JP3814482B2 - Rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene - Google Patents

Rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene Download PDF

Info

Publication number
JP3814482B2
JP3814482B2 JP2000544812A JP2000544812A JP3814482B2 JP 3814482 B2 JP3814482 B2 JP 3814482B2 JP 2000544812 A JP2000544812 A JP 2000544812A JP 2000544812 A JP2000544812 A JP 2000544812A JP 3814482 B2 JP3814482 B2 JP 3814482B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
sequence
rice
vector
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2000544812A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
輝彦 寺川
久和 長谷川
将憲 山口
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hokko Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Hokko Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hokko Chemical Industry Co Ltd filed Critical Hokko Chemical Industry Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of JP3814482B2 publication Critical patent/JP3814482B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C12N15/8254—Tryptophan or lysine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼの遺伝子と、該遺伝子に関連するＤＮＡに関する。詳しく言えば、本発明はイネ植物のリジンの生合成経路に関与するジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする新規なＤＮＡに関する。また、本発明は、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有する新規なタンパク質をコードするＤＮＡにも関する。さらに本発明は、それら新規なＤＮＡで形質転換された大腸菌、あるいはそれら新規なＤＮＡで形質転換されたイネ植物とその種子も包含する。
【０００２】
さらに、本発明は、新規なＤＮＡを組込んだ新規な組換えベクターも包含する。
【０００３】
背景技術
イネ、トウモロコシ、コムギなどの穀物種子は、人や家畜等にとって重要な栄養源である。しかし、これらの種子は、必須アミノ酸の一つであるリジン含量が低いことから栄養価が多少とも劣っている。高いリジン含量をもち栄養価に優れた穀物種子を産生できる植物の新品種を作出することが望まれている。
【０００４】
植物体中のリジンの生合成経路であるジアミノピメリン酸経路において、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドとピルビン酸とがジヒドロジピコリネートシンターゼ（以下、「ＤＨＤＰＳ」と略すことがある）の作用によって縮合結合することにより、２，３−ジヒドロピコリン酸が生成し、これからさらに５段階の酵素反応によりジアミノピメリン酸を生成し、これを経てリジンが生成することが知られている。（生化学実験講座、第１１巻、５１１頁〜５１７頁、東京化学同人）。従って、ＤＨＤＰＳは、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドとピルビン酸とを縮合結合することにより２，３−ジヒドロピコリン酸を生成する活性を有する酵素タンパク質であることが知られている。
【０００５】
ＤＨＤＰＳをコードする遺伝子すなわちＤＨＤＰＳ遺伝子を、トウモロコシ、タバコ、ナタネ、ダイズなどの有用植物体中に導入しその遺伝子の機能を発現させることにより、それら形質転換植物の種子中のリジン含量を向上することが報告されている（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／１５３９２号公報、特表平７−５０４８２１号、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１３巻、５７７頁〜５８２頁、１９９５年）。
【０００６】
これまで、ＤＨＤＰＳの遺伝子はコムギ、トウモロコシ、ダイズおよびタバコの植物より取得され、それら遺伝子のＤＮＡの塩基配列が解明されている。例えば次の技術が幾つかの文献に報告されている。
【０００７】
（１）コムギのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列の解析とＤＨＤＰＳ遺伝子の単離（特開平３−１２７９８４号公報）。
【０００８】
（２）トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の単離とそのＤＮＡの塩基配列の解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２２８巻、２８７頁〜２９３頁、１９９１年）。
【０００９】
（３）トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変型ＤＮＡを用いるトウモロコシの形質転換と、種子のリジン含量の向上（米国特許５５４５５４５号明細書）。
【００１０】
（４）タバコのＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡを改変して、植物体中のリジン含量を高め得るようにＤＮＡでコードされるＤＨＤＰＳのリジンによるフィードバック阻害感受性を解除されてある改変ＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、第８巻、５号、７３３頁〜７４３頁、１９９５年）。
【００１１】
（５）ダイズのＤＨＤＰＳ遺伝子（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻、９８９頁〜９９３頁、１９９４年）。
【００１２】
（６）細菌例えば大腸菌のＤＨＤＰＳ遺伝子を用いる形質転換により植物の種子のリジン含量を向上させる方法（欧州特許出願公開第０４８５９７０Ａ２号公報）。
【００１３】
しかし、本発明者らの知る限りでは、イネのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列を解析したこと、及びイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を取得できたことを報告する文献は知られていないし、またイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を利用することを報告する文献も知られていない。
【００１４】
本発明の目的の一つは、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子をイネ植物から取得して提供することにある。本発明の別の目的は、イネのＤＨＤＰＳタンパク質のＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードできる新規なＤＮＡを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードできる新規なＤＮＡによって、トウモロコシ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギなどの有用植物を形質転換することであり、また高いリジン含量をもつ種子を産生できる有用植物の新しい形質転換品種を提供することである。
【００１５】
本発明のその他の目的は、後記の説明から明らかになるであろう。
【００１６】
発明の開示
上記の諸目的を達成するために、本発明者らは一連の種々研究を行った。先づ、イネ植物からＤＨＤＰＳ遺伝子を取得するための研究を行った。この研究の結果、イネの幼植物体の組織、例えば緑色の茎葉の破砕物から全ＲＮＡを遺伝子工学技術で知られる方法により抽出し、その抽出された全ＲＮＡからｍＲＮＡを常法により単離し、そのｍＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを収得することに成功した。得られたｃＤＮＡは、λｇｔ１１ファージベクターのＥｃｏＲＩ切断片の末端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで処理したファージベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製の市販品）に連結すると、複製可能な組換えラムダ−ファージを構築できることが多くの試行錯誤の結果により知見された。
【００１７】
その組換えラムダーファージを大腸菌Ｙ１０８８に感染させ、インキュベートすると、多数のプラーク（溶菌斑）として組換えλファージの多数が得られること、また得られた多数のプラークに含まれる組換えλファージ群は、イネ由来のｃＤＮＡを含有する各種多様なファージであってイネのｃＤＮＡライブラリーとして利用できることが知見された。
【００１８】
他方、日本特開平３−１２７９８４号明細書に記載されたコムギのＤＨＤＰＳタンパク質のアミノ酸配列と、これから推認されるＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列、ならびに文献「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２２８巻、２８７〜２９３頁（１９９１年）に記載されたトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列を参照しながら、ＰＣＲ法のプライマーとして適すると考えられた２５個のヌクレオチドからなる第１のオリゴヌクレオチドと、２４個のヌクレオチドからなる第２のオリゴヌクレオチドとを本発明者は、化学合成により作製した。
【００１９】
前記の第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドと前記のイネのｃＤＮＡライブラリー（すなわち前記の組換えλファージ）との混合物を用いてＰＣＲ法増幅反応を行うと、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法で所要なプライマー（相補的ＤＮＡ）として働くことができ、前記のイネｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡがテンプレートとして利用することができ、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子由来のｃＤＮＡの一部分を増幅できることが認められた。そしてＰＣＲ増幅反応液からイネＤＨＤＰＳ遺伝子由来のｃＤＮＡの一部分の増幅生成物を、プローブＤＮＡとして回収することに成功した。
【００２０】
このように収得された上記のプローブＤＮＡをスクリーニング材料として用いるファージプラーク−ハイブリダイゼーション法によって、先に得られたイネのｃＤＮＡライブラリー（すなわち前記の組換えλファージの３０万個のプラーク）から、多くの試行錯誤の試験の結果としてイネのＤＨＤＰＳ遺伝子を組込まれた組換えλファージのプラークの４個を単離することに幸にも成功した。それら４個のプラークの組換えλファージを別々に増幅した後に、各々のλファージＤＮＡを常法で単離した。こうして得られた４種類のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡ断片は相互に比較すると、同一の塩基配列を有するものであることが認められ、そしてコムギおよびトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡ配列との比較から、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片であると認定された。
【００２１】
上記のようにして得られた、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当すると認められるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得られたＤＮＡ断片は、これを次に、市販の既知のプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーションキットにより挿入、連結することができた。こうして得られた組換えプラスミドベクターで大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換することができた。得られた大腸菌形質転換体をインキュベートして多数の菌体を得ることができた。得られた菌体からプラスミドを採取し、得られたプラスミドＤＮＡから、制限酵素でイネ由来のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を切出した。切出されたＤＮＡ断片を、ＤＮＡの塩基配列の解析にかけることによって、このＤＮＡ断片に含有されて且つイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当すると判定されたＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するものであると確認された。
【００２２】
さらに、本発明者らの知る限りでは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、何れの文献にも記載されていない新規なＤＮＡ配列であると認められた。
【００２３】
配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡでコードされるタンパク質は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であると認められ、またこのタンパク質はイネのＤＨＤＰＳを構成するタンパク質であると認められる。
【００２４】
従って、第１の本発明においては、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するイネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードするＤＮＡが提供される。
【００２５】
第１の本発明によるＤＮＡは、具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡであることができる。
【００２６】
第１の本発明のＤＮＡは、イネのＤＨＤＰＳであるタンパク質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、本発明者らの研究を行うに際しては、前述のように、イネのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の技法で取得されたものである。しかし、そのＤＮＡの塩基配列が本発明で明らかにされたので、配列表の配列番号１の塩基配列を参照してヌクレオチドから化学合成によっても取得することができる。また、前記の塩基配列を参照して合成ヌクレオチドをプローブとして作製して用いるか、もしくはその合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる公知の方法によってイネ染色体のＤＮＡライブラリーから、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の方法又はハイブリダイゼーションによって第１の本発明のＤＮＡを取得することもできる。
【００２７】
以下に、イネの茎葉から遺伝子工学の技法によって、第１の本発明によるＤＮＡを取得する方法を概略的に説明する。
【００２８】
（１）イネｍＲＮＡの調製およびイネのｃＤＮＡライブラリーの構築
イネ（Ｏｒｉｚａ ｓａｔｉｖａ）の種々な組織、例えば茎葉、根、カルスなどの組織、好ましくは緑色の茎葉から、常法により全ＲＮＡを抽出する。抽出された全ＲＮＡから蛋白質などの夾雑物を除いた後、さらにオリゴｄＴセルロースの充填カラムに通してｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製することによって、イネのｍＲＮＡを得ることができる。
【００２９】
次に、ｍＲＮＡから市販のｃＤＮＡを合成キットによりイネのｃＤＮＡを合成する。合成されたｃＤＮＡをファージベクター、例えばλ ｇｔ１１ベクター又はλ ＺＡＰＩＩベクターなどに組み込み、多数の組換えファージを得る。それら組換えファージを宿主として大腸菌に感染させ、インキュベートすると、プラークとして多数の組換えファージを得ることができる。これら一連の操作は、市販のｃＤＮＡクローニングキットを使用して実施できる。
【００３０】
このように宿主大腸菌の溶菌のプラークとして得られた多数の組換えファージは、イネ由来の全ｃＤＮＡを含有する多種多様のファージから成るものであるから、イネのｃＤＮＡライブラリーとして利用できる。
【００３１】
（２）ＰＣＲ法用のプライマーの構築
コムギのＤＨＤＰＳ遺伝子の既知の塩基配列（例えば、日本特開平３−１２７９８４号明細書に記載されるＤＮＡ配列）と、トウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の既知の塩基配列（例えば、前出の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２２８巻、２８７〜２９３頁に記載のＤＮＡ配列）とを相互に比較し且つこれらとの間で共通に保存されている塩基配列があることを本発明者は見出した。このように見出された共通の塩基配列を参照して、本発明者らは２種類のオリゴヌクレオチド（後記の配列表の配列番号３および４のオリゴヌクレオチド）をＰＣＲ法用のプライマー（相補的ＤＮＡ）として化学合成により作製して構築した。
【００３２】
（３）プローブＤＮＡの作製
先に多数の組換えファージからなるプラークとして得られたイネのｃＤＮＡライブラリーの中で、所望のイネＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡを選択的に増幅するために、前記の合成オリゴヌクレオチドよりなるプライマーを使用し、それで、ＰＣＲ法によりテンプレートとしてのイネｃＤＮＡライブラリーからイネＤＨＤＰＳ遺伝子の一部分をコードするＤＮＡを増幅する。
【００３３】
増幅反応をＰＣＲ法によって反復した後に、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列のうちの一部分であるＤＮＡ断片の増幅生成物を、増幅反応液から、プローブＤＮＡとして採取する。
【００３４】
（４）イネｃＤＮＡライブラリーからのイネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡの選択
先にイネのｃＤＮＡライブラリーとして得られた組換えファージの多数のプラークの中から、上記のプローブＤＮＡをスクリーニング材料として利用するファージプラーク−ハイブリダイゼーション法により、目的のイネＤＨＤＰＳ遺伝子に全体的に対応するＤＮＡ配列を組込まれた組換えファージよりなる数個のプラークを選抜する。
【００３５】
これによって、イネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡに相当する目的のＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片が該ＤＮＡ断片を組込んでいる組換えファージの形で採取できる。
【００３６】
すなわち、詳しく言えば、上記のようなプラーク・ハイブリダイゼーションで選抜されたプラークのファージを採取して、さらに採取ファージからファージＤＮＡを回収する。回収したファージＤＮＡをジデオキシ法などで処理することにより、イネ由来の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定することができる。そのイネ由来の挿入ＤＮＡ配列の塩基配列中のタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム）から規定されるアミノ酸配列を、既知のトウモロコシＤＨＤＰＳやコムギＤＨＤＰＳのタンパク質のアミノ酸配列に対して比較すると、相同性を判定することにより、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に対応するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であることを特定できる。
【００３７】
従って、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有すると判定された挿入ＤＮＡ断片は、上記のように選抜された採取ファージのファージＤＮＡから制限酵素で切出して収得できる。
【００３８】
（５）イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するｃＤＮＡのクローニング
上記のようにイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡ断片として、ファージから切出して収得されたＤＮＡは、これをプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位に挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築する。このように構築された組換えプラスミドベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換する。こうして得られた大腸菌形質転換体を培養して増殖させると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を担う前記の組換えプラスミドをクローニングできる。従って、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片がクローニングできる。
【００３９】
（６）クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析
上記のクローニングされた組換えプラスミドから適当な制限酵素により遺伝子に該当のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片を切り出す。切り出されたＤＮＡ断片を市販の塩基配列決定キットで処理すると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に該当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡの塩基配列を決定できる。このように決定された塩基配列をもち且つイネＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載されてある。
【００４０】
前記に説明したように収得された第１の本発明のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片をプローブとして用いると、常法によってイネ染色体自体からもＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡを取得し得る。しかし、イネ染色体自体から得たＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡは、イントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているＤＮＡも、イネＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡである限り、第１の本発明のＤＮＡに含まれると認められる。
【００４１】
なお、後記の実施例１で得られて且つ配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するイネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片は、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミドベクターに挿入、連結された。このように得られた組換えプラスミドベクターの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＡＰ８−１と命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９６年１０月１４日に、ＦＥＲＭ Ｐ−１５９０６の受託番号で寄託されている。さらに、エシエリヒア・コリＤＡＰ８−１は、１９９８年３月２６日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３１０の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【００４２】
第１の本発明によるＤＮＡは、本発明で解明された該ＤＮＡの塩基配列を指針として用いることによって、イネのＤＨＤＰＳタンパク質を化学合成により多量に収得たることを可能にしている点で有用であり、そしてイネのＤＨＤＰＳタンパク質の酵素学的研究を進めるのに貢献できるものである。
【００４３】
さらに、第１の本発明によるＤＮＡ配列、またはそのＤＮＡ配列を含有する適当なＤＮＡ断片は、それの末端をＥｃｏＲＩリンカーと連結した後に、市販のプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造株式会社製、日本）のＥａｃプロモーターの下流にあるＮｃｏＲＩ切断部位に挿入することにより、組換えベクターを構築できる。このように構築された組換えベクターで形質転換された大腸菌は、培養されると、細胞中にＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質を生産することができると期待される。従って、第１の本発明によるＤＮＡを発現できるように前記の組換えベクターを導入されて形質転換された大腸菌を培養すると、イネＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質を製造できると期待される。
【００４４】
他方、一般的には、生理活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失されるか、及び（又は）他のアミノ酸に置換されるか、及び（又は）１個もしくは複数個のアミノ酸が該アミノ酸配列中に付加されたアミノ酸配列でも、元のアミノ酸配列のタンパク質の生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。第１の本発明のＤＮＡは、その塩基配列の一部分又は数部分に修飾が加えられた後にも、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが可能である。
【００４５】
換言すれば、第１の本発明によるＤＮＡは、それの塩基配列の中の１個又は複数個の塩基、例えば１、２又は３〜１０個の塩基を別の塩基に改変された後にも、ＤＨＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードする能力を保有することができる。
【００４６】
従って、第２の本発明においては、後記の配列表の配列番号６または配列番号８に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡすなわち、請求項１のＤＮＡまたは請求項３のＤＮ Ａが提供される。
【００４７】
第２の本発明によるＤＮＡは、第１の本発明によるＤＮＡから改変されたＤＮＡであり、この第２の本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、ＤＮＡでコードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸が上記のような仕方で欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列をもつタンパク質をコードするように、第１の本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００４８】
また、第１の本発明のＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を包有する細胞に変異処理を行い、変異した細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるが配列番号１の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するＤＮＡを選別することによっても、第２の本発明の改変されたＤＮＡを得ることができる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、第１の本発明のＤＮＡに対するいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、これを明確に数値で特定化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い２つの核酸同志、高い相同性を有する例えば９８％以上の相同性を有するＤＮＡ同志がハイブリダイズすることを許すが、それより相同性が低い核酸同志がハイブリダイズすることを許さない条件が挙げられる。
【００４９】
従って、第２の本発明によるＤＮＡは、その具体例として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有するが、配列番号１に記載の前記の塩基配列に対して高い相同性を示すＤＮＡであって、しかも配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることができる。
【００５０】
第２の本発明によるＤＮＡの具体的な例には、後記の実施例２に記載された方法で作製されて実施例２で改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（請求項２）と、後記の実施例３に記載された方法で作製されて実施例３で改変ＤＮＡ−１６６Ａと命名されたＤＮＡ配列（請求項４）とがある。
【００５１】
その改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（請求項２）は、後記の配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡである。これは配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する第１の本発明ＤＮＡの中にある４７２番目、４７３番目、４７４番目のＡＡＣ配列（アスパラギンをコードするコドン）での４７３番目の塩基Ａ（アデニン）１個をＴ（チミン）１個に置換して、塩基配列の４７２〜４７４番目に配列ＡＴＣ（イソロイシンをコードするコドン）が在るように改変されたＤＮＡに相当する。この改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列は、第１の本発明のＤＮＡに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできる。
【００５２】
この配列番号５の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列でコードされるタンパク質は、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するものであり、ＤＨＤＰＳ活性を有する（請求項１、参照）。
【００５３】
さらに、配列番号８のアミノ酸配列をもち且つＤＨＤＰＳ活性をもつタンパク質（請求項３参照）をコードする上記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（請求項４、参照）は、配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するＤＮＡである。これは、配列番号１に記載の塩基配列を有する第１の本発明ＤＮＡの中にある４９６番目、４９７番目、４９８番目のＧＣＡ配列（アラニンをコードするコドン）での４９７番目の塩基Ｃ（シトシン）１個をＴ（チミン）１個に置換して、塩基配列の４９６〜４９８番目に配列ＧＴＡ（バリンをコードするコドン）が在るように改変されたＤＮＡに相当する。この改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列は、第１の本発明のＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる。
【００５４】
この改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列でコードされるタンパク質は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するものであり、ＤＨＤＰＳ活性を有する（請求項３、参照）。
【００５５】
第２の本発明による改変ＤＮＡの更に別の例は、配列表の配列番号１に示す塩基配列における、４７３番目のアデニンをチミンに置換し且つ４９７番目のシトシンをチミンに置換して形成された塩基配列を有するＤＮＡ配列であり、このＤＮＡ配列によっては、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列における１５８番目のアスパラギンをイソロイシンに置換し且つ１６６番目のアラニンをバリンに置換して形成されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質がコードされる。
【００５６】
一般的には、ＤＮＡ配列の一部分の領域にある塩基配列を改変する方法として、（Ｋｕｎｋｅｌ法「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１５４巻３６７号）、およびオリゴヌクレオチド−ダイレクト デュアルアンバー法、さらにその他の方法が知られている。
【００５７】
本発明の本来の目的は、高いリジン含量をもつ種子を産生できるように形質転換された新品種植物を創成することにあることから、リジンの生合成経路に関与するＤＨＤＰＳが生合成生成物としてのリジンによる酵素活性のフィードバック阻害を受けなくなるように酵素活性を改質されたＤＨＤＰＳ、ならびにこの改質ＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡが必要とされる。そこでリジンによるフィートバック阻害についての酵素の感受性を解消されたように改質された新規なＤＨＤＰＳをコードできる新規な改変ＤＮＡを第１の本発明のＤＮＡから作製することを目的として、先づ本発明者らは研究を行った。その結果、既知のＫｕｎｋｅｌ法の改良法と、オリゴヌクレオチド−ダイレクト デュアルアンバー法の改良法とを組合せることによって、イネのＤＨＤＰＳをコードする第１の本発明の塩基の配列の一部領域における１個又は２個又はそれ以上の塩基を別の塩基に置換することが可能であることを本発明者らは、知見した。
【００５８】
更に、前記の米国特許第５５４５５４５号明細書に記載されるトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変に関する従来技術および前記の「Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ」８巻、５号、７３３〜７４３頁に記載されるタバコのＤＨＤＰＳ遺伝子の改変に関する技術、ならびに欧州特許出願公開第０４８５９７０Ａ２号明細書に記載される細菌のＤＨＤＰＳ遺伝子を用いる植物の形質転換に関する技術を参照しながら、本発明者らは、第１の本発明のＤＮＡの配列表、配列番号１に記載の塩基配列の４７３番目の塩基、アデニン（Ａ）をチミン（Ｔ）に取代えるか又は４９７番目の塩基、シトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）に取代えて得られた改変ＤＮＡが、リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素活性を有するように改質された酵素タンパク質であって且つＤＨＤＰＳ活性を維持できる新規なタンパク質をコードできるはずであるとの予想的な着想を今回、得た。
【００５９】
この着想に基づいて、本発明者らは、種々の研究を行ったが、多くの試行錯誤の試験の結果として、第１の本発明の新規ＤＮＡの作製にあたり構築された、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片〔すなわち、λファージから前記のとおり切出したＤＮＡ断片、すなわち配列表の配列番号１のＤＮＡ配列（これは以下ではＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３と称す）を含有するＤＮＡ断片〕をプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位とＳａｃ Ｉ切断部位との間にＤＮＡリゲーションキットにより挿入、連結してなる組換えプラスミドベクター（以下、ｐ ＤＡＰ８−１と称する）が目的の新規な改変ＤＮＡの作製のための出発材料として適することを認めた。
【００６０】
また、このような目的の新規な改変ＤＮＡを、前記の出発材料、組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１がらＰＣＲ法に準じて作製するために適当に使用できるプラマーとして、５種類のプライマー、すなわち、後記の配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプラマーＮｏ．３と、配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＮｏ．４と、配列番号１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＦＷ−１と、配列番号１２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＲＶ−１と、配列番号１３に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドよりなるプライマーＢＳ ＫＰＮ−１）を化学合成により本発明者は作製した。
【００６１】
上記のプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１と、上記の５種の合成オリゴヌクレオチドよりなるプライマーとを利用して、後記に詳述される方法を実施すると、第２の本発明による改変ＤＮＡの具体的な例である配列表、配列番号５に記載のＤＮＡ、すなわち前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片、ならびに配列番号７に記載のＤＮＡ、すなわち前記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を収得することに成功できたのである。
【００６２】
第１の本発明によるＤＮＡも、また改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列も、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列も、これを組換えベクターに組込んで後記の実施例４又は５に記載される植物体への外来遺伝子の導入方法によりイネ植物に導入されると、その形質転換されたトランスジェニック植物の中で発現することができた。
【００６３】
そして、第１の本発明ＤＮＡ、または第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列あるいは改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列で形質転換されたイネのトランスジェニック植物は、リジン含量を増強されたイネ植物細胞あるいはイネ種子を産生することができることが確認された。
【００６４】
次に、第２の本発明による上記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するのに、好適に使用でき且つ後記の実施例２において例示される手順よりなるＤＮＡの改変方法を要約的に説明する。
【００６５】
（１）第１の本発明のＤＮＡのクローニング
配列表の配列番号１に記載される１１４３個の塩基からなる第１の本発明のＤＮＡ、すなわち前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有するＤＮＡ断片を、ＤＮＡリゲーション・キットの利用により、ベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入、連結することによって、前記の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１を得る。このベクターｐ ＤＡＰ８−１を大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入し、これで得られた形質転換大腸菌を増殖する。増殖された大腸菌細胞から、常法で抽出することにより組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１を多量に収得する。このベクターは、ＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有するＤＮＡ断片のコピーを多量に含むから、第１の本発明ＤＮＡがクローニングされたことになる。
【００６６】
（２）ＰＣＲ用のプライマーの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１，アプライド バイオシステムズ社製）を利用して、下記の塩基配列を有する５種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成する。
【００６７】
（ａ）プライマーＮｏ．３（配列表の配列番号９に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＡＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣ−３′
（ｂ）プライマーＮｏ．４（配列表の配列番号１０に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣ−３′
（ｃ）プライマーＦＷ−１（配列表の配列番号１１に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧ−３′
（ｄ）プライマーＲＶ−１（配列表の配列番号１２に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３′
（ｅ）プライマーＢＳＫＰＮ−１（配列表の配列番号１３に記載され且つ下記される塩基配列をもつプライマー）：５′−ＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧ−３′
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
所要なＤＮＡ断片を増幅して得るために、ＰＣＲ法の第１回段階として２つの反応、すなわち後記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行う。
【００６８】
その（Ａ）反応は、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１と、プライマーとして用いられる前記のプライマーＦＷ−１（配列番号１１の合成オリゴヌクレオチド）と、プライマーＮｏ．３（配列番号９の合成オリゴヌクレオチドであり、５′−末端から１５〜１７番目のＧＡＴが−ＤＮＡ−１５８Ｎ配列の改変部ＡＴＣを誘導できる）とを、ＰＣＲ法用の通常の反応液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、４種のデオキシヌクチオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびＬａＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有）に加え、次いで増幅反応を行うことから成る。この（Ａ）反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列をもつＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ａと称す）が増幅反応により生成される。
【００６９】
また（Ｂ）反応は、前記のプライマーＲＶ−１（配列番号１２の合成オリゴヌクレオチド）と、プライマーＢＳ ＫＰＮ−１（配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドと、テンプレートとして用いられる前記のベクターｐ ＤＡＰ８−１とを、（Ａ）反応で用いたと同じＰＣＲ法用の通常の反応液に加え、次いで増幅反応を行うことから成る。この（Ｂ）反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列を含有し且つ３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｂと称す）が増幅反応により生成される。
【００７０】
ＰＣＲ法による上記の増幅反応は、市販のＰＣＲ反応装置を用いて実施できる。
【００７１】
増幅反応の終了後に、上記の（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画して、増幅生成物としての４８０ｂｐ（ベースペア）のＤＮＡ断片−Ａを含むバンドをアガロースゲルから切出す。また、上記の（Ｂ）反応の増幅反応液を同様に低融点アガロース電気泳動により分画し、そしてそのアガロースゲルから１２００ｂｐ（ベースペア）のＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドを切出す。
【００７２】
次いで、それら２つのゲル切片をＤＮＡ精製キット、例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩキット（フナコシ社製）により精製することにより、ＤＮＡ断片−Ａの精製品と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品とをそれぞれ回収する。
【００７３】
さらに、ＰＣＲ法の第２回段階として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうちの４７３番目のアデニンをチアミンに置換してなる塩基配列をもつＤＮＡ配列（すなわち配列番号３の塩基配列をもつ第２の本発明のＤＮＡ−１５８Ｎ断片に相当する配列）を含み且つ該ＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有する配列長１２００ｂｐのＤＮＡ断片を作製する工程を行う。このためには、テンプレートとして用いられる前記の（Ａ）反応の増幅生成物であるＤＮＡ断片−Ａの精製品（配列長４８０ｂｐ）と、（Ｂ）反応の増幅生成物であるＤＮＡ断片−Ｂの精製品（配列長１２００ｂｐ）と、前記のプライマーＲＶ−１（配列番号１２の合成オリゴヌクレオチド）と、前記のプライマーＦＷ−１（配列番号１１の合成オリゴヌクレオチド）とを、ＰＣＲ法用の通常の増幅反応液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、４種のｄＮＴＰ、およびＬａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有）に加え、次いで増幅反応を行う。その反応終了後に、その反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、そのアガロースゲルから、配列長１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｃと称す）を含有するバンドを切出す。
【００７４】
そのゲル切片を、ＤＮＡ精製キット、例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（フナコシ社製）により精製して、ＤＮＡ断片−Ｃの精製品を得る。このＤＮＡ断片−Ｃは、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片に相当する塩基配列を内部に含有し且つＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有する構造をもつものである。
【００７５】
（４）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
次に、上記の（３）項で得られたＤＮＡ断片−Ｃを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列（第２の本発明による改変型ＤＮＡの第１例）を含有するＤＮＡ断片を収得する。
【００７６】
そのためには、先づ、上記のＤＮＡ断片−Ｃの５′−及び３′−末端における延伸部を、制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＳａｃＩで処理する。
【００７７】
これによって、ＤＮＡ断片−Ｃから、３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有し、且つ５′−側がＡＴＧから始まる改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を切取る。
【００７８】
このようにして、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ａ配列に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片の試料が得られる。次に、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＳａｃＩで処理することにより、５′−側の−端にＫｐｎＩ切断部位をもち且つ３′−側の他端にＳａｃＩ切断部位をもつ短縮されたプラスミド（以下では、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）−ＫｐｎＩ−ＳａｃＩ−短縮プラスミド称す）を得る。
【００７９】
このＫｐｎ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ−短縮プラスミドを前記のＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含むＤＮＡ断片試料と混合し、次いでＤＮＡリゲーション・キットで連結反応にかけると、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えプラスミド（以下では、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドと称す）を作製できる。
【００８０】
この組換えプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入して形質転換し、こうして得られた形質転換大腸菌を液体培地中で培養して増殖させる。大量に増殖された大腸菌細胞は、前記の組換えプラスミド、すなわちｐ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドのコッピイを含有する。このようにして、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列はクローニングできる。その大腸菌培養細胞から、常法により改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するプラスミドを抽出して取る。
【００８１】
（５）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片の回収
