JP3822006B2

JP3822006B2 - Method for producing cytidine 5'-choline diphosphate

Info

Publication number: JP3822006B2
Application number: JP28743699A
Authority: JP
Inventors: 利忠野口; 健治竹之内; 智樹浜本; 潔奥山; 邦明長岡
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: JP2001103973A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ−コリン）の効率的な製造法およびそれに使用する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＣＤＰ−コリンは医薬品として頭部外傷、脳手術に伴う意識障害、脳卒中などの改善治療に用いられている有用な化合物である。
ＣＤＰ−コリンの製造方法としては、化学合成法、酵母などの微生物を用いる方法などが古くから知られている。しかし、これらいずれの方法もシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率は低く、低コストでＣＤＰ−コリンを製造できる効率的な方法とはいえなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
最近、丸山らはオロット酸より酵素処理によりＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特開平５−２７６９７４）。しかしながら、該方法ではオロット酸からウリジン５’−トリリン酸（ＵＴＰ）を製造するための微生物を培養する工程とＵＴＰからのＣＤＰ−コリンの合成に関与する３種類の酵素〔ＣＴＰシンセターゼ、コリンホスフェートシチジルトランスフェラーぜ（ＣＣＴ）およびコリンキナーゼ（ＣＫＩ）〕を生産する組換え大腸菌を培養する工程があり、微生物培養の手間と培養設備の観点から必ずしも簡便な方法とは言えない。また、オロット酸１モルに対するＣＤＰ−コリンの合成収率も必ずしも高くなく、満足し得る方法ではない。
【０００４】
また、山下らはＣＣＴ遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換された酵母菌体を用い、ＣＭＰとホスホコリンからＣＭＰ１モルに対し９０％前後の合成収率でＣＤＰ−コリンを製造する方法を開発した（特許第２７２４８２５号）。該方法は、セルフクローニングによりＣＤＰ−コリンの合成に関与するＣＣＴの生産を増強した酵母を用いることで、高収率でＣＤＰ−コリンを合成できるものの、用いる組換え酵母菌体はＣＭＰからのＣＤＰ−コリン合成に関与する一連の酵素の供給を担うこととなり、しかもＣＣＴ以外のＣＤＰ−コリン合成関連酵素の生産性は必ずしも高くないため、合成反応には多量の酵母菌体を使用する必要があった。このため、組換え酵母の培養量が膨大となり、結果的には必ずしも実用的な方法とは言えず、実際には実施されるに至っていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酵母菌体がヌクレオシド５’−モノリン酸を効率的にヌクレオシド５’−トリリン酸に転換する活性を有することに着目し、ＣＭＰからのＣＤＰ−コリンの効率的な合成法を確立すべく、ＣＭＰとコリン（あるいはホスホリルコリン）を基質とする酵母添加反応液に酵母由来のＣＣＴ及びＣＫＩを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することで、またはＣＭＰとホスホコリンを基質とする酵母添加反応液にＣＣＴを生産する組換え大腸菌、その処理物あるいは酵素抽出液を添加して反応することでＣＤＰ−コリンが合成できるかどうか検討した結果、コリンを用いた場合には意外なことに目的とするＣＤＰ−コリンはまったく合成されないか、合成されても極くわずかな量しか生成されないこと、およびホスホコリンを用いた場合であっても満足しうる量のＣＤＰ−コリンを合成することができないことを確認した。
【０００６】
この原因を究明する過程において、ＣＤＰ−コリンの低収率は、酵母由来のＣＣＴ並びにＣＫＩは大腸菌において安定に高生産されないことに起因していることを突き止めた。
そこで本発明者らは、大腸菌における当該酵素の発現経過を検討した結果、完全には解明されなかったものの、発現後のＣＣＴおよびＣＫＩを不安定化する要因の１つにプロテアーゼによる加水分解が関与しているものと推測された。そこで、使用する酵素にプロテアーゼ抵抗性を付与し、安定に高発現させるための方策に関し種々検討を重ねた結果、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させて得られるタンパク質は目的とする酵素活性を維持し、発現量が増大するとともに、プロテアーゼに対しても抵抗性を示し、大腸菌においても安定に高生産される系を構築できることを見いだし、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することで効率的にＣＤＰ−コリンを合成することを確認し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンホスフェートシチジルトランシフェラーゼ（ＣＣＴ）活性を有する酵素タンパク質、および（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるコリンキナーゼ（ＣＫＩ）活性を有する酵素タンパク質の２種類の酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、シチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）及びコリンを反応させてシチジン５’−ジリン酸コリン（ＣＤＰ-コリン）を製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００８】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質の存在下、酵母菌体、ＣＭＰ及びホスホリルコリンを反応させてＣＤＰ-コリンを製造することを特徴とする、ＣＤＰ-コリンの製造法に関するものである。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【０００９】
さらに、本発明は、（１）配列番号１で示される塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、（１）配列番号２で示される塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、（２）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、または（３）上記（１）のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上述したように、本発明の特徴は、反応系に添加するＣＣＴとして、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、および必要によりＣＫＩとして以下の（ｄ）〜（ｆ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することにある。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｃ）上記（ａ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片
【００１２】
上記（ａ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列が酵母のＣＣＴ構造遺伝子に相当し、このＣＣＴ遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分（６６塩基）を欠失させたものが配列番号１で示される塩基配列である。
上記（ａ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＣＴ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号１で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
【００１３】
また、上記（ｄ）記載のＤＮＡ断片は、酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片である。具体的には、図１に示す塩基配列中、塩基番号１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子に相当し、このＣＫＩ遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分（８７塩基）を欠失させたものが配列番号２で示される塩基配列である。
上記（ｄ）のＤＮＡ断片と同等の機能、すなわちＣＫＩ活性を維持し、プロテアーゼに対する抵抗性を示す限り、配列番号２で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはこれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も本発明で使用可能である。
なお、本発明でいうストリンジェントな条件下での反応とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶解させたもの）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度のハイブリダイゼーション反応を行うことを意味する。
【００１４】
このような特定のＤＮＡ断片を使用するとき、酵素タンパク質の発現量を最大にすることができ、生産された後の安定性も向上することが本発明者らの実験で初めて確認された。
ＤＮＡ断片の調製は、既にクローン化され、その全塩基配列が決定されており、酵母のＣＣＴ遺伝子（Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 1987）およびＣＫＩ遺伝子（J. Biol. Chem., 264, 2053-2059, 1989）を参考に公知の組換えＤＮＡ手法（例えば「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）をクローン化後、ヌクレアーゼ等の酵素を用いて消化させることにより容易に実施することができる。
また、調製したＤＮＡ断片を用い発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＣＣＴおよびＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の調製なども分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、例えば（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）に従って行うことができる。
【００１５】
すなわち、宿主微生物としては、ＣＣＴ活性またはＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質が発現でき、ＣＤＰ−コリンの製造に適用できるものであればいずれも使用可能であり、培養及び酵素調製の簡便さから大腸菌が適当である。具体的には、組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))などが使用可能であり、特にプロテアーゼ欠損株が好ましい。また、発現用ベクターとしては大腸菌内で複製可能であれば特に限定されないが、ｐＢＲ３２２（Gene, 2, 95-113, 1977）あるいはｐＵＣ１８（Gene, 33, 103-119, 1985）など、あるいはそれら誘導体が使用できる。このようなベクターと上記ＤＮＡ断片を用いて、大腸菌の菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００１６】
このような発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、酵素タンパク質の発現量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。具体的には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを例示することができる。
作製した組換えべクターを用いて大腸菌を形質転換する。大腸菌を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、たとえば、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Biol．，53，159（1970））により大腸菌を形質転換することができる。
【００１７】
得られた形質転換体は当該形質転換体が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＣＣＴ活性ならびにＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の発現を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。
培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００１８】
形質転換体の培養は、低温で培養することで上記酵素タンパク質を安定に生産させることができるので、当該培地に種菌を接種後、２０〜３０℃で、好ましくは２０〜２８℃で１０〜５０時間程度必要により通気撹拌しながら培養する。
また、酵素タンパク質の産生を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
【００１９】
反応液に添加する酵素タンパク質としては、上記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの固液分離手段で回収した微生物の菌体を利用することも可能であるが、該微生物の処理物、該処理物から得られる酵素調製物を利用することもできる。
微生物の処理物としては、上記回収した微生物菌体を、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体処理物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
【００２０】
また、反応系に添加する酵母菌体としては、ＣＭＰをシチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）に変換できる酵母であればよく、なかでも市販のパン酵母、あるいはワイン酵母を用いることで酵母菌体製造の過程が省略でき、極めて有利である。また、酵母乾燥菌体、酵母生菌体いずれの形態も利用可能である。酵母菌体の使用濃度としては、乾燥重量として１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から適宜設定することができる。
基質として使用するＣＭＰ、コリンまたはホスホリルコリンは市販品を使用することができる。各基質の使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。
【００２１】
ＣＤＰ−コリンの合成反応は、例えば水溶液、好ましくはリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中、酵母菌体、ＣＭＰ、コリン（またはホスホリルコリン）を添加し、さらにＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質、ＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質（ホスホリルコリンを使用した場合には不要）をそれぞれ０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０４〜１．０ユニット／ｍｌ添加し、５〜３０℃、好ましくは２０〜３０℃で１０〜７２時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。
