mixture is stirred for several hours until TLC shows no further reaction. Acidify the mixture to pH 1 with 1N HCl and add CH.₂Cl₂Extract with CH₂Cl₂Layer MgSO_Four, Filtered and concentrated. ProductOAre separated by silica gel chromatography.
[0247]
<Compound P>
CompoundOIn EtOH and in a Parr shakerO Hydrogenate with 100 mg of 10% Pd carbon per gram. TLC confirms completion of reaction. When the reaction is complete, the catalyst is removed by filtration and the mixture is concentrated to give the compoundPGet.
[0248]
<Compound Q>
N-methoxycarbonylmaleimide 3mmol, compoundP 1 mmol 20 mL dioxane and saturated NaHCO_Three Add to the solution in 5 mL at 0 ° C. The mixture is stirred for 1 hour, acidified with 1N HCl, CH₂Cl₂Extract with CH₂Cl₂Layer MgSO_FourDried, filtered, concentrated and the product purified by silica gel chromatography,QGet.
[0249]
<Compound R>
DCC 2mmol,Q 1 mmol and p-nitrophenol 2 mmol CH₂Cl₂To the solution, the mixture is stirred for 16 hours. Remove the solids by filtration, concentrate the filtrate and purify by silica gel chromatography.RGet.
[0250]
<Complex with two peptides and two drug molecules, Compound S>
Over 2 equivalents of thiol-containing peptideR Add to 1 equivalent of pH 7.5 phosphate buffer solution. The mixture is stirred for 1 hour and 2 equivalents of amine-containing drug are added. This complexSIs isolated by reverse phase HPLC or ion exchange chromatography, or a combination thereof.
[0251]
Embedded image

[0252]
Example 5 Synthesis and Testing of Complex 3-II
[0253]
Embedded image

[0254]
<DMTr-5'-modified (CA)_TenPreparation of>
Polynucleotide d- [DMTr- (bzCp (CE) bzA)_TenWere prepared on a Milligen 8800 Prep Scale DNA synthesizer according to the manufacturer's protocol for DNA phosphoramidite synthesis (see FIG. 6). This synthesis was performed on 10 g DMTr-d-bzA-CPG support loaded with nucleosides at 30.0 μmol / g. The last DMTr blocking group was removed using a mechanical protocol. Milligen activator solution (Cat. No. MBS5040) 45mL and compounds51(See Reaction Scheme 11) 0.385 g was added to the reaction system, and this suspension was mixed for 8 minutes by blowing argon. The mixture was oxidized by normal mechanical protocol, the polynucleotide bound to the support was collected by filtration, air dried, and treated with 100 mL of concentrated ammonia for 16 hours at 55 ° C. As the temperature decreased, the mixture was filtered through a Gelman 10μ polypropylene filter. The filter was washed with 200 mL of 2 mM NaCl adjusted to pH 12 with NaOH. The filtrate was then passed through an Amicon chromatography column (0.45 × 9.4 cm, 150 mL) packed with Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrated to pH 12 first with 3M NaCl and then with 2 mM NaCl. The column was eluted with 500 mL of a linear gradient (2 mM NaCl, pH 12 to 1.3 M NaCl, pH 12) and then washed with 1.3 M NaCl (pH 12) until all U.V. absorbing material appeared. 260nm absorbance fractions are further analyzed by polyacrylamide electrophoresis and fractions containing pure product are pooled. This pool (120 mL) was treated with 240 mL of cold isopropanol and held at −20 ° C. for 30 minutes. A Sorvall RC 3B centrifuge using a model H-6000A rotor, centrifuged at 3000 rpm, 4 ° C. for 15 minutes, collecting precipitates, DMTr-5′-modified (CA)_Ten(14946 A₂₆₀ Unit, 498 mg, 62.2 μM, 20% (based on 300 μM CPG nucleoside).
[0255]
<Tr-5'-modified (CA)_TenSynthesis>
[0256]
Embedded image

[0257]
Tr-5'-modified (CA)_TenThe synthesis of compounds51The compound53DMTr-5′-modified (CA) by replacing (prepared as described in Reaction Scheme 11)_TenAs described above for the synthesis of
[0258]
<Conjugation of DMTr-5′-modified polynucleotide and Compound 3 (IA-DABA-PEG, Reaction Scheme 1) —Preparation of Complex 3-I>
In the conjugation procedure shown below, sufficient helium was bubbled through all buffers and solutions used, and all reaction vessels were purged with argon before use. DMTr-5'-modified (CA)_TenOf 11,568 A₂₆₀ A solution of unit (48.2 μmol, estimated molar absorbance at 260 nm = 240,000) in water (7.7 mL) was added to 0.1 M NaHCO 3._Three Treatment with 1 mL and 210 μL of tributylphosphine (876 μmol, 18-fold excess mol) at room temperature for 0.5 hour. This suspension was occasionally shaken. The suspension was treated with 0.8 mL 3M NaCl and 16 mL cold isopropanol. After 30 minutes at -20 ° C., the material was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The resulting pellet was redissolved in 2 mL of water and 0.2 mL of 3M NaCl, treated with 4 mL of isopropanol, and centrifuged again. The pellet is briefly dried under reduced pressure, 2.8 mL of water blown with helium and 0.1 N NaHCO_Three Dissolved in 1 mL. Compound36.7 mg of (IA-DABA-PEG) was added and the mixture was left in the dark at room temperature for 16 hours. The final volume of 6 mL reaction mixture was passed through a 5 × 91 (1800 Ml) Pharmacia column packed with Sephacryl 200 (Pharmacia). The column was eluted with 0.5M NaCl, 0.1M sodium borate (pH 8.3). Using a peristaltic pump, the flow rate was set to approximately 2 mL / min and 15 ml fractions were collected. The absorbance at 260 nm of this fraction was measured. Furthermore, this fraction was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis, and fractions containing pure complex were pooled.
[0259]
<Hybridization of Complex 3-I-Preparation of Complex 3-II>
The pooled fraction is 726 A₂₆₀The fraction containing the unit. Equivalent (TG)_TenAnd the tube was heated at 90 ° C. for 10 minutes and then cooled to room temperature over 1.5 hours. An equal volume of isopropanol was added and the mixture was placed at −20 ° C. for 3 hours. After centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes, the pellet was dissolved in 0.15 M NaCl and 0.01 M sodium citrate (pH 6.8). 53 mg of hybrid was obtained. A portion of this material was diluted with the above buffer and the melting temperature (Tm) of the double helix was measured with a Carey 3E spectrophotometer. This material had a Tm of 73.4 ° C. and a darkness of 24.3%. 10 A of product₂₆₀ A portion of the unit is added in excess (TG) as described above._TenAnnealed with. Non-annealed complex and (TG) as well as this material_TenStandards were analyzed by gel permeation HPLC on a Shodex Protein KW 8025 column using a Rainin HPLC instrument. Column is 0.05M NaH₂PO_Four(PH 6.5), eluted with 0.5M NaCl isocratic. The elution time was 12 minutes. Product retention time is 6.9 minutes, (TG)_TenWas 9.2 minutes. Comparison of peak areas showed that 98.09% of this product was double stranded DNA. This complex is represented by a structure indicating “complex 3-II” in FIG.
[0260]
(Example 6: Preparation of PN-KLH complex)
The PN-KLH complex was prepared by the scheme shown below:
[0261]
Embedded image

