JP3820607B2

JP3820607B2 - Antithrombin-III liquid preparation and storage stabilization method thereof

Info

Publication number: JP3820607B2
Application number: JP29316095A
Authority: JP
Inventors: 勝寛瓜生; 常隆中島; 隆結城
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1995-11-10
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2015-11-10
Also published as: JPH09132534A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、長期保存において安定で、かつ投与しても血圧の低下や心臓障害の生じることがほとんどないアンチトロンビン−III の液状製剤およびアンチトロンビン−III 液状製剤の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンチトロンビン−III （以下、ＡＴ−III という。）は血漿中に存在するα₂グロブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５０００〜６８０００である。ＡＴ−III はプロテアーゼ阻害活性を有しており、トロンビンの凝固活性に対する強い阻害作用、およびその他の血液凝固因子、活性化Ｘ因子、活性化IX因子などに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミンやトリプシンに対する阻害作用があることも報告されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速やかに進行することが知られている。
【０００３】
このような薬理作用を有するＡＴ−III は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症（ＤＩＣ）の治療を目的として用いられるものである。ところで、ＡＴ−III は溶解状態では安定性が悪く、重合化により静注投与における副作用の原因ともなることから、これまで凍結乾燥の態様で製剤化されていた。
一方、液状製剤は、乾燥製剤に比べると使用時における注射用蒸留水への溶解の必要もなく簡便に投与でき、また製造工程で凍結乾燥操作を必要とせず製造上経済的であるなどの利点があるが、上記の如く、ＡＴ−III は溶液状態では安定性に劣ることからＡＴ−III 液状製剤の実用化は遅れていた。僅かに試薬の分野で、ＡＴ−III をヘパリンの共存下、溶液状態で４℃７日間保存可能であったことを確認したにすぎない（特開昭５５−１０３４６３号）。
【０００４】
このような問題を解決する製剤として、ＷＯ９４／２２４７１に、安定化剤としてクエン酸もしくはその塩を含有するＡＴ−III 液状製剤が開示されている。このＡＴ−III 液状製剤は、加熱処理時および長期保存時におけるＡＴ−III の活性の低下および重合化が防止され、安定性が良好である。
しかし、上記ＡＴ−III 液状製剤はクエン酸もしくはその塩を含有しているため、この液状製剤を投与すると血圧の低下や心臓障害が生じるという問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＡＴ−III の溶液状態での安定性を改善し、長期保存が可能で、特に４℃から室温での長期保存において安定であり、かつ投与しても血圧の低下や心臓障害が生じることがほとんどなく、さらには投与の簡易なＡＴ−III 液状製剤およびその保存安定化方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前述の如き従来技術における問題を解消するため本発明者らは、溶液状態でのＡＴ−III の安定化および心臓障害の低減について広範な検討を試みてきたところ、安定化剤としてグルコン酸もしくはその塩を配合することにより、ＡＴ−III の溶液状態での安定性が良好で長期保存においてもＡＴ−III が安定であり、かつこのように調製したＡＴ−III 液状製剤を投与しても血圧の低下や心臓障害を生じることがほとんどないことを見出した。そしてこのＡＴ−III 液状製剤は、臨床面でも薬理効果および安全性において何ら問題のないことを見出し本発明を完成したものである。
【０００７】
すなわち本発明は、アンチトロンビン−III 、およびグルコン酸もしくはその塩とを含有することを特徴とするアンチトロンビン−III の液状製剤に関する。また、本発明は、アンチトロンビン−III 液状製剤に安定化剤としてグルコン酸もしくはその塩を添加することを特徴とするアンチトロンビン−III 液状製剤の保存安定化方法に関する。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ＡＴ−III について
本発明で使用されるＡＴ−III は、ヒト由来のもので医薬として使用できる程度に精製されたものであれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾された血清などから精製することができる。使用される血液としては、特にＨＢｓ抗原、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体に対して陰性であり、ＧＴＰが正常値の２倍以下であるものが好ましい。
血液，血漿からのＡＴ−III の精製法としては、例えば特開昭４８−３５０１７号公報（米国特許３８４２０６１号）、特公昭５９−７６９３号公報（米国特許４３４０５８９号）、特開平１−２７５６００号公報（ＥＰ３３９９１９）、ＥＰ５５１０８４に開示の方法等が例示される。
例えば、血漿からクリオプリシピテートを除去した上清の低温エタノール画分IV−１、画分IVまたは画分II＋III を、更にヘパリンアフィニティークロマトグラフィーなどの操作を経て精製する方法などが挙げられる。
また、細胞培養法〔例えば、特表昭５７−５００７６８号公報（ＥＰ５３１６５）参照〕、遺伝子工学法〔例えば、特開昭５８−１６２５２９号公報（ＥＰ９０５０５）参照〕などにより調製されるＡＴ−III も使用できる。
【０００９】
（II）ＡＴ−III の液状製剤
本発明のＡＴ−III 液状製剤は、ＡＴ−III 、およびグルコン酸もしくはその塩とを含有する液状製剤である。
本発明のＡＴ−III 液状製剤は、ＡＴ−III を通常１０〜５００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割合で含有するものである。本明細書においてＡＴ−III １単位とは、正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III 量に相当するＡＴ−III の量をいう。
【００１０】
グルコン酸は塩の態様をしていてもよく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示される。好ましくはナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩であり、特に好ましくはカルシウム塩、ナトリウム塩である。
【００１１】
グルコン酸もしくはその塩は、上記液状製剤中、好ましくは０．５〜３．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．５〜２．０ｗ／ｖ％、特に好ましくは１．０〜１．５ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この添加量が０．５ｗ／ｖ％未満の場合、ＡＴ−III の安定化効果が不十分であり、逆に添加量が３．０ｗ／ｖ％を超える場合、クエン酸ナトリウムとのキレート作用により、沈殿物を生じたり、ＡＴ−III の安定化効果が低下して好ましくない。
【００１２】
本発明の液状製剤は、さらにグルコン酸以外の有機酸を含有していてもよい。本明細書において有機酸とは、分子内に少なくとも１個、好ましくは１〜３個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する化合物をいう。一塩基酸、二塩基酸、三塩基酸とは、それぞれカルボキシル基を１、２または３個有する化合物をいう。
【００１３】
本発明で使用されるグルコン酸以外の有機酸は、脂肪族または芳香族、飽和または不飽和、一塩基酸（モノカルボン酸）、二塩基酸（ジカルボン酸）または三塩基酸（トリカルボン酸）のいずれでもよい。好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは炭素数２〜６のものが挙げられる。一塩基酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの飽和脂肪族モノカルボン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの一塩基酸のアミノ酸が例示される。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などの飽和脂肪族ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和脂肪族ジカルボン酸、フタル酸などの芳香族ジカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸などの二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、酒石酸などの二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩基酸としては、クエン酸などの三塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、アスパラギン酸、クエン酸であり、より好ましくはリンゴ酸、クエン酸である。
【００１４】
さらに、かかる有機酸は塩の態様をしていてもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示される。好ましくは、ナトリウム塩またはカルシウム塩である。本発明で使用される有機酸塩として、より好ましくはリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムであり、特に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
【００１５】
有機酸もしくはその塩は、上記液状製剤中、好ましくは２〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは２〜１０ｗ／ｖ％、特に好ましくは３〜５ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この添加量が２ｗ／ｖ％未満の場合、ＡＴ−III の安定化効果が低下し、逆に添加量が２０ｗ／ｖ％を超える場合、ＡＴ−III の安定化効果は良好となるが、浸透圧比が高くなり毒性による血圧の低下をきたすので好ましくない。特に有機酸がクエン酸である場合、得られる製剤を投与すると血圧の低下や心臓障害が生じる。
【００１６】
本発明の液状製剤には、さらに補助安定化剤として糖を添加してもよい。糖の添加により、有機酸の添加量を低くし、ＡＴ−III 活性の失活の原因となる二峰性を防ぐことができる。本発明で使用される糖としては、例えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げられる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マルトース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミノ糖としては、グルコサミンおよびアミノ糖誘導体であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが例示される。好ましくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、マルトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンニトールである。
【００１７】
糖は、上記製剤中、好ましくは０．１〜４０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．５〜２０ｗ／ｖ％、特に好ましくは５〜１０ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この添加量が０．１ｗ／ｖ％未満の場合、ＡＴ−III の安定化効果が低下し、逆に添加量が４０ｗ／ｖ％を超える場合、ＡＴ−III の安定化効果は良好となるが、浸透圧比が高くなり粘性が増すので好ましくない。
