JP3831935B2

JP3831935B2 - Vitamin K2 sensitivity prediction method

Info

Publication number: JP3831935B2
Application number: JP25671199A
Authority: JP
Inventors: 正孝白木; 尉義大内; 孝之細井
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: JP2001078798A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はビタミンＫ２感受性予測方法に関し、特にヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、アポリポプロテインＥ（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子の遺伝子多型を分析し、その結果から、該試料が、ビタミンＫ２に対する感受性において特定の優先性を示すヒト由来のものであるかどうかを予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢者、特に閉経後の女性において、骨粗鬆症の発生が問題となっている。その患者数は、高齢化に伴い、既に約１０００万人を越えたとも言われ、その発症により、骨折あるいは寝たきりへとつながるため、重大な社会問題のひとつとなっている。
このような骨粗鬆症に関して、現在、治療薬としては、カルシウム製剤、ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、エストロゲンなどの種々の薬剤が用いられている。しかし、その治療効果は患者の体質によって、それぞれ異なり、これらの薬剤をどのように使い分けるかについては、現在のところ、正確な検討はほとんどされていない。
【０００３】
また、骨粗鬆症の治療は、患者には高齢者が多く、治療も長期に渡るため、単剤投与が原則とされている。しかし、投与する治療薬が効果的であるかを調べる方法は、現在のところ、実際に数年間、患者に該薬剤を投与して、その結果を見て判断するより方法がなく、きわめて非効率的であり、効果のない治療薬を用いた場合には、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を損なうこととなる。
【０００４】
骨粗鬆症に関する治療法、治療薬の研究は近年、盛んであり、それにつれて、治療薬と体質（遺伝的要因）に関する研究もすすめられている。たとえば、骨粗鬆症と遺伝的要因の研究としては、N.A.MorrisonらによるビタミンＤ受容体遺伝子多型の研究（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6665-6669,1992）を皮切りとして、多くの研究が行われている。
【０００５】
本発明者らは既に、ビタミンＤ受容体遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子およびエストロゲン遺伝子が、骨粗鬆症のビタミンＤ治療、ビタミンＫ２治療およびエストロゲン治療の治療効果と関係があることを見いだした（1997年、骨代謝学会、要旨集第52頁）。また、ＡｐｏＥ遺伝子に関しては、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型に４型を含む群（４／４、３／４、２／４型）は、４型を含まない群（２／２、２／３、３／３）に対して、ビタミンＫ２に対する反応が有意に低かったことを発表している（Osteoporosis Japan、第５巻、第２号、第187〜191頁、1997年）
【０００６】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の目的は、骨粗鬆症患者もしくは将来、骨粗鬆症を発症する可能性のあるヒトが、ビタミンＫ２に対して、いかなる感受性を有するかを予測する手段を提供することであり、それによって、患者のＱＯＬを向上させることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討を重ねた結果、ヒト由来の試料から得たゲノムＤＮＡを、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型について分析することにより、得られた遺伝子型に基づいて、ビタミンＫ２に対して、いかなる感受性をもつヒト由来の検体であるかを予測可能であることを見いだした。すなわち、本発明者らは、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型がＥ３／４型である場合も、ビタミンＫ２に対する感受性が高い傾向を示すことを見い出した。このことより、これまで発表されたＡｐｏＥ遺伝子の４型（Ｅ２／４、Ｅ３／４、Ｅ４／４型）を有する場合が、ビタミンＫ２感受性が低いのではなく、ＡｐｏＥ遺伝子の３型遺伝子を有さない場合（Ｅ２／２、Ｅ２／４、Ｅ４／４型）が、ビタミンＫ２感受性が低いのであり、ＡｐｏＥ遺伝子の３型（Ｅ２／３、Ｅ３／３、Ｅ３／４型）遺伝子を有する場合が、ビタミンＫ２感受性が高く、さらに、３型遺伝子多型のホモ・タイプであるＥ３／３型の場合に、最も感受性が高くなる傾向を示すことを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明はヒトから採取した試料中に含まれるゲノムＤＮＡから、アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を分析し、該試料がビタミンＫ２に対する感受性において特定の優先性を示すヒト由来のものであると予測するビタミンＫ２感受性予測方法である。
【０００９】
また、前記アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型は、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４であり、Ｅ３／３である試料はビタミンＫ２に対する感受性が非常に高いヒト由来のものであり、Ｅ２／３またはＥ３／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が高いヒト由来のものであり、およびＥ２／２、Ｅ２／４またはＥ４／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が低いまたはほとんど有さないヒト由来の試料であると予測する上記ビタミンＫ２感受性予測方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、アポリポプロテインＥ（以下、ＡｐｏＥ）とは、リポプロテインの粒子の構造を維持、安定化する機能および脂質代謝の補助因子としての機能を有する、２９９個のアミノ酸残基からなる、分子量約３４，２００の蛋白質である。該蛋白質は末梢から肝臓へのコレステロールの逆輸送系に重要な役割を果たしている。該ＡｐｏＥをコードする遺伝子は、ヒト第１９染色体上に存在して、４つのエクソンと３つのイントロンからなる。該遺伝子には、２、３、４の３つの遺伝子型が存在する。該ＡｐｏＥは、古くから２型蛋白質がIII型高脂血症の原因であることが判明しており、近年、４型蛋白質がアルツハイマー型痴呆の発症との関連を言われいている。また、最近は、骨量などとの関係も言われるようになった（特開平9-299337号公報）。