前項（４）で得られた改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するプラスミドを、次いで制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＳａｃＩで処理することによって消化する。
【００８２】
これによってＸｂａＩ切断部位に隣接する５′−側端に塩基配列ＡＴＧを有し且つ３′−側端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を有する改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片を含有する消化反応液を得ることができる。
【００８３】
この消化反応液を、低融点アガロース電気泳動により分画して、前記のＤＮＡ断片を含むバンドをアガロースゲルから切出す。切出されたアガロースゲル片をＴＥバッファーに溶解し、得られた溶液をフェノールで抽出すると、フェノール抽出液に前記のＤＮＡ断片が回収される。前記のＤＮＡ断片を含むフェノール抽出液を、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液およびエタノールを混合し、その混合物を−２０℃で約６時間放置し、さらに低温で遠心分離すると、前記のＤＮＡ断片が沈澱する。これを減圧下に乾燥すると、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するＤＮＡ断片が粉末として得られる。この改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の粉末は水に可溶性である。
【００８４】
更に、第２の本発明による前記の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するのに好適に使用でき、且つ後記の実施例３で例示されるＤＮＡの改変方法は、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の作製のための先に説明した方法と同様な手順により実施できる。
【００８５】
すなわち、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を作製するための好適な作製方法は、先づ改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の作製法の（１）項で説明したと同じ手順により、第１の本発明のＤＮＡ（すなわち、ＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３）を含有する組換えベクターｐ ＤＡＰ８−１を、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入し、大腸菌を増殖することにより成るクローニング工程から始まる。
【００８６】
次に、テンプレートとして用いられるベクターｐ ＤＡＰ８−１と、オリゴヌクレオチドとして合成されたプライマーＦＷ−１と、ブライマーＮｏ．４（配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドであり、５′−末端から１８〜２０番目のＴＡＣが改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列の改変部ＧＴＡを誘導できる）とを、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（３）項で説明された（Ａ）反応で用いたと同じＰＣＲ法用の通常の反応液に加え、次いで増幅反応を行うことから成る工程が実施される。この際の増幅反応によって、前記のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列のうちの或る領域における塩基配列をもつＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｄと称す）が生成される。
【００８７】
次に、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（３）項で説明された手順で行われる（Ｂ）反応と全く同じに、ＰＣＲ法の（Ｂ）反応を行うことから成る工程が実施される。これによって、その（Ｂ）反応から、前記ＤＮＡ断片−Ｂを増幅生成物として得る。
【００８８】
上記のプライマーＦＷ−１とプライマーＮｏ．４を用いる（Ａ）反応によって生成された前記ＤＮＡ断片−Ｄを含む増幅反応液は、これを低融点アガロース電気泳動にかけて分画する。こうして、増幅生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｄを含むバンドをアガロースゲルから切出す。また、（Ｂ）反応によって生成されたＤＮＡ断片−Ｂを含む増幅な反応液も、同様に低融点アガロース電気泳動により分画して、１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出す。さらに、ＤＮＡ精製キットによりそれらゲル切片を精製すると、ＤＮＡ断片−Ｄ精製品と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品とをそれぞれ回収できる。
【００８９】
さらに、ＰＣＲ法の第２回段階として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうちの４９７番目の塩基シトシンをチミンに置換してなる塩基配列をもつＤＮＡ配列（すなわち配列番号７の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ配列）を内部に含み且つ該ＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を延伸部とを含有する配列長１２００ｂｐのＤＮＡ断片を作製する工程を行う。このためには、テンプレートとして用いられる前記のＤＮＡ断片−Ｄの精製品（配列長４８０ｂｐ）と、ＤＮＡ断片−Ｂの精製品（配列長１２００ｂｐ）と、前記のプライマーＲＶ−１と、プライマーＦＷ−１とをＰＣＲ法用の増幅反応液に加え、次いで増幅反応を行う。その反応終了後に、その反応液を低融点アガロース電気泳動により分画する。そのアガロースゲルから、配列長１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−Ｅと称す）を含有するバンドを切出す。
【００９０】
そのゲル切片をＤＮＡ精製キットにより精製して、ＤＮＡ断片−Ｅの精製品を得る。このＤＮＡ断片−Ｅは、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当する塩基配列を内部に含有し且つＤＮＡ配列の５′−末端にＫｐｎＩ切断部位を有する延伸部と３′−末端にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部とを含有する構造をもつものである。
【００９１】
このＤＮＡ断片−Ｅを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（第２の本発明による改変型ＤＮＡの第２例）を含有するＤＮＡ断片を収得する。そのためには、ＤＮＡ断片−Ｅを制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで処理する。これによって、ＤＮＡ断片−Ｅから、３′−側にＳａｃＩ切断部位を有する延伸部を含有し且つ５′側がＡＴＧから始まる改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を切取る。
【００９２】
このようにして、改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片の試料が得られる。このＤＮＡ試料を、先に改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（４）項に記載と同じ要領でＤＮＡリゲーション・キットの利用により、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）と連結し、得られた組換えベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換し、さらに増殖することにより、クローニングできる。
【００９３】
さらに、このようにクローニングされた改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するプラスミドを大腸菌の細胞から回収する。次いで該プラスミドを、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列含有のＤＮＡ断片の製法の（５）項に記載と同じ手順により処理する。このようにすると、１１４３ｂｐのＤＮＡ断片として、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片を水溶性粉末の形で収得することができる。
【００９４】
以上の説明においては、第２の本発明の第１例による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片と、第２の本発明の第２例による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片は、遺伝工学の技法を利用する方法で作製された。しかしながら、配列表の配列番号５および配列番号７に記載の塩基配列を参照しながら、従来知られるポリヌクレオチド化学合成法によっても製造できる。
【００９５】
なお、第１の本発明のＤＮＡの塩基配列の４７３番目のアデニン又は４９７番目のシトシンを前記のようにチミンに置換する場合について、第２の本発明の具体例を説明した。しかしながら、第１の本発明のＤＮＡをテンプレートとして用い且つ適当に工夫された塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドの数種類を組合せてプライマーとして用いるならば、第１の本発明のＤＮＡの４７３番目又は４９７番目の場所とは別の場所における塩基を別の塩基に置換して形成される塩基配列を有する別例の改変ＤＮＡを作製することが可能である。
【００９６】
更に、本発明者らは別段の研究を進めた。その結果、植物体に外来遺伝子を導入して植物体を形質転換され、得られたトランスジェニック植物体で外来遺伝子を発現させるための従来知られたバイオテクノロジー技法を利用することによって、第１の本発明によるＤＨＤＰＳをコードする新規ＤＮＡも、第２の本発明によるＤＨＤＰＳをコードする新規な改変ＤＮＡも、組換えベクターによる組込んだ後に植物体に導入することができ、しかも植物体内で発現できることが知見された。
【００９７】
従って、第３の本発明（請求項５の発明）においては、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする第２の本発明に係る配列番号５または７の塩基配列をもつＤＮＡを担持する組換えベクターを導入されて形質転換されたイネ植物細胞を有し、そして導入された前記ＤＮＡが発現可能であることを特徴とする、形質転換イネ植物が提供される。
【００９８】
しかも、第１の本発明または第２の本発明によるＤＮＡの導入により形質転換された植物体が栽培すると種子を結実できる植物である場合、その植物を通常の条件で栽培して植物の種子を収獲できることが知見された。
【００９９】
従って、第４の本発明においては、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする第１の本発明のＤＮＡを担持する組換えベクターを植物細胞に導入することによって得られ且つ前記のＤＮＡが発現可能である形質転換植物を栽培し、さらにその栽培により結実した植物から採取された種子であることを特徴とする、形質転換植物の種子が提供される。
【０１００】
また、第５の本発明によると、ジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする第２の本発明によるＤＮＡを担持する組換えベクターを植物細胞に導入することによって得られ且つ前記のＤＮＡが発現可能である形質転換植物を栽培し、さらにその栽培により結実した植物から採取された種子であることを特徴とする、形質転換植物の種子が提供される。
【０１０１】
さらにまた、第６の本発明においては、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位に、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ断片をＤＮＡリゲーション・キットにより連結して形成された組換えプラスミドを含み、しかもアンピシリンの存在下でも安定に増殖できることを特徴とする、形質転換された大腸菌が新規な微生物として提供される。
【０１０２】
第６の本発明による形質転換大腸菌は、日本における工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約の規約下に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３１０で寄託されてある大腸菌ＤＡＰ８−１であることができる。
【０１０３】
第１の本発明によるＤＮＡ、あるいは第２の本発明によるＤＮＡを外来遺伝子として用いて植物を形質転換する場合には、形質転換できる植物の種類は多種多様であり、また植物の形質転換のために外来遺伝子としての本発明ＤＮＡを植物に導入する方法は、その目的で行われる従来公知のバイオテクノロジーの種々な技法であることができる。
【０１０４】
第１の本発明のＤＮＡまたは第２の本発明のＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物に導入するために好適に実施でき且つ後記の実施例４に例示される方法を以下に要約的に説明する。
【０１０５】
（１）外来遺伝子の導入用の組換えベクターの作成
従来知られるカリフラワー・モザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する既知のプラスミドベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をバッファー中で制限酵素ＸｂａＩおよび制限酵素ＳａｃＩで処理すると、３５Ｓプロモーターの下流のＸｂａＩ切断部位で切断され且つＮＯＳターミネーターの上流のＳａｃＩ切断部位で切断された約３．８ｋｂのサイズのベクターＤＮＡ断片を得る。
【０１０６】
そのベクターＤＮＡ断片の水溶液を、本発明のＤＮＡの水溶液と混合し、その混合物をＤＮＡリゲーション・キットで処理して連結反応を行う。これによると、ベクターＤＮＡ断片の３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に本発明のＤＮＡが挿入、連結されてある組換えベクターを得る。
【０１０７】
得られた組換えベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に導入して、形質転換大腸菌を得る。
【０１０８】
得られた形質転換大腸菌を、抗生物質アンピシリン含有の培地に接種、培養することにより、アンピシリン耐性の大腸菌コロニーの数個を得る。これらのコロニーを更にアンピシリン含有の培地中でそれぞれ別々に増殖させる。
【０１０９】
各コロニーごとの増殖されたアンピシリン耐性の大腸菌から、それぞれにプラスミドを回収する。回収されたプラスミドは、挿入ＤＮＡの向きが相異なる種々なプラスミドを含む。各コロニーごとに回収されたプラスミドを、制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩとで消化して切出された種々のＤＮＡ断片を含む消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、それらＤＮＡ断片の大きさ及び塩基配列を解析すると、組換えプラスミドの３５Ｓプロモーターの下流に本発明のＤＮＡを正常な向きで挿入、連結されている適当なプラスミド（約４．９ｋｂのサイズ）を選抜できる。
【０１１０】
第１の本発明のＤＮＡが正常に挿入、連結されている組換えプラスミドをベクターｐ ＤＡＰと称し、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ断片が正常に挿入、連結されている組換えプラスミドをベクターｐ １５８Ｎと称する。また、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ断片が正常に挿入、連結している組換えプラスミドを、ベクターｐ １６６Ａと称する。これらのベクターは、何れも、本発明のＤＮＡ断片と３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域とアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｒ）とを含有する。
【０１１１】
（２）イネのカルスの調製
イネの完熟種子から籾殻を除き、得られた外皮付きコメ種子をエタノール溶液で殺菌、次いで次亜塩素酸ナトリウムの希水溶液で殺菌し、さらに滅菌水で洗浄する。
【０１１２】
ＭＳ培地にショ糖、植物ホルモンとしての２，４−ＰＡ、寒天を加えてなる組成のカルス形成用培地に、前の外皮付きコメ種子を置く。２８℃で１日当り１５〜１８時間にわたり、１５００〜２５００ルックスの大陽光を照射しながら４０〜５０日間、培養すると、イネのカルスが形成される。そのカルスを種子の胚乳部分から切取り、さらに篩別により１ｍｍ以下の寸法のカルスを得る。
【０１１３】
（３）遺伝子運搬用のウイスカの調製
チタン酸カリウム製の市販ウイスカ（微細な針状体）の多数を、小型のチューブ状容器内に入れてエタノールで殺菌する。エタノールを完全に蒸発により除去する。このように殺菌されたウイスカを収納している前記のチューブ状容器に滅菌水を入れて洗浄し、該容器から遠心分離により洗液を除去する。洗浄されたウイスカを収容するチューブ状容器にＲ２液体培地を加えて、ウイスカの懸濁液を得る。
【０１１４】
（４）イネ・カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調製
前項（１）に記載したように作製された、本発明ＤＮＡを正常に挿入、連結してある組換えベクター（すなわち、前記のベクターｐ ＤＡＰ、ベクターｐ １５８Ｎ、またはベクターｐ １６６Ａ）をＴＥ緩衝液に溶解してベクター溶液を調製する。
【０１１５】
上記のウイスカ懸濁液を収容するチューブ状容器内に、前記の１ｍｍ以下の寸法のカルスを装入する。カルスの細胞量のＰＣＶ１ｍｌあたりウイスカの量が１〜１００ｍｇであるようにする。さらに容器内の混合物を攪拌し、次いで遠心分離にかける。上清を捨てると、イネのカルス細胞とウイスカとの混合物が沈殿として得られる。
【０１１６】
上記のチューブ状容器内で前記のカルス細胞とウイスカとの混合物よりなる沈殿へ、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクター（すなわちベクターｐ ＤＡＰ、ベクターｐ １５８Ｎまたはベクターｐ １６６Ａ）の溶液と、除草剤ホスフィノスリシンに耐性の遺伝子を選択マーカーとして含む既知のプラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳの溶液とを加えて、さらに十分に振り混ぜる。このようにして、カルス細胞とウイスカと、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクターと、プラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳとの均質な混合物を得る。この混合物を遠心分離と振り混ぜる操作とに反復的にかけることにより、より均質な混合物を得る。
【０１１７】
（５）イネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作
前項（４）に示されたように調製されたカルス細胞、ウイスカ、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクター、およびプラスミドベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳよりなる均質な混合物を超音波照射により処理する。用いる超音波は、１０〜６０ＫＨｚの振動数のものであることができ、照射強度は０．１〜１Ｗ／ｃｍ２であることができる。３０秒〜２分間の時間、超音波処理を行うと、超音波の物理作用とウイスカの助けにより、本発明ＤＮＡを含む組換えベクターと、選抜マーカー用のプラスミドベクターとは、カルスの細胞内に侵入して導入できる。
【０１１８】
（６）導入ベクターで形質転換されたカルス細胞の選抜
上記のように超音波処理された混合物を、Ｒ２液体培地で洗浄し、洗浄された混合物を遠心分離にかけて、ウイスカからカルス細胞を分離する。分離されたカルス細胞は、上記のプラスミドベクターを細胞内に導入されて含有する形質転換細胞である。
【０１１９】
プラスミドベクターを含有するカルス細胞を、Ｒ２培地にショ糖、植物ホルモン２，４−ＰＡを添加してなる植物細胞培養用の培地に入れて、１５００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜２０時間照射しながら２７〜２９℃で振とう培養する。これによって、カルス細胞は細胞分裂を起こして増殖する。
【０１２０】
培養を２〜３日行った後に、得られた分裂した植物細胞の懸濁液を、Ｎ６培地にショ糖、２，４−ＰＡ、ゲルライト及び除草剤ホスフィノスリシンを添加してなる選抜用培地（半固体状である）の上に均一に広げて加える。さらに、１５００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜２０時間照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。こうしてホスフィノスリシン耐性であり且つ導入ベクターで形質転換された植物細胞が得られる。
【０１２１】
（７）形質転換植物細胞の再選抜
上記のように得られたホスフィノスリシン耐性の形質転換植物細胞の中から、本発明ＤＮＡを外来遺伝子として十分に有効な量で含有する形質転換植物細胞のみを再選抜する。
【０１２２】
このために、前者の形質転換細胞を、Ｎ６培地にショ糖と、２，４−ＰＡと、ゲルライトと、リジンのアナログ体であるＡＥＣ（すなわちＳ−（２−アミノエチル）システイン）とを添加してなる再選抜用培地上に移植する。
【０１２３】
移植された細胞を、１日当り１５〜１６時間、１８００〜２０００ルックスの光で照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。
【０１２４】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子として十分に有効な量で含有する形質転換植物細胞は、培地中に細胞増殖阻害剤として作用するＡＥＣが存在していてもＡＥＣ耐性であって、生育できる。ＡＥＣ添加の上記培地で生育できたＡＥＣ耐性の培養植物細胞を選抜する。
【０１２５】
（８）再選抜されたＡＥＣ耐性の形質転換植物細胞からの植物体の再生
上記のように再選抜されたＡＥＣ耐性の培養植物細胞を、植物組織培養用のＭＳ培地にショ糖、植物ホルモンとしてのベンジルアデニン、ナフタレン酢酸、ゲルライトを添加してなる植物体再生用の分化培地に移植する。
【０１２６】
移植された細胞を、１８００〜２０００ルックスの光を１日当り１５〜１６時間照射しながら２７〜２８℃で２５〜３０日間培養する。このようにすると、培養された形質転換植物細胞から、分化により、芽と根が再生できる。
【０１２７】
再生した芽と根を含有する幼芽が長さ１０〜３０ｍｍに生育した後に、その幼芽を、ＭＳ培地にショ糖とゲルライトを添加してなる順化用の培地に移植する。さらに、１日当り１５〜１６時間、１８００〜２０００ルックスの光を照射しながら２７〜２８℃で１８〜２０日間育成する。
【０１２８】
このようにして、形質転換植物が再生できる。こうして得られた植物体は、温室内で土壌に移植して通常の条件下で栽培すると、順長に生育して３〜６ケ月の栽培でイネ種子を結実できる。
【０１２９】
（９）導入した外来遺伝子の確認
上記のように再生された形質転換イネ植物から緑色の葉を採取する。採取された葉を液体窒素で凍結した後に破砕する。その葉破砕物から、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載）に準じてＤＮＡを抽出する。
【０１３０】
他方、後記の配列表の配列番号１４に記載される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成して、プライマー用に用いる。
【０１３１】
再生イネ植物体から上記のように抽出されたＤＮＡをテンプレートとして用い且つ上記の２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡを増幅する。得られた増幅反応液を常法によりアガロース電気泳動にかけて分画し、再生イネ植物から抽出されたＤＮＡの種々のＤＮＡ分画のうちで、導入された外来遺伝子のＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を含むゲルバンドを採る。
【０１３２】
このバンドに含有されたＤＮＡ断片の塩基配列を公知のサザン法によって解析すると、本発明ＤＮＡに相当するか否かを確認できる。
【０１３３】
前記においては、本発明ＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物に導入してイネ植物を形質転換することのできる好適な形質転換方法を説明した。しかし、本発明ＤＮＡは、外来遺伝子としてイネ植物のみならず、他の種類の植物に導入して植物の形質転換を行うことに使用できる。従って、本発明ＤＮＡを植物体に外来遺伝子に導入できる方法を次に一般的に説明する。
【０１３４】
本発明のＤＮＡを導入できる植物は、特に限定される種類のものではなく、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、およびその他の単子葉植物、ならびにタバコ、ダイズ、ワタ、トマト、ハクサイ、キュウリ、レタスなどの双子葉植物などが挙げられる。先づ、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に本発明ＤＮＡを外来遺伝子として導入するのが都合よい。
【０１３５】
本発明のＤＮＡ導入に用いられる培養細胞の作製は、植物由来のいかなる外殖物であってもよく、例えば、胚盤、生長点、花粉、葯、葉身、茎、葉柄、根由来の外殖物を使用できる。
【０１３６】
上記した外殖片を、カルス形成用の培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅら、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ」、１９６２年、第１５巻、４７３頁〜４９７頁）、またはＲ２培地（Ｏｊｉｍａら、「Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」、１９７３年、第１４巻、１１１３〜１１２１頁、あるいはＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７８年、「Ｉｎ Ｐｒｏｃ，Ｓｙｍｐ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ Ｐｅｋｉｎｇ」、４３頁〜５０頁などの如く、必須成分としての無機塩成分およびビタミン類を含む植物組織培養用の培地に、植物ホルモンとして、例えば、２，４−ＰＡ（２，４−ｄｉｃｈｉｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）０．１〜５ｍｇ／リットル、ならびに、炭素源として、例えば、ショ糖１０〜６０ｇ／リットル、ゲルライト１〜５ｇ／リットルを添加してなる培地に置床して培養することにより得られる培養細胞を用いて、これに本発明ＤＮＡを導入するのが便利である。
【０１３７】
本発明ＤＮＡの導入の対象となる植物細胞は、例えば、カルスや懸濁細胞などの脱分化した培養細胞あるいは不定胚、苗条原基などの培養細胞、もしくは植物組織例えば葉、根、茎、胚、生長点などの細胞から作られたカルス細胞および懸濁細胞であるのが好ましい。
【０１３８】
本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞を調製するために、カルス形成用培地に外殖片を置床する場合、本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞が得られるまでの培養期間は特に限定されるものではない。しかし、形質転換植物を再生することが必要であるから、当該の培養細胞からの植物体再生が可能であること、つまり、当該植物細胞が植物体再生能力を保有している期間内に得られた培養細胞を用いることが重要である。
【０１３９】
また、本発明ＤＮＡの導入用の培養細胞は、植物体再生能力を保有している培養細胞であれば、液体培地中で培養された懸濁細胞であってもよい。
【０１４０】
本発明ＤＮＡを植物細胞に導入するためには、先づ、本発明ＤＮＡを発現ベクターに組込んだ組換えベクターを調製することが必要である。その組換えベクターは、植物体に導入後の本発明ＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターの下流に本発明ＤＮＡを配し、さらに本発明ＤＮＡの下流にターミネーターを配するように調整された組換えベクターであることを要する。この目的に用いられる組換えベクターは、植物への導入方法の種類に応じて、通常の植物形質転換に利用される各種のベクターであることができる。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイスカー法などによる植物細胞への直接的なＤＮＡ導入法を用いる場合は、ｐＵＣ系またはｐＢＲ３２２系などの大腸菌で増殖可能であるプラスミドベクターを利用するのがよく、またアグロバクテリウム法を用いる場合はｐｌａｎ系などのプラスミドベクターを利用するのがよい。
【０１４１】
組換えベクター中で本発明ＤＮＡの上流に配されるプロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、第６巻、第３９０１頁〜３９０７頁、１９８７年、または、特開平６−３１５３８１号公報」、トウモロコシのユビキチンプロモーター［特開平２−７９９８３号公報］、ファゼオリンプロモーター「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、第１巻、第８３９頁〜８５３頁、１９８９年］であることができる。また、本発明ＤＮＡの下流に配されるターミネーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター［Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．第６巻、第３９０１頁〜３９０７頁、１９８７年］であるのがよい。しかし、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、何れでもよい。
【０１４２】
また、本発明ＤＮＡの導入で形質転換された植物細胞を効率的に選択するためには、用いる上記の組換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含有するプラスミドベクターと共に植物細胞に導入されることが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはカナマイシン、ゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、もしくは除草剤フォスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子［Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻、第２５１３頁〜２５１８頁、１９８７年、または特開平２−１７１１８８号公報］であることができる。
【０１４３】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子として植物に導入する方法は、アグロバクテリウム法［Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、第９１５頁〜９２２頁、１９８８年］、エレクトロポレーション法［Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，第１０巻、第１０６頁〜１１０頁、１９９１年］、パーティクルガン法［Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，第７９巻、第３３７頁〜３４１頁、１９９０年］、ウイスカー法であることができ、しかし特にこれらに限定されない。
【０１４４】
本発明ＤＮＡを外来遺伝子に導入するのにウイスカ法を用いる場合、好適に使用できるウイスカは、具体的には、直径が０．０１〜１０μｍ、好ましくは、０．５〜１μｍであり、長さが、１〜１００μｍ、好ましくは３〜４０μｍである。ウイスカ材質は、チタン酸カリウム、炭酸カルシウム、ホウ酸アルミニウム、窒化ケイ素、酸化亜鉛、塩基性硫酸マグネシウム、マグネシア、ホウ酸マグネシウム、カーボングラファイト、硫酸カルシウム、サファイア、シリコンカーバイドであるのがよい。好ましくはチタン酸カリウム、炭酸カルシウム、またはホウ酸アルミニウム製ウイスカがよい。
【０１４５】
ここで使用されるウイスカは、表面処理を行わなくとも単独で使用できるが、ウイスカ表面に塩基性官能基を持つウイスカ、好ましくは表面処理剤により表面処理されているウイスカを使用すると、植物細胞の形質転換率を高めることができる。
【０１４６】
ウイスカ表面への塩基性官能基の付与に用いる化合物は、ウイスカ表面と共有結合できる化合物であれば、特に限定されない。好ましくは、シランカップリング剤、より好ましくは塩基性官能基を有するシラン、カップリング剤である。シランカップリング剤としては、３−（２−アミノエトキシルアミノプロピル）−トリメトキシシラン、３−アミノプロピル−トリエトキシシランなどの塩基性シランカップリング剤を使用できる。塩基性官能基を有するシランカップリング剤であれば、何れも使用できる。
【０１４７】
ウイスカと混合される植物細胞の量は適宜に調整される。しかし、ウイスカと混合される植物細胞の容量は、特定の値に限定されるものではない。植物細胞と共に媒質液体中に混合されるウイスカの量は植物細胞の容量に伴い調整されるのがよい。植物細胞量のＰＣＶ１ｍｌ当たり、ウイスカはその量が１〜１００ｍｇ、好ましくは、４〜４０ｍｇになるように添加されるのが好ましい。
【０１４８】
このようにして、媒質液体中に分散させた植物細胞、ウイスカおよび本発明ＤＮＡ含有の組換えベクターの混合物を作る。この混合物を次に遠心分離処理する。
【０１４９】
例えば遠心加速度が３，０００〜５０，０００×ｇ、好ましくは、１０，０００〜３０，０００×ｇで、遠心時間が、１０秒〜４０分、好ましくは、５〜１０分間行う。その後、得られた沈殿を超音波処理にかける。例えば超音波処理は、周波数が１ｋ〜１ＭＨｚ、好ましくは、１０〜６０ｋＨｚで、照射時間が０．２秒〜２０分間、好ましくは、３０秒〜２分間で、強度は、０．０１〜１０Ｗ／ｃｍ２、好ましくは、０．１〜Ｗ／ｃｍ２で超音波の照射を行うのがよい。
【０１５０】
超音波処理された混合物から、遠心分離によって植物細胞を分け取る。得られた植物細胞は、導入された本発明ＤＮＡ含有の組換えベクターおよび選抜マーカー用のプラスミドベクターを含有するものである。
【０１５１】
このようにして得られた外来遺伝子を導入された植物細胞は、液体培地などにより洗浄する。その後に、細胞に導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより、形質転換された培養植物細胞を得ることができる。
【０１５２】
次に、本発明ＤＮＡを含有する組換えベクターを十分に有効な量で含有する形質転換細胞を効率良く再選抜するために、細胞増殖阻害剤であるリジンアナログを添加した培地上で培養する。リジンアナログとしては、例えばＳ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）あるいはＯ−（２−アミノエチル）−セリンを、１０ｍｇ／ｌ〜１０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００ｍｇ／ｌ〜３００ｍｇ／ｌの濃度で再選抜用培地に添加できる。
【０１５３】
前記のように再選抜された本発明ＤＮＡを外来遺伝子として組込まれた組換えベクターと選抜マーカー用のベクターとを含有する形質転換植物細胞から、次に、植物体を再生する。植物体の再生は公知の要領で行うことができる。例えば、前記のように再選抜された形質転換植物細胞を、公知の植物体再生用培地に置床して培養することにより植物体の再生を行うことができる。
【０１５４】
植物体再生用の培地に置床された形質転換細胞は１５〜３０℃、好ましくは、２０〜２８℃の温度で５００〜２０００ルックス、好ましくは、８００〜１０００ルックスの光を照射しながら培養期間２０〜６０日間、好ましくは３０〜４０日間で培養する。
【０１５５】
これによって、個々の植物細胞から本発明ＤＮＡを含む外来遺伝子を担う組換えベクターが導入されて形質転換された植物体が再生できる。
【０１５６】
形質転換細胞から再生された植物体は次に順化用培地で培養する。その後、順化された再生植物体を、温室内で通常の栽培条件下で育成すると、３〜６カ月の栽培で植物体は成熟し結実して種子を得ることができる。
【０１５７】
なお、このように再生され且つ栽培された形質転換植物体中の導入された外来遺伝子の存在は、公知のＰＣＲ法とサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，」９８巻５０３−５１７頁、１９７５年）によって、植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認できる。
【０１５８】
この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に準じて実施できる。
【０１５９】
再生された植物体中に存在する本発明ＤＮＡよりなる外来遺伝子をＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出されたＤＮＡを、テンプレートとして用い且つ第１の本発明によるＤＮＡ、あるいは第２の本発明による改変ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合してＰＣＲ法用反応液中に加えて増幅反応を行う。この増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返えすと、本発明ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。
【０１６０】
増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画される。導入した外来遺伝子である本発明ＤＮＡに相当するＤＮＡ配列を含有すると認められるＤＮＡ断片を含むバンドアガロースゲル片を切出す。切出されたゲル片内に含有されるＤＮＡ断片のＤＮＡ配列の塩基配列をサザン法で解析すると、そのＤＮＡ配列が本発明ＤＮＡに対応するか確認できる。
【０１６１】
第７の本発明（請求項６の発明）においては、カリフラワーモザイクウイルス由来であり且つ植物で発現可能なプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミドベクターに、前記のプロモーターの支配下に、配列番号５または配列番号７に記載の１１４３ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ配列を担うＤＮＡ断片を組込んでなる組換えベクターが提供される。
【０１６２】
上記のプラスミドベクターがプラスミドベクターｐＢＩ２２１であるのが好ましい（請求項７）。
【０１６３】
発明を実施するための最良の形態
以下に、第１の本発明による配列長１１４３ｂｐのＤＮＡ配列（配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列すなわちＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例１を参照して、第１の本発明を具体的に説明する。また、第２の本発明による配列長１１４３ｂｐの改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（配列表の配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例２、ならびに第２の本発明による配列長１１４３ｂｐの改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（配列表の配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する実施例３を参照して、第２の本発明を具体的に説明する。
【０１６４】
さらに、組換えベクターに組込まれた本発明ＤＮＡを外来遺伝子としてイネ植物体に導入してイネ植物を形質転換する方法を例示する実施例４を参照して、第３の本発明を具体的に説明する。
【０１６５】
但し、以下の実施例に記載される実験操作の手順は、特に記述しない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【０１６６】
実施例１
（１）イネｍＲＮＡの調製
イネ（品種：日本晴）の種子を播種した。栽培７日目の幼植物体の茎葉２ｇを液体窒素で凍結した。凍結した茎葉を乳鉢内で粉砕した。その粉砕物から公知のＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｃ ｐｈｃｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを使用）（実験医学、Ｖｏｌ．９ Ｎｏ．１５（１１月号）１９９１年、９９頁〜１０２頁）に従い、全ＲＮＡ約２ｍｇを抽出した。次に、得られた全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により単離した。こうしてイネのｍＲＮＡを約３０μｇ得た。
【０１６７】
（２）イネのｃＤＮＡライブラリーの構築
上記（１）で得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）によりｃＤＮＡを得た。
【０１６８】
このｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断末端を仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ処理したλ ｇｔ１１ファージベクター〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｎｄ，４９巻（１９８５年）参照；ａｍｂｄａ ｇｔ１１／ＥｃｏＲＩ／ＣｌＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ社製）〕に連結して、得られた組換えてファージをイン−ビトロパッケージング・キット（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））によりラムダファージにパッケイジングした。
【０１６９】
こうして得られた組換えファージを大腸菌Ｙ１０８８に感染させて増殖させた。大腸菌の溶菌プラークとして多数の組換えファージが得られた。プラーク中のファージは、イネ由来の全ｃＤＮＡを含有する多種多様のファージから成るものであり、イネのｃＤＮＡライブラリーとして利用した。
【０１７０】
（３）ＰＣＲ法用のプライマーの構築
イネＤＨＤＰＳをコードするのｃＤＮＡ断片をクローニングするためのＤＮＡプローブをＰＣＲ法用に作製するために、まずプライマーの設計を行った。そのためには、既知のコムギ及びトウモロコシのＤＨＤＰＳ遺伝子の塩基配列およびＤＨＤＰＳのアミノ酸配列を参考にして、下記の塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーＮｏ．１とプライマーＮｏ．２として作製した。
【０１７１】
ブライマーＮｏ．１（配列表の配列番号３に示す塩基配列を有す）：５′−ＧＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧ−３′
プライマーＮｏ．２（配列表の配列番号４に示す塩基配列を有す）：５′−ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧ−３′
上記のオリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、さらにイオン交換ＨＰＬＣで精製することにより行った。
【０１７２】
（４）プローブＤＮＡの作製
次に、上記の２種類の合成オリゴヌクレオチドの各１０ｐ．Ｍを第１のプライマー及び第２のプライマーとして用い、上記（２）で得られた組換えファージよりなるｃＤＮＡライブラリーの１μｌをテンプレイトとして用い、これらをＰＣＲ法用の増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．００１％ゼラチン、ｐＨ８．３；４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各２．５ｍＭの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ、２．５単位）５０μｌに加えて、増幅反応を行った。ここで使用される増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）により調製した。
【０１７３】
ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製、ＤＮＡ、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて、変性を９４℃、３０秒間、アニーリングを５５℃、１分間、また伸張（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）を７２℃、２分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【０１７４】
上記のようにすると、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列のうちの一部分であるＤＮＡ断片の増幅生成物が生成されるから、これをプローブＤＮＡとして採取する。そして、以下のｃＤＮＡライブラリーのクローニングに用いた。
【０１７５】
（５）イネのｃＤＮＡライブラリーからのイネＤＨＤＰＳ遺伝子のＤＮＡの選択
上記（２）で作製したイネのｃＤＮＡライブラリーである組換えファージから、上記（３）で作製したプローブＤＮＡにより、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に対応するＤＮＡ配列を組込まれた組換えファージをスクリーニングする。
【０１７６】
この目的のためには、上記（２）で得られたイネｃＤＮＡライブラリーである組換えファージのプラークを１．５％寒天培地上に形成させた。それらプラークをナイロン膜（アマシャム社製）ハイボンドＮに転写した。こうしてナイロン膜に転写されたファージのプラークに含まれているファージＤＮＡは、アルカリ変性液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、２．０Ｍ ＮａＯＨ）および中和液（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ５、２．０Ｍ ＮａＣｌ）でそれぞれ１０分間処理し、その後にＵＶ照射によりナイロン膜上に固定した。
【０１７７】
次に、上記（４）で得られたプローブＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして得られた標識プローブＤＮＡを、ファージＤＮＡを固定したナイロン膜に対してプラーク・ハイブリダイゼーションさせた。プローブＤＮＡのラベリングはＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）により行った。
【０１７８】
この場合、ファージＤＮＡの固定されたナイロン膜をハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸し、さらに６５℃、１０分間、浸漬処理を行った。次に前記のＤＩＧラベルした標識プローブＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、６５℃、１５時間にわたりハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１７９】
反応終了後、ナイロン膜を洗浄液（４０ｍＭ Ｎａ−Ｐｉバッファー、ｐＨ７．２、１％ ＳＤＳ）で２０分間ずつ３回洗浄した。その後、上記のＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、目的の組換えファージの検出を行った。ハイブリダイズしＸ線フィルム上で強くシグナルを発している４個の組換えファージプラーク、すなわちＤＨＤＰＳ遺伝子が組み込まれていると思われるファージのプラークを３０万個のファージプラークから、探知することができた。そして、前記の４個の組換えファージプラークを単離選抜できた。
【０１８０】
これら４個の組換えファージから、λ ＤＮＡ単離キット（Ｌａｍｂｄａ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））により、それぞれにファージプラークの４個ごとに別々にλ ＤＮＡを単離した。
【０１８１】
この際のλ ＤＮＡの単離は次のようにして行った。すなわち、各々のファージを大量に増殖させた培養液５ｍｌに、ＤＮａｓｅＩ（２０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＲＮａｓｅＡ（２ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを加え、室温で１５分間、放置した。得られたファージ増殖溶液を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた上清に８０％ＤＥＡＥ−セルロース２５ｍｌ加え、室温で１０分間インキュベートした。このようにインキュベートされた混合液を遠心分離し、得られた上清に０．５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌ、Ｐｒｏｎａｓｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）７７０μｌを加え、３７℃で１５分間放置した。さらに、５％ ＣＴＡＢ溶液（１％ ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｕｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１．５ｍｌを加えた。得られた混合物を６５℃、３分間処理した後、氷中で５分間放置した。こうして得られたそれぞれの反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後、この溶液を遠心分離し、沈澱したファージＤＮＡを乾燥させ、５ｍｌの水に溶解して保存した。
【０１８２】
上記のようにして単離された４種類のファージＤＮＡの各々５μｌをＨバッファー中で制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して、その消化反応液を分析した。その結果これらファージＤＮＡはいずれも同一のＤＮＡ配列であることが確認された。
【０１８３】
従って、イネのＤＨＤＰＳの遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたファージ中の挿入ＤＮＡ断片は、上記のように選抜された採取ファージのファージＤＮＡから制限酵素ＥｃｏＲＩで切出して収得できた。
【０１８４】
（６）イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡのクローニング
上記のようにイネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されたＤＮＡ断片として、ファージから切出して収得されたＤＮＡ断片は、これをプラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーション・キットにより挿入、連結して組換えプラスミドベクターを構築した。このように構築された組換えプラスミドベクターの導入で大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換した。
【０１８５】