【００１８】
また本発明の液状製剤には、補助安定化剤として界面活性剤をさらに添加してもよい。界面活性剤の添加により、保存中の不溶性異物の発生を防止することができる。界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤が好ましく、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば商品名：トウィーン）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（例えば商品名：プルロニック）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば商品名：トリトン）等が例示される。これらの界面活性剤の分子量は２，０００〜２０，０００が好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの脂肪酸としては、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸等の炭素数１２〜１８の脂肪酸が挙げられる。
【００１９】
界面活性剤は、上記製剤中、好ましくは０．００５〜０．１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％、特に好ましくは０．０１〜０．０３ｗ／ｖ％の範囲となるように添加される。この添加量が０．００５ｗ／ｖ％未満の場合、ＡＴ−III の安定化効果が低下し、また振盪すると蛋白の変性による不溶性異物が出現し、逆に添加量が０．１ｗ／ｖ％を超える場合、毒性による血圧の低下をきたすので好ましくない。
【００２０】
また、本発明の液状製剤には、さらにその他の安定化剤を添加することもできる。例えば、無機塩、アルブミン、アプロチニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩などが挙げられる。無機塩としては特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム等が例示される。
【００２１】
また本発明の液状製剤には、本発明の目的に反しない限り、通常液状製剤に用いられる添加剤、例えば等張化剤（ソルビトール、マンニトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルコース、塩化ナトリウム等）、防腐殺菌剤（塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキセノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等）、キレート剤（エデト酸ナトリウム、縮合リン酸ナトリウム等）、粘稠剤（ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム等）等を通常使用される添加量で配合することができる。
【００２２】
本発明のＡＴ−III 液状製剤は、さらに糖硫酸エステルを添加することもできる。糖硫酸エステルとしては、ヘパリン、デキストラン硫酸等が例示され、好ましくはヘパリンである。ヘパリンの含有量は、液状製剤中、好ましくは１〜１０００単位／ｍｌ、より好ましくは１０〜１００単位／ｍｌである。またＡＴ−III に対する割合は、ＡＴ−III １単位当たり好ましくは０．１〜１００単位、より好ましくは１〜５単位が例示される。
【００２３】
本発明の液状製剤は、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ７．０〜９．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜８．０であり、この範囲において安定であり、就中ｐＨ７．０〜７．８においては長期保存に安定である。またｐＨ７．０〜８．０の製剤は、注射時の疼痛が緩和されるので、注射剤として使用するのに適している。
【００２４】
ｐＨの調整は通常の方法で行うことができ、例えば調整剤として水酸化物または適当な緩衝液などを用いて行ってもよい。水酸化物としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が例示される。緩衝液としてはリン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。
【００２５】
本発明の液状製剤には、本発明の目的に反しない限りＡＴ−III 以外の薬効成分を配合することができる。例えば血漿分画製剤（トロンビン、ヘパリンコファクター、フィブリノゲン）等が例示される。
【００２６】
本発明の液状製剤の態様としては、ＡＴ−III が他の成分と共に水中に溶解された態様であれば特に制限されるものではなく、例えば注射剤、点滴剤などの態様のものが例示される。溶解させる水としては、例えば注射用蒸留水、滅菌精製水等が例示される。
【００２７】
本発明の液状製剤は、液剤の種類に応じ、自体既知の手段を用いて調製することができる。また所望により加熱処理、除菌濾過などの処理を施すことができる。
【００２８】
このようにして調製された本発明液状製剤は、通常４℃〜室温において長期保存が可能である。通常１５℃以下で少なくとも２４ヵ月間、室温で少なくとも６ヵ月間の保存が可能であり、製剤調製時におけるＡＴ−III 活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％以上保持する。
【００２９】
本発明の液状製剤は、先天性ＡＴ−III 欠乏に起因する血栓形成傾向およびＡＴ−III 低下を伴う汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療に有用である。
本剤の投与方法は、従来のＡＴ−III 注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることができ、例えば、本発明液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する方法が挙げられる。
通常、本発明液状製剤は１日１，０００〜３，０００単位（又２０〜６０単位／kg）の割合で投与されるが、かかる投与量は年齢、体重、症状などにより適宜増減してもよい。なお、産科的、外科的ＤＩＣなどで緊急処置として本剤を使用する場合は、１日１回４０〜６０単位／ｋｇを投与することが好ましい。
本発明の液状製剤の浸透圧は、ヒトおよび動物の生理的条件と同じかもしくはそれに近いことが好ましい。
【００３０】
【実施例】
次に、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでない。
実施例１
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム３００ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３１】
実施例２
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、クエン酸ナトリウム３００ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３２】
実施例３
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸ナトリウム１５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５００ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３３】
実施例４
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、リンゴ酸ナトリウム３００ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３４】
実施例５
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、サッカロース２０００ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３５】
実施例６
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ−６８）１ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３６】
実施例７
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、サッカロース２０００ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ−６８）１ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３７】
実施例８
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１００ｍｇ、クエン酸ナトリウム３００ｍｇ、サッカロース２０００ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ−６８）１ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３８】
実施例９
ＡＴ−III ５００単位、グルコン酸カルシウム１５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５００ｍｇ、サッカロース１０００ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ−６８）１ｍｇ、ヘパリン５０００単位を注射用水１０ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III 液状製剤とした。
【００３９】
以下の実験例において、本発明のＡＴ−III 液状製剤中のＡＴ−III の安定性を調べた。
なお、ＡＴ−III の安定性は、残存するＡＴ−III 活性および／またはＡＴ−III の重合化の割合から評価した。なお、以下に述べるように、ＡＴ−III 活性はＡＴ−III 活性測定キット（テストチームＡＴ−III ・２キット：第一化学薬品製）を用いて測定し、ＡＴ−III の重合化の割合はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析によって測定した。
【００４０】
（１）ＡＴ−III 活性の測定
検体希釈液５０μｌ〔２．４Ｕ／ｍｌヘパリン，４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，０．１４ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．４）中〕をチューブに採り、ヒトトロンビン溶液〔０．９％塩化ナトリウム、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．０５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６０００中、１Ｕ／ｍｌトロンビン含有）１００μｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした後、合成基質液（Ｓ−２２３８：ＨＤ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩）１００μｌを加え、さらに３７℃で５分間インキュベートした。発色後、クエン酸溶液を１ｍｌ加えて反応を停止させ、分光光度計で波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿（１ＵＡＴ−III ／ｍｌ）を測定し、その検量線から検体のＡＴ−III 含量を測定した。
【００４１】
（２）ＨＰＬＣ分析
Ｇ３，０００ＳＷ_XLカラム（東ソー社製）を０．３ＭＮａＣｌ加０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した後、流速０．７ｍｌ／分で測定を行った。
【００４２】
実験例１
ＡＴ−III （乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）濃縮バルク液（ＡＴ−III 力価：５０Ｕ／ｍｌ）を２％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で一夜透析した後、表１に示す各種安定化剤を添加し、除菌濾過後、６０℃で１時間または５５℃で１０時間加熱処理を行い、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】