【００１１】
また、ＡｐｏＥ遺伝子には、主に３つの遺伝子型（遺伝子多型、２型、３型および４型）が存在しており、１１２番目のアミノ酸をシステイン、１５８番目のアミノ酸をアルギニンとコードしている遺伝子を３型もしくは野生型とよび、１１２番目のアミノ酸をアルギニンとコードしている遺伝子を４型、１５８番目のアミノ酸をシステインとコードしている遺伝子を２型とよぶ。
【００１２】
本発明において、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型（遺伝子多型）とは、２本鎖ＤＮＡが有する遺伝子多型から、Ｅ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４の６種である。
【００１３】
本発明に供されるヒト由来試料とは、ヒトゲノムＤＮＡを含有するものであれば、特に限定されない。好ましくは、全血や分画された血球細胞、表皮細胞や毛髪などの入手が容易な細胞や組織などが用いられる。この場合、細胞を破砕した上で、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合溶液などによる慣用法によってＤＮＡの抽出を行い、遺伝子多型検出の試料とする。
【００１４】
本発明の遺伝子多型の分析方法は、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を区別し得る方法であれば、特に制限されず、各種のハイブリダイゼーション法、シークエンス法、ＲＦＬＰ法などの通常のＤＮＡの検出、分析法を利用することが出来る。また、ＡｐｏＥ蛋白質を含む試料から、等電点電気泳動などの方法により、ＡｐｏＥ蛋白質の表現形を検出し、そこからＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を検出することも可能である。
【００１５】
上記分析方法として、例えば、リバース・ハイブリダイゼーション法では、ヒトゲノムＤＮＡより選択的にＡｐｏＥ遺伝子を標識プライマーでＰＣＲで増幅した後、増幅ＤＮＡを担体上に固定化された各遺伝子型に対応した捕捉プローブとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズした増幅ＤＮＡの標識を検出することにより、遺伝子多型を分析する。
また、例えばＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ヒトゲノムＤＮＡより選択的にＡｐｏＥ遺伝子を増幅した後、制限酵素HhaIによって制限酵素処理を行い、その後に電気泳動をおこない、検出されたバンド・パターンによってＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を分析することが出来る。
また、ＰＣＲ後に各種のＤＮＡ塩基解析装置（シークエンサー）を用いて、増幅ＤＮＡの塩基配列を解析し、その結果よりＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を分析することもできる。
【００１６】
本発明において、ビタミンＫ２とは脂溶性のビタミンであるビタミンＫの一種であり、オステオカルシンのGla化を促進して骨形成を促進し、破骨細胞の形成を抑制して骨吸収を抑制していると考えられている。また、ここでビタミンＫ２に対する感受性とは、該治療薬の骨粗鬆症治療効果の度合いの大きさを意味する。本発明においては、薬剤投与前と投与後（6ヶ月から数年後）の腰椎骨密度の変化率を比較し、その増大率が大きい（もしくは減少率が少ない）程、薬剤感受性が高いと定義する。すなわち、ビタミンＫ２に対する感受性において、「非常に高い」とは、腰椎骨密度の変化率が投与６ヶ月後において、＋０．５％を越える場合をいい、また、「高い」とは、投与６ヶ月後の腰椎骨密度の変化率が正である場合をいい、さらに、「低いまたはほとんど有さない」とは、投与６ヶ月後の腰椎骨密度の変化率が−１％以下である場合を言う。
【００１７】
【実施例】
以下、参考例および実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
参考例１
無作為に選んだ原発性骨粗鬆症患者１０１人より血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。該ゲノムＤＮＡを鋳型として下記のプライマー対を用いてＡｐｏＥ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅したのちに、制限酵素HhaIを用いたＲＦＰＬで、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を検出した（Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI, James E.Hixson et al. Journal of Lipid Research vol.31,1990 page.545の方法に従った）。
ＡｐｏＥ遺伝子断片増幅用プライマー
forward: 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' （配列番号１）
reverse: 5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3' （配列番号２）
増幅条件は、変性:９５℃、1分、アニーリング:６０℃、１分、伸張:７２℃、２分（30サイクル）で行った。
【００１８】
この増幅法により、多型部位を含む２４４ｂｐのＡｐｏＥ遺伝子断片が増幅された。これを制限酵素HhaIで処理した後、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にかけた。電気泳動終了後にエチジウムブロマイドでゲルを染色し、バンド・パターンよりＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型を判別した。
2/2型 16,18,38,81,91bp
2/3型 16,18,33,38,48,81,91bp
2/4型 16,18,19,33,38,48,72,81,91bp
3/3型 16,18,33,38,48,91bp
3/4型 16,18,19,33,38,48,72,91bp
4/4型 16,18,19,33,38,48,72bp
【００１９】
ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子型３型の数に従って、3/3型をＡｐｏＥ３+/+型、2/3、3/4型をＡｐｏＥ３+/-型、2/2、2/4、4/4型をＡｐｏＥ３-/-と分類する。
上記１０１人のうち、ＡｐｏＥ３+/+型であった者は７９人、ＡｐｏＥ３+/-型であった者は１８人、ＡｐｏＥ３-/-型であった者は４人であった。
【００２０】
上記のようにして遺伝子多型分析を行った１０１人の腰椎骨密度を測定した。これらの患者には、ビタミンＫ２を４５ｍｇ/日、２年間以上投与した。ほぼ６ヶ月、１年後、２年後に腰椎骨密度を測定し、骨密度の変化率を求めた。これとは別に、骨粗鬆症治療薬を何も投与しなかった患者４３人について、コントロール群として同様に６ヶ月後の骨密度の変化を測定した。その骨密度の変化率の平均値は、−１．５８％であった。その結果を表１および図１に示す。
【００２１】
【表１】