【００２２】
なお、上記酵素反応は、無機リン酸及びエネルギー源を反応系に添加して行うのが望ましい。使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどのリン酸塩をそのまま使用してもよく、リン酸緩衝液の形態で使用してもかまわない。無機リン酸の使用濃度は、１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜３００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。また、エネルギー源としてはグルコース、フラクトースなどの糖類または酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができ、それぞれ１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜４００ｍＭの範囲から適宜選定することができる。
このようにして得られたＣＤＰ−コリンは、通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
また、実施例において、反応液中のＣＤＰ−コリンの定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離には日立社製の３０１３−Ｎカラムを用い、溶出液としてはＡ液；０．１２ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、０．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、０．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、Ｂ液；５００ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、８３ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、８３ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用い、０〜５０％Ｂ液（０−２０分リニアーグラジエント）、１００％Ｂ液（２０−２５分）の条件で分析を行った。
【００２４】
実施例１
（１）発現用プラスミドｐＴｒｃ１２−６の作製
プラスミドベクター πＡＧ１（プラスミドベクター πＡＧ１を保持した大腸菌Ｋ−１２株ＴＮＣ１１１菌の寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６９０１号：平成１１年９月３０日生命工学工業技術研究所寄託）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＢｇｌＩＩリンカーを付与した。該ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製した。
次にｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで切断後、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼによる部分消化を行い、β―ラクタマーゼ遺伝子を欠失させ、さらにｐＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ末端に付与し、さらに制限酵素ＢｇｌＩＩで切断した。該ＤＮＡと先に調製したカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換した。
得られたカナマイシン耐性形質転換体より、プラスミドｐＴｒｃ１２−６を得た。ｐＴｒｃ１２−６は、ｐＴｒｃ９９Ａのβ―ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し（position ５６７―１８１６ｂｐが欠失）、その欠失部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである。
【００２５】
（２）ＣＣＴ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ４４７７３）の染色体ＤＮＡを公知の方法（Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＣＴ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3'
プライマー（Ｂ）：5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-3'
ＰＣＲによるＣＴＴ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２６】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＣＴは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＸｂａＨＩ切断部位に酵母ＣＣＴ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２７】
（３）ＣＫＩ遺伝子のクローニング
酵母 Saccharomyces cerevisiae DBY746（ＡＴＣＣ４４７７３）の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により酵母ＣＫＩ遺伝子を増幅した。
プライマー（Ｃ）：5'-ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCA-3'
プライマー（Ｄ）：5'-ATCTGCAGGAATTCGTATACGTATTACA-3'
ＰＣＲによるＣＫＩ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．５μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００２８】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩを単離した。
ｐＴｒｃ１２−ＣＫＩは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２９】
（４）ＣＣＴ及びＣＫＩの調製
プラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＣＴを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ＣＣＴ遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片を分離精製した。該断片とＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＴｒｃ１２−ＣＫＩＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結反応液を用いた大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を単離した。ｐＴｒｃ−ＣＣＫ８は、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流に酵母ＣＣＴ及びＣＫＩ遺伝子が連結されて挿入されたものである。
プラスミドｐＴｒｃ−ＣＣＫ８を用いて大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭＢＰ−６８４７号：平成１１年８月１８日生命工学工業技術研究所寄託）を形質転換し、得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。４ｘ１０⁸菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２８℃で２０時間振とう培養を続けた。
【００３０】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭＥＤＴＡ〕に懸濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このように得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるＣＣＴ活性は０．８４ユニット／ｍｇ蛋白、ＣＫＩ活性は０．０６ユニット／ｍｇ蛋白であった。
さらに、酵素生産の過程をタイムコースを追って調べた結果、ＩＰＴＧ誘導後、ＣＣＴ、ＣＫＩとも生産されるものの、その量は必ずしも高くなく、しかも生産された酵素の活性が徐々に失われてゆき、その原因の１つとしてプロテアーゼによる加水分解が推定された。
【００３１】
なお、本発明における各種酵素の単位（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出したものである。
（ＣＣＴ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭＣＴＰ、５ｍＭホスホコリン、２５ｍＭ塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応させる。反応終了後１００℃で１分間の熱処理を行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で反応液中のＣＤＰ−コリン量を分析する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（ＣＫＩ活性の測定と単位の算出法）
５ｍＭＣＴＰ、５ｍＭ塩化コリン、５ｍＭＡＴＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１ユニット／ｍｌＣＣＴを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に酵素標品を添加し、２８℃で反応を行い、１００℃で１分間の熱処理により反応を停止させる。反応液中のＣＤＰ−コリン量をＨＰＬＣ法により定量する。２８℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰ−コリンの生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３２】
（５）酵母ＣＣＴをコードする遺伝子からＣ末端２２アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＴＲ−１）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、前述のプライマーＤＮＡ（Ａ）と下に示すプライマーＤＮＡ（Ｅ）を常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＣＴＲ−１を増幅した。
プライマー（Ｅ）：5'-TACCATGGCAAACCCAACAACAGGGA-3'
ＰＣＲによるＣＴＲ−１の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｅ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３３】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＣＴＲ１を単離した。
ｐＴｒｃ−ＣＴＲ１は、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に３’末端６６ｂｐを欠失した酵母ＣＣＴ構造遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００３４】
（６）酵母ＣＫＩをコードする遺伝子からＮ末端２９アミノ酸残基相当分を欠失させたＤＮＡ断片（ＣＫＦ−Ａ）の調製
上記（４）で構築、単離したｐＴｒｃ−ＣＣＫ８プラスミドをテンペレートとして、先に示したプライマーＤＮＡ（Ｄ）と以下に示すプライマーＤＮＡ（Ｆ）を常法に従って合成し、ＰＣＲによりＣＫＦ−Ａを増幅した。
プライマー（Ｆ）：5'-TGTCTAGATGGTAACACGCCAACGTTCCTC-3'
ＰＣＲによるＣＫＦ−Ａの増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＮＴＰ、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｄ）（Ｆ）各々０．２μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。
【００３５】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＫＦ−Ａを単離した。
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａは、ｐＴｒｃ１２−６のｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に酵母ＣＫＩ遺伝子の５’末端８７ｂｐを欠失した構造遺伝子を含有するＸｂａＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。なお、ＣＫＦ−Ａタンパク質のＮ末端１、２番目のアミノ酸基はメチオニン、バリンである（天然のＣＫＩではセリン、ロイシンに相当）。
【００３６】
（７）ＣＴＲ−１およびＣＫＦ−Ａを用いてのＣＣＴ活性を有する酵素タンパク質とＣＫＩ活性を有する酵素タンパク質の生産
ｐＴｒｃＣＫＦ−Ａプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、切断断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。続いて平滑化処理した該プラスミドを制限酵素ＸｂａＩで切断し、得られたＣＫＦ−Ａ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片を文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離、回収した。次にｐＴｒｃ−ＣＴＲ１プラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断断片を平滑化した。続いて制限酵素ＸｂａＩで切断し、該ＤＮＡ断片と実施例で調製したＣＫＦ−Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ−１２株ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭＢＰ−６８４７）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＦＡを単離した。
得られた形質転換体を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する改変ＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１％グルコース）３００ｍｌに植菌し、２４℃で振とう培養した。培養液ｍｌあたりの菌体数が５ｘ１０⁸に達した時点で終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２４℃で２０時間培養を続けた。
【００３７】
培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、３０ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕にけん濁した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を酵素標品とした。
このようにして調製した酵素標品における両酵素活性と従来のＣ末またはＮ末欠失前の遺伝子を用いて調製した上記（４）で得られた酵素液の酵素活性との比較を表１に示す。表１から明らかなように、大腸菌における生産性は、上述したＣ末またはＮ末を欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することにより、生来の酵母ＣＣＴに比べて約１．４倍、ＣＫＩは生来の酵母ＣＫＩに比べて約２０倍の生産性の向上が確認され、発現量の増大とともに、プロテアーゼ抵抗性の付与が生産された酵素タンパク質の活性を高レベルに維持できる要因と推測された。
【００３８】
【表１】