【００４４】
クエン酸の添加量を減らし、グルコン酸ナトリウムを安定化剤の１つとして添加した製剤は対照と同等の安定化効果を示した。
【００４５】
実験例２
ＡＴ−III （乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）濃縮バルク液（ＡＴ−III 力価：５０Ｕ／ｍｌ）を２％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で一夜透析した後、表２に示す安定化剤を添加し、除菌濾過後、５５℃で１０時間または６０℃で３０分間加熱処理を行い、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】

【００４７】
有機酸としてグルコン酸カルシウムのみを用いた例は、有機酸としてクエン酸ナトリウムのみを用いた例と同等の安定化効果を示し、有機酸としてグルコン酸カルシウムとクエン酸ナトリウムを併用した例は、有機酸としてクエン酸ナトリウムのみを用いた例よりも良好な安定化効果を示した。
【００４８】
実験例３
ＡＴ−III （乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）濃縮バルク液（ＡＴ−III 力価：５０Ｕ／ｍｌ）を２％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で一夜透析した後、表３に示す安定剤を添加し、除菌濾過後、５５℃で１０時間加熱処理を行い、１時間、３時間、５時間および１０時間のＡＴ−III 活性の残存率の測定およびＨＰＬＣ分析を行った。結果を表３、図１および図２に示す。
【００４９】
【表３】

【００５０】
3.0w/v%Cit-Na, 20w/v%Sacc., 1.0w/v%Gluc-Ca, 0.01w/v%P.F.-68 pH7.5の組成の安定化剤を使用した製剤が安定化効果が最も良好であることがわかった。
【００５１】
実験例４
ＡＴ−III （乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）濃縮バルク液（ＡＴ−III 力価：５０Ｕ／ｍｌ）を２％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で一夜透析した後、表４に示す安定剤を添加し、除菌濾過後、１１℃で３、６、１２、１５、１８、２２ヵ月後のＡＴ−III 活性の残存率の測定およびＨＰＬＣ分析を行った。結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】

【００５３】
表４より、 3w/v%Gluc-Ca, 20w/v%Sacc., 0.01w/v%P.F.-68 pH7.5 の組成、 3w/v%Cit-Na, 20w/v%Sacc., 1w/v%Gluc-Ca, 0.01w/v%P.F.-68 pH7.5の組成、および 5w/v%Cit-Na, 10w/v%Sacc., 1w/v%Gluc-Ca, 0.01w/v%P.F.-68 pH7.5の組成の液状製剤はいずれも２２ヵ月でも安定性が良好であることがわかった。
【００５４】
表１〜４および図１〜２中、Cit-Naはクエン酸ナトリウム、Sacc. はサッカロース、P.F.-68 はプルロニックＰＦ−６８、 Lact.はラクトース、 Dext.はデキストロース、 Sorb.はソルビトール、Gly.はグリシン、 Mann.はマンニトール、 Malt.はマルトース、 Inos.はイノシトール、lys はリジン、Arg はアルギニン、Phe はフェニルアラニン、Gluc-Na はグルコン酸ナトリウム、Ala はアラニン、Sali-Na はサリチル酸ナトリウム、Gluc-Ca はグルコン酸カルシウム、Glu-Naはグルタミン酸ナトリウムを示す。
【００５５】
実験例５
ＡＴ−III 液状製剤の犬に対する呼吸・循環器系に及ぼす影響を調べた。
なお、試験にはイヌ（雑種、雄性、体重９．０〜１１．０ｋｇ、予備飼育期間１週間以上）を７頭使用し、温度１９±２℃、湿度６５±１０％の条件で飼育した。この雄性雑犬を１群３頭使用し、ペントバルビタール−Ｎａ塩の静脈内投与（２５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し後背位に固定した。呼吸、血圧、心拍数、血流量および心電図を測定し、平均値±標準偏差を求めた。呼吸は気管にチューブ（商品名トラキロン、テルモ製）にサーミスター型呼吸センサー（日本光電製、ＴＲ−６１２Ｔ）を介し、血圧は大腿動脈にカテーテルを挿入しディスポ血圧トランスデュサー（日本光電製、ＤＸ−３６０）および圧ランプ（日本光電製、ＡＰ−６４１Ｇ）を介して、心拍数は脈圧をトリガーして心拍計（日本光電製、ＡＴ−６０１Ｇ）を介して、血流量は大腿動脈に血流量測定用プローブを装着し電磁流量計（日本光電製、ＭＦＶ−３１００）を介して、いずれもポリグラフ（日本光電製、ＲＭ−６０００）に連結し同時記録した。心電図（ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、Ｔ、Ｓ−Ｔ）は標準四肢第II誘導にて心電計（日本光電製、ＥＣＧ−８１１０）上に記録した。被検薬剤として、ＡＴ−III （５０Ｕ／ｍｌ）、３ｗ／ｖ％グルコン酸カルシウム、２０．０ｗ／ｖ％サッカロースおよび０．０１ｗ／ｖ％プルロニックＰＦ−６８からなるｐＨ７．５のＡＴ−III 液状製剤（Ａ）、ＡＴ−III （５０Ｕ／ｍｌ）、３ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム、２０．０ｗ／ｖ％サッカロースおよび０．０１ｗ／ｖ％プルロニックＰＦ−６８からなるｐＨ７．５のＡＴ−III 液状製剤（Ｂ）、およびＡＴ−III （５０Ｕ／ｍｌ）、３ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム、２０．０ｗ／ｖ％サッカロース、１．０ｗ／ｖ％、グルコン酸カルシウムおよび０．０１ｗ／ｖ％プルロニックＰＦ−６８からなるｐＨ７．５のＡＴ−III 液状製剤（Ｃ）を使用し、その投与量は０．６ｍｌ／ｋｇとし、大腿静脈内に留置したカテーテルを介してマルチホルダー付シリンジポンプ（Ｈａｒｖｅｒｄ２２−Ｍ）を用い、投与速度０．２５ｍｌ／ｋｇ／ｍｉｎとした。なお、観察時間は投与前、投与中間、投与後１分、５分、１５分および３０分とした。その結果を表５〜表７に示す。
【００５６】
【表５】

