JP3827420B2 - Method for producing amide compound using microorganism - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体またはその菌体処理物を用いて、水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成させる反応方法に関する。より詳細には、反応開始時または反応途中の該ニトリル化合物の濃度を水性媒体中での該ニトリル化合物の飽和濃度以上に設定することにより、効率的にニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見されている。該酵素、該酵素を含有する微生物の菌体またはその菌体処理物等を用いて水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が知られている（特公昭６２−２１５１９）。ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法では、それまでの化学的な方法と比べて、ニトリル化合物の転化率及び選択率が高いメリットがある。しかし、その一方で、酵素反応の基質となるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物は一般的に強い生物毒性を有する有機化合物であり、その反応系内の濃度が高くなるにつれて該酵素を急速に失活させることが従来より指摘されている。そのため、工業的にニトリル化合物からアミド化合物を製造するに際しては、反応系内のニトリル化合物及びアミド化合物の濃度を低く保つことにより、ニトリルヒドラターゼ活性を安定に保持して反応を円滑に進行させることが重要であると考えられてきた。
【０００３】
一例を挙げると、ニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造する方法として、長沢・山田の報文（遺伝、別冊１号、３６頁から４５頁、１９８８年３月）が知られている。該報文中（３８頁、右段、下から８行目）には、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法について、「静止菌体を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で５〜１５℃、ｐＨ７．０付近でアクリロニトリルと反応させる。このとき、高濃度のアクリロニトリルはニトリルヒドラターゼ活性を阻害するので反応の進行に伴い経時的に分割添加していく」と記載されている。
【０００４】
特公昭５６−３８１１８号公報には、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを基質とする該水和反応を氷点から１５℃までの低温下で行わせる方法が開示されているが、その際の基質濃度について、「本酵素反応においては基質は反応系内おいて常に溶解状態となるように加えることが適当である」と記載されている。さらに、「回分法による場合には、通常フィーディング方式がとられるが、前記固定化菌体を含む水性懸濁液に温度を氷点〜１５℃に保ちつつアクリロニトリルまたはメタクリロニトリルを撹拌下に滴下すればよい。」と記載されており、ニトリル化合物の分割添加の必要性が示されている。
【０００５】
特公昭５７−１２３４号では、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルよりアクリルアミドまたはメタクリルアミドを連続的に製造するに際して、ニトリル化合物の濃度を反応混合物に対して溶解する範囲内の量で連続的に供給する方法が開示されており、当該公報においてもニトリル化合物の濃度を低くコントロールすることの重要性が示されている。
【０００６】
ニトリルヒドラターゼを用いて水性媒体中でニトリル化合物を水和させてアミド化合物を製造する場合、反応の進行と共に生成したアミド化合物は水性媒体中に蓄積し続けてゆく。生成するアミド化合物の最大の濃度は、個々の微生物由来のニトリルヒドラターゼの性質と反応温度により決定される。すなわち、その反応温度において該酵素とアミド化合物を接触させた場合に、該酵素が直ちに失活してしまうアミド化合物濃度の下限値以上には、反応液中のアミド化合物の濃度は高くなることはない。尚、今後、このアミド化合物の濃度を限界のアミド化合物濃度と記す。
【０００７】
前述の長沢・山田の報文では、「４０％にも達するアクリルアミドの生産は現在の化学的方法によっては不可能とされ、ここにアクリルアミドの工業的製法としての酵素法の有効性が強く示唆された。」とある（３９頁、左段、上から２行目）。このように、工業的には、反応終了時のアミド化合物の濃度が高いことが重要であり、この限界のアミド化合物濃度が高いニトリルヒドラターゼが有用である。
【０００８】
反応液中のニトリル化合物濃度を低くコントロールして反応を行わせた場合、ニトリルヒドラターゼがニトリル化合物及びアミド化合物と接触する時間が相対的に長くなり、限界のアミド化合物濃度までアミド化合物濃度を蓄積させるためには、相対的に反応系内のニトリルヒドラターゼ活性を多くする必要がある。酵素使用量の増大は、工業的なアミド化合物の製造にとって、コスト面から不利になるので、反応液中のニトリル化合物濃度を低くコントロールする反応方法は、必ずしも効率的な反応方法とは言えない。
【０００９】
ところで、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌株は、アミド化合物を対応するカルボン酸化合物に水和する酵素であるアミダーゼを有していることがほとんどである。このため、該微生物菌株を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成させた場合、該アミダーゼによって対応するカルボン酸化合物が副成することが知られている。これを避けるためには、アミダーゼ活性を有していない変異微生物菌株を取得したり、アミダーゼ活性が相対的に低くなるような微生物菌体の調製方法を工夫したりする必要があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造するより効率的な方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の目的はニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物から対応するアミドを製造する方法において、より少ない菌体量でより高いアミド濃度の反応液を得ることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の限界のアミド化合物濃度がある程度以上に高いニトリルヒドラターゼは対応するニトリル化合物に対する耐性も高いことを見出した。そしてそのようなアミド化合物に対する耐性がある程度以上に高いニトリルヒドラターゼを有する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物から対応するアミドを生成する反応を行うと、その反応液中では、アクリロニトリルやメタクリロニトリル等の生物毒性の強いニトリル化合物による該酵素の失活は急速には進まず、水性媒体中の該ニトリル化合物の濃度が高くなるにつれて該酵素の反応速度が相対的に増加することが判明した。即ち、従来より行われていた反応系内のニトリル化合物の濃度を常に低く制御する必要のない、水性媒体中でのニトリル化合物の飽和濃度以上となるように反応液にアクリロニトリルを添加する反応方法が新たに見出された。
【００１３】
そして、本発明者らによる検討の結果、新たに見いだされた反応方法によれば、同じ酵素量（活性量）を使用した場合に従来の方法に比してより短時間で該ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換できること、より少量の酵素量（活性量）でより高い濃度のアミド化合物水溶液を得ることができることが確認された。
本発明者らは以上の知見を基に本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を利用してニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法であって、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後にもニトリルヒドラターゼの活性を保持しているような該微生物の菌体または菌体処理物を、水性媒体中でニトリル化合物と接触させてアミド化合物を生成させる反応の反応開始時または反応途中のニトリル化合物濃度が水性媒体中でのニトリル化合物の飽和濃度以上となるように反応液にニトリル化合物を添加することを特徴とするアミド化合物の製造方法を提供するものである。
【００１５】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体または菌体処理物を用いて、水性媒体中でニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造するに際して、ニトリル化合物より対応するアミド化合物を生成する反応の開始時またはその途中において、水性媒体中での該ニトリル化合物の飽和濃度以上に該ニトリル化合物を反応系内に添加することにより、効率的かつ短時間でニトリル化合物から対応するアミド化合物を高濃度で生成することが可能となる。
【００１６】
【発明実施の形態】
以下、本発明の詳細について概説する。
本発明におけるニトリル化合物は炭素数が２〜８のニトリル化合物である。その中でも、特にアクリロニトリル、メタクリロニトリル、クロトンニトリルを好適な例として挙げることができる。
【００１７】
本発明におけるニトリルヒドラターゼとは、微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体を１０℃にて６０分間処理した後にも該ニトリルヒドラターゼの活性が保持されているニトリルヒドラターゼである。
【００１８】
種々の微生物のニトリルヒドラタアーゼのアミド化合物に対する耐性は様々である。アミド化合物としてアクリルアミドを例にとると、ニトリルヒドラターゼをアクリルアミド水溶液中で１０℃にて処理する場合、１０重量％のアクリルアミド水溶液中で６０分後に完全に失活してしまうニトリルヒドラターゼがある一方、５０重量％のアクリルアミド水溶液中で６０分間処理しても失活しないニトリルヒドラターゼがある。このように、前述したニトリルヒドラターゼの限界のアクリルアミド濃度は個々のニトリルヒドラターゼによって異なっている。
【００１９】
工業的には、反応終了時のアミド化合物の濃度が高いことが重要であり、アクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した後に失活しない（活性を保持している）アクリルアミド濃度が３０重量％以上のニトリルヒドラターゼの利用が特に有効である。また、工業的にアミド化合物を生産する場合、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を反応に供することがコスト面から有利である。
【００２０】
即ち、本発明においては、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体をアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理した場合に、ニトリルヒドラターゼの活性が保持されるアクリルアミド濃度の上限が３０重量％以上のニトリルヒドラターゼを産生する微生物の菌体またはその菌体処理物を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明における微生物とは、該微生物が発現しているニトリルヒドラターゼが、αサブユニット内に配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列または配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有しており、且つ３０重量％のアクリルアミド水溶液中で１０℃にて６０分間処理してもニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物である。具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００２２】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も本発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。尚、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も本発明でいうニトリルヒドラターゼを産生する微生物に含まれる。
