JP3784251B2

JP3784251B2 - Immobilized enzyme and method for producing optically active cyanohydrin

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Publication number: JP3784251B2
Application number: JP2000377793A
Authority: JP
Inventors: 幸生 ▲土▼▲橋▼; 尚仙波
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2000-12-12
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2020-12-12
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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、固定化担体にR-ヒドロキシニトリルリアーゼが固定化された固定化酵素、該固定化酵素の製造方法及び該固定化酵素を用いる光学活性シアノヒドリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
R-ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアン化合物とカルボニル化合物とから光学活性なシアノヒドリンを合成する活性を有する酵素として有用であることが知られている。ところが、R-ヒドロキシニトリルリアーゼは、一般には植物組織から抽出することによって調製されるため、高価なものとなる。したがって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼに関しては、効率的な使用方法、すなわち、反応効率の向上及び再利用といった効率化が重要な課題となっている。
【０００３】
これまで、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを用いた光学活性シアノヒドリンの合成方法としては、当該酵素を適当な担体に固定化した固定化酵素を使用する方法が提案されている。しかし、従来公知の当該酵素の固定化方法では、反応系内での分散性が悪いこと、酵素と反応液との分離性が悪いこと、酵素の固定化量が少ないこと等の問題があった。例えば、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを用いた酵素反応において、R-ヒドロキシニトリルリアーゼをシリカゲルに化学的に吸着させた固定化酵素が知られている（Ernst Wehtjeら、Appl. Microbiol. Biotechnol., (1988) 29 : 419-425）。この固定化酵素は、シリカゲルの表面をグルタルアルデヒド処理することによって、シリカゲルの表面にR-ヒドロキシニトリルリアーゼを化学的に固定化したものである。
【０００４】
しかし、この固定化酵素においては、シリカゲルの表面を活性化するための煩雑な前処理を行わなければならない。このため、この固定化酵素を調製するためには、多段階の工程を必要とし、容易に作製できないといった不都合があった。
【０００５】
また、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを固定化する担体として、セライトを用いた固定化酵素（Wehtjeら、Biotechnol. Bioeng., (1990) 36 : 39-46）及びセルロースを用いた固定化酵素（Effenbergerら、Tetrahedron Lett., (1991) 32 : 2605-2608）も知られている。これらの固定化酵素は、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを物理的に固定化したものである。
【０００６】
しかし、これらの固定化酵素は、酵素の固定量が少なく、所要量の酵素を固定化するために担体量を多くする必要があった。このため、一定反応容器内に占める固定化酵素量が多くなるため、生産性が悪く、さらに、固定化担体が極めて微細であるうえ、親水性であるため、水分を含有した有機溶媒中で用いた場合、反応系内部の水分を吸収し、固定化酵素同士が凝集を起こし、反応系内での分散性が極めて悪くなるといった問題があった。したがって、この固定化酵素には、不定形を呈するための取扱いが困難であるといった不都合があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、簡便に作製することができ、且つ、反応効率がよく、さらに取扱いも容易な固定化酵素、当該固定化酵素の製造方法及び当該固定化酵素を用いる光学活性シアノヒドリンの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意研究を行った結果、酵素の固定化担体として多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体を用い、これらにR-ヒドロキシニトリルリアーゼを物理的に吸着させることによって、極めて容易に製造することができるとともに、取扱いが容易な固定化酵素を調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、シアン化合物とカルボニル化合物とからR体のシアノヒドリンを合成する活性を有するR-ヒドロキシニトリルリアーゼを、多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体からなる担体に物理吸着により固定化してなることを特徴とする固定化酵素である。
また、この固定化酵素において、上記多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体が細孔径１０〜２００nmの細孔を有するものであることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明は、シアン化合物とカルボニル化合物とからR体のシアノヒドリンを合成する活性を有するR-ヒドロキシニトリルリアーゼを、多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体からなる担体に物理吸着により固定化することを特徴とする固定化酵素の製造方法である。
【００１１】
一方、本発明者らは、上記固定化酵素を反応溶媒として水に難溶又は不溶な有機溶媒中で用いることによって、回分反応系内で固定化酵素を効率よく分散させることができ、また、反応終了後において固定化酵素と反応液とを容易に分離できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、カルボニル化合物及びシアン化合物から光学活性なシアノヒドリンを合成する際に、前記固定化酵素を用いることを特徴とする光学活性シアノヒドリンの製造方法である。
また、この光学活性シアノヒドリンの製造方法は、水に難溶又は不溶の有機溶媒を溶媒として用い、光学活性シアノヒドリン生成反応終了後、反応液と固定化酵素とを分離し、当該固定化酵素を再使用することができる。
【００１３】
さらに、この光学活性シアノヒドリンの製造方法は、上記固定化酵素を充填型反応装置に充填し、反応原料液を当該充填型反応装置に連続的に供給することによって、当該充填型反応装置から光学活性なシアノヒドリンを連続的に調製することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る固定化酵素、該固定化酵素の製造方法及び該固定化酵素を用いる光学活性シアノヒドリンの製造方法について詳細に説明する。