[0262]
<ACT-Modification (CA)_{twenty five}Synthesis>
As a final step in automated synthesis, compounds58(CA)_{twenty five}Combined. Starting from 10 g DMT-d-bzA-CPG support loaded with nucleosides at 30.0 μmol / g, 49 sequential steps were performed using alternating dC and dA phosphoramidites. Obtained d- [DMTr- (bzCp (CE) bzA)_{twenty five}DMTr blocking group from] and 40 mL of activator solution (Milligen, Cat. No. MBS5040) and compound58 800 mg was added to the reaction mixture. The suspension was mixed with argon for 8 minutes and the normal oxidation step was performed. The polynucleotide bound to the support was removed from the reaction vessel, air dried, and treated with 100 mL of concentrated ammonia for 40 hours at 55 ° C. When the temperature decreased, the mixture was filtered through a Gelman 10 μm polypropylene filter and the filtrate was then purified by conventional ion exchange chromatography. Fractions showing absorbance at 260 nm were further analyzed by polyacrylamide electrophoresis, fractions containing pure product were combined, precipitated with isopropanol, and ACT-modified (CA)_{twenty five} 510 mg (31.9 μmol, 10%) were obtained.
[0263]
<Synthesis of single-chain PN-KLH complex>
NaIO_FourProcessed ACT-modified (CA)_{twenty five} To a solution of 100 mg (2.5 μmol) dissolved in 1.33 mL of 50 mM sodium borate (pH 8.0), 31.3 mg (0.208 μmol) of KLH and 2.0 mg (31.8 μmol) of pyridine-borane were added. The mixture was placed at 37 ° C. for 72 hours and the product was purified by chromatography on S-200.
[0264]
<(TG) of single-chain PN-KLH complex_{twenty five}Hybridization with>
Equivalent (TG)_{twenty five}Was added to the single-stranded PN-KLH complex and the tube was heated at 90 ° C. for 10 minutes and then cooled to room temperature over 1.5 hours. Precipitation with isopropyl alcohol gave 53 mg of PN-KLH; Tm (0.15 M NaCl, 0.01 M sodium citrate, pH 6.8) 73.4 ° C., 31.1% darkness; excess (TG)_TenAnnealed samples, non-annealed composites, and non-annealed (TG)_TenHPLC comparison to a standard consisting of 98% confirmed to be double stranded (Shodex Protein KW 8025 column, 0.05M NaH₂PO_FourPH 6.5, 0.5M NaCl). This complex can be represented by the following formula:
KLH- [NH (CH₂)_FiveOPO₂・ O- (CA)_{twenty five}: (TG)_{twenty five}]_-Five
(The molecular weight of KLH is 10^FiveIt is called “PN-KLH”.
[0265]
<Test of Complex 3-II as an immunotolerant>
Complex 3-II was tested for its ability to induce tolerance in mice immunized with a polynucleotide in the form of an immunogen.
[0266]
<Materials and methods>
Mice: C57BL / 6 female mice (6 weeks old) were purchased from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Mice were bred according to an improved method of the National Institutes of Health (NIH). Immunization: The method of Iverson (Handbook of Experimental Immunology, Volume 2)Cellular Immunology, (D.M. Weir, L.A. Herzenberg, C. Blackwell, and A. Herzenberg, 4th edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford)Assay for in vivo Adoptive Immune Response) PN-KLH 100 μg precipitated with alum and formalin-fixed Bordetella pertussis as an adjuvant 2 × 10⁹Were first immunized by intraperitoneal injection. The mice were boosted with 50 μg PN-KLH dissolved in saline (intraperitoneal).
[0267]
Binding of PN to SRBC: A solution of ovine red blood cell (SRBC) solver was purchased from Colorado Serum Co. (Denver, CO) and used within 2 weeks. This SRBC, Kipp and Miller method (Selected Methods in Cellular Immunology(1980), edited by B.B.Mishell and S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co. (San Francisco), page 103, “Preparation of protein-complexed red blood cells using ECDI (modified)”) (CA)_{twenty five}: (TG)_{twenty five}(50 mer consisting of CA: GT). Briefly, SRBC was washed 4 times with cold saline and in 0.01M NaCl, 0.35M mannitol containing 10 mg carbodiimide.D-EK coupling (CA)_{twenty five}: (TG)_{twenty five} Mixed with 2 mg and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The coated SRBC was washed twice with cold balanced salt solution and resuspended to 10% (v / v).
[0268]
Plaque assay: The number of anti-PN plaque-forming cells (pfc) was determined using the Cunningham method (Selected Methods in Cellular Immunology(1980), edited by B.B.Mishell and S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co. (San Francisco), page 86, Marbrook, J., “Liquid Matrix (Slide Method)”). The number of IgG pfc is described by Henry (Selected Methods in Cellular Immunology(1980), edited by BBMishell and SM Shiigi, WH Freeman and Co., San Francisco, page 91, “Evaluation of IgG response by removing IgM plaques”), removing IgM plaques using rabbit anti-mouse IgG Was measured. Briefly, spleens were harvested and single cell suspensions were prepared in balanced salt solution (BSS). Guinea pig serum is added to the polynucleotide-coated SRBC so that the final dilution is 1: 9 Guinea pig serum, and a sufficient amount of rabbit anti-mouse IgG is added to make the final dilution 1: 100 rabbit anti-mouse IgG. I did it. SRBC mixture and diluted spleen cells were mixed in equal volumes in microtiter wells and transferred to a Cunningham chamber. Each spleen was tested individually three times. The end of the chamber was sealed with paraffin and the chamber was incubated at 37 ° C. for 1 hour. The number of plaques was counted by observing the chamber under an inverted microscope.
[0269]
<Result>
Mice were first immunized with alum-precipitated PN-KLH with pertussis (A & P) as an adjuvant and divided into 3 groups in each group 7 weeks later. This mouse was treated with PN-DABA-PEG, ie, a dilute solution whose concentration was changed by 2 times each of the complex 3-II (intraperitoneal), and after 5 days, all mice including controls were placed in physiological saline. Boosted with 50 μg of PN-KLH (intraperitoneal). Four days later, the spleen was collected and the number of IgG pfc was measured. As shown in Table 2, the test body to which complex 3-II was administered showed a marked decrease in the number of pfc compared to the control group.
[0270]
Under the same conditions as above, Complex 3-II andD-EK coupling (PN)₅₀Were used to treat mice and anti-dsPN antibodies were measured by Farr assay. The results are shown in FIG. LJP-105 (D-EK coupling (PN)₅₀) LJP-249A and LJP-249B (complex 3-II) were significantly more effective in reducing anti-dsPN antibodies.
[0271]
[Table 2]

