JP3809709B2

JP3809709B2 - Novel eosinophil serine protease

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Publication number: JP3809709B2
Application number: JP19131997A
Authority: JP
Inventors: 博木戸; 雅広井上
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: JPH1132768A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なセリンプロテアーゼに関する。
更に詳細に述べると、ヒト好酸球が産生する新規なセリンプロテアーゼ、その製造方法、そのセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのセリンプロテアーゼの抗体、およびそのセリンプロテアーゼまたは抗体を含有する薬学的組成物、セリンプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法、セリンプロテアーゼの酵素活性を測定することを特徴とするアレルギー疾患の診断法、そのセリンプロテアーゼの抗体を用いたアレルギー疾患の診断方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
好酸球は白血球の一種であり、エオジンで染色されることからその名前が付けられている。好酸球は、好中球とその形態、発生源、貪食作用の点において似ているが、染色性、病原微生物、化学物質、ホルモンなどに対する反応性に違いがある。好酸球は健常人の末梢血白血球の約１〜５％を占めている。
好酸球増多症を伴う疾患としては、アレルギー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾患、膠原病、血管炎などが知られている。さらに末梢血のみならず、喘息患者の気道内や喘息に合併するアレルギー性肉芽種性血管炎や好酸球性肺炎の組織に好酸球が浸潤していること、寄生虫感染患者の中で肺浸潤、胸水を合併する例で活性化された状態にある低比重好酸球がそれらの局所に多く出現していること、アレルギー性鼻炎や皮膚炎患者の末梢血中の好酸球は活性化された状態にあることが報告されており、病態発症と好酸球の活性化あるいは組織への浸潤が深く関わっていると考えられている（治療学，Vol.25, No.4, pp.384-387, 1991）。
【０００３】
好酸球は、寄生虫感染において寄生虫を攻撃する働きを担っているが、アレルギー反応においては、自己組織を傷害し、アレルギー性炎症を助長してしまうと考えられている。
好酸球のメディエータとしては、顆粒蛋白（好エオジン性カチオン蛋白（eosinophilic cationic protein）、主要塩基性蛋白（major basic protein）等の塩基性蛋白、各種酵素）、細胞膜リン脂質代謝物（プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、血小板活性化因子等）、活性酸素、サイトカイン等が報告されており、好酸球はこれらのメディエータを介して機能を発揮しているものと考えられる。しかしながら、これまでに確認されたメディエータのみでは好酸球の役割を完全に説明できず、まだ単離されていないメディエータが存在することを示唆している。
【０００４】
アレルギー反応においては、初期段階で肥満細胞が関与していると考えられているが、慢性期においては好酸球の関与が強く示唆されている。好酸球は、脱顆粒を起こすことによって自己組織を攻撃すると考えられ、この脱顆粒には、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼが関わっていることが分かってきた（Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.312, No.1, July, pp.67-74, 1994)
【０００５】
【発明の目的】
本発明者らは、この点に注目し、ヒト好酸球が産生している新規な因子（ポリペプチド）、特にセリンプロテアーゼに着目してそれを見出すべく、鋭意検討を行なった。
【０００６】
従来、ある特定のポリペプチドまたはそれをコードするｃＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングする方法、あるいは、その生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的に用いられていた。
しかし、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリペプチドと同一であることが後になって判明するという事例が増えている。また、特定の細胞が産生する因子はほとんどのものが微量しか産生されず、そのことが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとしている。
【０００７】
近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを迅速に行なうことができるようになった。そこでこれらの技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニングして塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現させた後、その生理機能を解析していくという方法が発展しつつある。そのような技術の一環として、特徴的な部分配列を有するＲＮＡに対してセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ（Polymerase chain reaction）により、特徴的な部分配列を有する未知なポリペプチドを見いだすことができるようになった。
本発明者らは、この方法を用いて、好酸球が産生している新規な因子（ポリペプチド）およびそれをコードするｃＤＮＡを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明の配列が新規であることは、ホモロジー検索により確認した。後に詳述する本発明の配列の製造方法で得られたいくつかのクローンのうち、本発明配列のみが新規であった。
本発明の推定アミノ酸配列は、セリンプロテアーゼのプロファイルを有し、Ｃ末端には疎水性アミノ酸配列を有していた。また、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカード膜蛋白に対するω、ω１、ω２サイトを有しており、膜蛋白としての特徴と分泌型蛋白としての特徴を合わせ持っている。既知配列との比較により、本セリンプロテアーゼは、プロフォームの形で産生されると考えられ、上流部分が切れて成熟蛋白になると考えられる。
【０００９】
【発明の構成】
本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ、
（２）前記（１）に記載したセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、
（４）配列番号３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、
に関する。
【００１０】
さらに詳しく述べると、本発明は、実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼであるポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらにそれらのセリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するｃＤＮＡに関する。
【００１１】
実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のセリンプロテアーゼとは、一般に生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼであることを意味する。
【００１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる本発明のセリンプロテアーゼのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のセリンプロテアーゼとして記載される。
【００１３】
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる本発明のセリンプロテアーゼのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１４】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発明のｃＤＮＡとして記載される。
【００１５】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００１６】
さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡが組み込まれた複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vitro）において、例えばｃＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明には、配列番号２または３で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明には、本発明のセリンプロテアーゼを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のセリンプロテアーゼの製造方法も含まれる。培養は、本発明のセリンプロテアーゼが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行なわれることが好ましい。
【００１９】
本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入する等の方法によりアンチセンスを製造することもできる。このようなアンチセンスは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
【００２０】
本発明は、本発明におけるセリンプロテアーゼのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。さらに本発明におけるセリンプロテアーゼのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法をも含む。モノクローナル抗体は、本発明のセリンプロテアーゼ、またはその断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のセリンプロテアーゼを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。
【００２１】
本発明には、本発明のセリンプロテアーゼ、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
本発明には、さらに、本発明セリンプロテアーゼを用いたセリンプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法も含まれる。スクリーニングは、例えば、バッファー中に本発明のセリンプロテアーゼとスクリーニングしようとする化合物を共存させ、合成基質に発色剤をつけたもの等を用いて、吸光度等から酵素活性を測定することにより行なわれる。
また、この方法を応用することにより、アレルギー疾患等の診断に用いることもできる。
さらに、本発明には本願セリンプロテアーゼの抗体を用いたアレルギー疾患等の診断方法も含まれる。抗体を用いた診断は、種々公知であるが、例えば、抗原抗体反応を用いて酵素量をエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）法等で測定する事により行なわれる。
【００２２】
（１）の本発明のセリンプロテアーゼとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号１中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）あり、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２３】
（２）で特定される本発明のｃＤＮＡには、（１）の配列番号１で示されるセリンプロテアーゼをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、セリンプロテアーゼの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるｃＤＮＡは、（２）で示されるｃＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（４）に示されるｃＤＮＡは、（３）で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２４】