【００３９】
（８）ＣＤＰ−コリンの合成（その１）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化コリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、上記（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加して（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ、ＣＫＩ活性：０．４０ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２８℃で４６時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４６時間後に６８ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：９０．７％）。
比較として、前記（４）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加する他は同じ条件で反応を行ったが、ＣＤＰ−コリンの合成はわずかであった。
【００４０】
実施例２ＣＤＰ−コリンの合成（その２）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１１０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．９ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を０．１ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、試験管中で通気撹拌し、２５℃で４８時間保温した。反応開始７、２３、３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４８時間後に、１０２ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８１．６％）。
【００４１】
実施例３ＣＤＰ−コリンの合成（その３）
実施例１の（７）と同様の方法で、調製した組換え大腸菌の培養液２０ｍｌを遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、−５℃で１晩保存した後、２．３ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化マグネシウム〕にけん濁し、菌体けん濁液とした。
次に、２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、１３０ｍＭホスホリルコリン、０．４Ｍグルコース、３．０％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液４．８７５ｍｌに、調製した菌体けん濁液を０．１２５ｍｌ添加し、さらにキシレンを０．０２５ｍｌ添加し、試験管中で通気撹拌し、２４℃で４０時間保温した。反応開始１６と２４時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。反応４０時間後に、１０７ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率：８５．６％）。
【００４２】
実施例４ＣＤＰ−コリンの合成（その４）
２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、７５ｍＭＣＭＰ、２５ｍＭ塩化マグネシウム、８０ｍＭホスホリルコリン、０．２Ｍグルコース、２％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社）を含有する反応液１５００ｍｌに、実施例１の（７）で調製した酵素液を１２．５ｍｌ添加し（ＣＣＴ活性：０．３８ユニット／ｍｌ）、３Ｌ卓上型ジャーファメンターで通気撹拌し（０．５Ｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍ）、２４℃で４８時間保温した。反応開始７時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコース、並びに酵素液を１２．５ｍｌを添加した。さらに反応２４及び３２時間後に終濃度０．２Ｍとなるようにグルコースを添加した。
反応４８時間後に、６７．５ｍＭのＣＤＰ−コリンが合成された（対ＣＭＰモル収率９０．０％）
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を複数個欠失させた特定のＤＮＡ断片を使用することで、目的とする酵素タンパク質を安定に高生産させることができ、このような高生産系で得られた酵素タンパク質を使用することでＣＤＰ−コリンを短時間に効率的に合成できる極めて実用性の高い方法である。
具体的には、本発明の特定のＤＮＡ断片を使用することで、大腸菌における酵素タンパク質の生産性は、ＣＣＴは約１．４倍以上、ＣＫＩは約２０倍以上向上し、もってＣＤＰ−コリンの合成も飛躍的に向上させることが可能である。
【００４４】
【配列表】

