JP3795972B2 - Thermostable D-amino acid oxidase, process for producing the same, and microorganism - Google Patents

Description

【００１２】
【表２】

【００１３】
本発明の第２の要旨は、フザリウム イクイセチ (Fusarium equiseti)に属し、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に第１の要旨に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの製造法に存する。
【００１４】
本発明の第３の要旨は、フザリウム イクイセチ（Fusarium equiseti)に属し、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能を有する微生物に存する。
本発明の第４の要旨は、第３の要旨に記載の微生物であって、フザリウム・エスピー (Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株 ( ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９９）又はその変異株である微生物に存する。
【００１５】
本発明の第５の要旨は、酸素の存在下、第１の要旨に記載の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを触媒としてＤ−アミノ酸の酸化反応を行う工程を含むＤ−アミノ酸の測定方法に存する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本発明の耐熱性Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ(以下Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ又は本酵素と略称する）の製造法について説明する。本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する微生物としては、フザリウム イクイセチ (Fusarium equiseti)に属する、例えば、フザリウム・エスピー (Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９９）が挙げられる。
【００１７】
上記の菌株（以下、本菌株と略称する）は、本発明者らによって土壌中より分離され、その菌学的性質は、下記の通りである。
【００１８】
１．形態的性質：
ポテト・デキストロース寒天培地上で生育した本菌株の光学顕微鏡下での形態的特徴を以下に記述する。菌糸は、幅１〜７μｍ、無色で、表面は滑面ときにやや粗面、隔壁を有する。分生子座は、よく発達し、桃色〜黄褐色の分生子塊を形成する。分生子柄は、無色で、隔壁を有し、菌糸から単生または２〜４回分枝を繰り返し、最後の分枝上にフィアリドを着生する。細胞の大きさは、８〜１４×２〜４μｍであり、フィアリドはこん棒形、単生または輪生（２〜５本）である。大きさは、４〜１７×２〜４μｍであり、分生子はフィアロ型で、大型分生子のみで小型分生子はみられない。
【００１９】
形は、鎌形、三日月形、船形、紡錘形で、３〜５（まれに７）隔壁を有する。先端細胞は、細く尖り、やや湾曲する。基部は、明瞭な柄足細胞となる。大きさは、３３〜６０×３〜５μｍであり、色は無色、表面は滑面である。分生子は、フィアリド先端に粘塊状に集まる。厚膜胞子は、菌糸上に頂生または菌糸間に形成され、数個が塊状に集まるか鎖状に連なることもある。形は、球形、楕円形で単細胞である。大きさは、８〜１３（まれに１５）μｍであり、色は無色のちに褐色を帯びる。表面は粗面となる。
【００２０】
２．各培地での生育：
各種培地上で、２５℃で３日間培養したときの成育状態を表３及び表４に示す。本菌株は、ポテト・デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培地上における生育は良好で、綿毛状の集落となり、分生子座が散在し、分生子形成は良好である。集落の色は、変化に富み、培養初期の表面は、白色、淡褐色、黄白色、桃色である。裏面は、白色、クリーム色、淡褐色を呈し、後期になると、表面は、黄色、黄褐色、褐色、橙色を帯びるが、赤色系にはならない。三浦寒天培地上での生育は、普通で、気生菌糸が薄く広がり、平坦な集落となり、分生子形成は普通である。
【００２１】
【表３】

【００２２】
【表４】

【００２３】
３．生理的性質：
本菌株は、好気性で、麦芽エキス寒天培地における生育ｐＨ範囲は３〜１３と広く、至適ｐＨは１０付近である。また、ポテト・デキストロース寒天培地における生育至適温度は、３２℃付近であり、３７℃では生育しない。
【００２４】
以上の菌学的および生理学的性質より、本菌株は、ホークスワース (D.L.Hawksworth) 、サットン (B.C.Sutton) 、エーンズワース (G.C.Ainsworth)編、「エーンズワース・アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ザ・ファンジャイ 第７版 (Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 7th ed. (1983))」に従い、真菌門、不完全菌亜門、不完全糸状菌綱、フザリウム (Fusarium) 属のイクイセチ（equiseti) 種の菌に分類されることが明らかになった。
【００２５】
本菌株は、フザリウム・エスピーＩＫＤ−１２３８Ｂ株 (Fusarium sp. IKD-1238B) と命名された。当該菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９９として寄託されている。本発明においては、上記菌株の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線などの放射線または化学的変異剤（ＮＴＧ）などの処理によって得られる。
【００２６】
本発明の菌培養には、通常のカビ用培地が使用でき、炭素源、窒素源、無機物その他使用菌が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。炭素源としては、グルコース、シュークロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜などが使用できる。
【００２７】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、又は、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスチープリッカー等の窒素含有天然物が利用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
【００２８】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養で行う。培養温度は、通常１０〜３５℃、好ましくは２０〜３２℃の範囲であり、培地のｐＨは、通常３〜１３、好ましくは５〜１１の範囲である。培養期間は、通常１〜７日間、好ましくは２〜４日である。斯かる方法で培養することにより、培養物中、特に菌体内にＤ−アミノ酸オキシダーゼを生成蓄積することが出来る。
【００２９】
培養物中からＤ−アミノ酸オキシダーゼを得る方法は、蛋白質における通常の精製方法が利用できる。すなわち、菌を培養後、培養液をろ過して菌体を得、次いで、適当な方法で菌体を破砕し、破砕液から遠心分離などによって上清液を得る。この上清液中に含まれるＤ−アミノ酸オキシダーゼは、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、電気泳動などの適当な精製操作を組み合わせることによって精製できる。
【００３０】
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性は、次の２つの方法で測定できる。
(1) 過酸化水素の比色検出法（活性測定法１）
１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬ、２５ｍＭの４−アミノアンチピリン０．１ｍＬ、４２０ｍＭフェノール溶液０．１ｍＬ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ西洋わさびペルオキシダーゼ０．１ｍＬ、１００ｍＭのＤ−アラニン１ｍＬ及び水０．６５ｍＬを３ｍＬ石英セルに添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを加えて攪拌し、５００ｎｍにおける５分間の吸光度変化（ΔＡＢＳ／分) を測定する。酵素活性は次の式により算出する。なお、式中のｎは希釈倍率である。
【００３１】
【数１】

