JP3824422B2

JP3824422B2 - Retinoic acid activity enhancer

Info

Publication number: JP3824422B2
Application number: JP11637898A
Authority: JP
Inventors: 泰宏金谷; 誠槇嶋; 健一旭; 成桜井; 信孝高橋; 和夫元吉; 直一永田; 良夫本間
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1998-04-27
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2018-04-27
Also published as: JPH11302194A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レチノイン酸などのRXR リガンドの生理活性を増強することができ、例えば白血病の治療に有用な医薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
レチノイン酸（ビタミンＡ酸）はビタミンＡの活性代謝産物であり、発生途上にある未熟な細胞を特有な機能を有する成熟細胞へと分化させる作用や、細胞の増殖制御作用や生命維持作用など極めて重要な生理作用を有している。例えば、オールトランス(all-trans)・レチノイン酸 (ATRA) は、脊椎発達における天然のモルフォゲン（形態形成物質）であり、骨髄性白血病細胞の分化を誘導することが知られている。レチノイン酸及びレチノイン酸様の生物活性を有する上記化合物は「レチノイド」と総称されている。
【０００３】
例えば、オール・トランス(all-trans)・レチノイン酸は、細胞核内に存在する核内レセプター・スーパーファミリー (Evans, R.M., Science, 240, p.889, 1988) に属するレチノイン酸レセプター（RAR)にリガンドとして結合して、動物細胞の増殖・分化あるいは細胞死などを制御することが明らかにされている(Petkovich, M., et al., Nature, 330, pp.444-450, 1987)。オールトランスレチノイン酸を投与することによってほとんどの急性前骨髄球白血病(APL) 患者を完全寛解に導くことができる。オールトランスレチノイン酸の立体異性体である9-シス(9-cis)・レチノイン酸は、オールトランスレチノイン酸に比べてインビトロでの骨髄性白血病細胞の増殖阻害及び分化誘導作用に優れるものの（Sakashita, A., et al., Blood, 81, pp.1009-1016, 1993) 、APL 患者に対する分化誘導療法ではオールトランス・レチノイン酸よりも副作用の点で有効性に劣ることが知られている。
【０００４】
従来、レチノイドの作用を増強する物質についてはほとんど報告がない。例えば、特開平8-59511 号公報には、レチノイドＸレセプター(RXR) に対する特異的リガンドである化合物が、RAR-αレセプターに対する特異的なリガンド化合物であるAm80の作用を増強する作用を有することが示唆されている。この刊行物には、4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8- テトラメチル-2- ナフチル) カルボニル] 安息香酸- エチレンアセタールが合成レチノイドであるAm80（4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbamoyl]benzoic acid）の分化誘導作用を増強することが示唆されている。また、4-[5H-2,3-(2,5- ジメチル-2,5- ヘキサノ)-5-メチルジベンゾ[b,e][1,4]ジアゼピン-11-イル] 安息香酸(HX600) などのベンゾジアゼピン化合物がレチノイドの作用を増強することも知られている(Umemiya et al., Chem. Pharm. Bull., 43, pp.1827-1829, 1995)。この化合物の作用は、RXR-RAR ヘテロダイマーを形成する RXRを活性化するものと考えられている。
【０００５】
一方、ケトミウム(Chaetomium)属に属する微生物の培養物中から、ディファラニゾールＡ（3,5-ジクロロ-2- ヒドロキシ-4- メトキシ-6-n- プロピル安息香酸）が単離されている（特公平4-32816 号公報）。この物質はマウスの赤血球性白血病細胞に対して分化誘導作用を発揮し、正常細胞に誘導する作用を有することから、抗腫瘍剤としての利用が期待されている。もっとも、ディファラニゾールＡは神経芽細胞腫 C-1300 細胞を接種したマウスに対して抗腫瘍活性を示すものの、骨髄性白血病細胞の分化誘導における活性は弱いという問題がある (Suzuki, T., etal., J. Antibiotics, 39, pp.869-871, 1986)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明者らはヒト骨髄性白血病細胞に対して優れた増殖阻害作用及び分化誘導作用を発揮できる医薬を開発すべく鋭意研究を行ったところ、ディファラニゾールＡと例えば9-シス・レチノイン酸などのRXR に対して親和性をしめす化合物又はその塩とを組み合わせると、RXR リガンドの生理作用が顕著に増強されることを見出した。また、両者を組み合わせて用いると、白血病細胞に対して相乗的な増殖抑制作用及び分化誘導作用を達成できること、並びにこれらの物質を有効成分として含む医薬が白血病の治療に高い有効性を発揮できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、ディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むRXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又は生理学的に許容されるその塩）の生理活性増強剤を提供するものである。また、本発明により、ディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含み、RXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又は生理学的に許容されるその塩）を有効成分として含む医薬、好ましくは白血病の治療剤の作用増強のために用いられる医薬が提供される。
【０００８】
また、別の観点からは、本発明によりディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩とRXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又は生理学的に許容されるその塩）とを有効成分として含み、好ましくは骨髄性白血病の治療に用いる医薬の製造のためのディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩の使用；並びに、骨髄性白血病の治療方法であって、ディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩の治療有効量とRXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又は生理学的に許容されるその塩）の治療有効量とを患者に投与する工程を含む方法が提供される。さらに別の観点からは、ディファラニゾールＡ又は生理学的に許容されるその塩とRXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又は生理学的に許容されるその塩）とを有効成分として含む医薬が提供される。この医薬は、骨髄性白血病などの種々の白血病の治療に有用である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ディファラニゾールＡは、例えば、特公平4-32816 号公報に記載された方法により製造することができる。生理学的に許容されるディファラニゾールＡの塩の種類は特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩；アンモニウム塩：トリエチルアミン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩：アルギニン塩、リジン塩などのアミノ酸塩などの塩基付加塩を用いることができる。
【００１０】
本明細書において用いられる「RXR リガンド」という用語は、レチノイドＸレセプター (RXR)に対してリガンドとしての親和性を示し、レチノイドの代表的生物活性（例えば、細胞分化作用、細胞増殖制御作用、及び生命維持作用など）を発揮できる化合物又はその塩（一般的に「RXR ・アゴニスト」と呼ばれる場合もある）を意味しているが、RXR に対する特異的リガンドのほか、RXR 及びRAR に対して親和性を示す化合物またはその塩も包含されることを理解すべきである。例えば、RXR に対する特異的リガンドとして Ro47-5944 (Apfel, C.M. et al., J. Biol. Chem., 270, pp.30765-30772, 1995)を挙げることができる。RAR 及び RXRの両方に親和性を示すリガンドとしては9-シス・レチノイン酸を挙げることができる (Levin, A.A., et al., Nature, 355, pp.359-361, 1992; Zhang, X.K., etal., Nature, 358, pp.587-591, 1992)。
【００１１】