表中の数字は、腰椎骨密度の変化率の平均値（％）を示し、かっこ内はその標準偏差を示す。
【００２２】
上記表１および図１より明らかなように、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型が３型を含む３／３、２／３、３／４型の場合は、３型を含まない２／２、２／４、４／４型に比べて、明らかに骨密度の変化率が高く、ビタミン感受性が高かった。また、３型を２つ含む３／３型の場合が最も感受性が高かった。３型を含まない２／２、２／４、４／４型の場合、その骨塩変化率は治療を行わなかったコントロール群とほぼ同じであり、これらの遺伝子多型の場合、ビタミンＫ２に対する感受性がほとんどなく、ビタミンＫ２が骨粗鬆症治療薬としてほとんど機能していないことが示された。
【００２３】
実施例１
ある日本人の骨粗鬆症と診断された患者から血液を採取し、血球細胞を分画して、常法によりゲノムＤＮＡを抽出精製する。該ゲノムＤＮＡを鋳型とし、参考例１と同様の方法で、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を分析する。得られた遺伝子多型がＥ２／２、Ｅ２／３、Ｅ２／４、Ｅ３／３、Ｅ３／４またはＥ４／４であり、Ｅ３／３である試料はビタミンＫ２に対する感受性が非常に高いヒト由来のものであり、Ｅ２／３またはＥ３／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が高いヒト由来のものであり、およびＥ２／２、Ｅ２／４またはＥ４／４である試料はビタミンＫ２に対する感受性が低いまたはほとんど有さないヒト由来の試料であると予測する。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、ビタミンＫ２投薬前に、対象となる患者がビタミンＫ２に対して高い感受性をもっているかどうかを高確率で予測することができる。したがって、その治療薬を投与すべきか、別の治療薬を投与すべきかについて適切な判断をする上で、非常に役立つ指針となり、治療効果の低い薬剤を長期投与することを回避でき、患者のＱＯＬを向上する上できわめて有用である。
【００２５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型とビタミンＫ２治療に対する応答を示す図である。図中、ＬＢＭＤは腰椎骨塩量変化を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for predicting vitamin K2 sensitivity, and in particular, gene polymorphism of an apolipoprotein E (hereinafter referred to as ApoE) gene is analyzed from genomic DNA contained in a sample collected from humans. The present invention relates to a method for predicting whether or not the substance is derived from a human having a specific preference in sensitivity to K2.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the occurrence of osteoporosis has become a problem in elderly people, particularly postmenopausal women. The number of patients is said to have already exceeded about 10 million with the aging of the population, and the occurrence of such cases leads to fractures or bedriddenness, which is a serious social problem.
Regarding such osteoporosis, various drugs such as calcium preparations, vitamin D3, vitamin K2, and estrogen are currently used as therapeutic agents. However, the therapeutic effect differs depending on the patient's constitution, and at present, there is little accurate examination on how to use these drugs properly.
[0003]
In addition, as for the treatment of osteoporosis, since there are many elderly people in the patient and the treatment is for a long period of time, single-agent administration is a principle. However, the method to determine whether the therapeutic agent to be administered is effective is currently much less efficient than actually administering the drug to the patient for several years and judging the result. When a therapeutic agent that is effective and ineffective is used, the patient's QOL (Quality of Life) is impaired.
[0004]
In recent years, research on therapeutic methods and therapeutic agents relating to osteoporosis has been active, and accordingly, research on therapeutic agents and constitutions (genetic factors) is also being promoted. For example, as for research on osteoporosis and genetic factors, many studies have been conducted, starting with the study of vitamin D receptor gene polymorphism by NAMorrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6665-6669,1992). Has been done.
[0005]
The present inventors have already found that vitamin D receptor gene, ApoE gene and estrogen gene are related to the therapeutic effects of vitamin D treatment, vitamin K2 treatment and estrogen treatment of osteoporosis (1997, Bone Metabolism Society). , Abstracts, p. 52). In addition, regarding the ApoE gene, the group containing 4 type in the polymorphism of the ApoE gene (4/4, 3/4, 2/4 type) is the group not containing 4 type (2/2, 2/3, 3/3), it was announced that the response to vitamin K2 was significantly lower (Osteoporosis Japan, Vol. 5, No. 2, pp. 187-191, 1997)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a means to predict what susceptibility a patient with osteoporosis or in the future who may develop osteoporosis has to vitamin K2, thereby providing a QOL for the patient. It is to improve.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