【００４５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、酵母由来のＣＣＴおよびＣＫＩの構造遺伝子を含有する塩基配列を示したものである。図中、塩基番号１〜１２０８番目で示される配列がＣＣＴの構造遺伝子であり、１２２３〜２８８１番目で示される配列がＣＫＩの構造遺伝子である。
【００４６】
【受託証】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an efficient method for producing cytidine 5′-diphosphate choline (CDP-choline) and a DNA fragment encoding an enzyme protein used therefor.
[0002]
[Prior art]
CDP-choline is a useful compound that is used as a pharmaceutical for improvement treatment of head injury, disturbance of consciousness associated with brain surgery, and stroke.
As a method for producing CDP-choline, a chemical synthesis method, a method using a microorganism such as yeast, and the like have been known for a long time. However, none of these methods is an efficient method capable of producing CDP-choline at a low cost because the synthesis yield of CDP-choline relative to 1 mol of cytidine 5′-monophosphate (CMP) is low.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Recently, Maruyama et al. Developed a method for producing CDP-choline from orotic acid by enzymatic treatment (Japanese Patent Laid-Open No. 5-276974). However, the method involves culturing a microorganism for producing uridine 5′-triphosphate (UTP) from orotic acid and three enzymes involved in the synthesis of CDP-choline from UTP [CTP synthetase, choline phosphate sciti Zirtran The There is a step of culturing recombinant Escherichia coli producing Ferrase (CCT) and choline kinase (CKI)], which is not necessarily a simple method from the viewpoint of microbial culture labor and culture facilities. Further, the synthesis yield of CDP-choline per mole of orotic acid is not necessarily high, and it is not a satisfactory method.
[0004]
Yamashita et al. Also developed a method for producing CDP-choline from CMP and phosphocholine in a yield of about 90% with respect to 1 mol of CMP using yeast cells transformed with recombinant DNA containing the CCT gene ( Japanese Patent No. 2724825). Although this method can synthesize CDP-choline in high yield by using yeast that has enhanced the production of CCT involved in the synthesis of CDP-choline by self-cloning, the recombinant yeast cell used is CDP from CMP. -It will be responsible for the supply of a series of enzymes involved in choline synthesis, and the productivity of CDP-choline synthesis-related enzymes other than CCT is not necessarily high, so a large amount of yeast must be used for the synthesis reaction. It was. For this reason, the culture amount of the recombinant yeast becomes enormous, and as a result, it is not necessarily a practical method and has not been actually implemented.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors paid attention to the fact that yeast cells have an activity of efficiently converting nucleoside 5′-monophosphate to nucleoside 5′-triphosphate, and developed an efficient method for synthesizing CDP-choline from CMP. In order to establish, yeast-derived CCT and yeast-containing reaction solution using CMP and choline (or phosphorylcholine) as substrates are added. And Recombinant Escherichia coli that produces CKI, its treated product or enzyme extract, reacts with it, or recombinant E. coli that produces CCT in a yeast-added reaction solution using CMP and phosphocholine as substrates, its treated product or enzyme As a result of investigating whether CDP-choline can be synthesized by adding an extract and reacting, surprisingly, when choline is used, the target CDP-choline is not synthesized at all or even if synthesized, It was confirmed that only a small amount was produced and that a satisfactory amount of CDP-choline could not be synthesized even when phosphocholine was used.
[0006]
In the process of investigating this cause, it was found that the low yield of CDP-choline was due to the fact that yeast-derived CCT and CKI were not stably produced at high levels in E. coli.
As a result, the present inventors examined the expression process of the enzyme in Escherichia coli. As a result, although not completely elucidated, hydrolysis by protease is involved in one of the factors destabilizing CCT and CKI after expression. It was speculated that. Therefore, as a result of various investigations on the method for imparting protease resistance to the enzyme to be used, and for stable high expression, a plurality of N-terminal or C-terminal amino acids were deleted. Let me It was found that the obtained protein maintains the target enzyme activity, increases the expression level, is resistant to proteases, and can construct a system that can be stably and highly produced in E. coli. It was confirmed that CDP-choline was efficiently synthesized by using the enzyme protein obtained in the production system, and the present invention was completed.
[0007]
That is, the present invention is described in the following (a) to (c). Encoded by the base sequence of any DNA fragment An enzyme protein having choline phosphate cytidyl transferase (CCT) activity, and (d) to (f) Encoded by the base sequence of any DNA fragment In the presence of two types of enzyme proteins having choline kinase (CKI) activity, yeast cells, cytidine 5′-monophosphate (CMP) and choline are reacted to give cytidine 5′-diphosphate choline (CDP-choline). ), And a process for producing CDP-choline.
(A) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 Consist of DNA fragments,
(B) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or several Bases deleted, substituted, inserted or added Consists of base sequence DNA fragments,
(C) In (a) above DNA fragments that hybridize under stringent conditions to the described DNA fragments,
(D) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Consist of DNA fragments,
(E) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several Bases deleted, substituted, inserted or added Consists of base sequence DNA fragments,
(F) In (d) above DNA fragments that hybridize to the described DNA fragments under stringent conditions
[0008]
Moreover, this invention is described in the following (a)-(c). Encoded by the base sequence of any DNA fragment The present invention relates to a method for producing CDP-choline, which comprises producing CDP-choline by reacting yeast cells, CMP and phosphorylcholine in the presence of an enzyme protein having CCT activity.
(A) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 Consist of DNA fragments,
(B) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or several Bases deleted, substituted, inserted or added Consists of base sequence DNA fragments,
(C) In (a) above DNA fragments that hybridize to the described DNA fragments under stringent conditions
[0009]
Furthermore, the present invention provides (1) a DNA fragment consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding an enzyme protein having CCT activity, (2) one or more in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 several A DNA fragment that encodes an enzyme protein having a CCT activity, comprising a nucleotide sequence in which is deleted, substituted, inserted or added, or (3) (1) above The present invention relates to a DNA fragment that hybridizes with a DNA fragment under stringent conditions and encodes an enzyme protein having CCT activity.
[0010]
Furthermore, the present invention provides (1) a DNA fragment consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding an enzyme protein having CKI activity, (2) one or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or several A DNA fragment that encodes an enzyme protein having a CKI activity, comprising a nucleotide sequence in which the base of is deleted, substituted, inserted or added, or (3) (1) above The present invention relates to a DNA fragment that hybridizes with a DNA fragment under stringent conditions and encodes an enzyme protein having CKI activity.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As described above, the present invention is characterized by the following (a) to (c) as CCT added to the reaction system. Encoded by the base sequence of any DNA fragment An enzyme protein having CCT activity and, if necessary, CKI as described in (d) to (f) below Encoded by the base sequence of any DNA fragment It is to use an enzyme protein having CKI activity.
(A) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 Consist of DNA fragments,
(B) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or several Bases deleted, substituted, inserted or added Consists of base sequence DNA fragments,
(C) In (a) above DNA fragments that hybridize under stringent conditions to the described DNA fragments,
(D) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Consist of DNA fragments,
(E) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several Bases deleted, substituted, inserted or added Consists of base sequence DNA fragments,
(F) In (d) above DNA fragments that hybridize to the described DNA fragments under stringent conditions
[0012]
The DNA fragment described in the above (a) is a DNA fragment obtained by deleting the C-terminal 22 amino acid residue equivalent from the gene encoding yeast CCT. Specifically, in the base sequence shown in FIG. 1, the sequence represented by nucleotide numbers 1-1208 corresponds to the yeast CCT structural gene, and the C-terminal 22 amino acid residue equivalent (66 bases) is derived from this CCT gene. The deleted one is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
As long as the function equivalent to that of the above DNA fragment (a), that is, CCT activity is maintained and resistance to protease is exhibited, one or more bases are deleted, substituted or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Alternatively, added DNA fragments, or DNA fragments that hybridize with these DNA fragments under stringent conditions can also be used in the present invention.
[0013]
The DNA fragment described in (d) above is a DNA fragment obtained by deleting the portion corresponding to the N-terminal 29 amino acid residues from the gene encoding yeast CKI. Specifically, in the base sequence shown in FIG. 1, the sequence represented by nucleotide numbers 1223 to 2881 corresponds to the CKI structural gene, and the N-terminal 29 amino acid residue equivalent (87 bases) is missing from this CKI gene. What was lost is the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
As long as the function equivalent to that of the DNA fragment of (d) above, that is, CKI activity is maintained and resistance to protease is exhibited, one or more bases are deleted, substituted, or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Alternatively, added DNA fragments, or DNA fragments that hybridize with these DNA fragments under stringent conditions can also be used in the present invention.
The reaction under stringent conditions referred to in the present invention means 5 × SSC (1 × SSC is 8.76 g of sodium chloride, 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 0.1% ( w / v) N-lauroyl sarcosine sodium salt, 0.02% (w / v) SDS, 0.5% (w / v) A solution containing blocking reagent was used, and a hybridization reaction was performed at 60 ° C. for about 20 hours. Means to do.
[0014]
It has been confirmed for the first time in our experiments that when such a specific DNA fragment is used, the expression level of the enzyme protein can be maximized and the stability after production can be improved.