【００２３】
本発明における微生物を本発明の製造方法に使用するに際しては、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離・回収して得る方法が挙げられる。
【００２４】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られれる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当する。
【００２５】
本発明における微生物の菌体または菌体処理物は、回分反応に供することもできるし、連続反応に供することもできる。また、懸濁床として用いてもよいし固定床として用いてもよい。その際の反応液中での該微生物の菌体または菌体処理物の濃度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り特に制限はされるものではない。
【００２６】
本発明における水性媒体とは、水、または、リン酸塩等の緩衝剤・硫酸塩や炭酸塩等の無機塩・アルカリ金属の水酸化物・アミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液を示す。
【００２７】
本発明においては、水性媒体中のニトリル化合物が反応の進行に伴って消費されると同時にニトリル相より供給されることにより、その濃度が飽和濃度前後に相対的に長時間維持されることが重要である。このため、回分反応または連続反応いずれの場合でも、必要なニトリル化合物の全量を反応開始時に一括して添加するか、反応途中における水性媒体中でのニトリル化合物濃度が飽和濃度以上に保たれるようにニトリル化合物を逐次添加することが好ましい。また、回転翼やラインミキサー等の適当な混合装置を使用して、静置下において二相に分離する水性媒体相とニトリル相を十分に混和させることも重要である。
【００２８】
ニトリル化合物を反応開始時に一括添加する場合のニトリル化合物の濃度の下限は、反応開始時において該ニトリル化合物の飽和濃度以上であればよい。一方、その濃度の上限は特に限定されるものではなく、想定する反応終了時のアミド化合物濃度およびニトリル化合物濃度により任意に決定すればよい。また、未反応のニトリル化合物は、反応後に蒸留等の手段により反応液より除去することもできる。よって、想定する反応終了時のアミド化合物濃度に達した時点でもニトリル化合物が過剰となるようにニトリル化合物を添加することもできる。
【００２９】
具体的には、アクリロニトリルがニトリル化合物である場合、水に対する本化合物の飽和濃度は約７重量％であるので、約７重量％以上、５０重量％以下の範囲が好適である。また、メタクリロニトリルまたはクロトンニトリルがニトリル化合物である場合、水に対するこれらの化合物の飽和濃度は約２重量％であるので、約２重量％以上５０重量％以下の範囲が好適である。
【００３０】
本発明における反応は、一般的には常圧下で行われるが、水性媒体中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体の氷点以上であれば特に制限されないが、好ましくは０℃から５０℃、より好ましくは１０℃から３０℃の範囲内で行われる。一方、ｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されないが、好ましくはｐＨ６からｐＨ１０、より好ましくはｐＨ７からｐＨ９の範囲内である。
【００３１】
本発明の方法におけるアミド化合物を生成する反応においては、ニトリルヒドラターゼが直ちに失活するようなことはなく、むしろニトリル水和反応は良好に進行する。そればかりか、水性媒体相中のニトリル化合物は、反応の進行に伴って消費されると同時にニトリル相より供給されるため、その濃度は常に飽和濃度付近に維持される。このため、その反応温度における最大の反応速度またはそれに近い速度でニトリル水和反応が進行するので、相対的に短時間かつ効率的に該ニトリル化合物から対応するアミド化合物が生成することになる。
【００３２】
また、ニトリル化合物を水性媒体中での飽和濃度以上に添加した後、反応の進行に伴って反応系内のニトリル化合物濃度は徐々に低下し、水性媒体中の飽和濃度以下になる。これにより反応速度も徐々に低下するが、その時点までは最大の反応速度またはそれに近い速度でニトリル水和反応が進行するので、実質的に短時間かつ効率的に該ニトリル化合物から対応するアミド化合物が生成することになる。
【００３３】
さらに、本発明の製造方法によれば、水性媒体中の該ニトリル化合物の濃度を高くすることによって、微生物菌体中のアミダーゼによる対応するカルボン酸化合物の生成が相対的に抑制されるという副次的な効果を得ることもできる。
【００３４】
得られたアミド化合物は、反応液より遠心分離等の通常の公知の方法により菌体または菌体処理物を分離した後、そのままの水溶液として利用してもよいし、膜濃縮やスプレードライ濃縮等の方法により濃縮して結晶を得ても良い。また、菌体または菌体処理物を分離した後、活性炭、イオン交換樹脂、イオン交換膜等も用いて着色物質等の不純物を除去することにより、アミド化合物の純度をさらに高めることもできる。
【００３５】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。
尚、各実施例及び比較例におけるＨＰＬＣ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用した。また、アクリルアミド、メタクリルアミド及びクロトンアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出し、アクリロニトリル、アクリル酸、メタクリロニトリル及びクロトンニトリルは２１０ｎｍの吸光度により検出した。
【００３６】
［実施例１］アクリルアミド濃度耐性の測定（１）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００３７】
該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００３９】
続いて、同じ該湿菌体５０ｍｇを４０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩を含む３０重量％のアクリルアミド水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１０℃にてゆるやかにかくはんさせながら６０分間接触させた。この後、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離した。続いて、５０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行う操作を２回繰り返すことにより該菌体を洗浄した。洗浄した該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００４０】
３０重量％のアクリルアミド水溶液と接触させる前の反応速度を１００％とし、１０℃にて６０分間接触させた後の反応速度を相対値として比較した。その結果、相対値は７０％であった。すなわち、活性残存率は７０％であった。
【００４１】
［実施例２］ニトリル化合物の濃度と反応速度の比較
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルが第１表(表１)に示した終濃度になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出し、反応開始時のアクリロニトリル濃度が１重量％の場合の反応速度を１００％として、それぞれのアクリロニトリル濃度場合の相対値を相対反応速度として比較した（第１表(表１)及び第１図(図１)）。
【００４２】
【表１】
［実施例３］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを３６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応した。反応開始から８時間後にＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４４】
［実施例４］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１２ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。さらに反応開始と同時にアクリロニトリルを１時間当たり１２ｇの速度で２時間添加し、アクリロニトリルを合わせて３６ｇ添加した。反応開始から８時間後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４５】
［比較例１］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（１）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり２ｇの速度で１８時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は１７．４重量％であり、アクリロニトリル濃度は０．８重量％であった。すなわち、転化率は９４％であった。さらに、反応開始から２６時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は３３．０重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．９重量％であった。すなわち、転化率は９３％であった。
【００４６】
［比較例２］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（２）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり１．２ｇの速度で３０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中のアクリルアミド濃度は１０．３重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．０重量％であった。すなわち、転化率は８８％であった。さらに、反応開始から３８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は３２．６重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．１重量％であった。すなわち、転化率は９２％であった。
【００４７】
［実施例５］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体３．０ｇを９７．０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にメタクリロニトリルを８．６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から２４時間後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはメタクリルアミドのみが存在（濃度＝１０．０重量％）しており、メタクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４８】