上記のように、構築された組換えプラスミドベクターを大腸菌ＸＬＴ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ‘に導入するために、上記で得られた組換えファージＤＮＡの１０μｇを、Ｈバッファー中で、制限酵素ＥｃｏＲＩの１０ユニットで消化して消化反応液を得た。また、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の１０μｇを同様にＥｃｏＲＩで消化して消化反応液を得た。それぞれの消化反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置し、その後にそれぞれの得られたＤＮＡ溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。こうして得られたファージ由来のＤＮＡの水溶液とプラスミド由来のＤＮＡ水溶液の各々５μｌを混合し、得られた混合物をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）製）で処理して、それら２種のＤＮＡを連結させた。得られた連結反応液に１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間放置した。得られた混合液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させた。こうして得られた連結ベクターＤＮＡを１０μｌの水に溶解した。
【０１８６】
こうして得られた連結ベクターＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ１０ｎｇ）と、市販の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’コンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１００μｌとを、１．５ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０秒間、そして再び氷中で２分間インキュベートした。その後に、インキュベートされた混合物に対してＳＯＣ液体培地（２％ バクト−トリプトン、０．５％ バクト−酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅを含有）９００μｌを加えてから、３７℃で１時間大腸菌を振とう培養する。
【０１８７】
得られた大腸菌の培養液の１００μｌを、アンピシリンを５０ｍｇ／ｌの濃度、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を２０ｍｇ／ｌの濃度で添加されてあるＬＢ寒天培地（１％ バクト−トリプトン、０．５％ バクト−酵母抽出物、０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．５、寒天１．５％含有）にプレーティングした。３７℃で１６時間、大腸菌を培養後、白色に発色してない大腸菌コロニーから、白色に発色している大腸菌コロニーを、前記の連結ベクターＤＮＡで形質転換された大腸菌として分離した。
【０１８８】
このようにして分離された白色を発色している且つアンピシリン耐性である大腸菌コロニー１０個を、アンピシリン５０ｍｇ／ｌを含む液体培地で増殖させ、さらに増殖された大腸菌から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ社製）によりプラスミドを分離し且つ精製した。この精製により、上記で得られた耐性コロニーの形質転換大腸菌から５０μｇ（５０μｌ）のプラスミドを得た。
【０１８９】
このようにクローニングされて得られた前記のプラスミドは、イネＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を内部に含有するＤＮＡである目的の組換えプラスミドであり、そして約４．３ｋｂのサイズを有した。
【０１９０】
（７）クローニングされたＤＮＡのシークエンス解析
上記のクローニングされたＤＮＡである組換えプラスミド（約４．３ｋｂのサイズ）を市販の塩基配列決定キットで処理すると、そのＤＮＡ断片の全体の塩基配列を決定できる。そして、そのＤＮＡ断片内部に含有されたイネＤＨＤＰＳ遺伝子に該当するＤＮＡ配列の塩基配列を判定できる。このように判定された塩基配列をもち且つイネＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の塩基配列は、後記の配列表の配列番号１に記載されてある。
【０１９１】
なお、上記のＤＮＡの塩基配列の決定を行うに当っては、塩基配列決定キット（Ａｕｔｏｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、変性処理を行った後に自動ＤＮＡシーケンサＡＬＦ ＤＮＡ ＳｅｑｕｅｎｃｅｒＩＩ（ファルマシア社製）で前記ＤＮＡ断片−αの塩基配列を決定した。
【０１９２】
本発明によって実施例１で得られたＤＮＡ断片−αに含有され且つイネＤＨＤＰＳをコードすると判定されたＤＮＡ配列の塩基配列は、配列表の配列番号１に記載された単一のオープンリーディングフレーム内にある１１４０ｂｐの塩基からなる。また、第１の本発明による配列番号１に記載される塩基配列をもつＤＮＡは、配列番号２に記載の３８０個のアミノ酸残基からなるタンパクをコードしている。この配列番号２のアミノ酸配列を前記のコムギのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列（前記の特開平３−１２７９８４号公報）およびトウモロコシのＤＨＤＰＳのアミノ酸配列（前記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２２８巻２８７頁〜２９３頁、１９９１年）と比較すると、それぞれ８２％および７９％の相同性があると認められた。この相同性がある領域より以外のＤＮＡ配列領域では、コムギおよびトウモロコシとは明らかに異なり且つイネに特有であるＤＮＡ配列を、第１の本発明ＤＮＡは有する。
【０１９３】
実施例２
本例は、第２の本発明により得られた改変ＤＮＡ−１５８Ｎと命名されたＤＮＡ配列（すなわち、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する。
【０１９４】
（１）ＰＣＲ用のプライマーとしての合成オリゴヌクレオチドの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１，アプライドバイオシステムズ社製）を利用して、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーＮｏ．３と、配列番号１１に記載の塩基配列を有するプライマーＦＷ−１と、配列番号１２に記載の塩基配列を有するプライマーＲＶ−１と、配列番号１３に記載の塩基配列を有するプライマーＢＳＫＰＮ−１とを化学合成により構築した。
【０１９５】
さらに、配列番号１４に記載の塩基配列を有するプライマーと、配列番号１５に記載の塩基配列を有するプライマーも合成した。
【０１９６】
（２）ＰＣＲ法用のテンプレートの作製
実施例１の（６）項において、イネのＤＨＤＰＳ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を含有すると判定されるＤＮＡ断片として組換えファージから切出して収得されたＤＮＡ断片は、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ切断部位にＤＮＡリゲーション・キットにより連結されて、組換えプラスミドを構築した。
【０１９７】
上記の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１に含まれるＤＮＡ断片に対して、ＰＣＲ法によるＸｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ制限酵素切断部位を付与するために、下記の反応を行った。
【０１９８】
ｐ ＤＡＰ８−１の５μｌと、配列番号１４のプライマーおよび配列番号１５のプライマーの１μＭとを増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１００μｌに加えて、増幅反応を行った。増幅反応は、変性を９４℃，１分、アニーリング６０℃，３０秒、伸張７２℃，１分の３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施した。
【０１９９】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として約１１６０ｂｐのバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により、ＤＨＤＰＳ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の５′側にＸｂａ Ｉ部位、３′側にＳａｃ Ｉ部位を持つ、ＤＮＡ断片の精製品（Ｘｂａ Ｉ−ＤＮＡ−Ｓａｃ Ｉ）（ＤＮＡ断片−ＸＳ）を得た。
【０２００】
市販のプラスミドベクターｐＵＣ１９の１０μｇをＭバッファー中でＸｂａ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化した。
【０２０１】
前記のＤＮＡ断片（Ｘｂａ Ｉ−ＤＮＡ−Ｓａｃ Ｉ）とこの切断された線状のプラスミドベクターｐＵＣ１９とを、前記のＤＮＡリゲーション・キットにより連結して環状の組換えプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳ（約３．９ｋｂ）を得た。
【０２０２】
このプラスミドベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳが下記のＰＣＲ法でテンプレートとして利用された。
【０２０３】
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
（ｉ）ＰＣＲ法の第１回段階
所要なＤＮＡ断片をＰＣＲ法による増幅反応により収得するために、ＰＣＲ法の第１回段階として下記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行った。
【０２０４】
すなわち、その（Ａ）反応では、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーＦＷ−１の１μＭと、配列番号９のプライマーＮｏ．３の１μＭとを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この（Ａ）反応で得られたＤＮＡの増副生成物を、ＤＮＡ断片−Ａと称する。
【０２０５】
また、（Ｂ）反応では、テンプレートとして用いられる前記ベクターｐ ＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーとして用いられる前記のプライマーＲＶ−１の１μＭと、前記のＢＳＫＰＮ−１μＭとを、（Ａ）反応で用いたと同じ組成の増幅反応液に加えて、増幅反応を行った。この（Ｂ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物をＤＮＡ断片−Ｂと称する。
【０２０６】
なお、前記の増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｍｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アステック社製））内で、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で２分間、伸張を７２℃で２分間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施された。
【０２０７】
増幅反応の終了後、（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ａを含むバンドをアガロースゲルから切出した。また、（Ｂ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動にかけて分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出した。
【０２０８】
これらのゲル切片から、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により分離してＤＮＡ断片−Ａの精製品とＤＮＡ断片−Ｂの精製品を得た。
【０２０９】
（ｉｉ）ＰＣＲ法の第２回段階
次に、ＰＣＲ法の第２回段階として、前記のプライマーＲＶ−１の１μｌおよびＦＷ−１の１μｌ、ならびに前記の（Ａ）反応および（Ｂ）反応で増幅したＤＮＡ断片−Ａの１μｌとＤＮＡ断片−Ｂの１μｌを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ，ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を９４℃、３０秒、アニーリングを５５℃、２分、伸張を７２℃、２分行う３つの反応操作を２０回繰り返して実施した。
【０２１０】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片−Ｃを含有するバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片−Ｃを分離して且つＤＮＡ断片−Ｃの精製品を得た。
【０２１１】
このＤＮＡ断片−Ｃは、配列表の配列番号５に示された塩基配列を有するＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１３５０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であり、しかもＤＮＡ−１５８Ｎ配列の５′−末端の先方にＫｐｎＩ切断部位をもち且つ３′−末端の後方にＳａｃＩ切断部位をもつＤＮＡ断片である。
【０２１２】
（４）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングにより十分な量で収得する操作を次に行う。
【０２１３】
（ｉ）先づ、上記で得られたＤＮＡ断片−Ｃの１０μｇを、Ｌバッファー（宝酒造（株）社製）中で制限酵素Ｋｐｎ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化した。この消化で得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片−βと称する。他方、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）社製）中で、Ｋｐｎ Ｉの１０ユニットとＳａｃ Ｉの１０ユニットで消化して短縮プラスミドを得た。ＤＮＡ断片−βを含む消化反応液と、短縮プラスミドを含む消化反応液とにそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。その後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。
【０２１４】
こうして得られたＤＮＡ断片−βの水溶液の５μｌと、該短縮プラスミドＤＮＡの水溶液の５μｌとを混合し、次に、得られた混合物（１０μｌ）に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）社製）により連結反応させた。その連結反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。インキュベートされた反応溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解して水溶液にした。
【０２１５】
この水溶液に含まれるＤＮＡは、前記のＤＮＡ断片−βと、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＫｐｎ−１及びＳａｃＩ切断で得られた前記の短縮プラスミドとを連結して作られた２本鎖の組換えプラスミド（前記のｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドである）であり、その挿入ＤＮＡ領域内に、前記の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有した。
【０２１６】
（ｉｉ）このｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８Ｎプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′に導入することにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′を形質転換した。さらに形質転換された大腸菌細胞を液体培地中で培養した。
【０２１７】
培養された大腸菌細胞から、さらにプラスミドを抽出した。こうして改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えプラスミドがクローニングできた。
【０２１８】
（５）改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片の回収
得られたｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１５８ＮプラスミドのプラスミドＤＮＡの１０μｌを、Ｍバッファー（宝酒造（株）社製）中でＸｂａＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液を低融点アガロース電気泳動により分画した。ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片−β−２と称する）をアガロースから切出した。このＤＮＡ断片−β−２を含有するアガロース切片にＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有、ｐＨ８）を等量加え、６８℃、２０分間加温することによりアガロースを溶解した。得られた溶液を飽和フェノールで２回抽出することによりアガロースを除いた。得られたＤＮＡを含むフェノール抽出液に対して、それの１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間放置しインキュベートした。インキュベートされた溶液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。得られたＤＮＡ沈殿を減圧下で乾燥させ、得られたＤＮＡ粉末を１０μｌの水に溶解させた。そのＤＮＡ粉末は、目的の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有するＤＮＡ断片−β−２からなるものであった。
【０２１９】
実施例３
本例は、第２の本発明により得られた改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列と命名されたＤＮＡ配列（すなわち、配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列）を含有するＤＮＡ断片の製造を例示する。
【０２２０】
（１）ＰＣＲ用のプライマーとしての合成オリゴヌクレオチドの構築
ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ−３９１、アプライドバイオシステムズ社製）を利用して、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーＮｏ．４を化学合成により構築した。
【０２２１】
（２）ＰＣＲ法用のテンプレート
実施例２の（２）項に記載されたベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳは、それのＸｂａＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ配列（すなわち前記のＤＨＰＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列）を内部に含有する約１２００ｂｐの配列長をもつＤＮＡ断片を挿入されて有するものである。
【０２２２】
この組換えベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳが本実施例２でも下記のＰＣＲ法でテンプレートとして利用された。
【０２２３】
（３）所要なＤＮＡ断片のＰＣＲ法による増幅と回収
（ｉ）ＰＣＲ法の第１回段階
所要なＤＮＡ断片をＰＣＲ法による増幅反応により収得するために、ＰＣＲ法の第１回段階として下記の（Ａ）反応と（Ｂ）反応とを行った。
【０２２４】
すなわち、その（Ａ）反応では、テンプレートとして用いられる前記の組換えプラスミドベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーＦＷ−１の１μＭと、配列番号１０のプライマーＮｏ．４の１μＭとを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、４種のヌクレオチドｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）の１０μｌに加えて、増幅反応を行った。この（Ａ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物を、ＤＮＡ断片−Ｄと称する。
【０２２５】
また、（Ｂ）反応では、実施例２の（３）項に記載と同じく、テンプレートとして用いられる前記ベクターｐＤＡＰ８−１−ＸＳの５μｌと、プライマーとして前記のプライマーＲＶ−１の１μＭと、前記のＢＳＫＰＮ−１の１μＭとを、（Ａ）反応で用いたと同じ組成の増幅反応液に加えて、増幅反応を行った。この（Ｂ）反応で得られたＤＮＡの増幅生成物を、実施例２の（３）項と同じく、ＤＮＡ断片−Ｂと称する。
【０２２６】
なお、前記の増幅反応は、実施例２の（３）項に記載されたと同じく、ＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アステック社製）内で、変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で２分間、伸張を７２℃で２分間行う３つの反応操作を３０回繰り返すことにより実施された。
【０２２７】
増幅反応の終了後、（Ａ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての４８０ｂｐのＤＮＡ断片−Ｄを含むバンドをアガロースゲルから切出した。また、（Ｂ）反応の増幅反応液を低融点アガロース電気泳動にかけて分画し、増幅ＤＮＡ生成物としての１２００ｂｐのＤＮＡ断片−Ｂを含むバンドをアガロースゲルから切出した。
【０２２８】
これらのゲル切片から、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）により分離してＤＮＡ断片−Ｄの精製品とＤＮＡ断片−Ｂの精製品を得た。
【０２２９】
（ｉｉ）ＰＣＲ法の第２回段階
次に、ＰＣＲ法の第２回段階として、前記のプライマーＰＶ−１の１μｌおよびプライマーＦＷ−１の１μｌ、ならびに前記の（Ａ）反応および（Ｂ）反応で増幅したＤＮＡ断片−Ｄの１μｌとＤＮＡ断片−Ｂの１μｌを、増幅反応液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの２．５ユニットを含有）１００μｌに加えて、増幅反応を行った。この場合の増幅反応は、変性を９４℃、３０秒、アニーラングを５５℃、２分、伸張を７２℃、２分行う３つの反応操作を２０回繰り返して実施した。
【０２３０】
この増幅反応の終了後、その増幅反応液を低融点アガロース電気泳動により分画し、増幅ＤＮＡ生成物として１２００ｂｐの所期のＤＮＡ断片−Ｅを含有するバンドをゲルから切出した。このゲル切片からＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片−Ｅを分離して且つＤＮＡ断片−Ｅの精製品を得た。
【０２３１】
このＤＮＡ断片−Ｅは、配列表の配列番号７に示された塩基配列を有するＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１３５０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片であり、しかもＤＮＡ−１６６Ａ配列の５′−末端の先方にＫｐｎ１切断部位をもち且つ３′−末端の後方にＳａｃＩ切断部位をもつＤＮＡ断片である。
【０２３２】
（４）改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片のクローニング
上記で得られたＤＮＡ断片−Ｅを利用して、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片をクローニングにより十分な量で収得する操作を次に行う。
【０２３３】
（ｉ）先づ、上記で得られたＤＮＡ断片−Ｅの１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）製）中で制限酵素ＫｐｎＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。この消化で得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ断片−γと称する。他方、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の１０μｇをＬバッファー（宝酒造（株）製）中で、ＫｐｎＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化して短縮プラスミドを得た。ＤＮＡ断片−γを含む消化反応液と、短縮プラスミドを含む消化反応液とにそれぞれに１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。その後、インキュベートされた溶液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解した。
【０２３４】
こうして得られたＤＮＡ断片−γの水溶液の５μｌと、該短縮プラスミドＤＮＡの水溶液の５μｌとを混合し、次に、得られた混合物（１０μｌ）に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造（株）製）により連結反応させた。その連結反応液に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃に約６時間インキュベートした。インキュベートされた反応液を遠心分離し、沈殿したＤＮＡを乾燥させ、５μｌの水に溶解して水溶液にした。
【０２３５】
この水溶液に含まれるＤＮＡは、前記のＤＮＡ断片−γと、プラスミドベクターｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＫｐｎ−１及びＳａｃＩ切断で得られた前記の短縮プラスミドとを連結して作られた組換えプラスミド（ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６Ａプラスミドと称する）であり、その挿入ＤＮＡ領域内に、前記のＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有した。
【０２３６】
（ｉｉ）このｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６Ａプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’に導入することにより大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を形質転換した。さらに形質転換大腸菌細胞を液体培地中で培養した。
【０２３７】
培養された大腸菌細胞から、さらにプラスミドを抽出した。こうして改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するプラスミドがクローニングできた。
【０２３８】
（５）改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有するＤＮＡ断片の回収
得られたｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＤＮＡ−１６６ＡプラスミドのプラスミドＤＮＡの１０μｌを、Ｍバッファー（宝酒造（株）製）中でＸｂａＩの１０ユニットとＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液を低融点アガロース電気泳動により分画した。ＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有するＤＮＡ断片−γ−２を含有するバンドをアガロースから切出した。このＤＮＡ断片−γ−２を含有するアガロースゲル切片にＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有、ｐＨ８）を等量加え、６８℃、２０分間加温することによりアガロースを溶解した。得られた溶液を飽和フェノールで２回抽出することによりアガロースを除いた。得られたＤＮＡを含むフェノール抽出液に対して、それの１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム、２倍容のエタノールを加え、−２０℃で約６時間放置インキュベートした。インキュベートされた溶液を、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心分離した。得られたＤＮＡ沈殿を減圧下で乾燥させ得られた粉末と１０μｌの水に溶解させた。このＤＮＡ粉末は、目的の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有する約１２００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片−γ−２から成るものであった。
【０２３９】
なお、実施例２の（５）で得られた前記のＤＮＡ断片−β−２を、実施例１の（７）項に記載されたと同様にして、塩基配列決定キットを用いる自動ＤＮＡシーケンサ、ＡＬＦ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｅｒ ＩＩにかけた。ＤＮＡ断片−β−２は配列表の配列番号５に記載の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であると確認できた。
【０２４０】
また、実施例３の（５）で得られたＤＮＡ断片−γ−２も、上記と同様に、塩基配列決定の試験にかけた。ＤＮＡ断片−γ−２は、配列表の配列番号７に記載の塩基配列をもつ改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を内部に含有するＤＮＡ断片であると確認できた。
【０２４１】
実施例４
本例は、第１の本発明によるＤＮＡ配列または第２の本発明による改変ＤＮＡ配列を、外来遺伝子としてイネ植物に導入することからなるイネ植物の形質転換法を例示する。
【０２４２】
（１）外来遺伝子の導入用の組換えベクターの作成
（ｉ）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有する５．７ｋｂのサイズのプラスミドベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＤＮＡ（１０μｇ）を、Ｍバッファー（宝酒造（株）製）中で制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｃＩの１０ユニットで消化した。その消化反応液からＤＮＡを沈殿させ、遠心分離してから乾燥させた。３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターを保有する約３．８ｋｂのサイズのベクター断片を得た。
【０２４３】
（ｉｉ）得られたベクター断片を５μｌの水に溶解した。そのベクター断片の水溶液の５μｌを、実施例２で得られ且つ第１の本発明による配列番号１に記載のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡであるＤＮＡ断片−ＸＳの水溶液の５μｌと混合した。
【０２４４】
得られた混合物をＤＮＡリゲーション・キット（宝酒造（株）製）で処理して、ＤＮＡの連結反応を行った。こうしてプラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩ−ＳａｃＩ−切断ベクター断片に対して、前記のＤＮＡ断片−ＸＳを連結してなる環状の組換えベクターを作成した。この組換えベクターをベクターｐＤＡＰと称する。ベクターｐＤＡＰは、３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−ＸＳ領域が挿入、連結されてあり、且つアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｒ）を含有する構造を有し、４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４５】
（ｉｉｉ）実施例２で得られたＤＮＡ断片−ＸＳの代りに、実施例２で得られたＤＮＡ断片−β−２（すなわち、第２の本発明による配列番号５に記載の改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡである）を用いて、前記と同様な連結反応により、プラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩ−ＳａｃＩ−切断−ベクター断片に対して連結した。こうして作成された環状の組換えベクターはベクターｐ１５８Ｎと称する。ベクターｐ１５８Ｎは、３５Ｓプロモーター領域と、ＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−β−２の領域が挿入、連結された構造を有し、４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４６】
（ｉｖ）さらに、実施例２で得られたＤＮＡ断片−ＸＳの代りに、実施例３で得られたＤＮＡ断片γ−２（すなわち、第２の本発明による配列番号７に記載の改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列（１１４３ｂｐのサイズ）を内部に含有する約１１４３ｂｐのサイズのＤＮＡである）を用いて、前記と同様な連結反応により、プラスミドベクターｐＢＩ２２１のＸｂａＩＳａｃＩ−切断−ベクター断片に対して連結した。こうして作成された環状の組換えベクターはベクターｐ１６６Ａと称する。ベクターｐ１６６Ａは、３５Ｓプロモーター領域とＮＯＳターミネーター領域との間に、ＤＮＡ断片−γ−２の領域が挿入、連結されてある構造を有し、また４．９ｋｂのサイズを有した。
【０２４７】
（２）組換えベクターのクローニング
上記で得られた組換えベクターｐＤＡＰあるいは組換えベクターｐ１５８Ｎあるいは組換えベクターｐ１６６Ａの水溶液１０μｌ（ＤＮＡの量：１０ｍｇ）と、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’コンピテントセル１００μｌとを１．５ｍｌ容チューブに入れ、氷中で３０分間、４２℃で３０秒間、そして再び氷中で２分間インキュベートした。その後に、インキュベートされた混合物を実施例１の（６）項で記載されたと同様に処理し且つ大腸菌を振とう培養した。
【０２４８】
得られた大腸菌の培養液を、実施例１の（６）項に記載されたと同様に、アンピシリン及びその他の添加物を添加されたＬＢ寒天培地にプレーティングした。３７℃、１６時間にわたって大腸菌を培養した。
【０２４９】
用いた組換えベクターｐＤＡＰまたは組換えベクター１５８Ｎまたは組換えベクター１６６Ａの導入により形質転換され且つアンピシリン耐性である大腸菌コロニー１０個を得た。これら大腸菌コロニー１０個を、それぞれにアンピシリン５０ｍｇ／ｌを含む液体培地で増殖させた。
【０２５０】
（３）組換えベクターの回収
１０個のコロニーから夫々に増殖した大腸菌細胞から、プラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）により組換えプラスミドを分離し且つ精製した。
【０２５１】
得られたそれぞれの組換えプラスミドを、制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩとで消化し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により解析した。
【０２５２】
その解析の結果を参照して、得られた組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐＤＡＰとして選択して、採取した。
【０２５３】
また、同様にして、組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐ１５８Ｎとして選択して、採取した。
【０２５４】
さらに、同様にして、組換えプラスミドの中で３５Ｓプロモーターの下流に正常に第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ｎ配列が連結されてある組換えプラスミドを、ベクターｐ１６６Ａとして選択して、採取した。
【０２５５】
このように得られた組換えベクターｐ１５８Ｎの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｐ１５８Ｎと命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年４月１３日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３２３の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【０２５６】
このように得られた組換えベクターｐ１６６Ａの導入により形質転換された大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’／ｐ１６６Ａと命名され、日本の茨城県、つくば市の工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９８年４月１３日以降、ブダペスト条約の規約下でＦＥＲＭ ＢＰ−６３２４の受託番号で前記の研究所に寄託されてある。
【０２５７】
（４）イネのカルスの調製
イネ（品種：日本晴）の完熟種子から籾穀を脱穀した。得られた外皮付きの種子を７０％エタノール溶液に６０秒間、ついで有効塩素約１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に６分間浸漬して種子を殺菌処理した。さらに種子を滅菌水で洗浄した。
【０２５８】
ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌ、植物ホルモンとして２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌを添加してなる培地に、上記で殺菌したイネ種子を置床した。２８℃で４５日間、２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照明しながらインキュベートした。カルスが形成された。それらカルスを胚乳部分から切り出し、孔１ｍｍのステンレスメッシュの篩を用いて、１ｍｍ以下のカルスをＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ；圧縮細胞量）として３ｍｌの細胞量で得た。
【０２５９】
（５）ウイスカの調製
チタン酸カリウム製ウイスカ（チタン工業（株）製、ＬＳ２０）５ｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、エタノールを０．５ｍｌ加えて、一晩放置した。エタノールを完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、よく攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、同チューブ内にＲ２液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカ懸濁液を得た。
【０２６０】
（６）イネ・カルス細胞への外来遺伝子の導入用の材料の調製
前項（３）に記載するように調製した組換えベクターｐＤＡＰ、またはベクターｐ１５８Ｎ、またはベクターｐ１６６Ａを１ｍｇ／ｍｌの濃度でＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ，ＥＤＴＡ １ｍＭ，ｐＨ８）に溶解してベクター溶液を得た。
【０２６１】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに１ｍｍ以下のカルスを２５０μｌ入れて、攪拌した。得られた混合物を１０００ｒｐｍ／分で１０秒間遠心分離し、カルスとウイスカを沈殿させた。上清を捨てた。カルスとウイスカとの混合物が得られた。
【０２６２】
カルスとウイスカとの混合物を入れたチューブに、組換えベクター（すなわち、ベクターＤＡＰまたはｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａ）の１０μｌ（ＤＮＡの１０μｇ含有）と、選抜マーカー用として除草剤ホスフィノスリシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターｐ３５ＳＣ−ＳＳ（特開平８−１５４５１３号公報）１０μｌ（１０μｇのＤＮＡを含有）とを加えた。十分振り混ぜた均質な混合物を得た。
【０２６３】
次にこの均質な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離された混合物を再度振り混ぜた。この遠心分離の操作と再度振り混ぜる操作を３回反復した。
【０２６４】
（７）イネのカルスへの外来遺伝子の導入の操作
上記のようにして得られた、カルス細胞と、ウイスカと、本発明ＤＮＡ配列を含有する組換えベクターと、選択用プラスミドベクターｐ３５ＳＣ−ＳＳとよりなる均質な混合物を収容しているチューブを、超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸かるように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５Ｗ／ｃｍ２で１分間照射した。照射後、３０分間、４℃で超音波処理された混合物をインキュベートした。
【０２６５】
このように超音波処理した混合物をＲ２液体培地で洗浄し、組換えベクターを導入した目的の形質転換カルス細胞を得た。
【０２６６】
（８）導入ベクターで形質転換されたカルス細胞の選抜
上記で組換えベクターを導入された形質転換細胞を有するカルスを、３．５ｃｍのシャーレに入れた。さらにＲ２培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／ｌ、２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌを添加して得た液体培地を３ｍｌ加えた。その後に、２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながらロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ）上でカルス細胞を培養し、分裂細胞を得た。
【０２６７】
培養３日目に、得られた分裂細胞の懸濁液３ｍｌを、Ｎ６培地の無機成分組成に、ショ糖３０ｇ／ｌ、２，４−ＰＡ２ｍｇ／ｌ、ゲルライト３ｇ／ｌ、ホスフィノスリシン３０ｍｇ／ｌを添加してなる培地上に均一に広げた。培地上の細胞を、２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら３０日間培養した。ホスフィノスリシン耐性の形質転換カルス細胞を得た。
【０２６８】
（９）ベクターｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａによる形質転換カルス細胞の再選抜
上記により得たホスフィノスリシン耐性である形質転換カルス培養細胞のうち、第２の本発明によるＤＮＡを外来遺伝子として十分に導入されて形質転換された所期の培養細胞のみを再選抜する。そのためには、形質転換カルス細胞よりなるカルス４００個（直径２ｍｍ）を、Ｎ６培地の無機成分組成にショ糖の３０ｇ／ｌと、２，４−ＰＡの２ｍｇ／ｌと、ゲルライトの３ｇ／ｌと、細胞増殖阻害剤として働くＳ−（２−アミノエチル）システィン（以下、ＡＥＣという）（リジンのアナログ体）の２００ｍｇ／ｌとを添加してなる培地上に移植した。２８℃、２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながらカルス細胞を３０日間培養した。前記のＡＥＣ添加培地で生育できたベクターｐ１５８Ｎまたはｐ１６６Ａ含有の形質転換カルス細胞をこのようにして再選抜した。
【０２６９】
（１０）形質転換カルス細胞からの植物体の再生
上記により得たホスフィノスリシン耐性およびＡＥＣ耐性である形質転換カルス培養細胞（直径５ｍｍ）の９８〜１００個を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖の３０ｇ／ｌ、ベンジルアデニンの２ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸の１ｍｇ／ｌ、ゲルライトの３ｇ／ｌを添加してなる培地上に移植した。２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら３０日間培養した。形質転換カルス細胞よりなるカルスから芽と根が再生できた。再生した芽と根をもつ幼芽（長さ１０〜３０ｍｍに生育した芽）を、ショ糖の３０ｇ／ｌ、ゲルライトの３ｇ／ｌを含むＭＳ培地を入れた試験管（直径４５ｍｍ、長さ２５ｃｍ）に移植した。移植された幼芽を２０日間培養して形質転換したイネ植物を得た。
【０２７０】
上記の方法により、第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を外来遺伝子として含有する形質転換カルス細胞のカルス９８個から、８０個体のイネ植物が再生できた。また、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を外来遺伝子として含有するＡＥＣ耐性の形質転換カルス細胞のカルス１００個から、７６個体のイネ植物が再生できた。
【０２７１】
さらに、第２の本発明による改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列を外来遺伝子として含有するＡＥＣ耐性の形質転換カルス細胞のカルス１００個から、７９個体のイネ植物が再生できた。
【０２７２】
（１１）形質転換イネ植物の再生体の遺伝子解析
上記のように再生されたイネ植物体に存在するＤＨＤＰＳをコードするＤＮＡの解析をＰＣＲ法で次の手順により行った。
【０２７３】
（ｉ）前項（１０）で得た再生イネ植物から葉を採取した。その葉５０ｍｇを１．５ｍｌ容のマイクロチューブに入れ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３００μｌを添加し、これを磨砕した。磨砕物に２０％ＳＤＳを２０ｍｌ加えて、６５℃で１０分間加温した。得られた混合物に５Ｍ酢酸カリウムを１００μｌ加え、氷中に２０分間置いた後、１，７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清にイソプロパノール２００μｌを加え、転倒攪拌し、これを再び１．７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られたＤＮＡの沈殿を減圧下で乾燥した。１００μｌのＴＥ緩衝液にそのＤＮＡを溶解した。
【０２７４】
（ｉｉ）ＰＣＲ用のプライマーとして、配列表の配列番号１４に示す塩基配列を有する前記オリゴヌクレオチドと、配列番号１５に示す塩基配列を有する前記オリゴヌクレオチドとを用いた。
【０２７５】
次に、これら２種類のオリゴヌクレオチドの各１μＭをプライマーとして用い且つ上記再生イネ植物体由来のＤＮＡの５μｌをテンプレイトとして用い、これらを増幅用反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３、ｄＮＴＰの各０．２ｍＭの混合物およびＴａｑ ＤＮＡポリメタラーゼ２．５ユニットを含有）１００μｌに加えた。そして増幅反応を行った。用いた増幅反応液は、ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）で調製した。
【０２７６】
増幅反応は、ＰＣＲ反応装置（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｔｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＣ−７００（アズテック社製））内で、変性９４℃、１分、アニーリング６０℃、３０秒、伸張（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）７２℃、１分の３つの反応操作を３０回繰り返すことによって実施した。
【０２７７】
（ｉｉｉ）得られたＰＣＲ反応液を、常法によりアガロース電気泳動にかけて分析したところ、再生イネ植物から抽出したＤＮＡから増幅された各種のＤＮＡのバンドが確認された。
【０２７８】
さらに、それらの各種のＤＮＡ配列を、塩基配列決定キットにより解析したところ、本発明のＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列、改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列または改変ＤＮＡ−１６６Ａ配列に相当するＤＮＡ断片が再生イネ植物から上記のように抽出された各種のＤＮＡ断片の中に存在することが確認できた。
【０２７９】
上記のようにＰＣＲ法による遺伝子解析を行うことにより、導入した外来遺伝子が確認できた再生イネ植物体は、各々を培養土を入れたポットに移植して栽培した。これらの再生イネ植物体は正常に生育したので自殖種子を得ることができた。
【０２８０】
（１２）形質転換イネ植物の再生体中のリジン含量の測定
前項（１１）で得られた、第１の本発明によるＤＨＤＰＳ−ＤＮＡ−１１４３配列を含有する組換えベクターｐＤＡＰを導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体と、第２の本発明によるＤＮＡ−１５８Ｎ配列を含有する組換えベクターｐＤＮＡ−１５８Ｎを導入された植物細胞を有する再生された形質転換イネ植物体と、第２の本発明によるＤＮＡ−１６６Ａ配列を含有する組換えベクターｐＤＮＡ−１６６を導入された植物細胞を有する再生する形質転換イネ植物体とから、夫々に緑色の葉を採取した。
【０２８１】
このようにそれぞれに採取された葉を１ｇづつ取り、それらの葉の１ｇを、１．５ｍｌ容の第１のチューブに入れ、さらに５０％アセトニトリル１ｍｌを添加し、磨砕した。磨砕混合物を新たらしい１．５ｍｌ容の第２のチューブに移し替え、１７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。得られた上清を、再び新たらしい第３のチューブに移し入れ、その第３のチューブ内に５０％アセトニトリル１ｍｌを加え、十分に転倒攪拌し、再び遠心分離した。得られた上清を第１のチューブに加え、この操作を３回繰り返した。このようにして、葉からリジンを抽出したアセトニトリル抽出液を得た。
【０２８２】
このアセトニトリル抽出液を減圧下で乾固させた後、蒸留水１ｍｌを加えて水溶液を得た。その水溶液を１７０００Ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離により、上清の０．５ｍｌを得た。その上清のうち１００μｌに５ｍＭ ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン）１００μｌを混合した。得られた混合物を一晩反応させた。この反応液に２００μｌのアセトニトリルを添加し、攪拌した後、１７０００ｘｇの遠心加速度で２０分間遠心分離した。上清液として、リジンの抽出液を得た。これを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（東ソー（株）製、８０２０型）にかけて遊離リジン含量を測定した。このＨＰＬＣに用いたカラムは、ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ−Ｃ１８（資生堂（株）製）であり、展開溶媒はアセトニトリル−水をアセトニトリルの６０％〜７２％濃度勾配で用い、流量は０．８ｍｌ／分として、３５０ｎｍの光の吸光度を測定して、リジン含量を評定した。
【０２８３】
対照のイネ植物として、通常のイネ（品種：日本晴）の植物体を用いた。得られた測定結果を次の表１に示す。
【０２８４】

