JP3792898B2 - Method for measuring peroxidase activity - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に、詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度で検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法は、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法または蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体として過酸化水素を、そして発光増強剤としてｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度で定量することが可能になっている。
【０００４】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、前記事情に鑑み、更に高感度で測定可能な化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下に反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光系に比較して、更に高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて、本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより調製した化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において、更に、好ましくは発光増強剤の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものである。その測定方法は任意であるが、化学発光性物質、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法を採用することができる。
【００１０】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光性を有する反応生成物を含有するものであり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記の一般式（１）
【００１１】
【化３】
【００１２】
前記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜１４を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜１４のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、更に、アルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でも又は異なるものでもよい。これらの炭化水素基としては、炭素数が、例えば、１〜２０、特に、１〜１０のものが好ましい。
【００１４】
また、一般式（Ｉ）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン（ＮＯ3 -）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ3 -）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１５】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’ブスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’ビスアクリジニウム塩などが挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好ましい。
また、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は次の下記一般式（２）
【００１６】
【化４】
【００１７】
前記一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。又、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１８】
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を非限定的に挙げることができる。
【００１９】
前記化学発光試薬の製造に用いる光照射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電化移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電化移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位もしくは溶媒和によって安定化され、この安定化されたラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。
【００２０】
前記の光照射を行なう際に必要なＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対するＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物のモル比としては、過剰量が望ましいが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で用いることができ、更に、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬の製造時の反応温度は溶媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。
【００２２】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることができる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いる化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、特に５０〜３００μｌの範囲で用いることが好ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０-6〜１Ｍ、特に１０-4〜１０-2Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ましく用いられる。水素受容体の使用量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、特に１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが好ましい。
【００２４】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２５】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に選択することができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時には界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下に反応させることにより得られる化学発光性物質を用い、この化学発光試薬を過酸化水素の存在下において塩基性条件下で、試料中のペルオキシダーゼの作用により発光反応させ、その発光量を測定することにより、ペルオキシダーゼ活性を定量するものであるが、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に利用することが可能になる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００２９】
【表１】
［比較例１］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３１】
【表２】
［実施例２］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを５時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間の発光量を積算した結果、表３に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００３３】
【表３】
［比較例２］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３５】
【表４】
［実施例３］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを３時間照射することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0)溶液１００μｌを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７重量％過酸化水素の７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液５０μｌを順次注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表５に示す発光強度が得られ、ＨＲＰを５×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定可能なことが認められ、光照射せずに反応を行なった比較例３に較べて感度及び発光強度において改善が見られた。
【００３７】
【表５】
［比較例３］
［化学発光試薬の調製］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
次に、この化学発光試薬を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表６に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３９】
【表６】
［比較例４］
複数の化学発光測定用ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これにルミノール５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ及び０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを順次加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表７に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-17 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４１】
【表７】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識物質に用いる酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、ハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を各々より高感度で検出もしくは定量することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring peroxidase activity using a chemiluminescent method, and more specifically, a highly sensitive method in the presence of a hydrogen acceptor using a chemiluminescent method using a specific novel chemiluminescent reagent. The present invention relates to a method for measuring peroxidase activity.
[0002]
[Prior art]
Peroxidase is an enzyme that catalyzes the oxidation reaction of a hydrogen donor in the presence of a hydrogen acceptor. Such catalytic activity is also observed in non-enzymatic substances such as hemoglobin, and is collectively referred to as peroxidase activity. Since the catalytic activity of peroxidase is highly sensitive and easy to detect, it is used not only for detection of peroxidase enzyme activity but also as a reagent for analysis that serves as an indicator of various substances to be detected in a wide range of fields. As described above, analysis methods using peroxidase as a labeling substance include immunoassays using antigen-antibody reactions, nucleic acid hybridization assays using nucleic acid complementation, other avidin-biotin, hormone-hormone receptors, sugars. -Used for analysis systems utilizing specific affinity such as lectins.
