JP3819512B2

JP3819512B2 - DNA having a sequence for efficiently translating proteins in coryneform bacteria

Info

Publication number: JP3819512B2
Application number: JP03533897A
Authority: JP
Inventors: 幹小林; 朋子満; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2017-02-19
Also published as: JPH10229881A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリネ型細菌において、蛋白質の翻訳を効率よく行わせるＤＮＡ配列に関する。さらに詳しくは、細胞の中でｍＲＮＡが転写された後、リボソームが結合し、蛋白質の翻訳が開始されるが、このリボソームの認識、結合をより効率的に行わせ、その結果、蛋白質の発現量を増大させるＤＮＡ配列に関するものである。また、該ＤＮＡ配列を有するプラスミドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、種々の有用蛋白質が微生物を用いて生産されてきており、その一般的手法については既に確立されている。しかし、個々の微生物（属）における、特定の蛋白質の効率的生産方法については改良の余地が残されている。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、有用蛋白質を生産させる場合、様々の要因が、その生産性に影響を及ばす。中でも、有用蛋白質をコードする遺伝子の転写促進に関与するプロモーターと、ｍＲＮＡの、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端配列と相補的に結合して翻訳促進に関与するＳＤ配列が大きな要因となる。
【０００４】
蛋白質の翻訳においては、翻訳開始コドンの上流に存在するＳＤ配列と１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端との相補性［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, p1342 (1974), Nucleic Acid Research, 22, p1287 (1994)］、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離［Molecular Microbiology, 6, p1219 (1992), Nucleic Acid Research, 22, p4953 (1994)］、ＳＤ配列上流の配列［Nucleic Acid Research, 14, p5481 (1986), GENE, 73, p227 (1988)］、及び、翻訳開始コドン下流の配列［EMBO J., 6, p2489 (1987)］が影響を与えることが知られている。
【０００５】
しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌における、蛋白質の効率的な翻訳に関する配列については、本発明者等の知る限り従来の報告例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、有用蛋白質を細胞内で効率的に翻訳させ、大量に発現させるためには、翻訳開始コドン周辺の配列、特に、ＳＤ配列の塩基配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離、ＳＤ上流の塩基配列が重要である。ところが、コリネ型細菌についての知見はなく、工業的に重要なコリネ型細菌での検討はされていない。
【０００７】
本発明は、コリネ型細菌内において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を細胞内で大量に発現させるために必要な配列の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内で蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見いだした。すなわち、ＳＤ配列の改変、ＳＤ配列上流配列の改変、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改変により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）を提供する。
【００１０】
好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上である１〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高ＡＴ含量塩基配列としては、配列番号３７に示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】
また、好ましくは、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等またはそれ以上である。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。
(2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を培養する。
(4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を測定する。
【００１２】
このようなＤＮＡの例としては、配列番号２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げられる。
本発明ＤＮＡを用いるのに好ましいコリネ型細菌は、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）である。
【００１３】
また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。
【００１４】
かくして本発明によれば、コリネ型細菌内において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を大量に発現させるために必要なＤＮＡ及び該ＤＮＡを有するプラスミドが提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
＜１＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡである。本明細書において上記のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有するＤＮＡとは、そのＤＮＡが転写されて生じたＲＮＡの塩基配列が１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の塩基配列と相補的である塩基配列を有するＤＮＡを意味するものである。また、相補的な塩基は、その５つ以上が連続していることが好ましい。
【００１６】
ｒＲＮＡ相補的塩基配列の具体例としては、配列番号２９〜３６に示される塩基配列が挙げられる。
好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上、好ましくは８５％以上である１〜３０塩基、好ましくは２０〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高ＡＴ含量塩基配列の具体例としては、配列番号３７に示される塩基配列が挙げられる。
【００１７】
本発明ＤＮＡは、配列が上記の条件を満たすように決定されれば、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００１８】
あるいは、コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮＡあるいは、細胞内で比較的発現量の多い種々の遺伝子上流、例えば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子上流からクローニングすることもできる。その供給源となる微生物として、コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brevibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
【００１９】
これらの供給源微生物から本発明ＤＮＡを調製するための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。
まず、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を、上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）株の染色体の中から、通常遺伝子を単離する方法、すなわち、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、相補、等の方法で分離・取得し、目的遺伝子を含む断片を単離し、単離した断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コドンを同定することにより、その翻訳開始コドンの上流の配列が判明する。この判明した配列に基づいて本発明ＤＮＡを合成するか、または、単離した断片から、適切な制限酵素を用いて本発明ＤＮＡを切り出すことができる。
【００２０】
本発明ＤＮＡは、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置かれたとき、その蛋白質の翻訳を効率的に行わせる。すなわち、本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる機能が高いものである。本発明ＤＮＡの機能の評価は、該ＤＮＡにより発現される下流に位置する蛋白質が活性等を有する場合には、その活性等を測定することにより行うことができる。
【００２１】
下流に位置する蛋白質としては、例えば、ベータガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられ、該遺伝子をＡ断片の下流に連結することにより、ベータガラクトシダーゼ活性を指標にしてその翻訳効率を測定することができる。
【００２２】
例えば、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等またはそれ以上となるものである。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。
(2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を培養する。
(4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を測定する。
【００２３】
より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の工程から成る測定法で測定したときに、ベータガラクトシダーゼ活性が３５０Ｕ以上となるものである。
(1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子、前記遺伝子に連結したｔａｃプロモーター、及び、プラスミドｐｇａｌの前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモーターの間であって、開始コドンから１０塩基上流に上記ＤＮＡを有するプラスミドを調製する。
(2) 調製したプラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）に導入する。
(3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３を、１０ｍｌの半合成培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間前培養を行い、この前培養の培養液を同半合成培地に２％植菌して３１℃で５時間培養する。
(4) この培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性を、Experiments in Molecular Genetics, ed. by J.H. Miller (1977), chapter 48, p. 352-355に記載の方法により測定する。すなわち、培養液のＯＤを波長６００ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにする。トルエンを０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸発させる。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を反応温度に合わせる。基質であるＯＮＰＧ〔オルトニトロフェノールベータガラクトシド）溶液（ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させる。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められたら、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了させる。吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式により算出する。
【００２４】
【数１】
活性（Ｕ）＝（ＯＤ₄₂₀−１．７５×ＯＤ₅₅₀）／（測定時間（分）×ＯＤ₆₀₀）×１０００
【００２５】
このようなＤＮＡの例としては、配列番号２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げられる。
なお、本発明ＤＮＡは、蛋白質を効率よく翻訳すなわち発現させるために、染色体上の発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよいし、また、プラスミド上の発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい。本発明ＤＮＡを所定位置に置くことすなわち組み込むことは、ＤＮＡ断片を染色体またはプラスミドの所望の位置に組み込むための公知の方法によって行うことができる。
【００２６】
本発明ＤＮＡは、特に、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）において、蛋白質を効率よく翻訳させることができる。
【００２７】
本発明ＤＮＡは、二本鎖および一本鎖のいずれの形態であってもよい。
【００２８】
＜２＞本発明プラスミド
また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。なお、４〜１６塩基上流とは、本発明ＤＮＡのｒＲＮＡ相補的配列と翻訳開始コドンの間に４〜１６塩基のスペーサー塩基配列があることを意味する。
【００２９】
ＤＮＡ断片をプラスミドの所望の位置に組み込む方法は公知であり、公知の方法に従って、コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドに、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの所定塩基対上流に本発明ＤＮＡを組み込むことによって本発明プラスミドを得ることができる。
【００３０】
コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドには、特に制限はなく、公知のもの（例えばｐＢＹ５０１（特開昭６０−２４８１８２号公報）、ｐＢＹ５０３（特開昭６２−２５２３７９号公報）、ｐＢＬ１００（特開昭６０−１２０９９２号公報）、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＢＬ１（J. Gen. Microbiol., 1984, 130, p. 2237-2246）等）を使用してもよいし、任意のプラスミドにコリネ型細菌内でのプラスミドの安定化及び複製に必要な配列を組み込むことにより作製してもよい。
【００３１】
本発明プラスミドは、コリネ型細菌に導入され、コリネ型細菌内において蛋白質が効率的に翻訳される。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３３】
【実施例１】
評価用プラスミドの作製
（Ａ）シャトルベクターの構築
米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００３４】
【化１】