Preparation of the DNA fragment has already been cloned and its entire nucleotide sequence has been determined. The yeast CCT gene (Eur. J. Biochem., 169, 477-486, 1987) and the CKI gene (J. Biol. Chem) 264, 2053-2059, 1989) with reference to known recombinant DNA techniques (eg “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition” Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) It can be easily carried out by using and digesting.
In addition, preparation of an expression vector using the prepared DNA fragment, preparation of an enzyme protein having CCT and CKI activity using the expression vector, and the like are well-known techniques for engineers belonging to the field of molecular biology. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)).
[0015]
That is, any host microorganism can be used as long as it can express an enzyme protein having CCT activity or CKI activity and can be applied to the production of CDP-choline. It is. Specifically, the K12 strain, C600 strain, JM105 strain, JM109 strain (Gene, 33, 103-119 (1985)) used for recombinant DNA experiments can be used, and a protease-deficient strain is particularly preferable. The expression vector is not particularly limited as long as it can be replicated in Escherichia coli, but pBR322 (Gene, 2, 95-113, 1977), pUC18 (Gene, 33, 103-119, 1985), or derivatives thereof. Can be used. Using such a vector and the above-mentioned DNA fragment, a recombinant expression vector is prepared in which expression control signals (transcription initiation and translation initiation signals) are linked upstream so that they can be expressed in Escherichia coli cells.
[0016]
As such an expression control signal, artificial control is possible, and it is desirable to use a strong transcription initiation signal and translation initiation signal that dramatically increase the expression level of the enzyme protein. Specifically, the lac promoter, trp promoter, tac promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 21 (1983), Gene, 20, 231 (1982)), trc promoter (J. Biol. Chem. , 260, 3539 (1985)).
E. coli is transformed using the prepared recombinant vector. Many methods for transforming E. coli have already been reported. For example, a method of introducing a plasmid into cells by treating with calcium chloride at a low temperature (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). Can transform E. coli.
[0017]
The obtained transformant is grown in a medium in which the transformant can grow, and the expression of the cloned enzyme protein having CCT activity and CKI activity is induced to accumulate a large amount of the enzyme protein in the cell body. Incubate until complete.
Medium includes bouillon medium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% salt) or 2 × YT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5% salt) Can be used. In addition, when a plasmid is used as a vector, culture is performed by adding an appropriate amount of an antibiotic (such as ampicillin or kanamycin depending on the drug resistance marker of the plasmid) to the culture medium in order to prevent the plasmid from dropping during culture. To do.
[0018]
Since the enzyme protein can be stably produced by culturing the transformant at a low temperature, it is inoculated with the inoculum on the medium at 20-30 ° C, preferably 20-28 ° C, preferably 10-50. Incubate with aeration and agitation if necessary.
Also of enzyme protein Production When it is necessary to induce gene Induces the expression of For example, when lac promoter or tac promoter is used, an appropriate amount of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (hereinafter abbreviated as IPTG), which is an expression inducer, is added in the middle of the culture. Further, when the promoter used has a transcriptional activity constitutively, it is not necessary to add an expression inducer.
[0019]
As the enzyme protein to be added to the reaction solution, it is possible to use microbial cells recovered from the culture solution obtained by the above method by solid-liquid separation means such as centrifugation and membrane separation. A treated product and an enzyme preparation obtained from the treated product can also be used.
As the processed microorganisms, the recovered microbial cells are mechanically destroyed (using a Waring blender, French press, homogenizer, mortar, etc.), freeze-thawed, self-digested, dried (by freeze-drying, air-drying, etc.), enzyme treatment Illustrates a treated cell product or a modified cell wall or cell membrane obtained by treatment according to a general treatment method such as sonication (by lysozyme, etc.), ultrasonic treatment, chemical treatment (by acid, alkali treatment, etc.) be able to.
As the enzyme preparation, the fraction having the enzyme activity from the above-mentioned processed bacterial cell product is purified by usual enzyme purification means (salting out treatment, isoelectric point precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, dialysis treatment, various chromatographic treatments, etc. A crude enzyme or a purified enzyme obtained by applying ().
[0020]
The yeast cell added to the reaction system may be any yeast that can convert CMP to cytidine 5′-triphosphate (CTP). Among them, a yeast cell can be obtained by using commercially available baker's yeast or wine yeast. The manufacturing process can be omitted, which is extremely advantageous. In addition, any form of dried yeast or live yeast can be used. The use concentration of the yeast cells can be appropriately set from the range of 1 to 5% (w / v) as the dry weight.
Commercially available products can be used as CMP, choline or phosphorylcholine used as a substrate. The use concentration of each substrate can be appropriately set within the range of 1 to 200 mM, preferably 50 to 150 mM.
[0021]
The CDP-choline synthesis reaction is performed by adding yeast cells, CMP, choline (or phosphorylcholine) in an aqueous solution, preferably a phosphate buffer (pH 6.0 to 8.0), and further having an enzyme protein having CCT activity. In addition, 0.01 unit / ml or more, preferably 0.04 to 1.0 unit / ml of enzyme protein having CKI activity (not required when phosphorylcholine is used) is added at 5 to 30 ° C., preferably 20 The reaction can be carried out at about 30 ° C. for about 10 to 72 hours with stirring as necessary.
[0022]
The enzyme reaction is Inorganic phosphoric acid and energy source It is desirable to add it to the reaction system. As the inorganic phosphoric acid to be used, a phosphate such as potassium phosphate may be used as it is, or it may be used in the form of a phosphate buffer. The use concentration of inorganic phosphoric acid can be appropriately selected from the range of 10 to 500 mM, preferably 100 to 300 mM. As an energy source Sugars such as glucose and fructose, or organic acids such as acetic acid and citric acid can be used, and each can be appropriately selected from the range of 10 to 500 mM, preferably 20 to 400 mM.
The CDP-choline thus obtained can be isolated and purified by ordinary isolation and purification means (ion exchange chromatography, adsorption chromatography, salting out, etc.).
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but it is clear that the present invention is not limited thereto. The preparation of DNA, the digestion with restriction enzymes, the DNA ligation with T4 DNA ligase, and the transformation method of Escherichia coli are all described in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition” (Sambrook et al., Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Restriction enzymes, AmpliTaq DNA polymerase, and T4 DNA ligase were obtained from Takara Shuzo.
In the examples, the quantitative determination of CDP-choline in the reaction solution was performed by HPLC. Specifically, a 3013-N column manufactured by Hitachi, Ltd. was used for the separation, and the eluent was solution A; 0.12 mM NH. _Four Cl, 0.2 mM KH ₂ PO _Four 0.2 mM KH ₂ PO _Four 5% (v / v) acetonitrile, solution B; 500 mM NH _Four Cl, 83 mM KH ₂ PO _Four , 83 mM K ₂ HPO _Four Analysis was performed using 5% (v / v) acetonitrile under the conditions of 0 to 50% B solution (0 to 20 minutes linear gradient) and 100% B solution (20 to 25 minutes).
[0024]
Example 1
(1) Preparation of expression plasmid pTrc12-6
After cleaving plasmid vector πAG1 (deposited number of E. coli K-12 strain TNC111 holding plasmid vector πAG1: FERM BP-6901: deposited on September 30, 1999, Biotechnology Institute of Technology) with restriction enzyme EcoRI, The DNA ends were blunted using T4 DNA polymerase and a pBglII linker was added using T4 DNA ligase. The DNA was cleaved with restriction enzymes BglII and BamHI to prepare a 1.8 kb BglII-BamHI fragment containing a kanamycin resistance gene.
Next, pTrc99A DNA is cleaved with the restriction enzyme PvuI, then partially digested with Bal31 nuclease, the β-lactamase gene is deleted, a pBglII linker is added to the DNA ends using T4 DNA ligase, and further cleaved with the restriction enzyme BglII. did. The DNA and the previously prepared DNA fragment containing the kanamycin resistance gene were ligated using T4 DNA ligase, and Escherichia coli JM109 was transformed using the reaction solution.
Plasmid pTrc12-6 was obtained from the obtained kanamycin resistant transformant. In pTrc12-6, the β-lactamase gene of pTrc99A is completely deleted (position 567-1816bp is deleted), and the kanamycin resistance gene derived from Tn903 is inserted at the deletion site.
[0025]
(2) Cloning of CCT gene
Chromosomal DNA of yeast Saccharomyces cerevisiae DBY746 (ATCC 44773) Publicly known It was prepared by the method (Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)). Using this DNA as a template, the following two kinds of primer DNAs were synthesized according to a conventional method, and the yeast CCT gene was amplified by the PCR method.
Primer (A): 5'-TACCATGGCAAACCCAACAAGGGA-3 '
Primer (B): 5'-TATCTAGAGGGGCTCAGTTCGCTGATT-3 '
Amplification of the CTT gene by PCR was performed in 100 μl of a reaction solution (50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 0.2 mM dNTP, temperate DNA 0.5 μg, Primer DNA (A) (B) 0.2 μM each and AmpliTaq DNA polymerase 2.5 units) were heat-denatured (94 ° C., 1 minute), annealed (55 ° C.) using a DNA Thermal Cycler manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instrument. 1.5 minutes) and polymerization (72 ° C., 1.5 minutes) were repeated 25 times.
[0026]
After gene amplification, the reaction solution was treated with a phenol / chloroform (1: 1) mixture, and 2-fold volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA. The DNA collected by precipitation was separated by agarose gel electrophoresis according to the method of the literature (Molecular Cloning, mentioned above), and a DNA fragment corresponding to 1.8 kb was purified. The DNA was cleaved with restriction enzymes NcoI and XbaI and ligated with plasmid pTrc12-6, which was also digested with restriction enzymes NcoI and XbaHI, using T4 DNA ligase. Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution, and the plasmid pTrc12-CCT was isolated from the resulting ampicillin resistant transformant.