本発明の固定化酵素は、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを、多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体（以下、担体という）に物理吸着により固定化したものである。この固定化酵素は、R-ヒドロキシニトリルリアーゼをシリカゲル担体等に化学的に吸着させた固定化酵素よりも、容易に調製することができ、且つ、取扱い性に優れているという特徴を有する。本発明の固定化酵素は、例えば、以下のようにして製造することができる。
１．R-ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
固定化の対象となるR-ヒドロキシニトリルリアーゼとは、シアン化合物とカルボニル化合物とから光学活性なシアノヒドリンを合成する活性を有する酵素を意味する。ここで、カルボニル化合物とは、アルデヒドまたはケトンをいい、具体的には、下記式(１)で表される。
【００１５】
【化１】

【００１６】
上記式(１)において、Ｒ₁とＲ₂は、(i) 水素原子、(ii)置換または非置換の炭素数１〜18の線状または分枝鎖状の飽和アルキル基、または(iii) 置換または非置換の環員が5 〜22の芳香族基である。ただし、Ｒ₁とＲ₂は同時に水素原子を表すことはない。
【００１７】
上記(ii)で、Ｒ₁とＲ₂が置換アルキル基の場合、置換基は、１個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜８のアルコキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数３〜20のシクロアルキル基、またはN、O、Sのヘテロ原子で置換されていてもよい炭素数22までの芳香族基である（ここで、置換基が環状置換基の場合は、それ自体が１個またはそれ以上のハロゲン、ヒドロキシ基、炭素数１〜８の線状若しくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数２〜８の線状若しくは分枝鎖状のアルケニル基で置換されていてもよい。）。
【００１８】
上記(iii) で、芳香族基は、環員の４個までがＮ、Ｏおよび／またはＳによって置換されているヘテロ芳香族基であってもよい。また、Ｒ１とＲ２が置換芳香族基の場合、置換基は、１個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜８のアルコキシ基、アリルオキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数２２までの線状若しくは分枝鎖状の飽和若しくは不飽和のアルキル基である（ここで、一つの芳香族基が少なくとも２個の置換基により置換されてもよい）。
【００１９】
また、シアン化合物としては、シアン化物イオン（CN^-)を生じる物質であれば、特に限定されず、例えば、シアン化水素、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素塩、アセトンシアンヒドリンなどのシアノヒドリン類などが挙げられる。
【００２０】
R-ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアン化合物とカルボニル化合物とからR体シアノヒドリンを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されないが、例えば、アーモンド（Prunus amygdalus）等のバラ科植物、アマ（Linum usitatissimum）等のアマ科植物及びダイオウウラボシ（Phlebodium aureum）等のウラボシ科植物から抽出したものであることが好ましい。また、R-ヒドロキシニトリルリアーゼとしては、適当な宿主-ベクター系を用いて当該酵素をコードする遺伝子を有する遺伝子組換体を作製し、当該遺伝子組換体によって生産されたものであっても使用できる。
【００２１】
２．R-ヒドロキシニトリルリアーゼの固定化
(1)R-ヒドロキシニトリルリアーゼの固定化担体
R-ヒドロキシニトリルリアーゼを固定化する担体としては、多孔性粘土系焼結担体及び/又は多孔性シリカ系担体を使用することができる。
【００２２】
多孔性粘土系焼結担体とは、ケイ酸塩類原料（例えば、カオリナイト、ディッカイト、ナクライト、ハロイサイトなどのカオリナイト族鉱物、パイロフィライト、モンモリロナイト、絹雲母、滑石、緑泥石などの粘土系のものなど）を造粒し、焼結して得られる多孔性担体をいう。具体的に、多孔性粘土系焼結担体としては、Toyonite200（東洋電化工業社製）、Toyonite200 S（東洋電化工業社製）などを例示できる。
【００２３】
多孔性シリカ系担体とは、二酸化ケイ素の微粒子が凝集してできた高表面積の多孔性担体をいう。具体的に、多孔性シリカ系担体としては、CARiACT Q（富士シリシア化学社製）、Micro Bead Silica Gel（富士シリシア化学社製）などを例示できる。
【００２４】
これら担体は、細孔を有する多孔性無機質材料からなり、当該細孔にR-ヒドロキシニトリルリアーゼを物理的に吸着させることができる。これら担体において、細孔径は10〜200nm、好ましくは10〜100 nmである。細孔径が10nm未満である場合、担体は、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを確実に吸着できない虞がある。また細孔径が200nmを越える場合、担体はR-ヒドロキシニトリルリアーゼの脱落を生じやすくなり、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを充分に固定化できない虞がある。したがって、細孔径がこれらの範囲である担体を使用することによって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを確実に且つ、十分な量で吸着することができる。
【００２５】
さらに、担体は、比表面積が20m²/g以上であることが好ましい。担体の比表面積が20m²/g未満である場合には、酵素反応に十分な量のR-ヒドロキシニトリルリアーゼを固定化することができない虞がある。したがって、比表面積が20m²/g以上である担体を使用することによって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを多量に固定化することができ、優れた効率で酵素反応を行うことができる。
【００２６】
さらにまた、固定化に用いる場合の担体の形状は、特に限定されないが、充填型反応槽用の固定化酵素を作製する場合には球状であることが好ましい。球状の担体において、粒径は10μm〜５mm、好ましくは50μm〜2mmである。ここで、粒径分布は狭いほうが好ましい。粒径が10μm〜５mmである球状の担体を使用することによって、反応溶液と固定化酵素の分離作業性を向上させることができ、充填型反応装置に用いる場合では反応原料液を通液する際の圧力損失を低減させることができる。
【００２７】
(2) 担体へのR-ヒドロキシニトリルリアーゼの固定化
担体へのR-ヒドロキシニトリルリアーゼの固定化は以下のようにして行うことができる。
すなわち、上記１において調製したR-ヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液を酵素活性が損なわれない範囲のpHに調整した後、上記(1)の担体と混合及び攪拌することによって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを担体に物理的に吸着することができる。具体的な固定化方法としては、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液に担体を添加し、一定時間混合して吸着させた後、固定化酵素を分別する方法、担体が含有しうる水分量と等量以下のR-ヒドロキシニトリルリアーゼを含む溶液を担体に添加し、混合することによって酵素を固定化する方法等があげられるが、これらの方法に限定されない。次いで、固定化処理後、得られた固定化酵素は、濾過などによって分離することができる。なお、固定化酵素は過剰に水分を含んだ状態では、光学活性シアノヒドリンの合成時に反応溶媒中で担体同士が凝集する原因となるので、固定化酵素中に含まれる水分は、分散可能なレベルまで除去することが好ましい。固定化酵素からの水分の除去は、減圧乾燥、通風乾燥などによって行うことができる。