【００３５】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００３６】
【表１】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３７】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋１μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００３８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００３９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００４０】
さらに、米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００４１】
【化２】

【００４２】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００４３】
【表２】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４４】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ１μｌを各々制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ(１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００４５】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００４６】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００４７】
上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−ｒｅｐ１μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｌを各々制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００４８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００４９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命名した。
【００５０】
（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入
ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５１】
【化３】

【００５２】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００５３】
【表３】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００５４】
上記で生成した反応液１０μｌを３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００５５】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００５６】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ａ）で作製したプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命名した。
【００５７】
（Ｃ）ベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入
大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の配列は決定されており［EMBO Journal, 2, 593 (1983)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿入し、評価用プラスミドを作製した。
【００５８】
下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００５９】
【化４】

【００６０】
実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行った。
【００６１】
【表４】
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡＭｇＣｌ₂ １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下）
上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６２．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００６２】
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上記で増幅産物を確認できた反応終了液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミド溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢａｍＨＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００６３】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology、５３、１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００６４】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素（ＰａｃＩ，ＢａｍＨＩ）により切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記（Ｂ）で作製したプラスミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
【００６５】
このプラスミドをｐｇａｌと命名した。
【００６６】
【実施例２】
Ａ断片の評価
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のＡ断片の単離
微生物細胞内含量の多い蛋白質、または多いと考えられる蛋白質をコードする遺伝子を単離することにより、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるために必要なＤＮＡ（Ａ断片）を単離することができる。
【００６７】
特開平５−３０９７７号公報、特開平７−１０７９８１号公報等に記載の方法に従い、変異株を用いた相補、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等により、ａｓｐＡ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を単離し、目的の遺伝子のＯＲＦの配列を決定した。さらに、該ＯＲＦの上流の配列を決定することにより、Ａ断片の配列を決定した。配列決定した配列を配列番号２９〜３７に記載する。
【００６８】
（Ｂ）Ａ断片の合成
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３から単離したＡ断片の配列に基づき、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成した。
【００６９】
また、人工的にデザインしたＡ断片、すなわち、単離した以外の配列のＳＤ配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させた配列、ＳＤ配列上流を改変した配列を種々合成した。
【００７０】
合成した配列は以下の（あ）〜（う）の通りである（配列番号１〜２０）。
（あ）単離した遺伝子上流の配列に基づいて合成した配列
【００７１】
【化５】

【００７２】
（い）ＳＤ配列上流に新しい配列を付加して合成した配列
【００７３】
【化６】

【００７４】
（う）ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させて合成した配列
【００７５】
【化７】