配列番号３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
１）全ＲＮＡ（Total ＲＮＡ）の抽出
好酸球増多症の患者血液を遠心分離し、好酸球の画分を分離する。好酸球の純度については、ＦＡＣＳ解析などの方法によって確認を行なうことが好ましい。得られた分画から、公知の方法、グアニジン・フェノール法（Current Protocol in Molecular Biology, WILEY inter science社）等により、全ＲＮＡの抽出を行なう。
２）ｃＤＮＡの合成
得られた全ＲＮＡを鋳型にプライマーと逆転写酵素を用いて、ｃＤＮＡを合成する。
用いられるプライマーとしては、オリゴ（Oligo）ＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖ、オリゴ（ｄＴ１８）等が挙げられる。逆転写酵素としては、スーパースクリプトII（Super Script II）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（MMLV reverse transcriptase）、ＡＭＶ逆転写酵素（AMV reverse transcriptase）等を用いることができる。
【００２５】
３）ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの合成
セリンプロテアーゼのアクティブサイトをモチーフとしてセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ化学合成する。これらをそれぞれ組み合わせ、プライマーミックスを作成する。センスプライマー、アンチセンスプライマーについては、目的とするアミノ酸をコードするものであれば何でもよいが、ハイブリダイズのし易さを考慮して作成、組み合わせる必要がある。
４）選択的ＰＣＲ
２）で得たｃＤＮＡを鋳型とし、３）で得たプライマーミックスを用いて、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲにより、アクティブサイトを有するセリンプロテアーゼの部分配列が増幅される。得られた生成物を電気泳動にかけ、今まで知られているセリンプロテアーゼの長さを勘案してバンドを切り出し、ｃＤＮＡ断片を回収する。今回は、４００〜６００ｂｐのものを選んだ。
【００２６】
５）大腸菌への形質転換
４）で得られたｃＤＮＡ断片をＴベクターに連結し、得られたプラスミドを菌体に形質転換を行なう。好ましい菌体としては、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＨＢ１０９、ＸＬ−１等が挙げられる。菌体を培養し、プラスミドを抽出する。プラスミドを制限酵素（ＥｃｏＲＩ等）で切断し、電気泳動により、４００〜６００ｂｐのバンドを切り出し、回収し、インサートを確認する。
６）シーケンシング
５）で得られたクローンについて、公知の方法により、シーケンシングを行ない、それぞれのクローンの配列を決定する。得られた部分配列のうち、セリンプロテアーゼのアクティブサイトの配列を有し、しかも新規であるものを探すためにホモロジー検索を行なう。
【００２７】
７）５′末端の同定
６）で得られた配列の全長を得るために、５′ＲＡＣＥ法により同定する。例えば、キャップファインダー（CAP finder）変法（Clontec社）、５′ＲＡＣＥシステム（Gibco BRL 社）等を用いて、６）で得られた部分配列の５′末端の同定を行なう。そのための鋳型として、ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡを作成する。
詳しくは、
ｉ）２）で得られた全ＲＮＡを用いて、プライマーおよび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成する。プライマーとしては、キャップスイッチ（CAP switch）プライマー、オリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー等が用いられる。逆転写酵素は前記と同じものを用いることができる。
ii）ｉ）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマーおよび６）で得られた部分配列の部分をプライマーに用いて、ＰＣＲを行なう。
iii）確かさおよびＰＣＲ生成物の量を増すために、同じプライマーおよび６）で得られた部分配列の別の部分配列を用いてネステッドＰＣＲ（nested PCR）を行なう。
iv）このようにして得られたＰＣＲ生成物を電気泳動にかけ、バンドを切り出し、ｃＤＮＡを回収する。
ｖ）回収されたｃＤＮＡをＴベクターにサブクローニングし、得られたプラスミドを菌体に形質転換し、培養する。菌体よりプラスミドを回収し、制限酵素により切断し、電気泳動により、インサートを確認する。
vi）クローンのシーケンシングを行ない、５′末端の配列を同定する。
【００２８】
８）３′末端の同定
３′ＲＡＣＥ法を用いて、６）で得られた配列の３′末端の配列を得る。方法は、５′ＲＡＣＥ法と同様であるが、６）の部分配列については、より下流側の配列を用いる。鋳型は、５′ＲＡＣＥ法で用いたものと同じｃＤＮＡを用いる。９）全長の確認
６）、７）および８）の操作により得られた全長の配列が、本当に存在することを確認するために、得られた配列の３′末端および５′末端の部分配列を用いて、ＰＣＲを行ない、生成物を電気泳動にかけ、バンドを切り出し、回収し、Ｔベクターに接合してプラスミドを得、得られたプラスミドを菌体に形質転換し、菌体を培養後、プラスミドを回収し、シーケンシングを行なう。
１０）好中球における本配列の確認
好中球画分に対して、部分配列を用いたＰＣＲにより、本発明配列が存在しないことを確認した。
【００２９】
このようにして得られたｃＤＮＡは、そのものが全長またはほぼ全長であることを確認する必要がある。公知のシグナルシークエンスの長さおよび配列との比較により、本願ポリペプチドは、ほぼ全長であることを確認した。
配列番号２および３で示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、あるいは本発明の塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要量得ることができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００３１】
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟蛋白部分またはプロフォーム蛋白部分をコードするｃＤＮＡの５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。
【００３２】
次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.Coli ＤＨ５α、E.Coli ＪＭ１０９、E.Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
【００３３】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードするｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、ヒト未分化好酸球白血病ＥＯＬ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、好酸球が産生するセリンプロテアーゼであり、脱顆粒に関与し、好酸球の増多は、前述したように、アレルギー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾患、膠原病、血管炎などに伴って起こるため、これらの疾患に関与していると考えられる。
従って、本発明のセリンプロテアーゼを阻害することは、上記の疾患の予防および／または治療に有用であると考えられる。本発明のセリンプロテアーゼは、その阻害剤を得るためのスクリーニングにとって、必須のものである。
また、この方法を応用することにより、アレルギー疾患の診断に用いることもできる。
【００３５】
本発明のセリンプロテアーゼの抗体は、上記疾患の診断のために用いることができる。
すなわち、本発明のセリンプロテアーゼのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における本発明セリンプロテアーゼの定量が行なえ、これによって本発明のセリンプロテアーゼと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。さらに、本発明のセリンプロテアーゼを用いることにより本発明のポリペプチドと結合する蛋白（受容体）の精製あるいは遺伝子クローニングをすることができる。また本発明のセリンプロテアーゼのアゴニスト、アンタゴニストの検索に用いることもできる。
【００３６】
本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明セリンプロテアーゼを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によって、セリンプロテアーゼの発現を停止させることによる治療等）に利用できる。また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ｃＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明セリンプロテアーゼと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００３７】
【医薬品への適用】
本発明のセリンプロテアーゼは、アレルギー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾患、膠原病、血管炎等の予防および／または治療のために有用である。また、上記疾患の診断にも有用である。本発明のセリンプロテアーゼ、あるいは本発明のセリンプロテアーゼに対する抗体は通常、全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与および静脈内投与である。
【００３８】
本発明化合物、抗体またはアンチセンスを投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。
【００３９】
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて必要な場合もある。
【００４０】
【実施例】
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００４１】
実施例１：全ＲＮＡの抽出
好酸球増多症の患者の血液をパーコール（Sigma社）密度遠心分離により、顆粒球分画を分離し、抗ＣＤ１６抗体にて、ネガティブセレクションを行なった。この分画が好酸球の純度が９８％以上であることをＦＡＣＳ解析（Becton Dickinson社）により確認した。好酸球分画からグアニジン・フェノール法（Current Protocol in Molecular Biology, WILEY inter science社）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。
【００４２】
実施例２：一本鎖ｃＤＮＡの合成
オリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー：５′−ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′（配列番号５）を合成した。
実施例１で得た全ＲＮＡ（１μｌ（１μｇ／１μｌ））および上記で合成したバイファンクショナルプライマー（１μｌ、１００μＭ）を混合し、0.5ｍｌの RNAase・フリーチューブ（RNAase free tube）内で、７２℃で２分間、氷中で５分間反応させた。前記チューブにRNAsin（１μｌ）、スーパースクリプトII（Super Script II（１μｌ、Gibco BRL社））、ジチオスレイトール（ＤＴＴ，１μｌ）、５×スーパースクリプトIIバッファー（Super Script II Buffer）（４μｌ）、ＤＥＰＥＣ処理水（１１μｌ）を加え、４２℃で６０分間、９４℃で５分間反応させた。
【００４３】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの合成
プラスミンのアクティブサイトをモチーフとした以下のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー各４種を化学合成し、これらを組み合わせて、１６種類のプライマーミックスを得た。
【００４４】
【化１】