【００２８】
３．本発明の固定化酵素を用いた光学活性シアノヒドリンの合成
本発明の固定化酵素を用いた光学活性シアノヒドリンの合成は、以下のようにして行うことができる。
まず、反応溶媒中に、上記２において得られた固定化酵素及び反応基質を加え、反応温度0〜50℃において、反応させることによって、光学活性シアノヒドリンを合成することができる。反応時間は、基質の転換速度に応じて適宜調整すればよく、通常、10分〜120時間反応を行うことによって光学活性シアノヒドリンを合成することができる。合成反応終了後、固定化酵素は、回収し、再度光学活性シアノヒドリンの合成に使用することができる。
【００２９】
また、光学活性シアノヒドリンは、上記２において得られた固定化酵素を、例えばカラム等の充填型反応装置に充填し、反応溶媒及び基質からなる反応原料液を当該充填型反応装置に供給することによって調製することもできる。この場合には、上記反応原料液を連続的に供給することによって、光学活性シアノヒドリンを連続的に調製することができる。
【００３０】
ここで、反応基質としては、上述したようなカルボニル化合物及びシアン化合物を使用する。また、反応溶媒としては、反応系内に水が大量に存在すると、酵素反応によって生成した光学活性シアノヒドリンの光学純度が低下したり、固定化酵素の凝集が起こって反応効率が低下したり、水に対する溶解度の小さいアルデヒドまたはケトンを原料として用いる場合には生産効率が低下するなどの点から、水に難溶または不溶である有機溶媒を主成分としてなる反応溶媒を用いることが好ましい。かかる有機溶媒としては、酵素反応による光学活性シアノヒドリンの合成反応に影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができ、合成反応に用いる原料のアルデヒドまたはケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。具体的に、反応溶媒としては、ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和炭化水素系溶媒、例えば、ペンタン、ヘキサン、トルエン、キシレン、塩化メチレンなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和アルコール系溶媒、例えば、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和エーテル系溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテルなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和エステル系溶媒、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどが挙げられ、これらを単独で用いても、また複数を混合して用いてもよい。また、上記溶媒は水又は水系の緩衝液を含有又は飽和させたものを用いることもできる。
次いで、生成された光学活性シアノヒドリンは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等によって測定・定量することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕R-ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
先ず、アーモンド種子を粉砕した粉砕物100gをアセトン200ml中に分散混合し、2時間攪拌した。その後、アセトン溶液を濾過し、固形分を回収した。乾燥させた固形分に水600gを加え、アンモニア水でpH7.5に調製した後、攪拌混合を一晩行い、スラリーを調製した。
【００３２】
次に、このスラリーを遠心分離し、上澄液を回収した。回収した上澄液のpHを5.5に調製した後に遠心分離し、不溶画分を除去した。そして、硫酸アンモニウムを用いた、いわゆる硫安沈殿処理によって得られた溶液を濃縮し、酵素溶液とした。
【００３３】
この酵素溶液中に含まれるR-ヒドロキシニトリルリアーゼの活性を以下のようにして測定した。先ず、DL-マンデロニトリルを基質として反応させてベンズアルデヒドを生成させる。このとき、ベンズアルデヒドの生成速度を、波長249.6nmの吸光度変化を測定することによって算出する。そして、R-ヒドロキシニトリルリアーゼの活性１単位（U：unit）は、1分間にベンズアルデヒド1μmolを生成する活性と定義した。得られた酵素溶液についてR-ヒドロキシニトリルリアーゼの活性を測定したところ、1500U/mlであり、上記調製によって、2.5万UのR-ヒドロキシニトリルリアーゼを回収できたことが判った。
【００３４】
〔実施例２〕R-ヒドロキシニトリルリアーゼ固定化担体の検討１
実施例１において調製したR-ヒドロキシニトリルリアーゼを含む酵素溶液を用いて固定化酵素を調製した。固定化酵素に使用する担体としては、多孔性粘土系焼結担体としてカオリナイト系セラミック（商品名Toyonite 200 S-4、東洋電化工業社製、細孔径38nm、比表面積235m²/g、平均粒子径166μm）、多孔性シリカ系担体としてシリカゲル（商品名CARiACT Q-20、富士シリシア化学社製、細孔径20nm、比表面積152m²/g、粒子径75〜500μm）を使用した。また、比較として、セルロース担体（商品名Avicel cellulose microcrystalline、E.Merck社製）を用いた固定化酵素及び珪藻土担体（商品名Celite No.545、Celite社製）を用いた固定化酵素も調製した。
【００３５】
R-ヒドロキシニトリルリアーゼをこれら担体に固定化する際には、実施例１で得られた酵素溶液0.3mlと各種担体0.3gとを混合攪拌し、酵素溶液の水分を担体に吸収させることにより行った。これにより、R-ヒドロキシニトリルリアーゼは、担体に対して物理的に吸着することとなる。
【００３６】
このようにして調製された4種類の固定化酵素を用いて、以下のようなベンズアルデヒドからのR-マンデロニトリルの酵素合成反応を行い、4種類の固定化酵素について特性を評価した。酵素反応は、得られた固定化酵素全量に、反応溶媒としてのメチル-t-ブチルエーテル4199.4mlと、基質としてのベンズアルデヒド508.2μｌ（5mmol）及びシアン化水素（青酸）292.4μｌ（7.5mmol）と添加し、室温で30分間、混合攪拌しながら行った。
【００３７】
反応後の溶液をHPLCにかけ、ベンズアルデヒドの濃度、R-マンデロニトリルの濃度及びS-マンデロニトリルの濃度を測定した。そして、ベンズアルデヒドの濃度から、ベンズアルデヒドの減少率を算出し「転換率」とした。また、R-マンデロニトリルの濃度とS-マンデロニトリルの濃度とから、R-マンデロニトリルの「光学純度」を算出した。4種類の固定化酵素を用いた場合における「転換率」、「光学純度」及び反応系内での固定化酵素の分散状態を観察した結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
表１から判るように、4種類の固定化酵素を用いたR-マンデロニトリルの合成では、高い転換率、光学純度を示している。すなわち、多孔性シリカ系担体であるシリカゲル又は多孔性粘土系焼結担体であるカオリナイト系セラミックを用いた固定化酵素は、従来公知の固定化担体であるセルロース又は珪藻土を用いた固定化酵素と同程度の活性を有していることが判る。
【００４０】
ところが、反応系内における分散状態を比較すると、カオリナイト系セラミックを用いた固定化酵素及びシリカゲルを用いた固定化酵素は、均一に分散していて容易に取扱えるのに対し、セルロース又は珪藻土を用いた固定化酵素は集塊を形成するために不均一に分散しており取扱いが困難である。