【００３２】
(2) ２−オキソ酸のＤＮＰ検出法（活性測定法２）
１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬ、１００ｍＭの Ｄ−アラニン１ｍＬ及び水０．９５ｍＬを試験管に添加し、３７℃の恒温槽で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを加えて攪拌し、１０分間反応させる。反応後、３０％トリクロロ酢酸１ｍＬを加えて反応を停止する。反応液２ｍＬを別の試験管に取り、０．０５％２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）の２Ｍ塩酸溶液２ｍＬを加えてよく攪拌し、室温下に５分間放置後、トルエン６ｍＬを加えて強く攪拌する。
【００３３】
さらに、上層（トルエン層）５ｍＬを別の試験管に移し、これに１０％炭酸ナトリウム溶液５ｍＬを加えて強く攪拌し、ＤＮＰ反応物を水層に抽出する。下層（水層）３ｍＬを別の試験管に取り、これに４Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬを加えてよく攪拌後、４７０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性は、あらかじめピルビン酸カリウム（ｍＭ単位）で作成した検量線の値（ＰｍＭ）から、次の式により算出する。なお、式中のｎは希釈倍率である。
【００３４】
【数２】

【００３５】
次に、本発明の第１の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼ( 実施例１で得られる酵素）について説明する。
(1) 作用：
酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素で、国際生化学連合（ＩＵＢ）の分類ではＥＣ１．４．３．３に分類される。一例として、Ｄ−アラニンが基質の場合の反応式を次に示す。
【００３６】
【化１】
Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂ Ｏ → ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＮＨ₃
【００３７】
(2) 基質特異性、基質親和性および最大反応速度：
活性測定法１でＤ−アラニン及び他の各種アミノ酸（いずれも終濃度３３mM）を使用した場合の相対反応性（基質特異性）は、表５及び表６のようであった。Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−チロシンに強く、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−リジン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギンには弱く作用した。
【００３８】
また、Ｄ−システイン、Ｄ−シスチン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−アミノ酸（２１種）には、ほとんど作用しなかった。更に、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリンについての基質親和性（Ｋｍ）及び最大反応速度（Ｖｍａｘ）は、表５及び表６のようであった。
【００３９】
【表５】

【００４０】
【表６】

【００４１】
（３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：
活性測定法２の緩衝液を、図１に示した各種ｐＨを有する酢酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）、リン酸カリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ユニバーサル緩衝液（各緩衝液とも３３mM）に代え、精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図１に示す。図１から、本酵素の至適ｐＨの幅は広く、ｐＨ６〜１１の範囲にあることがわかる。
【００４２】
精製酵素を、図２に示した各種のｐＨを有する酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、ユニバーサル緩衝液中（各緩衝液とも５０mM）に溶解し、３０℃で３０分間保持後、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を図２に示す。図２から、本酵素の安定ｐＨ範囲は、６〜１０．７であることがわかる。
【００４３】
(4) 至適温度および熱安定性：
活性測定法２で反応温度を変えて精製酵素の酵素活性を測定した。結果を図３に示す。３図から、本酵素の至適温度は、４０℃付近であることがわかる。精製酵素を５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、各温度で１５分間保持後、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を図４に示す。４図から、本酵素は、５０℃まで安定であることがわかる。
【００４４】
(5) 阻害剤：
活性測定法２の系に、１ｍＭ濃度になるように各種添加物を添加し、精製酵素の酵素活性を測定した。無添加物のコントロ−ルに対し、添加物により表７及び表８のような阻害効果および増強効果が認められた。本酵素は、硝酸銀、塩化第二水銀、塩化カドミウム、塩化第一鉛、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、アミノグアニジンで強く阻害されることがわかる。
【００４５】
【表７】

【００４６】
【表８】

【００４７】
(6) 分子量：
本酵素の分子量は、ゲル濾過法で測定した結果、約１６６，０００であった。また、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定値は、約４１，２００の単一バンドを示した。従って、本酵素の分子量は、約４１，２００のサブユニットの４量体からなるものと考えられる。
【００４８】
(7) 等電点：
等電点電気泳動法で測定した本酵素の等電点（ｐＩ）は、約４．８であった。
【００４９】
次に、本発明の第１の要旨に係るＤ−アミノ酸オキシダーゼ（実施例１で得られる酵素）の安定性について、これまで広くＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を介する測定法に使用されてきたブタ腎由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグマ社製、Type II）と比較しながら説明する。
【００５０】
(8) 溶液保存安定性：
それぞれの酵素を、０．６〜０．８Ｕ／mLとなるように５０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解して冷蔵庫（４℃）に保存し、０〜８１日目に、活性測定法１を使用して残存酵素活性を測定した。結果を表９及び表１０に示す。表９及び表１０から、ブタ腎由来の酵素と比較して本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、極めて安定であることがわかる。
【００５１】
【表９】