[0272]
Example 7 Preparation and Testing of Complex 20-II
<5'-Modification (CA)_TenTo a hand platform molecule 20-Preparation of a single-stranded complex 20-I>
Tri-n-butylphosphine 969μL (789mg, 3.89mol) 5'-modified (CA)_Ten 918 mg (0.14 mmol) H₂To the O (30 mL) solution was added under argon gas. The mixture was stirred for 1 hour, then 2.4 mL of 3M NaCl solution was added followed by 42 mL of isopropanol purged with helium and purged of oxygen. The mixture was placed in a freezer at -20 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. Remove the supernatant and remove the oily residue with H₂Dissolved in 15.5 mL of O. 1.24 mL of 3M NaCl and 21.7 mL of isopropanol bubbled with helium were added to the mixture. The resulting mixture was then placed in a refrigerator at -20 ° C for 1 hour and centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The resulting oily pellet was dried under reduced pressure for 18 hours to obtain a solid. This solid material is mixed with helium blown H₂Dissolved in 6 mL of O, the total volume was 6.4 mL. According to UV absorbance measurement at 260 nm, the amount of DNA was 863 mg (0.333 mg per absorbance unit in pH 7.5 saline phosphate buffer). This solution was transferred to a 50 mL three neck flask under argon gas. One neck of the flask was used as an inlet for argon gas, and the other two were stoppered. 1M sodium phosphate buffer (pH7.8) 0.87mL, MeOH 0.97mL and H₂O was added to adjust the total volume to 7.7 mL. Compound201.9 mL (33.63 mg, 0.025 mmol) of 17.7 mg / mL MeOH solution was added to the mixture. The resulting mixture was stirred under argon gas for 20 hours and then diluted to 100 mL with a solution containing 0.1 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate (pH 7.5), and 10% MeOH. Purification was performed by chromatography on Fractogel® (equilibrium: 0.1 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate, pH 7.5, 10% MeOH: elution gradient 0.5 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate, pH 7. 5, 10% MeOH to 0.8M NaCl, 0.05M sodium phosphate, pH 7.5, 10% MeOH). Pure complex as shown by HPLC and polyacrylamide gel electrophoresis20 -IThe fractions containing were collected in 232 mL of eluent. The product and salt were precipitated by adding an equal volume of isopropanol and placing it in a freezer at -20 ° C for 1 hour. H₂Dialyze against O (2 x 100 vol), 335 mg complex20 -I(32 mL at a concentration of 10.47 mg / mL, 0.033 mg / absorption unit (260 nm)) was obtained.
[0273]
<Complex 20-I and (TG) to form double-stranded complex 20-II_TenAnnealing with>
Complex20 -I 150 mg (based on 0.033 mg / absorption unit (260 nm), 14.33 mL at a concentration of 10.47 mg / mL) and (TG)_Ten 157.5 mg (based on 0.033 mg / absorption unit (260 nm), 1.50 mL at 104.6 mg / mL) was placed in a 50 mL polypropylene centrifuge tube. pH 7.2 10 x PBS 2.0 mL and H₂The concentration was adjusted to 15 mg / mL by adding 2.17 mL of O. The mixture was placed in a 90 ° C. water bath and cooled to room temperature over 1.5 hours. The concentration was confirmed to be 17.7 mg / mL by absorbance at 260 nm (0.050 mg / absorption unit); transition melting temperature 67.5 ° C .; darkness 27%; osmolality 346; pH 7.2. Complex20 -IIFor the final formulation, the solution was diluted to a final concentration of 12.7 mg / mL and osmolality of 299 by adding 7.23 mL of pH 7.2 1/2 × PBS and filtering through a 0.22 μ filter.
[0274]
<5'-Modification (CA)_10-20Preparation of single-stranded complex 20-I
10 equivalents of tri-n-butylphosphine, 5′-modified (CA)_TenIs added to a 10 mg / mL solution dissolved in 100 mM sodium acetate (pH 5). The mixture is stirred for 1 hour and then precipitated with 1.4 volumes of isopropyl alcohol (IPA). The mixture is placed in a freezer at -20 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The supernatant is removed and the pellet is dissolved at 10 mg / mL in IPA blown with helium. The mixture is placed in a freezer at -20 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The pellet is dried under reduced pressure for 18 hours to obtain a solid. A 50 mg / mL solution of this solid is prepared in 100 mM sodium borate buffer (pH 10), blown with helium. 9/1 MeOH / H₂0.25 equivalents of compound as a 40 mg / mL solution in O20Is added to this mixture. The mixture is stirred at room temperature for 3-20 hours and diluted (0.1 M NaCl, 0.05 M sodium phosphate (pH 7.5), 10% MeOH). Purification is carried out by chromatography on Factogel. (Equilibrium: 0.1M NaCl, 0.05M sodium phosphate, pH 7.5, 10% MeOH: elution gradient 0.5M NaCl, 0.05M sodium phosphate, pH 7.5, 10% MeOH to 0.8M NaCl, 0.05M sodium phosphate , PH 7.5, up to 10% MeOH). Pure complex as shown by HPLC and polyacrylamide gel electrophoresis20 -IFractions containing were collected. The product and salt are precipitated by adding an equal amount of IPA and placing it in a freezer at -20 ° C for 1 hour. H₂Dialyze against O (2 x 10 vol) and complex20 -IGet.
[0275]
<20-I (TG) to form double-stranded complex 20-II_10-20Another annealing by>
The above method is substantially the same except that the annealing is performed at 70 ° C instead of 90 ° C.
[0276]
<5'-Modification (CA)_10-20Further preparation of complex, preparation of single-stranded complex 20-I>
Tri-n-butylphosphine 4.8mL, Ar blown 100mM sodium acetate (pH5) 104mL 7.75g 5'-modified (CA)_TenN in the dissolved solution₂Added under gas. The mixture was stirred for 1 hour and then precipitated with 232.5 mL IPA. The mixture was placed in a freezer at −20 ° C. for 1.5 hours, then centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes and frozen at −20 ° C. for 24 hours. The supernatant was removed, and the pellet was dissolved in 170 mL of 0.3 M NaCl solution with bubbling helium. The mixture was reprecipitated with 232 mL of Ar blown IPA. The mixture was then placed in a freezer at −20 ° C. for 2 hours, centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes, and placed at −20 ° C. for 11 hours. The supernatant was removed, and the pellet was dried under reduced pressure for 12 hours to obtain a solid. A solution of this solid was prepared in 110 mL of Ar blown 100 mM sodium borate buffer (pH 10). 9/1 MeOH / H₂406 mg of compound as a solution in O (4.4 mL)20Was added to this mixture. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The resulting mixture was 62% by high pressure ion chromatography.20 -IIt was shown to contain. This chromatography was performed using a Waters Gen Pak Fax column (100 × 4 mm), 60 ° C., linear gradient 65% A / 35% B to 18% A / 82% B; A = 0.05M NaH₂PO_Four, PH 7.5 1 mM EDTA, 10% MeOH (v / v); B = 0.05M NaH₂PO_FourPH 7.5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10% MeOH (v / v), and 20-I eluted at 19.5 minutes.
[0277]
<Test of Complex 20-II and Non-Complex Control>
C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. After 3 weeks, each group of 5 mice / group was conjugated with various doses of complex 20-II or 4.5 nM HAD-AHAB-TEG (derivatized binding platform molecule, AHAB-TEG with linker HAD , See Fig. 7), or 18nM (4 x 4.5) (CA)_Ten: (TG)_TenOr 4.5nM HAD-AHAB-TEG and 18nM (CA)_Ten: (TG)_TenWas administered intraperitoneally; and one group received no treatment. Each group was injected and boosted, serum was collected, and the assay described in Example 6 was performed. The decrease in anti-PN response (expressed as a percentage) is shown in FIG. The anti-KLH response in these mice was normal and was not significantly different from the anti-KLH response shown in FIG. From the results of this example, it is clear that the anti-PN response was not affected by (i) the bond platform molecule alone, (ii) PN alone, or (iii) the mixture of the two. PN must be coupled with a non-immunogenic binding platform molecule to induce immune tolerance.
[0278]
<Complex 20-II brings about a decrease in the number of PN-specific antibody producing cells>
C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, groups of 3 mice / group were each administered intraperitoneally with various doses of Complex 20-II; and one group received no treatment. After 5 days, all mice were boosted by intraperitoneal injection of PN-KLH in saline, then 4 days later their spleens were collected and PN-specific IgG production using a hemolytic plaque assay Assayed for cell number. The results are shown in Table 3. From this result, it is clear that this complex reduced the number of PN-specific IgG producing cells.
[0279]
[Table 3]