以上のように、担体としてカオリナイト系セラミック（多孔性粘土系焼結担体）やシリカゲル（多孔性シリカ系担体）を用いた場合には、取扱い性に優れた固定化酵素を作製できることが判る。
【００４１】
〔実施例３〕R-ヒドロキシニトリルリアーゼ固定化担体の検討２
実施例２で調製した4種類の固定化酵素を用いて、以下のような2-クロロベンズアルデヒドからのR-2-クロロマンデロニトリルの酵素合成反応を行い、4種類の固定化酵素について特性を評価した。酵素反応は、得られた固定化酵素全量に、反応溶媒としてのメチル-t-ブチルエーテル3716.6mlと、基質としての2-クロロベンズアルデヒド844.8μｌ（7mmol）及びシアン化水素（青酸）219.3μｌ（11.25mmol）とを添加し、室温で2時間、混合攪拌しながら行った。
【００４２】
反応後の溶液をHPLCにかけ、2-クロロベンズアルデヒドの濃度、R-2-クロロマンデロニトリルの濃度及びS-2-クロロマンデロニトリルの濃度を測定した。そして、実施例２と同様に「転換率」、「光学純度」及び固定化酵素の分散状態を観察した結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】

【００４４】
表２から判るように、4種類の固定化酵素を用いたR-2-クロロマンデロニトリルの合成は、それぞれ高い転換率を示している。ところが、4種類の固定化酵素について光学純度を比較すると、カオリナイト系セラミックを用いた固定化酵素及びシリカゲルを用いた固定化酵素では、セルロース又は珪藻土を用いた固定化酵素よりも高い光学純度を示していることが判る。また、反応系内における分散状態を比較すると、カオリナイト系セラミックを用いた固定化酵素及びシリカゲルを用いた固定化酵素は均一に分散していて容易に取扱えるのに対し、セルロース又は珪藻土を用いた固定化酵素は集塊を形成するために不均一に分散していて取扱いが困難である。
【００４５】
以上のように、担体としてカオリナイト系セラミック（多孔性粘土系焼結担体）やシリカゲル（多孔性シリカ系担体）を用いた場合には、優れた転換率及び高い光学純度を達成するとともに、取扱い性に優れた固定化酵素を作製できることが判る。
【００４６】
〔実施例４〕R-ヒドロキシニトリルリアーゼ固定化方法の検討
実施例２で調製した固定化酵素のうち、担体としてシリカゲル（商品名CARiACT Q-20、富士シリシア化学社製）を使用したものと、このシリカゲルに対してR-ヒドロキシニトリルリアーゼを化学的に吸着させたものとを比較した。以下、シリカゲルに対してR-ヒドロキシニトリルリアーゼを化学的に吸着させたものを比較例と呼ぶ。
【００４７】
比較例は、Ernst Wehtjeら、Appl. Microbiol. Biotechnol., (1988) 29 : 419-425を参照して調製した。すなわち、先ず、シリカゲルを、5%HNO₃を用いて90℃で1時間洗浄した後に110℃で乾燥させた。次に、pH3.5の10%アミノプロピルトリエトキシシラン溶液をシラン化剤として用いて、10%アミノプロピルトリエトキシシラン溶液にシリカゲルを混合し、75℃で2時間攪拌しながら放置することによって、シリカゲルの表面にアミノ基を導入した。
【００４８】
次に、シリカゲルを水で洗浄し、pH7.0の50mMリン酸緩衝液中に含まれる25mlの2.5%グルタルアルデヒドでシリカゲルを1時間処理した。次に、シリカゲルを水で洗浄し、pH7.0の50mMリン酸緩衝液中で活性化したシリカゲル溶液中に、酵素溶液5mlを添加した。R-ヒドロキシニトリルリアーゼの結合は、酵素溶液添加後4時間で進行し、その後、結合を安定化するために50mgのNa(CN)BH₃を加えた。そして、さらに12時間放置することによって、比較例の固定化酵素を調製した。
【００４９】
実施例２で調製した固定化酵素と比較例の固定化酵素とについて、R-ヒドロキシニトリルリアーゼの吸着率、転換率及び光学純度を測定した。なお、転換率及び光学純度に関しては、実施例２と同様にして測定した。R-ヒドロキシニトリルリアーゼの吸着率は、使用した酵素溶液中の残存活性を測定し、シリカゲル単位量あたりに吸着したR-ヒドロキシニトリルリアーゼ量を算出し、実施例２の固定化酵素の吸着率を100%とした相対値として比較例における吸着率を算出した。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】

【００５１】
この表３から判るように、実施例２の固定化酵素は、比較例の固定化酵素と比較して、R-ヒドロキシニトリルリアーゼの吸着率が優れている。したがって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを担体に物理的に吸着させることによって、R-ヒドロキシニトリルリアーゼのロスを防止することができ、固定化酵素を効率的に調製することができる。
【００５２】
また、表３に示すように、実施例２の固定化酵素は、比較例の固定化酵素と比較して優れた光学活性を示している。このことから、化学的に吸着させた固定化酵素を用いた場合には、酵素活性が低いためにラセミ体生成が頻繁に発生しており、純粋な目的生成物を得ることが困難である。これに対して、実施例２の固定化酵素においては、高純度な光学純度を達成しており、ラセミ体の生成が抑制されている。したがって、実施例２の固定化酵素を用いることによって、より高純度な目的生産物が得られることが判る。
【００５３】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明に係る固定化酵素は、非常に簡便に調製することができるものであり、取扱い性にも優れたものである。また、本発明に係る固定化酵素を用いた場合には、ラセミ体生成反応を抑制することができ、光学的に純粋な生成物を合成することができる。
【００５４】
また、本発明に係る固定化酵素の製造方法は、R-ヒドロキシニトリルリアーゼを物理吸着により所定の担体に対して固定化する方法である。このため、本発明に係る固定化酵素の製造方法によれば、取り扱い性に優れた固定化酵素を非常に簡便に且つ効率的に製造することができる。
さらに、本発明に係る光学活性シアノヒドリンの製造方法は、ラセミ体生成反応を確実に抑制し、光学的に優れた純度で光学活性シアノヒドリンを合成することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immobilized enzyme in which R-hydroxynitrile lyase is immobilized on an immobilization carrier, a method for producing the immobilized enzyme, and a method for producing an optically active cyanohydrin using the immobilized enzyme.
[0002]
[Prior art]
R-hydroxynitrile lyase is known to be useful as an enzyme having an activity of synthesizing optically active cyanohydrin from a cyanide compound and a carbonyl compound. However, R-hydroxynitrile lyase is generally expensive because it is prepared by extraction from plant tissue. Therefore, with regard to R-hydroxynitrile lyase, an efficient method of use, that is, efficiency such as improvement of reaction efficiency and reuse has become an important issue.