【００５２】
【表１０】

【００５３】
次に、本発明によって得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼの用途について説明する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下にＤ−アミノ酸の酸化反応を触媒し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素であるから、この反応による変化が利用できるものであれば、用途は、特に制限されない。
【００５４】
直接反応生成物を利用するものとしては、２−オキソ酸の製造法および前駆原料のＤ−アミノ酸側鎖を酸化し、抗生物質の原料などを製造する方法、例えば、セファロスポリンＣから７−アミノセファロスポラン酸の製造が挙げられる。また、間接的に利用するものとしては、ＤＬ−アミノ酸からＤ−体だけを酸化し、Ｌ−アミノ酸を製造する方法および反応生成物の量的変化を直接または間接的にシグナルとして検出する基質のＤ−アミノ酸、抗生物質などの測定法が挙げられる。
【００５５】
また、Ｄ−アミノ酸の生成を伴う別な酵素反応系の後にＤ−アミノ酸測定法を結合した、末端にＤ−アミノ酸を有する前駆基質、例えば、ペプチド等の測定法、逆に、Ｄ−アミノ酸を有する合成ペプチドを基質として添加するエクソプロテアーゼ、ぺプチターゼ等の酵素活性の測定法、例えば、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定などが挙げられる。
【００５６】
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、従来の酵素より安定性に優れ、従来使用が制限されていた領域にも応用可能になることは、言うまでもない。基質を測定する方法の一例として、Ｄ−アラニンの定量法を使用して詳しく説明する。Ｄ−アラニンが基質の場合、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが触媒する反応の式を以下に示す。
【００５７】
【化２】
Ｄ−アラニン＋Ｏ₂ ＋Ｈ₂ Ｏ → ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＮＨ₃
【００５８】
上記の反応式から明らかな様に、反応生成物のピルビン酸、過酸化水素、アンモニアのいずれを検出してもＤ−アラニンを定量することが出来る。具体的には、反応生成物のピルビン酸を検出する場合、通常の生化学検査で使用されている乳酸脱水素酵素を利用するピルビン酸の測定方法、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの酵素活性測定で前記した「２−オキソ酸のＤＮＰ検出法」などが利用できる。
【００５９】
反応生成物の過酸化水素を検出する場合、過酸化水素の検出法として公知の方法が利用でき、例えば、前記の「過酸化水素の比色検出法」を例示することが出来る。反応生成物のアンモニアを検出する場合、通常のアンモニア測定法が利用でき、例えば、グルタミン酸脱水素酵素を使用するアンモニアの測定系がある。
【００６０】
また、これらの測定法は、反応速度上から、レート法またはエンドポイント法の２つに分類されているが、いずれであってもよく、測定系、反応時間、基質のＤ−アラニンの濃度、検体の種類などの条件により、適宜選択される。
【００６１】
基質Ｄ−アミノ酸を測定する場合、基質を含有する試料およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを、約ｐＨ６〜１１の緩衝液に加えて反応させればよい。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、溶液状態の他、必要に応じて凍乾品、マイクロカプセル化または担体に固定し、不溶化して使用することも出来る。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液などが使用される。酵素は、通常１〜５００μM 濃度の基質に対し、０．５〜５０Ｕ／mLの濃度で使用される。
【００６２】
生成した過酸化水素の検出には、比色法、蛍光法、化学発光法、電極法などのいずれも使用できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色させ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、o −フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、４−アミノアンチピリンとフェノール、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル〕アミン等が利用できる。
【００６３】
蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成させ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用できる。
【００６４】
化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒により、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質としては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸エステル類の化合物などが利用できる。
【００６５】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びＤ−アミノ酸の検出に必要な前記の試薬成分を含む試薬を調製し、Ｄ−アミノ酸の測定キットとして診断薬に組み立てることが出来る。
【００６６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
実施例１（フザリウム属の菌によるＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造）
ポリペプトン（和光純薬）１．７％、ソイトン（Ｄｉｆｃｏ）０．３％、グルコース（和光純薬）２．５％、塩化ナトリウム（ナカライテスク）０．５％、リン酸水素二カリウム（ナカライテスク）０．２５％、リン酸二水素カリウム（ナカライテスク）１．０％、ＤＬ−アラニン（ナカライテスク）１．０％、アデカノール（旭電化）ＬＧ １２６を０．１％及びクロラムフェニコール（和光純薬）０．０１％を含む培地（ｐＨ５）を、２００ｍＬ容の培養フラスコ２本に各６０ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分間殺菌して冷却した。
【００６８】
各培養フラスコにフザリウム・エスピー (Fusarium sp.) ＩＫＤ−１２３８Ｂ株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１５３９９）を一白金耳接種し、２７℃で２日間振とう培養して種培養液とした。前記と同じ組成の培地１．５Ｌを入れた２Ｌ容のジャーファーメンター１１本を、１２１℃で２０分間殺菌冷却後、前記の種培養液を各１５ｍＬずつ接種し、２２℃で６０時間、１．２Ｖ／Ｖ／ｍの通気量および３００ｒｐｍの攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液をろ過して湿菌体６５８ｇを得た。
【００６９】
得られた菌体を、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸及び０．２ｍＭの４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩を含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、冷却下に破砕装置ダイノミルを使用して菌体を破砕した。得られた破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、粗酵素液５５５０ｍＬを得た。この粗酵素液を５０℃の湯浴上で３０分間処理し、続いて氷浴上で２０℃まで冷却した。
【００７０】
冷却した粗酵素液に終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようにストレプトマイシン硫酸塩を添加し、氷浴上に２時間置いた後、遠心分離して上清液５２９０ｍＬを得た。この上清液に硫安を４０％飽和になるように加え、一昼夜放置後、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上清液に９０％飽和となるように硫安を追加し、再度一昼夜放置し、遠心分離により析出した沈殿物を得た。
【００７１】
得られた沈殿物を、１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍＬに溶解後、透析膜を使用して同組成の緩衝液にて脱塩した。脱塩液を、あらかじめ１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径４．７ｃｍ×長さ７．８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液で洗浄した。
【００７２】
次いで、１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）から０．４ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭジチオスレイトールを含有する１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への直線グラジエントにて溶出し、酵素の活性画分を集めた。この活性画分を透析膜を使用して１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて脱塩した。
【００７３】
この脱塩液を、あらかじめ１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００ｍカラム（直径４．７ｃｍ×長さ７．８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同組成の緩衝液で洗浄後、０．１ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭジチオスレイトール含有２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、酵素の活性画分を集めた。
【００７４】
この活性画分を透析膜を使用して０．１ｍＭジチオスレイトール含有５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて脱塩した。この脱塩液に硫安を加えて１０％飽和となるように調製後、あらかじめ１０％飽和硫安および０．１ｍＭジチオスレイトールを含有する５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍカラム（直径２．１ｃｍ×長さ３．２ｃｍ）に素通し、酵素の活性画分を集めた。
【００７５】
次に、この活性画分を限外ろ過膜（アミコン社製、セントリプラス−１０：分画分子量１万）で濃縮後、高速液体クロマトグラフィーのカラムＴＳＫ−ＧＥＬＧ３０００ＳＷ（東ソー社製；直径２．１５ｃｍ×長さ６０ｃｍ）に、移動相０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、流速３．０ｍＬ／分の条件で注入し、活性画分を分取した。分取した酵素は、ＳＤＳ電気泳動で単一のバンドを示した。各精製工程の収率および比活性の関係を表１1 に示す。
【００７６】
【表１１】