【００４５】
【化２】

【００４６】
【表１】

【００４７】
実施例４：選択的ＰＣＲ
１０×ＥＸタックバッファー（EX Taq Buffer，４０μｌ、宝酒造）、ｄＮＴＰミクスチャー（dNTP Mix，３２μｌ、宝酒造社）、ＥＸタックポリメラーゼ（EX Taq polymerase ，２μｌ、宝酒造社）、実施例２で得られたｃＤＮＡ（１０μｌ）およびｄＨ₂Ｏ（２９６μｌ）を混合し、ＰＣＲミックスを作成した。実施例３で得た１６種類のプライマーミックス（１μｌ）およびＰＣＲミックス（１９μｌずつ）をＰＣＲチューブに分注し、遺伝子増幅ＰＣＲシステム2400 （Gene Amp PCR system 2400，Perkin Elmer社）を用いてＰＣＲを３５サイクル行なった。ＰＣＲは、９４℃で1.5分おいた後、９４℃で0.5分、６６℃で1.0分７２℃で2.0分を３５サイクルした後、７２℃で7.0分おいた。
反応後、各チューブの生成物をアガロースゲル（１×ＴＡＥ）を用いた電気泳動にかけたのち、エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）溶液処理を行ない、４００〜６００ｂｐのバンドを回収した。この長さのバンドが得られた組み合わせは、Ｎｏ．３，９，１１および１３であった。
【００４８】
実施例５：大腸菌への形質転換
実施例４で回収したｃＤＮＡ（１μｌ）をＴベクターＰＣＲ2.1（１μｌ、Invitrogen社）にリガーゼＩ（LigaseＩ，２μｌ、宝酒造社）を用いて連結した。得られたプラスミドをＸＬ−２Ｂｌｕｅ（Stratagen社）に形質転換し、クローンを得た。２４個のクローンをランダムに選び、アンピシリン含有のＬＢ培養液（Difco社）中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード・ミニプレップキット（Wizard miniprep kit，Promega社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolab社）を用いて切断し、アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理した結果、５個のクローンに４００〜６００ｂｐのバンドを得た。
【００４９】
実施例６：シーケンシング
実施例５で得られた５つのクローンをサイクルシーケンスキット（Cycle Sequence kit，Applied Biosystems社）を用いてシーケンシングを行ない、各々の核酸配列を得た。ホモロジー検索（BLASTX，NCBI）の結果、３クローンがセリンプロテアーゼの配列を有していた。そのうち１クローンは新規な配列であった。
【００５０】
実施例７：５′末端の同定
実施例６で得られたクローンの全長を得るために、まず一本鎖ｃＤＮＡをキャップファインダー（Cap finder）法を用いて作成し、これを鋳型として５′ＲＡＣＥ変法を行なった。すなわち、実施例１で得た全ＲＮＡ（１μｌ）を鋳型に、キャップスイッチII（Cap Switch II）オリゴヌクレオチド（１μｌ、５μＭ）：５′−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧ−３′（配列番号６）および実施例３で合成したオリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー（１μｌ、１０μＭ）、ｄＨ₂Ｏ（２μｌ）をRNAase・フリーチューブに入れ、７２℃で２分間反応させ、氷中に５分間放置後、５×スーパースクリプトIIバッファー（Super Script II Buffer）（２μｌ）、ＤＴＴ（１μｌ，２０ｍＭ）、ｄＮＴＰ（１μｌ、１０ｍＭ）およびスーパースクリプトII（Super Script II）（１μｌ）を加えて、４２℃で１時間反応後９５℃で２分間変性した。得られた一本鎖ｃＤＮＡは、ＱＩＡクイックＰＣＲピュリフィケーションキット（QIA quick PCR Purification Kit，QIAGEN社）を用いて精製し、３０μｌのトリス（Tris，１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）に再懸濁（resuspend）た。
【００５１】
これを鋳型に用いて、キャップ（ＣＡＰ）ＰＣＲプライマー：５′−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３′（配列番号７）および実施例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（６８）：５′−ＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣ−３′（配列番号８）を用いてＰＣＲ（First PCR）を３５サイクル行ない、精製後さらに、上記のＣＡＰＰＣＲプライマーおよび実施例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（４９）：５′−ＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＧＴＣＡＣ−３′（配列番号９）を用いてＰＣＲ（Second PCR）を２０サイクル行なった。
生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、約３００ｂｐのバンドを得た。得られたバンドを切り出し、回収したｃＤＮＡを実施例５と同様の操作により、Ｔベクターにサブクローニングし、ＸＬ−２Ｂｌｕｅに形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液（Difco社）中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード・ミニプレップキット（Wizard miniprep kit，Promega社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolab社）を用いて切断し、アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し３００ｂｐのインサートを確認した。得られた５クローンについて、実施例６と同様の方法によりシーケンシングを行なったところ、２つのクローンにおいて、実施例６で得られた配列の一部と一致した。
【００５２】
実施例８：３′末端の同定
実施例７で得られたｃＤＮＡを鋳型として実施例７と同様の方法（３′ＲＡＣＥ変法）により、ＮｏｔＩ（ｄＴ）プライマー：５′−ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧ−３′（配列番号１０）および実施例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（４２４）：５′−ＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣ−３′（配列番号１１）を用いてＰＣＲ（First PCR）を３５サイクル行ない、精製後さらに、上記のＮｏｔＩ（ｄＴ）プライマーおよび実施例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（４５６）：５′−ＣＧＧＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧ−３′（配列番号１２）を用いてＰＣＲ（Second PCR）を２０サイクル行なった。生成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、約４００ｂｐのバンドを得た。得られたバンドを切り出し、回収したｃＤＮＡを実施例５と同様の操作により、Ｔベクターにサブクローニングし、ＸＬ−２Ｂｌｕｅに形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード・ミニプレップキット（Wizard miniprep kit， Promega社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、約４００ｂｐのインサートを確認した。得られた２クローンについて、実施例６と同様の方法によりシーケンシングを行なったところ、２つのクローンにおいて、実施例６で得られた配列の一部と一致した。
【００５３】
実施例９：全長の確認
実施例６、７および８より得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（−９）：５′−ＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＣ−３′（配列番号１３）および部分配列ＥＳＰ−１（１０５８）：５′−ＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１４）をプライマーとして、実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型として、実施例７と同様の操作を行ない、８クローン中、３クローンにおいて全長が１０５８ｂｐの配列が得られた。欠失（deletion）を持つ１クローンを含む４クローンの配列を参照し、配列番号３に示される配列を得た。
この核酸配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１に、翻訳部分の配列を配列番号２に、アミノ酸と核酸を併記したものを配列番号４にそれぞれ示す。
【００５４】
本発明の推定アミノ酸配列は、シグナルペプチド（Ｍｅｔ^-26〜Ａｌａ^-1）を含む、全長３１５アミノ酸からなっており、セリンプロテアーゼのプロファイル（活性中心、Ｈｉｓ⁵⁶、Ａｓｐ¹¹¹、Ｓｅｒ²¹³）を有し、Ｃ末端に１８個の疎水性領域（Ｔｒｐ²⁷²〜Ｖａｌ²⁸⁹）を有していた。一方、Ａｌａ²⁶¹〜Ｓｅｒ²⁶³あるいはＧｌｙ²⁶⁴〜Ｓｅｒ²⁶⁶にはＧＰＩアンカード膜蛋白に対するω、ω１、ω２サイトを有しており、膜蛋白としての特徴と分泌型蛋白としての特徴を合わせ持っている。既知配列との比較により、本セリンプロテアーゼは、プロフォームの形で産生されると考えられ（Ａｌａ¹〜Ｖａｌ²⁸⁹）、成熟蛋白としては、Ｉｌｅ¹⁶からであると考えられる。
【００５５】
実施例１０：好中球において本発明配列が発現していないことの確認
実施例１と同様の操作により、抗ＣＤ１６抗体にてポジティブセレクションを行なって得た好中球分画に対して、実施例２と同様の操作を行ない、ｃＤＮＡを得、これにＰＣＲプライマーとして、実施例７で用いた部分配列ＥＳＰ−１（６８）および実施例９で用いた部分配列ＥＳＰ−１（−９）を用いたＰＣＲを行ない、実施例６と同様の操作を行なった結果、約３００ｂｐのバンドは得られず、好中球には、本発明のアミノ酸配列をコードするＲＮＡを発現していないことが確認された。
【００５６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala
-26 -25 -20 -15
Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro
-10 -5 1 5
Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala
10 15 20
Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser
25 30 35
His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala
40 45 50
Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp
55 60 65 70
Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu
75 80 85
Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro
90 95 100
Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser
105 110 115
Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln
120 125 130
Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly
135 140 145 150
Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu
155 160 165
Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu
170 175 180
Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys
185 190 195
Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly
200 205 210
Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val
215 220 225 230
Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr
235 240 245
Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln
250 255 260
Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro
265 270 275
Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val
280 285
【００５７】
配列番号：２
配列の長さ：９４５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
ATGGGCGCGC GCGGGGCGCT GCTGCTGGCG CTGCTGCTGG CTCGGGCTGG ACTCAGGAAG 60
CCGGAGTCGC AGGAGGCGGC GCCGTTATCA GGACCATGCG GCCGACGGGT CATCACGTCG 120
CGCATCGTGG GTGGAGAGGA CGCCGAACTC GGGCGTTGGC CGTGGCAGGG GAGCCTGCGC 180
CTGTGGGATT CCCACGTATG CGGAGTGAGC CTGCTCAGCC ACCGCTGGGC ACTCACGGCG 240
GCGCACTGCT TTGAAACCTA TAGTGACCTT AGTGATCCCT CCGGGTGGAT GGTCCAGTTT 300
GGCCAGCTGA CTTCCATGCC ATCCTTCTGG AGCCTGCAGG CCTACTACAC CCGTTACTTC 360
GTATCGAATA TCTATCTGAG CCCTCGCTAC CTGGGGAATT CACCCTATGA CATTGCCTTG 420
GTGAAGCTGT CTGCACCTGT CACCTACACT ACTAAACACA TCCAGCCCAT CTGTCTCCAG 480
GCCTCCACAT TTGAGTTTGA GAACCGGACA GACTGCTGGG TGACTGGCTG GGGGTACATC 540
AAAGAGGATG AGGCACTGCC ATCTCCCCAC ACCCTCCAGG AAGTTCAGGT CGCCATCATA 600
AACAACTCTA TGTGCAACCA CCTCTTCCTC AAGTACAGTT TCCGCAAGGA CATCTTTGGA 660
GACATGGTTT GTGCTGGCAA TGCCCAAGGC GGGAAGGATG CCTGCTTCGG TGACTCAGGT 720
GGACCCTTGG CCTGTAACAA GAATGGACTG TGGTATCAGA TTGGAGTCGT GAGCTGGGGA 780
GTGGGCTGTG GTCGGCCCAA TCGGCCCGGT GTCTACACCA ATATCAGCCA CCACTTTGAG 840
TGGATCCAGA AGCTGATGGC CCAGAGTGGC ATGTCCCAGC CAGACCCCTC CTGGCCACTA 900
CTCTTTTTCC CTCTTCTCTG GGCTCTCCCA CTCCTGGGGC CGGTC 945
【００５８】
配列番号：３
配列の長さ：１０８５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
GAGGAGGCCA TGGGCGCGCG CGGGGCGCTG CTGCTGGCGC TGCTGCTGGC TCGGGCTGGA 60
CTCAGGAAGC CGGAGTCGCA GGAGGCGGCG CCGTTATCAG GACCATGCGG CCGACGGGTC 120
ATCACGTCGC GCATCGTGGG TGGAGAGGAC GCCGAACTCG GGCGTTGGCC GTGGCAGGGG 180
AGCCTGCGCC TGTGGGATTC CCACGTATGC GGAGTGAGCC TGCTCAGCCA CCGCTGGGCA 240
CTCACGGCGG CGCACTGCTT TGAAACCTAT AGTGACCTTA GTGATCCCTC CGGGTGGATG 300
GTCCAGTTTG GCCAGCTGAC TTCCATGCCA TCCTTCTGGA GCCTGCAGGC CTACTACACC 360
CGTTACTTCG TATCGAATAT CTATCTGAGC CCTCGCTACC TGGGGAATTC ACCCTATGAC 420
ATTGCCTTGG TGAAGCTGTC TGCACCTGTC ACCTACACTA CTAAACACAT CCAGCCCATC 480
TGTCTCCAGG CCTCCACATT TGAGTTTGAG AACCGGACAG ACTGCTGGGT GACTGGCTGG 540
GGGTACATCA AAGAGGATGA GGCACTGCCA TCTCCCCACA CCCTCCAGGA AGTTCAGGTC 600
GCCATCATAA ACAACTCTAT GTGCAACCAC CTCTTCCTCA AGTACAGTTT CCGCAAGGAC 660
ATCTTTGGAG ACATGGTTTG TGCTGGCAAT GCCCAAGGCG GGAAGGATGC CTGCTTCGGT 720
GACTCAGGTG GACCCTTGGC CTGTAACAAG AATGGACTGT GGTATCAGAT TGGAGTCGTG 780
AGCTGGGGAG TGGGCTGTGG TCGGCCCAAT CGGCCCGGTG TCTACACCAA TATCAGCCAC 840
CACTTTGAGT GGATCCAGAA GCTGATGGCC CAGAGTGGCA TGTCCCAGCC AGACCCCTCC 900
TGGCCACTAC TCTTTTTCCC TCTTCTCTGG GCTCTCCCAC TCCTGGGGCC GGTCTGAGCC 960
TACCTGAGCC CATGCAGCCT GGGGCCACTG CCAAGTCAGG CCCTGGTTCT CTTCTGTCTT 1020
GTTTGGTAAT AAACACATTC CAGTTGATGC CTTGCAGGGC ATTCTTCAAA AAAAAAAAAA 1080
AAAAA 1085
【００５９】
配列番号：４
配列の長さ：１０８５
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：Homo Sapiens
細胞：好酸球
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：10..954
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：sig peptide
存在位置：10..87
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：proform peptide
存在位置：88..954
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：mat. peptide
存在位置：133..954
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：活性中心（Ｈｉｓ）
存在位置：253..255
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：活性中心（Ａｓｐ）
存在位置：418..420
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：活性中心（Ｓｅｒ）
存在位置：724..726
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト
存在位置：868..876
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト
存在位置：877..885
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：親水性領域
