JP3825069B2

JP3825069B2 - Human epidermal keratinocyte activator

Info

Publication number: JP3825069B2
Application number: JP17959895A
Authority: JP
Inventors: 英成高原; 望樋浦; 智昭大栗; 英司山本
Original assignee: マルハ株式会社
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2021-09-20
Also published as: JPH0881378A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト表皮角化細胞の無血清培地による培養系が確立され、最近ではヒト表皮角化細胞の培養を目的とした細胞培養キットが販売されており〔例えば、（株）森永生科学研究所製、倉敷紡績（株）製、極東製薬工業（株）製〕、皮膚関連の研究技術は大きく進歩している。また、無血清培地を用いることにより、血清中に含まれる不明な成分を考慮する必要がなく、基礎的な研究を行いやすくなった。しかも、コストの削減、ロット差の解消、及び品質等の維持管理が容易となった。
【０００３】
その結果、種々の分野で無血清培地を利用した研究開発が進められており、特に、皮膚科領域では、創傷ややけど等の皮膚治療を目的とした臨床応用へと発展しようとしている。このような技術的進歩に伴い、皮膚治療の分野では、培養によって得られた皮膚を用いた治療が注目されている。即ち、重症やけど等を負ったため自力では皮膚を再生できない患者等に対する治療において、患者自身の皮膚断片を培養して表面積の大きい皮膚をつくり、これを移植するというものである。この治療の対象としては、例えば、体表70％以上に及ぶやけどや、広範囲のアザ、やけど後の痕跡等を負った患者が挙げられる。外国では、体表98％に及ぶやけどを負った患者に培養表皮の移植を行い、治療が成功した例もある。
【０００４】
しかし、治療に用いる患者自身の皮膚の培養期間が２〜３週間と長くかかること、又は培養を植え継ぐ回数 (継代数) を４回以上行うことは困難であることが依然として解決すべき問題点として残されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、皮膚の細胞の培養に要する培養時間を短縮でき、しかも、培養細胞の継代数を増加させることにより、目的とする皮膚の細胞を確実に多く得ることが可能なヒト表皮角化細胞賦活剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を無血清培養系に添加した培地でヒト表皮角化細胞を培養することにより、上記諸問題を解決し、さらに培養細胞システムの構築（ヒトの皮膚を保管・保存し、いつでも利用可能な状態にできる皮膚バンクを確かなものとすること）が期待されるほどの増殖活性が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、アルギン酸オリゴ糖又はその塩を有効成分として含むヒト表皮角化細胞賦活剤である。ここで、アルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、アルギン酸又はその塩をアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理したものが挙げられる。また、アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、分子量1,000 以下のものであるが、アルギン酸オリゴ糖又はその塩における２糖〜５糖の割合は、80〜100重量％である。
【０００８】
さらに、本発明は、ヒト表皮角化細胞用無血清培地に添加してヒト表皮角化細胞を増殖させるための、又は、やけど、創傷若しくはアザの治療のための、前記記載のヒト表皮角化細胞賦活剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の有効成分であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩に、アルテロモナス属に属する微生物が生産するアルギン酸又はその塩の分解酵素、即ちアルギン酸リアーゼを作用させて得ることができる。アルギン酸とは、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸を構成糖とする多糖類の一つであり、その塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、又はその混合物が挙げられる。また、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ糖、又はその混合物が挙げられる。
【０００９】
先ず、本発明の有効成分であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩を得るために用いられるアルギン酸リアーゼを生産する微生物について説明する。
かかる微生物としては、アルテロモナス属に属する微生物が挙げられ、アルテロモナスエスピー No.1786を例示することができる。
アルテロモナスエスピー No.1786は、魚介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブトガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性質及び生理学的性質は下記の表１に示す通りである。
【００１０】
【表１】