【００７７】
実施例２（Ｄ−アラニン定量法への応用）
０．３８５ｍｇ／ｍＬの４−アミノアンチピリン、１１．７ｍｇ／ｍＬのＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、７．６９Ｕ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼを含む７６．９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（第１試薬）１３０μＬに、Ｄ−アラニン溶液１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートして恒温化した。次に、０．２Ｕ／ｍＬの実施例１で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む５０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）（第２試薬）２０μＬを加えて３７℃で５分間インキュベートして発色させ、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍにおける吸光度増加速度を測定した。検量線の測定結果を図５に示した。検量線は、５から５０ｍｇ／Ｌまで直線となり、Ｄ−アラニンの測定が可能であった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により臨床診断薬として極めて有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びその工業的生産に適した製造法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨを示す図
【図２】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼのｐＨ安定性を示す図
【図３】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの至適温度を示す図
【図４】本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼの温度安定性を示す図
【図５】Ｄ−アラニン測定の検量線を示す図[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to D-amino acid oxidase, a method for producing the same, and a microorganism, and particularly relates to a thermostable D-amino acid oxidase useful for a diagnostic agent, a method for producing the same, and a microorganism belonging to Fusarium equiseti.
[0002]
[Prior art]
D-amino acid oxidase is an enzyme that oxidizes D-amino acid in the presence of oxygen to produce hydrogen peroxide, 2-oxoacid, and ammonia. EC1.4.3.3 is classified according to the International Biochemical Union (IUB) classification. are categorized. In addition, this enzyme is known to be widely present in mammalian organs and microorganisms (Enzyme Handbook: supervised by Fumio Maruo, Nobuo Tamiya, Asakura Shoten).
[0003]
Examples of microorganisms that produce D-amino acid oxidase include Aspergillus ustus (Japanese Patent Publication No. 55-35119 and Japanese Patent Publication No. 59-15635), Cephalosporium Potronii (Japanese Patent Publication No. 57-30479), Trigonopsis barrier bilis (Japanese Examined Patent Publication Nos. 59-15635, 62-501679, 54-32694, 56-30988, 62-262994, 63-71180) And Gliocladium (Japanese Examined Patent Publication No. 60-57837).
[0004]
Further, microorganisms that produce D-amino acid oxidase include Candida (Japanese Patent Laid-Open No. 55-23966), Pseudomonas (Japanese Patent Laid-Open No. 63-63377), Fusarium Solani (Japanese Patent Laid-Open No. 2-200181). No.), Rhodotorula glutinis (JP-A-5-21890, EP517200 publication), incomplete filamentous fungus Curvularia genus, Robillarda genus, Myrothecium striatisporum genus ( There is a report such as JP-A-7-274957.
[0005]
These enzymes are used in the production of antibiotic precursors (Japanese Patent Publication No. 55-35119, Japanese Patent Publication No. 57-18879, Japanese Patent Publication No. 57-30479, Japanese Patent Publication No. 59-15635, Japanese Patent Publication No. 60-57837). Gazette, Japanese Patent Publication No. 62-501777, Japanese Patent Publication No. 01-23473, Japanese Patent Publication No. 51-112594, Japanese Patent Publication No. 52-11890, Japanese Patent Publication No. 52-38092, Japanese Patent Publication No. 54-. No. 32694, JP-A-55-23966, JP-A-56-30988, JP-A-62-262994, JP-A-63-71180, JP-A-63-74488, Published by Kaihei 2-200181, JP-A-4-229190, JP-A-4-504362, JP-A-5-21890, and EP465600 Distribution, EP474211 Patent Publication, are utilized in EP517200 Publication No.).
[0006]
Further, these enzymes can be used to produce L-amino acids from DL-amino acids (Japanese Patent Laid-Open Nos. 43-65484, 48-72314, 48-72391, and 63-63). No. 63377), leucine aminopeptidase activity measurement method (Japanese Patent Publication No. 59-2278, Japanese Patent Laid-Open No. 53-65787), analysis method for antibiotics (EP181102 publication), and the like.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Recently, the measurement of blood D-amino acids has been shown to be an indicator of renal failure (Clinical Science, 73, 105-108 (1987), Journal of Chromatography, 614, 7-17 (1993), Kitasato Medicine, 23, 51-62 (1993)). Nagata et al. Have already used D-amino acid oxidase to enzymatically measure D-amino acids (Analytical Biochemistry, 150, 238-242 (1985), Clinical Science, 73, 105-108 (1987)). Although being studied, since an enzyme extracted from pig kidney was used, there was a problem in ensuring the stability and quantity of the enzyme.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have found bacteria that produce thermostable D-amino acid oxidase, and have reached the present invention. That is, an object of the present invention is to provide a thermostable D-amino acid oxidase useful as a diagnostic agent for renal failure and the like.
[0009]
Another object of the present invention is to provide a method for producing the D-amino acid oxidase. Still another object of the present invention is to provide a microorganism having the ability to produce thermostable D-amino acid oxidase belonging to the genus Fusarium. The gist of each invention is as follows.
[0010]
The first gist of the present invention resides in D-amino acid oxidase having the following physicochemical properties.
[0011]
[Table 1]

[0012]
[Table 2]