[0003]
Until now, as an optically active cyanohydrin synthesis method using R-hydroxynitrile lyase, a method using an immobilized enzyme in which the enzyme is immobilized on an appropriate carrier has been proposed. However, the known enzyme immobilization methods have problems such as poor dispersibility in the reaction system, poor separation between the enzyme and the reaction solution, and a small amount of enzyme immobilization. . For example, in an enzyme reaction using R-hydroxynitrile lyase, an immobilized enzyme in which R-hydroxynitrile lyase is chemically adsorbed on silica gel is known (Ernst Wehtje et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. , (1988) 29: 419-425). This immobilized enzyme is obtained by chemically immobilizing R-hydroxynitrile lyase on the surface of silica gel by treating the surface of silica gel with glutaraldehyde.
[0004]
However, in this immobilized enzyme, complicated pretreatment for activating the surface of silica gel must be performed. For this reason, in order to prepare this immobilized enzyme, a multi-step process is required, and there is a disadvantage that it cannot be easily produced.
[0005]
In addition, as a carrier for immobilizing R-hydroxynitrile lyase, an immobilized enzyme using celite (Wehtje et al., Biotechnol. Bioeng. , (1990) 36: 39-46) and an immobilized enzyme using cellulose (Effenberger et al., Tetrahedron Lett. (1991) 32: 2605-2608) is also known. These immobilized enzymes are physically immobilized R-hydroxynitrile lyases.
[0006]
However, these immobilized enzymes have a small amount of immobilized enzyme, and it was necessary to increase the amount of carrier in order to immobilize the required amount of enzyme. For this reason, the amount of immobilized enzyme occupying in a certain reaction vessel increases, resulting in poor productivity. Furthermore, since the immobilization carrier is extremely fine and hydrophilic, it is used in an organic solvent containing water. In such a case, the moisture in the reaction system is absorbed, the immobilized enzymes are aggregated, and the dispersibility in the reaction system becomes extremely poor. Therefore, this immobilized enzyme has the disadvantage that it is difficult to handle for presenting an irregular shape.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, the present invention provides an immobilized enzyme that can be easily produced, has good reaction efficiency, and is easy to handle, a method for producing the immobilized enzyme, and a method for producing an optically active cyanohydrin using the immobilized enzyme. The purpose is to provide.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors used a porous clay-based sintered support and / or a porous silica-based support as an enzyme immobilization support, and R-hydroxy was used as the support. It has been found that by immobilizing nitrile lyase physically, it is possible to prepare an immobilized enzyme that can be produced very easily and is easy to handle, and the present invention has been completed.
[0009]
That is, the present invention provides a method for physically applying R-hydroxynitrile lyase having an activity of synthesizing an R cyanohydrin from a cyanide compound and a carbonyl compound to a carrier comprising a porous clay-based sintered carrier and / or a porous silica-based carrier. It is an immobilized enzyme characterized by being immobilized by adsorption.
In this immobilized enzyme, the porous clay-based sintered carrier and / or the porous silica-based carrier preferably has pores having a pore diameter of 10 to 200 nm.
[0010]
Furthermore, the present invention provides an R-hydroxynitrile lyase having an activity of synthesizing an R-type cyanohydrin from a cyanide compound and a carbonyl compound as a carrier comprising a porous clay-based sintered support and / or a porous silica-based support. It is a method for producing an immobilized enzyme, wherein the immobilized enzyme is immobilized by adsorption.
[0011]
On the other hand, the present inventors can efficiently disperse the immobilized enzyme in the batch reaction system by using the immobilized enzyme in a water-insoluble or insoluble organic solvent as a reaction solvent, It was found that the immobilized enzyme and the reaction solution can be easily separated after completion of the reaction.
[0012]
That is, the present invention is a method for producing an optically active cyanohydrin, wherein the immobilized enzyme is used when an optically active cyanohydrin is synthesized from a carbonyl compound and a cyanide compound.
In addition, this optically active cyanohydrin production method uses an organic solvent that is hardly soluble or insoluble in water as a solvent, and after completion of the optically active cyanohydrin formation reaction, the reaction solution and the immobilized enzyme are separated, and the immobilized enzyme is re-reacted. Can be used.
[0013]
Furthermore, this optically active cyanohydrin is produced by filling the above-mentioned immobilized enzyme into a packed reactor and continuously supplying the reaction raw material liquid to the packed reactor so that the optically active cyanohydrin is optically active from the packed reactor. Cyanohydrins can be prepared continuously.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the immobilized enzyme according to the present invention, a method for producing the immobilized enzyme, and a method for producing an optically active cyanohydrin using the immobilized enzyme will be described in detail.
The immobilized enzyme of the present invention is obtained by immobilizing R-hydroxynitrile lyase on a porous clay-based sintered carrier and / or a porous silica-based carrier (hereinafter referred to as a carrier) by physical adsorption. This immobilized enzyme is characterized in that it can be easily prepared and is easy to handle than an immobilized enzyme in which R-hydroxynitrile lyase is chemically adsorbed on a silica gel carrier or the like. The immobilized enzyme of the present invention can be produced, for example, as follows.
1. Preparation of R-hydroxynitrile lyase
The R-hydroxynitrile lyase to be immobilized means an enzyme having an activity of synthesizing optically active cyanohydrin from a cyanide compound and a carbonyl compound. Here, the carbonyl compound refers to an aldehyde or a ketone, and specifically represented by the following formula (1).
[0015]
[Chemical 1]

[0016]
In the above formula (1), R ₁ And R ₂ (I) a hydrogen atom, (ii) a substituted or unsubstituted linear or branched saturated alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, or (iii) a substituted or unsubstituted ring member having 5 to 22 It is an aromatic group. However, R ₁ And R ₂ Do not represent hydrogen atoms at the same time.
[0017]
In (ii) above, R ₁ And R ₂ Is a substituted alkyl group, the substituent is one or more amino groups, imino groups, hydroxy groups, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, halogens, carboxyl groups, cycloalkyl groups having 3 to 20 carbon atoms, Or an aromatic group having up to 22 carbon atoms which may be substituted with a heteroatom of N, O, S (wherein the substituent is a cyclic substituent, it is itself one or more halogen atoms). , A hydroxy group, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, or a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms.
[0018]
In the above (iii), the aromatic group may be a heteroaromatic group in which up to 4 ring members are substituted by N, O and / or S. In the case where R1 and R2 are substituted aromatic groups, the substituents are one or more amino groups, imino groups, hydroxy groups, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, allyloxy groups, halogens, carboxyl groups, carbons. It is a linear or branched, saturated or unsaturated alkyl group of up to several 22 (wherein one aromatic group may be substituted with at least two substituents).
[0019]
As cyan compounds, cyanide ions (CN ^- For example, hydrogen cyanide, hydrogen cyanide salts such as sodium cyanide and potassium cyanide, cyanohydrins such as acetone cyanohydrin, and the like.
[0020]
The R-hydroxynitrile lyase is not particularly limited as long as it is an enzyme having an activity of synthesizing an R cyanohydrin from a cyanide compound and a carbonyl compound. For example, almond ( Prunus amygdalus ) Rose family plants, flax ( Linum usitatissimum ) And other leguminous plants such as Phlebodium aureum ) And the like. In addition, as R-hydroxynitrile lyase, a gene recombinant having a gene encoding the enzyme can be prepared using an appropriate host-vector system, and the product produced by the gene recombinant can be used.
[0021]
2. Immobilization of R-hydroxynitrile lyase
(1) R-hydroxynitrile lyase immobilization support
As a carrier for immobilizing R-hydroxynitrile lyase, a porous clay-based sintered carrier and / or a porous silica-based carrier can be used.
[0022]
Porous clay-based sintered carriers are silicate raw materials (for example, kaolinite minerals such as kaolinite, dickite, nacrite, halloysite, pyrophyllite, montmorillonite, montmorillonite, sericite, chlorite, and chlorite. Is a porous carrier obtained by granulating and sintering. Specifically, examples of the porous clay-based sintered carrier include Toyonite200 (manufactured by Toyo Denka Kogyo Co., Ltd.), Toyonite200 S (manufactured by Toyo Denka Kogyo Co., Ltd.), and the like.
[0023]
The porous silica carrier is a high surface area porous carrier formed by agglomeration of silicon dioxide fine particles. Specifically, examples of the porous silica-based carrier include CARiACT Q (manufactured by Fuji Silysia Chemical), Micro Bead Silica Gel (manufactured by Fuji Silysia Chemical), and the like.
[0024]
These carriers are made of a porous inorganic material having pores, and R-hydroxynitrile lyase can be physically adsorbed into the pores. In these carriers, the pore diameter is 10 to 200 nm, preferably 10 to 100 nm. If the pore diameter is less than 10 nm, the carrier may not be able to reliably adsorb R-hydroxynitrile lyase. On the other hand, when the pore diameter exceeds 200 nm, the carrier tends to cause the R-hydroxynitrile lyase to fall off, and there is a possibility that the R-hydroxynitrile lyase cannot be immobilized sufficiently. Therefore, R-hydroxynitrile lyase can be adsorbed reliably and in a sufficient amount by using a carrier having a pore diameter in these ranges.
[0025]
Furthermore, the carrier has a specific surface area of 20 m. ² / g or more is preferable. The specific surface area of the carrier is 20m ² If it is less than / g, there is a possibility that an amount of R-hydroxynitrile lyase sufficient for enzyme reaction cannot be immobilized. Therefore, the specific surface area is 20m ² By using a carrier that is greater than / g, R-hydroxynitrile lyase can be immobilized in a large amount, and an enzyme reaction can be performed with excellent efficiency.
[0026]
Furthermore, the shape of the carrier when used for immobilization is not particularly limited, but it is preferably spherical when producing an immobilized enzyme for a packed reaction tank. In the spherical carrier, the particle size is 10 μm to 5 mm, preferably 50 μm to 2 mm. Here, it is preferable that the particle size distribution is narrow. By using a spherical carrier having a particle size of 10 μm to 5 mm, it is possible to improve the separation workability of the reaction solution and the immobilized enzyme. The pressure loss can be reduced.
[0027]
(2) Immobilization of R-hydroxynitrile lyase on support
Immobilization of R-hydroxynitrile lyase to the carrier can be performed as follows.
That is, after adjusting the solution containing R-hydroxynitrile lyase prepared in 1 above to a pH within a range where the enzyme activity is not impaired, mixing and stirring with the carrier of (1) above, R-hydroxynitrile lyase is obtained. It can be physically adsorbed on a carrier. Specific immobilization methods include a method in which a carrier is added to a solution containing R-hydroxynitrile lyase, mixed and adsorbed for a certain period of time, and then the immobilized enzyme is separated, the amount of water that the carrier can contain, etc. Although the method etc. which fix | immobilize an enzyme by mentioning the solution containing the R-hydroxy nitrile lyase below the quantity are added to a support | carrier and mixed, it is not limited to these methods. Next, after the immobilization treatment, the obtained immobilized enzyme can be separated by filtration or the like. In the state where the immobilized enzyme contains excessive moisture, carriers are aggregated in the reaction solvent during the synthesis of the optically active cyanohydrin, so that the moisture contained in the immobilized enzyme can reach a dispersible level. It is preferable to remove. The removal of water from the immobilized enzyme can be performed by drying under reduced pressure, drying by ventilation, or the like.
[0028]
3. Synthesis of optically active cyanohydrin using the immobilized enzyme of the present invention
Synthesis of optically active cyanohydrin using the immobilized enzyme of the present invention can be performed as follows.
First, the optically active cyanohydrin can be synthesized by adding the immobilized enzyme and reaction substrate obtained in 2 above to the reaction solvent and reacting them at a reaction temperature of 0 to 50 ° C. The reaction time may be appropriately adjusted according to the conversion rate of the substrate, and the optically active cyanohydrin can usually be synthesized by performing the reaction for 10 minutes to 120 hours. After completion of the synthesis reaction, the immobilized enzyme can be recovered and used again for the synthesis of optically active cyanohydrin.
[0029]
The optically active cyanohydrin is prepared by filling the immobilized enzyme obtained in 2 above into a packed reaction apparatus such as a column, and supplying a reaction raw material solution comprising a reaction solvent and a substrate to the packed reaction apparatus. It can also be prepared. In this case, the optically active cyanohydrin can be continuously prepared by continuously supplying the reaction raw material liquid.
[0030]
Here, as the reaction substrate, the above-mentioned carbonyl compound and cyanide compound are used. As a reaction solvent, when a large amount of water is present in the reaction system, the optical purity of the optically active cyanohydrin produced by the enzyme reaction is reduced, the agglutination of the immobilized enzyme occurs, the reaction efficiency is lowered, In the case of using an aldehyde or ketone having a low solubility as a raw material, it is preferable to use a reaction solvent mainly composed of an organic solvent which is hardly soluble or insoluble in water, from the viewpoint of decreasing production efficiency. As such an organic solvent, any organic solvent that does not affect the synthesis reaction of the optically active cyanohydrin by an enzymatic reaction can be used without particular limitation. Physical properties of the raw material aldehyde or ketone used in the synthesis reaction, and the product cyanohydrin can be used. It can select suitably according to a physical property. Specifically, the reaction solvent may be a halogenated aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated hydrocarbon solvent, such as pentane, hexane, toluene, xylene. Methylene chloride, etc .; aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated alcohol solvents which may be halogenated, such as isopropyl alcohol, n-butanol, isobutanol, t- Butanol, hexanol, cyclohexanol, n-amyl alcohol and the like; aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated ether solvents which may be halogenated, such as diethyl ether, di- Propyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, methyl-t-butyl Ethers, etc .; aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated ester solvents which may be halogenated, such as methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, propionic acid Examples thereof include methyl, and these may be used alone or in combination. Moreover, the said solvent can also use what contained or was saturated with water or an aqueous buffer solution.
Subsequently, the produced optically active cyanohydrin can be measured and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.
[0031]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Preparation of R-hydroxynitrile lyase
First, 100 g of a pulverized product obtained by pulverizing almond seeds was dispersed and mixed in 200 ml of acetone and stirred for 2 hours. Then, the acetone solution was filtered and solid content was collect | recovered. After adding 600 g of water to the dried solid and adjusting to pH 7.5 with aqueous ammonia, stirring and mixing were performed overnight to prepare a slurry.
[0032]
Next, this slurry was centrifuged, and the supernatant was recovered. The collected supernatant was adjusted to pH 5.5 and then centrifuged to remove insoluble fractions. Then, the solution obtained by so-called ammonium sulfate precipitation using ammonium sulfate was concentrated to obtain an enzyme solution.
[0033]
The activity of R-hydroxynitrile lyase contained in this enzyme solution was measured as follows. First, benzaldehyde is produced by reacting DL-mandelonitrile as a substrate. At this time, the production rate of benzaldehyde is calculated by measuring the change in absorbance at a wavelength of 249.6 nm. And 1 unit (U: unit) activity of R-hydroxy nitrile lyase was defined as the activity to produce 1 μmol of benzaldehyde in 1 minute. When the activity of R-hydroxynitrile lyase was measured for the obtained enzyme solution, it was 1500 U / ml, and it was found that 25,000 U of R-hydroxynitrile lyase could be recovered by the above preparation.
[0034]
[Example 2] Examination of R-hydroxynitrile lyase immobilization carrier 1
An immobilized enzyme was prepared using the enzyme solution containing R-hydroxynitrile lyase prepared in Example 1. The carrier used for the immobilized enzyme is a kaolinite ceramic (trade name Toyonite 200 S-4, manufactured by Toyo Denka Kogyo Co., Ltd., pore diameter 38 nm, specific surface area 235 m as a porous clay-based sintered carrier. ² / g, average particle diameter 166μm), silica gel as a porous silica carrier (trade name CARiACT Q-20, manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd., pore diameter 20nm, specific surface area 152m ² / g, particle size 75-500 μm) was used. For comparison, an immobilized enzyme using a cellulose carrier (trade name Avicel cellulose microcrystalline, manufactured by E. Merck) and an immobilized enzyme using a diatomaceous earth carrier (trade name Celite No. 545, manufactured by Celite) were also prepared. .
[0035]
When immobilizing R-hydroxynitrile lyase on these carriers, 0.3 ml of the enzyme solution obtained in Example 1 and 0.3 g of various carriers were mixed and stirred to absorb the moisture of the enzyme solution onto the carrier. It was. As a result, the R-hydroxynitrile lyase is physically adsorbed to the carrier.
[0036]
Using the four types of immobilized enzymes thus prepared, the following enzyme synthesis reaction of R-mandelonitrile from benzaldehyde was performed, and the characteristics of the four types of immobilized enzymes were evaluated. For the enzyme reaction, 4199.4 ml of methyl-t-butyl ether as a reaction solvent, 508.2 μl (5 mmol) of benzaldehyde as a substrate and 292.4 μl (7.5 mmol) of hydrogen cyanide (hydrocyanic acid) are added to the total amount of the immobilized enzyme thus obtained. This was carried out at room temperature for 30 minutes with mixing and stirring.
[0037]
The solution after the reaction was subjected to HPLC, and the concentration of benzaldehyde, the concentration of R-mandelonitrile and the concentration of S-mandelonitrile were measured. Then, the reduction rate of benzaldehyde was calculated from the concentration of benzaldehyde and used as the “conversion rate”. The “optical purity” of R-mandelonitrile was calculated from the concentration of R-mandelonitrile and the concentration of S-mandelonitrile. Table 1 shows the results of observation of the “conversion rate”, “optical purity”, and the state of dispersion of the immobilized enzyme in the reaction system when four types of immobilized enzymes were used.
[0038]
[Table 1]

[0039]
As can be seen from Table 1, the synthesis of R-mandelonitrile using four types of immobilized enzymes shows high conversion and optical purity. That is, the immobilized enzyme using silica gel which is a porous silica-based carrier or kaolinite ceramic which is a porous clay-based sintered carrier is an immobilized enzyme using cellulose or diatomaceous earth which is a conventionally known immobilizing carrier. It can be seen that they have similar activity.
[0040]
However, comparing the dispersion state in the reaction system, the immobilized enzyme using kaolinite ceramic and the immobilized enzyme using silica gel are uniformly dispersed and can be easily handled, whereas cellulose or diatomaceous earth is used. The immobilized enzyme used is dispersed unevenly to form agglomerates and is difficult to handle.
As described above, it is understood that when a kaolinite ceramic (porous clay-based sintered carrier) or silica gel (porous silica-based carrier) is used as a carrier, an immobilized enzyme having excellent handling properties can be produced.
[0041]
[Example 3] Examination of R-hydroxynitrile lyase immobilization carrier 2
Using the four types of immobilized enzymes prepared in Example 2, the following enzyme synthesis reaction of R-2-chloromandelonitrile from 2-chlorobenzaldehyde was performed, and the characteristics of the four types of immobilized enzymes were characterized. evaluated. The enzyme reaction was carried out by adding 3716.6 ml of methyl-t-butyl ether as a reaction solvent, 844.8 μl (7 mmol) of 2-chlorobenzaldehyde as a substrate and 219.3 μl (11.25 mmol) of hydrogen cyanide (hydrocyanic acid) to the total amount of the immobilized enzyme obtained. Was added at room temperature for 2 hours with mixing and stirring.