また、オール・トランス・レチノイン酸は実質的に RARにのみ結合するリガンドとして知られているが（上掲 Levinら及びZhanら）、この化合物は生体内での代謝過程で9-シス・レチノイン酸を生成する場合があり、生体内で RXRリガンドとして作用することができる。本発明におけるRXR リガンドには、このように生体内でRXR リガンドとして作用可能な化合物またはその塩も包含されることを理解すべきである。なお、ある化合物またはその塩が RXR及び／又はRAR に対するリガンドとして作用するか否かは、上掲 Levinら及びZhanらの文献に記載された方法に従って容易に検定可能である。RXR リガンドとしては遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。例えば、生理学的に許容される9-シス・レチノイン酸の塩として上記に例示した塩基付加塩を用いることができる。
【００１２】
ディファラニゾールＡ又はその塩は、それ自体が白血病細胞に対する増殖抑制作用及び分化誘導作用を有しているが、RXR リガンドの代表的生物活性（例えば、細胞分化作用、細胞増殖制御作用、及び生命維持作用など）を増強する作用を有している。より具体的には、ディファラニゾールＡ又はその塩は、9-シス・レチノイン酸又はその塩の白血病細胞に対する増殖抑制作用及び分化誘導作用を増強する作用を有しており、その増強作用は相乗的である。
【００１３】
従って、ディファラニゾールＡ又はその塩は、RXR リガンドをビタミンＡ欠乏症；上皮組織の角化症、乾癬などの皮膚疾患；アレルギー疾患；リウマチなどの免疫性疾患；骨粗鬆症、骨折などの骨疾患；アルツハイマー；ハンチントン舞踏病；白血病やその他の癌などの疾患の予防及び／又は治療のための医薬として投与する場合に、該RXR リガンドの作用増強剤として用いることができる。また、ディファラニゾールＡ又はその塩は生体内に既に存在するRXR リガンド（例えばレチノイン酸）の作用を増強するので、RXR リガンドを上記疾患の治療及び／又は予防のために投与しない場合においても、生体内RXR リガンドの作用を増強することによって上記疾患の治療及び／又は予防を達成することができる。典型的には、ディファラニゾールＡ又はその塩とRXR リガンド（好ましくは9-シス・レチノイン酸又はその塩）とを有効成分として含む、いわゆる合剤の形態の医薬組成物として用いることができる。この合剤は、骨髄性白血病、リンパ性白血病のいずれの白血病に対しても治療剤として適用できる。
【００１４】
経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、及び貼付剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができる。
【００１５】
ディファラニゾールＡ又はその塩の投与量は特に限定されないが、RXR リガンドと組み合わせて投与する場合には、ディファラニゾールＡ又はその塩を成人一日あたり 0.01 〜1,000 mg程度の範囲で投与し、RXR リガンドの投与量を通常の投与量よりも適宜減じることが望ましい。上記の投与形態での投与量を参照することによって、いわゆる合剤として投与する場合にもディファラニゾールＡ又はその塩とRXR リガンドとの配合比を適宜選択可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
(1) 材料と方法
(a) 試薬等
ディファラニゾールＡ（3,5-ジクロロ -2-ヒドロキシ -4-メトキシ -6-n-プロピル安息香酸：「Dif 」と略する場合がある。）は文献記載の方法により調製した (Iimura, Y. et al., Acta Cryst., C40, pp.2058-2061, 1984; Mori, K. etal., Liebigs Ann. Chem., pp.303-305, 1989; Oka et al., J. Antibiotics, 38, pp.1100-1102, 1985)。オールトランスレチノイン酸（以下、「ATRA」と略する場合がある。）及びニトロブルー・テトラゾリウム(NBT) はシグマ・ケミカルズ（セントルイス、MO) から購入した。 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃ (以下、「VD3」と略する場合がある。) 及び 9-cisレチノイン酸（以下、「9cisRA」と略する場合がある。）は、それぞれ和光純薬工業株式会社及び BIOMOL リサーチ・ラボラトリーズ（プリマウス・ミーティング、PA、USA)から入手した。
【００１７】
レチノイン酸レセプター(RAR)-特異的リガンド Am80 (4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbamoyl]benzoic acid; Hashimoto, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, pp.1300-1307, 1990)は首藤教授（東京大学）から寄贈されたものを用い、レチノイド Xレセプター(RXR) リガンド Ro47-5944 (Apfel, C.M. et al., J. Biol. Chem., 270, pp.30765-30772, 1995)は F. ホフマン−ラロシュ社から寄贈されたものを用いた。
【００１８】
(b) 細胞系及び細胞培養
ヒト骨髄性白血病細胞系を 10%ウシ胎児血清を添加した RPMI-1640培地に懸濁して 5% CO₂を含む37℃の加湿空気中で培養した。t(15;17)- 陽性 APL（仏米英委員会が提案した基準による M3 変異体）患者の28歳の男性から治療開始前にインフォームドコンセントを行って末梢血液を採取した。白血病細胞を精製するために、ヘパリン処理した血液細胞を等容量の RPMI-1640培地と混合し、フィコール−ハイパック（ファルマシア）で遠心した。
【００１９】
(c) 細胞増殖及び分化細胞の性質のアッセイ
細胞数は ZM 型コウルター・カウンター（コウルター・エレクトロニクス、ルートン、UK）で計数した。分化誘導能をアッセイするために、白血病細胞(5×10⁴細胞/ml)を所定期間、試験化合物の存在下又は非存在下に培養した。細胞に 12-O-テトラデカノイルホルボル-13-アセテート(TPA) を与えた際に NBTを還元する能力を指標としてスーパーオキシドを発生させるオキシダーゼを測定した。NBT 還元能は、 NBT (1mg/ml) 及び TPA (100 ng/ml)を含む 1 ml の RPMI 1640培地中で 1×10⁶個の細胞を 37 ℃で 60 分インキュベートすることによりアッセイした。細胞内ブルー−ブラック・フォルマザン沈殿を含む細胞のパーセンテージを顕微鏡下で測定し、少なくとも 200細胞を計数した。
【００２０】
形態学的分化は、メイ−グルンワルド−ギムザ (May-Grunwald-Giemsa)で染色した細胞スメアで調べた。CD11b の発現は間接的免疫蛍光染色及びフロー・サイトメトリーにより分析した (Kanatani Y. et al., Cell Growth Differ. 7, pp.187-196, 1996)。簡単に述べると、白血病細胞(2×10⁶)をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)で洗浄し、 0.1% ウシ血清アルブミンを含む PBS中のマウス抗-CD11b(Mac-1; ニチレイ株式会社）50μl 中、４℃で 30 分間インキュベートした。細胞を PBSで洗浄し、 0.1 %ウシ血清アルブミンを含む PBS中の FITC-共役抗マウスIgG （タゴ社）50μl 中で 30 分間インキュベートし PBSで洗浄した後、エピックス XL フロー・サイトメトリー（コウルター・エレクトロニクス）で分析した。細胞周期は前述のようにヨウ化プロピジウムで染色した核を用いて蛍光活性化細胞選別器で分析した。
【００２１】
(d) レチノイドレセプターのトランスアクティベイションアッセイ
CV-1細胞をリポフェクチン試薬（GIBCO BRL 、ガイサーズバーグ、MD）を用いてレセプタープラスミド (pCMX-hRAR-α, pCMX-hRXR-α) 200 ng、レセプタープラスミド 500 ng 及び pCMX-β-gal 300 ng でトランスフェクトした (Umesono, K., et al., Cell, 65, pp.1255-1266, 1991)。使用したレセプターは RARについては TK-TREpx2-LUC(Umesono, K., et al., Cell, 65, pp.1255-1266, 1991) 及び RXRについては TK-CRBPII-LUC (Mangelsdorf, D.J., et al., Cell, 66, pp.555-561, 1991)であった。細胞を18時間トランスフェクトし、DNA を含む培地を除去した後、 10%樹脂−チャコール−ストリプト・ウシ胎児血清を含む培地中で試験化合物と共に24時間インキュベートした。ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性をそれぞれ発光測定装置 (BLR-201;アロカ）及び分光光度計（日立）を用いて分析した。トランスフェクションデータは全て内部β−ガラクトシダーゼマーカーを用いて標準化し、３回の実験の平均値で表した。
【００２２】
(2) 結果
(a) ヒト白血病細胞系の増殖及び分化におけるディファラニゾールＡの効果
ディファラニゾールＡは用量依存的に骨髄性白血病細胞の増殖を阻害した。細胞を５日間処理した場合、ML-1、HL-60 、NB4 、THP-1 、U937、及び KU812細胞では IC₅₀は 89 〜130 μM であった。ついで、種々の濃度のディファラニゾールＡで 24-72時間処理したHL-60 細胞の細胞周期分布の変化を測定した。結果を表１に示す（表中の結果は３回の測定の平均値±SDを示す）。
【００２３】
【表１】