[0003]
In addition, for the measurement of such peroxidase activity, a colorimetric method or a fluorescent substance is used which oxidizes a hydrogen donor using hydrogen peroxide as a hydrogen acceptor, generates a dye, and measures the color development amount with a spectrophotometer or the like. A fluorescence method or the like in which the fluorescence is generated and measured with a fluorescence spectrophotometer is performed. However, when a colorimetric method is used for measuring peroxidase activity, there is a problem that the quantitative property in the low concentration region of peroxidase is lacking, and a fluorescence method has been developed to solve this problem. It is not yet sufficient for quantitativeness in the area. In order to solve this problem, a method for measuring peroxidase activity by a chemiluminescence method has been developed. The chemiluminescence method is a method for quantifying peroxidase enzyme activity by measuring the amount of luminescence emitted when the chemiluminescent substance is excited through an intermediate due to the catalytic activity of the peroxidase enzyme and returns from this state to the ground state. A chemiluminescent system has been developed that uses luminol as a chemiluminescent substance, hydrogen peroxide as a hydrogen acceptor, and p-iodophenol as a luminescence enhancer, and can quantify peroxidase activity with high sensitivity. It is possible.
[0004]
However, when measuring peroxidase enzyme activity in enzyme immunoassay, there are many cases in which it is necessary to further improve the quantitativeness of the enzyme in a low concentration region, and the sensitivity of peroxidase enzyme activity measurement is further increased. It was desired.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, in view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a novel method for measuring peroxidase activity by a chemiluminescence method that can be measured with higher sensitivity.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have determined that N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are N, N-disubstituted as chemiluminescent reagents. A luminescent system using a chemiluminescent reagent prepared by reacting under light irradiation in the presence of a carboxylic acid amide compound, using hydrogen peroxide as a hydrogen acceptor, and using a specific phenol compound as a luminescence enhancer The present inventors have found that peroxidase activity can be quantified with higher sensitivity than a luminescent system using luminol as a chemiluminescent substance, and the present invention has been achieved based on these findings.
[0007]
Therefore, the first of the present invention is
Using a chemiluminescent reagent prepared by reacting N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts with light irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, hydrogen The present invention relates to a method for measuring peroxidase activity by a chemiluminescence method, which comprises measuring peroxidase enzyme activity in the presence of a receptor.
[0008]
The second of the present invention is
Using a chemiluminescent reagent prepared by reacting N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts with light irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, hydrogen The present invention relates to a method for measuring peroxidase activity by a chemiluminescence method, wherein a phenolic compound is used as a luminescence enhancer when measuring peroxidase enzyme activity in the presence of a receptor.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
In the method for measuring peroxidase activity of the present invention, N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are irradiated with light as a chemiluminescent substance in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. The peroxidase enzyme activity is measured in the presence of a hydrogen acceptor, preferably in the presence of a luminescence enhancer, using a chemiluminescent reagent obtained by reacting under the above conditions. The measurement method is arbitrary, but a chemiluminescent substance, a luminescence enhancer, and a peroxidase enzyme-containing measurement sample are mixed, and a hydrogen acceptor solution is added in a specific basic pH region to cause a chemiluminescent reaction. A method of measuring the amount of luminescence with a luminescence measuring device can be employed.
[0010]
The chemiluminescent reagent used in the method for measuring peroxidase activity according to the present invention is a method in which N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are photo-reacted in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. It contains a reaction product having chemiluminescence obtained by reacting under irradiation, and N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts are represented by the following general formula (1 )
[0011]
[Chemical 3]
[0012]
In the general formula (1), R 1 and R 2 are selected from the group consisting of an alkyl group, an aryl group, and a halogenated aryl group, and may be the same as or different from each other. An alkyl group, an aryl group, and a halogenated aryl group are those having 1 to 14 carbon atoms, and preferred alkyl groups are those having 1 to 10 carbon atoms. Examples thereof include linear or branched alkyl groups such as methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, and decyl group. The aryl group preferably has 6 to 14 carbon atoms, and examples thereof include a phenyl group, a tolyl group, and a xylyl group, and may further be substituted with an alkyl group. As the aryl group, a phenyl group is particularly preferable. Examples of the halogenated aryl group include a halogenated phenyl group, a halogenated tolyl group, a halogenated xylyl group, and the like, and a chlorophenyl group is particularly preferable.