【００５７】
【表６】

【００５８】
【表７】

【００５９】
表５〜７より、液状製剤（Ｂ）においては、血圧が低下し、心電図に変化が認められたが、液状製剤（Ａ）においては、液状製剤（Ｂ）に比べて血圧の低下および心電図の変化はかなり抑えられ、液状製剤（Ｃ）においては、血圧の低下および心電図の変化はほとんど認められなかった。
【００６０】
参考例
コーンの冷エタノール分画法で得られた画分IV−１のペースト１０ｋｇを生理食塩水１００リットルに懸濁し、硫酸バリウムを５ｗ／ｖ％になるように加え、室温で３０分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５に調整し、ポリエチレングリコール＃４，０００を１３ｗ／ｖ％となるように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチレングリコール＃４，０００を３０ｗ／ｖ％になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷生理食塩水約２０リットルに溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロースのカラムに注入し、ＡＴ−III をカラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる部分を回収した。
このＡＴ−III の水溶液にクエン酸ナトリウムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７．８に調整した後、６０℃で１０時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム（最終濃度３Ｍ）およびクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）を添加し、ｐＨ７．５に調整した。一方、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチルトヨパール６５０、東洋曹達（株）製）にＡＴ−III 含有水溶液を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回収した。続いて０．５％クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して一夜透析を行い精製ＡＴ−III を得た。
【００６１】
【発明の効果】
ＡＴ−III と安定化剤（グルコン酸もしくはその塩、糖硫酸エステルまたは界面活性剤）を配合してなる本発明のＡＴ−III 液状製剤によれば、加熱処理時および長期保存時におけるＡＴ−III 活性の低下、重合化を防止することができ、かつ投与しても血圧の低下や心臓障害が生じることがほとんどない。このため、本発明の液状製剤はそのまま商品（注射剤など）として提供することができる。従って、使用に際して用時溶解することなく、そのまま注射剤等として患者に投与することができるため、投与時の操作が簡略化でき臨床使用上有用である。また製造工程において、凍結乾燥工程を省くことができるため、製造の効率化、および経済化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例３のＡＴ−III 活性残存率のタイムコースを示すグラフである。
【図２】実験例３のＨＰＬＣ分析のタイムコースを示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a liquid preparation of antithrombin-III that is stable in long-term storage and hardly causes a decrease in blood pressure or heart damage even when administered, and a method for stabilizing an antithrombin-III liquid preparation.
[0002]
[Prior art]
Antithrombin-III (hereinafter referred to as AT-III) is α present in plasma. ₂ It is a kind of glycoprotein belonging to globulin, and its molecular weight is 65000-68000. AT-III has protease inhibitory activity, has a strong inhibitory effect on the coagulation activity of thrombin, and also has an inhibitory effect on other blood coagulation factors, activated factor X, activated factor IX and the like. In addition, it has been reported that it has an inhibitory effect on plasmin and trypsin. These inhibitory actions are generally known to proceed more rapidly in the presence of heparin.
[0003]
AT-III having such a pharmacological action is used for the purpose of correcting hypercoagulability hypersensitivity, specifically for treating generalized vascular abnormalities (DIC). By the way, AT-III is not stable in a dissolved state and causes side effects in intravenous administration due to polymerization, so that it has been formulated in a lyophilized form until now.
On the other hand, liquid preparations can be easily administered without the need for dissolution in distilled water for injection when used compared to dry preparations, and are advantageous in that they are economical in production without the need for freeze-drying operations in the production process. However, as described above, AT-III is inferior in stability in a solution state, so that the practical use of AT-III liquid preparations has been delayed. In the reagent field, it was only confirmed that AT-III could be stored in solution in the presence of heparin at 4 ° C. for 7 days (Japanese Patent Laid-Open No. 55-103463).
[0004]
As a preparation for solving such problems, WO94 / 22471 discloses an AT-III liquid preparation containing citric acid or a salt thereof as a stabilizer. This AT-III liquid preparation has good stability because it prevents the AT-III activity from decreasing and polymerizing during heat treatment and long-term storage.
However, since the AT-III liquid preparation contains citric acid or a salt thereof, there is a problem that administration of this liquid preparation causes a decrease in blood pressure and heart damage.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to improve the stability of AT-III in a solution state, and can be stored for a long period of time, and is particularly stable for a long period of storage from 4 ° C. to room temperature. An object of the present invention is to provide an AT-III liquid preparation which is hardly disturbed and can be easily administered, and a method for stabilizing its storage.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the problems in the prior art as described above, the present inventors have made extensive studies on the stabilization of AT-III in a solution state and the reduction of heart damage. By adding a salt, the stability of AT-III in a solution state is good, and AT-III is stable even in long-term storage. Even when the prepared AT-III liquid preparation is administered, the blood pressure is reduced. It was found that there was almost no decline or heart damage. And this AT-III liquid preparation has found that there is no problem in pharmacological effect and safety in clinical aspect, and has completed the present invention.
[0007]
That is, the present invention relates to a liquid preparation of antithrombin-III characterized by containing antithrombin-III and gluconic acid or a salt thereof. The present invention also relates to a method for stabilizing and stabilizing an antithrombin-III liquid preparation, which comprises adding gluconic acid or a salt thereof as a stabilizer to the antithrombin-III liquid preparation.
[0008]
The present invention is described in detail below.
(I) About AT-III
AT-III used in the present invention is not particularly limited as long as it is human-derived and purified to the extent that it can be used as a medicine. For example, human whole blood, plasma, serum or coagulated blood is used. It can be purified from squeezed serum. The blood to be used is particularly preferably one that is negative for HBs antigen, anti-HIV antibody, anti-ATLV antibody, and anti-HCV antibody and has GTP less than twice the normal value.
Examples of methods for purifying AT-III from blood and plasma include, for example, JP-A-48-35017 (US Pat. No. 3,842,061), JP-B-59-7693 (US Pat. No. 4,340,589), and JP-A-1-275600. The method etc. which are indicated by gazette (EP339919) and EP551084 are illustrated.
For example, a method of purifying the low-temperature ethanol fraction IV-1, fraction IV or fraction II + III of the supernatant from which cryopricipitate has been removed from plasma through further operations such as heparin affinity chromatography, and the like.
In addition, AT-III prepared by a cell culture method (for example, see JP-T-57-5000076 (EP53165)), a genetic engineering method (for example, see JP-A-58-162529 (EP90505)), etc. Can be used.
[0009]
(II) Liquid preparation of AT-III
The AT-III liquid preparation of the present invention is a liquid preparation containing AT-III and gluconic acid or a salt thereof.
The AT-III liquid preparation of the present invention contains AT-III usually at a rate of 10 to 500 units / ml, preferably 1 to 200 units / ml, more preferably 25 to 100 units / ml. In this specification, 1 unit of AT-III refers to the amount of AT-III corresponding to the amount of AT-III contained in 1 ml of normal human plasma.
[0010]
Gluconic acid may be in the form of a salt, and examples thereof include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and organic salts such as ammonium salt. . Preferred are alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, and particularly preferred are calcium salt and sodium salt.