[0280]
(Example 8: Test of complex as an immunotolerant)
<Test of complex 17-II as immunotolerant>
C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, groups of 5 mice / group were each administered various doses of Complex 17-II intraperitoneally; and one group received no treatment. Five days later, all mice were boosted by intraperitoneal injection of PN-KLH in physiological saline, and seven days later, the mice were bled. Serum with a PN concentration of 10^-8M was analyzed for anti-PN antibodies by Farr assay. The decrease in anti-PN response (expressed as a percentage) is shown in FIG. The serum was also analyzed for anti-KLH antibodies using an ELISA assay. The results are expressed as a percentage of anti-KLH compared to a standard pool of anti-KLH serum and are shown in FIG. The data in FIG. 1 shows that this complex reduced the anti-PN response. All these mice had a normal anti-KLH (platform molecule) response (see Figure 2).
[0281]
<Test of various 11-series complexes as immunotolerant>
Groups of C57BL / 6 mice / group were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, two groups were administered intraperitoneally with three different doses of Complex 11-IV, Complex 11-II, Complex 11-VI, or Complex 11-VIII, respectively. No processing was done. These complexes are described in FIG. 6 and were prepared according to the method of Example 7 above. Five days later, all mice were boosted by intraperitoneal injection of PN-KLH in physiological saline, and seven days later, the mice were bled. Serum with a PN concentration of 10^-8M was analyzed for anti-PN antibodies by Farr assay. The decrease in anti-PN response (expressed as a percentage) is shown in FIG. The anti-KLH response of these mice was not significantly different from the anti-KLH response shown in FIG. All four conjugates significantly reduced the anti-PN response at all doses tested.
[0282]
<Complex 11-II causes a decrease in the number of PN-specific antibody-producing cells>
C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, groups of 3 mice / group were administered intraperitoneally with various doses of Complex 11-II, and one group was not treated. After 5 days, all mice were boosted by intraperitoneal injection of PN-KLH in saline, then 4 days later their spleens were collected and PN-specific IgG production using a hemolytic plaque assay Assayed for cell number. Results of experiments with various doses of Complex 11-II are shown in Table 4. From this result, it is clear that this complex reduces the number of PN-specific IgG producing cells and that the decrease in antibody titer is not due to the clearance of serum antibodies bound to the complex.
[0283]
[Table 4]

[0284]
(Example 9: HADpS- (CA)_Ten-Preparation of complex 20-IV)
A modified polynucleotide having a phosphorothioate linking a linker at the 5 ′ end was prepared. 20mer (CA)_TenAnd the addition of the HAD linker to the polynucleotide was performed according to the method of Example 5 except as described below. In the final oxidation step, the iodine solution was replaced with a 0.05M acetonitrile solution of 3H-1,2-benzodithiol-3-one 1,1 dioxide (Glen Reseach, Sterling, VA). The sulfurization treatment was performed according to the manufacturer's instructions. Ammonia treatment and purification were carried out in the same manner as in Example 5. Conjugation of the polynucleotide to the AHAB-TEG bond platform was performed according to the method of Example 5.
[0285]
<Test of Complex 20-IV as an immunotolerant>
Since the 5 'phosphate of PN is susceptible to enzymatic degradation, one of the terminal phosphate oxygen molecules was replaced with sulfur (hence HAD_pName it S). C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, groups of 5 mice / group were administered intraperitoneally with various doses of Complex 20-IV, and one group was not treated. Groups were boosted and serum collected and the above assay was performed. The results showing a decrease in anti-PN response (expressed as a percentage) are shown in FIG. The anti-KLH response of these mice (data not shown) was normal and not significantly different from the anti-KLH response shown in FIG. These results indicate that this complex significantly reduced the anti-PN response.
[0286]
<Complex 20-IV brings about a decrease in the number of PN-specific antibody producing cells>
C57BL / 6 mice were immunized with PN-KLH and A & P. Three weeks later, groups of 3 mice / group were administered intraperitoneally with various doses of Complex 20-IV, and one group was not treated. After 5 days, all mice were boosted by intraperitoneal injection of PN-KLH in saline, then 4 days later their spleens were collected and PN-specific IgG production using a hemolytic plaque assay Assayed for cell number. The results are shown in Table 5. From this result, it is clear that this complex reduced the number of PN-specific IgG producing cells.
[0287]
[Table 5]