Figure 0003814482
表１に示された結果から明らかなように、本発明による新規ＤＮＡ配列を外来遺伝子として用い且つ植物細胞中で発現できるプロモーターを有する組換えベクターを利用すると、本発明による新規ＤＮＡ配列を導入することにより、イネ植物体中に生成される遊離リジン含量が増加できることが確認された。
【０２８５】
産業上の利用可能性
以上の説明から明らかなように本発明により、イネのジヒドロジピコリネートシンターゼをコードできる新規なＤＮＡ配列が提供される。当該ＤＮＡ配列を外来遺伝子としてイネ植物体に導入することにより、イネ植物体中の必須アミノ酸、リジンの含量を高めることができた。本発明によるＤＮＡ配列は、従来知られるバイオテクノロジーの技法によって、イネ及びその他の有用植物、例えばトウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギの植物体にも外来遺伝子として導入できる。従って、本発明で提供されたＤＮＡ配列は、高いリジン含量を有する種子を産生できる新品種の植物を育種するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
第１図は、前記の実施例４においてイネの培養細胞を形質転換するのに用いる外来遺伝子の導入用の組換えベクターであり且つ第２の本発明による改変ＤＮＡ−１５８Ｎ配列を内部に含有するベクターｐ １５８Ｎを、ベクターｐ ＢＩ２２１から作成する手順を図解的に示す。
【０２８７】
第２図は、前記の実施例４においてベクターｐ １５８Ｎと共にイネの培養細胞に導入されるベクターであって、選抜マーカーとしてのホスフィノスリシン遺伝子ＳＳを含有するベクターｐ ３５ＳＣ−ＳＳの構造を図解的に示す。
【０２８８】
[配列表]
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
[0001]
Technical field
The present invention relates to a rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene. Specifically, the present invention relates to a novel DNA encoding dihydrodipicolinate synthase involved in the lysine biosynthesis pathway of rice plants. The present invention also relates to DNA encoding a novel protein having dihydrodipicolinate synthase activity. Furthermore, the present invention relates to Escherichia coli transformed with these novel DNAs, or transformed with these novel DNAs.RiceIncludes plants and their seeds.
[0002]
Furthermore, the present invention also includes a novel recombinant vector incorporating a novel DNA.
[0003]
Background art
Grain seeds such as rice, corn, and wheat are important nutrient sources for humans and livestock. However, these seeds are somewhat inferior in nutritional value due to the low content of lysine, which is one of the essential amino acids. It is desired to produce new varieties of plants that have high lysine content and can produce grain seeds with excellent nutritional value.
[0004]
In the diaminopimelate pathway, which is the biosynthetic pathway of lysine in plants, aspartate-β-semialdehyde and pyruvate are condensed by the action of dihydrodipicolinate synthase (hereinafter abbreviated as “DHDPS”). By doing so, it is known that 2,3-dihydropicolinic acid is generated, and then diaminopimelic acid is further generated by an enzyme reaction in five stages, and lysine is generated via this. (Biochemical Experiment Course, Vol. 11, pp. 511-517, Tokyo Chemical Doujin). Therefore, it is known that DHDPS is an enzyme protein having an activity of generating 2,3-dihydropicolinic acid by condensation-bonding aspartic acid-β-semialdehyde and pyruvic acid.
[0005]
Improving the lysine content in the seeds of these transformed plants by introducing a gene encoding DHDPS, that is, a DHDPS gene, into a useful plant such as corn, tobacco, rapeseed, or soybean and expressing the function of the gene. Have been reported (PCT International Publication No. WO95 / 15392, JP 7-504821, and Biotechnology, Vol. 13, pp. 576-582, 1995).
[0006]
So far, DHDPS genes have been obtained from wheat, corn, soybean and tobacco plants, and the DNA base sequences of these genes have been elucidated. For example, the following techniques have been reported in several documents.
[0007]
(1) Analysis of the amino acid sequence of wheat DHDPS and isolation of the DHDPS gene (Japanese Patent Laid-Open No. 3-127984).
[0008]
(2) Isolation of corn DHDPS gene and analysis of the DNA base sequence (Molecular & General Genetics, 228, 287-293, 1991).
[0009]
(3) Transformation of maize using modified DNA of maize DHDPS gene and improvement of lysine content of seed (US Pat. No. 5,545,545).
[0010]
(4) Modified DNA that has been desensitized to feedback inhibition by lysine of DHDPS encoded by DNA so that the lysine content in the plant can be increased by modifying the DNA of tobacco DHDPS gene (The Plant Journal, No. 1) 8: 5, 733-743, 1995).
[0011]
(5) DHDPS gene of soybean (Plant Molecular Biology, Vol. 26, pages 989 to 993, 1994).
[0012]
(6) A method for improving the lysine content of plant seeds by transformation using a DHDPS gene of bacteria such as Escherichia coli (European Patent Application No. 0485970A2).
[0013]
However, as far as the present inventors know, there is no known literature that reports the analysis of the amino acid sequence of rice DHDPS and that the rice DHDPS gene has been obtained, and the rice DHDPS gene is used. There is no known literature to report this.
[0014]
One of the objects of the present invention is to obtain and provide rice DHDPS genes from rice plants. Another object of the present invention is to provide a novel DNA capable of encoding a protein having DHDPS activity of rice DHDPS protein. Still another object of the present invention is to transform useful plants such as corn, rice, soybean, wheat, barley and the like with a novel DNA capable of encoding a protein having DHDPS activity, and a seed having a high lysine content. It is to provide new transformed varieties of useful plants capable of producing sucrose.
[0015]
Other objects of the present invention will become apparent from the following description.
[0016]
Disclosure of the invention
In order to achieve the above objectives, the present inventors conducted a series of various studies. First, research was conducted to obtain the DHDPS gene from rice plants. As a result of this research, total RNA was extracted from the tissue of rice seedlings, such as crushed green foliage, by a method known in genetic engineering technology, and mRNA was isolated from the extracted total RNA by a conventional method. From the mRNA, cDNA was successfully obtained by a commercially available cDNA synthesis kit. The resulting cDNA can construct a replicable recombinant lambda-phage when ligated to a phage vector (commercially available from STRATAGEN) in which the end of the EcoRI fragment of the λgt11 phage vector is treated with alkaline phosphatase derived from calf small intestine. However, it was discovered by many trial and error results.
[0017]
When the recombinant lambda phage is infected with E. coli Y1088 and incubated, a large number of recombinant λ phages are obtained as a large number of plaques (lytic plaques), and the recombinant λ phage group included in the obtained large numbers of plaques It was found that various phages containing rice-derived cDNA can be used as a rice cDNA library.
[0018]
On the other hand, the amino acid sequence of the wheat DHDPS protein described in JP-A-3-127984, the nucleotide sequence of the DHDPS gene deduced therefrom, and the document “Molecular & General Genetics”, Vol. 228, pages 287-293 ( 1991) with reference to the base sequence of the maize DHDPS gene, a 25-nucleotide first oligonucleotide considered to be suitable as a primer for the PCR method and a 24-nucleotide second sequence. The inventor of the present invention has prepared by chemical synthesis.
[0019]
When a PCR amplification reaction is performed using a mixture of the first oligonucleotide, the second oligonucleotide, and the rice cDNA library (ie, the recombinant λ phage), the first and second Oligonucleotides can serve as required primers (complementary DNA) in the PCR method, and the cDNA in the rice cDNA library can be used as a template to amplify a part of the cDNA derived from the rice DHDPS gene. It was recognized that we could do it. Then, the amplification product of a part of the rice DHDPS gene-derived cDNA was successfully recovered as a probe DNA from the PCR amplification reaction solution.
[0020]
From the rice cDNA library obtained in advance by the phage plaque-hybridization method using the probe DNA thus obtained as a screening material (ie, 300,000 plaques of the recombinant λ phage), As a result of many trial and error tests, it was fortunately successful to isolate four of the recombinant lambda phage plaques incorporating the rice DHDPS gene. After the four plaques of recombinant λ phage were amplified separately, each λ phage DNA was isolated by conventional methods. The DNA fragments obtained by cleaving the four types of DNA thus obtained with the restriction enzyme EcoRI were found to have the same base sequence when compared with each other, and the DNA of wheat and corn DHDPS genes. From the comparison with the sequence, it was identified as a DNA fragment containing a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene.
[0021]
A DNA fragment obtained by cleaving the DNA fragment containing the DNA sequence recognized as corresponding to the rice DHDPS gene obtained as described above with the restriction enzyme EcoRI is then used as a commercially available known plasmid. The vector pBluescript II SK (+) could be inserted and ligated into the EcoRI cleavage site using a DNA ligation kit. The recombinant plasmid vector thus obtained was able to transform E. coli XLI-Blue MRF '. The resulting Escherichia coli transformant was incubated to obtain a large number of cells. A plasmid was collected from the obtained bacterial cells, and a DNA fragment containing a rice-derived DNA sequence was cut out from the obtained plasmid DNA with a restriction enzyme. The base sequence of the DNA sequence which was determined to correspond to the rice DHDPS gene by containing the excised DNA fragment by analyzing the base sequence of the DNA is shown in the sequence listing below. It was confirmed to have the base sequence described in No. 1.
[0022]
Furthermore, as far as the present inventors know, the DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was recognized as a novel DNA sequence not described in any document.
[0023]
The protein encoded by the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is recognized as a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and this protein is a protein constituting rice DHDPS. It is recognized that there is.
[0024]
Accordingly, in the first aspect of the present invention, there is provided DNA encoding a rice dihydrodipicolinate synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
[0025]
Specifically, the DNA according to the first aspect of the present invention can be a DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
[0026]
The DNA of the first aspect of the present invention is a DNA encoding a protein that is rice DHDPS. As described above, this DNA was obtained from a rice cDNA library by a genetic engineering technique when the present inventors conducted research. However, since the base sequence of the DNA has been clarified in the present invention, it can also be obtained from nucleotides by chemical synthesis with reference to the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In addition, a synthetic nucleotide is prepared and used as a probe with reference to the above base sequence, or a polymerase chain reaction (PCR) is performed from a rice chromosome DNA library by a known method using the synthetic oligonucleotide as a primer. The DNA of the first present invention can also be obtained by the method or hybridization.
[0027]
Hereinafter, a method for obtaining DNA according to the first present invention from rice stems and leaves by a genetic engineering technique will be schematically described.
[0028]
(1) Preparation of rice mRNA and construction of rice cDNA library
Total RNA is extracted from various tissues of rice (Oriza sativa), for example, tissues such as foliage, roots and callus, preferably green foliage, by a conventional method. Rice impurities can be obtained by removing contaminants such as proteins from the extracted total RNA and further purifying poly (A) + RNA through a packed column of oligo dT cellulose.
[0029]
Next, rice cDNA is synthesized from mRNA using a commercially available cDNA synthesis kit. The synthesized cDNA is incorporated into a phage vector such as a λgt11 vector or a λZAPII vector to obtain a large number of recombinant phages. When these recombinant phages are infected into E. coli as a host and incubated, a large number of recombinant phages can be obtained as plaques. These series of operations can be performed using a commercially available cDNA cloning kit.
[0030]
Thus, a large number of recombinant phages obtained as a lysis plaque of host E. coli are composed of a wide variety of phages containing the total rice-derived cDNA, and can be used as a rice cDNA library.
[0031]
(2) Construction of primers for PCR
A known nucleotide sequence of a wheat DHDPS gene (for example, a DNA sequence described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-127984) and a known nucleotide sequence of a corn DHDPS gene (for example, “Molecular & General Genetics” described above) The present inventors have found that there are nucleotide sequences that are conserved in common with each other and the DNA sequences described in Vol. 228, pages 287 to 293). With reference to the common base sequence thus found, the present inventors used two types of oligonucleotides (the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing below) as primers for the PCR method (complementary). DNA) and was constructed by chemical synthesis.
[0032]
(3) Preparation of probe DNA
In order to selectively amplify DNA encoding the desired rice DHDPS in the rice cDNA library obtained as a plaque consisting of a large number of recombinant phages, the primer comprising the above synthetic oligonucleotide is used. Therefore, DNA encoding a part of the rice DHDPS gene is amplified from the rice cDNA library as a template by the PCR method.
[0033]
After the amplification reaction is repeated by the PCR method, an amplification product of a DNA fragment that is a part of the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene is collected as a probe DNA from the amplification reaction solution.
[0034]
(4) Selection of DNA of rice DHDPS gene from rice cDNA library
From the large number of recombinant phage plaques previously obtained as a rice cDNA library, the phage plaque-hybridization method using the probe DNA as a screening material as a whole supports the target rice DHDPS gene. Several plaques consisting of recombinant phage incorporating the DNA sequence to be selected are selected.
[0035]
Thus, a DNA fragment containing a target DNA sequence corresponding to the DNA of rice DHDPS gene can be collected in the form of a recombinant phage incorporating the DNA fragment.
[0036]
Specifically, plaque phages selected by plaque hybridization as described above are collected, and phage DNA is further recovered from the collected phages. By treating the recovered phage DNA by the dideoxy method or the like, the base sequence of the rice-derived inserted DNA fragment can be determined. Homology is determined by comparing the amino acid sequence defined from the protein coding region (open reading frame) in the base sequence of the DNA sequence derived from rice with the amino acid sequences of known corn DHDPS and wheat DHDPS proteins. By doing so, it can be identified that the DNA fragment contains the DNA sequence corresponding to the DHDPS gene of rice.
[0037]
Therefore, the inserted DNA fragment determined to contain therein the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene can be obtained by cutting out from the phage DNA of the collected phage selected as described above with a restriction enzyme.
[0038]
(5) Cloning of cDNA corresponding to rice DHDPS gene
As described above, DNA obtained by excising from phage as a DNA fragment containing the DNA sequence corresponding to rice DHDPS gene was inserted into the EcoRI cleavage site of plasmid vector pBluescript II SK (+). Ligate to construct a recombinant plasmid vector. E. coli XL1-Blue MRF 'is transformed with the thus constructed recombinant plasmid vector. When the Escherichia coli transformant thus obtained is cultured and grown, the above-mentioned recombinant plasmid carrying a DNA fragment containing a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene can be cloned. Therefore, a DNA fragment containing a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene can be cloned.
[0039]
(6) Sequence analysis of cloned DNA
A DNA fragment containing the DNA sequence corresponding to the gene is excised from the cloned recombinant plasmid with an appropriate restriction enzyme. When the excised DNA fragment is treated with a commercially available nucleotide sequencing kit, the nucleotide sequence of DNA containing therein the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene can be determined. The base sequence of the DNA sequence having the base sequence determined in this manner and encoding the rice DHDPS gene is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later.
[0040]
When the DNA sequence of the first invention obtained as described above or a DNA fragment containing the DNA sequence is used as a probe, DNA of the DHDPS gene can be obtained from the rice chromosome itself by a conventional method. However, the DNA of the DHDPS gene obtained from the rice chromosome itself is expected to contain an intron. It is recognized that the DNA divided by such an intron is also included in the DNA of the first invention as long as it is a DNA encoding rice DHDPS.
[0041]
A DNA fragment obtained in Example 1 described later and containing a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was inserted into the p Bluescript SK (+) plasmid vector. Concatenated. Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ transformed by the introduction of the recombinant plasmid vector thus obtained is named Escherichia coli DAP8-1, and is the life of the Industrial Technology Institute of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Deposited at the Institute of Industrial Science and Technology on October 14, 1996, with a deposit number of FERM P-15906. Furthermore, Escherichia coli DAP8-1 has been deposited with the above-mentioned research institute under the terms of the Budapest Treaty under the terms of the FERM BP-6310 since March 26, 1998.
[0042]
The DNA according to the first aspect of the present invention is useful in that a large amount of rice DHDPS protein can be obtained by chemical synthesis by using as a guide the base sequence of the DNA elucidated in the present invention. , And can contribute to the enzymological study of rice DHDPS protein.
[0043]
Furthermore, the DNA sequence according to the first aspect of the present invention or an appropriate DNA fragment containing the DNA sequence is ligated to the end with an EcoRI linker, and then Eac of a commercially available plasmid vector pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) is used. A recombinant vector can be constructed by inserting into the NcoRI cleavage site downstream of the promoter. E. coli transformed with the recombinant vector thus constructed is expected to be able to produce a protein having DHDPS activity in the cells when cultured. Therefore, it is expected that a protein having rice DHDPS activity can be produced by culturing E. coli transformed with the above recombinant vector so that the DNA according to the first invention can be expressed.
[0044]
On the other hand, in general, one or more amino acids in the amino acid sequence constituting a protein having physiological activity are deleted and / or substituted with other amino acids, and / or It is widely recognized by those skilled in the art that even if an amino acid sequence in which one or more amino acids are added to the amino acid sequence, the physiological activity of the protein of the original amino acid sequence may be maintained. The DNA of the first aspect of the present invention can be a DNA encoding a protein having DHDPS activity even after modification is made to a part or a part of the base sequence.
[0045]
In other words, the DNA according to the first aspect of the present invention can be obtained by modifying one or more bases in the base sequence thereof, for example, 1, 2 or 3 to 10 bases, to another base. It can retain the ability to encode a protein having DHDPS activity.
[0046]
Therefore, in the second aspect of the present invention,It has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.A DNA encoding a protein having dihydrodipicolinate synthase activityA, ie the DNA of claim 1 or the DN of claim 3 A isProvided.
[0047]
The DNA according to the second aspect of the present invention is a DNA modified from the DNA according to the first aspect of the present invention. It is obtained by modifying the base sequence of the DNA of the first invention so as to encode a protein having an amino acid sequence in which the amino acid at the site is deleted, substituted or added in the manner described above.
[0048]
In addition, the cell containing the DNA fragment containing the DNA of the first invention is subjected to mutation treatment, and for example, a stringent sequence is obtained from the mutated cell with respect to the DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. The modified DNA of the second aspect of the present invention can also be obtained by selecting a DNA that can hybridize under conditions but has a base sequence partially different from the base sequence of SEQ ID NO: 1. The term “stringent conditions” as used herein refers to conditions under which a so-called specific hybrid to the DNA of the first invention is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to specify this condition clearly by numerical values, for example, two nucleic acids having high homology, for example, DNA homologs having high homology of 98% or more are shown. Is allowed to hybridize, but nucleic acids with lower homology are not allowed to hybridize.
[0049]
Therefore, as a specific example, the DNA according to the second aspect of the present invention has a base sequence partially different from the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, but is different from the base sequence described in SEQ ID NO: 1. Can be hybridized under stringent conditions to a DNA having a high homology and having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and having a dihydrodipicolinate synthase activity DNA encoding a protein having
[0050]
A specific example of the DNA according to the second aspect of the present invention is a DNA sequence prepared by the method described in Example 2 below and designated as modified DNA-158N in Example 2.Columns (Claim 2) andThe DNA sequence prepared by the method described in Example 3 below and designated as modified DNA-166A in Example 3Columns (Claim 4) andThere is.
[0051]
The DNA arrangement designated as the modified DNA-158NThe column (Claim 2) isA DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing described later. This is because the 473th base A in the 472th, 473th, and 474th AAC sequences (codons encoding asparagine) in the first DNA of the present invention having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. One (adenine) is replaced with one T (thymine), which corresponds to DNA modified so that the sequence ATC (codon encoding isoleucine) is present at positions 472 to 474 of the base sequence. This modified DNA-158N sequence can be hybridized under stringent conditions to the DNA of the first invention.
[0052]
ThisModification of SEQ ID NO: 5The protein encoded by the modified DNA-158N sequence has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and has DHDPS activity.(See claim 1).
[0053]
Further, the modified DNA-166A sequence (see claim 4) encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and having DHDPS activity (see claim 3) is described in SEQ ID NO: 7 of the sequence listing. DNA having a base sequence. This is because the 497th base C (cytosine) in the 496th, 497th, and 498th GCA sequences (codons encoding alanine) in the first DNA of the present invention having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. 1) Substituting one for T (thymine) and corresponding to DNA modified so that the sequence GTA (codon encoding valine) is present at positions 496 to 498 of the base sequence. This modified DNA-166A sequence can hybridize under stringent conditions to the DNA of the first invention.
[0054]
The protein encoded by this modified DNA-166A sequence has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing and has DHDPS activity (see claim 3).
[0055]
Still another example of the modified DNA according to the second invention was formed by substituting the 473rd adenine with thymine and the 497th cytosine with thymine in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A DNA sequence having a base sequence, and depending on this DNA sequence, an amino acid formed by substituting the 158th asparagine with isoleucine and the 166th alanine with valine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing A protein having a sequence and having dihydrodipicolinate synthase activity is encoded.
[0056]
In general, as a method for modifying a base sequence in a partial region of a DNA sequence (Kunkel method “Methods in Enzymology”, Vol. 154, No. 367), oligonucleotide-direct dual amber method, and other methods are known. It has been.
[0057]
Since the original object of the present invention is to create a new variety plant transformed so as to produce seeds having a high lysine content, DHDPS involved in the biosynthesis pathway of lysine is used as a biosynthetic product. There is a need for DHDPS whose enzyme activity has been modified so that it is not subject to feedback inhibition of enzyme activity by lysine, as well as DNA encoding this modified DHDPS. Therefore, for the purpose of producing a novel modified DNA capable of encoding a novel DHDPS modified so as to eliminate the sensitivity of the enzyme for the inhibition of footback by lysine from the DNA of the first invention, The inventors conducted research. As a result, by combining the improved method of the known Kunkel method and the improved method of the oligonucleotide-direct dual amber method, 1 in a partial region of the base sequence of the first invention encoding rice DHDPS is obtained. The inventors have found that it is possible to replace one or two or more bases with another base.
[0058]
Furthermore, the conventional DHPPS gene modification described in US Pat. No. 5,545,545 and the tobacco DHDPS gene described in “The Plant Journal”, Vol. 8, No. 5, pp. 733-743. While referring to the technology relating to the modification of the plant and the technology relating to the transformation of plants using the bacterial DHDPS gene described in EP 0 485 970 A2, the present inventors have described the first DNA of the present invention. Obtained by replacing the 473th base, adenine (A) in the sequence listing, SEQ ID NO: 1 with thymine (T) or the 497th base, cytosine (C) with thymine (T). The modified enzyme DNA is modified so that it has an enzyme activity that is not subject to feedback inhibition by lysine. This expected specific idea of that should be encoded a novel protein capable of maintaining and DHDPS activity a Park protein was obtained.
[0059]
Based on this idea, the present inventors have conducted various studies. As a result of many trial and error tests, the inventors have developed a rice DHDPS gene constructed in the production of the first novel DNA of the present invention. DNA fragment containing the corresponding DNA sequence [i.e., DNA fragment excised from λ phage as described above, that is, DNA containing the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (hereinafter referred to as DHDPS-DNA-1143) Fragment] is inserted into and ligated with a DNA ligation kit between the EcoRI cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid vector p Bluescript II SK (+) (hereinafter referred to as pDAP8-1). Has been found to be suitable as starting material for the production of the novel modified DNA of interest.
[0060]
Further, as a plasmid that can be suitably used for preparing a novel modified DNA for such purpose according to the above-mentioned starting material, recombinant plasmid vector pDAP8-1 according to the PCR method, five types of primers, Plumer No. consisting of an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing below. 3 and a primer No. consisting of an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10. 4, a primer FW-1 composed of an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 11, a primer RW-1 composed of an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 12, and a base described in SEQ ID NO: 13 The present inventor prepared a primer BSKPN-1) comprising an oligonucleotide having a sequence by chemical synthesis.
[0061]
When the method described in detail below is carried out using the plasmid vector pDAP8-1 and the primers comprising the above five synthetic oligonucleotides, a specific example of the modified DNA according to the second invention will be described. Example Sequence Listing, DNA of SEQ ID NO: 5, ie, DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence, and DNA of SEQ ID NO: 7, ie, DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence Was able to succeed.
[0062]
The DNA according to the first aspect of the present invention, the modified DNA-158N sequence, the modified DNA-166A sequence, both of which are incorporated into a recombinant vector and described in Example 4 or 5 described later, are exogenous genes for plants. When introduced into a rice plant by the introduction method described above, it could be expressed in the transformed transgenic plant.
[0063]
A rice transgenic plant transformed with the first DNA of the present invention, or the modified DNA-158N sequence or the modified DNA-166A sequence of the second present invention is a rice plant cell or rice plant with enhanced lysine content. It was confirmed that seeds can be produced.
[0064]
Next, a DNA modification method that can be suitably used to produce a DNA fragment containing the above modified DNA-158N sequence according to the second aspect of the present invention and comprises the procedure exemplified in Example 2 described below will be summarized. I will explain it.
[0065]
(1) Cloning of the DNA of the first invention
Using the DNA ligation kit, the first DNA of the present invention consisting of 1143 bases described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, that is, the DNA fragment containing the DHDPS-DNA-1143 sequence described above is used as a vector. The recombinant plasmid vector pDAP8-1 is obtained by inserting and ligating between the EcoRI cleavage site of p Bluescript II SK (+). This vector pDAP8-1 is introduced into Escherichia coli XLI-Blue MRF ', and the transformed Escherichia coli thus obtained is propagated. A large amount of the recombinant plasmid vector pDAP8-1 is obtained from the grown Escherichia coli cells by extraction by a conventional method. Since this vector contains a large number of copies of the DNA fragment containing the DHDPS-DNA-1143 sequence, the first DNA of the present invention has been cloned.
[0066]
(2) Construction of primers for PCR
Using a DNA synthesizer (Model-391, manufactured by Applied Biosystems), five kinds of oligonucleotides having the following base sequences are synthesized as primers.
[0067]
(A) Primer No. 3 (primer described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and having the following base sequence): 5'-GCCTCTCTTTGTGAGATACACTCCTGTTGTGCC-3 '
(B) Primer No. 4 (a primer having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing and described below): 5'-GCAAATCCCTGCCTCTGTTACATGAATAGGCC-3 '
(C) Primer FW-1 (primer having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 11 of the Sequence Listing and described below): 5'-GTAAAACGACGCCCAGTGAG-3 '
(D) Primer RV-1 (primer having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12 of the Sequence Listing and described below): 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3 '
(E) Primer BSKPN-1 (a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 13 of the Sequence Listing and described below): 5'-TAGGGCGAATTGTGGTTACCG-3 '
(3) Amplification and recovery of required DNA fragments by PCR
In order to amplify a necessary DNA fragment, two reactions, that is, the following reaction (A) and reaction (B) are performed as the first stage of the PCR method.
[0068]
The (A) reaction consists of the recombinant plasmid vector pDAP8-1 used as a template, the primer FW-1 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 11) used as a primer, primer No. 3 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 9 and 15th to 17th GAT from the 5'-end can induce the modified portion ATC of the -DNA-158N sequence) and a normal reaction solution for PCR (Tris) -Containing HCl, MgCl2, KCl, four deoxynucleotide triphosphates (dNTP), and LaTaq DNA polymerase) followed by an amplification reaction. By this (A) reaction, a DNA fragment (referred to as DNA fragment-A) having a base sequence in a certain region of the DHDPS-DNA-1143 sequence is generated by an amplification reaction.
[0069]
In addition, (B) reaction is carried out by using the primer RV-1 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 12), the primer BSKPN-1 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 and the vector p DAP8-1 used as a template. Is added to the normal reaction solution for the same PCR method used in the reaction (A), followed by an amplification reaction, wherein (B) the reaction results in either of the above DHDPS-DNA-1143 sequences. A DNA fragment (referred to as DNA fragment-B) containing a base sequence in the region and containing an extended portion having a SacI cleavage site on the 3′-side is produced by an amplification reaction.
[0070]
The above amplification reaction by the PCR method can be carried out using a commercially available PCR reaction apparatus.
[0071]
After completion of the amplification reaction, the amplification reaction solution of the above reaction (A) is fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing a 480 bp (base pair) DNA fragment-A as an amplification product is extracted from the agarose gel. Cut out. Similarly, the amplification reaction solution of the (B) reaction is fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing 1200 bp (base pair) DNA fragment-B is cut out from the agarose gel.
[0072]
Then, the two gel slices are purified by a DNA purification kit, for example, GENECLEAN II kit (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.), thereby recovering a purified product of DNA fragment-A and a purified product of DNA fragment-B.
[0073]
Further, as the second stage of the PCR method, a DNA sequence having a base sequence obtained by substituting thiamine for the 473th adenine in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (ie, the base sequence of SEQ ID NO: 3) And a stretched portion having a KpnI cleavage site at the 5′-end of the DNA sequence and a stretched portion having a SacI cleavage site at the 3′-end. A step of preparing a DNA fragment having a sequence length of 1200 bp is contained. For this purpose, a purified product (sequence length 480 bp) of DNA fragment-A, which is the amplification product of the reaction (A) used as a template, and (B) DNA fragment-B, which is the amplification product of the reaction, are used. A purified product (sequence length 1200 bp), the primer RV-1 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 12), and the primer FW-1 (synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 11) were mixed with a conventional PCR method. It is added to the amplification reaction solution (containing Tris-HCl, MgCl2, KCl, four kinds of dNTPs, and La Taq DNA polymerase), and then the amplification reaction is performed. After completion of the reaction, the reaction solution is fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing an intended DNA fragment (referred to as DNA fragment-C) having a sequence length of 1200 bp is cut out from the agarose gel.
[0074]
The gel slice is purified by a DNA purification kit such as GENECLEAN II kit (Funakoshi Co., Ltd.) to obtain a purified product of DNA fragment-C. This DNA fragment-C contains a base sequence corresponding to the modified DNA-158N fragment according to the second aspect of the present invention, and has a stretched portion having a KpnI cleavage site at the 5'-end of the DNA sequence and a 3'-end. It has a structure containing an extending part having a SacI cutting site.
[0075]
(4) Cloning of DNA fragment containing modified DNA-158N sequence
Next, using the DNA fragment-C obtained in the above (3), a DNA fragment containing the target modified DNA-158A sequence (first example of the modified DNA according to the second invention) is obtained. To gain.
[0076]
For this purpose, first, the extending portions at the 5′- and 3′-ends of the above-mentioned DNA fragment-C are treated with the restriction enzyme KpnI and the restriction enzyme SacI.
[0077]
As a result, a DNA fragment containing a modified DNA-158A sequence containing an extended portion having a SacI cleavage site on the 3′-side and a 5′-side starting from ATG is cut out from the DNA fragment-C.
[0078]
In this way, a sample of a DNA fragment containing a DNA sequence corresponding to the target modified DNA-158A sequence is obtained. Next, the plasmid vector pBluescript II SK (+) is treated with the restriction enzymes KpnI and SacI to have a KpnI cleavage site at the 5′-end and at the other end of the 3′-end. A shortened plasmid with a site (hereinafter referred to as pBluescript II SK (+)-KpnI-SacI-shortened plasmid) is obtained.
[0079]
When this Kpn I-Sac I-shortened plasmid was mixed with a DNA fragment sample containing the above DNA-158N sequence and then subjected to a ligation reaction using a DNA ligation kit, a recombinant plasmid containing the modified DNA-158N sequence ( In the following, pBluescript-DNA-158N plasmid) can be prepared.
[0080]
The recombinant plasmid is introduced into E. coli XL1-Blue MRF ′ for transformation, and the transformed E. coli thus obtained is grown in a liquid medium. E. coli cells grown in large quantities contain a copy of the recombinant plasmid, i.e., p-Bluescript-DNA-158N plasmid. In this way, the modified DNA-158N sequence can be cloned. A plasmid containing the modified DNA-158N sequence is extracted from the E. coli cultured cells by a conventional method.
[0081]
(5) Recovery of modified DNA-158N fragment
The plasmid containing the modified DNA-158N sequence obtained in (4) above is then digested by treatment with restriction enzyme XbaI and restriction enzyme SacI.
[0082]
This digestion containing a DNA fragment containing a modified DNA-158N sequence having a base sequence ATG at the 5'-end adjacent to the XbaI cleavage site and an extension having a SacI cleavage site at the 3'-end A reaction solution can be obtained.
[0083]
The digestion reaction solution is fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and the band containing the DNA fragment is cut out from the agarose gel. When the excised agarose gel piece is dissolved in TE buffer and the resulting solution is extracted with phenol, the DNA fragment is recovered in the phenol extract. When the phenol extract containing the DNA fragment is mixed with 3M sodium acetate aqueous solution and ethanol, the mixture is allowed to stand at −20 ° C. for about 6 hours and further centrifuged at a low temperature to precipitate the DNA fragment. When this is dried under reduced pressure, a DNA fragment containing the desired modified DNA-158N sequence therein is obtained as a powder. This powder of DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence is soluble in water.
[0084]
Furthermore, the DNA modification method which can be suitably used for preparing the DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence according to the second aspect of the present invention and exemplified in Example 3 described later is the modified DNA described above. It can be carried out by a procedure similar to the method described above for the preparation of a DNA fragment containing the -158N sequence.
[0085]
That is, a suitable production method for producing a DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence is the same as that described in the section (1) of the method for producing a DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence. The recombinant vector pDAP8-1 containing the first DNA of the present invention (ie, DHDPS-DNA-1143) is introduced into Escherichia coli XLI-Blue MRF ′ and started from the cloning step. .
[0086]
Next, vector pDAP8-1 used as a template, primer FW-1 synthesized as an oligonucleotide, and Blimmer No. 4 (a synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 10, wherein the TAC at positions 18 to 20 from the 5′-end can induce the modified portion GTA of the modified DNA-166A sequence), and the DNA containing the modified DNA-158N sequence In addition to the usual reaction solution for the PCR method used in the reaction (A) described in the section (3) of the fragment production method, a step consisting of carrying out an amplification reaction is then carried out. By this amplification reaction, a DNA fragment having a base sequence in a certain region of the DHDPS-DNA-1143 sequence (referred to as DNA fragment-D) is generated.
[0087]
Next, the step (B) of the PCR method is performed in exactly the same manner as the (B) reaction performed in the procedure described in the step (3) of the method for producing the DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence. To be implemented. Thus, the DNA fragment-B is obtained as an amplification product from the reaction (B).
[0088]
The above primer FW-1 and primer No. The amplification reaction solution containing the DNA fragment-D produced by the (A) reaction using 4 is fractionated by subjecting it to low-melting point agarose electrophoresis. Thus, a band containing 480 bp DNA fragment-D as an amplification product is cut out from the agarose gel. In addition, the amplified reaction solution containing the DNA fragment-B produced by (B) reaction is similarly fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing 1200 bp DNA fragment-B is cut out from the agarose gel. . Furthermore, when these gel slices are purified using a DNA purification kit, the purified DNA fragment-D product and the purified DNA fragment-B product can be recovered.
[0089]
Furthermore, as a second stage of the PCR method, a DNA sequence having a base sequence obtained by substituting 497th base cytosine with thymine in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (ie, the base of SEQ ID NO: 7) A DNA sequence corresponding to a modified DNA-166A sequence having a sequence) and a stretched portion having a KpnI cleavage site at the 5'-end of the DNA sequence and a stretched portion having a SacI cleavage site at the 3'-end A step of preparing a DNA fragment having a sequence length of 1200 bp is performed. For this purpose, the DNA fragment-D purified product (sequence length 480 bp) used as a template, the DNA fragment-B purified product (sequence length 1200 bp), the primer RV-1 and the primer FW- 1 is added to the amplification reaction solution for PCR, and then the amplification reaction is performed. After completion of the reaction, the reaction solution is fractionated by low melting point agarose electrophoresis. A band containing the desired DNA fragment (referred to as DNA fragment-E) having a sequence length of 1200 bp is cut out from the agarose gel.