[0011]
Gluconic acid or a salt thereof is preferably 0.5 to 3.0 w / v%, more preferably 0.5 to 2.0 w / v%, particularly preferably 1.0 to 1.5 w / v in the liquid preparation. It adds so that it may become the range of v%. When this addition amount is less than 0.5 w / v%, the stabilizing effect of AT-III is insufficient, and conversely, when the addition amount exceeds 3.0 w / v%, it is caused by chelating action with sodium citrate. This is not preferable because a precipitate is formed or the stabilizing effect of AT-III is lowered.
[0012]
The liquid preparation of the present invention may further contain an organic acid other than gluconic acid. In this specification, an organic acid refers to a compound having at least one, preferably 1 to 3 carboxyl groups (—COOH) in the molecule. Monobasic acid, dibasic acid, and tribasic acid refer to compounds having 1, 2 or 3 carboxyl groups, respectively.
[0013]
Organic acids other than gluconic acid used in the present invention are aliphatic or aromatic, saturated or unsaturated, monobasic acid (monocarboxylic acid), dibasic acid (dicarboxylic acid) or tribasic acid (tricarboxylic acid). Either is acceptable. Preferably those having 2 to 10 carbon atoms, more preferably those having 2 to 6 carbon atoms. Examples of the monobasic acid include saturated aliphatic monocarboxylic acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, and valeric acid, and monobasic amino acids such as glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine. Dibasic acids include saturated aliphatic dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, and adipic acid, unsaturated aliphatic dicarboxylic acids such as maleic acid and fumaric acid, and aromatic dicarboxylic acids such as phthalic acid. And amino acids of dibasic acids such as aspartic acid and glutamic acid, and hydroxy acids of dibasic acids such as malic acid and tartaric acid. Examples of the tribasic acid include hydroxy acids of tribasic acids such as citric acid. Preferred are malic acid, tartaric acid, maleic acid, aspartic acid, and citric acid, and more preferred are malic acid and citric acid.
[0014]
Furthermore, the organic acid may be in the form of a salt. Examples of the salt of the organic acid include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt, and organic salts such as ammonium salt. A sodium salt or a calcium salt is preferable. The organic acid salt used in the present invention is more preferably sodium malate or sodium citrate, and particularly preferably sodium citrate.
[0015]
The organic acid or a salt thereof is added in the liquid preparation so as to be in the range of preferably 2 to 20 w / v%, more preferably 2 to 10 w / v%, particularly preferably 3 to 5 w / v%. When this addition amount is less than 2 w / v%, the stabilization effect of AT-III decreases, and conversely, when the addition amount exceeds 20 w / v%, the stabilization effect of AT-III is good, Since the pressure ratio is increased and the blood pressure is reduced due to toxicity, it is not preferable. In particular, when the organic acid is citric acid, administration of the resulting preparation causes a decrease in blood pressure and heart damage.
[0016]
In the liquid preparation of the present invention, sugar may be further added as an auxiliary stabilizer. By adding sugar, the amount of organic acid added can be reduced, and bimodality that causes inactivation of AT-III activity can be prevented. Examples of the sugar used in the present invention include monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols, and amino sugars. Examples of monosaccharides include glucose, fructose, galactose, mannose, arabinose, and inositol. Examples of disaccharides include saccharose, lactose, maltose, and examples of sugar alcohols include mannitol, sorbitol, and xylitol. Examples of amino sugars include glucosamine and amino sugar derivatives such as N-acetyl-D-glucosamine. Preferred are sucrose, lactose, sorbitol, inositol, maltose, N-acetyl-D-glucosamine, and mannitol.
[0017]
In the above preparation, sugar is preferably added so as to be in the range of 0.1 to 40 w / v%, more preferably 0.5 to 20 w / v%, particularly preferably 5 to 10 w / v%. When this addition amount is less than 0.1 w / v%, the stabilization effect of AT-III is reduced. Conversely, when the addition amount exceeds 40 w / v%, the stabilization effect of AT-III is good. , The osmotic pressure ratio is increased and the viscosity is increased.
[0018]
Further, a surfactant may be further added as an auxiliary stabilizer to the liquid preparation of the present invention. By adding a surfactant, it is possible to prevent the generation of insoluble foreign matters during storage. As the surfactant, nonionic surfactants are preferable. For example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (for example, trade name: Tween), polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (for example, trade name: Pluronic), polyalkylene Examples include glycol (for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc.), polyoxyethylene alkyl ether (for example, trade name: Triton) and the like. The molecular weight of these surfactants is preferably 2,000 to 20,000. Examples of the fatty acid of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester include fatty acids having 12 to 18 carbon atoms such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid, lauric acid, and oleic acid.
[0019]
The surfactant is preferably 0.005 to 0.1 w / v%, more preferably 0.01 to 0.05 w / v%, particularly preferably 0.01 to 0.03 w / v% in the above preparation. It adds so that it may become a range. When this addition amount is less than 0.005 w / v%, the stabilizing effect of AT-III is reduced, and when it is shaken, insoluble foreign matter appears due to protein denaturation. Conversely, the addition amount is less than 0.1 w / v%. If it exceeds, blood pressure decreases due to toxicity, which is not preferable.
[0020]
In addition, other stabilizers can be added to the liquid preparation of the present invention. For example, inorganic salts, albumin, aprotinin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or a salt thereof can be used. Examples of inorganic salts include, but are not limited to, sodium chloride, potassium chloride, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and potassium phosphate. The
[0021]
In addition, the liquid preparation of the present invention includes additives usually used in liquid preparations, for example, isotonic agents (sorbitol, mannitol, glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol, glucose, sodium chloride, etc.) unless they are contrary to the object of the present invention. ), Antiseptic fungicides (benzalkonium chloride, paraoxybenzoates, benzyl alcohol, parachlormetaxenol, chlorcresol, phenethyl alcohol, sorbic acid or salts thereof, thimerosal, chlorobutanol, etc.), chelating agents (edetic acid) Sodium, condensed sodium phosphate, etc.), thickeners (polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinyl alcohol, sodium polyacrylate, etc.) are usually used It can be blended with the addition amount of.
[0022]
A sugar sulfate ester can be further added to the AT-III liquid preparation of the present invention. Examples of the sugar sulfate ester include heparin and dextran sulfate, and heparin is preferable. The heparin content in the liquid preparation is preferably 1 to 1000 units / ml, more preferably 10 to 100 units / ml. Further, the ratio to AT-III is preferably 0.1 to 100 units, more preferably 1 to 5 units per unit of AT-III.