Based on the genotype obtained by analyzing the genomic DNA obtained from a human-derived sample for the genotype of the ApoE gene as a result of repeated diligent studies to achieve the above object, the present inventors Thus, the present inventors have found that it is possible to predict what sensitivity a human-derived specimen has to vitamin K2. That is, the present inventors have found that even when the ApoE gene polymorphism is E3 / 4 type, it tends to be highly sensitive to vitamin K2. Therefore, the case of having ApoE gene type 4 (E2 / 4, E3 / 4, E4 / 4 type) published so far does not have low sensitivity to vitamin K2, but has type 3 gene of ApoE gene. When not (E2 / 2, E2 / 4, E4 / 4 type), the vitamin K2 sensitivity is low, and the ApoE gene has 3 type (E2 / 3, E3 / 3, E3 / 4 type) genes However, the present inventors have found that E3 / 3 type, which is highly sensitive to vitamin K2, and is homozygous for type 3 gene polymorphism, shows the tendency to become the most sensitive and has reached the present invention.
[0008]
In other words, the present invention is derived from a human having a specific preference in sensitivity to vitamin K2 by analyzing the gene polymorphism of the apolipoprotein E gene from genomic DNA contained in a sample collected from human. This is a method for predicting vitamin K2 sensitivity.
[0009]
The gene polymorphism of the apolipoprotein E gene is E2 / 2, E2 / 3, E2 / 4, E3 / 3, E3 / 4 or E4 / 4, and a sample that is E3 / 3 is sensitive to vitamin K2. A sample that is of very high human origin and that is E2 / 3 or E3 / 4 is of human origin that is highly sensitive to vitamin K2 and that is E2 / 2, E2 / 4 or E4 / 4 Is a method for predicting vitamin K2 sensitivity, which predicts that the sample is derived from a human having low or almost no sensitivity to vitamin K2.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, apolipoprotein E (hereinafter referred to as ApoE) is a molecular weight composed of 299 amino acid residues having a function of maintaining and stabilizing the structure of lipoprotein particles and a function as a cofactor of lipid metabolism. There are about 34,200 proteins. The protein plays an important role in the reverse transport system of cholesterol from the periphery to the liver. The gene encoding ApoE is present on human chromosome 19 and consists of 4 exons and 3 introns. There are three genotypes of the gene, 2, 3, and 4. In ApoE, type 2 protein has long been found to be the cause of type III hyperlipidemia, and type 4 protein has recently been implicated in the development of Alzheimer's dementia. Recently, a relationship with bone mass and the like has also been said (Japanese Patent Laid-Open No. 9-299337).
[0011]
The ApoE gene has three main genotypes (gene polymorphism, type 2, type 3 and type 4). The 112th amino acid is encoded as cysteine and the 158th amino acid is encoded as arginine. The gene coding for the arginine at the 112th amino acid is called type 4 and the gene coding for the 158th amino acid for cysteine is called type 2.
[0012]
In the present invention, the genotype (gene polymorphism) of the ApoE gene refers to E2 / 2, E2 / 3, E2 / 4, E3 / 3, E3 / 4 or E4 / from the gene polymorphism of the double-stranded DNA. There are 6 types.
[0013]
The human-derived sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains human genomic DNA. Preferably, whole blood, fractionated blood cells, cells and tissues such as epidermis cells and hair that are easily available are used. In this case, after disrupting the cells, DNA is extracted by a conventional method using a mixed solution of phenol, chloroform, isoamyl alcohol, or the like, to obtain a gene polymorphism detection sample.
[0014]
The gene polymorphism analysis method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method that can distinguish the gene polymorphism of the ApoE gene, and various DNA detection methods such as various hybridization methods, sequencing methods, and RFLP methods, Analytical methods can be used. It is also possible to detect the phenotype of the ApoE protein from a sample containing the ApoE protein by a method such as isoelectric focusing, and to detect the gene polymorphism of the ApoE gene therefrom.
[0015]