[0288]
(Example 10: Treatment of BXSB mouse with LJP394, complex 20-II)
<Mouse processing protocol>
Six to nine week old male BXSB mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) were bred at La Jolla Pharmaceutical facility. Food and water were given ad libitum. The animals were rested for 1 week prior to use in the experiment. Prior to performing the first complex treatment, an initial blood sample was obtained and the initial body weight was measured. The treatment of the complex was started at 7-9 weeks of age, and intraperitoneal administration was performed twice a week from the 59th day to the 150th day. Animals were bled regularly and their anti-DNA antibody titers were determined.
[0289]
<Assay for IgG anti-DNA antibody production>
Serum samples from each mouse were evaluated by ELISA for the presence of anti-DNA antibodies. Falcon Probind 96-well microtiterization assay plates (Becton Dickerson, Oxnard, Calif.) At a concentration of 50 μg / mL (PN)₅₀-D-EK (copolymer of D-glutamic acid and D-lysine) 100 μL / well was coated overnight at 4 ° C. The plates were washed twice with PBS without calcium and magnesium and 0.05% Tween20 (wash buffer) using an M96V plate washer (ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA). Plates were blocked with PBS containing 1% gelatin (Norland Products, Inc, New Brunswick, NJ) and 0.05% Tween 20 for 1 hour at room temperature. The plate was washed twice with wash buffer before adding serum samples or standards. Serum samples and standards were prepared as dilutions containing PBS with 1% gelatin, 0.05% Tween 20, and 10% goat serum. Plates were incubated with serum samples at 37 ° C. for 60-90 minutes, then the wells were washed 4 times with wash buffer. Biotinylated goat anti-mouse IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) was diluted 1/1000 with blocking solution containing 10% goat serum. Plates were incubated for 1 hour at 37 ° C and washed 4 times. Substrate OPD (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)) was added. Plates were incubated in the dark until the highest standard reading was about 1 OD unit with an ELISA plate reader at OD 450 nm (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). The reaction was interrupted with 50 μL of 3M HCl and the plate was read at 490 nm. Each microtiter plate contained a reference positive serum, and positive wells from each assay were sensitive within the 95% range of this reference time curve. In blood collected later, some of the positive samples exceeded the reference curve. However, most diluted mouse serum samples were within the reference curve range. No significant binding was observed with normal control negative sera. The results are shown in FIG.
[0290]
Example 11: Preparation of melittin peptides and conjugates
The melittin molecule consists of 26 amino acids and is one of the main components of bee venom. One third of bee venom sensitive individuals have melittin-specific antibodies. Melittin is highly immunogenic in several mouse strains (Balb / c, CAF1). Many of the responding mouse strains of melittin-specific antibodies (> 80%) bind to B cell epitopes, which are seven peptides at the C-terminus of melittin.
[0291]
<Melittin>
[0292]
[Table 6]

[0293]
<Melittin peptide that stimulates T cells>
[0294]
[Table 7]

[0295]
<Peptide synthesis>
Melittin peptides were prepared by standard Fmoc chemistry on glycine resin (Advanced ChemTech # SG5130) or its equivalent (Advanced ChemTech, 2500 Seventh Street Road, Louisville, KY). In each coupling step, 2.3M excess of amino acid derivative was used. Completion of binding was monitored with bromophenol blue and confirmed with ninhydrin.
[0296]
<Melittin peptide used in complex>
[0297]
[Table 8]

[0298]
Cysteine was added as necessary to attach the peptide to the hand platform molecule via a thioether bond. The peptide was purified by reverse phase HPLC after synthesis and dried by lyophilization. The appropriate amount of peptide was then weighed for each complexation.
[0299]
<Reduction of preformed disulfide bond (tributylphosphine method)>
Helium was bubbled through all buffers. Peptide was added to a minimum volume (approximately 10-20 mg / mL) of 0.05M NaHCO_ThreeDissolved in (pH8.25). A 1 mL solution of 0.7 M tributylphosphine (TBP; MW = 202.32 g / mol; d − 0.812 g / mL) was prepared by adding 174.4 μL of TBP to 825.6 μL of isopropanol (iPrOH). The peptide solution prepared as above is then added in an equivalent amount of (1: 1) TBP, mixed well, and then stirred occasionally to dissolve and / or disperse the TBP in the solution for 30 minutes to 1 Reacted for hours. HPLC confirmed that the reduction was complete.
[0300]
<Conjugation of peptide to bond platform molecule # 3 or # 60>
Helium was bubbled through all buffers. Polyethylene glycol (PEG) derivative # 3 or # 60 is added to a minimum volume (approximately 20 mg / mL) of 0.05 M NaHCO 3._ThreeDissolved in (pH8.25). About 3 equivalents of peptide were used per iodoacetyl group of the PEG derivative. For p-aminobenzoic acid (PABA) 2 -PEG (2 iodoacetyl groups; MW = about 4100 g / mol), 6 equivalents of peptide were used for each equivalent of PABA-PEG. For diaminobenzoic acid (DABA) 2 -PEG (4 iodoacetyl groups; MW = about 4300 g / mol), 12 equivalents of peptide were used for each equivalent of DABA-PEG. The PEG solution was added to the reduced peptide solution and allowed to react for at least 1 hour in the dark. The peptide conjugate was purified by preparative HPLC. Prior to pooling and lyophilization, fractions were confirmed by electrophoresis using 15% Tricine gel.
[0301]
[Table 9]