pTrc12-CCT is obtained by inserting an NcoI-XbaI DNA fragment containing the yeast CCT gene into the NcoI-XbaHI cleavage site downstream of the trc promoter of pTrc12-6.
[0027]
(3) Cloning of CKI gene
Using the chromosomal DNA of yeast Saccharomyces cerevisiae DBY746 (ATCC 44773) as a temperate, the following two primer DNAs were synthesized according to a conventional method, and the yeast CKI gene was amplified by PCR.
Primer (C): 5'-ATTCTAGAGGAGCAAAAGATGGTACAAGAATCA-3 '
Primer (D): 5'-ATCTGCAGGAATTCGTATACGTATTACA-3 '
Amplification of the CKI gene by PCR was performed in 100 μl of a reaction solution (50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 0.2 mM dNTP, temperate DNA 0.5 μg, Primer DNA (C) (D) 0.2 μM each and AmpliTaq DNA polymerase 2.5 units) were heat-denatured (94 ° C., 1 minute) and annealed (55 ° C.) using a DNA Thermal Cycler manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instrument. 1.5 minutes) and polymerization (72 ° C., 1.5 minutes) were repeated 25 times.
[0028]
After gene amplification, the reaction solution was treated with a phenol / chloroform (1: 1) mixture, and 2-fold volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA. The DNA collected by precipitation was separated by agarose gel electrophoresis according to the method described in the literature (Molecular Cloning, mentioned above), and a DNA fragment corresponding to 2.0 kb was purified. The DNA was cleaved with restriction enzymes XbaI and PstI, and ligated with plasmid pTrc12-6, which was also digested with restriction enzymes XbaI and PstI, using T4 DNA ligase. Escherichia coli JM109 was transformed with the ligation reaction solution, and the plasmid pTrc12-CKI was isolated from the obtained kanamycin resistant transformant.
pTrc12-CKI is obtained by inserting an XbaI-PstI DNA fragment containing a yeast CKI gene into the XbaI-PstI cleavage site downstream of the trc promoter of pTrc12-6.
[0029]
(4) Preparation of CCT and CKI
Plasmid pTrc12-CCT was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI, and an NcoI-XbaI fragment containing the CCT gene was isolated and purified. The fragment was ligated with plasmid pTrc12-CKI DNA cleaved with NcoI and XbaI and T4 DNA ligase, and Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution. Plasmid pTrc-CCK8 was isolated from the resulting kanamycin resistant transformant. pTrc-CCK8 has yeast CCT and CKI genes linked and inserted downstream of the trc promoter of pTrc99A.
Plasmid pTrc-CCK8 was used to transform E. coli K-12 strain ME8417 (FERM BP-6847: deposited on August 18, 1999, Biotechnology Institute of Technology), and 20 μg / 300 ml of 2 × YT medium containing ml of kanamycin was inoculated and cultured at 37 ° C. with shaking. 4x10 ⁸ When the bacteria / ml were reached, IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 0.25 mM, and the shaking culture was continued at 28 ° C. for 20 hours.
[0030]
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (9,000 × g, 10 minutes), suspended in 30 ml of buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA), and then subjected to sonication. Then, the cells were crushed, and the cell residue was removed by centrifugation (20,000 × g, 10 minutes). The supernatant fraction thus obtained was used as an enzyme solution. The CCT activity in the enzyme solution was 0.84 unit / mg protein, and the CKI activity was 0.06 unit / mg protein.
Furthermore, as a result of investigating the process of enzyme production following the time course, after IPTG induction, both CCT and CKI are produced, but the amount is not necessarily high, and the activity of the produced enzyme is gradually lost. One of the causes was estimated to be hydrolysis by protease.
[0031]
In addition, the unit (unit) of various enzymes in this invention is measured and calculated by the method shown below.
(Measurement of CCT activity and unit calculation method)
The enzyme preparation is added to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 5 mM CTP, 5 mM phosphocholine, and 25 mM magnesium chloride, and reacted at 28 ° C. After completion of the reaction, heat treatment is performed at 100 ° C. for 1 minute, and the amount of CDP-choline in the reaction solution is analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The activity for producing 1 μmole of CDP-choline per minute at 28 ° C. is defined as 1 unit.
(Measurement of CKI activity and unit calculation method)
Enzyme preparation was added to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 5 mM CTP, 5 mM choline chloride, 5 mM ATP, 25 mM magnesium chloride, 1 unit / ml CCT, reacted at 28 ° C., and reacted at 100 ° C. The reaction is stopped by heat treatment for 1 minute. The amount of CDP-choline in the reaction solution is quantified by the HPLC method. The activity produced by 1 μmole of CDP-choline per minute at 28 ° C. is defined as 1 unit.
[0032]
(5) Preparation of a DNA fragment (CTR-1) from which a C-terminal 22 amino acid residue equivalent was deleted from a gene encoding yeast CCT
Using the pTrc-CCK8 plasmid constructed and isolated in (4) above as a template, the above primer DNA (A) and the primer DNA (E) shown below were synthesized according to a conventional method, and CTR-1 was amplified by PCR. did.
Primer (E): 5'-TACCATGGCAAACCCAACAACAGGGA-3 '
Amplification of CTR-1 by PCR was performed in 100 μl of a reaction solution (50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 0.2 mM dNTP, temperate DNA 0.1 μg. , Primer DNA (A) (E) 0.2 μM each, AmpliTaq DNA polymerase 2.5 units) using a DNA Thermal Cycler manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instrument, heat denaturation (94 ° C., 1 minute), annealing (55 C., 1.5 minutes) and polymerization (72.degree. C., 3 minutes) were repeated 25 times.
[0033]
After gene amplification, the reaction solution was treated with a phenol / chloroform (1: 1) mixture, and 2-fold volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA. The precipitated and recovered DNA was separated by agarose gel electrophoresis according to the method of the literature (Molecular Cloning, mentioned above), and a DNA fragment corresponding to 1.2 kb was purified. The DNA was cleaved with restriction enzymes NcoI and BamHI, and ligated with plasmid pTrc12-6, which was also digested with restriction enzymes NcoI and BamHI, using T4 DNA ligase. Escherichia coli K-12 strain ME8417 (FERM BP-6847) was transformed using the ligation reaction solution, and the plasmid pTrc-CTR1 was isolated from the obtained kanamycin resistant transformant.
pTrc-CTR1 is obtained by inserting an NcoI-BamHI DNA fragment containing a yeast CCT structural gene lacking the 3 ′ end 66 bp at the NcoI-BamHI cleavage site downstream of the trc promoter of pTrc12-6.
[0034]
(6) Preparation of a DNA fragment (CKF-A) from which the N-terminal 29 amino acid residue equivalent was deleted from the gene encoding yeast CKI
Using the pTrc-CCK8 plasmid constructed and isolated in (4) above as a template, the primer DNA (D) shown above and the primer DNA (F) shown below were synthesized according to a conventional method, and CKF-A was synthesized by PCR. Amplified.
Primer (F): 5'-TGTCTAGATGGTAACACGCCAACGTTCCTC-3 '
Amplification of CKF-A by PCR was performed in 100 μl of reaction solution (50 mM potassium chloride, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 0.2 mM dNTP, temperate DNA 0.1 μg. , Primer DNA (D) (F) 0.2 μM each, AmpliTaq DNA polymerase 2.5 units) using a DNA Thermal Cycler manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instrument, heat denaturation (94 ° C., 1 min), annealing (55 C., 1.5 minutes) and polymerization (72.degree. C., 3 minutes) were repeated 25 times.
[0035]
After gene amplification, the reaction solution was treated with a phenol / chloroform (1: 1) mixture, and 2-fold volume of ethanol was added to the water-soluble fraction to precipitate DNA. The precipitated and recovered DNA was separated by agarose gel electrophoresis according to the method of the literature (Molecular Cloning, mentioned above), and a DNA fragment corresponding to 1.7 kb was purified. The DNA was cleaved with restriction enzymes XbaI and PstI, and ligated with plasmid pTrc12-6, which was also digested with restriction enzymes XbaI and PstI, using T4 DNA ligase. Escherichia coli JM109 was transformed using the ligation reaction solution, and the plasmid pTrcCKF-A was isolated from the obtained kanamycin resistant transformant.
pTrcCKF-A is obtained by inserting an XbaI-PstI DNA fragment containing a structural gene from which the 5 ′ end 87 bp of the yeast CKI gene has been deleted at the XbaI-PstI cleavage site downstream of the trc promoter of pTrc12-6. Note that the N-terminal first and second amino acid groups of the CKF-A protein are methionine and valine (corresponding to serine and leucine in natural CKI).
[0036]
(7) Production of enzyme protein having CCT activity and enzyme protein having CKI activity using CTR-1 and CKF-A
After cutting the pTrcCKF-A plasmid with the restriction enzyme PstI, the cut fragment was blunted using T4 DNA polymerase. Subsequently, the blunted plasmid was digested with restriction enzyme XbaI, and the obtained 1.5 kb DNA fragment containing the CKF-A gene was separated and collected by agarose gel electrophoresis according to the method of the literature (Molecular Cloning, mentioned above). did. Next, the pTrc-CTR1 plasmid was cleaved with the restriction enzyme SalI, and then the cleaved fragment was blunted using T4 DNA polymerase. Subsequently, the DNA fragment was cleaved with the restriction enzyme XbaI, and the DNA fragment and the CKF-A fragment prepared in the example were ligated using T4 DNA ligase. Escherichia coli K-12 strain ME8417 (FERM BP-6847) was transformed using the ligation reaction solution, and plasmid pTrc-FA was isolated from the resulting kanamycin resistant transformant.
The obtained transformant was inoculated into 300 ml of a modified LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1% glucose) containing 20 μg / ml kanamycin, Incubated with shaking. The number of cells per ml of culture broth is 5x10 ⁸ IPTG was added to reach a final concentration of 0.1 mM at the point of time, and the culture was further continued at 24 ° C. for 20 hours.
[0037]
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (9,000 × g, 10 minutes), suspended in 30 ml of a buffer (50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 10 mM magnesium chloride), and then subjected to ultrasound. Treatment was performed, the cells were crushed, and cell residues were removed by centrifugation (20,000 × g, 10 minutes). The supernatant fraction thus obtained was used as an enzyme preparation.
Table 1 shows a comparison of both enzyme activities in the enzyme preparation thus prepared and the enzyme activity of the enzyme solution obtained in the above (4) prepared using the gene before the conventional C-terminal or N-terminal deletion. Shown in As is apparent from Table 1, the productivity in E. coli is about 1.4 times higher than that of native yeast CCT by using the above-mentioned specific DNA fragment lacking C-terminal or N-terminal. Was confirmed to be a factor that can maintain the activity of the produced enzyme protein at a high level as the expression level increases and the provision of protease resistance is confirmed. .
[0038]
[Table 1]