As the above analysis method, for example, in the reverse hybridization method, the ApoE gene is selectively amplified from human genomic DNA by PCR with a labeled primer, and then the capture probe corresponding to each genotype immobilized on the carrier is used. And polymorphism is analyzed by detecting the label of the hybridized amplified DNA.
For example, in the PCR-RFLP method, after selectively amplifying the ApoE gene from human genomic DNA, the restriction enzyme treatment is performed with the restriction enzyme HhaI, followed by electrophoresis, and the gene of the ApoE gene is detected according to the detected band pattern. A polymorphism can be analyzed.
In addition, after PCR, the base sequence of the amplified DNA can be analyzed using various DNA base analyzers (sequencers), and the gene polymorphism of the ApoE gene can be analyzed based on the result.
[0016]
In the present invention, vitamin K2 is a kind of vitamin K, which is a fat-soluble vitamin, which promotes osteocalcin glazing to promote bone formation, suppresses osteoclast formation and suppresses bone resorption. It is believed that Further, where the sensitivity to vitamin K2, means the size of the degree of osteoporosis therapeutic effect of the therapeutic agent. In the present invention, the rate of change of lumbar spine bone density before and after drug administration (6 months to several years later) is compared, and the larger the increase rate (or the lower the decrease rate), the higher the drug sensitivity is defined. To do. That is, in the sensitivity to vitamin K2, “very high” means that the rate of change of lumbar vertebra bone density exceeds + 0.5% after 6 months of administration, and “high” means 6 months of administration. The rate of change in the lumbar vertebra density afterwards is positive, and “low or hardly” means that the rate of change in lumbar vertebrae density after 6 months of administration is −1% or less. .
[0017]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail using reference examples and examples.
Reference example 1
Blood was collected from 101 randomly selected patients with primary osteoporosis, blood cells were fractionated, and genomic DNA was extracted and purified by a conventional method. After amplification of the ApoE gene fragment by PCR using the genomic DNA as a template and the following primer pair, the gene polymorphism of the ApoE gene was detected by RFPL using the restriction enzyme HhaI (Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaI, James E. Hixson et al. Journal of Lipid Research vol. 31, 1990 page. 545).
Primer for amplification of ApoE gene fragment
forward: 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3 '(SEQ ID NO: 1)
reverse: 5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Amplification conditions were denaturation: 95 ° C., 1 minute, annealing: 60 ° C., 1 minute, extension: 72 ° C., 2 minutes (30 cycles).
[0018]
By this amplification method, a 244 bp ApoE gene fragment containing the polymorphic site was amplified. This was treated with the restriction enzyme HhaI and then subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. After the electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide, and the gene polymorphism of the ApoE gene was discriminated from the band pattern.
2/2 type 16,18,38,81,91bp
2/3 type 16,18,33,38,48,81,91bp
2/4 type 16,18,19,33,38,48,72,81,91bp
3/3 type 16,18,33,38,48,91bp
3/4 type 16,18,19,33,38,48,72,91bp
4/4 type 16,18,19,33,38,48,72bp
[0019]
According to the number of genotype 3 of ApoE gene, 3/3 type is ApoE3 + / + type, 2/3, 3/4 type is ApoE3 +/- type, 2/2, 2/4, 4/4 type Classify as ApoE3 − / −.
Of the 101 persons, 79 were ApoE3 + / +, 18 were ApoE3 +/−, and 4 were ApoE3 − / −.
[0020]
Lumbar vertebra bone density was measured for 101 persons who were subjected to genetic polymorphism analysis as described above. These patients received vitamin K2 at 45 mg / day for over 2 years. Lumbar vertebra bone density was measured approximately 6 months, 1 year later, and 2 years later to determine the rate of change in bone density. Separately from this, the change in bone density after 6 months was measured for 43 patients who had not received any osteoporosis therapeutic agent as a control group. The average value of the bone density change rate was -1.58%. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0021]
[Table 1]