[0013]
  The second gist of the present invention belongs to Fusarium equiseti,As described in the first gistA microorganism having the ability to produce thermostable D-amino acid oxidase is cultured in a nutrient medium,As described in the first gistD-amino acid oxidase is produced and accumulated and collected.As described in the first gistIt exists in the manufacturing method of thermostable D-amino acid oxidase.
[0014]
  The third aspect of the present invention belongs to Fusarium equiseti,As described in the first gistIt exists in a microorganism having the ability to produce thermostable D-amino acid oxidase.
  A fourth aspect of the present invention is the microorganism according to the third aspect, wherein Fusarium sp. (Fusarium sp.) IKD-1238B strain ( FERM P-15399) or a mutant thereof.
[0015]
  The fifth gist of the present invention resides in a method for measuring D-amino acid, which comprises the step of oxidizing D-amino acid using the thermostable D-amino acid oxidase described in the first gist as a catalyst in the presence of oxygen.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be described in detail below. First, a method for producing the thermostable D-amino acid oxidase (hereinafter abbreviated as D-amino acid oxidase or the present enzyme) of the present invention will be described. The microorganism having the ability to produce D-amino acid oxidase of the present invention includes, for example, Fusarium sp. IKD-1238B strain (Department of Industrial Technology Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute) belonging to Fusarium equiseti. , FERM P-15399).
[0017]
The above-mentioned strain (hereinafter referred to as the present strain) is isolated from the soil by the present inventors, and its mycological properties are as follows.
[0018]
1. Morphological properties:
The morphological characteristics of the strain grown on potato dextrose agar medium under the light microscope are described below. The mycelium has a width of 1 to 7 μm, is colorless, and has a rough surface and partition walls when the surface is smooth. The conidia are well developed and form a pink to tan conidia mass. The conidial stalk is colorless, has a septum, and grows monophyllically or repeats 2-4 times from the mycelium, and establishes a fiary on the last branch. The cell size is 8 to 14 × 2 to 4 μm, and the fiary is a club-shaped, single or cyclist (2 to 5). The size is 4 to 17 × 2 to 4 μm, the conidia are fiaro type, and the small conidia is not seen only with the large conidia.
[0019]
The shape is a sickle shape, a crescent shape, a ship shape, and a spindle shape, and has 3 to 5 (rarely 7) partition walls. The apical cell is thin and sharp and slightly curved. The base is a clear peduncle cell. The size is 33-60 × 3-5 μm, the color is colorless, and the surface is smooth. Conidia collect in a viscous mass at the tip of the fiary. Thick membrane spores are formed on the mycelium or formed between the mycelia, and several may gather together in a lump or chain. The shape is spherical, oval and single cell. The size is 8 to 13 (rarely 15) μm, and the color is colorless and brownish. The surface is rough.
[0020]
2. Growth in each medium:
Tables 3 and 4 show the growth conditions when cultured at 25 ° C. for 3 days on various media. This strain has good growth on a potato-dextrose agar medium, a malt extract agar medium, and an oatmeal agar medium, becomes a fluffy colony, has scattered conidia, and has good conidia formation. The color of the village is varied, and the surface of the initial culture is white, light brown, yellowish white, pink. The back surface is white, cream, and light brown. In the later stage, the surface is yellow, tan, brown, orange, but not red. Growth on Miura Agar is normal, and aerial hyphae spread thinly and become flat settlements, and conidia formation is normal.
[0021]
[Table 3]

[0022]
[Table 4]

[0023]
3. Physiological properties:
This strain is aerobic, the growth pH range in the malt extract agar medium is as wide as 3 to 13, and the optimum pH is around 10. The optimum temperature for growth on a potato-dextrose agar medium is around 32 ° C., and does not grow at 37 ° C.
[0024]
Due to the above bacteriological and physiological properties, this strain is classified as DLHawksworth, BCSutton, GCAinsworth, "Ainsworth and Bisbees Dictionary of the According to Funjay 7th edition (Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 7th ed. (1983)), fungus phylum, imperfect fungus, imperfect filamentous fungi, equisarti species of the genus Fusarium It was revealed that it was classified into
[0025]
This strain was named Fusarium sp. IKD-1238B (Fusarium sp. IKD-1238B). This strain is deposited under the deposit number FERM P-15399 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. In the present invention, mutant strains of the above strains can also be used. Mutants can be obtained by treatment with radiation such as ultraviolet rays and X-rays or chemical mutation agents (NTG).
[0026]
For the fungus culture of the present invention, a normal mold medium can be used, and any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as it contains moderate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances and other micronutrients required by the bacteria used. It can be used. As the carbon source, glucose, sucrose, dextrin, starch, glycerin, molasses and the like can be used.
[0027]
As a nitrogen source, inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, or amino acids such as DL-alanine and L-glutamic acid, peptone, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, etc. Nitrogen-containing natural products can be used. Examples of inorganic substances that can be used include monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, and ferric chloride.
[0028]
The culture is usually performed by shaking culture or aeration and agitation culture. The culture temperature is usually in the range of 10 to 35 ° C., preferably 20 to 32 ° C., and the pH of the medium is usually in the range of 3 to 13, preferably 5 to 11. The culture period is usually 1 to 7 days, preferably 2 to 4 days. By culturing by such a method, D-amino acid oxidase can be produced and accumulated in the culture, particularly in the microbial cells.
[0029]
As a method for obtaining D-amino acid oxidase from the culture, a normal purification method for proteins can be used. That is, after culturing the bacteria, the culture solution is filtered to obtain microbial cells, and then the microbial cells are crushed by an appropriate method, and a supernatant is obtained from the crushed solution by centrifugation or the like. The D-amino acid oxidase contained in the supernatant can be purified by a combination of appropriate purification operations such as salting out, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic adsorption chromatography, gel filtration, and electrophoresis.
[0030]
The enzyme activity of the D-amino acid oxidase of the present invention can be measured by the following two methods.
(1) Colorimetric detection method for hydrogen peroxide (activity measurement method 1)
1 mL of 100 mM Tris / HCl buffer (pH 8.5), 0.1 mL of 25 mM 4-aminoantipyrine, 0.1 mL of 420 mM phenol solution, 0.1 mL of 100 units / mL horseradish peroxidase, 1 mL of 100 mM D-alanine and water 0. 65 mL is added to a 3 mL quartz cell, set in a spectrophotometer equipped with a thermostat cell holder, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, added with 0.05 mL of the enzyme solution and stirred, and the absorbance change at 500 nm for 5 minutes (ΔABS / min) ) Is measured. The enzyme activity is calculated by the following formula. In addition, n in a formula is a dilution rate.
[0031]
[Expression 1]