存在位置：883..900
特徴を決定した方法：Ｓ
特徴を表わす記号：疎水性領域
存在位置：901..954
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
GAGGAGGCC ATG GGC GCG CGC GGG GCG CTG CTG CTG GCG CTG CTG CTG 48
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
-26 -25 -20 -15
GCT CGG GCT GGA CTC AGG AAG CCG GAG TCG CAG GAG GCG GCG CCG TTA 96
Ala Arg Ala Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu
-10 -5 1
TCA GGA CCA TGC GGC CGA CGG GTC ATC ACG TCG CGC ATC GTG GGT GGA 144
Ser Gly Pro Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly
5 10 15
GAG GAC GCC GAA CTC GGG CGT TGG CCG TGG CAG GGG AGC CTG CGC CTG 192
Glu Asp Ala Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu
20 25 30 35
TGG GAT TCC CAC GTA TGC GGA GTG AGC CTG CTC AGC CAC CGC TGG GCA 240
Trp Asp Ser His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala
40 45 50
CTC ACG GCG GCG CAC TGC TTT GAA ACC TAT AGT GAC CTT AGT GAT CCC 288
Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro
55 60 65
TCC GGG TGG ATG GTC CAG TTT GGC CAG CTG ACT TCC ATG CCA TCC TTC 336
Ser Gly Trp Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe
70 75 80
TGG AGC CTG CAG GCC TAC TAC ACC CGT TAC TTC GTA TCG AAT ATC TAT 384
Trp Ser Leu Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr
85 90 95
CTG AGC CCT CGC TAC CTG GGG AAT TCA CCC TAT GAC ATT GCC TTG GTG 432
Leu Ser Pro Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val
100 105 110 115
AAG CTG TCT GCA CCT GTC ACC TAC ACT ACT AAA CAC ATC CAG CCC ATC 480
Lys Leu Ser Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile
120 125 130
TGT CTC CAG GCC TCC ACA TTT GAG TTT GAG AAC CGG ACA GAC TGC TGG 528
Cys Leu Gln Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp
135 140 145
GTG ACT GGC TGG GGG TAC ATC AAA GAG GAT GAG GCA CTG CCA TCT CCC 576
Val Thr Gly Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro
150 155 160
CAC ACC CTC CAG GAA GTT CAG GTC GCC ATC ATA AAC AAC TCT ATG TGC 624
His Thr Leu Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys
165 170 175
AAC CAC CTC TTC CTC AAG TAC AGT TTC CGC AAG GAC ATC TTT GGA GAC 672
Asn His Leu Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp
180 185 190 195
ATG GTT TGT GCT GGC AAT GCC CAA GGC GGG AAG GAT GCC TGC TTC GGT 720
Met Val Cys Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly
200 205 210
GAC TCA GGT GGA CCC TTG GCC TGT AAC AAG AAT GGA CTG TGG TAT CAG 768
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln
215 220 225
ATT GGA GTC GTG AGC TGG GGA GTG GGC TGT GGT CGG CCC AAT CGG CCC 816
Ile Gly Val Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro
230 235 240
GGT GTC TAC ACC AAT ATC AGC CAC CAC TTT GAG TGG ATC CAG AAG CTG 864
Gly Val Tyr Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu
245 250 255
ATG GCC CAG AGT GGC ATG TCC CAG CCA GAC CCC TCC TGG CCA CTA CTC 912
Met Ala Gln Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu
260 265 270 275
TTT TTC CCT CTT CTC TGG GCT CTC CCA CTC CTG GGG CCG GTC 954
Phe Phe Pro Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val
280 285
TGAGCCTACC TGAGCCCATG CAGCCTGGGG CCACTGCCAA GTCAGGCCCT GGTTCTCTTC 1014
TGTCTTGTTT GGTAATAAAC ACATTCCAGT TGATGCCTTG CAGGGCATTC TTCAAAAAAA 1074
AAAAAAAAAA A 1085
【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【００６９】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel serine protease.
More specifically, a novel serine protease produced by human eosinophils, a production method thereof, a cDNA encoding the serine protease, a vector comprising the cDNA, a host cell transformed with the vector, the serine protease Use of antibody and serine protease or pharmaceutical composition containing antibody, method for screening serine protease inhibitor, diagnostic method for allergic disease characterized by measuring enzyme activity of serine protease, antibody for serine protease The present invention relates to a method for diagnosing allergic diseases.
[0002]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Eosinophils are a type of white blood cell and are named for their staining with eosin. Eosinophils are similar to neutrophils in terms of their form, source, and phagocytosis, but differ in their reactivity to staining, pathogenic microorganisms, chemicals, and hormones. Eosinophils make up about 1-5% of peripheral blood leukocytes in healthy individuals.
Known diseases associated with eosinophilia include allergic diseases, infectious diseases, neoplastic diseases, granulomatous diseases, collagen diseases, vasculitis and the like. Furthermore, not only peripheral blood, but also the presence of eosinophils in the airways of asthmatic patients and tissues of allergic granulomatous vasculitis and eosinophilic pneumonia associated with asthma, among parasitic patients Low specific gravity eosinophils, which are activated in the case of pulmonary infiltration and pleural effusion, appear in many places, and eosinophils in the peripheral blood of patients with allergic rhinitis and dermatitis are activated It is reported that the pathogenesis and eosinophil activation or tissue infiltration are deeply related (Therapeutics, Vol.25, No.4, pp. 384-387, 1991).
[0003]
Eosinophils play a role in attacking parasites in parasitic infections, but in allergic reactions, it is believed that they damage the self tissue and promote allergic inflammation.
Eosinophil mediators include granule proteins (basic proteins such as eosinophilic cationic protein and major basic protein, various enzymes), cell membrane phospholipid metabolites (prostaglandins) , Leukotrienes, thromboxanes, platelet activating factors, etc.), active oxygen, cytokines, etc. have been reported, and eosinophils are considered to exert their functions via these mediators. However, the mediators identified so far alone cannot completely explain the role of eosinophils, suggesting that some mediators have not yet been isolated.
[0004]
In the allergic reaction, it is considered that mast cells are involved in the early stage, but the involvement of eosinophils is strongly suggested in the chronic stage. Eosinophils are thought to attack self-organization by causing degranulation, which has been found to involve proteases, particularly serine proteases (Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.312, No. .1, July, pp.67-74, 1994)
[0005]
OBJECT OF THE INVENTION
The present inventors paid attention to this point, and conducted diligent studies to find out the novel factor (polypeptide) produced by human eosinophils, particularly serine protease.
[0006]
Conventionally, when obtaining a specific polypeptide or cDNA encoding the same, the target biological activity is confirmed in tissue or cell culture medium, and then the gene is cloned through isolation and purification of the polypeptide. Generally, a method or a method of expression cloning of a gene using its biological activity as an index has been used.
However, in vivo bioactive polypeptides often have a variety of biological activities, and as a result of cloning a gene using one activity as an indicator, it may be the same as a known polypeptide. Increasing cases are found later. In addition, most of the factors produced by specific cells are produced in very small amounts, which makes isolation, purification and confirmation of biological activity difficult.
[0007]
In recent years, cDNA production technology and sequencing technology have been rapidly developed, and it has become possible to rapidly sequence a large amount of cDNA. Therefore, using these technologies, a cDNA library is created from various cells and tissues, the cDNA is randomly cloned, the nucleotide sequence is determined, the corresponding polypeptide is expressed, and its physiological function is analyzed. The method of doing is developing. As part of such technology, it is possible to find an unknown polypeptide having a characteristic partial sequence by PCR (Polymerase chain reaction) using sense and antisense primers for RNA having a characteristic partial sequence. I can do it now.
The present inventors have succeeded in finding a novel factor (polypeptide) produced by eosinophils and cDNA encoding the same, and completed the present invention.
[0008]
The novelness of the sequence of the present invention was confirmed by homology search. Of the several clones obtained by the method for producing the sequence of the present invention described in detail later, only the sequence of the present invention was novel.
The deduced amino acid sequence of the present invention had a serine protease profile and had a hydrophobic amino acid sequence at the C-terminus. In addition, it has ω, ω1, and ω2 sites for GPI (glycosylphosphatidylinositol) uncarded membrane protein, and has characteristics as a membrane protein and a secretory protein. By comparison with known sequences, the serine protease is considered to be produced in the form of a proform, and the upstream portion is considered to be a mature protein.
[0009]
[Structure of the invention]
The present invention
(1) a serine protease comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) cDNA encoding the serine protease described in (1) above,
(3) cDNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(4) cDNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3,
About.
[0010]
More specifically, the present invention relates to a polypeptide which is a serine protease consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in a substantially pure form, a homologue thereof, a fragment of the sequence and a homologue thereof.