[0302]
<Mouse lymph node proliferation assay>
Female Balb / c mice (6-8 weeks old; Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) were obtained and bred in La Jolla Pharmaceutical animal facility according to National Institutes of Health guidelines. Food and water were given ad libitum. Balb / c mice were immunized on the back of each hind paw with 50 μg melittin in complete Freund's adjuvant (CFA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Seven days later, popliteal lymph nodes were collected under aseptic conditions. Lymph nodes were gently separated by mincing the cells through a 50 mesh sieve screen. Single cell suspensions were washed in RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) containing glutamine, penicillin, and streptomycin. 5 × 10 5 in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum in quadruplicate wells of a round bottom 96-well Corning microtiter plate^FiveCells were cultured with melittin or melittin peptide at 10, 1.0, or 0.1 μg / mL. Cells in positive control wells were cultured with 100 or 50 U / mL mouse interleukin 2 (IL-2), 1 μg / mL PHA (phytohemagglutinin). Negative control wells had lymph node cells in RPM-1640 and 10% FCS. Cells, 5% CO₂For 4 days in a 37 ° C. incubator. Each well, 1 μCi [^ThreeH] thymidine (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA) was further pulsed for 18 hours. Cells were collected on glass fiber filter mats by a semi-automatic cell collector (Scatron, Sterling, VA). [^Three[H] thymidine incorporation was measured by liquid scintillation. Results were expressed as average counts per minute.
[0303]
<In vivo protocol>
Balb / c mice were initially immunized by intraperitoneal administration of 4 μg melittin in CFA. One month later, the latent immunotolerogen or formulation buffer was administered intraperitoneally. Three days later, all mice received an intraperitoneal injection of 4 μg melittin in incomplete Freund's adjuvant (ICF) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Ten days later, 100-200 μL of blood was collected from the retro-orbital venous plexus. Serum samples were assayed for anti-peptide or anti-melittin IgG antibodies.
[0304]
<Assay for IgG anti-melittin or total anti-melittin antibody>
Individual mouse serum samples were serially evaluated by ELISA for the presence of anti-melittin antibodies. Falcon Probind 96-well microtiter plates were pre-coated overnight at 4 ° C. with 10 μg / mL melittin or melittin peptide in saline phosphate buffer (PBS) (pH 7.2). The plate was washed twice with a wash solution containing PBS, 0.02% Tween-20, and 1% gelatin (Norland Products Inc., New Brunswick, NJ). Plates were blocked for 1 hour at 37 ° C. with 200 μL of PBS containing 5% gelatin. Serum samples were prepared as PBS dilutions containing 5% gelatin. Samples were tested diluted 1: 100 to 1: 1000. After 1 hour incubation at 37 ° C., the plate was washed 4 times. Extraavidin peroxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was diluted 1: 1000 with PBS containing 5% gelatin. The plate was incubated for 1 hour at 37 ° C. and then washed 5 times. The wells were developed with o-phenylenediamine (OPD) (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.) for 15-30 minutes in the dark and the reaction was interrupted with 3M HCl. Optical density (OD) was measured at 450 nm on a microplate reader (Bio-tek Instrument, Winooski, VT).
[0305]
<Antibody producing cell assay>
Cellulose microtiter plates (Millipore Co., Bedford, Mass.) Were prepared as indicated above for IgG antibody (ELISA) assays. However, when serum samples are added to the wells in the IgG antibody assay, spleen cells (5 × 10 5^Five/ Well) was added instead of serum and incubated overnight. The remaining steps of the ELISA assay were performed as described above.
[0306]
<T cell epitope>
T cells obtained from mice sensitized with melittin showed T cell proliferation in response to total melittin molecules and C-terminal melittin peptides 3, 4, and 5 (FIG. 8). However, C-terminal peptides 1 and 2 did not induce significant T cell proliferation. Melittin peptides 2 and 5 were conjugated to PEG. Similar to melittin peptide 2, the PEG conjugate of melittin peptide 2 also did not induce significant T cell proliferation.
[0307]
<Experiment with melittin-conjugated peptide that tolerates mice boosted by first immunization with melittin>
Mice treated with the above complexes (10 mg / kg, 200 μg / mouse) have significantly lower levels of anti-melitin peptide 2 antibody compared to control Balb / c mice treated with formulation buffer (FIG. 9) and also had low levels of anti-melittin antibodies (Figure 10). Spleen cells from mice treated with buffer control or the above complex were assayed for the ability of antibody producing cells to produce anti-melittin antibody or anti-melittin peptide 2 antibody by measurement in a soluble ELISA assay. As shown in FIG. 11, the level of anti-melittin peptide 2 antibody-producing cells in the group treated with the complex was significantly lower than the level in the control group to which the formulation buffer was administered. Mice treated with complex 4 (complex of peptide 5 containing a T cell epitope) did not reduce antibody titers against peptide 5 in treated mice. Thus, a complex containing a T cell epitope is not an immunotolerant (FIG. 12). In fact, rather than reducing the response, the level of the anti-peptide antibody can be slightly increased.
[0308]
Example 12: Further experiments with melittin peptide conjugates that tolerate mice boosted with melittin for the first time
Female C57BL / 6 mice (5-8 weeks old) were purchased from The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Animals were maintained and handled according to National Institutes of Health guidelines.
[0309]
<Immunotherapy protocol>
Alum precipitated melittin 5 μg and Bordetella pertussis (B. pertussis) (Michigan Department of Public Health, Lansing, MI) 2 × 10⁹Were injected intraperitoneally into mice. The mice were boosted by intraperitoneal administration of 5 μg of melittin in PBS.
[0310]
<Pfc assay>
Sheep red blood cells (SRBC) (Colorado Serum Co., Denver, Colorado) were complexed with melittin peptide 2 using carbodiimide. Fresh SRBC (<2 weeks old) was washed 4 times with cold saline and once with mannitol (0.35M mannitol, 0.01M NaCl). This SRBC was suspended in mannitol to a concentration of 10% (v / v). 100 μL of mannitol containing 30 μg of melittin peptide # 3 was added to a 1 mL aliquot of 10% SRBC, which was then incubated in ice for 10 minutes. Then, 100 μL of a 100 mg / mL solution of 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide HCl (EDCI) was added and incubated in ice for 30 minutes. SRBC was washed twice with balanced salt solution (BSS) (Irvine Scientific Co., Irvine, CA) and resuspended to 10% (v / v). Lyophilized guinea pig complement (GIBCO, New York, NY) was reconstituted with BSS and then diluted 1: 3 with BSS. 1 mL of diluted guinea pig complement was added to 3 mL of complexed SRBC. Rabbit anti-mouse IgG was added to obtain a 1: 100 final dilution of rabbit antiserum. This concentration was predetermined to increase the maximum number of IgG pfc while inhibiting all IgG pfc. This complement / anti-mouse IgG / SRBC solution was mixed with an equal amount of a cell suspension of mouse spleen cells collected from one mouse. Each 50 μL of the mixture was transferred to the chamber of the Cunningham slide (3 chambers per slide). The ends were then sealed with paraffin and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The number of plaques per chamber was counted using a dissecting microscope. Each spleen suspension was assayed using uncomplexed SRBC as a control. The number of viable cells was measured in each spleen cell suspension. Spleen cells 10⁶The number of pfc per piece was measured for each chamber and the average of triplicates was calculated. The number of pfc in non-complexed SRBC was subtracted from the number of pfc in complexed SRBC to determine the number of peptide specific pfc.
[0311]
<Determination of optimal time for pfc measurement>
Mice were first immunized with melittin. Groups of sensitized mice (3 mice per group) were boosted with melittin on days 2, 4, 6, and 8. On day 10, mice were killed and their spleens were collected. Cell suspensions were prepared and assayed for determination of the number of peptide specific pfc. The optimal number of pfc was obtained with melittin boost after 6 days.
[0312]
<Peptide orientation in the PEG conjugate does not affect the ability of the conjugate to induce immune tolerance>
To determine whether the peptide orientation of the PEG conjugate affects the ability of the conjugate to induce immune tolerance, two different immunotolerogens were constructed. Peptide, through its C-terminus, bond platform molecule3Was covalently bound to produce melittin complex 3. Groups of mice (3 / group) primed with melittin were treated intraperitoneally with different complexes or saline. After 5 days, all mice, including untreated control mice, were boosted with 5 μg melittin. Six days later, the mice were killed and their spleens were collected and the number of peptide-specific pfc was determined. As shown in Table 10, in both directions, peptide specific pfc / 10 in mice primed and boosted with the parent protein melittin in both directions.⁶There was an effect of reducing the number of spleen cells.
[0313]
[Table 10]