[0090]
The gel slice is purified by a DNA purification kit to obtain a purified product of DNA fragment-E. This DNA fragment-E internally contains a base sequence corresponding to the modified DNA-166A sequence according to the present invention, and has a stretched portion having a KpnI cleavage site at the 5'-end and a 3'-end. It has a structure containing an extending part having a SacI cutting site.
[0091]
Using this DNA fragment-E, a DNA fragment containing the target modified DNA-166A sequence (second example of the modified DNA according to the second invention) is obtained. For this purpose, DNA fragment-E is treated with restriction enzymes KpnI and SacI. As a result, a DNA fragment containing a modified DNA-166A sequence containing an extended portion having a SacI cleavage site on the 3′-side and a 5′-side starting from ATG is cut out from the DNA fragment-E.
[0092]
In this way, a sample of a DNA fragment containing a DNA sequence corresponding to the modified DNA-166A sequence is obtained. This DNA sample was ligated with the plasmid vector p Bluescript II SK (+) by using a DNA ligation kit in the same manner as described in the section (4) of the method for producing a DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence. The resulting recombinant vector can be cloned by transforming Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ and further proliferating.
[0093]
Furthermore, the plasmid containing the modified DNA-166A sequence thus cloned is recovered from E. coli cells. The plasmid is then treated by the same procedure as described in (5) of the method for producing a DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence. Thus, a DNA fragment containing the target modified DNA-166A sequence can be obtained as a 1143 bp DNA fragment in the form of a water-soluble powder.
[0094]
In the above description, the DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence according to the first example of the second invention and the DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence according to the second example of the second invention are: It was produced by a method using genetic engineering techniques. However, it can also be produced by a conventionally known polynucleotide chemical synthesis method with reference to the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
[0095]
The specific example of the second invention has been described in the case where the 473rd adenine or the 497th cytosine in the base sequence of the DNA of the first invention is substituted with thymine as described above. However, if the DNA of the first invention is used as a template and a combination of several kinds of synthetic oligonucleotides having a suitably designed base sequence is used as a primer, the 473th or 497th of the DNA of the first invention is used. It is possible to produce another modified DNA having a base sequence formed by substituting a base at a location different from the location with another base.
[0096]
In addition, the present inventors have made further research. As a result, the plant body is transformed by introducing the foreign gene into the plant body, and the first known technology is used to express the foreign gene in the resulting transgenic plant body. The novel DNA encoding DHDPS according to the present invention and the novel modified DNA encoding DHDPS according to the second present invention can be introduced into a plant after incorporation by a recombinant vector, and can be expressed in the plant. Was discovered.
[0097]
Therefore, in the third aspect of the present invention (the invention of claim 5),ofSecond invention encoding a protein having dihydrodipicolinate synthase activityD having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 according to MingA recombinant vector carrying NA is introduced and transformed.Rice plantA transformant characterized in that it has a living cell and is capable of expressing the introduced DNA.Convertible rice plantingThings are provided.
[0098]
Moreover, a plant transformed by the introduction of DNA according to the first invention or the second invention isTreeIf the plant is capable of fruiting seeds when cultivated, the plant should beTreeIt was found that plant seeds can be cultivated and harvested.
[0099]
Accordingly, in the fourth aspect of the present invention, the DNA obtained by introducing a recombinant vector carrying the DNA of the first aspect of the present invention encoding rice dihydrodipicolinate synthase into a plant cell and capable of expressing the DNA. The transformed plantTreeCultivate and furtherTreeProvided is a seed of a transformed plant, which is a seed collected from a plant that has been cultivated.
[0100]
According to a fifth aspect of the present invention, the DNA obtained by introducing a recombinant vector carrying the DNA according to the second aspect of the present invention encoding a protein having dihydrodipicolinate synthase activity into a plant cell, A transformed plant capable of expressionTreeCultivate and furtherTreeProvided is a seed of a transformed plant, which is a seed collected from a plant that has been cultivated.
[0101]
Furthermore, in the sixth aspect of the present invention, a DNA fragment containing a DNA sequence having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the site cleaved by the restriction enzyme EcoRI of the plasmid vector p Bluescript II SK (+) A transformed Escherichia coli comprising a recombinant plasmid formed by ligation with a gation kit and capable of stably growing in the presence of ampicillin is provided as a novel microorganism.
[0102]
The transformed Escherichia coli according to the sixth aspect of the present invention can be Escherichia coli DAP8-1 deposited at the National Institute of Biotechnology, Japan, with the accession number FERM BP-6310 under the terms of the Budapest Treaty.
[0103]
When a plant is transformed using the DNA according to the first invention or the DNA according to the second invention as a foreign gene, the types of plants that can be transformed are diverse and for plant transformation. The method of introducing the DNA of the present invention as a foreign gene into a plant can be various techniques of conventionally known biotechnology performed for that purpose.
[0104]
A method that can be suitably carried out for introducing the DNA of the first invention or the DNA of the second invention as a foreign gene into a rice plant and exemplified in Example 4 described below will be briefly described below.
[0105]
(1) Preparation of recombinant vector for introduction of foreign genes
When a known plasmid vector pBI221 (manufactured by Clontech) containing a cauliflower mosaic virus 35S promoter, a NOS terminator, and an ampicillin resistance gene is treated with a restriction enzyme XbaI and a restriction enzyme SacI in a buffer, the 35S promoter A vector DNA fragment having a size of about 3.8 kb is obtained that is cleaved at the XbaI cleavage site downstream of the NOS terminator and cleaved at the SacI cleavage site upstream of the NOS terminator.
[0106]
An aqueous solution of the vector DNA fragment is mixed with an aqueous solution of the DNA of the present invention, and the mixture is treated with a DNA ligation kit to perform a ligation reaction. According to this, a recombinant vector in which the DNA of the present invention is inserted and linked between the 35S promoter region and the NOS terminator region of the vector DNA fragment is obtained.
[0107]
The resulting recombinant vector is introduced into E. coli XL1-Blue MRF 'to obtain transformed E. coli.
[0108]
The resulting transformed Escherichia coli is inoculated and cultured in a medium containing the antibiotic ampicillin to obtain several ampicillin resistant Escherichia coli colonies. These colonies are further grown separately in a medium containing ampicillin.
[0109]
The plasmid is collected from each ampicillin-resistant Escherichia coli grown for each colony. The recovered plasmid includes various plasmids having different insert DNA directions. The plasmid collected for each colony was digested with restriction enzymes XbaI and SacI, and digestion reaction solutions containing various DNA fragments excised were subjected to agarose gel electrophoresis to determine the size and base sequence of these DNA fragments. When analyzed, an appropriate plasmid (about 4.9 kb in size) in which the DNA of the present invention is inserted and ligated in the normal orientation downstream of the 35S promoter of the recombinant plasmid can be selected.
[0110]
The recombinant plasmid in which the DNA of the first invention is normally inserted and linked is called vector pDAP, and the recombinant plasmid in which the modified DNA-158N fragment according to the second invention is normally inserted and linked is called Vector p158N. In addition, the recombinant plasmid into which the modified DNA-166A fragment according to the second aspect of the present invention has been normally inserted and linked is referred to as vector p166A. Each of these vectors contains the DNA fragment of the present invention, a 35S promoter region, a NOS terminator region, and an ampicillin resistance gene (Amr).
[0111]
(2) Preparation of rice callus
Rice husks are removed from the mature rice seeds, and the resulting hulled rice seeds are sterilized with an ethanol solution, then sterilized with a dilute aqueous solution of sodium hypochlorite, and further washed with sterilized water.
[0112]
The rice seeds with the outer shell are placed in a medium for callus formation composed of MS medium with sucrose, 2,4-PA as a plant hormone, and agar. When cultivated at 28 ° C. for 15 to 18 hours per day with irradiation of 1500 to 2500 lux of sunlight for 40 to 50 days, rice callus is formed. The callus is cut from the endosperm portion of the seed, and further, callus having a size of 1 mm or less is obtained by sieving.
[0113]
(3) Preparation of whiskers for gene delivery
A large number of commercially available whiskers (fine needles) made of potassium titanate are placed in a small tubular container and sterilized with ethanol. The ethanol is completely removed by evaporation. Sterilized water is poured into the tubular container containing whiskers sterilized in this way and washed, and the washing solution is removed from the container by centrifugation. An R2 liquid medium is added to a tubular container containing the washed whisker to obtain a whisker suspension.
[0114]
(4) Preparation of materials for introducing foreign genes into rice callus cells
A recombinant vector (ie, the vector p DAP, the vector p 158N, or the vector p 166A) prepared as described in (1) above, into which the DNA of the present invention is normally inserted and ligated, is added to a TE buffer solution. Prepare a vector solution by dissolving.
[0115]
The above-mentioned callus having a size of 1 mm or less is charged into a tubular container that accommodates the above whisker suspension. The amount of whisker is 1 to 100 mg per 1 ml of PCV of the cell volume of callus. The mixture in the vessel is further stirred and then centrifuged. When the supernatant is discarded, a mixture of rice callus cells and whiskers is obtained as a precipitate.
[0116]
A solution of the recombinant vector containing the DNA of the present invention (ie, vector p DAP, vector p 158N or vector p 166A) and a herbicide into the precipitate consisting of the mixture of the callus cells and whiskers in the tubular container. A solution of a known plasmid vector p35SC-SS containing a gene resistant to phosphinothricin as a selection marker is added and shaken thoroughly. In this way, a homogeneous mixture of callus cells, whiskers, the recombinant vector containing the DNA of the present invention, and the plasmid vector p35SC-SS is obtained. By repeatedly subjecting this mixture to centrifugation and shaking, a more homogeneous mixture is obtained.
[0117]
(5) Operation of introduction of foreign genes into rice callus
A homogeneous mixture consisting of callus cells, whiskers, recombinant vector containing the DNA of the present invention, and plasmid vector p35SC-SS prepared as shown in (4) above is treated by sonication. The ultrasonic wave to be used can have a frequency of 10 to 60 KHz, and the irradiation intensity can be 0.1 to 1 W / cm 2. When sonication is performed for 30 seconds to 2 minutes, the recombinant vector containing the DNA of the present invention and the plasmid vector for the selection marker are introduced into callus cells with the help of the physical action of ultrasonic waves and whiskers. Can be intruded.
[0118]
(6) Selection of callus cells transformed with the transfer vector
The mixture sonicated as described above is washed with R2 liquid medium, and the washed mixture is centrifuged to separate callus cells from whiskers. The isolated callus cell is a transformed cell containing the above plasmid vector introduced into the cell.
[0119]
Callus cells containing the plasmid vector are placed in a plant cell culture medium prepared by adding sucrose and plant hormone 2,4-PA to R2 medium, and light of 1500 to 2000 lux is applied for 15 to 20 hours per day. Culture with shaking at 27-29 ° C. while irradiation. This causes callus cells to proliferate through cell division.
[0120]
After culturing for 2 to 3 days, the obtained suspension of divided plant cells is selected by adding sucrose, 2,4-PA, gellite and the herbicide phosphinothricin to N6 medium. Spread evenly on the medium (semi-solid) and add. Furthermore, it culture | cultivates for 25 to 30 days at 27-28 degreeC, irradiating the light of 1500-2000 lux for 15-20 hours per day. Thus, plant cells that are resistant to phosphinothricin and transformed with the transfer vector are obtained.
[0121]
(7) Reselection of transformed plant cells
Only transformed plant cells containing the DNA of the present invention in a sufficiently effective amount as a foreign gene are re-selected from the phosphinothricin-resistant transformed plant cells obtained as described above.
[0122]
For this purpose, the former transformed cells are added to N6 medium with sucrose, 2,4-PA, gellite, and AEC which is an analog of lysine (ie, S- (2-aminoethyl) cysteine). Transplanted onto the reselection medium.
[0123]
The transplanted cells are cultured at 27-28 ° C. for 25-30 days with irradiation at 1800-2000 lux for 15-16 hours per day.
[0124]
A transformed plant cell containing the DNA of the present invention in a sufficiently effective amount as a foreign gene is AEC resistant and can grow even if AEC acting as a cell growth inhibitor is present in the medium. AEC-resistant cultured plant cells that can grow on the above-mentioned medium supplemented with AEC are selected.
[0125]
(8) Regeneration of plant bodies from reselected AEC-resistant transformed plant cells
Differentiated culture medium for plant regeneration comprising AEC-resistant cultured plant cells reselected as described above, and sucrose, benzyladenine as plant hormones, naphthalene acetic acid, and gellite added to MS medium for plant tissue culture To transplant.
[0126]
The transplanted cells are cultured at 27-28 ° C. for 25-30 days while irradiating with 1800-2000 lux light for 15-16 hours per day. Thus, buds and roots can be regenerated from the cultured transformed plant cells by differentiation.
[0127]
After regenerated shoots and roots containing shoots grow to a length of 10 to 30 mm, the shoots are transplanted to an acclimation medium comprising sucrose and gellite added to MS medium. Furthermore, it grows for 18 to 20 days at 27 to 28 ° C. while irradiating light of 1800 to 2000 lux for 15 to 16 hours per day.
[0128]
In this way, transformed plants can be regenerated. Plants obtained in this way are transplanted to soil in a greenhouse under normal conditions.TreeWhen cultivated, it grows in order and grows 3-6 monthsTreeRice seeds can be cultivated by cultivation.
[0129]
(9) Confirmation of introduced foreign gene
Green leaves are collected from the transformed rice plant regenerated as described above. The collected leaves are frozen with liquid nitrogen and then crushed. From the crushed leaves, J. DNA is extracted according to the method of Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
[0130]
On the other hand, an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing below and an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 are chemically synthesized and used for the primer.
[0131]
Using the DNA extracted from the regenerated rice plant as described above as a template and using the above-mentioned two synthetic oligonucleotides as primers, the DNA is amplified by a known PCR method. The obtained amplification reaction solution is fractionated by agarose electrophoresis by a conventional method, and contains DNA fragments corresponding to the introduced foreign gene DNA among various DNA fractions extracted from regenerated rice plants. Take a gel band.
[0132]
When the base sequence of the DNA fragment contained in this band is analyzed by a known Southern method, it can be confirmed whether it corresponds to the DNA of the present invention.
[0133]
In the above, the suitable transformation method which can introduce | transduce this invention DNA into a rice plant as a foreign gene, and can transform a rice plant was demonstrated. However, the DNA of the present invention can be used to transform plants by introducing them not only into rice plants but also into other kinds of plants as foreign genes. Therefore, a method for introducing the DNA of the present invention into a foreign gene into a plant body will be generally described below.
[0134]
The plant into which the DNA of the present invention can be introduced is not particularly limited, and examples thereof include rice, corn, wheat, barley, and other monocotyledonous plants, as well as tobacco, soybean, cotton, tomato, Chinese cabbage, cucumber, Examples include dicotyledonous plants such as lettuce. First, it is convenient to prepare cultured cells from these plants and introduce the DNA of the present invention into the obtained cultured cells as a foreign gene.
[0135]
Production of the cultured cells used for DNA introduction of the present invention may be any plant-derived explant, such as scutella, growth point, pollen, cocoon, leaf blade, stem, petiole, root-derived outside. You can use breeds.
[0136]
The explants described above can be used as a callus-forming medium, such as MS medium (Murashige et al., “Physiology Plantarum”, 1962, Vol. 15, pages 473-497), or R2 medium (Ojima et al., “Plant and Cell” Physiology ", 1973, Vol. 14, 1113-1112, or N6 medium (Chu et al., 1978," In Proc, Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking ", pages 43-50, etc. In a plant tissue culture medium containing an inorganic salt component and vitamins as components, for example, 2,4-PA (2,4-diphenylphenolic acid) 0.1-5 mg / liter as a plant hormone, In addition, as a carbon source, for example, using the cultured cells obtained by culturing by placing on a medium containing 10 to 60 g / liter of sucrose and 1 to 5 g / liter of gellite, It is convenient to introduce.
[0137]
Plant cells to which the DNA of the present invention is to be introduced include, for example, cultured cells such as callus and suspension cells, cultured cells such as somatic embryos, shoot primordia, or plant tissues such as leaves, roots, stems, embryos Callus cells and suspension cells made from cells such as growth points are preferred.
[0138]
In order to prepare cultured cells for introducing the DNA of the present invention, when explants are placed on the callus-forming medium, the culture period until the cultured cells for introducing the DNA of the present invention are obtained is particularly limited is not. However, since it is necessary to regenerate the transformed plant, it is possible to regenerate the plant body from the cultured cell, that is, the plant cell can be obtained within a period in which the plant cell has the ability to regenerate the plant body. It is important to use cultured cells.
[0139]
Moreover, the cultured cell for introducing the DNA of the present invention may be a suspended cell cultured in a liquid medium as long as it is a cultured cell possessing plant regeneration ability.
[0140]
In order to introduce the DNA of the present invention into plant cells, it is necessary to prepare a recombinant vector in which the DNA of the present invention is incorporated into an expression vector. The recombinant vector is arranged such that the DNA of the present invention is placed downstream of the expression promoter and a terminator is placed downstream of the DNA of the present invention so that the DNA of the present invention after introduction into the plant is expressed in the plant. Requires a conditioned recombinant vector. The recombinant vector used for this purpose can be various vectors used for normal plant transformation, depending on the type of introduction method into the plant. For example, when a direct DNA introduction method into plant cells by electroporation method, particle gun method, whisker method or the like is used, a plasmid vector that can be propagated in E. coli such as pUC system or pBR322 system is used. In addition, when the Agrobacterium method is used, it is preferable to use a plasmid vector such as a plan system.
[0141]
The promoter placed upstream of the DNA of the present invention in the recombinant vector is, for example, CaMV35S “The EMBO Journal” derived from cauliflower mosaic virus, Vol. 6, pages 3901 to 3907, 1987, or No. 315381 ”, corn ubiquitin promoter [JP-A-2-79983], phaseolin promoter“ Plant Cell, Vol. 1, pages 839-853, 1989 ”. The terminator placed downstream of the DNA of the invention is, for example, a terminator derived from cauliflower mosaic virus or a terminator derived from a nopaline synthase gene [The EMBO J. Vol. 6, pages 3901 to 3907, 1987]. Good, but planting If the promoter and terminator that functions in the body, may be any.
[0142]
Further, in order to efficiently select plant cells transformed by introduction of the DNA of the present invention, the above-mentioned recombinant vector to be used should be introduced into plant cells together with a plasmid vector containing an appropriate selection marker gene. Is preferred. The selectable marker gene used for this purpose is resistant to the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotic hygromycin, or the neomycin phosphotransferase gene that is resistant to kanamycin and gentamicin, or the herbicide phosphinothricin. It can be an acetyltransferase gene [The EMBO Journal, Vol. 6, pages 2513 to 2518, 1987, or JP-A-2-171188].
[0143]
Methods for introducing the DNA of the present invention into a plant as a foreign gene include the Agrobacterium method [Bio / technology, Vol. 6, pages 915 to 922, 1988], electroporation method [Plant cell Rep. , Vol. 10, pp. 106-110, 1991], particle gun method [Theor. Appl. Genet. 79, 337-341, 1990], whisker method, but is not particularly limited thereto.
[0144]
When the whisker method is used to introduce the DNA of the present invention into a foreign gene, the whisker that can be suitably used is specifically 0.01 to 10 μm in diameter, preferably 0.5 to 1 μm in length. Is 1 to 100 μm, preferably 3 to 40 μm. The whisker material may be potassium titanate, calcium carbonate, aluminum borate, silicon nitride, zinc oxide, basic magnesium sulfate, magnesia, magnesium borate, carbon graphite, calcium sulfate, sapphire, or silicon carbide. Preferably, whisker made of potassium titanate, calcium carbonate, or aluminum borate is preferable.
[0145]
Whisker used here can be used alone without surface treatment, but whisker having a basic functional group on the whisker surface, preferably whisker surface-treated with a surface treatment agent, The transformation rate can be increased.
[0146]
The compound used for imparting the basic functional group to the whisker surface is not particularly limited as long as it can be covalently bonded to the whisker surface. Preferred are silane coupling agents, more preferred are silanes having a basic functional group, and coupling agents. As the silane coupling agent, basic silane coupling agents such as 3- (2-aminoethoxylaminopropyl) -trimethoxysilane and 3-aminopropyl-triethoxysilane can be used. Any silane coupling agent having a basic functional group can be used.
[0147]
The amount of plant cells mixed with the whisker is appropriately adjusted. However, the volume of plant cells mixed with whisker is not limited to a specific value. The amount of whisker mixed with the plant cells in the medium liquid should be adjusted with the volume of the plant cells. It is preferable that whisker is added in an amount of 1 to 100 mg, preferably 4 to 40 mg per 1 ml of PCV of plant cells.
[0148]
In this way, a mixture of plant cells, whiskers and a recombinant vector containing the DNA of the present invention dispersed in a medium liquid is made. This mixture is then centrifuged.
[0149]
For example, the centrifugal acceleration is 3,000 to 50,000 × g, preferably 10,000 to 30,000 × g, and the centrifugation time is 10 seconds to 40 minutes, preferably 5 to 10 minutes. The resulting precipitate is then subjected to sonication. For example, the ultrasonic treatment has a frequency of 1 k to 1 MHz, preferably 10 to 60 kHz, an irradiation time of 0.2 seconds to 20 minutes, preferably 30 seconds to 2 minutes, and an intensity of 0.01 to 10 W / Ultrasonic irradiation may be performed at cm 2, preferably 0.1 to W / cm 2.
[0150]
Plant cells are separated from the sonicated mixture by centrifugation. The obtained plant cell contains the introduced recombinant vector containing the DNA of the present invention and a plasmid vector for a selection marker.
[0151]
The plant cell introduced with the foreign gene thus obtained is washed with a liquid medium or the like. Thereafter, the cells are placed on a known selection medium containing an appropriate selection drug according to the type of selection marker gene introduced into the cells and cultured. Thereby, transformed cultured plant cells can be obtained.
[0152]
Next, in order to efficiently reselect transformed cells containing a sufficiently effective amount of the recombinant vector containing the DNA of the present invention, the cells are cultured on a medium to which a lysine analog that is a cell growth inhibitor is added. As the lysine analog, for example, S- (2-aminoethyl) -cysteine (AEC) or O- (2-aminoethyl) -serine is 10 mg / l to 1000 mg / l, preferably 100 mg / l to 300 mg / l. It can be added to the reselection medium at a concentration.
[0153]
Next, the plant body is regenerated from the transformed plant cell containing the recombinant vector in which the DNA of the present invention reselected as described above is incorporated as a foreign gene and the vector for the selection marker. The regeneration of the plant body can be performed in a known manner. For example, plant bodies can be regenerated by placing the transformed plant cells reselected as described above on a known plant regeneration medium and culturing them.
[0154]
The transformed cells placed on the plant regeneration medium are cultured at a temperature of 15 to 30 ° C., preferably 20 to 28 ° C. while irradiating with a light of 500 to 2000 lux, preferably 800 to 1000 lux. Culturing is performed for -60 days, preferably 30-40 days.
[0155]
Thus, a transformed plant body can be regenerated by introducing a recombinant vector carrying a foreign gene containing the DNA of the present invention from individual plant cells.
[0156]
The plant body regenerated from the transformed cells is then cultured in an acclimation medium. After that, the acclimatized regenerated plant body is put in the normal greenhouse.TreeWhen grown under culturing conditions, 3-6 monthsTreeBy culturing, the plant body matures and bears fruit to obtain seeds.
[0157]
It should be noted that this is reproduced andTreeThe presence of the introduced foreign gene in the cultivated transformed plant body is determined by the known PCR method and Southern method (Southern, “J. Mol. Biol.,” 98, 503-517, 1975). This can be confirmed by analyzing the base sequence of DNA in the body.
[0158]
In this case, the extraction of DNA from the transformed plant body is carried out by the known J.P. It can be carried out according to the method of Sambrook et al. (“Molecular Cloning” 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
[0159]
When the foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant body is analyzed using the PCR method, the DNA extracted from the regenerated plant body as described above is used as a template and the first book Using the oligonucleotide according to the invention or the synthesized oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the modified DNA according to the second invention as a primer, mixing them and adding them to the PCR reaction solution for amplification Perform the reaction. In this amplification reaction, when DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times, an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention can be obtained.
[0160]
When the reaction solution containing the amplified product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, various amplified DNA fragments are fractionated. A band agarose gel piece containing a DNA fragment recognized to contain a DNA sequence corresponding to the DNA of the present invention, which is an introduced foreign gene, is cut out. When the base sequence of the DNA sequence of the DNA fragment contained in the cut gel piece is analyzed by the Southern method, it can be confirmed whether the DNA sequence corresponds to the DNA of the present invention.
[0161]
In the seventh aspect of the present invention (invention of claim 6), a plasmid vector containing a promoter derived from cauliflower mosaic virus and capable of being expressed in plants, a NOS terminator, and an ampicillin resistance gene is used. underThe arrayA recombinant vector comprising a DNA fragment carrying a DNA sequence having the base sequence of 1143 bp described in No. 5 or SEQ ID No. 7 is provided.
[0162]
The plasmid vector is preferably a plasmid vector pBI221 (Claim 7).
[0163]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The following examples exemplify the production of a DNA fragment containing a DNA sequence having a sequence length of 1143 bp according to the first invention (DNA sequence having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, ie, DHDPS-DNA-1143 sequence) The first aspect of the present invention will be specifically described with reference to FIG. In addition, Example 2 illustrating the production of a DNA fragment containing a modified DNA-158N sequence (DNA sequence having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 of the Sequence Listing) having a sequence length of 1143 bp according to the second invention, and Referring to Example 3 illustrating the production of a DNA fragment containing a modified DNA-166A sequence (DNA sequence having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the Sequence Listing) having a sequence length of 1143 bp according to the present invention, the second The present invention will be specifically described.
[0164]
Further, referring to Example 4 illustrating a method for transforming a rice plant by introducing the DNA of the present invention incorporated into a recombinant vector into a rice plant as a foreign gene, the third invention is specifically described. explain.
[0165]
However, the procedure of the experimental operation described in the following examples is the same as the method described in “Molecular Cloning” 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) unless otherwise specified. I followed.
[0166]
Example 1
(1) Preparation of rice mRNA
Rice (variety: Nipponbare) seeds were sown.TreeThe stems and leaves of seedlings on the seventh day of cultivation were frozen with liquid nitrogen. The frozen foliage was crushed in a mortar. About 2 mg of total RNA is extracted from the pulverized product in accordance with the well-known AGPC method (using Acid Guanidinium thiocyanatec phcnol-chloroform) (Experimental Medicine, Vol. 9 No. 15 (November) 1991, pages 99 to 102) did. Next, mRNA was isolated from the obtained total RNA using an mRNA purification kit (Pharmacia Biotech, mRNA Purification Kit). Thus, about 30 μg of rice mRNA was obtained.
[0167]
(2) Construction of rice cDNA library
From the mRNA obtained in (1) above, cDNA was obtained using a cDNA synthesis kit (Pharmacia Biotech, Time Saver cDNA Synthesis Kit).
[0168]
Λ gt11 phage vector in which EcoRI cut ends were treated with calf intestine-derived alkaline phosphatase [see DNA Cloning Technologies, IRL Press, Oxford, 49 (1985); ambda gt11 / EcoRI / ClAP-Treated Vector Kit The resulting recombinant phage was packaged into lambda phage using an in vitro packaging kit (Gigapack II Gold Packaging Extract (manufactured by STRATAGENE)).
[0169]
The recombinant phage thus obtained was propagated by infecting E. coli Y1088. A number of recombinant phages were obtained as lytic plaques of E. coli. The phages in the plaque consisted of a wide variety of phages containing all the rice-derived cDNAs, and were used as rice cDNA libraries.
[0170]
(3) Construction of primers for PCR
In order to prepare a DNA probe for cloning a cDNA fragment encoding rice DHDPS for the PCR method, first, a primer was designed. For this purpose, two types of oligonucleotides having the following base sequences are used as primer No. 4 with reference to the nucleotide sequences of the known wheat and corn DHDPS genes and DHDPS amino acid sequences. 1 and primer no. 2 was produced.
[0171]
Blimmer No. 1 (having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing): 5′-GTAATAGTTGGAGAACAACAGGAG-3 ′
Primer No. 2 (having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing): 5′-GAGCTGAGCCAGAGCAGTGTTGAG-3 ′
The above-mentioned oligonucleotides were prepared by synthesizing oligonucleotides using a DNA synthesizer (Model 391, manufactured by Applied Biosystems) and further purifying by ion exchange HPLC.
[0172]
(4) Preparation of probe DNA
Next, 10 p. Using M as the first primer and the second primer, 1 μl of the cDNA library consisting of the recombinant phage obtained in (2) above was used as a template, and these were used as an amplification reaction solution for PCR (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 0.001% gelatin, pH 8.3; 2.5 mM each mixture of 4 nucleotides dNTPs, and DNA polymerase Takara Ex Taq, 2 .5 units) in addition to 50 μl, an amplification reaction was performed. The amplification reaction solution used here was prepared using a PCR kit (PCR Amplification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)).
[0173]
PCR amplification (DNA, Thermal Cycler 480) was used to amplify the DNA by PCR. Denaturation was 94 ° C for 30 seconds, annealing was 55 ° C for 1 minute, and extension was performed. Three reaction operations performed at 72 ° C. for 2 minutes were repeated 35 times.
[0174]
If it carries out as mentioned above, since the amplified product of the DNA fragment which is a part of DNA sequence corresponded to a rice DHDPS gene is produced | generated, this is extract | collected as probe DNA. And it used for the cloning of the following cDNA libraries.
[0175]
(5) Selection of DNA of rice DHDPS gene from rice cDNA library
A recombinant phage incorporating a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene is screened from the recombinant phage which is a rice cDNA library prepared in (2) above, using the probe DNA prepared in (3) above.
[0176]
For this purpose, plaques of recombinant phage, which is the rice cDNA library obtained in (2) above, were formed on a 1.5% agar medium. The plaques were transferred to nylon membrane (Amersham) High Bond N. Phage DNA contained in the phage plaque thus transferred to the nylon membrane is alkaline denaturation solution (1.5M NaCl, 2.0M NaOH) and neutralization solution (1.0M Tris-HCl pH5, 2.0M NaCl). ) For 10 minutes each, and then fixed on the nylon membrane by UV irradiation.
[0177]
Next, the labeled probe DNA obtained by labeling the probe DNA obtained in the above (4) with digoxigenin (DIG) was subjected to plaque hybridization to a nylon membrane on which phage DNA was immobilized. Labeling of the probe DNA was performed by DIG-ELISA DNA Labeling & Detection Kit (manufactured by Boehringer Mannheim).
[0178]
In this case, the nylon membrane on which the phage DNA was immobilized was immersed in a hybridization solution (500 mM Na-Pi buffer, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA), and further immersed at 65 ° C. for 10 minutes. Next, the DIG-labeled labeled probe DNA (10 ng / ml) was added, and a hybridization reaction was performed at 65 ° C. for 15 hours.
[0179]
After the reaction is completeNylon filmWashing was performed 3 times for 20 minutes each with a washing solution (40 mM Na-Pi buffer, pH 7.2, 1% SDS). Then, the target recombinant phage was detected using said DIG-ELISA Labeling & Detection Kit. It is possible to detect 4 recombinant phage plaques that hybridize and emit a strong signal on X-ray film, that is, phage plaques that seem to incorporate the DHDPS gene from 300,000 phage plaques. It was. The four recombinant phage plaques were isolated and selected.
[0180]
From each of these four recombinant phages, λ DNA was isolated separately for each four phage plaques using a λ DNA isolation kit (Lambda DNA Purification Kit (manufactured by STRATAGENE)).
[0181]
In this case, λ DNA was isolated as follows. That is, 50 μl of DNase I (20 mg / ml) and 200 μl of RNase A (2 mg / ml) were added to 5 ml of a culture solution in which each phage was grown in large quantities, and left at room temperature for 15 minutes. The obtained phage growth solution was centrifuged at 15000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes. To the obtained supernatant, 25 ml of 80% DEAE-cellulose was added and incubated at room temperature for 10 minutes. The mixture thus incubated was centrifuged, and 2 ml of 0.5M EDTA and 770 μl of Pronase (50 mg / ml) were added to the resulting supernatant, and left at 37 ° C. for 15 minutes. Further, 1.5 ml of 5% CTAB solution (1% CTAB (Cetyltrimethyl-ammoudium bromide), 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA) was added. The resulting mixture was treated at 65 ° C. for 3 minutes and then left on ice for 5 minutes. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to each reaction solution thus obtained, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for about 6 hours. Thereafter, this solution was centrifuged, and the precipitated phage DNA was removed. Dried and dissolved in 5 ml water and stored.
[0182]
Five μl of each of the four types of phage DNA isolated as described above was digested with 10 units of restriction enzyme EcoRI in H buffer, and the digestion reaction solution was analyzed. As a result, it was confirmed that these phage DNAs had the same DNA sequence.
[0183]
Therefore, the inserted DNA fragment in the phage determined to contain a DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene could be obtained by cutting out from the phage DNA of the collected phage selected as described above with the restriction enzyme EcoRI.
[0184]
(6) Cloning of cDNA containing DNA sequence corresponding to rice DHDPS gene
As described above, as a DNA fragment determined to contain the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene, the DNA fragment obtained by excision from the phage was used as an EcoRI cleavage site of the plasmid vector pBluescript II SK (+). A recombinant plasmid vector was constructed by insertion and ligation with a DNA ligation kit. E. coli XLI-Blue MRF ′ was transformed with the introduction of the recombinant plasmid vector constructed as described above.
[0185]
In order to introduce the constructed recombinant plasmid vector into E. coli XLT-Blue MRF ′ as described above, 10 μg of the recombinant phage DNA obtained above was added in 10 units with the restriction enzyme EcoRI in H buffer. Digestion reaction solution was obtained by digestion. In addition, 10 μg of the plasmid vector p Bluescript II SK (+) was similarly digested with EcoRI to obtain a digestion reaction solution. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to each digestion reaction solution and left at -20 ° C. for about 6 hours, after which each obtained DNA solution was centrifuged and precipitated DNA. Was dried and dissolved in 5 μl of water. 5 μl each of the phage-derived DNA aqueous solution and the plasmid-derived DNA aqueous solution thus obtained were mixed, the resulting mixture was treated with DNA Ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the two kinds of DNA were ligated. I let you. One-tenth volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the resulting ligation reaction solution, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for about 6 hours. The resulting mixture was centrifuged and the precipitated DNA was dried. The ligation vector DNA thus obtained was dissolved in 10 μl of water.
[0186]
10 μl of the aqueous solution of the ligation vector DNA thus obtained (10 ng of DNA) and 100 μl of commercially available Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ competent cell (manufactured by STRATAGENE) were placed in a 1.5 ml tube for 30 minutes in ice. Incubated for 30 seconds at 0 ° C. and again in ice for 2 minutes. Thereafter, 900 μl of SOC liquid medium (containing 2% Bacto-tryptone, 0.5% Bacto-yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM Glucose) against the incubated mixture Then, E. coli is cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour.
[0187]