The invention further relates to cDNAs encoding these serine proteases. More specifically, the present invention relates to a cDNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3, and a cDNA having a fragment that selectively hybridizes to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3.
[0011]
The serine protease of the present invention having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in substantially pure form generally means that 90% or more, eg, 95, 98 or 99% of the polypeptide as produced is SEQ ID NO: 1. It means a serine protease having the amino acid sequence shown.
[0012]
The homologue of the serine protease of the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is generally at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60 or 100 consecutive amino acid regions, at least 70%, preferably Are those that are at least 80 or 90% homologous, more preferably 95% or more, and such homologs are hereinafter described as serine proteases of the present invention.
[0013]
Furthermore, the fragment of the serine protease of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a homolog fragment thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, such as 20, 25, 30, 40, 50 or Means the 60 amino acid part.
[0014]
The cDNA that selectively hybridizes to the cDNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 generally includes at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60, or 100 consecutive base sequence regions. At least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such cDNAs are hereinafter described as cDNAs of the invention.
[0015]
The fragment of cDNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 means a portion of at least 10 bases, preferably at least 15 bases, such as 20, 25, 30 or 40 bases, and such a fragment is also of the present invention. contained in cDNA.
[0016]
Furthermore, the present invention includes a replication or expression vector incorporating the cDNA of the present invention. Examples of the vector include a plasmid, virus, or phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the cDNA, a promoter control factor, and the like. The vector may contain one or more selective marker genes, such as an ampicillin resistance gene. The vector can be used in vitro, for example, for production of RNA corresponding to cDNA and transformation of host cells.
[0017]
Furthermore, the present invention also includes a host cell transformed with a vector for replicating or expressing the cDNA of the present invention including the cDNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 or the open reading frame thereof. It is. Examples of the cell include bacteria, yeast, insect cells, and mammalian cells.
[0018]
Furthermore, the present invention includes a method for producing the serine protease of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the serine protease of the present invention. The culture is preferably performed under conditions where the serine protease of the present invention is expressed and produced from the host cell.
[0019]
Antisense can be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of the vector as described above. Such antisense can also be used to control the level of the polypeptide of the invention in the cell.
[0020]
The present invention includes a monoclonal or polyclonal antibody of serine protease according to the present invention. Furthermore, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of serine protease. A monoclonal antibody can be produced by a conventional hybridoma technique using the serine protease of the present invention or a fragment thereof as an antigen. Polyclonal antibodies can be produced by a conventional method in which a host animal (eg, rat, rabbit, etc.) is inoculated with the serine protease of the present invention and immune serum is collected.
[0021]
The present invention also includes a pharmaceutical composition containing the serine protease of the present invention, its antibody, and a pharmaceutically acceptable excipient and / or carrier.
The present invention further includes a screening method for serine protease inhibitors using the serine protease of the present invention. The screening is carried out, for example, by measuring the enzyme activity from the absorbance or the like using a serine protease of the present invention and a compound to be screened in a buffer and using a synthetic substrate with a color former.
Moreover, by applying this method, it can also be used for diagnosis of allergic diseases and the like.
Furthermore, the present invention includes a method for diagnosing allergic diseases and the like using the serine protease antibody of the present application. Various types of diagnosis using antibodies are known. For example, an enzyme amount is measured by an enzyme immunoassay (EIA) method using an antigen-antibody reaction.
[0022]
The serine protease according to the present invention of (1) is one in which a part thereof is deleted in addition to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, only a portion essential for expression of biological activity in SEQ ID NO: 1) A polypeptide in which a part of the amino acid is substituted with another amino acid (for example, a substance substituted with an amino acid having similar physical properties), and a part in which another amino acid is added or inserted. .
There are 1 to 6 codons encoding one amino acid (for example, 1 type for Met and 6 types for Leu), and the base sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
[0023]
The cDNA of the present invention specified in (2) includes all base sequence groups encoding serine protease represented by SEQ ID NO: 1 in (1). The productivity of serine protease may be improved by changing the base sequence.
The cDNA specified in (3) is an embodiment of the cDNA shown in (2) and represents a natural sequence.
The cDNA shown in (4) shows a sequence obtained by adding a natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
[0024]
Preparation of cDNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is performed according to the following method.
1) Extraction of total RNA
The blood of a patient with eosinophilia is centrifuged and the eosinophil fraction is separated. The purity of eosinophils is preferably confirmed by a method such as FACS analysis. Total RNA is extracted from the obtained fraction by a known method, such as guanidine-phenol method (Current Protocol in Molecular Biology, WILEY interscience).
2) cDNA synthesis
Using the obtained total RNA as a template, cDNA is synthesized using a primer and reverse transcriptase.
Examples of the primer to be used include Oligo (Oligo) NotI (dT18) V and Oligo (dT18). As the reverse transcriptase, Super Script II, MMLV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, or the like can be used.
[0025]
3) Synthesis of primers for RT-PCR
A sense primer and an antisense primer are chemically synthesized using the active site of serine protease as a motif. These are combined to create a primer mix. The sense primer and the antisense primer may be anything as long as they encode the target amino acid, but need to be prepared and combined in consideration of the ease of hybridization.
4) Selective PCR
PCR is performed using the cDNA obtained in 2) as a template and the primer mix obtained in 3). By PCR, a partial sequence of serine protease having an active site is amplified. The obtained product is subjected to electrophoresis, and the band is excised taking into account the length of the serine protease known so far, and the cDNA fragment is recovered. This time, 400-600 bp thing was chosen.
[0026]
5) Transformation into E. coli
The cDNA fragment obtained in 4) is ligated to a T vector, and the resulting plasmid is transformed into cells. Examples of preferable cells include XL-2Blue, DH5α, HB101, HB109, XL-1. The cells are cultured and the plasmid is extracted. The plasmid is cleaved with a restriction enzyme (EcoRI or the like), and a 400 to 600 bp band is excised and collected by electrophoresis, and the insert is confirmed.
6) Sequencing
The clones obtained in 5) are sequenced by a known method, and the sequence of each clone is determined. Among the obtained partial sequences, a homology search is performed in order to search for a novel one having a serine protease active site sequence and being novel.
[0027]
7) Identification of 5 'end
In order to obtain the full length of the sequence obtained in 6), it is identified by the 5′RACE method. For example, the 5 ′ end of the partial sequence obtained in 6) is identified using a modified CAP finder (Clontec), 5′RACE system (Gibco BRL), or the like. As a template for that purpose, a RACE cDNA is prepared.
For more information,
i) Using the total RNA obtained in 2), cDNA is prepared with a primer and reverse transcriptase. As the primer, a cap switch (CAP switch) primer, an oligo NotI (dT18) V primer, or the like is used. The same reverse transcriptase as described above can be used.
ii) PCR is performed using the cDNA obtained in i) as a template and using the primer and the partial sequence obtained in 6) as a primer.
iii) Nested PCR is performed using the same primer and another partial sequence obtained in 6) to increase the certainty and the amount of PCR product.
iv) The PCR product thus obtained is subjected to electrophoresis, the band is excised and the cDNA is recovered.