[0032]
(2) DNP detection method for 2-oxo acid (activity measurement method 2)
Add 1 mL of 100 mM Tris / HCl buffer (pH 8.5), 1 mL of 100 mM D-alanine and 0.95 mL of water, and incubate in a constant temperature bath at 37 ° C. for 5 minutes, and then add 0.05 mL of the enzyme solution. Stir and react for 10 minutes. After the reaction, 1 mL of 30% trichloroacetic acid is added to stop the reaction. Take 2 mL of the reaction solution in a separate test tube, add 2 mL of 2% hydrochloric acid solution of 0.05% 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNP), stir well, leave it at room temperature for 5 minutes, and then add 6 mL of toluene. Stir vigorously.
[0033]
Further, 5 mL of the upper layer (toluene layer) is transferred to another test tube, and 5 mL of 10% sodium carbonate solution is added thereto and stirred vigorously to extract the DNP reaction product into the aqueous layer. Take 3 mL of the lower layer (aqueous layer) in a separate test tube, add 1 mL of 4M sodium hydroxide solution to this and stir well, and then measure the absorbance at 470 nm. The enzyme activity is calculated by the following formula from the value (PmM) of a calibration curve prepared beforehand with potassium pyruvate (mM units). In addition, n in a formula is a dilution rate.
[0034]
[Expression 2]

[0035]
Next, D-amino acid oxidase (enzyme obtained in Example 1) according to the first aspect of the present invention will be described.
(1) Action:
An enzyme that oxidizes D-amino acids in the presence of oxygen to produce hydrogen peroxide, 2-oxoacids and ammonia, and is classified as EC 1.4.3.3 by the International Biochemical Union (IUB) classification. As an example, the reaction formula when D-alanine is a substrate is shown below.
[0036]
[Chemical 1]
D-alanine + O₂+ H₂O → pyruvic acid + H₂O₂+ NH_Three
[0037]
(2) Substrate specificity, substrate affinity and maximum reaction rate:
Table 5 and Table 6 show the relative reactivity (substrate specificity) when D-alanine and other various amino acids (both of which had a final concentration of 33 mM) were used in activity measurement method 1. D-phenylalanine, D-alanine, D-valine, D-methionine, D-proline, D-leucine, D-isoleucine, D-histidine, D-glutamine, strong against D-tyrosine, D-serine, D-tryptophan, It acted weakly on D-lysine, D-arginine, D-threonine, and D-asparagine.
[0038]
Moreover, it hardly acted on D-cysteine, D-cystine, D-aspartic acid, D-glutamic acid, glycine, and L-amino acids (21 species). Furthermore, the substrate affinity (Km) and the maximum reaction rate (Vmax) for D-phenylalanine, D-alanine, D-methionine, and D-proline were as shown in Tables 5 and 6.
[0039]
[Table 5]

[0040]
[Table 6]

[0041]
(3) Optimal pH and pH stability:
Buffers of activity measurement method 2 are acetate buffers having various pHs shown in FIG. 1, 2-morpholinoethanesulfonic acid buffer (MES), potassium phosphate buffer, Tris / hydrochloric acid buffer, glycine buffer, Instead of universal buffer (each buffer was 33 mM), the enzyme activity of the purified enzyme was measured. The results are shown in FIG. From FIG. 1, it can be seen that the optimum pH range of this enzyme is wide and in the range of pH 6-11.
[0042]
Purified enzyme in acetate buffer, MES buffer, potassium phosphate buffer, Tris / HCl buffer, glycine buffer, universal buffer (each buffer is 50 mM) having various pH values shown in FIG. After dissolving and holding at 30 ° C. for 30 minutes, the residual enzyme activity was measured using activity measurement method 1. The results are shown in FIG. FIG. 2 shows that the stable pH range of the enzyme is 6 to 10.7.
[0043]
(4) Optimal temperature and thermal stability:
In the activity measurement method 2, the reaction temperature was changed and the enzyme activity of the purified enzyme was measured. The results are shown in FIG. FIG. 3 shows that the optimum temperature of this enzyme is around 40 ° C. The purified enzyme was dissolved in 50 mM N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid (TAPS) buffer (pH 8.5), held at each temperature for 15 minutes, and then assayed for activity 1 Residual enzyme activity was measured. The results are shown in FIG. FIG. 4 shows that this enzyme is stable up to 50 ° C.
[0044]
(5) Inhibitor:
Various additives were added to the activity measurement method 2 system to a concentration of 1 mM, and the enzyme activity of the purified enzyme was measured. In contrast to the additive-free control, the inhibitory and enhancing effects as shown in Tables 7 and 8 were observed with the additive. It can be seen that this enzyme is strongly inhibited by silver nitrate, mercuric chloride, cadmium chloride, lead lead, p-chloromercuribenzoic acid, and aminoguanidine.
[0045]
[Table 7]

[0046]
[Table 8]

[0047]
(6) Molecular weight:
The molecular weight of this enzyme was about 166,000 as measured by gel filtration. The measured value by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis showed about 41,200 single bands. Therefore, the molecular weight of this enzyme is considered to consist of tetramers of about 41,200 subunits.
[0048]
(7) Isoelectric point:
The isoelectric point (pI) of this enzyme measured by isoelectric focusing was about 4.8.
[0049]
Next, with regard to the stability of the D-amino acid oxidase (enzyme obtained in Example 1) according to the first aspect of the present invention, pigs that have been widely used in the measurement methods so far through D-amino acids or D-amino acids. This will be described in comparison with kidney-derived D-amino acid oxidase (Sigma, Type II).
[0050]
(8) Solution storage stability:
Each enzyme was dissolved in 50 mM TAPS buffer (pH 8.5) so as to be 0.6 to 0.8 U / mL and stored in a refrigerator (4 ° C.). Method 1 was used to measure residual enzyme activity. The results are shown in Table 9 and Table 10. From Tables 9 and 10, it can be seen that the D-amino acid oxidase of the present invention is extremely stable as compared with the enzyme derived from porcine kidney.
[0051]
[Table 9]

[0052]
[Table 10]