［実施例６］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
実施例１と同様の方法により、ＭＴ−１０８２２株の湿菌体を調製した。該湿菌体１．５ｇを９８．５ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にクロトンニトリル（但し、ｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体の混合物）を１８．７ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から２４時間後に析出したクロトンアミドの結晶を３０℃にて完全に溶解した後に、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはクロトンアミド（但し、ｃｉｓ体とｔｒａｎｓ体の混合物）のみが存在（濃度＝２０．０重量％）しており、クロトンニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００４９】
［実施例７］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（５）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特開平０８−５６６８４号記載のシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila ）（ＪＣＭ３０９５）を一白菌耳植菌し、５０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００５０】
該湿菌体１０．０ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを３６ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝３５．０重量％）しており、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５２】
［実施例８］アクリルアミド濃度耐性の測定（２）
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に特公平０６−５５１４８号記載のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される）を一白菌耳植菌し、３０℃・１３０ｒｐｍにて７２時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００５３】
該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００５５】
続いて、同じ該湿菌体５０ｍｇを４０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩を含む３０重量％のアクリルアミド水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１０℃にてゆるやかにかくはんさせながら６０分間接触させた。この後、遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを懸濁液より分離した。続いて、５０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行う操作を２回繰り返すことにより該菌体を洗浄した。洗浄した該湿菌体１０ｍｇを１０ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルの終濃度が１４重量％になるように添加し、１０℃にてかくはんを行いながら５分間反応を行った。１０ｍＭのリン酸水溶液を９０ｇ添加して反応を終了させた後、ＨＰＬＣ分析により反応終了液中のアクリルアミド濃度を測定した。続いて、単位湿菌体及び単位反応時間あたりのアクリルアミドの生成速度（＝反応速度）を算出した。
【００５６】
３０重量％のアクリルアミド水溶液と接触させる前の反応速度を１００％とし、１０℃にて６０分間接触させた後の反応速度を相対値として比較した。その結果、相対値は９５％であった。すなわち、活性残存率は９５％であった。
【００５７】
［実施例９］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（６）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを６０ｇ一括添加して、２０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝５０．０重量％）しており、アクリロニトリルおよびアクリル酸は認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５８】
［実施例１０］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（７）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを６０ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４７．７重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．９重量％であった。すなわち、転化率は９５％であった。さらに、反応開始から１２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は５０．０重量％、アクリル酸濃度は０．０５重量％であり、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００５９】
［実施例１１］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（８）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製した。該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを２０ｇ一括添加して、１０℃にてかくはんを行いながら反応を開始した。さらに反応開始と同時にアクリロニトリルを１時間当たり２０ｇの速度で２時間添加し、アクリロニトリルを合わせて６０ｇ添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４６．７重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．６重量％であった。すなわち、転化率は９３％であった。さらに、反応開始から１２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は５０．０重量％、アクリル酸濃度は０．０５重量％であり、アクリロニトリルは認められなかった。すなわち、転化率は１００％であった。
【００６０】
［比較例３］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（３）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製し、該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり３ｇの速度で２０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中のアクリルアミド濃度は２３．６重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．７重量％であった。すなわち、転化率は９１％であった。さらに、反応開始から３２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４６．１重量％、アクリル酸濃度は０．２重量％であり、アクリロニトリル濃度は２．９重量％であった。すなわち、転化率は９２％であった。
【００６１】
［比較例４］ニトリル化合物のアミド化合物への変換（４）
実施例８と同様の方法により、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の湿菌体を調製し、該湿菌体０．１５ｇを１００ｇの５０ｍＭのトリス塩酸塩水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１時間当たり２ｇの速度で３０時間添加した。反応開始から８時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は１６．４重量％であり、アクリロニトリル濃度は１．５重量％であった。すなわち、転化率は８９％であった。さらに、反応開始から４２時間後に実施例１と同様のＨＰＬＣ分析により反応液の分析を行った。その結果、反応液中のアクリルアミド濃度は４３．５重量％、アクリル酸濃度は０．３重量％であり、アクリロニトリル濃度は４．８重量％であった。すなわち、転化率は８７％であった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来に比べより短期間内に少量の酵素量で高ニトリル濃度の反応液を得ることが可能であり、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率的に製造することが可能となる。しかも、本発明の方法によれば、ニトリル化合物に対応するカルボン酸化合物の副成も抑制される。そのため、本発明の方法は、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を利用した工業的なアミド化合物の生産にとって極めて有用である。
【００６３】
【配列表】
【００６４】
【図面の簡単な説明】
【図１】反応開始時のアクリロニトリル濃度に対する反応速度を比較した図である。横軸は反応開始時のアクリロニトリル濃度（重量％）、縦軸は相対反応速度（％）を表している。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a reaction method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound in an aqueous medium using a microbial cell having nitrile hydratase activity or a treated product thereof. More specifically, a method for efficiently producing the corresponding amide compound from the nitrile compound by setting the concentration of the nitrile compound at the start of the reaction or during the reaction to be equal to or higher than the saturation concentration of the nitrile compound in the aqueous medium About.
[0002]
[Prior art]