【００１１】
上記表１に示す菌株の性質に基づいて清水らの方法〔海洋微生物研究法、学会出版センター、 228〜239 (1985)参照〕に従って同定を試みた結果、上記微生物 (本菌株) は、アルテロモナス属に属することが判明した。尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM P-11685として寄託されている。
【００１２】
上記表１に示す性質を有する菌株を培養し、得られた培養物から通常の精製手法によってアルギン酸リアーゼを分離精製する。
培地としては、例えば、アルギン酸ナトリウム（10ｇ）、人工海水〔塩化ナトリウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム（７水和物）50mM、塩化カルシウム（２水塩）10mMを含有〕、クエン酸鉄アンモニウム10g/100ml 脱塩水、リン酸水素二カリウム（３水和物）7.5g/100ml 脱塩水、塩化アンモニウム20g/100ml 脱塩水及び１Ｍトリス−塩酸緩衝液を含む培地組成が挙げられる。
【００１３】
培養は、例えば、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日) 後、本培養 (25℃、１日) を行う。
このようにして上記微生物を培養することによって、アルギン酸リアーゼが蓄積された培養上清又は微生物を含む培養物が得られる。次に、該培養物を材料にして、蛋白質の分離、精製に用いられる方法によりアルギン酸リアーゼを得ることができる。例えば、上記培養液から分画分子量500,000 限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とするほか、更に、該粗アルギン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて精製を行ってもよい。各種クロマトグラフィーとしては、疎水、ゲルろ過、イオン交換、逆相、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の純度及びその分子量の確認のため、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電気泳動等を用いることもできる。
【００１４】
このようにして得られたアルギン酸リアーゼの酵素的性質は次の通りである。▲１▼作用：アルギン酸又はその塩を基質として上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼを反応させた時、反応生成物であるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の二重結合に由来する特異吸収波長である230nm における吸光度の増加、及び生じるオリゴ糖による還元力の増加が確認された。
【００１５】
▲２▼至適ｐＨ：上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼは、ｐＨ7.０〜7.５の範囲で相対活性量が高く、相対活性量が最大になるｐＨ7.０が至適ｐＨである。▲３▼至適温度及び熱安定性：上記微生物の生産するアルギン酸リアーゼは、45〜55℃の範囲で高くなる。
▲４▼酵素活性：下記組成の反応液を用い、アルギン酸ナトリウムとアルギン酸リアーゼを50℃にて10分間反応させ、生成したオリゴ糖量をネルソン・ソモギー法により測定することにより、アルギン酸リアーゼの酵素活性を測定できる。この酵素活性は、１μmoleのマンニュロン酸に相当するアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を生成する酵素量を１単位として示す。酵素活性測定には、アルギン酸カリウムを用いても良い。
（反応液の組成)
・0.５％アルギン酸ナトリウム（和光純薬製) を含む0.05Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 (ｐＨ7.０) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.45ml
・酵素液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・0.05ml
尚、本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩を製造するためには、上記本菌株を通常の変異手段を適用して得られる変異株であってアルギン酸リアーゼ産生能を有する菌株を培養して得られるアルギン酸リアーゼも使用することができる。
【００１６】
原料のアルギン酸又はその塩は若干のカルシウムを含有するため、それらを用いて製造したアルギン酸オリゴ糖又はその塩にもカルシウムが含まれている可能性がある。カルシウムは表皮角化細胞の角質化（分化) を促す物質として知られ、カルシウムが存在すると十分に増殖する前に角質化してしまうため、増殖段階の培地からカルシウムを除く必要がある。そこで、本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩について、脱塩及び脱カルシウム処理を行うのが好ましい。該処理には電気透析装置 (旭化成工業（株) 製、商品名、マイクロアシライザー) 等を用いることが好ましい。
【００１７】
次に、原料のアルギン酸又はその塩に、前記アルギン酸リアーゼを反応させてアルギン酸オリゴ糖又はその塩を得る。
尚、この場合、アルギン酸又はその塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は45〜55℃、反応時のｐＨが7.０〜7.５の条件で行うのが好ましく、50℃、ｐＨ7.０の条件で行うのが更に好ましい。
【００１８】
本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩としては、２糖〜５糖を中心とした分子量1,000 以下のものが挙げられ、アルギン酸オリゴ糖又はその塩における２糖〜５糖の割合は80〜100重量％である。
以上のようにして得られるアルギン酸オリゴ糖又はその塩の活性成分は、そのまま本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤として用いることができ、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥しておくことができる。
【００１９】
本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、例えば、患者から得られた表皮細胞を培養して増殖させることを目的として用いることができる。また、市販されている正常ヒト表皮角化細胞培養キットに本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を添加して培養液を調製し、これを用いて細胞の増殖を促進させることができる。この場合、培地に含めるヒト表皮角化細胞賦活剤の有効量は、0.001 〜100 mg／ml、好ましくは0.01〜0.1 mg／mlである。
【００２０】
また、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を医薬として適用する場合は、ヒト表皮角化細胞賦活作用により、各種疾患又は症状を治療又は改善する目的であれば、特に対象を限定しない。例えば、やけど、創傷又はアザ等に対する治療を特異目的として用いることができる。また、投与する方法は非経口により行い、その投与形態としては、クリーム剤、軟膏、パップ剤等が挙げられる。また、その投与量は動物か人間かによって、また、年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組成物として投与される有効量は、0.01〜100mg/cm²皮膚/日であり、１日１回から数回に分けて２日以上投与される。
【００２１】
本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を非経口投与する場合、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有させることもできる。
本発明において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩がヒト表皮角化細胞賦活剤として有効であることを裏付ける薬理試験を以下に述べる。
〔ヒト表皮角化細胞増殖試験〕
（株）森永生科学研究所製の正常ヒト表皮角化細胞培養キットを用い、ヒト表皮角化細胞の増殖に及ぼす本発明の増殖賦活剤としての効果を調べるため、以下の試験を行った。
【００２２】
〔試験例１〕
凍結した正常ヒト表皮角化細胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地で培養し、さらに２回継代した。そして、３回目の継代時に上記の無血清培地に濾過滅菌したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (濃度１mg/ml)を加え、経時的に細胞数を計測するとともに、細胞の増殖の様子を形態学的に観察した。尚、アルギン酸カリウムオリゴ糖を加えなかったものを対照として比較した。
【００２３】
その結果、図１に示す通り、アルギン酸カリウムオリゴ糖含有培養基（「○」）では、対照培養基（「●」）と比較して、顕著な細胞増加が認められた。一方、アルギン酸カリウムオリゴ糖の添加直後、６時間後及び48時間後における細胞の増殖の様子をそれぞれ図２、図３及び図４に写真として示した。対照培養基（写真上段）に比較して、アルギン酸カリウムオリゴ糖含有培養基（写真下段）の方が細胞数が多いのは写真からも明らかである。以上より、アルギン酸カリウムオリゴ糖を加えることによってヒト表皮角化細胞の増殖活性を高めることができた。
【００２４】
〔試験例２〕
凍結した正常ヒト表皮角化細胞を融解後、表皮角化細胞用無血清培地に濾過滅菌したアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培地（0.01、0.10、1.00mg/ml)で培養し、セミ・コンフルエント（付着細胞が培養器の面積の約80％を占める状態）に達したところで継代を行った。セミ・コンフルエントに達する時間及び継代数を検討し、細胞の様子を形態学的に観察した。尚、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を加えなかったものを対照として比較した。
【００２５】
表２にそれぞれの継代数におけるセミ・コンフルエント達成時間を示した。
【００２６】
【表２】