【００２４】
60μM ディファラニゾールＡで処理した細胞の DNAヒストグラムに著しい変化はなかったが、120 μM で処理した培養物には G₁期の細胞数が蓄積していた。HL-60 細胞(5×10⁴/ml) をディファラニゾールＡで７日間処理した場合には、細胞はわずかながら有意の形態学的分化を受けていた（表２：３回の別個の実験の平均値±SDを示す）。ディファラニゾールＡにより機能的分化 (NBT 還元能) も惹起されたが、ディファラニゾールＡの分化誘導能は弱かった。また、ディファラニゾールＡは、単球白血病 U937 細胞及び赤白血病 K562 細胞についても弱い分化誘導活性を示した。
【００２５】
【表２】

【００２６】
(b) ディファラニゾールＡ及び分化誘導物質の併用効果
ATRA、9cisRA、又はVD3 の存在下におけるディファラニゾールＡの白血病細胞の増殖及び分化に対する効果を検討した。ディファラニゾールＡはこれらの物質によって誘導されるHL-60 細胞の増殖阻害及び NBT還元能の誘導を増進し、その作用は相乗的であり、9cisRAについては特に顕著な相乗効果が認めらた（図１）。また、別の骨髄単球様分化マーカーである CD11b表面抗原の発現についても同様の結果が得られた（図２）。ディファラニゾールＡと 9cisRA による(15;17) 染色体転座を伴う前骨髄球白血病 NB4細胞の増殖抑制及び分化誘導活性を相乗的に誘導した（図３）。
【００２７】
つぎに、NB4 細胞の増殖阻害及び分化誘導作用（NBT 還元能）におけるディファラニゾールＡと 9cisRA の時間的効果を検討した。NB4 細胞をディファラニゾールＡと24時間プレインキュベートしても 9cisRA の増殖阻害作用及び分化誘導活性に対して本質的な影響は及ぼさず、また 9cisRA をプレインキュベートしてもディファラニゾールＡの増殖阻害作用は促進されなかった（表３）。72時間前処理した場合にも同様の結果が得られた。一方、4 nM 9cisRA 及び60μM ディファラニゾールＡで同時処理した場合には著しく高い増殖抑制作用及び分化誘導活性が認められた。実験は、 NB4細胞を 60 μM ディファラニゾールＡ又は 4 nM 9cisRAで１日間処理し、60μM ディファラニゾールＡ又は 4 nM 9cisRAを含む新しい培地中でさらに５日間培養することにより行い、表３には３回の実験の平均値±SDを示した。
【００２８】
【表３】