Recently, nitrile hydratase, an enzyme having nitrile hydration activity that hydrates nitrile groups and converts them into amide groups, has been discovered. A method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound in an aqueous medium using the enzyme, a microbial cell containing the enzyme, or a treated product of the microbial cell is known (Japanese Patent Publication No. Sho 62-21519). The method for producing an amide compound using nitrile hydratase has a merit that the conversion rate and selectivity of the nitrile compound are high as compared with conventional chemical methods. However, on the other hand, nitrile compounds that serve as substrates for enzyme reactions and amide compounds that are products are generally organic compounds with strong biotoxicity, and as the concentration in the reaction system increases, the enzyme rapidly It has been pointed out to deactivate. Therefore, when industrially producing amide compounds from nitrile compounds, the concentration of nitrile compounds and amide compounds in the reaction system is kept low so that nitrile hydratase activity is stably maintained and the reaction proceeds smoothly. Has been considered important.
[0003]
For example, as a method for industrially producing an amide compound from a nitrile compound, a report by Nagasawa and Yamada (Genetics, volume 1, pages 36 to 45, March 1988) is known. In the report (page 38, right column, 8th line from the bottom), a method for producing acrylamide from acrylonitrile is described in “Acrylonitrile at a concentration of 20 mg / ml at 5 to 15 ° C. and pH 7.0. At this time, since acrylonitrile at a high concentration inhibits nitrile hydratase activity, it is added in portions over time as the reaction proceeds.
[0004]
Japanese Patent Publication No. 56-38118 discloses a method in which the hydration reaction using acrylonitrile or methacrylonitrile as a substrate is carried out at a low temperature from the freezing point to 15 ° C. “In this enzyme reaction, it is appropriate to add the substrate so that it is always in a dissolved state in the reaction system”. Furthermore, in the case of the batch method, the feeding method is usually used, but acrylonitrile or methacrylonitrile is dropped into the aqueous suspension containing the immobilized cells while stirring at a temperature of from freezing to 15 ° C. Need to be divided and added to the nitrile compound.
[0005]
In Japanese Examined Patent Publication No. 57-1234, when acrylamide or methacrylamide is continuously produced from acrylonitrile or methacrylonitrile, the concentration of the nitrile compound is continuously supplied in an amount within the range in which it is dissolved in the reaction mixture. This publication discloses the importance of controlling the concentration of the nitrile compound to be low.
[0006]
When a nitrile compound is hydrated in an aqueous medium using nitrile hydratase to produce an amide compound, the amide compound produced as the reaction proceeds continues to accumulate in the aqueous medium. The maximum concentration of the amide compound produced is determined by the nature of the nitrile hydratase from the individual microorganism and the reaction temperature. That is, when the enzyme and the amide compound are brought into contact at the reaction temperature, the concentration of the amide compound in the reaction solution is higher than the lower limit of the amide compound concentration at which the enzyme is immediately deactivated. Absent. In the future, the concentration of this amide compound will be referred to as the limit amide compound concentration.
[0007]
According to the aforementioned Nagasawa / Yamada report, “40% acrylamide production is impossible by the current chemical method, which strongly suggests the effectiveness of the enzymatic method as an industrial method for producing acrylamide. "(Page 39, left column, second line from the top). Thus, industrially, it is important that the concentration of the amide compound at the end of the reaction is high, and nitrile hydratase having a high concentration of the amide compound at this limit is useful.
[0008]
When the reaction is performed with the nitrile compound concentration in the reaction solution controlled low, the time for the nitrile hydratase to contact the nitrile compound and the amide compound becomes relatively long, and the amide compound concentration is accumulated up to the limit amide compound concentration. In order to achieve this, it is necessary to relatively increase the nitrile hydratase activity in the reaction system. The increase in the amount of enzyme used is disadvantageous from the cost viewpoint for the production of industrial amide compounds, and therefore the reaction method for controlling the nitrile compound concentration in the reaction solution to be low is not necessarily an efficient reaction method.
[0009]
By the way, most microbial strains having nitrile hydratase activity have amidase which is an enzyme that hydrates an amide compound to a corresponding carboxylic acid compound. For this reason, it is known that when the corresponding amide compound is produced from the nitrile compound using the microorganism strain, the corresponding carboxylic acid compound is formed as a by-product by the amidase. In order to avoid this, it has been necessary to obtain a mutant microbial strain having no amidase activity or to devise a method for preparing a microbial cell so that the amidase activity is relatively low.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a more efficient method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a microorganism.