[0039]
(8) Synthesis of CDP-choline (Part 1)
To 4.9 ml of a reaction solution containing 200 mM potassium phosphate (pH 8.0), 75 mM CMP, 25 mM magnesium chloride, 75 mM choline chloride, 0.2 M glucose, 2% (w / v) dry baker's yeast (Oriental Yeast) Then, 0.1 ml of the enzyme solution prepared in the above (7) was added (CCT activity: 0.38 unit / ml, CKI activity: 0.40 unit / ml), aerated and stirred in a test tube at 28 ° C. Incubated for 46 hours. Glucose was added to a final concentration of 0.2 M at 7, 23 and 32 hours after the start of the reaction. After 46 hours of reaction, 68 mM CDP-choline was synthesized (vs. CMP molar yield: 90.7%).
For comparison, the reaction was carried out under the same conditions except that 0.1 ml of the enzyme solution prepared in (4) was added, but the synthesis of CDP-choline was slight.
[0040]
Example 2 Synthesis of CDP-choline (Part 2)
4.9 ml of reaction solution containing 200 mM potassium phosphate (pH 8.0), 125 mM CMP, 25 mM magnesium chloride, 110 mM phosphorylcholine, 0.2 M glucose, 3.0% (w / v) dry baker's yeast (Oriental Yeast) Then, 0.1 ml of the enzyme solution prepared in (7) of Example 1 was added (CCT activity: 0.38 unit / ml), aerated and stirred in a test tube, and kept at 25 ° C. for 48 hours. Glucose was added to a final concentration of 0.2 M at 7, 23 and 32 hours after the start of the reaction. After 48 hours of reaction, 102 mM CDP-choline was synthesized (vs. CMP molar yield: 81.6%).
[0041]
Example 3 Synthesis of CDP-choline (Part 3)
In the same manner as in (7) of Example 1, 20 ml of the prepared recombinant Escherichia coli culture was collected by centrifugation (9,000 × g, 10 minutes), and stored at −5 ° C. overnight. The suspension was suspended in 2.3 ml of a buffer [50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 10 mM magnesium chloride].
Next, a reaction solution containing 200 mM potassium phosphate (pH 8.0), 125 mM CMP, 25 mM magnesium chloride, 130 mM phosphorylcholine, 0.4 M glucose, 3.0% (w / v) dry baker's yeast (Oriental Yeast Co., Ltd.) To 4.875 ml, 0.125 ml of the prepared bacterial suspension was added, 0.025 ml of xylene was further added, and the mixture was aerated and stirred in a test tube, and kept at 24 ° C. for 40 hours. Glucose was added to a final concentration of 0.2 M 16 and 24 hours after the start of the reaction. After 40 hours of reaction, 107 mM CDP-choline was synthesized (vs. CMP molar yield: 85.6%).
[0042]
Example 4 Synthesis of CDP-choline (Part 4)
Into 1500 ml of a reaction solution containing 200 mM potassium phosphate (pH 8.0), 75 mM CMP, 25 mM magnesium chloride, 80 mM phosphorylcholine, 0.2 M glucose, 2% (w / v) dry baker's yeast (Oriental Yeast) 12.5 ml of the enzyme solution prepared in (7) of 1 was added (CCT activity: 0.38 unit / ml) and aerated with a 3 L tabletop jar fermenter (0.5 L / min, 300 rpm) at 24 ° C. For 48 hours. Seven hours after the start of the reaction, 12.5 ml of glucose and enzyme solution were added to a final concentration of 0.2M. Further, glucose was added to a final concentration of 0.2 M after 24 and 32 hours of reaction.
After 48 hours of reaction, 67.5 mM CDP-choline was synthesized (vs. CMP molar yield 90.0%).
[0043]
【The invention's effect】
The method of the present invention can stably produce a target enzyme protein by using a specific DNA fragment in which a plurality of N-terminal or C-terminal amino acids are deleted. It is a highly practical method that can efficiently synthesize CDP-choline in a short time by using the enzyme protein obtained in the system.
Specifically, by using the specific DNA fragment of the present invention, the productivity of enzyme protein in E. coli is improved by about 1.4 times or more for CCT and about 20 times or more for CKI, so that CDP-choline Synthesis can also be improved dramatically.
[0044]
[Sequence Listing]