【００２９】
(c) ディファラニゾールＡの RXR又は RARリガンドとの組み合わせ効果
9cisRAは RAR及び RXRの両方に対するリガンドであり、ATRAは RARのみに結合するリガンドである(Levin, A.A., et al., Nature, 355, pp.359-361, 1992; Zhang, X.K., et al., Nature, 358, pp.587-591, 1992)。もっとも、ATRAは代謝によってある程度 9cisRA に変化する場合がある。ディファラニゾールＡの性質を理解するために、RAR-特異的又はRXR-特異的リガンドとディファラニゾールＡの協力作用を調べた。RAR-特異的リガンドとしてAm80を用い、RXR-特異的リガンドとして Ro47-5944を用いた。HL-60 細胞をディファラニゾールＡの存在下で種々の濃度の Am80 又は Ro47-5944で処理した結果を図４に示す。この結果から、 Am80 及びディファラニゾールＡの増殖阻害作用は相加的であり、一方、 Ro47-5944及びディファラニゾールＡの効果は相乗的であることが明らかである。ATRAも Ro47-5944の存在下でHL-60 細胞の増殖を相乗的に阻害した。
【００３０】
末梢血単核細胞（＞80% 芽球又は前骨髄球）を APL患者から単離した（20,000/ μl の白血球数）。この白血病細胞は ATRA 及び 9cisRA に対しては反応したが、ディファラニゾールＡに対しては反応しなかった（図５）。しかしながら、ディファラニゾールＡは、この細胞のレチノイド誘導による NBT還元能を著しく促進した（0.4 nM 9cisRA プラス 60 μM ディファラニゾールＡでは 88%が NBT陽性であり、0.4 nM 9cisRA 単独では 40%であった）。ディファラニゾールＡの促進作用は 9cisRA で処理した細胞の形態学的変化においても観察された。
【００３１】
(d) レチノイドレセプターのトランスアクティベイションにおけるディファラニゾールＡの効果
ディファラニゾールＡが部分的に RARアゴニストとして作用しうる可能性がある。そこで、 CV-1 細胞をレセプター・プラスミド(pCMX-hRARα及び pCMX-hRXR- α) 及びルシフェラーゼレポーター・プラスミドでトランスフェクトし、レセプター介在トランスアクティベーションにおけるディファラニゾールＡの効果を調べた。プラスミドでトランスフェクトした CV-1 細胞を無添加、又は10^-4M ディファラニゾールＡ (DIF)、10^-6 M ATRA 、若しくは10^-7 M 9cisRA の存在下で24時間インキュベートした。 RARα及び RXRαの遺伝子をpCMXベクター中に導入した。結果を表４に示す（表中の値は刺激を与えていない細胞におけるルシフェラーゼ活性に対する比を示し、３回の平均値として示した。NTは試験していないことを示す。）。ディファラニゾールＡは TK-TREpx2-LUCレポーターにおける RARαのトランスアクティベイティング活性を刺激しなかったが、ATRAは著しく増大させた。また、ディファラニゾールＡは RXRについても効果を示さなかった。これらの結果はディファラニゾールＡが RARまたは RXRに対するアゴニストとして作用しないことを示している。
【００３２】
【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】オールトランスレチノイン酸、9-シスレチノイイン酸、又は 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃の存在下におけるディファラニゾールＡの白血病細胞HL-60 の増殖及び分化に対する効果（５日間培養）を示した図である。図中、(a) は０（○）、３（□）、及び30（▲）nMの 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃(VD3) 存在下での結果を示し；(b) は１（△）、４（□）、８（●）、及び10（■）nMのオールトランスレチノイン酸(ATRA)存在下での結果を示し；(c) は１（△）、４（□）、８（●）、及び10（■）nMの9-シスレチノイイン酸(9cisRA)存在下での結果を示す。結果は４回の独立の実験の平均値として示した。
【図２】オールトランスレチノイン酸、9-シスレチノイイン酸、又は 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃(VD3) の存在下におけるディファラニゾールＡの白血病細胞HL-60 の分化に対する効果を、骨髄単球様分化マーカーである CD11b表面抗原の発現について示した図である。図中、(a) は 3 nM の 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃(VD₃) 存在下での結果を示し；(b) は 4 nM のオールトランスレチノイン酸(RA)存在下での結果を示し；(c) は 4 nM の9-シスレチノイイン酸(9cisRA)存在下での結果を示す。実線は60μM のディファラニゾールＡ存在下で３日間培養を行った結果を示し、鎖線はディファラニゾールＡ非存在下での結果を示す。マーカーの発現は抗CD11b 抗体を用いた免疫蛍光染色法で行った。図中、細線は無処理の対照を示し、点線は免疫蛍光測定用の陰性対照を示す。
【図３】オールトランスレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、又は 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃の存在下におけるディファラニゾールＡの前骨髄球白血病 NB4細胞の増殖及び分化に対する効果（５日間培養）を示した図である。図中、(a) は０（○）、３（△）、及び30（▲） nM の 1α,25-ジヒドロキシビタミンD₃(VD3) 存在下での結果を示し；(b) は４（□）及び40（■） nM のオールトランスレチノイン酸(ATRA)存在下での結果を示し；(c) は４（□）及び40（■） nM の9-シスレチノイイン酸(9cisRA)存在下での結果を示す。結果は４回の独立の実験の平均値として示した。
【図４】 HL-60細胞をディファラニゾールＡの存在下で種々の濃度の Am80 又は Ro47-5944で５日間処理した結果を示した図である。図中、(a) は０（○）、30（△）、60（□）、及び90（■）μM のディファラニゾールＡ存在下でのAm80の影響を示し；(b）は０（○）、30（△）、60（□）、及び90（■）μM のディファラニゾールＡ存在下でのRo47-5944 の影響を示し；(c) は０（○）、40（▲）、及び 400（◆） nM のオールトランスレチノイン酸存在下でのRo47-5944 の影響を示す。結果は４回の独立の実験の平均値として示した。
【図５】 APL 患者から単離した末梢血単核細胞の初代培養系におけるディファラニゾールＡ及びレチノイドの作用を示した図である。図中、(a) は０（○）、30（△）、及び60（□）μM のディファラニゾールＡの存在下でのオールトランスレチノイン酸(ATRA)の作用を示し；(b) は０（○）、30（△）、及び60（□）μM のディファラニゾールＡの存在下での9-シスレチノイイン酸(9cisRA)の作用を示す。培養は７日間行った。結果は３回の実験の平均値として示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a pharmaceutical that can enhance the physiological activity of RXR ligands such as retinoic acid, and is useful for the treatment of leukemia, for example.
[0002]
[Prior art]
Retinoic acid (vitamin A acid) is an active metabolite of vitamin A. It is extremely useful for differentiating developing immature cells into mature cells with unique functions, cell growth control and life support. Has important physiological effects. For example, all-trans retinoic acid (ATRA) is a natural morphogen (morphogenic substance) in spinal development and is known to induce differentiation of myeloid leukemia cells. The above compounds having retinoic acid and retinoic acid-like biological activity are collectively referred to as “retinoids”.
[0003]
For example, all-trans retinoic acid is a retinoic acid receptor (RAR) belonging to the nuclear receptor superfamily (Evans, RM, Science, 240, p. 889, 1988) that exists in the cell nucleus. It has been clarified that it binds as a ligand to control the proliferation / differentiation or cell death of animal cells (Petkovich, M., et al., Nature, 330, pp.444-450, 1987). Administration of all-trans retinoic acid can lead to complete remission in most acute promyelocytic leukemia (APL) patients. 9-cis retinoic acid, a stereoisomer of all-trans retinoic acid, is superior to all-trans retinoic acid in in vitro growth inhibition and differentiation-inducing activity of myeloid leukemia cells (Sakashita, A., et al., Blood, 81, pp.1009-1016, 1993), it is known that differentiation induction therapy for APL patients is less effective in terms of side effects than all-trans retinoic acid.
[0004]
Conventionally, there are few reports on substances that enhance the action of retinoids. For example, JP-A-8-59511 discloses that a compound that is a specific ligand for retinoid X receptor (RXR) has an effect of enhancing the action of Am80, a specific ligand compound for RAR-α receptor. Has been suggested. This publication includes 4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl) carbonyl] benzoic acid-ethylene acetal is a synthetic retinoid, Am80 (4 -[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbamoyl] benzoic acid) has been suggested to enhance the differentiation-inducing action. 4- [5H-2,3- (2,5-dimethyl-2,5-hexano) -5-methyldibenzo [b, e] [1,4] diazepin-11-yl] benzoic acid (HX600) It is also known that benzodiazepine compounds, such as, enhance the action of retinoids (Umemiya et al., Chem. Pharm. Bull., 43, pp. 1827-1829, 1995). The action of this compound is thought to activate RXR, which forms RXR-RAR heterodimers.
[0005]
On the other hand, diffalanizole A (3,5-dichloro-2-hydroxy-4-methoxy-6-n-propylbenzoic acid) has been isolated from the culture of microorganisms belonging to the genus Chaetomium ( (Japanese Patent Publication No. 4-32816). This substance is expected to be used as an antitumor agent because it exhibits a differentiation-inducing action on mouse erythrocytic leukemia cells and has an action of inducing normal cells. However, although diffalanizole A exhibits antitumor activity in mice inoculated with neuroblastoma C-1300 cells, it has a problem that its activity in inducing differentiation of myeloid leukemia cells is weak (Suzuki, T., etal., J. Antibiotics, 39, pp.869-871, 1986).
[0006]
SUMMARY OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems
The present inventors conducted extensive research to develop a drug capable of exerting an excellent growth inhibitory action and differentiation-inducing action on human myeloid leukemia cells. As a result, diffalanizole A and, for example, 9-cis retinoic acid, etc. It has been found that the physiological action of RXR ligands is remarkably enhanced when combined with a compound that exhibits an affinity for RXR or a salt thereof. In addition, when used in combination, it is possible to achieve synergistic growth-inhibiting action and differentiation-inducing action on leukemia cells, and that drugs containing these substances as active ingredients can exhibit high efficacy in the treatment of leukemia. I found it. The present invention has been completed based on these findings.
[0007]
That is, the present invention provides a physiological activity enhancer of RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof) comprising difarranizole A or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is to provide. Further, according to the present invention, difaranizole A or a physiologically acceptable salt thereof is included as an active ingredient, and RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof) is used as an active ingredient. A medicament used for enhancing the action of a medicament containing the same, preferably a therapeutic agent for leukemia, is provided.
[0008]
From another point of view, according to the present invention, divalanizole A or a physiologically acceptable salt thereof and RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof) are used as active ingredients. And the use of diffalanizole A or a physiologically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicament preferably used for the treatment of myeloid leukemia; and a method for the treatment of myeloid leukemia comprising Or a method comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a physiologically acceptable salt thereof and a therapeutically effective amount of RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof). Provided. From another aspect, there is provided a medicament comprising difarranizole A or a physiologically acceptable salt thereof and an RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof) as active ingredients. Provided. This medicament is useful for the treatment of various leukemias such as myeloid leukemia.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Diffaranizole A can be produced, for example, by the method described in JP-B-4-32816. Physiologically acceptable salts of difaranizole A are not particularly limited, but include, for example, metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt; ammonium salts: organic amines such as triethylamine salt and morpholine salt Salt: Base addition salts such as amino acid salts such as arginine salt and lysine salt can be used.
[0010]