[0011]
An object of the present invention is a method for producing a corresponding amide from a nitrile compound using a bacterial body of a microorganism producing nitrile hydratase or a treated product thereof, and a reaction solution having a higher amide concentration with a smaller amount of bacterial body. There is in getting.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that a nitrile hydratase having a concentration of the above-mentioned limit amide compound that is higher than a certain level is also highly resistant to the corresponding nitrile compound. When a reaction is carried out to produce the corresponding amide from the nitrile compound using a microbial cell having a nitrile hydratase having a higher tolerance to such an amide compound or a treated product thereof, Then, the inactivation of the enzyme by a highly toxic nitrile compound such as acrylonitrile or methacrylonitrile does not proceed rapidly, and the reaction rate of the enzyme relatively increases as the concentration of the nitrile compound in the aqueous medium increases. It turned out to increase. That is, there is a conventional reaction method in which acrylonitrile is added to a reaction solution so as to be equal to or higher than a saturated concentration of a nitrile compound in an aqueous medium, which does not always need to be controlled at a low concentration in the reaction system. Newly found.
[0013]
As a result of the investigation by the present inventors, according to the newly found reaction method, when the same enzyme amount (activity amount) is used, the nitrile compound can be handled in a shorter time than the conventional method. It was confirmed that the amide compound aqueous solution having a higher concentration can be obtained with a smaller amount of enzyme (activity).
The present inventors have completed the present invention based on the above findings.
[0014]
That is, the present invention is a method for producing an amide compound from a nitrile compound using a microbial cell producing a nitrile hydratase or a treated product thereof,The nitrile hydratase expressed by the microorganism has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing within the α subunit, andIn 30 wt% acrylamide aqueous solution1A reaction in which an amide compound is produced by contacting a microbial cell or a treated product of a microorganism that retains the activity of nitrile hydratase even after being treated at 0 ° C. for 60 minutes with an nitrile compound in an aqueous medium. A method for producing an amide compound is characterized in that the nitrile compound is added to the reaction solution so that the concentration of the nitrile compound at the start of or during the reaction is equal to or higher than the saturation concentration of the nitrile compound in the aqueous medium. is there.
[0015]
According to the present invention, when a corresponding amide compound is produced from a nitrile compound in an aqueous medium using a microbial body or a treated product of a microorganism that produces nitrile hydratase, the corresponding amide compound is produced from the nitrile compound. By adding the nitrile compound to the reaction system at the start of or during the reaction, the nitrile compound is added to the reaction system at a concentration higher than the saturated concentration of the nitrile compound in the aqueous medium. It can be produced at a high concentration.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The details of the present invention will be outlined below.
The nitrile compound in the present invention is a nitrile compound having 2 to 8 carbon atoms. Of these, acrylonitrile, methacrylonitrile, and crotonnitrile are particularly preferable examples.
[0017]
The nitrile hydratase in the present invention isThe nitrile hydratase expressed by the microorganism has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing within the α subunit, and a 30 wt% aqueous acrylamide solution Among them, the nitrile hydratase retains the activity of the nitrile hydratase even after treating microbial cells producing nitrile hydratase at 10 ° C. for 60 minutes.
[0018]
The resistance of various microorganisms to amide compounds of nitrile hydratase varies. Taking acrylamide as an example of the amide compound, when nitrile hydratase is treated in an aqueous acrylamide solution at 10 ° C., there is a nitrile hydratase that is completely inactivated after 60 minutes in a 10% by weight aqueous acrylamide solution. There is nitrile hydratase that does not deactivate even when treated in 50% by weight aqueous acrylamide solution for 60 minutes. Thus, the limit acrylamide concentration of nitrile hydratase described above varies depending on the individual nitrile hydratase.
[0019]
Industrially, it is important that the concentration of the amide compound at the end of the reaction is high, and the acrylamide concentration that does not deactivate (retains activity) after being treated in an aqueous acrylamide solution at 10 ° C. for 60 minutes is 30 wt. It is particularly effective to use nitrile hydratase in an amount of at least%. Moreover, when producing an amide compound industrially, it is advantageous from a cost viewpoint to use for the reaction the microbial body of the microorganism which produces nitrile hydratase, or its processed microbial body.
[0020]
That is, in the present invention, the upper limit of the acrylamide concentration at which the activity of nitrile hydratase is maintained is 30% by weight when microbial cells producing nitrile hydratase are treated in an aqueous acrylamide solution at 10 ° C. for 60 minutes. It is preferable to use the microbial cell producing the above nitrile hydratase or a treated product thereof.
[0021]
In the present inventionFineWhat is a living thing?The nitrile hydratase expressed by the microorganism has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing in the α subunit, and 30% by weight of acrylamide It is a microorganism that retains the activity of nitrile hydratase even when treated in aqueous solution at 10 ° C for 60 minutes. Specifically, the genus Nocardia, the genus Corynebacterium, the genus Bacillus, the thermophilic Bacillus genus, the Pseudomonas genus, the Micrococcus genus, the Rhodochrous species Rhodococcus genus, Acinetobacter genus, Xanthobacter genus, Streptomyces genus, Rhizobium genus, Klebsiella genus, Enterobacter genus represented by Pseudonocardia represented by the genus Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium or thermophila A preferred example is a microorganism belonging to the genus Pseudonocardia).
[0022]
In addition, a transformant in which a nitrile hydratase gene cloned from the microorganism is expressed in an arbitrary host is also included in the microorganism producing nitrile hydratase referred to in the present invention. In addition, the arbitrary host mentioned here includes Escherichia coli (as described in the examples below).Escherichia coli) Is a representative example, but is not limited to E. coli in particular.Bacillus subtilisAnd other microbial strains such as yeast and actinomycetes. As an example of such a case, MT-10822 (this strain was assigned to the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki Prefecture on February 7, 1996. -5785, deposited under the Budapest Treaty on the international recognition of deposits of microorganisms in the patent procedure). In addition, by using recombinant DNA technology, one or more of the constituent amino acids of the enzyme may be substituted, deleted, deleted or inserted with other amino acids to further enhance amide compound resistance, nitrile compound resistance, and temperature resistance. The transformant expressing the improved mutant nitrile hydratase is also included in the microorganism producing nitrile hydratase referred to in the present invention.