【００７６】
（Ｃ）Ａ断片のｐｇａｌへの挿入
合成した、配列番号１〜２０の配列と相補的なＤＮＡをさらに合成し、各々アニーリングを行い２本鎖ＤＮＡを作製した。
【００７７】
２本鎖ＤＮＡ溶液１０μｌ、上記実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドｐｇａｌの溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢｇｌＩＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００７８】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
【００７９】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドを抽出し、通常の方法に従い、ベータガラクトシダーゼ遺伝子上流の配列を確認することにより、挿入断片を確認した。
【００８０】
これらのプラスミドを順次ｐｇａｌ−１〜ｐｇａｌ−２０と命名した。
【００８１】
（Ｄ）Ａ断片の評価
実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドを米国特許５，１８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）に導入した。
【００８２】
形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成培地のＡ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０. ５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振とう培養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌに前培養液を２％植菌し、３１℃で５時間振とうして対数増殖期中期まで培養した。この培養液を用いて、ベータガラクトシダーゼ活性の測定を行った。
【００８３】
ベータガラクトシダーゼ活性の測定は通常の方法［Experiments in Molecular Genetics, ed. by Jeffrey H. Miller (1977), chapter 48, Assay of β-galactosidase］に従って行った。具体的には、以下のようにして行った。
【００８４】
培養液のＯＤを波長６００ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにした。
【００８５】
トルエンを０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸発させた。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を反応温度に合わせた。
【００８６】
基質であるＯＮＰＧ（オルトニトロフェノールベータガラクトシド）溶液〔ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させた。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められた後、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了させた。
【００８７】
吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式により算出した。
【００８８】
【数２】
活性（Ｕ）＝（ＯＤ₄₂₀−１．７５×ＯＤ₅₅₀）／（測定時間（分）×ＯＤ₆₀₀）×１０００
【００８９】
下記表５に示したとおり、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列に相当する領域の評価を行ったところ、その中心部分ＧＧＡＧＧの保存性が高いものは、配列番号９に比較して、活性の高いことが判明した。
【００９０】
【表５】
表５ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド評価に用いた配列ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１配列番号１１１００
ｐｇａｌ−２配列番号２４５０
ｐｇａｌ−３配列番号３５００
ｐｇａｌ−４配列番号４５００
ｐｇａｌ−５配列番号５４００
ｐｇａｌ−６配列番号６３５０
ｐｇａｌ−７配列番号７６５０
ｐｇａｌ−８配列番号８６００
ｐｇａｌ−９配列番号９３０
────────────────────────────────────
【００９１】
次に、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補的な配列上流の配列の影響を調べたところ、表６に示したとおり、ＡＴに富む配列を付加した場合に、活性が上昇することが判明した。
【００９２】
【表６】
表６ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド評価に用いた配列ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１配列番号１１１００
ｐｇａｌ−２配列番号２４５０
ｐｇａｌ−１０配列番号１０１７００
ｐｇａｌ−１１配列番号１１１０００
ｐｇａｌ−１２配列番号１２２０００
ｐｇａｌ−１３配列番号１３１３００
────────────────────────────────────
【００９３】
１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端と相補的な配列に含まれる SD 配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させたところ、表７に示したとおり、８ｂｐから１４ｂｐの場合、特に１２ｂｐの場合、活性の上昇が観察できた。
【００９４】
【表７】
表７ベータガラクトシダーゼ活性
────────────────────────────────────
プラスミド評価に用いた配列ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）
────────────────────────────────────
ｐｇａｌ−１４配列番号１４１１００
ｐｇａｌ−１３配列番号１３１３００
ｐｇａｌ−１５配列番号１５１８００
ｐｇａｌ−１６配列番号１６９００
ｐｇａｌ−１７配列番号１７４００
ｐｇａｌ−１８配列番号１８１８００
ｐｇａｌ−１２配列番号１２２０００
ｐｇａｌ−１９配列番号１９２５００
ｐｇａｌ−２０配列番号２０１６００
────────────────────────────────────
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＳＤ配列の改良、ＳＤ配列上流配列の改良、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改良により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、細胞内で大量に発現させることが可能になる。
【００９６】
【配列表】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【０１１９】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【０１２８】