[0042]
The solution after the reaction was subjected to HPLC, and the concentration of 2-chlorobenzaldehyde, the concentration of R-2-chloromandelonitrile, and the concentration of S-2-chloromandelonitrile were measured. The results of observing the “conversion rate”, “optical purity”, and the state of dispersion of the immobilized enzyme as in Example 2 are shown in Table 2.
[0043]
[Table 2]

[0044]
As can be seen from Table 2, the synthesis of R-2-chloromandelonitrile using four types of immobilized enzymes each showed a high conversion rate. However, comparing the optical purity of the four types of immobilized enzymes, the immobilized enzyme using kaolinite ceramic and the immobilized enzyme using silica gel have higher optical purity than the immobilized enzyme using cellulose or diatomaceous earth. You can see that it shows. In addition, when comparing the dispersion state in the reaction system, the immobilized enzyme using kaolinite ceramic and the immobilized enzyme using silica gel are uniformly dispersed and can be handled easily, whereas cellulose or diatomaceous earth is used. The immobilized enzyme that has been dispersed is unevenly distributed to form agglomerates and is difficult to handle.
[0045]
As described above, when kaolinite ceramic (porous clay-based sintered carrier) or silica gel (porous silica-based carrier) is used as the carrier, it achieves excellent conversion and high optical purity and is handled. It can be seen that an immobilized enzyme having excellent properties can be produced.
[0046]
[Example 4] Examination of R-hydroxynitrile lyase immobilization method
Of the immobilized enzymes prepared in Example 2, silica gel (trade name CARiACT Q-20, manufactured by Fuji Silysia Chemical Co., Ltd.) was used as a carrier, and R-hydroxynitrile lyase was chemically adsorbed to this silica gel. We compared it with Hereinafter, a product obtained by chemically adsorbing R-hydroxynitrile lyase to silica gel is referred to as a comparative example.
[0047]
Comparative examples are Ernst Wehtje et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (1988) 29: 419-425. That is, first, silica gel, 5% HNO _Three After washing at 90 ° C. for 1 hour, it was dried at 110 ° C. Next, using a 10% aminopropyltriethoxysilane solution with a pH of 3.5 as a silanizing agent, mixing silica gel with the 10% aminopropyltriethoxysilane solution and leaving it at 75 ° C. with stirring for 2 hours, An amino group was introduced on the surface of the silica gel.
[0048]
Next, the silica gel was washed with water, and the silica gel was treated with 25 ml of 2.5% glutaraldehyde contained in 50 mM phosphate buffer at pH 7.0 for 1 hour. Next, the silica gel was washed with water, and 5 ml of enzyme solution was added to the silica gel solution activated in 50 mM phosphate buffer at pH 7.0. R-hydroxynitrile lyase binding proceeds 4 hours after addition of the enzyme solution, after which 50 mg Na (CN) BH is used to stabilize the binding. _Three Was added. Then, the immobilized enzyme of the comparative example was prepared by leaving it for 12 hours.
[0049]
For the immobilized enzyme prepared in Example 2 and the immobilized enzyme of the comparative example, the adsorption rate, conversion rate and optical purity of R-hydroxynitrile lyase were measured. The conversion rate and optical purity were measured in the same manner as in Example 2. The adsorption rate of R-hydroxynitrile lyase is determined by measuring the residual activity in the enzyme solution used, calculating the amount of R-hydroxynitrile lyase adsorbed per unit amount of silica gel, and calculating the adsorption rate of the immobilized enzyme of Example 2. The adsorption rate in the comparative example was calculated as a relative value of 100%. The results are shown in Table 3.
[0050]
[Table 3]

[0051]
As can be seen from Table 3, the immobilized enzyme of Example 2 is superior in the adsorption rate of R-hydroxynitrile lyase as compared with the immobilized enzyme of Comparative Example. Therefore, by physically adsorbing R-hydroxynitrile lyase to a carrier, loss of R-hydroxynitrile lyase can be prevented, and an immobilized enzyme can be prepared efficiently.
[0052]
In addition, as shown in Table 3, the immobilized enzyme of Example 2 exhibits superior optical activity compared to the immobilized enzyme of the comparative example. Therefore, when a chemically adsorbed immobilized enzyme is used, racemic products are frequently generated due to low enzyme activity, and it is difficult to obtain a pure target product. In contrast, in the immobilized enzyme of Example 2, high optical purity was achieved, and the generation of racemic body was suppressed. Therefore, it can be seen that a higher-purity target product can be obtained by using the immobilized enzyme of Example 2.
[0053]
【The invention's effect】
As described above in detail, the immobilized enzyme according to the present invention can be prepared very simply and has excellent handleability. Further, when the immobilized enzyme according to the present invention is used, the racemic product formation reaction can be suppressed, and an optically pure product can be synthesized.
[0054]
The method for producing an immobilized enzyme according to the present invention is a method for immobilizing R-hydroxynitrile lyase on a predetermined carrier by physical adsorption. For this reason, according to the manufacturing method of the immobilized enzyme which concerns on this invention, the immobilized enzyme excellent in the handleability can be manufactured very simply and efficiently.
Furthermore, the method for producing an optically active cyanohydrin according to the present invention can synthesize an optically active cyanohydrin with an optically excellent purity by reliably suppressing a racemate formation reaction.

Claims

Immobilizing R-hydroxynitrile lyase, which has the activity of synthesizing R cyanohydrin from cyanide and carbonyl compounds, onto a support composed of a porous clay-based sintered support and / or a porous silica-based support by physical adsorption. A method for producing an immobilized enzyme, characterized in that

2. The method for producing an immobilized enzyme according to claim 1, wherein the porous clay-based sintered carrier and / or the porous silica-based carrier has pores having a pore diameter of 10 to 200 nm.

A method for producing an optically active cyanohydrin, comprising using an immobilized enzyme produced by the production method according to claim 1 or 2 when synthesizing an optically active cyanohydrin from a carbonyl compound and a cyanide compound.

The organic solvent insoluble or insoluble in water is used as a reaction solvent, and after completion of the optically active cyanohydrin formation reaction, the reaction solution and the immobilized enzyme are separated, and the immobilized enzyme is reused. The manufacturing method of optically active cyanohydrin of description.