The numbers in the table indicate the average value (%) of the change rate of the lumbar bone density, and the standard deviation is shown in parentheses.
[0022]
As is clear from Table 1 and FIG. 1, when the polymorphism of the ApoE gene is 3/3, 2/3, 3/4 including

type

3, 2/2, 2 / not including type 3 Compared with

types

4 and 4/4, the rate of change in bone density was clearly higher and vitamin sensitivity was higher. In addition, the sensitivity was highest in the case of 3/3 type including two 3 types. In cases of 2/2, 2/4, and 4/4, which do not include type 3, the bone mineral density change rate is almost the same as in the control group that was not treated. In the case of these gene polymorphisms, There was little sensitivity and it was shown that vitamin K2 hardly functions as an osteoporosis therapeutic agent.
[0023]
Example 1
Blood is collected from a Japanese patient diagnosed with osteoporosis, blood cells are fractionated, and genomic DNA is extracted and purified by a conventional method. Using the genomic DNA as a template, the ApoE gene polymorphism is analyzed in the same manner as in Reference Example 1. The obtained polymorphism is E2 / 2, E2 / 3, E2 / 4, E3 / 3, E3 / 4 or E4 / 4, and the sample having E3 / 3 is derived from a human highly sensitive to vitamin K2. Samples that are E2 / 3 or E3 / 4 are from humans that are highly sensitive to vitamin K2, and samples that are E2 / 2, E2 / 4, or E4 / 4 are sensitive to vitamin K2 Predicts that the sample is from a human with low or almost no.
[0024]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to predict with high probability whether the subject patient has high sensitivity to vitamin K2 before vitamin K2 administration. Therefore, it can be a very useful guide in making an appropriate decision as to whether to administer the therapeutic or another therapeutic, avoiding long-term administration of drugs with low therapeutic effects, and the patient's QOL It is extremely useful in improving
[0025]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the gene polymorphism of the apolipoprotein E gene and the response to vitamin K2 treatment. In the figure, LBMD indicates changes in lumbar bone mineral density.

Claims

A method for analyzing a polymorphism of the apolipoprotein E gene from genomic DNA contained in a sample collected from a human and predicting that it is a human-derived sample having a high degree of osteoporosis treatment effect of vitamin K2,
The gene polymorphism of the apolipoprotein E gene is E2 / 2, E2 / 3, E2 / 4, E3 / 3, E3 / 4 or E4 / 4,
Vitamin K2 sensitivity that predicts that a sample that is E3 / 3, E2 / 3, or E3 / 4 is a human-derived sample that is more sensitive to vitamin K2 than a sample that is E2 / 2, E2 / 4, or E4 / 4 Prediction method.

The method for predicting vitamin K2 sensitivity according to claim 1, wherein the sample of E3 / 3 is predicted to be a human-derived sample having the highest degree of osteoporosis treatment effect of vitamin K2.