【００２７】
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基では、継代に適した状態であるセミ・コンフルエントになる時間が継代数４回以降徐々に長くなったものの、10回の継代でも細胞の増殖が可能であった。これに対して、対照培養基では、６回目の継代で増殖は認められず、継代できなかった。図５に継代数６回の細胞数の経時的変化を示した。アルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基では、0.01（「●」）、0.10（「▲」）、1.00（「■」）mg/ml のいずれの濃度においても４日でセミ・コンフルエントに達し、継代を行うことができたが、対照培養基（「○」）では、７日間培養しても増殖は認められず、継代できない状態になった。通常、継代数４回以降は、細胞の増殖活性は衰え、正常な状態は期待できない上に、６回以上の継代はできないが、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の添加により細胞の増殖活性が高められ、10回継代しても細胞が増殖可能であることが確認できた。継代数６回の対照培養基の培養７日目の細胞の形態学的様子を図６に、継代数６〜10回までのアルギン酸ナトリウムオリゴ糖含有培養基のセミ・コンフルエントに達した細胞の形態学的様子をそれぞれ図７〜11に写真として示した。写真から明らかな通り、対照培養基（図６）では６回目の継代で増殖しなくなったのに対して、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖を添加した培養基（図７〜11）では、継代数に関係なく正常な増殖を維持することができることがわかった。
【００２８】
以上より、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、継代数の少ない細胞の増殖活性を高めて培養期間を短縮できるだけでなく、４回以上の継代により増殖活性が衰えた細胞の賦活化にも効果があり、継代数を増加させることがわかった。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕アルギン酸塩オリゴ糖の製造
(1) アルギン酸リアーゼの調製
(培地組成)
・アルギン酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10 g
・人工海水^*1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1000 ml
・Fe stock^*2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1 ml
・Pi stock^*3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 ml
・NH₄stock^*4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 ml
・１Ｍトリス−塩酸緩衝液 (ｐＨ7.8)・・・・・・・・・・・・・・ 50 ml
────────────────────────────────────
＊１：人工海水：塩化ナトリウム 300mM、塩化カリウム10mM、硫酸マグネシウム (７水和物) 50mM、塩化カルシウム (２水塩) 10mM
＊２：Fe stock：クエン酸鉄アンモニウム 10g/100ml 脱塩水
＊３：Pi stock：リン酸水素二カリウム (３水和物) 7.5g/100ml 脱塩水
＊４：NH₄stock：塩化アンモニウム 20g/100ml 脱塩水
上記組成の培地を用い、凍結乾燥菌体アルテロモナス・エスピー No.1786株を２回前培養 (20℃、１日) 後、本培養 (25℃、１日) を行った。その結果、酵素活性が培養液１ml当たり、0.90単位であるアルギン酸リアーゼ培養液が生産された。
【００３０】
上記培養液から分画分子量500,000 限外濾過膜 (ロミコン社製) により菌体を取り除いて粗アルギン酸リアーゼ溶液とした。
(2) アルギン酸カリウムオリゴ糖の製造
アルギン酸カリウム (10.0kg) を90Ｌの脱塩水に溶解後、上記(1)で得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液 (50,000Ｕ) を加え、40℃で20時間攪拌しながら反応させた。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸カリウムオリゴ糖粉末を4.２kg得た。
【００３１】
尚、同様にしてアルギン酸ナトリウム、又はアルギン酸ナトリウムとアルギン酸カリウムとの混合物を用いれば、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、又はアルギン酸ナトリウムオリゴ糖とアルギン酸カリウムオリゴ糖との混合物が得られる。
(3) カルシウムを含まないアルギン酸塩オリゴ糖の製造
上記(2)で製造したアルギン酸カリウムオリゴ糖 (40.0ｇ) を電気透析装置 (旭化成工業 (株) 製、商品名、マイクロアシライザー) に供してカルシウムイオンを除去し、精製アルギン酸カリウムオリゴ糖 (39.5ｇ) を得た。そのオリゴ糖を精製前後で元素レベルで比較した。その結果を表３に示す。その結果からカルシウムを除去できたことが確認された。
【００３２】
【表３】