[0013]
In the general formula (1), R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an aryloxy group and a halogen atom, and are the same as each other Or it may be different. These hydrocarbon groups preferably have 1 to 20 carbon atoms, particularly 1 to 10 carbon atoms.
[0014]
In the general formula (I), X n− is an n-valent anion, and n is 1 or 2. The anion is not particularly limited, and nitrate ion (NO 3 − ), halide ion (eg, chloride ion, fluoride ion, bromide ion, etc.), (meth) phosphate ion (PO 3 − And the like. Of these anions, nitrate ions are particularly preferred.
[0015]
Specific examples of N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts include N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium salts and N, N′-diethyl-9. , 9 ′ busacridinium salt, N, N′-diphenyl-9,9′-bisacridinium salt, N, N′-di-m-chlorophenyl-9,9′bisacridinium salt, etc. Of course, the present invention is not limited to these. In particular, N, N′-dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate (lucigenin) is preferable.
The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound is represented by the following general formula (2):
[0016]
[Formula 4]
[0017]
In the general formula (2), R 1 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms. The group may be substituted with a group selected from the group consisting of an alkyl group, a halogen group, a nitro group, a hydroxyl group, an amino group, and the like. R 2 is selected from the group consisting of a methyl group and an ethyl group, and R 3 is selected from the group consisting of an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms. And the aryl group may be substituted with a group selected from the group consisting of an alkyl group, a halogen group, a nitro group, a hydroxyl group, an amino group, and the like. R 1 and R 3 may be bonded to each other to form a ring together with the carbon atom of the carbonyl group and the nitrogen atom of the amide group to which R 1 and R 3 are bonded.
[0018]
Specific examples of N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds include N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-dimethylpropionamide, N, N-dimethyl. Nonlimiting examples include benzamide, N-methyl-2-pyrrolidone, and the like.
[0019]
As the light beam for light irradiation used for the production of the chemiluminescent reagent, an ultraviolet-visible part having a wavelength region of about 290 to 800 nm is used, and visible light of about 400 to 800 nm is particularly desirable. As these light sources, high-pressure mercury lamps, low-pressure mercury lamps, germicidal lamps, fluorescent lamps, incandescent lamps and the like can be used without limitation, but incandescent lamps are preferably used. The chemiluminescent reagent obtained by this light irradiation has a very high luminescence in a short time when manufactured with the same raw material lucigenin concentration and used in the same amount as compared with the chemiluminescent reagent manufactured under natural light without using a light source. Light irradiation plays an important role in the production of chemiluminescent compounds because it shows strength, and when this reaction is carried out under light shielding, a chemiluminescent reagent that is dependent on peroxidase concentration cannot be obtained. It is recognized that N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts do not cause a significant luminescence reaction near hydrogen peroxide or hydrogen peroxide in the presence of peroxidase near pH 8. This is probably because the disubstituted-9,9′-bisacridinium cation forms a stable salt with a counter ion, particularly nitrate ion. However, by irradiating with light in the presence of a highly polar compound such as an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, a pair to the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium cation is obtained. The charge transfer from the anion is promoted and the salt is changed from a highly ionic salt to a charge transfer complex having a radical property, and this complex is stabilized by the coordination or solvation of the N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, This stabilized radical compound reacts with active oxygen generated by enzymatic decomposition of hydrogen peroxide and emits light through an excited dioxetane structure, so that it is considered that the emission intensity depending on the peroxidase concentration can be obtained.