100 μl of the obtained Escherichia coli culture solution was mixed with ampicillin at a concentration of 50 mg / l, X-gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactoside) at a concentration of 20 mg / l, IPTG ( LB agar medium (1% bacto-tryptone, 0.5% bacto-yeast extract, 0.5% NaCl, 0.1% Glucose to which Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside) is added at a concentration of 20 mg / l , PH 7.5, containing 1.5% agar). After culturing Escherichia coli at 37 ° C. for 16 hours, E. coli colonies that were colored in white were separated from E. coli colonies that were not colored in white as E. coli transformed with the ligation vector DNA.
[0188]
Ten isolated Escherichia coli colonies that are colored white and are ampicillin resistant are grown in a liquid medium containing 50 mg / l of ampicillin. From the grown E. coli, a plasmid purification kit (QIA filter Plasmid) is obtained. The plasmid was isolated and purified by Midi Kit (QIAGEN). By this purification, 50 μg (50 μl) of the plasmid was obtained from the transformed colonies of the resistant colonies obtained above.
[0189]
The plasmid obtained by cloning in this way was the intended recombinant plasmid, which is a DNA containing therein the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene, and had a size of about 4.3 kb.
[0190]
(7) Sequence analysis of cloned DNA
When the above-described cloned plasmid, which is a recombinant plasmid (about 4.3 kb in size), is treated with a commercially available nucleotide sequencing kit, the entire nucleotide sequence of the DNA fragment can be determined. Then, the base sequence of the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene contained in the DNA fragment can be determined. The base sequence of the DNA sequence having the base sequence determined in this way and encoding the rice DHDPS gene is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing described later.
[0191]
In order to determine the base sequence of the above DNA, an automatic DNA sequencer ALF DNA Sequencer II (Pharmacia Co., Ltd.) was used after denaturation using a base sequence determination kit (Autoread Sequencing Kit (Pharmacia Biotech)). The base sequence of the DNA fragment-α was determined.
[0192]
The nucleotide sequence of the DNA sequence contained in the DNA fragment-α obtained in Example 1 according to the present invention and determined to encode rice DHDPS is within a single open reading frame described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. 1140 bp of base. The DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 according to the first present invention encodes a protein consisting of 380 amino acid residues described in SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is converted into the above-mentioned wheat DHDPS amino acid sequence (JP-A-3-127984) and maize DHDPS amino acid sequence (Molecular & General Genetics, 228, pages 287-293). 1991) with 82% and 79% homology, respectively. In the DNA sequence region other than this homologous region, the first DNA of the present invention has a DNA sequence that is clearly different from wheat and maize and is unique to rice.
[0193]
Example 2
This example shows the production of a DNA fragment containing a DNA sequence named modified DNA-158N obtained according to the second invention (that is, a DNA sequence having the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing). Illustrate.
[0194]
(1) Construction of synthetic oligonucleotides as primers for PCR
Using a DNA synthesizer (Model-391, manufactured by Applied Biosystems), primer No. which is an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. 3, a primer FW-1 having the base sequence described in SEQ ID NO: 11, a primer RV-1 having the base sequence described in SEQ ID NO: 12, and a primer BSKPN-1 having the base sequence described in SEQ ID NO: 13 Was constructed by chemical synthesis.
[0195]
Furthermore, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 were also synthesized.
[0196]
(2) Preparation of template for PCR method
The DNA fragment obtained by excising from the recombinant phage as a DNA fragment determined to contain the DNA sequence corresponding to the rice DHDPS gene in the section (6) of Example 1 was obtained from the plasmid vector p Bluescript II SK (+). A recombination plasmid was constructed by ligating to the EcoRI cleavage site of DNA by a DNA ligation kit.
[0197]
The following reaction was carried out in order to confer Xba I and Sac I restriction enzyme cleavage sites by the PCR method on the DNA fragment contained in the above recombinant plasmid vector pDAP8-1.
[0198]
5 μl of pDAP8-1 and 1 μM of the primer of SEQ ID NO: 14 and the primer of SEQ ID NO: 15 (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 4 nucleotides) An amplification reaction was performed by adding 100 μl of each 0.2 mM mixture of dNTPs and 2.5 units of LA Taq DNA polymerase). The amplification reaction was carried out by repeating the three reaction operations of denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, extension at 72 ° C. for 1 minute 30 times.
[0199]
After completion of this amplification reaction, the amplification reaction solution was fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band of about 1160 bp was cut out from the gel as an amplified DNA product. From this gel slice, a purified DNA fragment (Xba I-DNA-) having a Xba I site on the 5 'side and a Sac I site on the 3' side of the DNA sequence encoding the DHDPS gene by GENECLEAN II Kit (manufactured by Funakoshi). Sac I) (DNA fragment-XS) was obtained.
[0200]
10 μg of the commercially available plasmid vector pUC19 was digested with 10 units of Xba I and 10 units of Sac I in M buffer.
[0201]
The DNA fragment (Xba I-DNA-Sac I) and the cleaved linear plasmid vector pUC19 are ligated by the DNA ligation kit to form a circular recombinant plasmid vector pDAP8-1-XS. (About 3.9 kb) was obtained.
[0202]
This plasmid vector pDAP8-1-XS was used as a template in the following PCR method.
[0203]
(3) Amplification and recovery of required DNA fragments by PCR
(I) First stage of PCR method
In order to obtain the required DNA fragment by an amplification reaction by the PCR method, the following (A) reaction and (B) reaction were performed as the first step of the PCR method.
[0204]
That is, in the reaction (A), 5 μl of the recombinant plasmid vector pDAP8-1-XS used as a template, 1 μM of primer FW-1, and primer No. 9 of SEQ ID NO: 9 were used. 3 of 1 μM was added to an amplification reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mM MgCl 2, 50 mM KCl, a mixture of 0.2 mM each of 4 nucleotide dNTPs, 2.5 μg of LA Taq DNA polymerase. Amplification reaction was performed in addition to 100 μl of (containing unit). The DNA by-product obtained by this reaction (A) is referred to as DNA fragment-A.
[0205]
In (B) reaction, 5 μl of the vector pDAP8-1-XS used as a template, 1 μM of the primer RV-1 used as a primer, and BSKPN-1 μM of the above (A) reaction An amplification reaction was performed in addition to the amplification reaction solution having the same composition as used in 1. The amplification product of DNA obtained by this (B) reaction is referred to as DNA fragment-B.
[0206]
The amplification reaction was carried out in a PCR reaction apparatus (Program Temp Control System PC-700 (manufactured by Astec)) with denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 2 minutes, and extension at 72 ° C. for 2 minutes. It was carried out by repeating three reaction operations performed for 30 minutes 30 times.
[0207]
After completion of the amplification reaction, the amplification reaction solution of (A) reaction was fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing a 480 bp DNA fragment-A as an amplified DNA product was cut out from the agarose gel. Further, the amplification reaction solution of (B) reaction was fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing 1200 bp DNA fragment-B as an amplified DNA product was cut out from the agarose gel.
[0208]
These gel slices were separated by GENECLEAN II Kit (Funakoshi Co., Ltd.) to obtain a purified DNA fragment-A product and a purified DNA fragment-B product.
[0209]
(Ii) Second stage of PCR method
Next, as the second stage of the PCR method, 1 μl of the primer RV-1 and 1 μl of FW-1 and 1 μl of DNA fragment-A amplified by the reactions (A) and (B) and DNA 1 μl of Fragment-B contains amplification reaction (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 0.2 mM each mixture of dNTPs, 2.5 units of LA Taq DNA polymerase ) In addition to 100 μl, an amplification reaction was performed. The amplification reaction in this case was carried out by repeating three reaction operations of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 2 minutes, and extension at 72 ° C. for 2 minutes 20 times.
[0210]
After completion of this amplification reaction, the amplification reaction solution was fractionated by low-melting point agarose electrophoresis, and a band containing the desired DNA fragment-C of 1200 bp as an amplified DNA product was excised from the gel. From this gel slice, DNA fragment-C was separated by GENECLEAN II Kit (Funakoshi Co., Ltd.) and a purified product of DNA fragment-C was obtained.
[0211]
This DNA fragment-C is a DNA fragment having a size of about 1350 bp containing therein a DNA-158N sequence (size of 1143 bp) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and the DNA-158N sequence A DNA fragment having a KpnI cleavage site in front of the 5'-end and a SacI cleavage site behind the 3'-end.
[0212]
(4) Cloning of DNA fragment containing modified DNA-158N sequence
Next, an operation for obtaining a sufficient amount of a DNA fragment containing the target modified DNA-158N sequence by cloning using the DNA fragment-C obtained above is performed.
[0213]
(I) First, 10 μg of the DNA fragment-C obtained above was digested with 10 units of restriction enzyme Kpn I and 10 units of Sac I in L buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.). The DNA fragment obtained by this digestion is called DNA fragment-β. On the other hand, 10 μg of the plasmid vector pBluescript II SK (+) was digested with 10 units of Kpn I and 10 units of Sac I in L buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain a shortened plasmid. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the digestion reaction solution containing the DNA fragment-β and the digestion reaction solution containing the shortened plasmid, respectively, and incubated at −20 ° C. for about 6 hours. The incubated solution was then centrifuged and the precipitated DNA was dried and dissolved in 5 μl water.
[0214]
5 μl of the aqueous solution of DNA fragment-β thus obtained and 5 μl of the aqueous solution of the shortened plasmid DNA were mixed, and then the DNA contained in the obtained mixture (10 μl) was converted into DNA Ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). The ligation reaction was carried out. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the ligation reaction solution and incubated at −20 ° C. for about 6 hours. The incubated reaction solution was centrifuged and the precipitated DNA was dried and dissolved in 5 μl of water to make an aqueous solution.
[0215]
The DNA contained in this aqueous solution was prepared by ligating the above-mentioned DNA fragment-β with the above-mentioned shortened plasmid obtained by cutting Kpn-1 and SacI of the plasmid vector pBluescript II SK (+). This is a strand-recombinant plasmid (the p Bluescript-DNA-158N plasmid described above), and the modified DNA-158N sequence was contained in the inserted DNA region.
[0216]
(Ii) This pBluescript-DNA-158N plasmid was introduced into E. coli XL1-Blue MRF ′ to transform E. coli XL1-Blue MRF ′. Furthermore, the transformed E. coli cells were cultured in a liquid medium.
[0217]
Further plasmids were extracted from the cultured E. coli cells. Thus, a recombinant plasmid containing the modified DNA-158N sequence could be cloned.
[0218]
(5) Recovery of DNA fragment containing the modified DNA-158N sequence
10 μl of the plasmid DNA of the obtained p Bluescript-DNA-158N plasmid was digested with 10 units of XbaI and 10 units of SacI in M buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.). The digestion reaction solution was fractionated by low melting point agarose electrophoresis. A DNA fragment (referred to as DNA fragment-β-2) containing the DNA-158N sequence (size of 1143 bp) inside was excised from agarose. To this agarose section containing the DNA fragment-β-2, an equal amount of TE buffer (containing 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) was added and heated at 68 ° C. for 20 minutes to dissolve the agarose. The resulting solution was extracted twice with saturated phenol to remove agarose. One-tenth volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the obtained phenol extract containing DNA, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for about 6 hours and incubated. The incubated solution was centrifuged at 15000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes. The obtained DNA precipitate was dried under reduced pressure, and the obtained DNA powder was dissolved in 10 μl of water. The DNA powder consisted of DNA fragment-β-2 containing the desired modified DNA-158N sequence.
[0219]
Example 3
This example shows the production of a DNA fragment containing a DNA sequence named as a modified DNA-166A sequence obtained by the second invention (ie, a DNA sequence having the base sequence described in SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing). Is illustrated.
[0220]
(1) Construction of synthetic oligonucleotides as primers for PCR
Using a DNA synthesizer (Model-391, manufactured by Applied Biosystems), primer No. which is an oligonucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is used. 4 was constructed by chemical synthesis.
[0221]
(2) Template for PCR method
The vector pDAP8-1-XS described in the section (2) of Example 2 has a DNA sequence having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing between the XbaI cleavage site and the SacI cleavage site ( That is, a DNA fragment having a sequence length of about 1200 bp containing the aforementioned DHPPDPS-DNA-1143 sequence) is inserted.
[0222]
This recombinant vector pDAP8-1-XS was also used as a template in the following PCR method in Example 2.
[0223]
(3) Amplification and recovery of required DNA fragments by PCR
(I) First stage of PCR method
In order to obtain the required DNA fragment by an amplification reaction by the PCR method, the following (A) reaction and (B) reaction were performed as the first step of the PCR method.
[0224]
That is, in the reaction (A), 5 μl of the recombinant plasmid vector pDAP8-1-XS used as a template, 1 μM of primer FW-1, and primer No. 10 of SEQ ID NO: 10 were used. 4 of 1 μM was added to the amplification reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mM MgCl 2, 50 mM KCl, a mixture of 0.2 mM each of 4 nucleotide dNTPs, 2.5 of LA Taq DNA polymerase. Amplification reaction was performed in addition to 10 μl of (containing units). The amplification product of DNA obtained by this reaction (A) is referred to as DNA fragment-D.
[0225]
In the reaction (B), as described in the item (3) of Example 2, 5 μl of the vector pDAP8-1-XS used as a template, 1 μM of the primer RV-1 as a primer, An amplification reaction was performed by adding 1 μM of BSKPN-1 to the amplification reaction solution having the same composition as that used in the reaction (A). The DNA amplification product obtained by the reaction (B) is referred to as DNA fragment-B, as in the item (3) of Example 2.
[0226]
The amplification reaction was performed in a CR reaction apparatus (Program Temp Control System PC-700 (manufactured by Astec)) at 94 ° C. for 30 seconds, as described in the item (3) of Example 2. The reaction was carried out by repeating three reaction operations 30 times at 55 ° C. for 2 minutes and extension at 72 ° C. for 2 minutes 30 times.
[0227]
After completion of the amplification reaction, the amplification reaction solution of (A) reaction was fractionated by low-melting point agarose electrophoresis, and a band containing 480 bp DNA fragment-D as an amplified DNA product was cut out from the agarose gel. Further, the amplification reaction solution of (B) reaction was fractionated by low melting point agarose electrophoresis, and a band containing 1200 bp DNA fragment-B as an amplified DNA product was cut out from the agarose gel.
[0228]
These gel slices were separated by GENECLEAN II Kit (Funakoshi Co., Ltd.) to obtain a purified DNA fragment-D product and a purified DNA fragment-B product.
[0229]
(Ii) Second stage of PCR method
Next, as the second stage of the PCR method, 1 μl of the primer PV-1 and 1 μl of the primer FW-1 and 1 μl of the DNA fragment-D amplified by the reactions (A) and (B) 1 μl of DNA fragment-B was added to the amplification reaction solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 mM MgCl 2, 50 mM KCl, a mixture of 0.2 mM each of dNTP, and 2.5 units of LA Taq DNA polymerase. In addition, the amplification reaction was performed in addition to 100 μl. The amplification reaction in this case was carried out by repeating three reaction operations of denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 55 ° C. for 2 minutes, and extension at 72 ° C. for 2 minutes 20 times.
[0230]
After completion of this amplification reaction, the amplification reaction solution was fractionated by low-melting point agarose electrophoresis, and a band containing the desired DNA fragment-E of 1200 bp as an amplified DNA product was excised from the gel. From this gel slice, DNA fragment-E was separated by GENECLEAN II Kit (Funakoshi Co., Ltd.) and a purified product of DNA fragment-E was obtained.
[0231]
This DNA fragment-E is a DNA fragment having a size of about 1350 bp containing a DNA-166A sequence (size of 1143 bp) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and the DNA-166A sequence. A DNA fragment having a Kpn1 cleavage site in front of the 5'-end and a SacI cleavage site behind the 3'-end.
[0232]
(4) Cloning of a DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence
Next, an operation of obtaining a sufficient amount of DNA fragment containing the target modified DNA-166A sequence by cloning using the DNA fragment-E obtained above is performed.
[0233]
(I) First, 10 μg of the DNA fragment-E obtained above was digested with 10 units of restriction enzyme KpnI and 10 units of SacI in L buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.). The DNA fragment obtained by this digestion is called DNA fragment-γ. On the other hand, 10 μg of plasmid vector pBluescriptIISK (+) was digested with 10 units of KpnI and 10 units of SacI in L buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) to obtain a shortened plasmid. 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the digestion reaction solution containing the DNA fragment-γ and the digestion reaction solution containing the shortened plasmid, respectively, and incubated at −20 ° C. for about 6 hours. The incubated solution was then centrifuged and the precipitated DNA was dried and dissolved in 5 μl water.
[0234]
5 μl of the aqueous solution of the DNA fragment-γ thus obtained and 5 μl of the aqueous solution of the shortened plasmid DNA were mixed, and then the DNA contained in the obtained mixture (10 μl) was converted into DNA Ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). )). 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the ligation reaction solution and incubated at −20 ° C. for about 6 hours. The incubated reaction solution was centrifuged, and the precipitated DNA was dried and dissolved in 5 μl of water to make an aqueous solution.
[0235]
The DNA contained in this aqueous solution is a recombinant prepared by ligating the above DNA fragment-γ and the above shortened plasmid obtained by cutting Kpn-1 and SacI of the plasmid vector pBluescript II SK (+). This is a plasmid (referred to as pBluescript-DNA-166A plasmid) and contained the DNA-166A sequence in the inserted DNA region.
[0236]
(Ii) E. coli XL1-Blue MRF 'was transformed by introducing this pBluescript-DNA-166A plasmid into E. coli XL1-Blue MRF'. Furthermore, the transformed E. coli cells were cultured in a liquid medium.
[0237]
Further plasmids were extracted from the cultured E. coli cells. A plasmid containing the modified DNA-166A sequence could thus be cloned.
[0238]
(5) Recovery of DNA fragment containing the modified DNA-166A sequence
10 μl of the plasmid DNA of the obtained p Bluescript-DNA-166A plasmid was digested with 10 units of XbaI and 10 units of SacI in M buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.). The digestion reaction solution was fractionated by low melting point agarose electrophoresis. A band containing a DNA fragment-γ-2 containing a DNA-166A sequence (size of 1143 bp) inside was excised from agarose. An agarose gel slice containing this DNA fragment-γ-2 was added with an equal amount of TE buffer (containing 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8), and agarose was dissolved by heating at 68 ° C. for 20 minutes. . The resulting solution was extracted twice with saturated phenol to remove agarose. One-tenth volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of ethanol were added to the obtained phenol extract containing DNA, and incubated at -20 ° C for about 6 hours. The incubated solution was centrifuged at 15000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes. The obtained DNA precipitate was dried under reduced pressure and dissolved in 10 μl of water. This DNA powder consisted of a DNA fragment -γ-2 of about 1200 bp in size containing the desired modified DNA-166A sequence.
[0239]
The above-mentioned DNA fragment-β-2 obtained in (2) of Example 2 was prepared in the same manner as described in (7) of Example 1, using an automatic DNA sequencer that uses a nucleotide sequencing kit, ALF It was applied to DNA Sequencer II. It was confirmed that DNA fragment-β-2 was a DNA fragment containing therein a modified DNA-158N sequence having the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing.
[0240]
In addition, the DNA fragment-γ-2 obtained in (3) of Example 3 was also subjected to a nucleotide sequence determination test in the same manner as described above. DNA fragment-γ-2 was confirmed to be a DNA fragment containing therein a modified DNA-166A sequence having the base sequence described in SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing.
[0241]
Example 4
This example illustrates a method for transforming a rice plant comprising introducing the DNA sequence according to the first invention or the modified DNA sequence according to the second invention into a rice plant as a foreign gene.
[0242]
(1) Preparation of recombinant vector for introduction of foreign genes
(I) DNA (10 μg) of a plasmid vector pBI221 (manufactured by Clontech) having a size of 5.7 kb containing a 35S promoter of cauliflower mosaic virus, a NOS terminator, and an ampicillin resistance gene, and M buffer (Takara Shuzo Co., Ltd.) Digested with 10 units of restriction enzymes XbaI and SacI. DNA was precipitated from the digestion reaction solution, centrifuged and dried. A vector fragment of about 3.8 kb in size carrying the 35S promoter and NOS terminator was obtained.
[0243]
(Ii) The obtained vector fragment was dissolved in 5 μl of water. 5 μl of an aqueous solution of the vector fragment was obtained in Example 2 and a DNA of about 1143 bp in size containing the DHDPS-DNA-1143 sequence (size of 1143 bp) described in SEQ ID NO: 1 according to the first invention And 5 μl of an aqueous solution of DNA fragment-XS.
[0244]
The obtained mixture was treated with a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to perform a DNA ligation reaction. Thus, a circular recombinant vector was prepared by ligating the above-mentioned DNA fragment-XS to the XbaI-SacI-cleaved vector fragment of the plasmid vector pBI221. This recombinant vector is referred to as vector pDAP. The vector pDAP has a structure in which a DNA fragment-XS region is inserted and linked between a 35S promoter region and a NOS terminator region and contains an ampicillin resistance gene (Amr), and has a size of 4.9 kb. Had.
[0245]
(Iii) Instead of the DNA fragment-XS obtained in Example 2, the DNA fragment-β-2 obtained in Example 2 (that is, the modified DNA-158N described in SEQ ID NO: 5 according to the second invention) The DNA (approximately 1143 bp in size) containing the sequence (size of 1143 bp) was ligated to the XbaI-SacI-cut-vector fragment of plasmid vector pBI221 by the same ligation reaction as described above. The circular recombinant vector thus prepared is referred to as vector p158N. The vector p158N had a structure in which the DNA fragment-β-2 region was inserted and ligated between the 35S promoter region and the NOS terminator region, and had a size of 4.9 kb.
[0246]
(Iv) Further, instead of the DNA fragment -XS obtained in Example 2, the DNA fragment γ-2 obtained in Example 3 (that is, the modified DNA described in SEQ ID NO: 7 according to the second invention) Using a 166A sequence (size of about 1143 bp containing therein 1143 bp in size), the plasmid was ligated to the XbaISacI-cut-vector fragment of the plasmid vector pBI221 by the same ligation reaction. The circular recombinant vector thus prepared is referred to as vector p166A. Vector p166A had a structure in which the region of DNA fragment-γ-2 was inserted and linked between the 35S promoter region and the NOS terminator region, and had a size of 4.9 kb.
[0247]
(2) Cloning of recombinant vectors
Place 10 μl of the aqueous solution of the recombinant vector pDAP, the recombinant vector p158N or the recombinant vector p166A obtained above (amount of DNA: 10 mg) and 100 μl of E. coli XL1-Blue MRF ′ competent cell into a 1.5 ml tube. Incubate for 30 minutes in ice, 30 seconds at 42 ° C., and again in ice for 2 minutes. Thereafter, the incubated mixture was treated as described in Example 1 (6) and E. coli was cultured with shaking.
[0248]
The obtained Escherichia coli culture solution was plated on an LB agar medium supplemented with ampicillin and other additives in the same manner as described in Example 6 (6). E. coli was cultured at 37 ° C. for 16 hours.
[0249]
Ten E. coli colonies that were transformed and resistant to ampicillin were obtained by introducing the recombinant vector pDAP, the recombinant vector 158N, or the recombinant vector 166A. Ten of these E. coli colonies were grown in a liquid medium containing 50 mg / l of ampicillin.
[0250]
(3) Recovery of recombinant vector
Recombinant plasmids were isolated and purified from E. coli cells grown respectively from 10 colonies using a plasmid purification kit (QIA filter Plasmid Midi Kit, manufactured by QIAGEN).
[0251]
Each of the obtained recombinant plasmids was digested with restriction enzymes XbaI and SacI, and the obtained DNA fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis.
[0252]
Referring to the result of the analysis, a recombinant plasmid in which the DHDPS-DNA-1143 sequence according to the first invention of the present invention is normally linked downstream of the 35S promoter is obtained as vector pDAP. Selected and collected.
[0253]
Similarly, a recombinant plasmid in which the modified DNA-158N sequence according to the second invention of the present invention is normally linked downstream of the 35S promoter was selected as a vector p158N and collected.
[0254]
Further, similarly, a recombinant plasmid in which the second modified DNA-166N sequence according to the present invention was normally ligated downstream of the 35S promoter was selected as vector p166A and collected.
[0255]
The Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ transformed by introduction of the recombinant vector p158N thus obtained was named Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ / p158N, and was obtained from Ibaraki Prefecture, Tsukuba City, Japan. Since April 13, 1998, it has been deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the terms of the Budapest Treaty, under the FERM BP-6323 accession number.
[0256]
The Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ transformed by introduction of the recombinant vector p166A thus obtained was named Escherichia coli XL1-Blue MRF ′ / p166A, and was obtained from Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan. Since April 13, 1998, it has been deposited at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the terms of the Budapest Treaty under the FERM BP-6324 accession number.
[0257]
(4) Preparation of rice callus
Rice grains were threshed from ripe seeds of rice (variety: Nipponbare). The obtained seeds with skin were immersed in a 70% ethanol solution for 60 seconds and then in a sodium hypochlorite solution containing about 1% effective chlorine for 6 minutes to sterilize the seeds. Furthermore, the seeds were washed with sterilized water.
[0258]
Rice seeds sterilized as described above were placed on a medium obtained by adding 30 g / l sucrose to the inorganic component composition of MS medium, 2,4-PA 2 mg / l as a plant hormone, and 8 g / l agar. Incubated at 28 ° C. for 45 days with 2000 lux light for 16 hours per day. Callus was formed. The calli were cut out from the endosperm portion, and using a stainless mesh sieve with a hole of 1 mm, callus of 1 mm or less was obtained as a PCV (Packed Cell Volume) with a cell volume of 3 ml.
[0259]
(5) Whisker preparation
5 g of potassium titanate whisker (manufactured by Titanium Industry Co., Ltd., LS20) was placed in a 1.5 ml tube, 0.5 ml of ethanol was added and left overnight. Ethanol was completely evaporated to obtain sterilized whiskers. 1 ml of sterilized water was added to the tube containing the whisker and stirred well. Whisker and sterilized water were centrifuged and the supernatant water was discarded. In this way, the whisker was washed. This whisker washing operation was performed three times. Thereafter, 0.5 ml of R2 liquid medium was added to the tube to obtain a whisker suspension.
[0260]
(6) Preparation of materials for introduction of foreign genes into rice callus cells
Recombinant vector pDAP, vector p158N, or vector p166A prepared as described in (3) above is dissolved in TE buffer (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) at a concentration of 1 mg / ml, and a vector solution Got.
[0261]
250 μl of callus of 1 mm or less was put into the tube containing the whisker suspension obtained above and stirred. The resulting mixture was centrifuged at 1000 rpm / min for 10 seconds to precipitate callus and whiskers. The supernatant was discarded. A mixture of callus and whisker was obtained.
[0262]
In a tube containing a mixture of callus and whisker, a plasmid containing 10 μl of a recombinant vector (ie, vector DAP or p158N or p166A) (containing 10 μg of DNA) and a herbicide phosphinothricin resistance gene as a selection marker Vector p35SC-SS (Japanese Patent Laid-Open No. 8-154513) 10 μl (containing 10 μg of DNA) was added. A well-shaken homogeneous mixture was obtained.
[0263]
The tube containing the homogeneous mixture was then centrifuged at 18000 × g for 5 minutes. The centrifuged mixture was shaken again. This centrifugation operation and shaking operation were repeated three times.
[0264]
(7) Operation of introduction of foreign genes into rice callus
A tube containing a homogeneous mixture of callus cells, whiskers, a recombinant vector containing the DNA sequence of the present invention, and a plasmid vector for selection p35SC-SS, obtained as described above, It was installed so that the tube was sufficiently immersed in the bathtub of the sonic generator. Ultrasonic waves having a frequency of 40 kHz were irradiated at an intensity of 0.25 W / cm 2 for 1 minute. Following irradiation, the sonicated mixture was incubated at 4 ° C. for 30 minutes.
[0265]
The mixture thus sonicated was washed with R2 liquid medium to obtain the desired transformed callus cells into which the recombinant vector was introduced.
[0266]
(8) Selection of callus cells transformed with the transfer vector
The callus having the transformed cells into which the recombinant vector was introduced was placed in a 3.5 cm petri dish. Further, 3 ml of a liquid medium obtained by adding 30 g / l sucrose and 2 mg / l 2,4-PA to the inorganic component composition of the R2 medium was added. Thereafter, callus cells were cultured on a rotary shaker (50 rpm) while irradiating 2000 lux light at 28 ° C. for 16 hours per day to obtain dividing cells.
[0267]
On the third day of culture, 3 ml of the resulting suspension of dividing cells was added to the inorganic component composition of N6 medium, sucrose 30 g / l, 2,4-PA 2 mg / l, gellite 3 g / l, phosphinothricin 30 mg. / L was spread evenly on the medium. The cells on the medium were cultured for 30 days at 28 ° C. with irradiation of 2000 lux light for 16 hours per day. Transformed callus cells resistant to phosphinothricin were obtained.
[0268]
(9) Reselection of transformed callus cells with vector p158N or p166A
Of the transformed callus culture cells resistant to phosphinothricin obtained as described above, only the desired cultured cells transformed by sufficiently introducing the DNA according to the second invention as a foreign gene are reselected. For that purpose, 400 calli consisting of transformed callus cells (diameter 2 mm) were mixed with 30 g / l of sucrose, 2 mg / l of 2,4-PA, and 3 g / l of gellite in the inorganic component composition of N6 medium. And 200 mg / l of S- (2-aminoethyl) cysteine (hereinafter referred to as AEC) (analogue of lysine) that acts as a cell growth inhibitor was transplanted onto a medium. Callus cells were cultured for 30 days while irradiating light at 28 ° C. and 2000 lux for 16 hours per day. Transformed callus cells containing the vector p158N or p166A that were able to grow on the aforementioned AEC-added medium were re-selected in this way.
[0269]
(10) Plant regeneration from transformed callus cells
98 to 100 transformed callus cultured cells (diameter 5 mm) having resistance to phosphinothricin and AEC obtained as described above were mixed with 30 g / l sucrose and 2 mg / l benzyladenine in the inorganic component composition of MS medium. Then, 1 mg / l of naphthalene acetic acid and 3 g / l of gellite were added onto a medium. The cells were cultured for 30 days at 28 ° C. while being irradiated with 2000 lux light for 16 hours per day. Buds and roots were regenerated from callus consisting of transformed callus cells. Regenerated shoots and rooted shoots (shoots grown to a length of 10 to 30 mm) were placed in a test tube (diameter 45 mm, length 25 cm) containing MS medium containing 30 g / l sucrose and 3 g / l gellite. ). Transformed rice plants were cultured for 20 days to obtain transformed rice plants.
[0270]
According to the above method, 80 rice plants could be regenerated from 98 callus of transformed callus cells containing the DHDPS-DNA-1143 sequence according to the first invention as a foreign gene. In addition, 76 rice plants could be regenerated from 100 callus of AEC-resistant transformed callus cells containing the modified DNA-158N sequence according to the second invention as a foreign gene.
[0271]
Furthermore, 79 rice plants could be regenerated from 100 callus of AEC-resistant transformed callus cells containing the modified DNA-166A sequence according to the second invention as a foreign gene.
[0272]
(11) Genetic analysis of regenerated plants of transformed rice plants
The DNA encoding DHDPS present in the rice plant regenerated as described above was analyzed by PCR according to the following procedure.
[0273]
(I) Leaves were collected from the regenerated rice plant obtained in (10) above. 50 mg of the leaves were placed in a 1.5 ml microtube, and 300 μl of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mM EDTA was added and ground. 20 ml of 20% SDS was added to the ground product and heated at 65 ° C. for 10 minutes. 100 μl of 5M potassium acetate was added to the resulting mixture, placed in ice for 20 minutes, and then centrifuged at a centrifugal acceleration of 1,7000 × g for 20 minutes. 200 μl of isopropanol was added to the obtained supernatant, and the mixture was stirred by overturning, and this was again centrifuged at a centrifugal acceleration of 1.7000 × g for 20 minutes. The resulting DNA precipitate was dried under reduced pressure. The DNA was dissolved in 100 μl TE buffer.
[0274]
(Ii) As a primer for PCR, the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing and the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 were used.
[0275]
Next, 1 μM of each of these two kinds of oligonucleotides was used as a primer, and 5 μl of the DNA derived from the regenerated rice plant was used as a template. These were used as amplification reaction solutions (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.0 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.01% gelatin, pH 8.3, each containing 0.2 mM mixture of dNTPs and 2.5 units of Taq DNA polymetallase). An amplification reaction was then performed. The amplification reaction solution used was prepared with a PCR kit (PCR Amplification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)).
[0276]
The amplification reaction was performed in a PCR reaction apparatus (Program Temp Control System PC-700 (manufactured by Aztec)) at a denaturation of 94 ° C. for 1 minute, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, an extension at 72 ° C. for 3 minutes. The reaction operation was performed by repeating 30 times.
[0277]
(Iii) The obtained PCR reaction solution was analyzed by agarose electrophoresis by a conventional method, and various DNA bands amplified from DNA extracted from regenerated rice plants were confirmed.
[0278]
Furthermore, when these various DNA sequences were analyzed by a nucleotide sequencing kit, DNA fragments corresponding to the DHDPS-DNA-1143 sequence, modified DNA-158N sequence or modified DNA-166A sequence of the present invention were obtained from regenerated rice plants. It was confirmed that it was present in various DNA fragments extracted as described above.
[0279]
By performing gene analysis by PCR as described above, the regenerated rice plants in which the introduced foreign gene was confirmed were transplanted and cultivated in pots containing culture soil. Since these regenerated rice plants grew normally, self-propagating seeds could be obtained.
[0280]
(12) Measurement of lysine content in regenerated plants of transformed rice plants
In the first aspect of the present invention obtained in the previous item (11)YoRegenerated transformed rice plants having plant cells introduced with the recombinant vector pDAP containing the DHDPS-DNA-1143 sequence, and the recombinant vector pDNA- containing the DNA-158N sequence according to the second invention Regenerated transformed rice plants having plant cells introduced with 158N and regenerated transformation having plant cells introduced with the recombinant vector pDNA-166 containing the DNA-166A sequence according to the second invention Green leaves were collected from each rice plant.
[0281]
1 g of each of the leaves collected in this way was taken, 1 g of those leaves was put into a first tube having a volume of 1.5 ml, and further 1 ml of 50% acetonitrile was added and ground. The milled mixture was transferred to a new 1.5 ml second tube and centrifuged at 17000 × g for 20 minutes. The obtained supernatant was again transferred to a new third tube, 1 ml of 50% acetonitrile was added to the third tube, and the mixture was thoroughly inverted and centrifuged, and centrifuged again. The obtained supernatant was added to the first tube, and this operation was repeated three times. Thus, the acetonitrile extract which extracted the lysine from the leaf was obtained.
[0282]
The acetonitrile extract was dried under reduced pressure, and 1 ml of distilled water was added to obtain an aqueous solution. The aqueous solution was centrifuged at a centrifugal acceleration of 17000 × g for 20 minutes to obtain 0.5 ml of the supernatant. 100 μl of the supernatant was mixed with 100 μl of 5 mM DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzene). The resulting mixture was allowed to react overnight. 200 μl of acetonitrile was added to the reaction solution, stirred, and then centrifuged for 20 minutes at a centrifugal acceleration of 17000 × g. As a supernatant, an extract of lysine was obtained. This was subjected to a high performance liquid chromatography (HPLC) apparatus (manufactured by Tosoh Corporation, model 8020) to measure the free lysine content. The column used for this HPLC was CAPCELLPAK-C18 (manufactured by Shiseido Co., Ltd.), the developing solvent was acetonitrile-water with a 60% to 72% concentration gradient of acetonitrile, the flow rate was 0.8 ml / min, and 350 nm. The lysine content was assessed by measuring the absorbance of light.
[0283]
A normal rice plant (variety: Nipponbare) was used as a control rice plant. The obtained measurement results are shown in Table 1 below.
[0284]
Figure 0003814482
As is apparent from the results shown in Table 1, the use of the recombinant DNA having the promoter capable of being expressed in a plant cell using the novel DNA sequence according to the present invention as a foreign gene introduces the novel DNA sequence according to the present invention. Thus, it was confirmed that the content of free lysine produced in rice plants can be increased.
[0285]
Industrial applicability
As is apparent from the above description, the present invention provides a novel DNA sequence capable of encoding rice dihydrodipicolinate synthase. By introducing the DNA sequence into a rice plant as a foreign gene, the content of essential amino acids and lysine in the rice plant could be increased. The DNA sequence according to the present invention can be introduced as a foreign gene into rice and other useful plants such as corn, soybean, wheat, and barley by conventional biotechnology techniques. Accordingly, the DNA sequences provided in the present invention are useful for breeding new varieties of plants capable of producing seeds having a high lysine content.
[Brief description of the drawings]
[0286]
FIG. 1 is a recombinant vector for introducing a foreign gene used for transforming rice cultured cells in Example 4, and contains the modified DNA-158N sequence according to the second invention. The procedure for creating the vector p158N from the vector pBI221 is shown schematically.
[0287]
FIG. 2 is a vector introduced into rice cultured cells together with vector p158N in Example 4 described above, and illustrates the structure of vector p35SC-SS containing the phosphinothricin gene SS as a selection marker. Indicate.
[0288]
[Sequence Listing]
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482
Figure 0003814482