【０１２９】

【０１３０】

【０１３１】

【０１３２】

【０１３３】

【０１３４】

【０１３５】

【０１３６】

【０１３７】

【０１３８】

【０１３９】

【０１４０】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a DNA sequence that allows efficient protein translation in coryneform bacteria. More specifically, after mRNA is transcribed in the cell, ribosomes bind and protein translation begins, but this ribosome is recognized and bound more efficiently, resulting in protein expression levels. Relates to DNA sequences that increase It also relates to a plasmid having the DNA sequence.
[0002]
[Prior art]
Until now, various useful proteins have been produced using microorganisms, and the general method has already been established. However, there remains room for improvement in the efficient production method of specific proteins in individual microorganisms (genus).
[0003]
When a useful protein is produced using recombinant DNA technology, various factors affect the productivity. Among these factors, a major factor is a promoter involved in promoting transcription of genes encoding useful proteins and an SD sequence involved in promoting translation by binding complementarily to the 3 'terminal sequence of 16S ribosomal RNA of mRNA.
[0004]
In protein translation, complementation between the SD sequence existing upstream of the translation initiation codon and the 3 'end of 16S ribosomal RNA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, p1342 (1974), Nucleic Acid Research, 22, p1287 (1994)], distance between SD sequence and translation initiation codon [Molecular Microbiology, 6, p1219 (1992), Nucleic Acid Research, 22, p4953 (1994)], sequence upstream of SD sequence [Nucleic Acid Research, 14, p5481 (1986), GENE, 73, p227 (1988)] and a sequence downstream of the translation initiation codon [EMBO J., 6, p2489 (1987)] are known to affect.
[0005]
However, as far as the present inventors know, there are no conventional reports on sequences relating to efficient translation of proteins in industrially important coryneform bacteria.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in order to efficiently translate useful proteins in cells and to express them in large quantities, sequences around the translation initiation codon, particularly the nucleotide sequence of the SD sequence, the distance between the SD sequence and the translation initiation codon, The base sequence upstream of SD is important. However, there is no knowledge about coryneform bacteria, and industrially important coryneform bacteria have not been studied.
[0007]
An object of the present invention is to provide a sequence necessary for efficiently translating useful proteins in coryneform bacteria and to express the proteins in large quantities in cells.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a sequence that efficiently translates a protein in coryneform bacteria. That is, the present inventors have completed the present invention by finding a sequence that efficiently translates a protein by modifying the SD sequence, modifying the upstream sequence of the SD sequence, and modifying the distance between the SD sequence and the translation initiation codon.
[0009]
That is, the present invention relates to a coryneform having a 6-12 base rRNA complementary base sequence in which at least 6 bases are complementary to the 1-12 base sequence at the 3 ′ end of 16S ribosomal RNA derived from coryneform bacteria. Provided is a recombinant DNA (hereinafter also referred to as DNA of the present invention) for efficiently translating a protein in bacteria.
[0010]
Preferably, the DNA of the present invention further has a high AT content base sequence of 1 to 30 bases having an AT content of 75% or more linked to the upstream side of the rRNA complementary base sequence. Examples of the high AT content base sequence include the base sequence represented by SEQ ID NO: 37.
[0011]
Further, preferably, the DNA of the present invention has a beta galactosidase activity equal to or higher than that of the DNA of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 as measured by a measurement method comprising the following steps.
(1) having a beta-galactosidase gene derived from E. coli, a tac promoter linked to the gene, and a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 or the DNA to be measured between the start codon of the beta-galactosidase gene and the tac promoter Prepare the plasmid.
(2) The plasmid is introduced into Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).
(3) Culturing the introduced Brevibacterium flavum MJ-233.
(4) The beta galactosidase activity is measured for the obtained culture solution.
[0012]
Examples of such DNA include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 36 and 38 to 45.
A preferred coryneform bacterium for using the DNA of the present invention is Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).
[0013]
The present invention also provides a plasmid capable of replicating in a coryneform bacterium comprising the DNA of the present invention, wherein the rRNA-complementary base sequence is located 4 to 16 bases upstream of the translation initiation codon of the protein to be expressed. To do.
[0014]
Thus, according to the present invention, DNA necessary for efficiently translating useful proteins in coryneform bacteria and expressing the proteins in large quantities and a plasmid having the DNA are provided.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
<1> DNA of the present invention
The DNA of the present invention is a coryneform bacterium having a 6-12 base rRNA complementary base sequence in which at least 6 bases are complementary to the 1'-12th base sequence at the 3 'end of 16S ribosomal RNA derived from coryneform bacterium. It is a recombinant DNA for efficiently translating proteins in the inside. In the present specification, the DNA having the rRNA-complementary base sequence is a DNA having a base sequence in which the base sequence of RNA generated by transcription of the DNA is complementary to the base sequence at the 3 ′ end of 16S ribosomal RNA. Means. Further, it is preferable that five or more complementary bases are continuous.
[0016]
Specific examples of the rRNA-complementary base sequence include the base sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 36.
Preferably, the DNA of the present invention has a high AT content base of 1 to 30 bases, preferably 20 to 30 bases having an AT content of 75% or more, preferably 85% or more linked to the upstream side of the rRNA complementary base sequence. It further has a sequence. A specific example of the high AT content base sequence is the base sequence represented by SEQ ID NO: 37.
[0017]
The DNA of the present invention can be synthesized using a commonly used DNA synthesizer, for example, a 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems, if the sequence is determined so as to satisfy the above conditions. .
[0018]
Alternatively, it can be cloned from 16S ribosomal RNA derived from coryneform bacteria, or upstream of various genes with relatively high expression levels in cells, for example, upstream of genes such as dnaK, groEL, dnaA, aspartase, secA. Examples of microorganisms serving as the supply source include coryneform bacteria such as Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), Brevibacterium ammoniagenes, ATCC6871, ATCC13745, ATCC13746, Brevibacterium devaricatum ATCC14020, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC31831 etc. can be used.
[0019]
An example of the basic operation for preparing the DNA of the present invention from these source microorganisms is as follows.
First, genes such as dnaK, groEL, dnaA, aspartase and secA are selected from the above-mentioned coryneform bacteria such as Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497). Isolation, ie, PCR, hybridization, complementation, etc. to isolate / acquire the fragment containing the target gene, determine the base sequence of the isolated fragment, and identify the translation initiation codon This reveals the sequence upstream of the translation initiation codon. The DNA of the present invention can be synthesized based on the determined sequence, or the DNA of the present invention can be excised from the isolated fragment using an appropriate restriction enzyme.
[0020]
When the DNA of the present invention is placed at a predetermined base upstream of the translation initiation codon of a protein to be expressed, the protein is efficiently translated. That is, the DNA of the present invention has a high function for efficiently translating proteins in coryneform bacteria. The function of the DNA of the present invention can be evaluated by measuring the activity or the like when the downstream protein expressed by the DNA has the activity or the like.
[0021]
Examples of the protein located downstream include a beta galactosidase gene, and by linking the gene downstream of the A fragment, the translation efficiency can be measured using the beta galactosidase activity as an index.
[0022]
For example, the DNA of the present invention has a beta galactosidase activity that is equal to or higher than that of the DNA of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 when measured by a measurement method comprising the following steps.
(1) having a beta-galactosidase gene derived from E. coli, a tac promoter linked to the gene, and a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 or the DNA to be measured between the start codon of the beta-galactosidase gene and the tac promoter Prepare the plasmid.
(2) The plasmid is introduced into Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).
(3) Culturing the introduced Brevibacterium flavum MJ-233.
(4) The beta galactosidase activity is measured for the obtained culture solution.
[0023]
More specifically, the DNA of the present invention has a beta galactosidase activity of 350 U or more when measured by a measurement method comprising the following steps.
(1) E. coli-derived beta galactosidase gene, tac promoter linked to the gene, and between the start codon and the tac promoter of the beta galactosidase gene of plasmid pgal, having the DNA 10 bases upstream from the start codon Prepare the plasmid.
(2) The prepared plasmid is introduced into Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).
(3) The introduced Brevibacterium flavum MJ-233 is mixed with 10 ml of semi-synthetic medium [composition: urea 2 g, (NH_Four)₂SO_Four 7g, K₂HPO_Four 0.5g, KH₂PO_Four 0.5g, MgSO_Four0.5g, FeSO_Four・ 7H₂O 6mg, MnSO_Four・ 4-6H₂6 mg of O, 2.5 g of yeast extract, 5 g of casamino acid, 200 μg of biotin, 200 μg of thiamine hydrochloride, and 20 g of glucose dissolved in 1 L of distilled water) and pre-cultured at 30 to 33 ° C. for 12 to 16 hours. Then, 2% of the pre-cultured culture solution is inoculated into the same semi-synthetic medium and cultured at 31 ° C. for 5 hours.
(4) The beta galactosidase activity of this culture solution is measured by the method described in Experiences in Molecular Genetics, ed. By J.H. Miller (1977), chapter 48, p. 352-355. Specifically, after measuring the OD of the culture solution at a wavelength of 600 nm, 10 to 100 μl of the culture solution was sampled, and a buffer for measuring beta galactosidase activity [60 mM disodium hydrogen phosphate, 40 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM potassium chloride, 1 mM sulfuric acid. Magnesium, 50 mM beta mercaptoethanol, pH 7.0] is added to make up the whole to 1 ml. Add 0.1% toluene and stir vigorously for 30 seconds, then leave at 37 ° C. for 45 minutes to evaporate the toluene. Next, the solution is transferred to a constant temperature bath at 28 ° C. and left for 5 minutes to adjust the liquid temperature to the reaction temperature. Add 0.2 ml of the substrate ONPG [orthonitrophenol beta galactoside] solution (ONPG 4 mg dissolved in 1 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)) to start the reaction. When the reaction solution is colored, 0.5 ml of 1M sodium carbonate solution is added to terminate the reaction, and the absorbance (OD) at wavelengths of 420 nm and 550 nm is measured with an absorptiometer, and the activity is expressed by the following formula. calculate.
[0024]
[Expression 1]
Activity (U) = (OD₄₂₀-1.75 x OD₅₅₀) / (Measurement time (minutes) x OD₆₀₀) X 1000
[0025]
Examples of such DNA include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 36 and 38 to 45.
In order to efficiently translate or express the protein, the DNA of the present invention may be placed at a predetermined base upstream of the translation initiation codon of the protein to be expressed on the chromosome, or should be expressed on a plasmid. It may be placed upstream of a predetermined base of the protein translation initiation codon. Placement, that is, integration of the DNA of the present invention at a predetermined position can be performed by a known method for integrating a DNA fragment into a desired position of a chromosome or a plasmid.
[0026]
In particular, the DNA of the present invention can efficiently translate a protein in Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).
[0027]
The DNA of the present invention may be either double-stranded or single-stranded.
[0028]
<2> Plasmid of the present invention
The present invention also provides a plasmid capable of replicating in a coryneform bacterium comprising the DNA of the present invention, wherein the rRNA-complementary base sequence is located 4 to 16 bases upstream of the translation initiation codon of the protein to be expressed. To do. In addition, 4-16 bases upstream means that there is a spacer base sequence of 4-16 bases between the rRNA complementary sequence of the DNA of the present invention and the translation initiation codon.
[0029]
A method for incorporating a DNA fragment into a desired position of a plasmid is known. According to a known method, the DNA of the present invention is upstream of a predetermined base pair of a translation initiation codon of a protein to be expressed into a plasmid replicable in a coryneform bacterium. The plasmid of the present invention can be obtained by incorporating.
[0030]
The plasmid that can replicate in coryneform bacteria is not particularly limited, and known plasmids (for example, pBY501 (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 60-248182), pBY503 (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 62-252379), pBL100 (Japanese Patent Laid-Open No. Sho 62-252379) are disclosed. Sho 60-120992), pAM330 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-67699), pBL1 (J. Gen. Microbiol., 1984, 130, p. 2237-2246), etc.) may be used or any This plasmid may be prepared by incorporating sequences necessary for the stabilization and replication of the plasmid in coryneform bacteria.
[0031]
The plasmid of the present invention is introduced into a coryneform bacterium, and the protein is efficiently translated in the coryneform bacterium.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0033]
[Example 1]
Preparation of evaluation plasmid
(A) Construction of shuttle vector
Based on the sequence of the region necessary for the stabilization of the plasmid in the coryneform bacterium present in the plasmid pCRY31 described in US Pat. No. 5,185,262, the following pair of primers was applied: The synthesis was performed using “394 DNA / RNA synthesizer” (Applied Biosystems).
[0034]
[Chemical 1]