[0023]
When the microorganism in the present invention is used in the production method of the present invention, the microbial cell or the processed microbial cell of the microorganism is used. The microbial cells may be prepared using a general method known in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering. For example, after inoculating the microorganism in a normal liquid medium such as LB medium or M9 medium, an appropriate culture temperature (generally 20 ° C. to 50 ° C., but in the case of thermophilic bacteria, it may be 50 ° C. or higher) And then the microorganism is separated and collected from the culture solution by centrifugation.
[0024]
In addition, the microbial cell treated product in the present invention is an extract or ground product of the above microbial cell, a post-separated product obtained by separating and purifying the nitrile hydratase activity fraction of the extract or ground product, This refers to an immobilization product obtained by immobilizing a microbial cell body or an extract / ground product / post-separate of the cell body using an appropriate carrier, and so on as long as it has nitrile hydratase activity. Corresponds to the treated bacterial cells.
[0025]
In the present invention, the microbial cells or processed microbial cells can be subjected to batch reaction or continuous reaction. Further, it may be used as a suspended bed or a fixed bed. In this case, the concentration of the microorganism or the treated product of the microorganism in the reaction solution is not particularly limited as long as the mixing of the aqueous medium and the nitrile compound is not hindered.
[0026]
The aqueous medium in the present invention is water or an aqueous solution in which a buffering agent such as a phosphate, an inorganic salt such as a sulfate or carbonate, an alkali metal hydroxide or an amide compound is dissolved at an appropriate concentration. Show.
[0027]
In the present invention, it is important that the nitrile compound in the aqueous medium is consumed as the reaction proceeds and simultaneously supplied from the nitrile phase, so that the concentration is maintained for a relatively long time around the saturated concentration. It is. For this reason, in either case of batch reaction or continuous reaction, all the necessary amount of nitrile compound is added at the beginning of the reaction, or the concentration of nitrile compound in the aqueous medium during the reaction is kept above the saturated concentration. It is preferable to sequentially add nitrile compounds to. It is also important to sufficiently mix the aqueous medium phase and the nitrile phase, which are separated into two phases under static conditions, using an appropriate mixing device such as a rotary blade or a line mixer.
[0028]
The lower limit of the concentration of the nitrile compound when the nitrile compound is added at the start of the reaction may be equal to or higher than the saturation concentration of the nitrile compound at the start of the reaction. On the other hand, the upper limit of the concentration is not particularly limited, and may be arbitrarily determined depending on the assumed amide compound concentration and nitrile compound concentration at the end of the reaction. Further, the unreacted nitrile compound can be removed from the reaction solution by a means such as distillation after the reaction. Therefore, the nitrile compound can also be added so that the nitrile compound becomes excessive even when the expected amide compound concentration at the end of the reaction is reached.
[0029]
Specifically, when acrylonitrile is a nitrile compound, the saturated concentration of the present compound with respect to water is about 7% by weight, and therefore a range of about 7% by weight to 50% by weight is preferable. When methacrylonitrile or crotonnitrile is a nitrile compound, the saturation concentration of these compounds with respect to water is about 2% by weight, and therefore a range of about 2% by weight to 50% by weight is preferable.
[0030]
The reaction in the present invention is generally carried out under normal pressure, but can also be carried out under pressure in order to increase the solubility of the nitrile compound in an aqueous medium. The reaction temperature is not particularly limited as long as it is at or above the freezing point of the aqueous medium, but it is preferably performed within the range of 0 ° C to 50 ° C, more preferably 10 ° C to 30 ° C. On the other hand, the pH is not particularly limited as long as the nitrile hydratase activity is maintained, but it is preferably in the range of pH 6 to
[0031]
In the reaction for producing an amide compound in the method of the present invention, the nitrile hydratase is not immediately deactivated, but rather the nitrile hydration reaction proceeds well. In addition, since the nitrile compound in the aqueous medium phase is consumed as the reaction proceeds and simultaneously supplied from the nitrile phase, its concentration is always maintained near the saturated concentration. For this reason, since the nitrile hydration reaction proceeds at the maximum reaction rate at the reaction temperature or a rate close thereto, the corresponding amide compound is efficiently produced from the nitrile compound in a relatively short time.
[0032]
Further, after the nitrile compound is added to a saturation concentration or higher in the aqueous medium, the nitrile compound concentration in the reaction system gradually decreases with the progress of the reaction, and becomes lower than the saturation concentration in the aqueous medium. As a result, the reaction rate gradually decreases, but until that point, the nitrile hydration reaction proceeds at the maximum reaction rate or a rate close thereto, so that the corresponding amide compound is effectively removed from the nitrile compound in a substantially short time. Will be generated.
[0033]
Furthermore, according to the production method of the present invention, by increasing the concentration of the nitrile compound in the aqueous medium, the production of the corresponding carboxylic acid compound by the amidase in the microbial cell is relatively suppressed. The effect can also be obtained.
[0034]
The obtained amide compound may be used as an aqueous solution after separating the cells or treated cells from the reaction solution by a conventional method such as centrifugation, or may be used as an aqueous solution, membrane concentration, spray dry concentration, etc. Crystals may be obtained by concentrating by the above method. In addition, after separating the cells or the treated cells, the purity of the amide compound can be further increased by removing impurities such as colored substances using activated carbon, ion exchange resins, ion exchange membranes, and the like.
[0035]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
In addition, HPLC analysis in each Example and Comparative Example uses Finepak SIL C18-5 (250 × 4.6 φmm) manufactured by JASCO as a column, and uses 10 mM phosphoric acid aqueous solution containing 4% by volume of acetonitrile as a developing solution. did. Acrylamide, methacrylamide and crotonamide were detected by absorbance at 220 nm, and acrylonitrile, acrylic acid, methacrylonitrile and crotonnitrile were detected by absorbance at 210 nm.