【００３３】
尚、同様にしてカルシウムを含まないアルギン酸ナトリウムオリゴ糖も調製することができる。
〔実施例２〕ヒト表皮角化細胞賦活剤を含む培養液の調製
(1) 正常ヒト表皮角化細胞用培地(I)
森永生科学研究所製角化細胞用無血清基礎液体培地の基礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0ml及び上皮成長因子2.5μgを添加混合し、完全液体培地を調製する。実施例１(3)で製造したアルギン酸ナトリウムオリゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃度１mg／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を含む培養液を得た。
【００３４】
(2) 正常ヒト表皮角化細胞用培地(II)
（株）森永生科学研究所製角化細胞用無血清基礎液体培地の基礎液体培地250mlに、付属の牛脳下垂体抽出液2.0ml及び上皮成長因子2.5 μgを添加混合し、完全液体培地を調製する。実施例１(3)で製造したアルギン酸カリウムオリゴ糖を濾過滅菌処理した後、完全液体培地へ濃度１mg／培地mlとなるように添加し、本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤を含む培養液を得た。
【００３５】
〔参考例１〕
本参考例は、本発明のアルギン酸カリウムオリゴ糖の重合度の分析例を示すものである。
重合度の決定は、薄層クロマトグラフィー (ＴＬＣ) により行った。
まず最初に、標準物質としてアルギン酸ナトリウムを１Ｎトリルオロ酢酸で 100℃、24時間で加水分解して調製した。尚、標準物質としてアルギン酸カリウムを用いても良い。
【００３６】
ＴＬＣは、以下のような条件で行った。
薄層プレート：シリカゲル60ＨＰＴＬＣプレート (メルク社製)
展開溶媒：１−ブタノール／酢酸／水 (５／２／３）
発色試薬：ジフェニルアミン−アニリン−リン酸試薬
上記アルギン酸ナトリウム加水分解物 (標準物質) をＴＬＣに供したところ、６つのスポットが得られた。６つのスポットのうち、一番移動度の大きいスポットは、Ｄ−マンニュロン酸 (シグマ社製Ｄ−マンニュロン酸ラクトンをアルカリ処理してラクトン環をはずしたもの、Ｒｆ値0.38、ＤＰ＝１) と一致した。さらに、他のスポットに関して、Bio-Gel P-2 (1.5×46cm、0.１Ｍ酢酸緩衝液 (ｐＨ4.０) で溶出) でゲル濾過して、精製オリゴ糖を得た。この精製オリゴ糖について、ウロン酸量 (オルシノール鉄塩酸法、Brown;Arch. Biochem., 11, 269-278 (1946)) と還元糖類 (ソモギーネルソン法、Somogyi；J.Biol. Chem., 195, 19-23(1952) 、Nelson；J.Biol. Chem., 153, 375-380(1944)) を測定し、ウロン酸量／還元糖量により重合度 (ＤＰ) を算出したところ、それぞれ２、３、４、５、６となった。
【００３７】
そして、これらの６種の精製オリゴ糖 (Ｄ−マンニュロン酸を含む) を用いて、薄層クロマトグラフィーにおける相対移動度 (Ｒｆ／１−Ｒｆ) の対数値と重合度 (ＤＰ) との関係を検討した結果、直線性の検量線が得られた（図12）。
図12中、「●」はアルギン酸ナトリウム加水分解物（標準物質）、「○」はアルギン酸オリゴ糖（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を示す。
【００３８】
次に、実施例１(2)の方法で調製したアルギン酸カリウムオリゴ糖を、DEAE GLASS（ナカナイテスク社製) を用いたNaClによる０から２Ｍグラジエント溶出により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、フラクションコレクターで分画した (特開平４−２６６８９６号公報参照) 。この溶出パターンを図13に示す。230nm に吸収のある画分である１〜８（以下、それぞれ「Ｐ−１」、「Ｐ−２」、・・・「Ｐ−８」とする）のうち、主な画分であるＰ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、Ｐ−８を回収し、それぞれの画分を Bio-Gel P-2（バイオラッド社製) を充填したカラムを用いて脱塩 (特開平４−１６９１８８号公報参照) した後凍結乾燥し、ＴＬＣに供した。その結果、図14に示すような薄層クロマトグラムが得られた。図14において、Ｏは原点を示す。ＭはＤ−マンニュロン酸、Ｓはアルギン酸ナトリウムの酵素分解オリゴ糖、２は、Ｐ−２画分、３はＰ−３画分、５は、Ｐ−５画分、８は、Ｐ−８画分を示す。また、ａ、ｂ、ｃ、ｄはＲｆ値を算出したスポットを示す。
【００３９】
図14の薄層クロマトグラムからわかるように、各サンプルとも１スポットにならなかった。そこで、主なスポットのＲｆ値を求め、図12に示した検量線の上にプロットし、重合度を検討した。その結果、分画したオリゴ糖 (Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−５、Ｐ−８) の重合度は、主に２〜５であることが明らかになった。
すなわち、アルギン酸カリウムオリゴ糖は、重合度２〜５の混合物であった。
【００４０】
本発明のアルギン酸カリウムオリゴ糖の構造の例を図15に示した。(a) は重合度２、(b) は重合度３、(c) は重合度４、(d) は重合度５のオリゴ糖をそれぞれ示している。構成糖はＤ−マンニュロン酸及びＬ−グルロン酸であるが、ホモ型、ヘテロ型どちらの場合もあり、「-COOR」基のＲとしては、Ｈ、Ｎａ又はＫの各場合がある。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、ヒト表皮角化細胞の培養系をより安定化させ、実用的に利用可能な４回以上の継代を可能にするヒト表皮角化細胞賦活剤が提供される。
本発明のヒト表皮角化細胞賦活剤は、継代数の少ない細胞の増殖活性を高めて培養期間を短縮できるだけでなく、継代を繰り返して増殖能力の著しく衰えた細胞の不活化にも効果があり、10回以上継代しても増殖が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト表皮角化細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図２】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図３】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図４】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図５】継代を６回繰り返したヒト表皮角化細胞の増殖試験の結果を示す図である。
【図６】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図７】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図８】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図９】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図１０】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図１１】ヒト表皮角化細胞における生物の形態を示す写真である。
【図１２】アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の重合度と相対移動度の対数値との関係を示す図である。
【図１３】アルギン酸カリウムオリゴ糖のＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１４】アルギン酸カリウムオリゴ糖の薄層クロマトグラムを示す図である。
【図１５】アルギン酸塩オリゴ糖の構造の例を示す模式図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a human keratinocyte activator comprising an alginic acid oligosaccharide or a salt thereof as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
A culture system using a serum-free medium for human epidermal keratinocytes has been established. Recently, cell culture kits for the purpose of culturing human epidermal keratinocytes have been sold [for example, manufactured by Morinaga Bioscience Institute, Kurashiki Spinning Co., Ltd., Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.], skin-related research technology has made great progress. In addition, by using a serum-free medium, it is not necessary to take into account unknown components contained in serum, and basic research is facilitated. In addition, cost reduction, elimination of lot differences, and maintenance of quality and the like are facilitated.