[0053]
Next, the use of D-amino acid oxidase obtained by the present invention will be described. Since D-amino acid oxidase is an enzyme that catalyzes the oxidation reaction of D-amino acid in the presence of oxygen to produce hydrogen peroxide, 2-oxoacid and ammonia, so long as the change due to this reaction can be utilized. The application is not particularly limited.
[0054]
As a method using a direct reaction product, a method for producing 2-oxo acid and a method for producing an antibiotic raw material by oxidizing a D-amino acid side chain of a precursor raw material, such as cephalosporin C to 7- Examples include the production of aminocephalosporanic acid. Indirect utilization includes a method for producing L-amino acid by oxidizing only D-form from DL-amino acid and a substrate for directly or indirectly detecting a quantitative change in reaction product as a signal. Examples of the measuring method include D-amino acids and antibiotics.
[0055]
In addition, a D-amino acid measurement method combined with another D-amino acid generation method after a D-amino acid production method, a precursor substrate having a D-amino acid at the terminal, for example, a measurement method for peptides, etc. Examples include methods for measuring enzyme activities such as exoprotease and peptidase in which a synthetic peptide is added as a substrate, such as measurement of leucine aminopeptidase activity.
[0056]
It goes without saying that the D-amino acid oxidase of the present invention is superior in stability to conventional enzymes and can be applied to regions where conventional use is limited. As an example of a method for measuring a substrate, a detailed description will be given using a D-alanine quantitative method. When D-alanine is a substrate, the reaction formula catalyzed by D-amino acid oxidase is shown below.
[0057]
[Chemical formula 2]
D-alanine + O₂+ H₂O → pyruvic acid + H₂O₂+ NH_Three
[0058]
As apparent from the above reaction formula, D-alanine can be quantified by detecting any of pyruvic acid, hydrogen peroxide, and ammonia in the reaction product. Specifically, when detecting pyruvic acid in the reaction product, it was described above in the method for measuring pyruvic acid using lactate dehydrogenase, which is used in normal biochemical tests, and the enzyme activity measurement of D-amino acid oxidase. "Doxo detection method of 2-oxo acid" etc. can be utilized.
[0059]
When detecting hydrogen peroxide in the reaction product, a known method can be used as a method for detecting hydrogen peroxide. For example, the above-described “colorimetric detection method for hydrogen peroxide” can be exemplified. When detecting ammonia in the reaction product, an ordinary ammonia measurement method can be used. For example, there is an ammonia measurement system using glutamate dehydrogenase.
[0060]
These measurement methods are classified into two methods, the rate method and the endpoint method, from the viewpoint of the reaction rate, and any of them may be used, and the measurement system, reaction time, concentration of substrate D-alanine, It is appropriately selected depending on conditions such as the type of specimen.
[0061]
When measuring the substrate D-amino acid, the sample containing the substrate and D-amino acid oxidase may be added to a buffer solution of about pH 6 to 11 for reaction. D-amino acid oxidase can be used in a solution state or freeze-dried product, microencapsulated or fixed on a carrier and insolubilized as necessary. As the buffer solution, phosphate buffer solution, Tris / HCl buffer solution, Good buffer solution, glycine buffer solution and the like are used. The enzyme is usually used at a concentration of 0.5 to 50 U / mL with respect to the substrate at a concentration of 1 to 500 μM.
[0062]
Any of colorimetric method, fluorescence method, chemiluminescence method, electrode method and the like can be used for detection of the generated hydrogen peroxide. In the colorimetric method, a peroxidase substrate is oxidized and colored with hydrogen peroxide using a catalyst such as peroxidase, and the color density is measured with a spectrophotometer. As substrates for peroxidase, o-phenylenediamine, 5-aminosalicylic acid, 4-aminoantipyrine and phenol, 2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), bis [3-bis (4- Chlorophenyl) methyl-4-dimethyl-aminophenyl] amine and the like can be used.
[0063]
In the fluorescence method, a substrate is oxidized with hydrogen peroxide using a catalyst such as peroxidase to generate a fluorescent substance, and the fluorescence intensity is measured with a fluorometer. As a substrate for peroxidase, p-hydroxyphenylacetic acid, p-hydroxyphenylpropionic acid and the like can be used.
[0064]
In the chemiluminescence method, a substrate such as peroxidase is used to oxidize a substrate with hydrogen peroxide to emit light, and the luminescence intensity is measured with a luminometer. As a chemiluminescent substrate, a luminol compound, lucigenin, an allyl oxalate compound, or the like can be used.
[0065]
A reagent containing the above-described reagent components necessary for detection of D-amino acid oxidase and D-amino acid can be prepared and assembled into a diagnostic agent as a D-amino acid measurement kit.
[0066]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by a following example, unless the summary is exceeded.
[0067]
Example 1 (Production of D-amino acid oxidase by Fusarium spp.)
Polypeptone (Wako Pure Chemical) 1.7%, Soyton (Difco) 0.3%, Glucose (Wako Pure Chemical) 2.5%, Sodium chloride (Nacalai Tesque) 0.5%, Dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque) ) 0.25%, potassium dihydrogen phosphate (Nacalai Tesque) 1.0%, DL-alanine (Nacalai Tesque) 1.0%, Adecanol (Asahi Denka) LG 126 0.1% and chloramphenicol ( A medium (pH 5) containing 0.01% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dispensed 60 mL each into two 200 mL culture flasks, sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, and cooled.
[0068]
Each culture flask is inoculated with a platinum loop of Fusarium sp. IKD-1238B strain (Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, FERM P-15399) and cultured with shaking at 27 ° C for 2 days. The seed culture solution was used. Eleven 2L jar fermenters containing 1.5L of medium having the same composition as described above were sterilized and cooled at 121 ° C for 20 minutes, then inoculated with 15 mL each of the seed culture solution, and at 22 ° C for 60 hours, The cells were cultured under conditions of an aeration rate of 2 V / V / m and a stirring speed of 300 rpm. After completion of the culture, the culture solution was filtered to obtain 658 g of wet cells.
[0069]
20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 0.2 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride was obtained. The cells were disrupted using a crusher Dynomill under cooling. The obtained crushed liquid was centrifuged to remove the cell residue, and 5550 mL of a crude enzyme solution was obtained. This crude enzyme solution was treated on a 50 ° C. hot water bath for 30 minutes, and then cooled to 20 ° C. on an ice bath.
[0070]
Streptomycin sulfate was added to the cooled crude enzyme solution to a final concentration of 1 mg / mL, placed on an ice bath for 2 hours, and then centrifuged to obtain 5290 mL of supernatant. Add ammonium sulfate to this supernatant so that it is 40% saturated, leave it overnight, remove the deposited precipitate by centrifugation, add ammonium sulfate to the resulting supernatant so that it becomes 90% saturated, and again. The mixture was left for a whole day and night, and a precipitate deposited by centrifugation was obtained.
[0071]
The obtained precipitate was dissolved in 200 mL of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol, and then desalted with a buffer having the same composition using a dialysis membrane. The desalted solution was passed through a DEAE-Cellulofine A-500m column (diameter: 4.7 cm × length: 7.8 cm) equilibrated in advance with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol. Was adsorbed and washed with a buffer solution of the same composition.
[0072]
Next, elution was performed with a linear gradient from 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.4 M NaCl and 1 mM dithiothreitol. Then, the active fraction of the enzyme was collected. This active fraction was desalted with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol using a dialysis membrane.
[0073]
This desalted solution was passed through a DEAE-Cellulofine A-500m column (diameter 4.7 cm × length 7.8 cm) equilibrated in advance with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM dithiothreitol. The enzyme was adsorbed, washed with a buffer solution having the same composition, and eluted with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.1 M NaCl and 1 mM dithiothreitol, and the active fractions of the enzyme were collected.
[0074]
This active fraction was desalted with a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0.1 mM dithiothreitol using a dialysis membrane. After preparing this desalted solution to be 10% saturated by adding ammonium sulfate, butyl equilibrated in advance with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 10% saturated ammonium sulfate and 0.1 mM dithiothreitol. The enzyme active fraction was collected by passing through a Toyopearl 650M column (diameter 2.1 cm × length 3.2 cm).
[0075]
Next, this active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon, Centriplus-10: molecular weight cut off 10,000), and then high-performance liquid chromatography column TSK-GELG3000SW (Tosoh; diameter: 2.15 cm) × 60 cm in length), 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.5 M NaCl in mobile phase was injected under conditions of a flow rate of 3.0 mL / min, and the active fraction was fractionated. . The fractionated enzyme showed a single band by SDS electrophoresis. Table 11 shows the relationship between the yield and specific activity of each purification step.
[0076]
[Table 11]