v) The cloned cDNA is subcloned into a T vector, and the resulting plasmid is transformed into cells and cultured. The plasmid is recovered from the cells, cut with a restriction enzyme, and the insert is confirmed by electrophoresis.
vi) Sequencing the clone and identifying the 5 'end sequence.
[0028]
8) Identification of 3 'end
Using the 3′RACE method, the sequence at the 3 ′ end of the sequence obtained in 6) is obtained. The method is the same as that of the 5′RACE method, but the downstream sequence is used for the partial sequence of 6). The same cDNA as that used in the 5′RACE method is used as the template. 9) Check the total length
In order to confirm that the full-length sequence obtained by the operations of 6), 7) and 8) really exists, PCR was performed using partial sequences at the 3 ′ end and 5 ′ end of the obtained sequence. The product is electrophoresed, the band is cut out and collected, and the plasmid is obtained by conjugation to a T vector. The resulting plasmid is transformed into bacterial cells. After culturing the bacterial cells, the plasmid is recovered and sequenced. Sing.
10) Confirmation of this sequence in neutrophils
For the neutrophil fraction, it was confirmed by PCR using a partial sequence that the sequence of the present invention does not exist.
[0029]
It is necessary to confirm that the cDNA thus obtained is full-length or almost full-length. By comparison with the length and sequence of the known signal sequence, it was confirmed that the polypeptide of the present application was almost full length.
Once the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 are determined, then, by chemical synthesis or by chemically synthesizing fragments of the base sequence of the present invention and hybridizing them as probes, cDNA can be obtained. Furthermore, a necessary amount of the target cDNA can be obtained by introducing a vector cDNA containing this cDNA into an appropriate host and propagating it.
[0030]
As a method for obtaining the polypeptide of the present invention,
(1) A method for purification and isolation from living organisms or cultured cells,
(2) Peptide synthesis method or
(3) A method of producing using genetic recombination technology,
Industrially, the method described in (3) is preferable.
[0031]
Examples of the expression system (host-vector system) for producing a polypeptide using a gene recombination technique include bacterial, yeast, insect cell and mammalian cell expression systems.
For example, when expressed in E. coli, an initiation codon (ATG) is added to the 5 ′ end of the cDNA encoding the mature protein portion or the proform protein portion, and the resulting cDNA is converted into an appropriate promoter (eg, trp promoter). , Lac promoter, λPL promoter, T7 promoter, etc.) and inserted into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) to produce an expression vector.
[0032]
Next, E. coli transformed with this expression vector (for example, E.Coli DH5α, E.Coli JM109, E.Coli HB101 strain, etc.) is cultured in an appropriate medium, and the desired polypeptide is obtained from the cells. Obtainable. In addition, if a bacterial signal peptide (for example, a pelB signal peptide) is used, the target polypeptide can be secreted into the periplasm. In addition, fusion proteins with other polypeptides can be produced.
[0033]
When expressed in mammalian cells, for example, a cDNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is used as an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia virus vector, SV40 vector, etc.) An expression vector is prepared by inserting it downstream of an appropriate promoter (for example, SV40 promoter, SRα promoter, LTR promoter, metallothionein promoter, etc.). Next, an appropriate mammalian cell (eg, human undifferentiated eosinophil leukemia EOL cell, COS-7 cell, CHO cell, mouse L cell, etc.) is transformed with the obtained expression vector, and the transformant is appropriately used. By culturing in a suitable medium, the desired polypeptide is secreted into the culture solution. The polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method.
[0034]
【The invention's effect】
The polypeptide of the present invention is a serine protease produced by eosinophils and is involved in degranulation. As described above, the increase in eosinophils is allergic disease, infectious disease, neoplastic disease, granuloma It is thought to be involved in these diseases because it occurs with sex diseases, collagen diseases, vasculitis, and the like.
Therefore, inhibiting the serine protease of the present invention is considered useful for the prevention and / or treatment of the above-mentioned diseases. The serine protease of the present invention is essential for screening to obtain its inhibitor.
In addition, by applying this method, it can also be used for diagnosis of allergic diseases.
[0035]
The serine protease antibody of the present invention can be used for diagnosis of the above diseases.
That is, the serine protease monoclonal antibody or monoclonal antibody of the present invention can be used to quantify the serine protease of the present invention in a living body, and this can be used for studying the relationship between the serine protease of the present invention and a disease or for diagnosing a disease. be able to. Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies can be prepared by a conventional method using the polypeptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. Furthermore, by using the serine protease of the present invention, a protein (receptor) that binds to the polypeptide of the present invention can be purified or cloned. It can also be used to search for agonists and antagonists of the serine protease of the present invention.
[0036]
The cDNA of the present invention is not only an important and indispensable template for producing the serine protease of the present invention, which is expected to have great utility, but also diagnosis and treatment of genetic diseases (treatment of gene deficiency or antisense DNA) (RNA) can be used for treatment by stopping the expression of serine protease. In addition, genomic DNA can be separated using the cDNA of the present invention as a probe. Similarly, it is possible to isolate a gene of a human related polypeptide having a high homology with the cDNA of the present invention, or a gene of a polypeptide having a high homology with the serine protease of the present invention in a non-human organism.
[0037]
[Application to pharmaceutical products]
The serine protease of the present invention is useful for the prevention and / or treatment of allergic diseases, infectious diseases, neoplastic diseases, granulomatous diseases, collagen diseases, vasculitis and the like. It is also useful for the diagnosis of the above diseases. The serine protease of the present invention or the antibody against the serine protease of the present invention is usually administered systemically or locally, generally in an oral or parenteral form. Oral administration and intravenous administration are preferable.
[0038]
When administering the compound, antibody or antisense of the present invention, it is used as a solid composition, liquid composition and other compositions for oral administration, injection for parenteral administration, external preparation, suppository, etc. It is done.
Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like. Capsules include soft capsules and hard capsules.
[0039]
The dose varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but it is usually administered orally once to several times a day in the range of 100 μg to 100 mg per adult. Or, it is administered parenterally once or several times a day in the range of 10 μg to 100 mg per adult per person.
Of course, as described above, since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage may be sufficient, or may be necessary beyond the range.
[0040]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to examples and reference examples below, but these do not limit the scope of the present invention.
[0041]
Example 1: Extraction of total RNA
The blood of the patient with eosinophilia was separated by percoll (Sigma) density centrifugation, and the condylar granule fraction was separated, and negative selection was performed with an anti-CD16 antibody. This fraction was confirmed by FACS analysis (Becton Dickinson) that the purity of eosinophils was 98% or more. Total RNA was extracted from the eosinophil fraction using the guanidine phenol method (Current Protocol in Molecular Biology, WILEY interscience).
[0042]
Example 2: Synthesis of single-stranded cDNA
Oligo NotI (dT18) V primer: 5′-AACTGGAAGAAATTCGCGGCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 ′ (SEQ ID NO: 5) was synthesized.
The total RNA obtained in Example 1 (1 μl (1 μg / 1 μl)) and the bifunctional primer (1 μl, 100 μM) synthesized above were mixed, and 72 ml in a 0.5 ml RNAase free tube. The reaction was allowed to proceed for 2 minutes at 5 ° C and 5 minutes in ice. RNAsin (1 μl), Superscript II (1 μl, Gibco BRL)), dithiothreitol (DTT, 1 μl), 5 × Super Script II Buffer (4 μl), DEPEC Treated water (11 μl) was added and reacted at 42 ° C. for 60 minutes and 94 ° C. for 5 minutes.
[0043]
Example 3: Synthesis of primers for RT-PCR
The following 4 types of sense and antisense primers were chemically synthesized using the active site of plasmin as a motif, and these were combined to obtain 16 types of primer mixes.
[0044]
[Chemical 1]