[0003]
As a result, research and development using a serum-free medium has been promoted in various fields, and in particular, in the dermatological field, it is going to develop into clinical application for the purpose of skin treatment such as wounds and burns. Along with such technical progress, in the field of skin treatment, attention has been paid to treatment using skin obtained by culture. That is, in the treatment for patients who cannot regenerate skin by themselves because of severe burns, etc., the patient's own skin fragment is cultured to produce skin having a large surface area and transplanted. Examples of the treatment target include burns of 70% or more of the body surface, a wide range of aza, and patients suffering from traces after burns. In foreign countries, there have been cases in which cultured epidermis was transplanted to patients with burns as much as 98% of the body surface and treatment was successful.
[0004]
However, it is still a problem to be solved that the culture period of the patient's own skin used for treatment takes as long as 2 to 3 weeks, or that it is difficult to perform the number of times of passage of the culture (passage number) 4 times or more. As left.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is a human epidermal keratinocyte that can shorten the culture time required for culturing skin cells and can reliably obtain a large number of cells of the target skin by increasing the number of passages of the cultured cells. An object is to provide an activator.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies based on the above problems, the present inventors solved the above problems by culturing human epidermal keratinocytes in a medium in which alginate oligosaccharide or a salt thereof was added to a serum-free culture system. In addition, we have found that the growth of cell culture systems can be achieved as expected (construction of a skin bank that can store and preserve human skin and make it available at any time). The present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention is a human epidermal keratinocyte activator comprising an alginate oligosaccharide or a salt thereof as an active ingredient. Here, as alginic acid oligosaccharide or its salt, what processed alginic acid or its salt with the microbial cell of the microorganisms which belong to Alteromonas genus, or its processed material is mentioned. The alginic acid oligosaccharide or its salt has a molecular weight of 1,000 or less, but the ratio of disaccharide to pentasaccharide in the alginic acid oligosaccharide or its salt is 80 to 100% by weight.
[0008]
Furthermore, the present invention provides the human epidermal keratinization as described above for growing human epidermal keratinocytes by adding to a serum-free medium for human epidermal keratinocytes, or for treating burns, wounds or aza It is a cell activator.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The alginic acid oligosaccharide or its salt, which is an active ingredient of the present invention, can be obtained by allowing alginic acid or a salt thereof to act on a degradation enzyme of alginic acid or a salt thereof produced by a microorganism belonging to the genus Alteromonas, that is, an alginate lyase. Alginic acid is one of polysaccharides having D-mannuronic acid and L-guluronic acid as constituent sugars, and examples of the salt thereof include sodium alginate, potassium alginate, or a mixture thereof. Moreover, as a salt of alginic acid oligosaccharide, sodium alginate oligosaccharide, potassium alginate oligosaccharide, or its mixture is mentioned, for example.
[0009]
First, a microorganism that produces an alginate lyase used for obtaining an alginate oligosaccharide or a salt thereof as an active ingredient of the present invention will be described.
Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Alteromonas, and examples thereof include Alteromonas sp. No. 1786.
Arteromonas sp. No. 1786 was isolated from the intestine of horseshoe crab as a result of screening using sodium alginate as the sole carbon source from the intestines of fish and seafood and its contents. Is as shown in Table 1 below.
[0010]
[Table 1]