[0023]
The liquid preparation of the present invention is preferably pH 7.0 to 10.0, more preferably pH 7.0 to 9.0, particularly preferably pH 7.0 to 8.0, and is stable in this range. At pH 7.0 to 7.8, it is stable for long-term storage. Moreover, since the pain at the time of injection is relieved, the formulation of pH 7.0-8.0 is suitable for using as an injection.
[0024]
The pH can be adjusted by a usual method, for example, using a hydroxide or an appropriate buffer as a regulator. Examples of the hydroxide include sodium hydroxide and potassium hydroxide. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution, a bicarbonate buffer solution, and a Tris buffer solution.
[0025]
In the liquid preparation of the present invention, a medicinal component other than AT-III can be blended unless it is contrary to the object of the present invention. Examples thereof include plasma fractionated preparations (thrombin, heparin cofactor, fibrinogen) and the like.
[0026]
The embodiment of the liquid preparation of the present invention is not particularly limited as long as AT-III is dissolved in water together with other components, and examples thereof include, for example, injections and drops. . Examples of water to be dissolved include distilled water for injection and sterilized purified water.
[0027]
The liquid preparation of the present invention can be prepared using a means known per se according to the type of the liquid preparation. Moreover, heat treatment, sterilization filtration, etc. can be performed as desired.
[0028]
The liquid preparation of the present invention thus prepared can be stored for a long period of time usually at 4 ° C. to room temperature. Usually, it can be stored at 15 ° C. or lower for at least 24 months and at room temperature for at least 6 months, and retains at least 80%, preferably 90% or more of the AT-III activity at the time of preparation.
[0029]
The liquid preparation of the present invention is useful for the treatment of generalized intravascular coagulation syndrome (DIC) accompanied by a tendency to thrombus formation due to congenital AT-III deficiency and a decrease in AT-III.
The administration method of this agent can be based on the conventional AT-III injection or infusion formulation, for example, a method of slowly or intravenously injecting the liquid preparation of the present invention.
Usually, the liquid preparation of the present invention is administered at a rate of 1,000 to 3,000 units (or 20 to 60 units / kg) per day, but the dose may be appropriately increased or decreased depending on age, body weight, symptoms and the like. Good. In addition, when this drug is used as an emergency treatment in obstetrics, surgical DIC, etc., it is preferable to administer 40 to 60 units / kg once a day.
The osmotic pressure of the liquid preparation of the present invention is preferably the same as or close to the physiological conditions of humans and animals.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not limited to these Examples.
Example 1
500 units of AT-III and 300 mg of calcium gluconate were dissolved in 10 ml of water for injection, and the pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0031]
Example 2
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, and sodium citrate 300 mg were dissolved in 10 ml of water for injection and the pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0032]
Example 3
AT-III 500 units, sodium gluconate 150 mg, and sodium citrate 500 mg were dissolved in 10 ml of water for injection and the pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0033]
Example 4
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, and sodium malate 300 mg were dissolved in 10 ml of water for injection, and the pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0034]
Example 5
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, and saccharose 2000 mg were dissolved in 10 ml of water for injection, and the pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0035]
Example 6
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (trade name Pluronic PF-68) 1 mg was dissolved in 10 ml of water for injection, pH was adjusted to 7.5, and AT-III was adjusted. It was set as the liquid formulation.
[0036]
Example 7
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, saccharose 2000 mg, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (trade name Pluronic PF-68) 1 mg was dissolved in 10 ml of water for injection and the pH was adjusted to 7.5. An AT-III liquid preparation was prepared.
[0037]
Example 8
AT-III 500 units, calcium gluconate 100 mg, sodium citrate 300 mg, saccharose 2000 mg, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (trade name Pluronic PF-68) 1 mg was dissolved in 10 ml of water for injection and the pH was adjusted to 7. 5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0038]
Example 9
AT-III 500 units, calcium gluconate 150 mg, sodium citrate 500 mg, saccharose 1000 mg, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (trade name Pluronic PF-68) 1 mg, heparin 5000 units are dissolved in 10 ml of water for injection, The pH was adjusted to 7.5 to obtain an AT-III liquid preparation.
[0039]
In the following experimental examples, the stability of AT-III in the AT-III liquid preparation of the present invention was examined.
The stability of AT-III was evaluated from the remaining AT-III activity and / or the rate of polymerization of AT-III. As described below, AT-III activity was measured using an AT-III activity measurement kit (Test Team AT-III-2 kit: manufactured by Daiichi Chemical), and the polymerization rate of AT-III was Measured by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis.
[0040]
(1) Measurement of AT-III activity
Sample dilution 50 μl [2.4 U / ml heparin, 40 mM Tris-HCl buffer, 0.14 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 8.4)] is taken into a tube, and human thrombin solution [0.9% sodium chloride, 0% 100 μl of 0.05% bovine serum albumin (BSA), 0.05% polyethylene glycol (PEG) # 6000 containing 1 U / ml thrombin) was added, preincubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then a synthetic substrate solution (S-2238 : HD-phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginyl-p-nitroanilide dihydrochloride) 100 μl was added and further incubated at 37 ° C. for 5 minutes. After color development, 1 ml of citric acid solution was added to stop the reaction, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured with a spectrophotometer. Simultaneously with the measurement sample, normal human plasma (1 U AT-III / ml) was measured, and the AT-III content of the sample was measured from the calibration curve.
[0041]
(2) HPLC analysis
G3,000SW _XL The column (manufactured by Tosoh Corporation) was equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3 M NaCl, and then measured at a flow rate of 0.7 ml / min.
[0042]
Experimental example 1
AT-III (dried preparation, trade name Neuart, manufactured by Midori Cross Co., Ltd.) concentrated bulk solution (AT-III titer: 50 U / ml) was dialyzed overnight against 2% sodium citrate, pH 7.5, and then shown in Table 1. Various stabilizers were added, and after sterilization filtration, heat treatment was performed at 60 ° C. for 1 hour or 55 ° C. for 10 hours, and HPLC analysis was performed. The results are shown in Table 1.
[0043]
[Table 1]