[0020]
The molar ratio of the N, N-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt to the N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salt required when performing the light irradiation is preferably an excess amount. N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts can be used in an amount of 1 to 10,000 moles of the N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound. And / or different N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds and / or other solvents can also be used as reaction solvents.
[0021]
The reaction temperature during production of the chemiluminescent reagent used in the method for measuring peroxidase activity of the present invention varies depending on the presence and type of solvent, but is generally −10 to + 150 ° C., preferably 0 to 120 ° C., particularly preferably 20 The temperature is in the range of ~ 90 ° C. The reaction time is 1 minute to 1 day, preferably 10 minutes to 15 hours, particularly preferably 30 minutes to 10 hours.
[0022]
The chemiluminescent reagent used in the method for measuring peroxidase activity of the present invention emits light in an amount depending on the concentration of peroxidase in the presence of excess hydrogen peroxide under basic conditions of pH 7.5-13. It is recognized that this luminescence is enhanced by a luminescence enhancer such as a phenolic compound. Such phenolic compounds include p-hydroxycinnamic acid, p-phenylphenol, p- (4-chlorophenyl) phenol, p- (4-bromophenyl) phenol, p- (4-iodophenyl) phenol, p -Iodophenol, p-bromophenol, p-chlorophenol, 6-hydroxybenzothiazole, 2-naphthol, firefly luciferin and the like can be mentioned without limitation.
[0023]
The chemiluminescent reagent used in the method for measuring peroxidase activity of the present invention is used at a concentration in the range of 10 −8 to 1 M, preferably 10 −6 to 10 −2 M. The amount used is 10 to 500 μl, particularly 50 to It is preferable to use in the range of 300 μl. The amount of the luminescence enhancing agent used is in the range of 0.01 to 100 times mol, preferably 0.1 to 10 times mol of the chemiluminescence reagent, and the concentration is 10 −6 to 1 M, particularly 10 −4 to It is preferably used in the range of 10 −2 M. The hydrogen acceptor used in the chemiluminescence reaction is not particularly limited as long as it can be a substrate for the peroxidase enzyme, and organic peroxides, inorganic peroxides, etc. are arbitrarily used. Hydrogen oxide is preferably used. It is necessary to use the hydrogen acceptor in an amount that is sufficiently excessive with respect to the chemiluminescent reagent, and the amount used is 3 to 10,000 times mol, particularly 10 to 1000 times mol of the chemiluminescent reagent. It is preferable to use within a range.
[0024]
Further, when various substances are quantified by labeling antibodies, nucleic acids and the like using peroxidase as a labeling substance, horseradish peroxidase (HRP) is preferably used as the peroxidase.
[0025]
As a basic buffer used in the chemiluminescence reaction, a Tris buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, a carbonate buffer, a glycine-sodium hydroxide buffer, or the like can be arbitrarily selected. The concentration of these buffer solutions is preferably used in the range of 1 mM to 1M. Further, during the reaction, additives such as a surfactant and a chelating agent can be arbitrarily used.
[0026]
In the method for measuring peroxidase activity of the present invention, N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridiniums as chemiluminescent reagents are irradiated with light in the presence of N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds. Using a chemiluminescent substance obtained by reacting with this, the chemiluminescent reagent is subjected to a luminescence reaction by the action of peroxidase in the sample under basic conditions in the presence of hydrogen peroxide, and the amount of luminescence is measured. Thus, peroxidase activity is quantified, but by using peroxidase as a labeling substance, it can be further used for quantification of various substances.
[0027]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to the following Example.
[0028]
[Example 1]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1.5 mg of lucigenin in a test tube, add 1 ml of N, N-dimethylacetamide and dissolve it, and then irradiate it with a 250 W copy lamp in a water bath at a temperature of 30 ° C. for 7 hours. A chemiluminescent reagent containing is obtained.