[0011]
Based on the characteristics of the strains shown in Table 1 above, identification was attempted according to the method of Shimizu et al. (See Marine Microbiology Research Institute, Society Press Center, 228-239 (1985)). Turned out to belong to. This strain has been deposited as FERM P-11685 in the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
[0012]
A strain having the properties shown in Table 1 above is cultured, and the alginate lyase is separated and purified from the obtained culture by a conventional purification method.
Examples of the medium include sodium alginate (10 g), artificial seawater (containing 300 mM sodium chloride, 10 mM potassium chloride, 50 mM magnesium sulfate (7 hydrate), 10 mM calcium chloride (dihydrate)), 10 g of ammonium iron citrate / 100 ml demineralized water, dipotassium hydrogen phosphate (trihydrate) 7.5 g / 100 ml demineralized water, ammonium chloride 20 g / 100 ml demineralized water and 1M Tris-HCl buffer solution.
[0013]
For example, the freeze-dried microbial cell Alteromonas sp. No. 1786 is pre-cultured twice (20 ° C., 1 day), followed by main culture (25 ° C., 1 day).
By culturing the microorganism in this manner, a culture supernatant containing alginate lyase or a culture containing the microorganism can be obtained. Next, alginate lyase can be obtained by the method used for protein separation and purification using the culture as a material. For example, in addition to removing the cells from the culture broth by ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 500,000 (manufactured by Romicon) to obtain a crude alginate lyase solution, the crude alginate lyase solution is further subjected to salting out, centrifugation, Purification may be performed by appropriately combining various types of chromatography, electrophoresis and the like. Examples of various chromatographies include hydrophobicity, gel filtration, ion exchange, reverse phase, affinity chromatography and the like. In addition, SDS (sodium lauryl sulfate) polyacrylamide gel electrophoresis or the like can be used to confirm the purity of the purified product and its molecular weight.
[0014]
The enzymatic properties of the alginate lyase thus obtained are as follows. (1) Action: When alginic acid lyase produced by the above microorganism is reacted with alginic acid or a salt thereof as a substrate, the reaction product at 230 nm which is a specific absorption wavelength derived from a double bond of an alginate oligosaccharide or a salt thereof. An increase in absorbance and an increase in reducing power due to the resulting oligosaccharide were confirmed.
[0015]
(2) Optimum pH: Alginate lyase produced by the above microorganism has a high relative activity in the range of pH 7.0 to 7.5, and pH 7.0 at which the relative activity is maximum is the optimal pH. (3) Optimum temperature and thermal stability: Alginate lyase produced by the above-mentioned microorganisms increases in the range of 45 to 55 ° C.
(4) Enzyme activity: Using a reaction solution having the following composition, sodium alginate and alginate lyase were reacted at 50 ° C. for 10 minutes, and the amount of the generated oligosaccharide was measured by the Nelson-Somogy method. Can be measured. This enzyme activity indicates the amount of enzyme that produces sodium alginate oligosaccharide corresponding to 1 μmole of mannuronic acid as one unit. For measuring enzyme activity, potassium alginate may be used.
(Composition of reaction solution)
・ 0.05M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.5% sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)・ 0.45ml
・ Enzyme solution ... 0.05ml
In addition, in order to produce the alginic acid oligosaccharide of the present invention or a salt thereof, the above-mentioned strain can be obtained by culturing a strain which is obtained by applying a usual mutation means and has alginate lyase-producing ability. Alginate lyase can also be used.
[0016]
Since the raw material alginic acid or a salt thereof contains some calcium, there is a possibility that the alginic acid oligosaccharide or a salt thereof produced by using them also contains calcium. Calcium is known as a substance that promotes keratinization (differentiation) of epidermal keratinocytes. If calcium is present, it is keratinized before it sufficiently proliferates, so it is necessary to remove calcium from the medium at the growth stage. Therefore, desalting and decalcification treatment are preferably performed on the alginate oligosaccharide of the present invention or a salt thereof. For the treatment, it is preferable to use an electrodialyzer (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., trade name, microacylizer).
[0017]
Next, the alginate lyase is reacted with the raw material alginic acid or a salt thereof to obtain an alginate oligosaccharide or a salt thereof.
In this case, the reaction temperature between alginic acid or a salt thereof and alginic acid lyase is preferably 45 to 55 ° C., and the pH during the reaction is preferably 7.0 to 7.5. The conditions are 50 ° C. and pH 7.0. More preferably,
[0018]
Examples of the alginic acid oligosaccharide or salt thereof according to the present invention include those having a molecular weight of 1,000 or less centering on disaccharide to pentasaccharide, and the ratio of disaccharide to pentasaccharide in the alginic acid oligosaccharide or salt thereof is 80 to 100% by weight. It is.
The active ingredient of the alginate oligosaccharide or salt thereof obtained as described above can be used as it is as the human epidermal keratinocyte activator of the present invention, and is dried by a method such as freeze drying, spray drying, hot air drying and the like. I can leave.
[0019]
The human epidermal keratinocyte activator of the present invention can be used for the purpose of culturing and proliferating epidermal cells obtained from a patient, for example. Moreover, the human epidermal keratinocyte activator of the present invention can be added to a commercially available normal human epidermal keratinocyte culture kit to prepare a culture solution, which can be used to promote cell proliferation. In this case, the effective amount of the human epidermal keratinocyte activator included in the medium is 0.001 to 100 mg / ml, preferably 0.01 to 0.1 mg / ml.
[0020]
In addition, when the human epidermal keratinocyte activator of the present invention is applied as a pharmaceutical, the subject is not particularly limited as long as it is intended to treat or improve various diseases or symptoms by the human epidermal keratinocyte activator. For example, treatment for burns, wounds, aza, etc. can be used as a specific purpose. Moreover, the method of administration is performed parenterally, and the dosage form includes creams, ointments, cataplasms and the like. The dosage varies depending on whether it is an animal or a human, and also varies depending on the age, administration route, and number of administrations, and can vary widely. In this case, the effective amount administered as a composition of an effective amount of the human epidermal keratinocyte activator of the present invention and an appropriate diluent and a pharmaceutically usable carrier is 0.01-100 mg / cm ² skin / It is a day, and it is administered once or several times a day for 2 days or more.
[0021]
When the human epidermal keratinocyte activator of the present invention is administered parenterally, additives such as a stabilizer, a buffer, a preservative, and an isotonic agent may be contained.
In the present invention, a pharmacological test confirming that alginic acid oligosaccharide or a salt thereof is effective as a human epidermal keratinocyte activator is described below.
[Human epidermal keratinocyte proliferation test]
In order to examine the effect as a proliferation activator of the present invention on the proliferation of human epidermal keratinocytes using a normal human epidermal keratinocyte culture kit manufactured by Morinaga Bioscience Institute, the following test was performed.
[0022]
[Test Example 1]
Frozen normal human epidermal keratinocytes were thawed, cultured in serum-free medium for epidermal keratinocytes, and subcultured twice. At the third passage, potassium alginate oligosaccharide (concentration: 1 mg / ml) sterilized by filtration is added to the above serum-free medium, and the number of cells is measured over time, and the state of cell proliferation is morphologically determined. Observed. In addition, the thing which did not add potassium alginate oligosaccharide was compared as a control.
[0023]
As a result, as shown in FIG. 1, in the culture medium containing potassium alginate oligosaccharide (“◯”), a marked increase in cells was observed compared to the control culture medium (“●”). On the other hand, the state of cell proliferation immediately after addition of potassium alginate oligosaccharide, 6 hours and 48 hours later is shown as photographs in FIGS. 2, 3 and 4, respectively. It is clear from the photograph that the number of cells is higher in the culture medium containing potassium alginate oligosaccharide (lower photograph) than in the control culture medium (upper photograph). As described above, the proliferation activity of human epidermal keratinocytes could be enhanced by adding potassium alginate oligosaccharide.
[0024]
[Test Example 2]
After thawing frozen normal human epidermal keratinocytes, the cells are cultured in a serum-free medium for epidermal keratinocytes and cultured in a medium (0.01, 0.10, 1.00 mg / ml) containing sodium alginate oligosaccharide sterilized by filtration, and semi-confluent ( Passage was performed when the adherent cells reached 80% of the area of the incubator. The time to reach semi-confluence and the number of passages were examined, and the appearance of cells was observed morphologically. In addition, the thing which did not add a sodium alginate oligosaccharide was compared as a control.
[0025]
Table 2 shows the time to achieve semi-confluence at each passage number.
[0026]
[Table 2]

[0027]
In the culture medium containing sodium alginate oligosaccharide, the time to become semi-confluent, which is in a state suitable for passage, gradually increased after 4 passages, but the cells could grow even after 10 passages. In contrast, in the control culture medium, no growth was observed at the sixth passage, and no passage was possible. FIG. 5 shows the changes over time in the number of cells at passage number 6. In culture medium containing sodium alginate oligosaccharide, it reaches semi-confluent in 4 days at any concentration of 0.01 (“●”), 0.10 (“▲”), and 1.00 (“■”) mg / ml, and is subcultured. However, in the control culture medium (“◯”), no growth was observed even after 7 days of culturing, and passage was not possible. Usually, after 4 passages, the proliferation activity of the cells declines and normal state cannot be expected and more than 6 passages cannot be performed, but the addition of sodium alginate oligosaccharide increases the proliferation activity of the cells, It was confirmed that the cells could grow even after 10 passages. Fig. 6 shows the morphology of cells on the 7th day of culture in the control culture medium with 6 passages. The morphology of the cells that reached the semi-confluent state of the culture medium containing sodium alginate oligosaccharide with 6 to 10 passages. The situation is shown as photographs in FIGS. As is apparent from the photograph, the control culture medium (FIG. 6) stopped growing at the 6th passage, whereas the culture medium added with sodium alginate oligosaccharide (FIGS. 7 to 11) was normal regardless of the passage number. It was found that it was possible to maintain proper growth.
[0028]
As described above, the human epidermal keratinocyte activator of the present invention not only enhances the proliferation activity of cells with a small number of passages and shortens the culture period, but also activates cells whose proliferation activity has declined by 4 or more passages. Was also effective and increased the number of passages.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Production of alginate oligosaccharide
(1) Preparation of alginate lyase
(Medium composition)
・ Sodium alginate ・・・・・・・・・・・ 10 g
・ Artificial seawater ^{* 1} ... 1000 ml
・ Fe stock ^{* 2}・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1 ml
・ Pi stock ^{* 3}・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 2 ml
・ NH ₄ stock ^{* 4}・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5 ml
・ 1M Tris-HCl buffer (pH 7.8) ・・・・・・・・・・・ 50 ml
────────────────────────────────────
* 1: Artificial seawater: sodium chloride 300 mM, potassium chloride 10 mM, magnesium sulfate (7 hydrate) 50 mM, calcium chloride (dihydrate) 10 mM
* 2: Fe stock: Ferric ammonium citrate 10 g / 100 ml demineralized water * 3: Pi stock: dipotassium hydrogen phosphate (trihydrate) 7.5 g / 100 ml of demineralized water * _4: NH 4 stock: ammonium chloride 20 g / 100 ml Demineralized water Using the medium having the above composition, freeze-dried microbial cells Alteromonas sp. No. 1786 was precultured twice (20 ° C., 1 day), followed by main culture (25 ° C., 1 day). As a result, an alginate lyase culture solution having an enzyme activity of 0.90 units per 1 ml of the culture solution was produced.
[0030]
Bacterial cells were removed from the culture broth by ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 500,000 (manufactured by Romicon) to obtain a crude alginate lyase solution.
(2) Preparation of potassium alginate oligosaccharide After dissolving potassium alginate (10.0 kg) in 90 L of demineralized water, add the crude alginate lyase solution (50,000 U) obtained in (1) above and stir at 40 ° C. for 20 hours. It was made to react. The reaction solution was deproteinized, desalted, and lyophilized to obtain 4.2 kg of potassium alginate oligosaccharide powder.
[0031]
Similarly, when sodium alginate or a mixture of sodium alginate and potassium alginate is used, a sodium alginate oligosaccharide or a mixture of sodium alginate oligosaccharide and potassium alginate oligosaccharide is obtained.
(3) Production of calcium-free alginate oligosaccharide Potassium alginate oligosaccharide (40.0 g) produced in (2) above was subjected to an electrodialysis apparatus (trade name, microacylizer manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.). Calcium ions were removed to obtain purified potassium alginate oligosaccharide (39.5 g). The oligosaccharides were compared at the elemental level before and after purification. The results are shown in Table 3. From the results, it was confirmed that calcium could be removed.
[0032]
[Table 3]

[0033]
Similarly, sodium alginate oligosaccharide containing no calcium can also be prepared.
[Example 2] Preparation of culture medium containing human epidermal keratinocyte activator
(1) Medium for normal human epidermal keratinocytes (I)
A complete liquid medium is prepared by adding 250 ml of the attached bovine pituitary extract and 2.5 μg of epidermal growth factor to 250 ml of the basic liquid medium of serum-free basic liquid medium for keratinocytes manufactured by Morinaga Bioscience Institute. The sodium alginate oligosaccharide produced in Example 1 (3) is sterilized by filtration, and then added to a complete liquid medium to a concentration of 1 mg / ml, and the culture solution containing the human epidermal keratinocyte activator of the present invention. Got.
[0034]
(2) Normal human epidermal keratinocyte medium (II)
Morinaga Bioscience Institute Co., Ltd. Serum-free basal liquid medium for keratinocytes 250 ml of basal liquid medium, 2.0 ml of the attached bovine pituitary extract and 2.5 μg of epidermal growth factor were added and mixed to prepare a complete liquid medium. Prepare. The potassium alginate oligosaccharide produced in Example 1 (3) is sterilized by filtration and then added to a complete liquid medium to a concentration of 1 mg / ml, and the culture solution containing the human epidermal keratinocyte activator of the present invention. Got.
[0035]
[Reference Example 1]
This reference example shows an analysis example of the polymerization degree of the potassium alginate oligosaccharide of the present invention.
The degree of polymerization was determined by thin layer chromatography (TLC).
First, sodium alginate as a standard substance was prepared by hydrolyzing with 1N trioloroacetic acid at 100 ° C. for 24 hours. Note that potassium alginate may be used as a standard substance.
[0036]
TLC was performed under the following conditions.
Thin layer plate: Silica gel 60HPTLC plate (Merck)
Developing solvent: 1-butanol / acetic acid / water (5/2/3)
Coloring reagent: Diphenylamine-aniline-phosphate reagent When the above sodium alginate hydrolyzate (standard substance) was subjected to TLC, six spots were obtained. Of the six spots, the spot with the highest mobility coincides with D-mannuronic acid (Sigma-treated D-mannuronic acid lactone removed from the lactone ring, Rf value 0.38, DP = 1) did. Further, the other spots were subjected to gel filtration with Bio-Gel P-2 (eluted with 1.5 × 46 cm, 0.1 M acetate buffer (pH 4.0)) to obtain purified oligosaccharides. About this purified oligosaccharide, the amount of uronic acid (Orcinol Iron Hydrochloride method, Brown; Arch. Biochem., 11 , 269-278 (1946)) and reducing sugar (Somogy Nelson method, Somogyi; J. Biol. Chem., 195) , 19-23 (1952), Nelson; J. Biol. Chem., 153 , 375-380 (1944)), the degree of polymerization (DP) was calculated from the amount of uronic acid / the amount of reducing sugar. 3, 4, 5, and 6.
[0037]
Using these 6 types of purified oligosaccharides (including D-mannuronic acid), the relationship between the logarithmic value of relative mobility (Rf / 1-Rf) and the degree of polymerization (DP) in thin-layer chromatography is shown. As a result of the examination, a linear calibration curve was obtained (FIG. 12).
In FIG. 12, “●” indicates a sodium alginate hydrolyzate (standard substance), and “◯” indicates an alginate oligosaccharide (a, b, c, d).
[0038]
Next, the potassium alginate oligosaccharide prepared by the method of Example 1 (2) was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) by 0 to 2 M gradient elution with NaCl using DEAE GLASS (manufactured by Nakanai Tesque), and fraction collector (See JP-A-4-266896). This elution pattern is shown in FIG. Among the fractions having absorption at 230 nm, 1 to 8 (hereinafter referred to as “P-1”, “P-2”,..., “P-8”, respectively), the main fraction is P−. 2, P-3, P-5, and P-8 were recovered, and each fraction was desalted using a column packed with Bio-Gel P-2 (Bio-Rad) (Japanese Patent Laid-Open No. 4-169188). And then freeze-dried and subjected to TLC. As a result, a thin layer chromatogram as shown in FIG. 14 was obtained. In FIG. 14, O indicates the origin. M is D-mannuronic acid, S is an enzyme-degraded oligosaccharide of sodium alginate, 2 is a P-2 fraction, 3 is a P-3 fraction, 5 is a P-5 fraction, and 8 is a P-8 fraction Indicates minutes. Further, a, b, c, and d indicate spots where Rf values are calculated.
[0039]
As can be seen from the thin layer chromatogram in FIG. 14, each sample did not result in one spot. Therefore, Rf values of main spots were obtained and plotted on the calibration curve shown in FIG. 12 to examine the degree of polymerization. As a result, it was found that the degree of polymerization of the fractionated oligosaccharides (P-2, P-3, P-5, P-8) was mainly 2-5.
That is, the potassium alginate oligosaccharide was a mixture having a polymerization degree of 2 to 5.
[0040]
An example of the structure of the potassium alginate oligosaccharide of the present invention is shown in FIG. (a) represents a degree of polymerization 2, (b) represents a degree of polymerization 3, (c) represents a degree of polymerization 4, and (d) represents an oligosaccharide having a degree of polymerization 5. Constituent sugars are D-mannuronic acid and L-guluronic acid, which may be either homo-type or hetero-type, and R of the “—COOR” group may be H, Na or K.
[0041]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a human epidermal keratinocyte activator that further stabilizes the human epidermal keratinocyte culture system and enables practical use of four or more passages.
The human epidermal keratinocyte activator of the present invention not only enhances the proliferation activity of cells with a small number of passages and shortens the culture period, but also has an effect on inactivation of cells whose proliferation ability has remarkably deteriorated by repeated passages. Yes, it was possible to grow even after 10 passages.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of a human epidermal keratinocyte proliferation test.
FIG. 2 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 3 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 4 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 5 is a diagram showing the results of a proliferation test of human epidermal keratinocytes in which passage was repeated 6 times.
FIG. 6 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 7 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 8 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 9 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 10 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 11 is a photograph showing the morphology of organisms in human epidermal keratinocytes.
FIG. 12 is a graph showing the relationship between the degree of polymerization of sodium alginate oligosaccharide and the logarithmic value of relative mobility.
FIG. 13 shows the results of HPLC of potassium alginate oligosaccharide.
FIG. 14 shows a thin-layer chromatogram of potassium alginate oligosaccharide.
FIG. 15 is a schematic diagram showing an example of the structure of an alginate oligosaccharide.

Claims

The following general formulas ( a ) to ( d )

(Where

Represents mannuronic acid or guluronic acid, R represents hydrogen, sodium or potassium)
A human epidermal keratinocyte activator comprising an alginate oligosaccharide represented by the formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.

The human epidermal keratinocyte activator according to claim 1, wherein the alginic acid oligosaccharide or a salt thereof is obtained by treating alginic acid or a salt thereof with a microbial cell belonging to the genus Alteromonas or a processed product thereof.

The human epidermal keratinocyte activator according to claim 1, wherein the alginic acid oligosaccharide or a salt thereof has a molecular weight of 1,000 or less.

The human epidermal keratinocyte activator according to claim 3, wherein the ratio of disaccharide to pentasaccharide in the alginic acid oligosaccharide or a salt thereof is 80 to 100% by weight.

The human epidermal keratinocyte activator according to any one of claims 1 to 4, which is added to a serum-free medium for human epidermal keratinocytes to proliferate human epidermal keratinocytes.

The human epidermal keratinocyte activator according to any one of claims 1 to 4 , for the treatment of burns, wounds or aza and for parenteral administration .