Claims (7)

配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有し且つジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。A DNA encoding a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing and having dihydrodipicolinate synthase activity. 配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡであり、ＤＮＡ−１５８Ｎ配列と命名されるＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。The DNA according to claim 1 , which is a DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing and designated as a DNA-158N sequence. 配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有し且つジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。A DNA encoding a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing and having dihydrodipicolinate synthase activity. 配列表の配列番号７に記載された塩基配列を有するＤＮＡであり、ＤＮＡ−１６６Ａ配列と命名されるＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。A DNA having a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7, DNA of claim 3 which is a DNA which is named DNA-166A sequence. イネのジヒドロジピコリネートシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１または請求項３に記載のＤＮＡを担持する組換えベクターを導入されて形質転換されたイネ植物細胞を有し、そして導入された前記ＤＮＡが発現可能であることを特徴とする、形質転換イネ植物。It is introducing a recombinant vector carrying a DNA according to claim 1 or claim 3 which encodes a protein having dihydrodipicolinate synthase activity of rice have transformed rice plant cell, and introduced A transformed rice plant characterized in that the DNA can be expressed. カリフラワーモザイクウイルス由来であり且つ植物で発現可能なプロモーターと、ＮＯＳターミネーターと、アンピシリン耐性遺伝子とを含有するプラスミドベクターに、前記のプロモーターの支配下に、配列表の配列番号５または配列番号７に記載の１１４３ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ配列を担うＤＮＡ断片を組込んでなる組換えベクター。A promoter expressible cauliflower mosaic virus-derived and is and plant, and the NOS terminator, the plasmid vector containing the ampicillin resistance gene, under control of the promoter, the sequence number 5 or SEQ ID NO: 7 A recombinant vector comprising a DNA fragment carrying a DNA sequence having the base sequence of 1143 bp described above. プラスミドベクターがプラスミドベクターｐＢＩ２２１である請求項６に記載の組換えベクター。The recombinant vector according to claim 6 , wherein the plasmid vector is plasmid vector pBI221.
JP2000544812A 1998-04-17 1998-04-17 Rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene Expired - Fee Related JP3814482B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP1998/001784 WO1999054483A1 (en) 1998-04-17 1998-04-17 Gene of rice dihydrodipicolinate synthase and dna relating to the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP3814482B2 true JP3814482B2 (en) 2006-08-30