[Measurement of peroxidase activity]
This chemiluminescent reagent is diluted 500 times with 8 × 10 −4 M p-iodophenol 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to prepare a chemiluminescent reagent solution. In addition, a plurality of wells of a microplate for chemiluminescence measurement were filled with 100 μl of 75 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) having various concentrations of horseradish peroxidase (HRP). 100 μl of a reagent solution and 50 μl of a 0.0017 wt% hydrogen peroxide 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) solution were sequentially injected to cause a luminescence reaction, and then the amount of luminescence was measured using a luminometer (Luminous CT As a result of integrating the luminescence amount for 0 to 5 seconds at 9000 D), the luminescence intensity shown in Table 1 was obtained, and it was confirmed that HRP could be measured up to 5 × 10 −19 mol / assay, and the reaction was performed without light irradiation. Compared to Comparative Example 1 performed, improvements were observed in sensitivity and emission intensity.
[0029]
[Table 1]
[Comparative Example 1]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1 mg of lucigenin in a test tube, dissolve it by adding 2 ml of N, N-dimethylacetamide, leave it at room temperature for 90 minutes, and then add 2 ml of pure water and mix to obtain a chemiluminescent reagent.
[Measurement of peroxidase activity]
Next, various concentrations of this chemiluminescent reagent were added to 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 4.0 × 10 −5 M and p-iodophenol at a concentration of 10 −3 M. 100 μl of a standard horseradish peroxidase (HRP) aqueous solution was mixed, 50 μl of 0.0034 wt% aqueous hydrogen peroxide was added thereto, and the amount of luminescence was accumulated for 0 to 5 seconds with a luminometer (Luminus CT-9000D manufactured by Diatron). As a result, as shown in Table 2, it was possible to measure HRP up to 1 × 10 −18 mol / assay.
[0031]
[Table 2]
[Example 2]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1.5 mg of lucigenin in a test tube, add 1 ml of N, N-dimethylformamide to dissolve it, and then irradiate it with a 250 W copy lamp in a water bath at a temperature of 30 ° C. for 5 hours. A chemiluminescent reagent containing is obtained.
[Measurement of peroxidase activity]
This chemiluminescent reagent is diluted 500 times with 8 × 10 −4 M p-iodophenol 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to prepare a chemiluminescent reagent solution. In addition, a plurality of wells of a microplate for chemiluminescence measurement were filled with 100 μl of 75 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) having various concentrations of horseradish peroxidase (HRP). 100 μl of a reagent solution and 50 μl of a 0.0017 wt% hydrogen peroxide 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) solution were sequentially injected to cause a luminescence reaction, and then the amount of luminescence was measured using a luminometer (Luminous CT As a result of integrating the amount of luminescence for 0-5 seconds at 9000D), the luminescence intensity shown in Table 3 was obtained, and it was confirmed that HRP could be measured up to 5 × 10 −19 mol / assay, and the reaction was performed without light irradiation. As compared with Comparative Example 1 in which the above was performed, the sensitivity and emission intensity were improved.
[0033]
[Table 3]
[Comparative Example 2]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1 mg of lucigenin in a test tube, add 2 ml of N, N-dimethylformamide and dissolve it, leave it at room temperature for 90 minutes, add 2 ml of pure water and mix to obtain a chemiluminescent reagent.
[Measurement of peroxidase activity]
The chemiluminescent reagent was then added to 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 4.0 × 10 −5 M and p-iodophenol at a concentration of 10 −3 M at various concentration levels. 100 μl of an aqueous solution of horseradish peroxidase (HRP) was added, 50 μl of 0.0034% by weight aqueous hydrogen peroxide solution was added thereto, and the amount of luminescence was integrated for 0 to 5 seconds using a luminometer (Luminus CT-9000D manufactured by Diatron). As a result, as shown in Table 4, it was possible to measure HRP up to 1 × 10 −18 mol / assay.
[0035]
[Table 4]
[Example 3]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1.5 mg of lucigenin in a test tube, add 1 ml of N-methyl-2-pyrrolidone to dissolve it, and then irradiate it with a 250 W copy lamp in a water bath at a temperature of 30 ° C. for 3 hours. Get.