As used herein, the term “RXR ligand” refers to its affinity as a ligand for the retinoid X receptor (RXR), and the typical biological activities of retinoids (eg, cell differentiation, cell growth control, and It means a compound that can exert a life-sustaining action or its salt (sometimes called “RXR ・ agonist” in general), but it has affinity for RXR and RAR in addition to a specific ligand for RXR. It should be understood that the compounds or salts thereof are also included. For example, Ro47-5944 (Apfel, CM et al., J. Biol. Chem., 270, pp. 30765-30772, 1995) can be mentioned as a specific ligand for RXR. Ligands that have affinity for both RAR and RXR include 9-cis retinoic acid (Levin, AA, et al., Nature, 355, pp.359-361, 1992; Zhang, XK, etal , Nature, 358, pp. 587-591, 1992).
[0011]
In addition, all-trans retinoic acid is known as a ligand that substantially binds only to RAR (Levin et al. And Zhan et al., Supra), but this compound is 9-cis retinoic acid in the metabolic process in vivo. Can act as an RXR ligand in vivo. It should be understood that the RXR ligand in the present invention includes a compound or a salt thereof that can act as an RXR ligand in vivo in this way. Whether a compound or a salt thereof acts as a ligand for RXR and / or RAR can be easily assayed according to the method described in the above-mentioned Levin et al. And Zhan et al. The RXR ligand may be a free form compound or a physiologically acceptable salt thereof. For example, the base addition salts exemplified above as physiologically acceptable salts of 9-cis retinoic acid can be used.
[0012]
Diffaranizole A or a salt thereof itself has a growth-inhibiting action and differentiation-inducing action on leukemia cells. However, representative biological activities of RXR ligands (for example, cell differentiation action, cell growth-control action, and life) It has an action to enhance the maintenance action. More specifically, diffaranizole A or a salt thereof has an action of enhancing the growth-inhibiting action and differentiation-inducing action of 9-cis retinoic acid or a salt thereof on leukemia cells, and the enhancing action is synergistic. Is.
[0013]
Therefore, diffaranizole A or a salt thereof has an RXR ligand vitamin A deficiency; skin diseases such as keratosis of epithelial tissues, psoriasis; allergic diseases; immune diseases such as rheumatism; bone diseases such as osteoporosis and fractures; Huntington's disease; when administered as a medicament for the prevention and / or treatment of diseases such as leukemia and other cancers, it can be used as an action enhancer of the RXR ligand. Moreover, since diffalanizole A or a salt thereof enhances the action of an RXR ligand (for example, retinoic acid) already present in the living body, even when RXR ligand is not administered for the treatment and / or prevention of the above-mentioned diseases, The treatment and / or prevention of the above-mentioned diseases can be achieved by enhancing the action of the RXR ligand in vivo. Typically, it can be used as a pharmaceutical composition in the form of a so-called combination containing difaranizole A or a salt thereof and RXR ligand (preferably 9-cis retinoic acid or a salt thereof) as active ingredients. This combination can be applied as a therapeutic agent for both leukemias such as myeloid leukemia and lymphoid leukemia.
[0014]
Examples of the pharmaceutical composition suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, and syrups. The pharmaceutical composition suitable for parenteral administration includes For example, injections, drops, suppositories, inhalants, eye drops, nasal drops, ointments, creams, patches and the like can be mentioned. Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable pharmaceutical additives used in the production of the above pharmaceutical composition include excipients, disintegrating agents or disintegrating aids, binders, lubricants, and coating agents. , Dyes, diluents, bases, solubilizers or solubilizers, isotonic agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, and adhesives.
[0015]
The dose of difaranizole A or a salt thereof is not particularly limited, but when administered in combination with an RXR ligand, difaranizole A or a salt thereof is administered within a range of about 0.01 to 1,000 mg per adult day, It is desirable to reduce the dose of RXR ligand as appropriate from the usual dose. By referring to the dosage in the above dosage form, the compounding ratio of difaranizole A or a salt thereof and the RXR ligand can be appropriately selected even when administering as a so-called combination.
[0016]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, the scope of the present invention is not limited to the following Example.
(1) Materials and methods
(a) Difaranizole A (3,5-dichloro-2-hydroxy-4-methoxy-6-n-propylbenzoic acid: may be abbreviated as “Dif”) prepared by a method described in the literature (Iimura, Y. et al., Acta Cryst., C40, pp. 2058-2061, 1984; Mori, K. etal., Liebigs Ann. Chem., Pp. 303-305, 1989; Oka et al., J. Antibiotics, 38, pp. 1100-1102, 1985). All-trans retinoic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “ATRA”) and nitroblue tetrazolium (NBT) were purchased from Sigma Chemicals (St. Louis, MO). 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (hereinafter sometimes abbreviated as “VD3”) and 9-cis retinoic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “9cisRA”) are respectively Wako Pure Chemical Industries Ltd. Obtained from the company and BIOMOL Research Laboratories (Premouse Meeting, PA, USA).
[0017]
Retinoic acid receptor (RAR) -specific ligand Am80 (4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbamoyl] benzoic acid; Hashimoto, Y., Res al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, pp.1300-1307, 1990) was donated by Prof. Shudo (University of Tokyo) and retinoid X receptor (RXR) ligand Ro47-5944 (Apfel , CM et al., J. Biol. Chem., 270, pp. 30765-30772, 1995) was used from F. Hoffman-Laroche.
[0018]
(b) Cell line and cell culture A human myeloid leukemia cell line was suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum and cultured in humidified air at 37 ° C. containing 5% CO ₂ . Peripheral blood was collected from a 28-year-old man in a t (15; 17) -positive APL (M3 variant according to criteria proposed by the French-American-English Committee) patient before initiating treatment. To purify leukemia cells, heparinized blood cells were mixed with an equal volume of RPMI-1640 medium and centrifuged with Ficoll-Hypack (Pharmacia).
[0019]
(c) Cell proliferation and differentiated cell properties assay The number of cells was counted with a ZM Coulter Counter (Coulter Electronics, Luton, UK). In order to assay differentiation induction ability, leukemia cells (5 × 10 ⁴ cells / ml) were cultured in the presence or absence of the test compound for a predetermined period. When 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) was given to cells, oxidase that generates superoxide was measured using the ability to reduce NBT as an index. The ability to reduce NBT was assayed by incubating 1 × 10 ⁶ cells at 37 ° C. for 60 minutes in 1 ml of RPMI 1640 medium containing NBT (1 mg / ml) and TPA (100 ng / ml). The percentage of cells containing intracellular blue-black formazan precipitates was measured under a microscope and at least 200 cells were counted.
[0020]
Morphological differentiation was examined with cell smears stained with May-Grunwald-Giemsa. CD11b expression was analyzed by indirect immunofluorescence staining and flow cytometry (Kanatani Y. et al., Cell Growth Differ. 7, pp. 187-196, 1996). Briefly, leukemia cells (2 × 10 ⁶ ) were washed with phosphate buffered saline (PBS) and mouse anti-CD11b (Mac-1; Nichirei Corporation) in PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Incubated in 50 μl at 4 ° C. for 30 minutes. Cells were washed with PBS, incubated for 30 minutes in 50 μl FITC-conjugated anti-mouse IgG (Tago) in PBS containing 0.1% bovine serum albumin, washed with PBS, and then Epix XL flow cytometry (Coulter Electronics ). Cell cycle was analyzed with a fluorescence activated cell sorter using nuclei stained with propidium iodide as described above.
[0021]
(d) Transactivation assay of retinoid receptor
CV-1 cells using lipofectin reagent (GIBCO BRL, Geysersburg, MD) 200 ng receptor plasmid (pCMX-hRAR-α, pCMX-hRXR-α), 500 ng receptor plasmid and 300 ng pCMX-β-gal (Umesono, K., et al., Cell, 65, pp.1255-1266, 1991). The receptors used were TK-TREpx2-LUC (Umesono, K., et al., Cell, 65, pp.1255-1266, 1991) for RAR and TK-CRBPII-LUC (Mangelsdorf, DJ, et al) for RXR. Cell, 66, pp.555-561, 1991). Cells were transfected for 18 hours, the medium containing DNA was removed, and then incubated with test compounds for 24 hours in medium containing 10% resin-charcoal-strept fetal calf serum. Luciferase and β-galactosidase activities were analyzed using a luminescence measuring device (BLR-201; Aloka) and a spectrophotometer (Hitachi), respectively. All transfection data were normalized using an internal β-galactosidase marker and expressed as the average of three experiments.
[0022]
(2) Results
(a) Effect of diffaranizole A on proliferation and differentiation of human leukemia cell lines Diffaranizole A inhibited the growth of myeloid leukemia cells in a dose-dependent manner. When cells were treated for 5 days, IC ₅₀ was 89-130 μM for ML-1, HL-60, NB4, THP-1, U937, and KU812 cells. Subsequently, changes in the cell cycle distribution of HL-60 cells treated with various concentrations of diffalanizole A for 24-72 hours were measured. The results are shown in Table 1 (the results in the table show the mean value ± SD of three measurements).
[0023]
[Table 1]

[0024]
Although there was no significant change in the DNA histogram of cells treated with 60 μM diffalanizole A, the number of cells in the G ₁ phase accumulated in the culture treated with 120 μM. When HL-60 cells (5 × 10 ⁴ / ml) were treated with diffalanizole A for 7 days, the cells had undergone slight but significant morphological differentiation (Table 2: 3 separate experiments). Mean values ± SD). Functional differentiation (NBT reducing ability) was also induced by diffalanizole A, but differentiation differentiation ability of diffalanizole A was weak. Diffaranizole A also showed weak differentiation-inducing activity in monocyte leukemia U937 cells and erythroleukemia K562 cells.
[0025]
[Table 2]

[0026]
(b) Combined effect of diffalanizole A and differentiation inducer
The effect of diffalanizole A on the proliferation and differentiation of leukemic cells in the presence of ATRA, 9cisRA, or VD3 was examined. Diffaranizole A enhances the growth inhibition of HL-60 cells and the induction of NBT reducing ability induced by these substances, and its action is synergistic, and a particularly remarkable synergistic effect was observed for 9cisRA ( FIG. 1). Similar results were obtained for the expression of CD11b surface antigen, which is another myelomonocytic differentiation marker (FIG. 2). Proliferation suppression and differentiation-inducing activity of promyelocytic leukemia NB4 cells with (15; 17) chromosomal translocation by diffalanizole A and 9cisRA was induced synergistically (FIG. 3).
[0027]
Next, the temporal effects of diffaranizole A and 9cisRA on the growth inhibition and differentiation-inducing action (NBT reducing ability) of NB4 cells were examined. Preincubation of NB4 cells with diffalanizole A for 24 hours has no essential effect on the growth inhibitory and differentiation-inducing activities of 9cisRA, and preincubation of 9cisRA inhibits the growth of diffalanizole A. The action was not promoted (Table 3). Similar results were obtained when pretreated for 72 hours. On the other hand, when treated with 4 nM 9cisRA and 60 μM diffalanizole A at the same time, extremely high growth inhibitory action and differentiation inducing activity were observed. The experiment was performed by treating NB4 cells with 60 μM diffalanizole A or 4 nM 9cisRA for 1 day and culturing in a new medium containing 60 μM diffalanizole A or 4 nM 9cisRA. Mean values ± SD of three experiments are shown.
[0028]
[Table 3]

[0029]
(c) Combined effect of diffalanizole A with RXR or RAR ligand
9cisRA is a ligand for both RAR and RXR, and ATRA is a ligand that binds only to RAR (Levin, AA, et al., Nature, 355, pp.359-361, 1992; Zhang, XK, et al. , Nature, 358, pp. 587-591, 1992). However, ATRA may change to 9cisRA to some extent by metabolism. To understand the nature of diffalanizole A, the synergistic action of diffalanizole A with RAR-specific or RXR-specific ligands was investigated. Am80 was used as the RAR-specific ligand and Ro47-5944 was used as the RXR-specific ligand. The results of treating HL-60 cells with various concentrations of Am80 or Ro47-5944 in the presence of diffalanizole A are shown in FIG. From this result, it is clear that the growth inhibitory action of Am80 and difaranizole A is additive, while the effects of Ro47-5944 and difaranizole A are synergistic. ATRA also synergistically inhibited the proliferation of HL-60 cells in the presence of Ro47-5944.
[0030]
Peripheral blood mononuclear cells (> 80% blasts or promyelocytes) were isolated from APL patients (20,000 / μl white blood cell count). The leukemic cells reacted to ATRA and 9cisRA but not to diffalanizole A (FIG. 5). However, diffalanizole A significantly enhanced the ability of this cell to reduce NBT induced by retinoids (0.4 nM 9cisRA plus 60 μM diffalanizole A was 88% NBT positive and 0.4 nM 9cisRA alone was 40%. ) The promoting effect of diffalanizole A was also observed in the morphological changes of cells treated with 9cisRA.
[0031]
(d) Effect of diffaranizole A on transactivation of retinoid receptors It is possible that diffaranizole A may act as a RAR agonist in part. Therefore, CV-1 cells were transfected with receptor plasmids (pCMX-hRARα and pCMX-hRXR-α) and a luciferase reporter plasmid to examine the effect of diffaranizole A on receptor-mediated transactivation. CV-1 cells transfected with the plasmid were incubated for 24 hours in the presence of no added or 10 ⁻⁴ M diffaranizole A (DIF), 10 ⁻⁶ M ATRA or 10 ⁻⁷ M 9cisRA. The RARα and RXRα genes were introduced into the pCMX vector. The results are shown in Table 4 (values in the table indicate the ratio to luciferase activity in unstimulated cells and are shown as an average of three times. NT indicates not tested). Diffaranizole A did not stimulate RARα transactivating activity in the TK-TREpx2-LUC reporter, but ATRA significantly increased. Diffaranizole A also had no effect on RXR. These results indicate that diffaranizole A does not act as an agonist for RAR or RXR.
[0032]
[Table 4]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of diffalanizole A on the proliferation and differentiation of leukemia cells HL-60 in the presence of all-trans retinoic acid, 9-cis retinoic acid, or 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (5-day culture). It is a figure. In the figure, (a) shows the results of 0 (○), 3 (□), and 30 (▲) nM in the presence of 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (VD3); (b) shows 1 (△ ), 4 (□), 8 (●), and 10 (■) nM in the presence of all-trans retinoic acid (ATRA); (c) shows 1 (Δ), 4 (□), 8 ( )) And 10 (■) nM in the presence of 9-cis retinoic acid (9cisRA). Results are shown as the average of 4 independent experiments.
FIG. 2 shows the effect of diffalanizole A on the differentiation of leukemic cells HL-60 in the presence of all-trans retinoic acid, 9-cis retinoic acid, or 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (VD3). It is the figure shown about the expression of CD11b surface antigen which is a differentiation marker. In the figure, (a) shows the results in the presence of 3 nM 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (VD ₃ ); (b) shows the results in the presence of 4 nM all-trans retinoic acid (RA). (C) shows the results in the presence of 4 nM 9-cis retinoic acid (9cisRA). The solid line shows the results of culturing for 3 days in the presence of 60 μM diffalanizole A, and the chain line shows the results in the absence of diffalanizole A. Marker expression was performed by immunofluorescence staining using an anti-CD11b antibody. In the figure, a thin line indicates an untreated control, and a dotted line indicates a negative control for immunofluorescence measurement.
FIG. 3. Effect of diffalanizole A on promyelocytic leukemia NB4 cell proliferation and differentiation in the presence of all-trans retinoic acid, 9-cis retinoic acid, or 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (5-day culture) FIG. In the figure, (a) shows the results of 0 (○), 3 (△), and 30 (▲) nM in the presence of 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (VD3); (b) shows 4 (□ ) And 40 (■) nM in the presence of all-trans retinoic acid (ATRA); (c) shows results in the presence of 4 (□) and 40 (■) nM 9-cis retinoic acid (9cisRA). Indicates. Results are shown as the average of 4 independent experiments.
FIG. 4 shows the results of treatment of HL-60 cells with various concentrations of Am80 or Ro47-5944 for 5 days in the presence of diffalanizole A. FIG. In the figure, (a) shows the effect of Am80 in the presence of 0 (○), 30 (△), 60 (□), and 90 (■) μM diffalanizole A; (b) shows 0 (○ ), 30 (△), 60 (□), and 90 (■) μM in the presence of Diffaranizole A; (c) shows 0 (○), 40 (▲), and The effect of Ro47-5944 in the presence of 400 (◆) nM all-trans retinoic acid is shown. Results are shown as the average of 4 independent experiments.
FIG. 5 shows the effects of diffaranizole A and retinoid in primary culture systems of peripheral blood mononuclear cells isolated from APL patients. In the figure, (a) shows the action of all-trans retinoic acid (ATRA) in the presence of 0 (○), 30 (△), and 60 (□) μM diffalanizole A; (b) shows 0 (O) shows the action of 9-cis retinoic acid (9cisRA) in the presence of 30 (Δ) and 60 (□) μM diffalanizole A. The culture was performed for 7 days. Results are shown as the average of three experiments.