[0314]
<The number of peptides per PEG conjugate affects the ability of the conjugate to induce immune tolerance>
To determine whether the ratio of peptide to PEG molecule is important, three different conjugates (each with a different number of peptides per PEG conjugate) were constructed. Conjugate 1 had only 2 peptides per PEG conjugate. Another conjugate had 4 peptides per PEG conjugate (complex 2). The third conjugate had 8 peptides per PEG conjugate (complex 5). Groups of mice (3 / group) initially immunized with melittin were treated intraperitoneally with complex or saline. After 5 days, all mice, including untreated control mice, were boosted with 5 μg melittin. Six days later, the mice were killed and their spleens were collected and the number of peptide-specific pfc was determined. As shown in Table 11, Conjugate 1 (containing 2 peptides per PEG molecule) is peptide specific pfc / 10 in mice primed and boosted with the parent protein melittin.⁶It was not effective in reducing the number of spleen cells. This result indicates that both melittin complexes 2 and 5 were effective as immunotolerogens. However, Complex 5 (containing 8 peptides) was more effective at a lower dose than Complex 2 (containing 4 peptides per bond platform molecule).
[0315]
[Table 11]

[0316]
As described above, the present invention provides chemically defined non-polymeric bond platform molecules, as well as chemically defined non-polymeric bond platform molecules and biological or chemical A complex comprising a molecule is provided. Biological molecules include polynucleotide duplexes of at least 20 base pairs that have significant binding activity against human lupus anti-dsDNA autoantibodies.
[0317]
Modifications of the above-described embodiments for practicing the invention, which will be apparent to those skilled in the art of polynucleotide chemistry, complex chemistry, immunology, and related fields, are intended to be within the scope of the appended claims. The
[0318]
[Sequence Listing]
[0319]
[SEQ ID NO: 1]

[0320]
[SEQ ID NO: 2]

[0321]
[SEQ ID NO: 3]

[0322]
[SEQ ID NO: 4]

[0323]
[SEQ ID NO: 5]

[0324]
[SEQ ID NO: 6]

[0325]
[SEQ ID NO: 7]

[0326]
[SEQ ID NO: 8]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the initial dose of PN-KLH and the dose [(PN) shown in the figure.₂₀The anti-PN response of mice treated with -BAHA] -EDDA (complex 17-II), boosted with PN-KLH, and bled 5 days later is shown. Serum of 3 dilution series, 10^-8 Tested in a Farr assay using PN radiolabeled with M, and data were expressed as the percentage reduction of anti-PN antibodies. One group used 5 mice.
FIG. 2 shows the initial dose of PN-KLH and the dose [(PN) shown in the figure.₂₀The anti-KLH response of mice treated with -BAHA] -EDDA (complex 17-II), boosted with PN-KLH and bled 5 days later is shown. Anti-KLH antibodies were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results were expressed as a percentage of the standard pool of antisera. One group used 5 mice.
FIG. 3 shows the initial immunization with PN-KLH and the dose [(PN)₁₆-BAHA_OX] -EDDA (Complex 11-IV), [(PN)₂₀-BAHA_OX] -EDDA (Complex 11-II), [(PN)_{twenty four}-BAHA_OX] -EDDA (complex 11-VI) or [(PN)₃₂-BAHA_OX] Shows the anti-PN response of mice treated with any of] -EDDA (complex 11-VIII), boosted with PN-KLH, and bled 5 days later. Serum, 10^-8 Tested in Farr assay using PN radiolabeled with M. One group used 5 mice.
FIG. 4 shows the initial dose of PN-KLH and the dose (PN) shown in the figure.₂₀-HAD_pOf mice treated with -AHAB-TEG (complex 20-II), or with HAD-AHAB alone, or with PN alone or a mixture of each, then boosted with PN-KLH and bled 5 days later -Indicates a PN response. Serum, 10^-8 Tested in Farr assay using PN radiolabeled with M. A percentage reduction was calculated to show this data. One group used 5 mice.
FIG. 5 shows the initial immunization with PN-KLH and the dose of (PN) shown in the figure.₂₀-HAD_pThe anti-PN response of mice treated with S-AHAB-TEG (complex 20-IV) and then boosted with PN-KLH and bled 5 days later is shown. Serum, 10^-8 Tested in Farr assay using PN radiolabeled with M. One group used 5 mice.
FIG. 6 shows complexes 3-I, 3-II, 11-I, 11-II, 11-IV, 11-VI, 11-VIII, 17-I, 17-II, 20-I, FIG. 6 shows the structure of derivatized bond platform molecules for 20-II, 20-III, and 20-IV and linkers that bind polynucleotides to the bond platform molecules.
FIG. 7 shows the structure of a derivatized bond platform molecule “HAD-AHAB-TEG”.
FIG. 8 compares the level of T cell proliferation induced by melittin peptides.
FIG. 9 compares the levels of anti- (melittin peptide 2) antibodies produced in mice treated with melittin peptide conjugates and in control mice treated with formulation buffer.
FIG. 10 compares the levels of anti- (melittin) antibodies produced in mice treated with melittin peptide conjugates and in control mice treated with formulation buffer.
FIG. 11 compares the levels of anti- (melittin peptide 2) antibody-producing cells in mice treated with melittin peptide complex and in control mice treated with formulation buffer.
FIG. 12 illustrates that melittin peptide complex 4, which is a complex of peptide # 5 containing a T cell epitope, is not an immunotolerogen.
FIG. 13 illustrates a melittin complex included in the present invention.
FIG. 14 shows the increase in the percentage decrease in anti-dsPN antibody achieved with the conjugates of the invention (LJP-249A and LJP-249B (complex 3-II));D-EK and polynucleotide (PN)₅₀A comparison with that of a prior art composite containing LJP-105 is shown.
FIG. 15 shows suppression of anti-DNA IgG antibody in circulating serum of male BXSB mice treated with complex LJP-394 of the present invention, complex 20-II. ELISA assayD-Combined with EK (PN)₅₀IgG antibody against was measured. Serum from each of the 8 mice in each group was assayed individually.