[Measurement of peroxidase activity]
This chemiluminescent reagent is diluted 500 times with 8 × 10 −4 M p-iodophenol 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to prepare a chemiluminescent reagent solution. In addition, a plurality of wells of a chemiluminescence measurement microplate are filled with 100 μl of 75 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) having various concentrations of horseradish peroxidase (HRP). After 100 μl of reagent solution and 50 μl of 0.0017 wt% hydrogen peroxide 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) were sequentially injected to cause a luminescence reaction, the luminescence was measured with a luminometer (Diatron Luminous CT- As a result of integrating the amount of luminescence for 0 to 5 seconds at 9000 D), the luminescence intensity shown in Table 5 was obtained, and it was confirmed that HRP could be measured up to 5 × 10 −19 mol / assay, and the reaction was performed without light irradiation. Compared to the comparative example 3 performed, improvements in sensitivity and emission intensity were observed.
[0037]
[Table 5]
[Comparative Example 3]
[Preparation of chemiluminescent reagent]
Take 1 mg of lucigenin in a test tube, add 2 ml of N, N-dimethylformamide and dissolve it, leave it at room temperature for 90 minutes, add 2 ml of pure water and mix to obtain a chemiluminescent reagent.
[Measurement of peroxidase activity]
Next, various concentrations of this chemiluminescent reagent were added to 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing 4.0 × 10 −5 M and p-iodophenol at a concentration of 10 −3 M. 100 μl of a standard horseradish peroxidase (HRP) aqueous solution was mixed, 50 μl of 0.0034 wt% aqueous hydrogen peroxide was added thereto, and the amount of luminescence was accumulated for 0 to 5 seconds using a luminometer (Luminus CT-9000D manufactured by Diatron). As a result, as shown in Table 6, it was possible to measure HRP up to 1 × 10 −18 mol / assay.
[0039]
[Table 6]
[Comparative Example 4]
200 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) solution of various concentrations of horseradish peroxidase (HRP) and p-iodophenol 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.4) in several chemiluminescence assay wells After adding 20 μl, 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing luminol at a concentration of 5.6 × 10 −5 M (pH 8.4) and 50 μl of 0.0034% by weight aqueous hydrogen peroxide solution were sequentially added. As a result of integrating the amount of luminescence for 0 to 5 seconds with a luminometer (Diatron's Luminous CT-9000D), the luminescence intensity as shown in Table 7 is obtained, and the HRP is measured up to 1 × 10 -17 mol / assay. Was possible.
[0041]
[Table 7]
【The invention's effect】
The method for measuring peroxidase activity of the present invention makes it possible to measure peroxidase enzyme activity with higher sensitivity than the measurement system using luminol, which has been widely used in the past, and by enzyme immunoassay using peroxidase as a labeling substance. Antigens and antibodies can be detected or quantified with higher sensitivity, respectively, by hybridization assays.
Claims (8)
で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
下記一般式（２）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において波長４００〜８００ｎｍの可視光照射下で反応させて得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。The following general formula (1)
N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the following general formula (2)
A chemiluminescent reagent containing a chemiluminescent substance obtained by reaction under irradiation with visible light having a wavelength of 400 to 800 nm in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound represented by the formula: A method for measuring peroxidase activity by chemiluminescence, which comprises measuring peroxidase enzyme activity in the presence.
で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
下記一般式（２）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において波長４００〜８００ｎｍの可視光照射下で反応させて得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。The following general formula (1)
N, N′-disubstituted-9,9′-bisacridinium salts represented by the following general formula (2)
A chemiluminescent reagent containing a chemiluminescent substance obtained by reaction under irradiation with visible light having a wavelength of 400 to 800 nm in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound represented by the formula: A method for measuring peroxidase activity by a chemiluminescence method, wherein a phenolic compound is used as a luminescence enhancer when measuring peroxidase enzyme activity in the presence.
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