[0035]
The actual PCR uses a “DNA thermal cycler” manufactured by PerkinElmer Citas, Inc., and uses the following conditions as a reaction reagent: Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) I went there.
[0036]
[Table 1]
Reaction solution:
(10 ×) PCR buffer 10 μl
1.25 mM dNTP mixture 16 μl
Template DNA MgCl₂ 10 μl (DNA content 1 μM or less)
1 μl each of a-1 and b-1 primers described above (final concentration 0.25 μM)
Recombinant Tack DNA Polymerase 0.5 μl
Sterile distilled water 62.5μl
The above was mixed and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.
PCR cycle:
Denaturation process: 94 ° C 60 seconds
Annealing process: 52 ° C 60 seconds
Extension process: 72 ° C 120 seconds
The above is one cycle, and 25 cycles are performed.
[0037]
10 μl of the reaction solution generated above was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.1 kb was detected.
After 10 μl of the reaction completion solution in which the amplification product was confirmed and 1 μl of the plasmid pBluescriptIISK + were completely digested with the restriction enzymes EcoRI and XhoI, respectively, and treated with 70 ° C. for 10 minutes, the restriction enzyme was inactivated, and then both were mixed. To this, 1 μl of T4 DNA ligase (10 ×) buffer and 1 U of T4 DNA ligase were added, and 10 μl was made with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
[0038]
Using the obtained plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg of ampicillin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g NaCl and 16 g agar were dissolved in 1 L distilled water].
[0039]
A growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme (EcoRI, XhoI) to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 3.0 kb DNA fragment of plasmid pBluescriptIISK +, an inserted DNA fragment of 1.1 kb was observed. This plasmid was named pBSpar.
[0040]
Further, based on the sequence of the region necessary for the replication of the plasmid in the coryneform bacterium present in the plasmid pCRY31 described in US Pat. No. 5,185,262, the following pair of primers were applied: Synthesis was performed using “394 DNA / RNA synthesizer” manufactured by Applied Biosystems.
[0041]
[Chemical 2]