[0036]
[Example 1] Measurement of acrylamide concentration tolerance (1)
A 500 ml baffled Erlenmeyer flask was prepared with 100 ml of a medium having the following composition and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium so that the final concentration was 50 μg / ml, and then MT-10822 strain (FERM BP-5785) was inoculated into white ears and cultured at 37 ° C. and 130 rpm for 20 hours. Only bacterial cells were separated from the culture solution by centrifugation (15000G × 15 minutes), then resuspended in 50 ml of physiological saline, and then centrifuged again to obtain wet cells. .
[0037]
10 mg of the wet cells are suspended in 10 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), added to this suspension so that the final concentration of acrylonitrile is 14% by weight, and stirred at 10 ° C. The reaction was carried out for 5 minutes. After 90 g of 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, the acrylamide concentration in the reaction completed solution was measured by HPLC analysis. Subsequently, the production rate (= reaction rate) of acrylamide per unit wet cell and unit reaction time was calculated.
[0039]
Subsequently, 50 mg of the same wet cells were suspended in a 30 wt% acrylamide aqueous solution (pH 8.0) containing 40 g of 50 mM Tris hydrochloride, and contacted for 60 minutes while gently stirring at 10 ° C. Thereafter, only the bacterial cells were separated from the suspension by centrifugation (15000 G × 15 minutes). Subsequently, the cells were resuspended in 50 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0) and then centrifuged again twice to wash the cells. 10 mg of the washed wet cells are suspended in 10 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), added to this suspension so that the final concentration of acrylonitrile is 14% by weight, and stirred at 10 ° C. The reaction was carried out for 5 minutes. After 90 g of 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, the acrylamide concentration in the reaction completed solution was measured by HPLC analysis. Subsequently, the production rate (= reaction rate) of acrylamide per unit wet cell and unit reaction time was calculated.
[0040]
The reaction rate before contacting with 30% by weight acrylamide aqueous solution was taken as 100%, and the reaction rate after contacting at 10 ° C. for 60 minutes was compared as a relative value. As a result, the relative value was 70%. That is, the activity remaining rate was 70%.
[0041]
[Example 2] Comparison of nitrile compound concentration and reaction rate
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. 10 mg of the wet cells are suspended in 10 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and acrylonitrile is added to the suspension so as to have a final concentration shown in Table 1 (Table 1). The reaction was carried out for 5 minutes while stirring at ° C. After 90 g of 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, the acrylamide concentration in the reaction completed solution was measured by HPLC analysis. Calculate the production rate of acrylamide per unit wet cell and unit reaction time (= reaction rate), the reaction rate when the acrylonitrile concentration at the start of the reaction is 1% by weight is taken as 100%, and the relative rate at each acrylonitrile concentration The values were compared as relative reaction rates (Table 1 (Table 1) and FIG. 1 (FIG. 1)).
[0042]
[Table 1]
[Example 3] Conversion of nitrile compound to amide compound (1)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. The wet cells (1.5 g) were suspended in 98.5 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 36 g of acrylonitrile was added all at once to this suspension, and the mixture was reacted at 10 ° C. while stirring. . After 8 hours from the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC analysis. As a result, only acrylamide was present in the reaction solution (concentration = 35.0 wt%), and acrylonitrile was not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0044]
[Example 4] Conversion of nitrile compound to amide compound (2)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. Suspend 1.5 g of the wet cells in 98.5 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), add 12 g of acrylonitrile all at once to this suspension, and perform the reaction while stirring at 10 ° C. Started. Further, simultaneously with the start of the reaction, acrylonitrile was added at a rate of 12 g per hour for 2 hours, and 36 g of acrylonitrile was added. Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, only acrylamide was present in the reaction solution (concentration = 35.0 wt%), and acrylonitrile was not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0045]
[Comparative Example 1] Conversion of nitrile compound to amide compound (1)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. 1.5 g of the wet cells were suspended in 98.5 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and acrylonitrile was added to the suspension at a rate of 2 g per hour for 18 hours. Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 17.4% by weight, and the acrylonitrile concentration was 0.8% by weight. That is, the conversion rate was 94%. Furthermore, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1 after 26 hours from the start of the reaction. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 33.0% by weight, and the acrylonitrile concentration was 1.9% by weight. That is, the conversion rate was 93%.
[0046]
[Comparative Example 2] Conversion of nitrile compound to amide compound (2)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. 1.5 g of the wet cells were suspended in 98.5 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and acrylonitrile was added to the suspension at a rate of 1.2 g per hour for 30 hours. 8 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 10.3% by weight, and the acrylonitrile concentration was 1.0% by weight. . That is, the conversion rate was 88%. Furthermore, 38 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 32.6% by weight, and the acrylonitrile concentration was 2.1% by weight. That is, the conversion rate was 92%.
[0047]
[Example 5] Conversion of nitrile compound to amide compound (3)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. The wet cells (3.0 g) were suspended in 97.0 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 8.6 g of methacrylonitrile was added all at once to this suspension, followed by stirring at 10 ° C. The reaction started while doing. 24 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, only methacrylamide was present in the reaction solution (concentration = 10.0% by weight), and no methacrylonitrile was observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0048]
[Example 6] Conversion of nitrile compound to amide compound (4)
In the same manner as in Example 1, a wet cell of MT-10822 strain was prepared. 1.5 g of the wet cells are suspended in 98.5 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 18.7 g of crotonnitrile (a mixture of cis and trans forms) is added to the suspension. Then, the reaction was started while stirring at 10 ° C. The crotonamide crystals precipitated 24 hours after the start of the reaction were completely dissolved at 30 ° C., and then the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, only crotonamide (however, a mixture of cis and trans isomers) was present in the reaction solution (concentration = 20.0% by weight), and no crotonnitrile was observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0049]
[Example 7] Conversion of nitrile compound to amide compound (5)
A 500 ml baffled Erlenmeyer flask was prepared with 100 ml of a medium having the following composition and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. In this medium, Pseudonocardia thermophila described in JP-A-08-56684 (Pseudonocardia thermophila ) (JCM3095) was inoculated in the ear and cultured at 50 ° C. and 130 rpm for 72 hours. Only bacterial cells were separated from the culture solution by centrifugation (15000G × 15 minutes), then resuspended in 50 ml of physiological saline, and then centrifuged again to obtain wet cells. .