[0044]
The formulation in which the amount of citric acid added was reduced and sodium gluconate was added as one of the stabilizers showed a stabilizing effect equivalent to that of the control.
[0045]
Experimental example 2
AT-III (dried preparation, trade name Neuart, manufactured by Green Cross Co., Ltd.) concentrated bulk solution (AT-III titer: 50 U / ml) was dialyzed overnight against 2% sodium citrate, pH 7.5, and then shown in Table 2. A stabilizer was added, and after sterilization filtration, heat treatment was performed at 55 ° C. for 10 hours or 60 ° C. for 30 minutes, and HPLC analysis was performed. The results are shown in Table 2.
[0046]
[Table 2]

[0047]
The example using only calcium gluconate as the organic acid shows the same stabilizing effect as the example using only sodium citrate as the organic acid, and the example using both calcium gluconate and sodium citrate as the organic acid is organic The stabilization effect was better than the example using only sodium citrate as the acid.
[0048]
Experimental example 3
AT-III (dried preparation, trade name Neuart, manufactured by Green Cross Co., Ltd.) concentrated bulk solution (AT-III titer: 50 U / ml) was dialyzed overnight against 2% sodium citrate, pH 7.5, and then shown in Table 3. A stabilizer was added, and after sterilization filtration, heat treatment was performed at 55 ° C. for 10 hours, and the residual rate of AT-III activity was measured for 1 hour, 3 hours, 5 hours, and 10 hours, and HPLC analysis was performed. The results are shown in Table 3, FIG. 1 and FIG.
[0049]
[Table 3]

[0050]
3.0w / v% Cit-Na, 20w / v% Sacc., 1.0w / v% Gluc-Ca, 0.01w / v% PF-68 Was found to be the best.
[0051]
Experimental Example 4
AT-III (dried preparation, trade name Neuart, manufactured by Green Cross Co., Ltd.) concentrated bulk liquid (AT-III titer: 50 U / ml) was dialyzed overnight against 2% sodium citrate, pH 7.5, and then shown in Table 4. A stabilizer was added, and after sterilization filtration, measurement of residual ratio of AT-III activity and HPLC analysis were performed at 11, 6, 12, 15, 18, and 22 months at 11 ° C. The results are shown in Table 4.
[0052]
[Table 4]

[0053]
From Table 4, the composition of 3w / v% Gluc-Ca, 20w / v% Sacc., 0.01w / v% PF-68 pH7.5, 3w / v% Cit-Na, 20w / v% Sacc., 1w / v% Gluc-Ca, 0.01w / v% PF-68 pH7.5 composition, and 5w / v% Cit-Na, Ten It was found that the liquid preparations having the composition of w / v% Sacc., 1 w / v% Gluc-Ca, 0.01 w / v% PF-68 pH 7.5 all had good stability even after 22 months.
[0054]
In Tables 1-4 and FIGS. 1-2, Cit-Na is sodium citrate, Sacc. Is saccharose, PF-68 is pluronic PF-68, Lact. Is lactose, Dext. Is dextrose, Sorb. Is sorbitol, Gly. Is glycine, Mann. Is mannitol, Malt. Is maltose, Inos. Is inositol, lys is lysine, Arg is arginine, Phe is phenylalanine, Gluc-Na is sodium gluconate, Ala is alanine, Sali-Na is sodium salicylate, Gluc -Ca indicates calcium gluconate, and Glu-Na indicates sodium glutamate.
[0055]
Experimental Example 5
The effect of the AT-III liquid preparation on the respiratory and circulatory system in dogs was investigated.
In the test, seven dogs (mongrel, male, body weight 9.0 to 11.0 kg, preliminary breeding period 1 week or longer) were used and reared under conditions of temperature 19 ± 2 ° C. and humidity 65 ± 10%. Three male dogs were used per group, anesthetized by intravenous administration of pentobarbital-Na salt (25 mg / kg), and fixed in the dorsal position. Respiration, blood pressure, heart rate, blood flow and electrocardiogram were measured, and the average value ± standard deviation was obtained. Breathing is performed on the trachea through a tube (trade name: Trachylon, Terumo) via a thermistor type respiratory sensor (Nihon Kohden, TR-612T), and blood pressure is inserted into a femoral artery by inserting a catheter into a disposable blood pressure transducer (Nippon Kohden, DX-360) and a pressure lamp (Nihon Kohden, AP-641G), the heart rate triggers the pulse pressure and the heart rate (Nihon Kohden, AT-601G), the blood flow to the femoral artery A blood flow measurement probe was attached, and both were connected to a polygraph (Nihon Kohden, RM-6000) via an electromagnetic flow meter (Nihon Kohden, MFV-3100) and recorded simultaneously. Electrocardiograms (PR, QRS, QT, T, ST) were recorded on an electrocardiograph (Nihon Kohden, ECG-8110) by standard limb lead II. As a test drug, a pH 7.5 AT-III liquid consisting of AT-III (50 U / ml), 3 w / v% calcium gluconate, 20.0 w / v% saccharose and 0.01 w / v% pluronic PF-68. AT-III liquid at pH 7.5 comprising formulation (A), AT-III (50 U / ml), 3 w / v% sodium citrate, 20.0 w / v% saccharose and 0.01 w / v% Pluronic PF-68 Formulation (B), and AT-III (50 U / ml), 3 w / v% sodium citrate, 20.0 w / v% saccharose, 1.0 w / v%, calcium gluconate and 0.01 w / v% Pluronic PF -68 liquid AT-III liquid formulation (C) consisting of -68, and its dosage is 0.6 ml / kg, and it was administered through a catheter placed in the femoral vein. Using a syringe pump with holder (Harverd22-M), and the administration rate 0.25ml / kg / min. The observation time was before administration, during administration, 1 minute, 5 minutes, 15 minutes and 30 minutes after administration. The results are shown in Tables 5-7.
[0056]
[Table 5]