[0042]
The actual PCR uses a “DNA thermal cycler” manufactured by PerkinElmer Citas, Inc., and uses the following conditions as a reaction reagent: Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) I went there.
[0043]
[Table 2]
Reaction solution:
(10 ×) PCR buffer 10 μl
1.25 mM dNTP mixture 16 μl
Template DNA MgCl₂ 10 μl (DNA content 1 μM or less)
1 μl each of the a-2 and b-2 primers described above (final concentration 0.25 μM)
Recombinant Tack DNA Polymerase 0.5 μl
Sterile distilled water 62.5μl
The above was mixed and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.
PCR cycle:
Denaturation process: 94 ° C 60 seconds
Annealing process: 52 ° C 60 seconds
Extension process: 72 ° C 120 seconds
The above is one cycle, and 25 cycles are performed.
[0044]
10 μl of the reaction solution generated above was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.8 kb was detected.
After 10 μl of the reaction completion solution in which the amplification product was confirmed and 1 μl of the plasmid pBSpar were completely digested with the restriction enzymes XhoI and KpnI, respectively, the restriction enzyme was inactivated by treating at 70 ° C. for 10 minutes, and then both were mixed. Then, 1 μl of T4 DNA ligase (10 ×) buffer and 1 U of T4 DNA ligase were added, made 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
[0045]
Using the obtained plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg of ampicillin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g NaCl and 16 g agar were dissolved in 1 L distilled water].
[0046]
A growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme (XhoI, KpnI) to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 4.1 kb DNA fragment of plasmid pBSpar, an inserted DNA fragment of 1.8 kb in length was observed. This plasmid was designated as pBSpar-rep.
[0047]
The plasmids pBSpar-rep 1 μl and pHSG298 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 μl prepared above were completely digested with the restriction enzymes KpnI and EcoRI, respectively, and the restriction enzymes were inactivated by treating them at 70 ° C. for 10 minutes. After mixing, each component of T4 DNA ligase 10 × buffer 1 μl and T4 DNA ligase 1 U was added to 10 μl with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
[0048]
Using the resulting plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g NaCl and 16 g agar were dissolved in 1 L distilled water].
[0049]
A growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 2.6 kb DNA fragment of plasmid pHSG298, an inserted 2.9 kb DNA fragment was observed. This plasmid was designated as pHSG298par-rep.
[0050]
(B) Insertion of tac promoter
In order to amplify the tac promoter fragment by the PCR method using the plasmid pTrc99A (Pharmacia) containing the tac promoter as a template, the following pair of primers was applied to “394 DNA / Applied Biosystems”. It was synthesized using an “RNA synthesizer”.
[0051]
[Chemical Formula 3]

[0052]
The actual PCR uses a “DNA thermal cycler” manufactured by PerkinElmer Citas, Inc., and uses the following conditions as a reaction reagent: Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) I went there.
[0053]
[Table 3]
Reaction solution:
(10 ×) PCR buffer 10 μl
1.25 mM dNTP mixture 16 μl
Template DNA MgCl₂ 10 μl (DNA content 1 μM or less)
1 μl each of the a-3 and b-3 primers described above (final concentration 0.25 μM)
Recombinant Tack DNA Polymerase 0.5 μl
Sterile distilled water 62.5μl
The above was mixed and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.
PCR cycle:
Denaturation process: 94 ° C 60 seconds
Annealing process: 52 ° C 60 seconds
Extension process: 72 ° C 120 seconds
The above is one cycle, and 25 cycles are performed.
[0054]
10 μl of the reaction solution generated above was electrophoresed on a 3% agarose gel, and a DNA fragment of about 100 bp could be detected.
10 μl of the reaction solution in which the amplification product was confirmed above and 5 μl of the plasmid pHSG298par-rep prepared in (A) above were completely digested with the restriction enzymes BamHI and KpnI, respectively, and treated with 70 ° C. for 10 minutes to thereby remove the restriction enzyme. After activation, both were mixed, and each component of T4 DNA ligase 10 × buffer 1 μl and T4 DNA ligase 1 U was added to 10 μl with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. I let you.
[0055]
Using the resulting plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g NaCl and 16 g agar were dissolved in 1 L distilled water].
[0056]
A growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 5.5 kb DNA fragment of the plasmid prepared in (A) above, an inserted DNA fragment having a length of 0.1 kb was observed. This plasmid was named pHSG298tac.
[0057]
(C) Insertion of beta-galactosidase gene
The sequence of the E. coli-derived beta-galactosidase gene (lacZ) has been determined [EMBO Journal, 2, 593 (1983)], and this gene portion was amplified by the PCR method and inserted into the plasmid pHSG298tac prepared in (B) above. A plasmid for evaluation was prepared.
[0058]
The following pair of primers was synthesized using “394 DNA / RNA synthesizer” manufactured by Applied Biosystems.
[0059]
[Formula 4]