[0077]
Example 2 (Application to D-alanine quantification method)
76.9 mM phosphate buffer containing 0.385 mg / mL 4-aminoantipyrine, 11.7 mg / mL N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aniline, 7.69 U / mL horseradish peroxidase ( 100 μL of D-alanine solution was added to 130 μL of pH 7.5) (first reagent), and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to make the temperature constant. Next, 20 μL of 50 mM TAPS buffer solution (pH 8.5) (second reagent) containing 0.2 U / mL of D-amino acid oxidase obtained in Example 1 was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes to develop color. The absorbance increase rate at 595 nm was measured with a microplate reader. The measurement result of the calibration curve is shown in FIG. The calibration curve was a straight line from 5 to 50 mg / L, and D-alanine could be measured.
[0078]
【The invention's effect】
The present invention provides D-amino acid oxidase that is extremely useful as a clinical diagnostic agent and a production method suitable for industrial production thereof.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the optimum pH of the D-amino acid oxidase of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the pH stability of the D-amino acid oxidase of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the optimum temperature of the D-amino acid oxidase of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the temperature stability of the D-amino acid oxidase of the present invention.
FIG. 5 shows a calibration curve for D-alanine measurement.

Claims (5)

D-amino acid oxidase having the following physicochemical properties:
(1) Action: Oxidizes D-amino acid in the presence of oxygen to produce hydrogen peroxide, 2-oxo acid and ammonia.
(2) Substrate specificity: Strongly acts on D-phenylalanine, D-alanine, D-valine, D-methionine, D-proline, D-leucine, D-isoleucine, D-histidine, D-glutamine and D-tyrosine. , D-serine, D-tryptophan, D-lysine, D-arginine, D-threonine, D-asparagine, D-cysteine, D-cystine, D-aspartic acid, D-glutamic acid, glycine, L- It has little effect on amino acids.
(3) Optimum pH and pH stability: The optimum pH is 6 to 11, and the stable pH range is 6 to 10.7.
(4) Optimum temperature and thermal stability: The optimum temperature is around 40 ° C, and is stable up to 50 ° C when treated for 15 minutes under the condition of pH 8.5.
(5) Inhibitor: Strongly inhibited by silver nitrate, mercuric chloride, cadmium chloride, lead lead, p-chloromercuribenzoic acid and aminoguanidine.
(6) Molecular weight: The molecular weight measured by gel filtration is about 166,000, and the measured value by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis shows a single band of about 41,200.
(7) Isoelectric point: about 4.8.
(8) Substrate affinity (Km value): D-phenylalanine: 0.37 mM, D-alanine: 2.4 mM, D-methionine: 0.84 mM, D-proline: 3.3 mM. A microorganism belonging to Fusarium equiseti and having the heat-stable D-amino acid oxidase producing ability described in the first aspect is cultured in a nutrient medium, and the D-amino acid oxidase according to claim 1 is produced in the culture. The method for producing a thermostable D-amino acid oxidase according to claim 1 , characterized in that it is accumulated and collected. The microorganism which belongs to Fusarium equiseti (Fusarium equiseti), and has the production ability of the thermostable D-amino acid oxidase of Claim 1 .   4. The microorganism according to claim 3, which is a Fusarium sp. IKD-1238B strain (FERM P-15399) or a mutant strain thereof. A method for measuring D-amino acid, comprising a step of oxidizing D-amino acid using heat-resistant D-amino acid oxidase according to claim 1 as a catalyst in the presence of oxygen.

Images