[0057]
[Table 6]

[0058]
[Table 7]

[0059]
From Tables 5 to 7, in the liquid preparation (B), the blood pressure decreased and the electrocardiogram was changed, but in the liquid preparation (A), the decrease in blood pressure and the electrocardiogram compared to the liquid preparation (B). The change was considerably suppressed, and in the liquid preparation (C), a decrease in blood pressure and a change in electrocardiogram were hardly observed.
[0060]
Reference example
10 kg of the paste of fraction IV-1 obtained by the cold ethanol fractionation method of corn was suspended in 100 liters of physiological saline, barium sulfate was added to 5 w / v%, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Was removed by adsorbing to barium sulfate. The supernatant was adjusted to pH 6.5, polyethylene glycol # 4,000 was added to 13 w / v%, the resulting precipitate was removed by centrifugation, and polyethylene glycol # 4,000 was further added to 30 w / v. %, And the resulting precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was dissolved in about 20 liters of cold physiological saline and injected into a column of heparin sepharose previously prepared with physiological saline to adsorb AT-III onto the column. The column was washed with 0.4 M sodium chloride solution to remove impure proteins, and then a 2.0 M sodium chloride solution was passed through the column to recover the eluted portion.
Sodium citrate was added to this AT-III aqueous solution to a concentration of 0.6 M, adjusted to pH 7.8, and then subjected to heat treatment at 60 ° C. for 10 hours, and then sodium chloride (final concentration 3 M) and citric acid. Sodium (final concentration 20 mM) was added and adjusted to pH 7.5. On the other hand, after contacting an AT-III-containing aqueous solution with a butyl-type polyvinyl carrier (Butyl Toyopearl 650, manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) equilibrated with 20 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) containing 3M sodium chloride. And developed with the above buffer solution, and the unadsorbed fraction was recovered. Subsequently, dialysis was performed overnight against 0.5% sodium citrate buffer (pH 7.5) to obtain purified AT-III.
[0061]
【The invention's effect】
According to the AT-III liquid preparation of the present invention comprising AT-III and a stabilizer (gluconic acid or a salt thereof, a sugar sulfate or a surfactant), AT-III during heat treatment and long-term storage Decrease in activity and polymerization can be prevented, and even when administered, there is almost no decrease in blood pressure or heart damage. For this reason, the liquid formulation of this invention can be provided as a product (injection etc.) as it is. Therefore, since it can be directly administered to a patient as an injection or the like without being dissolved at the time of use, the operation at the time of administration can be simplified and useful for clinical use. In addition, since the freeze-drying step can be omitted in the manufacturing process, manufacturing efficiency and economy can be improved.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the time course of AT-III activity remaining rate in Experimental Example 3. FIG.
2 is a graph showing the time course of HPLC analysis in Experimental Example 3. FIG.

Claims

A liquid preparation of antithrombin-III, comprising antithrombin-III and gluconic acid or a salt thereof.

The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 1, further comprising a sugar.

The antithrombin-III liquid preparation according to claim 1 or 2, further comprising a surfactant.

Furthermore, organic liquid other than gluconic acid or its salt is contained, The liquid formulation of antithrombin-III of Claims 1-3 characterized by the above-mentioned.

5. The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 4, wherein the organic acid other than gluconic acid is citric acid.

The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 1, wherein the concentration of gluconic acid or a salt thereof is in the range of 0.5 to 3.0 w / v% in the liquid preparation.

6. The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 4 or 5, wherein the concentration of the organic acid or a salt thereof is in the range of 2 to 20 w / v% in the liquid preparation.

8. The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 1, wherein the concentration of antithrombin-III is 10 to 500 units / ml.

9. The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 1, wherein the pH is in the range of 7-10.

The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 1, further comprising a sugar sulfate.

The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 10, wherein the sugar sulfate is heparin.

The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 11, wherein the concentration of heparin is 1-1000 units / ml.

A method for stabilizing the storage of an antithrombin-III liquid preparation, which comprises adding gluconic acid or a salt thereof as a stabilizer to the antithrombin-III liquid preparation.

14. The method for stabilizing and stabilizing an antithrombin-III liquid preparation according to claim 13, further comprising adding sugar as an auxiliary stabilizer.

The method for stabilizing and stabilizing an antithrombin-III liquid preparation according to claim 13 or 14, further comprising adding a surfactant as an auxiliary stabilizer.

16. The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to any one of claims 13 to 15, wherein an organic acid other than gluconic acid or a salt thereof is further added as a stabilizer.

17. The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to claim 16, wherein the organic acid other than gluconic acid is citric acid.

18. The liquid preparation of antithrombin-III according to claim 13, wherein gluconic acid or a salt thereof is added so as to have a concentration in the range of 0.5 to 3.0 w / v% in the liquid preparation. Storage stabilization method.

19. Stabilization of storage of an antithrombin-III liquid preparation according to claim 17 or 18, wherein an organic acid or a salt thereof is added to the liquid preparation to a concentration in the range of 2 to 20 w / v%. Method.

20. The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to claims 13 to 19, wherein the concentration of antithrombin-III is 1-1000 units / ml.

21. The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to claim 13, wherein the pH is adjusted to a range of 7 to 10.

The method for stabilizing and storing a liquid preparation of antithrombin-III according to any one of claims 13 to 21, further comprising adding a sugar sulfate ester.

The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to claim 22, wherein the sugar sulfate is heparin.

The method for stabilizing and stabilizing a liquid preparation of antithrombin-III according to claim 23, wherein the concentration of heparin is 1-1000 units / ml.