[0060]
The actual PCR uses a “DNA thermal cycler” manufactured by PerkinElmer Citas, Inc., and uses the following conditions as a reaction reagent: Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) I went there.
[0061]
[Table 4]
Reaction solution:
(10 ×) PCR buffer 10 μl
1.25 mM dNTP mixture 16 μl
Template DNA MgCl₂ 10 μl (DNA content 1 μM or less)
1 μl each of a-4 and b-4 primers described above (final concentration 0.25 μM)
Recombinant Tack DNA Polymerase 0.5 μl
Sterile distilled water 62.5μl
The above was mixed and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.
PCR cycle:
Denaturation process: 94 ° C 60 seconds
Annealing process: 52 ° C 60 seconds
Extension process: 72 ° C 120 seconds
The above is one cycle, and 25 cycles are performed.
[0062]
10 μl of the reaction solution generated above was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 3.1 kb could be detected.
10 μl of the reaction completion solution in which the amplification product was confirmed above and 5 μl of the plasmid solution prepared in (B) above were completely digested with the restriction enzymes PacI and BamHI, respectively, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. After mixing, add both components of T4 DNA ligase 10 × buffer 1 μl and T4 DNA ligase 1 U to 10 μl with sterilized distilled water, react at 15 ° C. for 3 hours, and bind. It was.
[0063]
Using the resulting plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg of kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g of NaCl and 16 g of agar were dissolved in 1 L of distilled water].
[0064]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture solution, and the plasmid was cleaved with restriction enzymes (PacI, BamHI) to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 5.6 kb DNA fragment of the plasmid prepared in (B) above, an inserted DNA fragment of 3.1 kb was observed.
[0065]
This plasmid was named pgal.
[0066]
[Example 2]
Evaluation of A fragment
(A) Isolation of A fragment derived from Brevibacterium flavum MJ-233
Isolation of DNA (A fragment) necessary for efficient translation of proteins in coryneform bacteria by isolating proteins with high microbial cell content or genes that are believed to be high Can do.
[0067]
According to the methods described in JP-A-5-30977, JP-A-7-107981, etc., genes such as aspA and secA are isolated by complementation using a mutant strain, PCR method, hybridization method, etc. The sequence of the gene ORF was determined. Furthermore, the sequence of the A fragment was determined by determining the sequence upstream of the ORF. Sequences determined are set forth in SEQ ID NOs: 29-37.
[0068]
(B) Synthesis of A fragment
Based on the sequence of the A fragment isolated from Brevibacterium flavum MJ-233, it was synthesized using a 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems.
[0069]
In addition, artificially designed A fragments, that is, an SD sequence other than the isolated sequence, a sequence in which the distance between the SD sequence and the translation initiation codon was changed, and a sequence in which the upstream of the SD sequence was modified were variously synthesized.
[0070]
The synthesized sequences are as follows (SEQ ID NOs: 1 to 20).
(A) Sequence synthesized based on upstream sequence of isolated gene
[0071]
[Chemical formula 5]

[0072]
(Ii) Sequence synthesized by adding a new sequence upstream of the SD sequence
[0073]
[Chemical 6]

[0074]
(U) Sequence synthesized by changing the distance between the SD sequence and the translation initiation codon
[0075]
[Chemical 7]