Claims

Including its salts differentiation Rani tetrazole A or a physiologically acceptable active ingredient, 9-cis-retinoic acid, Ro47-5944 selection, all-trans retinoic acid, and from the group consisting of physiologically acceptable salts An agent for enhancing cell differentiation, cell proliferation control, and life support of one or more RXR ligands.

Containing difaranizole A or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient, 9- A potentiator of the growth inhibitory action and differentiation-inducing action on leukemic cells of cis-retinoic acid or a physiologically acceptable salt thereof.

Vitamin A deficiency comprising as an active ingredient one or more RXR ligands selected from the group consisting of 9- cis retinoic acid, Ro47-5944 , all-trans retinoic acid, and physiologically acceptable salts thereof; skin disease Allergic disease; immune disease; bone disease; Alzheimer; Huntington's chorea; leukemia; or other drugs to enhance the action of drugs for the prevention and / or treatment of cancer, or physiologically acceptable including pharmaceutical salt thereof as an active ingredient.

The medicament according to claim 3 , wherein the RXR ligand is 9-cis retinoic acid.

One or more selected from the group consisting of difaranizole A or a physiologically acceptable salt thereof and 9- cis retinoic acid, Ro47-5944 , all-trans retinoic acid, and physiologically acceptable salts thereof A therapeutic agent for leukemia comprising the above-mentioned RXR ligand as an active ingredient.

The therapeutic agent according to claim 5 , wherein the RXR ligand is 9-cis retinoic acid.