[0050]
The wet cells 10.0 g were suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 36 g of acrylonitrile was added all at once to the suspension, and the reaction was started while stirring at 10 ° C. . Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, only acrylamide was present in the reaction solution (concentration = 35.0 wt%), and acrylonitrile was not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0052]
[Example 8] Measurement of acrylamide concentration tolerance (2)
A 500 ml baffled Erlenmeyer flask was prepared with 100 ml of a medium having the following composition and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. This medium was deposited as Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (FERM BP-1478) described in Japanese Patent Publication No. 06-55148 in accordance with the Budapest Treaty concerning the international approval of the deposit of microorganisms under the patent procedure. And distributed to all people upon request) and inoculated one white fungus, and cultured at 30 ° C. and 130 rpm for 72 hours. Only bacterial cells were separated from the culture solution by centrifugation (15000G × 15 minutes), then resuspended in 50 ml of physiological saline, and then centrifuged again to obtain wet cells. .
[0053]
10 mg of the wet cells are suspended in 10 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), added to this suspension so that the final concentration of acrylonitrile is 14% by weight, and stirred at 10 ° C. The reaction was carried out for 5 minutes. After 90 g of 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, the acrylamide concentration in the reaction completed solution was measured by HPLC analysis. Subsequently, the production rate (= reaction rate) of acrylamide per unit wet cell and unit reaction time was calculated.
[0055]
Subsequently, 50 mg of the same wet cells were suspended in a 30 wt% acrylamide aqueous solution (pH 8.0) containing 40 g of 50 mM Tris hydrochloride, and contacted for 60 minutes while gently stirring at 10 ° C. Thereafter, only the bacterial cells were separated from the suspension by centrifugation (15000 G × 15 minutes). Subsequently, the cells were resuspended in 50 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0) and then centrifuged again twice to wash the cells. 10 mg of the washed wet cells are suspended in 10 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), added to this suspension so that the final concentration of acrylonitrile is 14% by weight, and stirred at 10 ° C. The reaction was carried out for 5 minutes. After 90 g of 10 mM phosphoric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, the acrylamide concentration in the reaction completed solution was measured by HPLC analysis. Subsequently, the production rate (= reaction rate) of acrylamide per unit wet cell and unit reaction time was calculated.
[0056]
The reaction rate before contacting with 30% by weight acrylamide aqueous solution was taken as 100%, and the reaction rate after contacting at 10 ° C. for 60 minutes was compared as a relative value. As a result, the relative value was 95%. That is, the activity remaining rate was 95%.
[0057]
[Example 9] Conversion of nitrile compound to amide compound (6)
Rhodococcus rhodochrous J-1 strain wet cells were prepared in the same manner as in Example 8. 0.15 g of the wet cells were suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 60 g of acrylonitrile was added all at once to the suspension, and the reaction was started while stirring at 20 ° C. . Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, only acrylamide was present in the reaction solution (concentration = 50.0% by weight), and acrylonitrile and acrylic acid were not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0058]
[Example 10] Conversion of nitrile compound to amide compound (7)
Rhodococcus rhodochrous J-1 strain wet cells were prepared in the same manner as in Example 8. 0.15 g of the wet cells were suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), and 60 g of acrylonitrile was added all at once to the suspension, and the reaction was started while stirring at 10 ° C. . Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 47.7% by weight, and the acrylonitrile concentration was 1.9% by weight. That is, the conversion rate was 95%. Furthermore, 12 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 50.0% by weight, the acrylic acid concentration was 0.05% by weight, and acrylonitrile was not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0059]
[Example 11] Conversion of nitrile compound to amide compound (8)
Rhodococcus rhodochrous J-1 strain wet cells were prepared in the same manner as in Example 8. 0.15 g of the wet cells were suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0), 20 g of acrylonitrile was added all at once to the suspension, and the reaction was started while stirring at 10 ° C. . Further, simultaneously with the start of the reaction, acrylonitrile was added at a rate of 20 g per hour for 2 hours, and 60 g of acrylonitrile was added. Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 46.7% by weight, and the acrylonitrile concentration was 2.6% by weight. That is, the conversion rate was 93%. Furthermore, 12 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 50.0% by weight, the acrylic acid concentration was 0.05% by weight, and acrylonitrile was not observed. That is, the conversion rate was 100%.
[0060]
[Comparative Example 3] Conversion of nitrile compound to amide compound (3)
A wet cell of Rhodococcus rhodochrous strain J-1 was prepared in the same manner as in Example 8, and 0.15 g of the wet cell was suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0). Acrylonitrile was added to the suspension at a rate of 3 g per hour for 20 hours. 8 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 23.6% by weight and the acrylonitrile concentration was 1.7% by weight. . That is, the conversion rate was 91%. Further, 32 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 46.1% by weight, the acrylic acid concentration was 0.2% by weight, and the acrylonitrile concentration was 2.9% by weight. That is, the conversion rate was 92%.
[0061]
[Comparative Example 4] Conversion of nitrile compound to amide compound (4)
A wet cell of Rhodococcus rhodochrous strain J-1 was prepared in the same manner as in Example 8, and 0.15 g of the wet cell was suspended in 100 g of 50 mM Tris hydrochloride aqueous solution (pH 8.0). Acrylonitrile was added to the suspension at a rate of 2 grams per hour for 30 hours. Eight hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 16.4% by weight, and the acrylonitrile concentration was 1.5% by weight. That is, the conversion rate was 89%. Further, 42 hours after the start of the reaction, the reaction solution was analyzed by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, the acrylamide concentration in the reaction solution was 43.5% by weight, the acrylic acid concentration was 0.3% by weight, and the acrylonitrile concentration was 4.8% by weight. That is, the conversion rate was 87%.
[0062]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, it is possible to obtain a reaction solution having a high nitrile concentration with a small amount of enzyme in a shorter period of time than conventional methods, and it is possible to efficiently produce a corresponding amide compound from a nitrile compound. It becomes possible. Moreover, according to the method of the present invention, the by-generation of the carboxylic acid compound corresponding to the nitrile compound is also suppressed. Therefore, the method of the present invention is extremely useful for industrial production of amide compounds using microorganisms that produce nitrile hydratase.
[0063]
[Sequence Listing]
[0064]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph comparing reaction rates with respect to acrylonitrile concentration at the start of reaction. The horizontal axis represents the acrylonitrile concentration (% by weight) at the start of the reaction, and the vertical axis represents the relative reaction rate (%).
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