[0045]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a base sequence containing structural genes of CCT and CKI derived from yeast. In the figure, the sequence indicated by nucleotide numbers 1-1208 is the CCT structural gene, and the sequence indicated by the 1223-2881 is the CKI structural gene.
[0046]
[Consignment certificate]

Claims

The enzyme protein having choline phosphate cytidyl transferase (CCT) activity encoded by the base sequence of any of the DNA fragments described in (a) to (c) below, and (d) to (f) A yeast cell, cytidine 5′-monophosphate (CMP), and choline are reacted in the presence of two types of enzyme proteins having the choline kinase (CKI) activity encoded by the base sequence of any DNA fragment. And producing cytidine 5′-diphosphate choline (CDP-choline).
(A) DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a DNA fragment consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(C) a DNA fragment that hybridizes under stringent conditions to the DNA fragment described in (a ) above ,
(D) a DNA fragment comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(E) a DNA fragment consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(F) a DNA fragment that hybridizes to the DNA fragment according to (d ) above under stringent conditions

Production of CDP-choline by reacting yeast cells, CMP and phosphorylcholine in the presence of an enzyme protein having CCT activity encoded by the base sequence of any of the DNA fragments described in (a) to (c) below A process for producing CDP-choline, characterized by:
(A) DNA fragment consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a DNA fragment consisting of a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(C) a DNA fragment that hybridizes under stringent conditions to the DNA fragment described in (a ) above

A DNA fragment comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding an enzyme protein having CCT activity.

A DNA fragment comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and encoding an enzyme protein having CCT activity.

A DNA fragment that hybridizes with the DNA fragment according to claim 3 under stringent conditions and encodes an enzyme protein having CCT activity.

A DNA fragment consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and encoding an enzyme protein having CKI activity.

A DNA fragment encoding an enzyme protein having CKI activity, comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A DNA fragment that hybridizes with the DNA fragment according to claim 6 under stringent conditions and encodes an enzyme protein having CKI activity.