[0045]
[Chemical 2]

[0046]
[Table 1]

[0047]
Example 4: Selective PCR
10 × EX Tac Buffer (EX Taq Buffer, 40 μl, Takara Shuzo), dNTP Mixture (dNTP Mix, 32 μl, Takara Shuzo), EX Tac Polymerase (EX Taq polymerase, 2 μl, Takara Shuzo), cDNA obtained in Example 2 (10 μl) and dH ₂ O (296 μl) was mixed to make a PCR mix. The 16 types of primer mix (1 μl) and PCR mix (19 μl each) obtained in Example 3 were dispensed into PCR tubes, and PCR was performed using a gene amplification PCR system 2400 (Gene Amp PCR system 2400, Perkin Elmer). 35 cycles were performed. PCR was carried out at 94 ° C. for 1.5 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C. for 0.5 minute, 66 ° C. for 1.0 minute, 72 ° C. for 2.0 minutes, and then 72 ° C. for 7.0 minutes.
After the reaction, the product in each tube was subjected to electrophoresis using an agarose gel (1 × TAE) and then treated with an ethidium bromide solution to recover a 400 to 600 bp band. The combination from which the band of this length was obtained was No. 3, 9, 11 and 13.
[0048]
Example 5: Transformation into E. coli
The cDNA (1 μl) recovered in Example 4 was ligated to T vector PCR2.1 (1 μl, Invitrogen) using ligase I (Ligase I, 2 μl, Takara Shuzo). The resulting plasmid was transformed into XL-2Blue (Stratagen) to obtain a clone. Twenty-four clones were randomly selected and shaken overnight at 37 ° C. in an ampicillin-containing LB culture medium (Difco). Plasmids were extracted using a Wizard miniprep kit (Promega). The plasmid was cleaved with EcoRI restriction enzyme (New England Biolab), subjected to agarose electrophoresis and treated with ethidium bromide solution. As a result, 400 to 600 bp bands were obtained in 5 clones.
[0049]
Example 6: Sequencing
The five clones obtained in Example 5 were sequenced using a cycle sequence kit (Applied Biosystems) to obtain each nucleic acid sequence. As a result of homology search (BLASTX, NCBI), 3 clones had the serine protease sequence. One clone was a novel sequence.
[0050]
Example 7: Identification of the 5 'end
In order to obtain the full length of the clone obtained in Example 6, first, a single-stranded cDNA was prepared using the cap finder method, and 5′RACE modified method was performed using this as a template. That is, using the total RNA (1 μl) obtained in Example 1 as a template, Cap Switch II oligonucleotide (1 μl, 5 μM): 5′-AAGCAGGTGATCAACGCAGAGTACGCGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) and Example 3 Synthesized oligo NotI (dT18) V primer (1 μl, 10 μM), dH ₂ Place O (2 μl) in RNAase-free tube, react at 72 ° C. for 2 minutes, leave on ice for 5 minutes, then 5 × Super Script II Buffer (2 μl), DTT (1 μl, 20 mM) , DNTP (1 μl, 10 mM) and Super Script II (1 μl) were added, reacted at 42 ° C. for 1 hour and then denatured at 95 ° C. for 2 minutes. The obtained single-stranded cDNA was purified using a QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN) and resuspended in 30 μl of Tris (10 mM) and EDTA (1 mM) ( resuspend).
[0051]
Using this as a template, cap (CAP) PCR primer: 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and partial sequence ESP-1 (68) of the sequence obtained in Example 6: 5′-CCAAACTGGGACCATCCACC- PCR (First PCR) was carried out using 3 ′ (SEQ ID NO: 8) for 35 cycles, and after purification, the CAP PCR primer and partial sequence ESP-1 (49): 5 obtained in Example 6 were further used. PCR (Second PCR) was performed 20 cycles using '-CGGAGGGATCACTAAGGTCAC-3' (SEQ ID NO: 9).
The product was subjected to agarose electrophoresis and treated with ethidium bromide solution to obtain a band of about 300 bp. The obtained band was cut out, and the recovered cDNA was subcloned into T vector by the same operation as in Example 5, and transformed into XL-2Blue. The mixture was shaken overnight at 37 ° C in an LB culture solution (Difco) containing ampicillin. Plasmids were extracted using a Wizard miniprep kit (Promega). The plasmid was cleaved using EcoRI restriction enzyme (New England Biolab), subjected to agarose electrophoresis, and treated with ethidium bromide solution to confirm a 300 bp insert. When the obtained 5 clones were sequenced by the same method as in Example 6, the two clones matched part of the sequence obtained in Example 6.
[0052]
Example 8: Identification of the 3 'end
Using the cDNA obtained in Example 7 as a template, in the same manner as in Example 7 (modified 3′RACE), NotI (dT) primer: 5′-CTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 10) and in Example 6 Partial sequence ESP-1 (424): 5'-GAGACATGGGTTTGTGCTGGC-3 '(SEQ ID NO: 11) of the obtained sequence was subjected to PCR (First PCR) for 35 cycles, and after purification, the above NotI (dT) primer And PCR (Second PCR) was performed 20 cycles using the partial sequence ESP-1 (456): 5'-CGGGAAGGATGCCTGCTTCG-3 '(SEQ ID NO: 12) of the sequence obtained in Example 6. The product was subjected to agarose electrophoresis and treated with ethidium bromide solution to obtain a band of about 400 bp. The obtained band was cut out, and the recovered cDNA was subcloned into T vector by the same operation as in Example 5, and transformed into XL-2Blue. The mixture was shaken overnight at 37 ° C. in an LB medium containing ampicillin. Plasmids were extracted using a Wizard miniprep kit (Promega). The plasmid was cleaved with EcoRI restriction enzyme, subjected to agarose electrophoresis and treated with ethidium bromide solution, and an insert of about 400 bp was confirmed. The obtained two clones were sequenced by the same method as in Example 6. As a result, the two clones matched part of the sequence obtained in Example 6.
[0053]
Example 9: Confirmation of full length
Partial sequence ESP-1 (-9): 5'-GAGGAGGCCATGGGCGCGC-3 '(SEQ ID NO: 13) and partial sequence ESP-1 (1058): 5'-CCTGCAAGGCCATCAACTGGAATTGTG- of the sequences obtained from Examples 6, 7 and 8 The same operation as in Example 7 was performed using 3 ′ (SEQ ID NO: 14) as a primer and the cDNA obtained in Example 2 as a template, and a sequence having a total length of 1058 bp was obtained in 3 of 8 clones. With reference to the sequence of 4 clones including 1 clone having a deletion, the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
The amino acid sequence deduced from this nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1, the sequence of the translation part is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid and nucleic acid are shown together in SEQ ID NO: 4.
[0054]
The deduced amino acid sequence of the present invention is a signal peptide (Met ^-26 ~ Ala ^-1 ) And a serine protease profile (active center, His) ⁵⁶ , Asp ¹¹¹ , Ser ²¹³ ) And 18 hydrophobic regions (Trp) at the C-terminus ²⁷² ~ Val ²⁸⁹ ). On the other hand, Ala ²⁶¹ ~ Ser ²⁶³ Or Gly ²⁶⁴ ~ Ser ²⁶⁶ Has ω, ω1, and ω2 sites for the GPI anchor card membrane protein, and has both characteristics as a membrane protein and a secretory protein. By comparison with known sequences, the serine protease is thought to be produced in the form of a proform (Ala ¹ ~ Val ²⁸⁹ ), Ile is a mature protein ¹⁶ It is thought that it is from.
[0055]
Example 10: Confirmation that the sequence of the present invention is not expressed in neutrophils
By the same operation as in Example 1, the neutrophil fraction obtained by performing positive selection with an anti-CD16 antibody was subjected to the same operation as in Example 2 to obtain cDNA, and this was used as a PCR primer. PCR was performed using the partial sequence ESP-1 (68) used in Example 7 and the partial sequence ESP-1 (-9) used in Example 9, and the same operation as in Example 6 was performed. A 300 bp band was not obtained, and it was confirmed that neutrophils did not express RNA encoding the amino acid sequence of the present invention.
[0056]
[Sequence Listing]
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 315
Sequence type: amino acid
Topology: Linear
Sequence type: Protein
Array
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala
-26 -25 -20 -15
Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro
-10 -5 1 5
Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala
10 15 20
Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser
25 30 35
His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala
40 45 50
Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp
55 60 65 70
Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu
75 80 85
Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro
90 95 100
Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser
105 110 115
Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln
120 125 130
Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly
135 140 145 150
Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu
155 160 165
Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu
170 175 180
Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys
185 190 195
Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly
200 205 210
Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val
215 220 225 230
Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr
235 240 245
Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln
250 255 260
Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro
265 270 275
Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val
280 285
[0057]
SEQ ID NO: 2
Sequence length: 945
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
Array
ATGGGCGCGC GCGGGGCGCT GCTGCTGGCG CTGCTGCTGG CTCGGGCTGG ACTCAGGAAG 60
CCGGAGTCGC AGGAGGCGGC GCCGTTATCA GGACCATGCG GCCGACGGGT CATCACGTCG 120
CGCATCGTGG GTGGAGAGGA CGCCGAACTC GGGCGTTGGC CGTGGCAGGG GAGCCTGCGC 180
CTGTGGGATT CCCACGTATG CGGAGTGAGC CTGCTCAGCC ACCGCTGGGC ACTCACGGCG 240
GCGCACTGCT TTGAAACCTA TAGTGACCTT AGTGATCCCT CCGGGTGGAT GGTCCAGTTT 300
GGCCAGCTGA CTTCCATGCC ATCCTTCTGG AGCCTGCAGG CCTACTACAC CCGTTACTTC 360
GTATCGAATA TCTATCTGAG CCCTCGCTAC CTGGGGAATT CACCCTATGA CATTGCCTTG 420
GTGAAGCTGT CTGCACCTGT CACCTACACT ACTAAACACA TCCAGCCCAT CTGTCTCCAG 480
GCCTCCACAT TTGAGTTTGA GAACCGGACA GACTGCTGGG TGACTGGCTG GGGGTACATC 540
AAAGAGGATG AGGCACTGCC ATCTCCCCAC ACCCTCCAGG AAGTTCAGGT CGCCATCATA 600
AACAACTCTA TGTGCAACCA CCTCTTCCTC AAGTACAGTT TCCGCAAGGA CATCTTTGGA 660
GACATGGTTT GTGCTGGCAA TGCCCAAGGC GGGAAGGATG CCTGCTTCGG TGACTCAGGT 720
GGACCCTTGG CCTGTAACAA GAATGGACTG TGGTATCAGA TTGGAGTCGT GAGCTGGGGA 780
GTGGGCTGTG GTCGGCCCAA TCGGCCCGGT GTCTACACCA ATATCAGCCA CCACTTTGAG 840
TGGATCCAGA AGCTGATGGC CCAGAGTGGC ATGTCCCAGC CAGACCCCTC CTGGCCACTA 900
CTCTTTTTCC CTCTTCTCTG GGCTCTCCCA CTCCTGGGGC CGGTC 945
[0058]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 1085
Sequence type: Nucleic acid
Number of chains: single chain
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
Array
GAGGAGGCCA TGGGCGCGCG CGGGGCGCTG CTGCTGGCGC TGCTGCTGGC TCGGGCTGGA 60
CTCAGGAAGC CGGAGTCGCA GGAGGCGGCG CCGTTATCAG GACCATGCGG CCGACGGGTC 120
ATCACGTCGC GCATCGTGGG TGGAGAGGAC GCCGAACTCG GGCGTTGGCC GTGGCAGGGG 180
AGCCTGCGCC TGTGGGATTC CCACGTATGC GGAGTGAGCC TGCTCAGCCA CCGCTGGGCA 240
CTCACGGCGG CGCACTGCTT TGAAACCTAT AGTGACCTTA GTGATCCCTC CGGGTGGATG 300
GTCCAGTTTG GCCAGCTGAC TTCCATGCCA TCCTTCTGGA GCCTGCAGGC CTACTACACC 360
CGTTACTTCG TATCGAATAT CTATCTGAGC CCTCGCTACC TGGGGAATTC ACCCTATGAC 420
ATTGCCTTGG TGAAGCTGTC TGCACCTGTC ACCTACACTA CTAAACACAT CCAGCCCATC 480
TGTCTCCAGG CCTCCACATT TGAGTTTGAG AACCGGACAG ACTGCTGGGT GACTGGCTGG 540
GGGTACATCA AAGAGGATGA GGCACTGCCA TCTCCCCACA CCCTCCAGGA AGTTCAGGTC 600
GCCATCATAA ACAACTCTAT GTGCAACCAC CTCTTCCTCA AGTACAGTTT CCGCAAGGAC 660
ATCTTTGGAG ACATGGTTTG TGCTGGCAAT GCCCAAGGCG GGAAGGATGC CTGCTTCGGT 720
GACTCAGGTG GACCCTTGGC CTGTAACAAG AATGGACTGT GGTATCAGAT TGGAGTCGTG 780
AGCTGGGGAG TGGGCTGTGG TCGGCCCAAT CGGCCCGGTG TCTACACCAA TATCAGCCAC 840
CACTTTGAGT GGATCCAGAA GCTGATGGCC CAGAGTGGCA TGTCCCAGCC AGACCCCTCC 900
TGGCCACTAC TCTTTTTCCC TCTTCTCTGG GCTCTCCCAC TCCTGGGGCC GGTCTGAGCC 960
TACCTGAGCC CATGCAGCCT GGGGCCACTG CCAAGTCAGG CCCTGGTTCT CTTCTGTCTT 1020
GTTTGGTAAT AAACACATTC CAGTTGATGC CTTGCAGGGC ATTCTTCAAA AAAAAAAAAA 1080
AAAAA 1085
[0059]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 1085
Topology: Linear
Sequence type: cDNA to mRNA
origin
Name of organism: Homo Sapiens
Cell: Eosinophil
Sequence features
Characteristic symbol: CDS
Location: 10..954
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: sig peptide
Location: 10..87
Method for determining characteristics: S
Symbol representing the feature: proform peptide
Location: 88..954
Method for determining characteristics: S
Symbol representing the feature: mat. Peptide
Location: 133..954
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: active center (His)
Location: 253..255
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: active center (Asp)
Location: 418..420
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: active center (Ser)
Location: 724..726
Method for determining characteristics: S
Symbols representing features: ω, ω1, ω2 sites
Location: 868..876
Method for determining characteristics: S
Symbols representing features: ω, ω1, ω2 sites
Location: 877..885
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: hydrophilic region
Location: 883..900
Method for determining characteristics: S
Characteristic symbol: hydrophobic region
Location: 901..954
Method for determining characteristics: S
Array
GAGGAGGCC ATG GGC GCG CGC GGG GCG CTG CTG CTG GCG CTG CTG CTG 48
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
-26 -25 -20 -15
GCT CGG GCT GGA CTC AGG AAG CCG GAG TCG CAG GAG GCG GCG CCG TTA 96
Ala Arg Ala Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu
-10 -5 1
TCA GGA CCA TGC GGC CGA CGG GTC ATC ACG TCG CGC ATC GTG GGT GGA 144
Ser Gly Pro Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly
5 10 15
GAG GAC GCC GAA CTC GGG CGT TGG CCG TGG CAG GGG AGC CTG CGC CTG 192
Glu Asp Ala Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu
20 25 30 35
TGG GAT TCC CAC GTA TGC GGA GTG AGC CTG CTC AGC CAC CGC TGG GCA 240
Trp Asp Ser His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala
40 45 50
CTC ACG GCG GCG CAC TGC TTT GAA ACC TAT AGT GAC CTT AGT GAT CCC 288
Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro
55 60 65
TCC GGG TGG ATG GTC CAG TTT GGC CAG CTG ACT TCC ATG CCA TCC TTC 336
Ser Gly Trp Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe
70 75 80
TGG AGC CTG CAG GCC TAC TAC ACC CGT TAC TTC GTA TCG AAT ATC TAT 384
Trp Ser Leu Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr
85 90 95
CTG AGC CCT CGC TAC CTG GGG AAT TCA CCC TAT GAC ATT GCC TTG GTG 432
Leu Ser Pro Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val
100 105 110 115
AAG CTG TCT GCA CCT GTC ACC TAC ACT ACT AAA CAC ATC CAG CCC ATC 480
Lys Leu Ser Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile
120 125 130
TGT CTC CAG GCC TCC ACA TTT GAG TTT GAG AAC CGG ACA GAC TGC TGG 528
Cys Leu Gln Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp
135 140 145
GTG ACT GGC TGG GGG TAC ATC AAA GAG GAT GAG GCA CTG CCA TCT CCC 576
Val Thr Gly Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro
150 155 160
CAC ACC CTC CAG GAA GTT CAG GTC GCC ATC ATA AAC AAC TCT ATG TGC 624
His Thr Leu Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys
165 170 175
AAC CAC CTC TTC CTC AAG TAC AGT TTC CGC AAG GAC ATC TTT GGA GAC 672
Asn His Leu Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp
180 185 190 195
ATG GTT TGT GCT GGC AAT GCC CAA GGC GGG AAG GAT GCC TGC TTC GGT 720
Met Val Cys Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly
200 205 210
GAC TCA GGT GGA CCC TTG GCC TGT AAC AAG AAT GGA CTG TGG TAT CAG 768
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln
215 220 225
ATT GGA GTC GTG AGC TGG GGA GTG GGC TGT GGT CGG CCC AAT CGG CCC 816
Ile Gly Val Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro
230 235 240
GGT GTC TAC ACC AAT ATC AGC CAC CAC TTT GAG TGG ATC CAG AAG CTG 864
Gly Val Tyr Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu
245 250 255
ATG GCC CAG AGT GGC ATG TCC CAG CCA GAC CCC TCC TGG CCA CTA CTC 912
Met Ala Gln Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu
260 265 270 275
TTT TTC CCT CTT CTC TGG GCT CTC CCA CTC CTG GGG CCG GTC 954
Phe Phe Pro Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val
280 285
TGAGCCTACC TGAGCCCATG CAGCCTGGGG CCACTGCCAA GTCAGGCCCT GGTTCTCTTC 1014
TGTCTTGTTT GGTAATAAAC ACATTCCAGT TGATGCCTTG CAGGGCATTC TTCAAAAAAA 1074
AAAAAAAAAA A 1085
[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

Claims

A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

The polypeptide according to claim 1, wherein a part thereof is deleted.

The polypeptide according to claim 2, wherein a part thereof is one amino acid.

A cDNA encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 3.

The cDNA according to claim 4, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

The cDNA according to claim 4, comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.

A replication or expression vector in which the cDNA according to any one of claims 4 to 6 is incorporated.

A host cell transformed with the replication or expression vector of claim 7.

The method according to any one of claims 1 to 3, comprising culturing the host cell according to claim 8 under conditions for expressing the polypeptide according to any one of claims 1 to 3. A method for producing a polypeptide.

A monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide according to any one of claims 1 to 3.

A method for screening a serine protease inhibitor, wherein the polypeptide according to any one of claims 1 to 3 is used.