[0076]
(C) Insertion of A fragment into pgal
The synthesized DNAs complementary to the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 20 were further synthesized and each annealed to prepare a double-stranded DNA.
[0077]
10 μl of double-stranded DNA solution and 5 μl of the plasmid pgal solution prepared in Example 2 (C) above were completely digested with restriction enzymes PacI and BglII, respectively, and treated with 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. After that, both components were mixed, and each component of T4 DNA ligase 10 × buffer 1 μl and T4 DNA ligase 1 U was added thereto, made 10 μl with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound. .
[0078]
Using the resulting plasmid mixture, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and a medium containing 50 mg kanamycin [tryptone 10 g, yeast extract]. 5 g, 5 g NaCl and 16 g agar were dissolved in 1 L distilled water].
[0079]
The growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid was extracted from the culture solution, and the inserted fragment was confirmed by confirming the sequence upstream of the beta galactosidase gene according to the usual method.
[0080]
These plasmids were sequentially named pgal-1 to pgal-20.
[0081]
(D) Evaluation of A fragment
According to the method described in US Pat. No. 5,185,262, the plasmid prepared in Example 2 (C) was subjected to Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM).
BP-1497).
[0082]
The transformed Brevibacterium flavum MJ-233 cells were placed in a 10 ml semi-synthetic medium A medium [composition: urea 2 g, (NH_Four)₂SO_Four 7g, K₂HPO_Four 0.5g, KH₂PO_Four 0.5g, MgSO_Four0.5g, FeSO_Four・ 7H₂O 6mg, MnSO_Four・ 4-6H₂6 mg of O, 2.5 g of yeast extract, 5 g of casamino acid, 200 μg of biotin, 200 μg of thiamine hydrochloride and 20 g of glucose dissolved in 1 L of distilled water), and cultured with shaking at 30-33 ° C. for 12-16 hours ( Pre-culture). Next, 2% of the preculture solution was inoculated into 100 ml of medium A, and the mixture was shaken at 31 ° C. for 5 hours and cultured until the mid-logarithmic growth phase. Beta galactosidase activity was measured using this culture solution.
[0083]
Beta galactosidase activity was measured according to a conventional method [Experiments in Molecular Genetics, ed. By Jeffrey H. Miller (1977), chapter 48, Assay of β-galactosidase]. Specifically, it was performed as follows.
[0084]
After measuring the OD of the culture solution at a wavelength of 600 nm, 10 to 100 μl of the culture solution was sampled, and a buffer for measuring beta galactosidase activity [60 mM disodium hydrogen phosphate, 40 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM potassium chloride, 1 mM magnesium sulfate, 50 mM beta mercaptoethanol, pH 7.0] was added to make up the whole to 1 ml.
[0085]
Toluene was added at 0.1% and stirred vigorously for 30 seconds, then left at 37 ° C. for 45 minutes to evaporate the toluene. Subsequently, it moved to the 28 degreeC thermostat, and was left for 5 minutes, and liquid temperature was match | combined with reaction temperature.
[0086]
0.2 ml of ONPG (orthonitrophenol beta galactoside) solution (4 mg of ONPG dissolved in 1 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0)) as a substrate was added to initiate the reaction. After 1 to 10 minutes had elapsed and coloring was observed in the reaction solution, 0.5 ml of 1M sodium carbonate solution was added to terminate the reaction.
[0087]
Absorbance (OD) at wavelengths of 420 nm and 550 nm was measured with an absorptiometer, and the activity was calculated by the following formula.
[0088]
[Expression 2]
Activity (U) = (OD₄₂₀-1.75 x OD₅₅₀) / (Measurement time (minutes) x OD₆₀₀) X 1000
[0089]
As shown in Table 5 below, the region corresponding to the sequence complementary to the 3 ′ end of 16S ribosomal RNA was evaluated. As a result, compared to SEQ ID NO: 9, the central portion GGAGG is highly conserved. It was found to be highly active.
[0090]
[Table 5]
Table 5 Beta-galactosidase activity
────────────────────────────────────
Sequence used for plasmid evaluation Galactosidase activity (U)
────────────────────────────────────
pgal-1 SEQ ID NO: 1 1100
pgal-2 SEQ ID NO: 2 450
pgal-3 SEQ ID NO: 3 500
pgal-4 SEQ ID NO: 4 500
pgal-5 SEQ ID NO: 5 400
pgal-6 SEQ ID NO: 6 350
pgal-7 SEQ ID NO: 7 650
pgal-8 SEQ ID NO: 8 600
pgal-9 SEQ ID NO: 9 30
────────────────────────────────────
[0091]
Next, when the influence of the sequence upstream of the sequence complementary to the 3 ′ end of 16S ribosomal RNA was examined, as shown in Table 6, it was found that the activity increased when an AT-rich sequence was added. .
[0092]
[Table 6]
Table 6 Beta-galactosidase activity
────────────────────────────────────
Sequence used for plasmid evaluation Galactosidase activity (U)
────────────────────────────────────
pgal-1 SEQ ID NO: 1 1100
pgal-2 SEQ ID NO: 2 450
pgal-10 SEQ ID NO: 10 1700
pgal-11 SEQ ID NO: 11 1000
pgal-12 SEQ ID NO: 12 2000
pgal-13 SEQ ID NO: 13 1300
────────────────────────────────────
[0093]
Sequence complementary to the 3 'end of 16S ribosomal RNAinclude SD ArrayWhen the distance between the translation initiation codon and the translation initiation codon was changed, as shown in Table 7, an increase in activity was observed in the case of 8 bp to 14 bp, particularly in the case of 12 bp.
[0094]
[Table 7]
Table 7 Beta-galactosidase activity
────────────────────────────────────
Sequence used for plasmid evaluation Galactosidase activity (U)
────────────────────────────────────
pgal-14 SEQ ID NO: 14 1100
pgal-13 SEQ ID NO: 13 1300
pgal-15 SEQ ID NO: 15 1800
pgal-16 SEQ ID NO: 16 900
pgal-17 SEQ ID NO: 17 400
pgal-18 SEQ ID NO: 18 1800
pgal-12 SEQ ID NO: 12 2000
pgal-19 SEQ ID NO: 19 2500
pgal-20 SEQ ID NO: 20 1600
────────────────────────────────────
[0095]
【The invention's effect】
According to the present invention, by improving the SD sequence, improving the upstream sequence of the SD sequence, and improving the distance between the SD sequence and the translation initiation codon, the protein can be efficiently translated and expressed in a large amount in the cell. It becomes possible.
[0096]
[Sequence Listing]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

[0127]

[0128]

[0129]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133]

[0134]

[0135]

[0136]

[0137]

[0138]

[0139]

[0140]

Claims

A 6-12 base rRNA complementary base sequence in which at least 6 bases are complementary to the 1-12th base sequence at the 3 ′ end of 16S ribosomal RNA derived from coryneform bacterium, and the rRNA complementary base sequence It further has a sequence of 20 bases or more selected from a base sequence at positions 10 to 34 of SEQ ID NO: 10 and a base sequence at positions 10 to 35 of SEQ ID NO: 12 linked upstream. Recombinant DNA for efficiently translating proteins in coryneform bacteria.

The DNA according to claim 1, wherein the rRNA-complementary base sequence is a base sequence represented by SEQ ID NO: 29 in the sequence listing .

A sequence of 20 bases or more selected from the base sequence at positions 10 to 34 of SEQ ID NO: 10 and the base sequence at positions 10 to 35 of SEQ ID NO: 12 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 of the sequence list The DNA according to claim 1 or 2 .

The DNA according to any one of claims 1 to 3, wherein the coryneform bacterium is Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497).

The DNA according to any one of claims 1 to 4, wherein the complementary base sequence is replicated in a coryneform bacterium located 4 to 16 bases upstream of the translation initiation codon of the protein to be expressed. Possible plasmid.

Coryneform bacterium comprising the DNA according to any one of claims 1 to 4, wherein the SD sequence contained in the complementary base sequence is located 12 bases upstream of the translation initiation codon of the protein to be expressed. A plasmid that can replicate within.

Using a plasmid capable of replicating in a coryneform bacterium, wherein the DNA according to any one of claims 1 to 4 is placed upstream of a translation initiation codon of a protein to be expressed, A method of expressing a protein in coryneform bacteria.