Claims (49)

(a) (i) 2,2'- ethylenedioxy di ethylamine,
(ii) triethylene glycol, and
(iii) a chemically defined bond platform molecule comprising a moiety selected from the group consisting of polyethylene glycol having a molecular weight of about 200 to about 8,000, wherein said moiety is derivatized with a branching group Provided that when the chemically defined bond platform molecule comprises polyethylene glycol having a molecular weight of about 200 to about 8,000, the branching group is derived from a diamino acid, a triamine, and an amino diacid group. The bond of the platform molecule has four or more binding sites located at the ends of the bond platform molecule, wherein the bond platform molecule is biologically active , derived from a functional moiety selected from the group consisting of Chemically defined so that the number of binding sites for a particular molecule is predetermined by the number of branching groups Said bond platform molecule,
(b) a conjugate that can be formed by conjugation with a plurality of biologically active molecules, wherein the plurality of biologically active molecules are bound to a bond platform molecule at the binding site; Said conjugate. Bond platform molecule contains 2,2' ethylenedioxy di ethylamine The conjugate of claim 1.   The conjugate of claim 1, wherein the bond platform molecule comprises triethylene glycol.   The conjugate of claim 1, wherein the bond platform molecule comprises polyethylene glycol. 5. A conjugate according to any of claims 1 to 4, wherein the branching group is derived from a functional moiety selected from the group consisting of diamino acids, triamines, and aminodioic acid groups .   6. A conjugate according to any of claims 1 to 5, wherein the conjugate comprises two branching groups and provides a binding site for all four biologically active molecules.   7. A conjugate according to any of claims 1 to 6, wherein one of said biologically active molecules is bound to an individual binding site.   The conjugate according to any one of claims 1 to 7, wherein the number of biologically active molecules is four.   9. A conjugate according to claim 8, wherein the four biologically active molecules are each identical.   The biologically active molecule is selected from the group consisting of polynucleotides and analogs of immunogens selected from the group consisting of carbohydrates, lipids, lipopolysaccharides, proteins, peptides, lipoproteins and glycoproteins. Item 6. The conjugate according to any one of Items 1 to 5.   11. A conjugate according to claim 10, wherein the biologically active molecule is a single-stranded or double-stranded polynucleotide.   12. The conjugate of claim 11, wherein the polynucleotide is double stranded having a length of at least about 20 bp.   13. The conjugate according to claim 12, wherein the double strand has a significant binding activity to anti-dsDNA autoantibodies of human systemic lupus erythematosus.   14. The conjugate of claim 13, wherein the duplex is linked to the bond platform molecule via a linker molecule. 15. A conjugate according to claim 14, wherein the linker molecule is selected from the group consisting of HAD and HAD _p S.   The conjugate according to any one of claims 13 to 15, wherein the length of the double strand is substantially uniform.   The conjugate according to any one of claims 13 to 16, wherein the double-stranded nucleotide composition is substantially uniform.   18. A conjugate according to any of claims 13 to 17, wherein the duplex length is from about 20 to about 50 base pairs.   15. A conjugate according to claim 14 wherein the duplex is attached to or near one end of a bond platform molecule. 15. The conjugate of claim 14, wherein the polynucleotide duplex is (CA) ₁₀ : (TG) ₁₀ and the bond platform molecule is derivatized triethylene glycol.   21. A conjugate according to any of claims 13 to 20, wherein the molar ratio of duplex to bond platform molecule ranges from 2: 1 to 8: 1.   21. A conjugate according to any of claims 13 to 20, wherein the molar ratio of duplex to bond platform molecule is from 4: 1 to 6: 1.   20. The conjugate according to claim 19, wherein the conjugate is an immunotolerant of human systemic lupus erythematosus. 21. The conjugate of claim 20, having the formula:

  The binding of the double strand and the bond platform molecule comprises covalently bonding the single stranded polynucleotide to the bond platform molecule, and annealing the complementary single strand to the combined single strand to form a double strand 25. A conjugate according to any one of claims 19, 23 and 24 comprising the step of forming   11. The conjugate of claim 10, wherein the biologically active molecule is an immunogen analog, wherein the analog has a B cell epitope of the immunogen and no T cell epitope of the immunogen.   27. The conjugate of claim 26, wherein the immunogen analog is a polypeptide.   27. A conjugate according to claim 26, wherein the immunogen is a foreign immunogen. 29. The foreign immunogen is a biological agent, allergen, Rh / D immunogen associated with Rh hemolytic disease , alpha-sperm associated with male infertility, or a carbohydrate complex associated with rheumatic fever. The conjugate according to 1.   27. A conjugate according to claim 26, wherein the immunogen is an autoimmunogen.   31. The conjugate of claim 30, wherein the autoimmunogen is associated with thyroiditis, stroke or myasthenia gravis.   32. A conjugate according to any of claims 26 to 31, wherein the immunogen and the analog are of the same chemical species.   32. A conjugate according to any of claims 26 to 31, wherein the immunogen and the analog are of different chemical species.   11. A conjugate according to claim 10, wherein the biologically active molecule is linked to the bond platform molecule via a linker molecule.   35. The conjugate of claim 34, wherein the linker comprises a sulfhydryl moiety and the binding site comprises a thiophilic group.   The conjugate according to any one of claims 1 to 5, wherein the binding site is a thiophilic group.   37. The thiophilic group of claim 36, wherein the thiophilic group is selected from the group consisting of haloacetyl, alkyl halide, alkyl sulfonate, maleimide, α, β-unsaturated carbonyl, alkylmercury, sulfhydryl, and α, β-unsaturated sulfone. Conjugate.   37. The conjugate according to claim 36, wherein the binding site is selected from maleimide, [alpha] -haloacetyl groups, or other Michael addition receptors.   The conjugate according to claim 38, wherein the binding site is an α-haloacetyl group.   40. The conjugate according to claim 39, wherein the [alpha] -haloacetyl group is bromoacetyl.   41. A method for producing a conjugate according to any of claims 1 to 40, comprising forming a conjugate by covalently binding a biologically active molecule to a bond platform molecule. (a) covalently binding a single-stranded polynucleotide of at least about 20 bases to a linker molecule;
(b) covalently binding a plurality of said single-stranded polynucleotides bound to a linker molecule to a bond platform; and
(c) annealing the complementary single-stranded polynucleotide of at least 20 bases to the single-stranded polynucleotide bound to the bond platform molecule to form a double strand. A method for producing the conjugate according to any one of 23, 24. 34. A pharmaceutical composition for treating an antibody-mediated disease comprising the conjugate according to any of claims 26 to 33 , wherein the pharmaceutical composition is formulated for administration by injection.   44. The pharmaceutical composition of claim 43, wherein the composition is suitable for reducing antibody levels.   44. The pharmaceutical composition according to claim 43, wherein the composition is suitable for inhibiting antibody production.   A pharmaceutical composition for treating human systemic lupus erythematosus comprising a conjugate according to any of claims 11 to 25, wherein the composition is formulated for administration by injection, Said pharmaceutical composition.   A pharmaceutical composition for treating human systemic lupus erythematosus, wherein a therapeutically effective amount of a conjugate according to any of claims 11 to 25 is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.   41. A pharmaceutical composition comprising a conjugate according to any of claims 1 to 40 and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 34. A pharmaceutical composition for treating an antibody mediated disease comprising a therapeutically effective amount of a conjugate according to any of claims 26 to 33 formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.

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