Family

ID=14208071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000544812A Expired - Fee Related JP3814482B2 (en) 1998-04-17 1998-04-17 Rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6451537B1 (en)
EP (1) EP1072685A4 (en)
JP (1) JP3814482B2 (en)
AU (1) AU770223B2 (en)
CA (1) CA2330839A1 (en)
WO (1) WO1999054483A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1301845A (en) * 1999-12-27 2001-07-04 上海博德基因开发有限公司 New polypeptide-dihydrodipyridine synthetase 9 and polynucleotide coding such polypeptide
JP4684551B2 (en) 2003-12-25 2011-05-18 東レ・ダウコーニング株式会社 Discoloration prevention or discoloration reducing method, discoloration prevention or discoloration reducing agent, and diorganopolysiloxane composition containing said discoloration prevention or discoloration reducing agent

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2803003B2 (en) * 1989-10-12 1998-09-24 東ソー株式会社 Wheat dihydrodipicolinate synthase
EP0485970A3 (en) * 1990-11-13 1992-07-01 Yeda Research And Development Company Limited Transgenic plants overproducing threonine and lysine
US5545545A (en) * 1993-04-27 1996-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase

Also Published As

Publication number Publication date
AU6854198A (en) 1999-11-08
EP1072685A4 (en) 2002-11-27
EP1072685A1 (en) 2001-01-31
US6451537B1 (en) 2002-09-17
WO1999054483A1 (en) 1999-10-28
CA2330839A1 (en) 1999-10-28
AU770223B2 (en) 2004-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4719754B2 (en) DNA related to the gene encoding the α subunit of the second isozyme of rice anthranilate synthase
US7235710B2 (en) Regulatory sequence
JP2911450B2 (en) Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
JP4987734B2 (en) Transformed plant introduced with stress responsive gene
JP5787413B2 (en) A method for producing a toothpick-forming plant in which the ability to produce tubers or the ability to form a toothpick is improved compared to a wild strain, and a toothpick-forming plant produced by the method
CN109456969B (en) Rice brown planthopper-harming inducible promoter and application thereof
JP3814482B2 (en) Rice dihydrodipicolinate synthase gene and DNA related to the gene
JPH10512451A (en) Deoxyribonucleic acid encoding glutathione S-transferase and use thereof
CN114958867A (en) Corn ear grain weight and yield regulation gene KWE2, and encoding protein, functional marker, expression vector and application thereof
JP4150706B2 (en) Modified DNA encoding the first isozyme α subunit of rice anthranilate synthase
JP4433497B2 (en) Method for increasing GGT activity of plant, plant having increased GGT activity and method for producing the same
CN114230649B (en) Tn1 protein related to rice tillering force, related biological material and application thereof
JP3564537B2 (en) Plant Ran gene mutant and method for promoting plant flowering time using the mutant
CN109097388B (en) Application of GmCOP1a and/or GmCOP1b in plant height regulation
CN116144694B (en) Method for creating material with high anthocyanin content, application and prepared material
JPWO2004092380A1 (en) Rice nicotianamine synthase gene promoter and use thereof
CN117025658A (en) Protein for regulating and controlling soybean pod color, encoding gene and application thereof
JP4097227B2 (en) Ubiquitin fusion gene promoter and use thereof
CN114717243A (en) GRMZM2G063882 gene, encoding protein, biological material and application thereof in plant drought resistance
CN116590270A (en) Gene for controlling rice grain size and application thereof
CN115851758A (en) Application of rape BnNRT2.3-like gene and expression vector thereof in promoting plant nitrogen utilization
JP2003189877A (en) Promoter dna of rice chloroplast liposome protein l11 gene
JP2002253071A (en) Plant body having disrupted gene encoding cell membrane proton-atpase and method for using the same
JP2000342277A (en) Promoter of alpha subunit gene of second isozyme of anthranilate synthase of rice plant
JPWO2006098423A1 (en) Polynucleotide that confers environmental stress tolerance to plants

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20051116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060131

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060329

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20060510

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060605

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090609

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100609

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110609

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110609

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120609

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120609

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130609

Year of fee payment: 7

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees