JP3783984B2

JP3783984B2 - Chromatographic continuous separation and chromatograph

Info

Publication number: JP3783984B2
Application number: JP11217197A
Authority: JP
Inventors: 達朗森野; 崇智山本
Original assignee: 第一製薬株式会社
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: JPH10300738A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれている複数の成分をクロマトグラフィーを利用して連続分離する方法に関する。また、本発明は、試料中に含まれている複数の成分を分離するためのクロマトグラフにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体試料中に含まれている複数の成分を分離する方法として、クロマトグラフィーによる分離法が広く用いられている。クロマトグラフィーは一般に回分式で行われるが、これを連続化することが古くからの課題とされている。これまでに代表的な連続分離法として、十字流式分離法と疑似移動層式分離法が開発されて、実際に利用されている。
疑似移動層式分離法は、溶離液と充填剤が擬似的に向流に移動するように設定された分離法である。この方法は、分離すべき成分の分配係数差が約０．３以下であり、充填剤粒子径が約５０μｍ以上である系において行なうのが好ましいとされている（Hashimotoら，6th Conference of the Asia Pacific Confederation of Chemical Engineering, Australia, Official Proceedings Vol.２，３０７−３１２（１９９３））。疑似移動層式分離法は、今日ではとくに多糖を分離する際に有効に利用されている。しかしながら、この方法を実施するためのクロマトグラフは配管群が複雑であることから、医薬品成分のように少量で精密な分画を必要とする場合には利用することができないという問題がある。
【０００３】
十字流式分離法は、Journal of chromatography，７，４７７−４８４（１９６２）に記載される方法や、特開平６−２３２３７号公報に記載されている連続円環式クロマトグラフィー法によって行われている。十字流式分離法は、成分の分配係数差が約０．３以上であり、充填剤粒子径が約５０μｍ以下である系において行なうのが好ましいとされている。この方法には、疑似移動層式分離法のように複雑な系は要求されない。しかしながら、十字流式分離法を実施するためのクロマトグラフは、各カラムの性能が完全に同一であって同じクロマトグラムを描くことを前提にして設計されている。このため、何らかの外乱によってピークにずれが生じると、対応することができないという問題がある。したがって、医薬品成分のように高い純度が要求される成分の分離には、有効に利用することができなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、このような従来技術の問題点を解消し、何らかの外乱によってピークのずれが生じても、精密な分画を連続的に行なうことができるクロマトグラフィー連続分離法を提供することを目的とした。また、本発明は、分離すべき成分の分配係数差や充填剤の粒子径による制約を受けることなく利用することができるクロマトグラフィー連続分離法を提供することも目的とした。さらに、本発明は、そのようなクロマトグラフィー分離法を行なうことができるクロマトグラフを提供することをも目的とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、本発明者らは、カラム出口に設置したバルブと検出器を特定の条件にしたがって連動させることによって、極めて精度の高い分画を連続的に行なうことができることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、並列接続された複数のカラムに試料を導入し、溶出される成分を検出器で検出しながら必要な成分を分離するクロマトグラフィーによる連続分離法において、次の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするクロマトグラフィーによる連続分離方法を提供するものである。
（１）分離すべき成分数と同数の検出器と成分受器を用意し、第１カラム出口から溶出する溶出液が第２成分検出器を経由して第１成分受器に導かれ、第ｍ成分受器に第ｍ＋１成分検出器を経由する溶出液が導かれるように初期設定する工程
（２）試料を第１カラムから順番に時間を遅らせて順次導入し、最後のカラムに導入後さらに第１カラムから順番に試料を導入する操作を繰り返す工程
（３）工程（２）の試料導入開始後に、第ｍ成分検出器に導入されている第ｎカラム溶出液中に第ｍ成分が検出されるごとに、
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導き、
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導く、
操作を繰り返す工程
上記（１）〜（３）の各工程において、ｍは１以上検出器数以下の整数であり、ｍ＋１が検出器数を越える場合はｍ＋１を１とする。ｎは１以上カラム本数以下の整数であり、ｎ＋１がカラムの本数を越える場合はｎ＋１を１とする。
【０００６】
また、本発明は、試料中に含まれている成分を連続分離するためのクロマトグラフであって、
分離すべき成分数と等しい数の検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）、並列に接続した２以上のカラム（１３〜２０）を少なくとも備えており、
各カラムの入口には、溶離液（１）か試料（２）のいずれかを選択的に導入するためのバルブ（５〜１２）が設置されており、
各カラムの出口には、溶出液を検出器（２９、３０）および成分受器（３１、３２）のいずれかに選択的に導くためのバルブ（２１〜２８）が設置されていることを特徴とするクロマトグラフを提供するものでもある。
【０００７】
以下において、まず本発明のクロマトグラフから説明する。
図１は、本発明のクロマトグラフの典型的な構成例を示したものである。このクロマトグラフは、試料中に含まれている２つの成分を分離するための装置である。
本発明のクロマトグラフは、複数のカラム（１３〜２０）で構成されており、各カラムの入口と出口にはそれぞれバルブが設置されている。入口のバルブ（５〜１２）は、溶離液か試料を選択的に導入するために設置されており、例えば図３に示すバルブを使用することができる。図３のバルブをＥ方向に開いてポンプ（３）を稼動させれば、溶離液貯槽（１）内の溶離液がバルブを通ってカラムに導入される。また、図３のバルブをＦ方向に開いてポンプ（４）を稼動させれば、試料貯槽（２）内の試料がバルブを通ってカラムに導入される。
各カラムの出口に設置されるバルブ（２１〜２８）は、カラムからの溶出液を各検出器（２９、３０）および各成分用の受器（３１、３２）のいずれかに選択的に導くために設置されており、例えば図２に示すバルブを使用することができる。カラム出口からの溶出液は、図２のバルブをＡ方向に開けば第２成分検出器（２９）に導かれ、Ｂ方向に開けば第２成分受器（３２）に導かれる。さらに、Ｃ方向に開けば第１成分検出器（３０）に導かれ、Ｄ方向に開けば第１成分受器（３１）に導かれる。
【０００８】
入口と出口にバルブを設置した各カラムは並列に接続する。本明細書において、並列に接続するとは、他のカラムを経由することなく直接試料や溶離液をカラムに導入し、カラムから溶出される溶出液を他のカラムを経由することなく直接検出器や成分受器に導く接続方式をいう。並列接続の方式は特に制限されないが、効率よく安定な分離を行なうためには、すべてのカラムを差別なく同等に接続しておくのが好ましい。また、カラムの形状、容積、材質、厚み、充填剤の種類、粒径および量などについてもとくに制限されないが、これらの条件はすべてのカラムで実質的に同じにしておくのが好ましい。さらに、各カラムの入口に設置されるバルブ（５〜１２）および出口に設置されるバルブ（２１〜２８）も、それぞれ実質的に同じものを用いるのが好ましい。
【０００９】
第２成分検出器（２９）を通る溶出液は、図１に示すように、バルブ（３３）によって第１成分受器（３１）または第２成分受器（３２）のいずれかに選択的に導かれるようにしておくのが好ましい。本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法によって分離を行なうと、第２成分検出器（２９）を通過する成分のほとんどは第１成分であり、第２成分は配管溜り程度に過ぎない。この配管溜りの第２成分が第１成分に混入することが許容される場合には、バルブ（３３）を設置せずに第２成分検出器の出口を直接第１成分受器（３１）に接続したクロマトグラフを用いても問題はない。
同様に、第１成分検出器（３０）を通る溶出液は、バルブ（３４）によって第２成分受器（３２）または第１成分受器（３１）のいずれかに選択的に導かれるようにしておくのが好ましい。
【００１０】
また、本発明のクロマトグラフには、前述の配管溜りを所定の成分受器に導くための洗浄手段が設置されているのが好ましい。たとえば、図１のクロマトグラフでは、第２成分検出器（２９）入口前の配管に溜まった第２成分を主とする溶出液を第２成分受器（３２）に入れるために、バルブ（３３）をＧ方向に開き、バルブ（３５）を開けてポンプ（３７）を稼動させれば洗浄することができるようになっている。こうすることによって、溶離液貯槽（１）内の溶離液が配管に溜まった溶出液を押し出すことができる。同様に、第１成分検出器（３０）入口前の配管に溜まった第１成分を主とする溶出液は、バルブ（３４）をＧ方向に開き、バルブ（３６）を開けてポンプ（３７）を稼動させることによって、第１成分受器（３１）に入れることができる。
【００１１】
図１は、分離すべき成分の数が２つである場合に用いるクロマトグラフを例示したものであるが、分離すべき成分数が３つ以上である場合にも図１と同様の基本構成を有するクロマトグラフを使用することができる。
たとえば、分離すべき成分数が３であるときは、検出器および成分受器を３つにし、カラム出口に設置するバルブの出口数は検出器と成分受器の数を足した値である６にする。分離すべき成分数が４以上の場合も同様にして計算する。なお、検出器出口に設置するバルブの出口数は、分離すべき成分数に関係なく２でよい。
なお、複数の化合物の混合物として分離するときには、その混合物が１つの「分離すべき成分」であるものとして「分離すべき成分数」を計算する。例えば、Ａ成分とＢ成分の混合物とＣ成分を分離する場合は、「分離すべき成分数」は２となり、検出器数および成分受器数も２つでよい。
一方、分離したい成分数は本明細書でいう「分離すべき成分数」に必ずしも一致しない。例えば、Ａ成分とＣ成分の２成分を分離したい場合であっても、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分の順に溶出するために３成分をそれぞれ個別に分離せざるを得ない場合には、「分離すべき成分数」は３になる。
以上の説明における検出器の数やバルブの出口数は、本発明に必要な最小限の数を挙げたものである。クロマトグラフにさらに別の機能をもたせるためにこれらの数を増やしたり、別の目的で追加のカラムを接続したりしても構わない。これらの付加や改変は、当業者が適宜行ない得る。
【００１２】
以下において、本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法について説明する。
本発明の分離法を実施する際には、少なくとも分離すべき成分の数と同じ数の検出器、各成分を含む溶出液を入れるための成分受器、並列接続された複数のカラムから構成されるクロマトグラフを用いる必要がある。クロマトグラフの構成の詳細は、本発明の連続分離法を実施することができるものであれば特に制限されない。好ましいクロマトグラフは、上述の本発明のクロマトグラフである。
本発明の連続分離法を実施する前に、試料中に含まれる成分をあらかじめクロマトグラフィー法によって確認しておくのが好ましい。この予備試験は、本発明の連続分離法を実施するクロマトグラフのカラムと、サイズや充填剤が同じカラムを用いて行なうのが好ましい。また、クロマトグラフのカラムの中から１本を選択して予備試験を行なってもよい。この予備試験によって得られたクロマトグラムに基づいて、分離すべき成分数、試料濃度、試料導入速度、試料導入時間などを好ましい値に適宜設定することができる。
【００１３】
予備試験などによって分離すべき成分数を決定したならば、その成分数と同じ数の検出器と成分受器を用意して初期設定を行なう。各検出器はそれぞれ１種類の成分の溶出開始時間を決定するために用いられる。たとえば、第１成分検出器であれば、溶出液中に第１成分が初めて検出された時点を決定するために使用される。
各検出器を通過した溶出液は、それぞれ検出器が検出しようとしている成分の前に溶出する成分を入れる受器に導かれるようにしておく。たとえば、第１成分、第２成分、第３成分の順に溶出する試料を分離する場合には、第２成分検出器を通過した溶出液が第１成分受器に入り、第３成分検出器を通過した溶出液が第２成分受器に入り、第１成分検出器を通過した溶出液が第３成分受器に入るように配管しておく。また、試料導入前に、最初に試料を導入する第１カラムからの溶出液が第２成分検出器に導かれるように初期設定しておく。
【００１４】
初期設定後、第１カラムから順に、第２カラム、第３カラムへと導入開始時間を遅らせながら試料を導入して行く。最後のカラムへの導入が終わったら、再度第１カラムから導入を繰り返す。各カラムへの試料導入開始時間のずれや、試料導入時間、試料導入速度はとくに制限されない。これらの条件は、望ましい純度を達成できる範囲内で効率よく分離できるように決定するのが望ましい。精度の高い分離を行なうには、これらの条件をすべて一定にし、同種のカラムを用いて行なうのがよい。
試料導入後には溶離液を導入して試料をカラム内で移動させる。溶離液は次の試料導入があるまで流し続けてもよいし、カラム出口から最後の成分が溶出した後にいったん止め、次の試料導入を行なった後に再び流し始めてもよい。好ましいのは、カラムに常に試料または溶離液を交互に導入し、成分のピークが重ならない範囲でそのサイクルを短くする場合である。
【００１５】
とくに好ましいのは、分離に用いるカラムと同じカラムに試料を導入して各成分のピーク時間と分散をあらかじめ求めておき、これらの関数として溶出曲線を描くシミュレーションを行なうことによって、良好な分離を行なうことができる試料導入時間とカラムの本数を求めて分離を行なう場合である。以下に、２成分を分離する場合についてこの方法を具体的に説明する。
まず、予備試験として、導入時間が無視し得る程度の微量の試料をカラムに導入して、第１成分のピーク時間μ₀₁と分散σ₀₁ ²、第２成分のピーク時間μ₀₂と分散σ₀₂ ²を求める。この系において、試料の導入量を増やして試料導入時間がｈになった場合の第１成分のピーク時間μ₁と分散σ₁ ²、第２成分のピーク時間μ₂と分散σ₂ ²は、以下の式で表される（Kubin, M,"Beitrag zur Theorie der Chromatographie", Collect. Czech.Chem.Commun.,30,1104-1118(1965)）。
【数１】
μ₁＝ μ₀₁ ＋ｈ／２
μ₂＝ μ₀₂ ＋ｈ／２
σ₁ ²＝ σ₀₁ ²＋ｈ²／１２
σ₂ ²＝ σ₀₂ ²＋ｈ²／１２
吸光度Ａは、μとσの関数ｆ（μ，σ）であることから、溶出曲線は以下の式で表される。
【数２】
Ａ＝ｆ₁（μ₁，σ₁）＋ｆ₂（μ₂，σ₂）
【００１６】
関数ｆはガウス分布であることから、同じカラムに試料を繰り返して導入した場合の溶出曲線は、以下の式で表される。
【数３】
Ａ＝ Σ｛ｆ₁（μ₁＋ｉＴ，σ₁）＋ｆ₂（μ₂＋ｉＴ，σ₂）｝
（ｉ＝０，１，２，３・・・）
上式において、Ｔは試料導入開始から次の試料導入開始までの時間である。この式を利用してシミュレーションを行なえば、分離後の第１成分と第２成分の純度を予測することができる。成分の純度を許容できる範囲内に維持しながら、可能な限りｈを大きくし、Ｔを小さくすることによって、ｈ_maxとＴ_minを求めることができる。また、Ｔ_min／ｈ_maxによって最低限必要なカラムの本数を求めることもできる（小数点以下繰り上げ）。このようにして求めた試料導入時間ｈ_maxで必要最小限のカラムに順次試料を導入して行けばもっとも効率のよい分離を行なうことができる。
【００１７】
各カラムから排出される溶出液は所定の成分受器に導かれる。その途中で、一部の溶出液に対して検出器による成分の検出がなされる。成分の検出は、溶出液に紫外線等を照射して吸光度を調べることによって行なうのが一般的である。成分の検出法はとくに制限されない。ただし、安定に検出することができない場合には、検出値に対して一次おくれの変換方式を用いるのが好ましい。
検出器が成分の検出を行なうごとに溶出液の流路を変更する。その変更は、以下のａ）およびｂ）にしたがって行う。これらは、第ｍ成分検出器によって第ｎカラムの溶出液内に第ｍ成分が検出された場合について一般化して記載したものである。なお、ｍ＋１が検出器数を越える場合はｍ＋１を１とし、ｎ＋１がカラムの本数を越える場合はｎ＋１を１とする。
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導き、
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導く、
【００１８】
この流路の変更を具体的に説明する。
カラムに導入された試料は、順次第１カラム出口から溶出される。初期設定にしたがって、第１カラムから排出された溶出液は第２成分検出器を経由して第１成分受器に入り、その他のカラムから排出された溶出液は第１成分受器に検出器を経由せずに入る。第１カラムからの第１成分溶出が完了し、第２成分の溶出が始ったところで第２成分検出器が検出を知らせる（ｍ＝２、ｎ＝１）。これに伴って、上記ａ）にしたがって、第１カラム溶出液は第３成分分析器を経由して第２成分受器へと導かれる。また、上記ｂ）にしたがって、第２カラム溶出液が第２成分分析器を経由して第１成分受器へと導かれる。
その後、第２成分分析器と第３成分分析器がそれぞれ成分を検出すると、互いに独立に上記ａ）およびｂ）にしたがって流路の変更を行なう。
仮に第３成分分析器が先に第１カラム溶出液中に第３成分を検出したとすると（ｍ＝３、ｎ＝１）、上記ａ）にしたがって第１カラム溶出液は第４成分検出器を経由して第３成分受器へと導かれる。この段階では、第２カラム溶出液は依然として第２成分検出器に導かれているので、上記ｂ）による流路変更はない。このように、第２カラム溶出液中に第２成分の溶出が検出されるまでは、第１カラム溶出液中に所定の成分が検出されるたびに上記ａ）による流路変更のみがなされることになる。
【００１９】
一方、第３成分分析器が成分を検出する前に、第２成分分析器が第２カラム溶出液中に第２成分の溶出を検出したとすると（ｍ＝２、ｎ＝２）、上記ａ）にしたがって第２カラム溶出液は検出器を経由せずに直接第２成分受器に導かれる。また、上記ｂ）にしたがって第３カラム溶出液が第２成分分析器を経由して第１成分受器へと導かれる。この段階では、第３成分検出器には第１カラム溶出液が導かれ、第２成分分析器には第３カラム溶出液が導かれているが、さらに第２成分分析器が先に第２成分の溶出を検出したとすると（ｍ＝２、ｎ＝３）、上記ａ）にしたがって第３カラム溶出液は検出器を経由せずに直接第２成分受器に導かれ、上記ｂ）にしたがって第４カラム溶出液が第２成分検出器を経由して第１成分受器に導かれる。このように、第１カラム溶出液中に第３成分の溶出が検出されるまでは、第２成分検出器が検出をするたびに上記ａ）の「それ以外の場合」およびｂ）による流路変更がなされることになる。
このように各検出器による成分検出と流路変更は、上記ａ）およびｂ）にしたがって互いに独立に行われる。このような成分検出と流路変更は、検出器やカラムの数の多少にかかわらず同様に行なうことができる。
【００２０】
また、すべての検出器またはカラムを利用した後は、再度最初の検出器またはカラムから利用を始める。たとえば、検出器を３台使用する場合には、３番目の検出器による検出が終了した溶出液は、次に最初の検出器による検出を行なうことになる。こうすることによって、連続的な分離が可能になる。
検出器による検出に伴う流路の変更は、当業者に周知の方法のいずれかを用いて行なうことができる。もっとも簡便で好ましい方法は、バルブによる制御である。例えば、図１に示すクロマトグラフのように、カラム（１３〜２０）出口にバルブ（２１〜２８）を設置しておき、検出器（２９、３０）による検出のたびに所定のバルブが指定された向きになるようにコンピューター制御する方法がある。
【００２１】
なお、本発明の連続分離法を実施するにあたっては、試料を最初に導入したカラムから順番に各成分の溶出が始まる限り、各カラムごとに設定条件を変えてもよい。すなわち、試料を第１カラム、第２カラム、第３カラムの順に導入したときに、第１カラム、第２カラム、第３カラムの順に分離すべき成分の溶出が始るのであれば、各カラムの容積、流速、形状、導入試料の量などを適宜変えてもよい。換言すれば、各カラムの条件は必ずしも統一する必要はなく、成分溶出順に変動がない範囲で条件のばらつきがあっても許容される。許容される条件の範囲は、分離しようとする成分の試料中濃度、溶出時間などによる影響を受けるため、具体的なケースごとに予備試験を行なって決定すべきである。このように、本発明の連続分離法は使用する各カラムの条件を厳密に統一することが必ずしも要求されないことから、突発的な外乱によってクロマトグラムに変動が生じたとしてもその影響を受け難いという特徴を有する。また、厳密性が要求されないことから、本発明を実施するためのクロマトグラフの作製が比較的容易であるという利点もある。また、なお、厳密な分離が要求される場合には、各カラムの条件は統一しておくのが好ましい。
【００２２】
本発明の連続分離法を用いれば、検出器の使用台数を少なくすることができるという利点がある。従来のクロマトグラフでは、カラム出口にそれぞれ検出器を接続して各カラムごとに溶出液の分析をしていたため、カラム本数分の検出器が必要であった。このため、カラムの本数を増やすと処理能力は上がるものの、高価な検出器が多数必要になり、検出器ごとに検出に応じたバルブ制御装置等が必要になるという問題があった。このため、カラム本数を増やすとクロマトグラフが複雑化してコストがかかる反面、カラム本数を減らすと十分な処理能力が得られないというジレンマがあった。
本発明の連続処理方法によれば、カラム本数を増やしても検出器の台数は分離すべき成分数に限られるため、このような問題は生じない。これは、試料導入順に各カラムから成分が溶出するため、成分の溶出が検出されるたびに次に該成分の溶出が予定されているカラム出口に検出器を接続する操作を繰り返しているためである。したがって、本発明の連続分離法には、複雑なクロマトグラフが要求されず、コストも抑制することができるという特徴もある。
【００２３】
また、本発明の連続分離法では、配管溜りによる純度ロスの回避を行なうのが好ましい。
検出器によって成分の検出がなされた時点では、すでにカラム出口から検出器までの配管にはその成分を含む溶出液が入っている。このため、これを放置したまま次のカラム溶出液の検出を始めると、この配管溜りの溶出液が不純物として成分受器に混入してしまう。たとえば、第２成分検出器が第２成分を検出した後に、そのまま次のカラム溶出液を流通させると、配管溜りの第２成分が第１成分受器に流れ込んでしまう。これによる純度低下が許容範囲内であれば問題はないが、できるだけ高い純度で分離することが必要とされている場合には配管溜りを所定の成分受器に導くための洗浄工程を行なう必要がある。また、充填剤の粒子径が小さい場合には、配管溜りの影響を受けやすいので洗浄工程を行なうのが好ましい。
【００２４】
洗浄工程は、所定の成分受器に向かって配管溜りに溶離液を流すことによって行なうことができる。この洗浄用溶離液は、検出器へ向かって流してもよいし、その逆の方向に流してもよい。洗浄用溶離液を検出器に向かって流す場合には、検出器出口にバルブを設置し、洗浄液が所定の成分受器に流れ込むようにしておくのが好ましい。例えば、図１のクロマトグラフを使用する場合には、第２成分検出器（２９）入口前の配管に溜まった第２成分を主とする溶出液を第２成分受器（３２）に入れるために、バルブ（３３）をＧ方向に開き、バルブ（３５）を開けてポンプ（３７）を稼動させればよい。洗浄の時間は、各カラムへの試料導入時間を越えない範囲で設定する。とくに、カラムへの試料導入時間の４割以下にするのが好ましい。
この洗浄工程を行なう場合、上記の流路変更操作ａ）は検出器が成分を検出した時点で行ない、ｂ）は検出器の洗浄が完了した時点で行なう。第ｍ＋１成分検出器が洗浄中である場合は、条件ａ）の「それ以外の場合」に該当する。このようにすることによって、洗浄を組み入れた自動制御が可能になる。本発明の連続分離法にこのような洗浄工程を入れることによって、分離する成分の純度をさらに高めることができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示すクロマトグラフの構成、試料組成、操作条件、操作順序等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下の実施例に示す具体例に制限されるものではない。
本実施例では、図１に示すクロマトグラフを使用して、下記構造を有するフマル酸セモチアジル（Ｒ体）とその光学異性体（Ｓ体）からなるラセミ体を光学分割した（Ｒ体とＳ体の分配係数差１以上）。
【化１】

ラセミ体は４重量％のエタノール溶液として、試料貯槽（２）に入れた。また、１００％エタノールを溶離液とし、溶離液貯槽（１）に入れた。
カラムは、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍの Chiralpak AS （ダイセル化学（株）製：充填剤粒子径１０μｍ）を８本使用した。また、Ｒ体およびＳ体を検出するために、溶出液に３００ｎｍの紫外線を照射してその吸光度変化を測定するように検出器を設定した。
【００２６】
クロマトグラフのカラム入口に設置した各バルブの向きは、バルブ（５）のみＦ方向とし、その他のバルブ（６〜１２）はＥ方向とした。また、カラム出口に設置した各バルブの向きは、バルブ（２１）をＡ方向とし、バルブ（２２〜２８）をＤ方向とした。また、検出器出口に設置したバルブ（３３、３４）の向きはＨ方向とした。また、洗浄用溶離液の流路に設置されたバルブ（３５、３６）は共に閉じておいた。
ポンプ（４）を稼動して試料貯槽（２）中のラセミ体溶液を第１カラム（１３）から順番に０．６ｍｌ／分で導入した。各カラムへの導入時間は２分とした。１本のカラムへの導入が終了した時点で、そのカラムの入口バルブをＥ方向にして溶離液の導入を開始し、同時に次のカラムの入口バルブをＦ方向にしてラセミ体溶液の導入を開始した。このようにして第１カラム（１３）にラセミ体溶液の導入を開始してから１６分後に第８カラム（２０）への導入が完了した。その後も、続けて第１カラム（１３）から同様にラセミ体溶液の導入を継続し、計１時間導入を行なった。その後、全カラムからＲ体およびＳ体が溶出するまで溶離液をカラムに導入し続けた。
【００２７】
カラム出口のバルブ（２１〜２８）の向きは、以下のａ）およびｂ）にしたがって制御した。条件ａ）およびｂ）は、第ｍ成分検出器によって第ｎカラムの溶出液内に第ｍ成分を検出した場合について一般化して記載したものである（第１成分がＲ体、第２成分がＳ体に対応する）。成分を検出した時点でａ）にしたがってバルブを操作し、ただちに検出器の洗浄を開始した。検出器の洗浄が完了した時点で、さらにｂ）にしたがってバルブを操作した。なお、以下のａ）およびｂ）において、ｍ＋１が２を越える場合はｍ＋１を１とし、ｎ＋１が８を越える場合はｎ＋１を１とする。
ａ）第ｍ＋１成分検出器に他のカラムの溶出液が導入されていない場合は、第ｎカラム溶出液を第ｍ＋１成分検出器に導き、それ以外の場合は第ｎカラム溶出液を第ｍ成分受器に導いた。
ｂ）第ｎ＋１カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれていない場合は、第ｎ＋１カラム溶出液を第ｍ成分検出器に導いた。
【００２８】
検出器の洗浄は、成分が検出された時点で溶離液のポンプ（３７）を駆動し、バルブ（３５、３６）を開き、検出器出口のバルブ（３３、３４）をＧ方向にして溶離液を３．６ｍｌ／分で３０秒間流すことによって行なった。洗浄終了時には、ポンプ（３７）を止め、バルブ（３５、３６）を閉じて、検出器出口のバルブ（３３、３４）をＨ方向に戻した。
この方法にしたがって、ラセミ体溶液を１時間カラムに導入し続けた後、溶離液を流すことによってすべてのＲ体およびＳ体の溶出が完了したところで系を止めた。第１成分受器に入っているＲ体の純度と、第２成分受器に入っているＳ体の純度を測定したところ、ともに純度は９９％を越えていた。なお、本明細書でいう純度は、Ｒ体とＳ体の濃度差を、Ｒ体とＳ体の総濃度で割った値である。
また、同じ方法によって、ラセミ体溶液導入時間だけを３時間に延長して分離した場合も、Ｒ体およびＳ体の純度の悪化は認められなかった。
【００２９】
さらに、比較のために、検出器を用いないで、カラムへのラセミ体溶液導入開始から所定の時間が経過するごとにカラム出口のバルブ（２１〜２８）を自動的に切り替える方法を用いて分離を行なった。バルブ（２１〜２８）の切り替えのタイミングは、上記実施例の第１カラムに最初のラセミ体溶液を導入したときの出口バルブ（２１）切り替えのタイミングを採用した。この方法は、図１のクロマトグラフを用いて行ったが、バルブ（３３、３４）は常にＨ方向とし、バルブ（３５、３６）は閉じたままにした。ラセミ体溶液のカラムへの導入条件等は、上記実施例と同じにして１時間分離を行なった。その結果得られたＲ体およびＳ体の純度はともに約９６％であった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のクロマトグラフィーによる連続分離法によれば、外乱による影響を受けることなく、多量の試料を効率よく分離することができる。また、本発明の連続分離法は、成分の分配係数差や充填剤の粒子径による制約を受けることなく利用することができる。さらに、バルブ切り替えに伴って検出器とカラム出口の間に溜まる配管溜りを洗浄して所定の受器に導くことによって、分離される成分の純度をより高めることができる。本発明のクロマトグラフを用いれば、本発明の連続分離法を良好に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクロマトグラフの全体構成を示す概略図である。
【図２】カラム出口に接続されたバルブ（２１〜２８）の概略図である。
【図３】カラム入口に接続されたバルブ（５〜１２）の概略図である。
【図４】検出器出口に接続されたバルブ（３３、３４）の概略図である。
【符号の説明】
１：溶離液貯槽
２：試料貯槽
３、４、３７：ポンプ
５〜１２：バルブ（３方弁：図３参照）
１３〜２０：カラム
２１〜２８：バルブ（５方弁：図２参照）
２９：第２成分検出器
３０：第１成分検出器
３１：第１成分受器
３２：第２成分受器
３３、３４：バルブ（３方弁：図４参照）
３５、３６：開閉バルブ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for continuously separating a plurality of components contained in a sample using chromatography. The present invention also relates to a chromatograph for separating a plurality of components contained in a sample.
[0002]
[Prior art]
A chromatographic separation method is widely used as a method for separating a plurality of components contained in a liquid sample. Chromatography is generally carried out batchwise, but it has long been an issue to make it continuous. So far, as a typical continuous separation method, a cross flow type separation method and a pseudo moving bed type separation method have been developed and actually used.
The pseudo moving bed type separation method is a separation method set so that the eluent and the filler move in a counter-current in a pseudo manner. This method is preferably carried out in a system in which the difference in the distribution coefficient of the components to be separated is about 0.3 or less and the filler particle size is about 50 μm or more (Hashimoto et al., 6th Conference of the Asia). Pacific Confederation of Chemical Engineering, Australia, Official Proceedings Vol. 2, 307-312 (1993)). The simulated moving bed separation method is used effectively today especially when separating polysaccharides. However, since the chromatograph for carrying out this method has a complicated piping group, there is a problem that it cannot be used when precise fractionation is required in a small amount like a pharmaceutical ingredient.
[0003]
Cross-flow separation method, Journal of chromatography,7, 477-484 (1962), and the continuous annular chromatography method described in JP-A-6-23237. The cross-flow separation method is preferably carried out in a system in which the component distribution coefficient difference is about 0.3 or more and the filler particle size is about 50 μm or less. This method does not require a complicated system unlike the pseudo moving bed separation method. However, a chromatograph for carrying out the cross-flow separation method is designed on the assumption that the performance of each column is completely the same and draws the same chromatogram. For this reason, if a peak shifts due to some disturbance, there is a problem that it cannot be dealt with. Therefore, it cannot be effectively used for separation of components that require high purity such as pharmaceutical components.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, the present invention provides a chromatographic continuous separation method capable of solving such problems of the prior art and continuously performing precise fractionation even when a peak shift occurs due to some disturbance. It was aimed. Another object of the present invention is to provide a chromatographic continuous separation method that can be used without being restricted by the difference in distribution coefficient of components to be separated or the particle size of the filler. Furthermore, another object of the present invention is to provide a chromatograph capable of performing such a chromatographic separation method.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent investigations to solve these problems, the present inventors have succeeded in continuously fractionating with extremely high accuracy by linking the valve installed at the column outlet and the detector according to specific conditions. The present invention has been completed.
That is, the present invention provides a chromatographic continuous separation method in which a sample is introduced into a plurality of columns connected in parallel and the components to be eluted are detected by a detector while separating the necessary components. The present invention provides a method for continuous separation by chromatography, comprising:
(1) The same number of detectors and component receivers as the number of components to be separated are prepared, and the eluate eluted from the first column outlet is guided to the first component receiver via the second component detector. Initial setting process so that the eluate passing through the (m + 1) th component detector is guided to the m component receiver.
(2) A step of sequentially introducing the sample in order from the first column with a delay in time, and repeating the operation of introducing the sample in order from the first column after introduction into the last column.
(3) After the start of sample introduction in step (2), every time the m-th component is detected in the n-th column eluate introduced into the m-th component detector,
a) When the eluate of the other column is not introduced into the (m + 1) th component detector, the nth column eluate is guided to the (m + 1) th component detector, otherwise the nth column eluate is used as the mth component detector. Lead to the receiver,
b) When the (n + 1) th column eluate is not guided to any detector, the (n + 1) th column eluate is guided to the mth component detector.
The process of repeating the operation
In each of the above steps (1) to (3), m is an integer of 1 to the number of detectors, and m + 1 is set to 1 when m + 1 exceeds the number of detectors. n is an integer not less than 1 and not more than the number of columns. When n + 1 exceeds the number of columns, n + 1 is set to 1.
[0006]
Further, the present invention is a chromatograph for continuously separating components contained in a sample,
At least a number of detectors (29, 30) and component receivers (31, 32) equal to the number of components to be separated, two or more columns (13-20) connected in parallel,
A valve (5 to 12) for selectively introducing either the eluent (1) or the sample (2) is installed at the inlet of each column.
Valves (21 to 28) for selectively introducing the eluate to either the detector (29, 30) or the component receiver (31, 32) are installed at the outlet of each column. It also provides a chromatograph.
[0007]
In the following, the chromatograph of the present invention will be described first.
FIG. 1 shows a typical configuration example of the chromatograph of the present invention. This chromatograph is an apparatus for separating two components contained in a sample.
The chromatograph of the present invention is composed of a plurality of columns (13 to 20), and valves are respectively installed at the inlet and outlet of each column. The inlet valves (5 to 12) are provided for selectively introducing the eluent or the sample. For example, the valve shown in FIG. 3 can be used. If the valve of FIG. 3 is opened in the E direction and the pump (3) is operated, the eluent in the eluent storage tank (1) is introduced into the column through the valve. 3 is opened in the F direction and the pump (4) is operated, the sample in the sample storage tank (2) is introduced into the column through the valve.
Valves (21 to 28) installed at the outlet of each column selectively guide the eluate from the column to either the detector (29, 30) or the receiver for each component (31, 32). For example, the valve shown in FIG. 2 can be used. The eluate from the column outlet is guided to the second component detector (29) when the valve of FIG. 2 is opened in the A direction, and is guided to the second component receiver (32) when it is opened in the B direction. Further, if it opens in the C direction, it is led to the first component detector (30), and if it opens in the D direction, it is led to the first component receiver (31).
[0008]
Each column with valves at the inlet and outlet is connected in parallel. In this specification, parallel connection means that a sample or an eluent is directly introduced into a column without going through another column, and an eluate eluted from the column is directly put into a detector without going through another column. A connection method that leads to a component receiver. The parallel connection method is not particularly limited, but it is preferable to connect all the columns equally without discrimination in order to perform efficient and stable separation. Further, the shape, volume, material, thickness, type of filler, particle size and amount of the column are not particularly limited, but these conditions are preferably substantially the same for all columns. Furthermore, it is preferable to use substantially the same valves (5 to 12) installed at the inlet of each column and valves (21 to 28) installed at the outlet.
[0009]
As shown in FIG. 1, the eluate passing through the second component detector (29) is selectively sent to either the first component receiver (31) or the second component receiver (32) by the valve (33). It is preferable to be guided. When separation is performed by the continuous separation method by chromatography of the present invention, most of the components that pass through the second component detector (29) are the first components, and the second components are only about the level of the pipes. When the second component of the pipe pool is allowed to enter the first component, the outlet of the second component detector is directly connected to the first component receiver (31) without installing the valve (33). There is no problem using a connected chromatograph.
Similarly, the eluate passing through the first component detector (30) is selectively guided to either the second component receiver (32) or the first component receiver (31) by the valve (34). It is preferable to keep it.
[0010]
Moreover, it is preferable that the chromatograph of the present invention is provided with a cleaning means for guiding the above-mentioned pipe reservoir to a predetermined component receiver. For example, in the chromatograph of FIG. 1, a valve (33) is used to enter the second component receiver (32) into the second component receiver (32) the eluate mainly containing the second component accumulated in the pipe before the second component detector (29). ) In the G direction, the valve (35) is opened, and the pump (37) is operated so that cleaning can be performed. By doing so, the eluent stored in the pipe can be pushed out by the eluent in the eluent storage tank (1). Similarly, the eluate mainly composed of the first component accumulated in the pipe before the inlet of the first component detector (30) opens the valve (34) in the G direction, opens the valve (36), and pumps (37). Can be put into the first component receiver (31).
[0011]
FIG. 1 exemplifies a chromatograph used when the number of components to be separated is two. However, when the number of components to be separated is three or more, the basic configuration similar to FIG. 1 is used. A chromatograph with can be used.
For example, when the number of components to be separated is 3, the number of detectors and component receivers is three, and the number of valve outlets installed at the column outlet is a value obtained by adding the number of detectors and component receivers. To. The same calculation is performed when the number of components to be separated is 4 or more. The number of outlets of the valve installed at the detector outlet may be two regardless of the number of components to be separated.
When the mixture is separated as a mixture of a plurality of compounds, the “number of components to be separated” is calculated assuming that the mixture is one “component to be separated”. For example, when the mixture of component A and component B and component C are separated, the “number of components to be separated” is two, and the number of detectors and the number of component receivers may be two.
On the other hand, the number of components to be separated does not necessarily match the “number of components to be separated” in the present specification. For example, even if it is desired to separate the two components of the A component and the C component, in order to elute the A component, the B component, and the C component in order, the three components must be separated individually. The number of components to be separated is 3.
In the above description, the number of detectors and the number of valve outlets are the minimum numbers necessary for the present invention. These numbers may be increased to give the chromatograph additional functions, or additional columns may be connected for other purposes. These additions and modifications can be appropriately performed by those skilled in the art.
[0012]
Hereinafter, the continuous separation method by chromatography of the present invention will be described.
When carrying out the separation method of the present invention, it comprises at least the same number of detectors as the number of components to be separated, a component receiver for containing an eluate containing each component, and a plurality of columns connected in parallel. It is necessary to use a chromatograph. Details of the configuration of the chromatograph are not particularly limited as long as the continuous separation method of the present invention can be carried out. A preferred chromatograph is the chromatograph of the present invention described above.
Before carrying out the continuous separation method of the present invention, it is preferable to confirm in advance the components contained in the sample by chromatography. This preliminary test is preferably carried out using a column having the same size and packing material as that of the chromatographic column for carrying out the continuous separation method of the present invention. Alternatively, a preliminary test may be performed by selecting one from the chromatographic columns. Based on the chromatogram obtained by this preliminary test, the number of components to be separated, the sample concentration, the sample introduction speed, the sample introduction time, and the like can be appropriately set to preferable values.
[0013]
When the number of components to be separated is determined by a preliminary test or the like, the same number of detectors and component receivers as the number of components are prepared and initial setting is performed. Each detector is used to determine the elution start time of one type of component. For example, if it is a 1st component detector, it will be used in order to determine the time of the 1st component being detected for the first time in an eluate.
The eluate that has passed through each detector is guided to a receiver that contains a component to be eluted before the component to be detected by the detector. For example, when a sample that elutes in the order of the first component, the second component, and the third component is separated, the eluate that has passed through the second component detector enters the first component receiver, and the third component detector is Piping is performed so that the eluate that has passed through enters the second component receiver, and the eluate that has passed through the first component detector enters the third component receiver. Prior to sample introduction, initial setting is performed so that the eluate from the first column into which the sample is first introduced is guided to the second component detector.
[0014]
After the initial setting, the sample is introduced into the second column and the third column in order from the first column while the introduction start time is delayed. When the introduction to the last column is completed, the introduction is repeated from the first column again. There are no particular restrictions on the deviation of the sample introduction start time, the sample introduction time, and the sample introduction speed into each column. These conditions are desirably determined so that separation can be performed efficiently within a range in which a desired purity can be achieved. In order to perform separation with high accuracy, it is preferable to make all these conditions constant and use the same kind of column.
After sample introduction, the eluent is introduced and the sample is moved in the column. The eluent may continue to flow until the next sample is introduced, or may be stopped after the last component is eluted from the column outlet, and may be allowed to flow again after the next sample is introduced. Preferred is when the sample or eluent is always introduced alternately into the column and the cycle is shortened as long as the component peaks do not overlap.
[0015]
It is particularly preferable to perform a good separation by introducing a sample into the same column as the column used for separation, obtaining the peak time and dispersion of each component in advance, and performing a simulation drawing an elution curve as a function of these. This is a case where separation is performed by obtaining the sample introduction time and the number of columns. In the following, this method will be specifically described for the case where two components are separated.
First, as a preliminary test, a very small amount of sample whose introduction time is negligible is introduced into the column, and the peak time μ of the first component is₀₁And variance σ₀₁ ², Peak time of second component μ₀₂And variance σ₀₂ ²Ask for. In this system, the peak time μ of the first component when the amount of sample introduction is increased and the sample introduction time becomes h.₁And variance σ₁ ², Peak time of second component μ₂And variance σ₂ ²Is represented by the following formula (Kubin, M, "Beitrag zur Theorie der Chromatographie", Collect. Czech.Chem.Commun.,301104-1118 (1965)).
[Expression 1]
μ₁= Μ₀₁ + H / 2
μ₂= Μ₀₂ + H / 2
σ₁ ²= Σ₀₁ ²+ H²/ 12
σ₂ ²= Σ₀₂ ²+ H²/ 12
Since the absorbance A is a function f (μ, σ) of μ and σ, the elution curve is expressed by the following equation.
[Expression 2]
A = f₁(Μ₁, Σ₁) + F₂(Μ₂, Σ₂)
[0016]
Since the function f is a Gaussian distribution, an elution curve when a sample is repeatedly introduced into the same column is expressed by the following equation.
[Equation 3]
A = Σ {f₁(Μ₁+ IT, σ₁) + F₂(Μ₂+ IT, σ₂)}
(I = 0, 1, 2, 3 ...)
In the above equation, T is the time from the start of sample introduction to the start of the next sample introduction. If simulation is performed using this equation, the purity of the first component and the second component after separation can be predicted. By increasing h as much as possible and decreasing T while maintaining the purity of the components within an acceptable range, h_maxAnd T_minCan be requested. T_min/ H_maxCan also determine the minimum number of columns required (rounded up after the decimal point). Sample introduction time h thus obtained_maxIn this case, the most efficient separation can be performed by sequentially introducing the sample into the minimum necessary column.
[0017]
The eluate discharged from each column is guided to a predetermined component receiver. In the middle of the process, a component is detected by a detector for a part of the eluate. In general, the component is detected by irradiating the eluate with ultraviolet rays or the like and examining the absorbance. The method for detecting the component is not particularly limited. However, when stable detection cannot be performed, it is preferable to use a first-order conversion method for the detected value.
Every time the detector detects a component, the flow path of the eluate is changed. The change is made according to the following a) and b). These are generalized descriptions for the case where the m-th component is detected in the eluate of the n-th column by the m-th component detector. When m + 1 exceeds the number of detectors, m + 1 is set to 1. When n + 1 exceeds the number of columns, n + 1 is set to 1.
a) When the eluate of the other column is not introduced into the (m + 1) th component detector, the nth column eluate is guided to the (m + 1) th component detector, otherwise the nth column eluate is used as the mth component detector. Lead to the receiver,
b) When the (n + 1) th column eluate is not guided to any detector, the (n + 1) th column eluate is guided to the mth component detector.
[0018]
The change of the flow path will be specifically described.
The sample introduced into the column is sequentially eluted from the first column outlet. According to the initial setting, the eluate discharged from the first column enters the first component receiver via the second component detector, and the eluate discharged from the other columns is detected by the first component receiver. Enter without going through. When elution of the first component from the first column is completed and elution of the second component starts, the second component detector notifies the detection (m = 2, n = 1). Accordingly, the first column eluate is guided to the second component receiver via the third component analyzer in accordance with a) above. Further, according to the above b), the second column eluate is guided to the first component receiver via the second component analyzer.
Thereafter, when the second component analyzer and the third component analyzer detect the respective components, the flow paths are changed independently of each other according to the above a) and b).
If the third component analyzer first detects the third component in the first column eluate (m = 3, n = 1), the first column eluate is the fourth component detector according to a) above. To the third component receiver. At this stage, since the second column eluate is still guided to the second component detector, the flow path is not changed by b). Thus, until the elution of the second component is detected in the second column eluate, only the flow path change in the above a) is performed every time a predetermined component is detected in the first column eluate. It will be.
[0019]
On the other hand, if the second component analyzer detects elution of the second component in the second column eluate before the third component analyzer detects the component (m = 2, n = 2), the above a ), The second column eluate is directly led to the second component receiver without passing through the detector. Further, according to the above b), the third column eluate is led to the first component receiver via the second component analyzer. At this stage, the first column eluate is guided to the third component detector and the third column eluate is guided to the second component analyzer. If the elution of the component is detected (m = 2, n = 3), the third column eluate is led directly to the second component receiver without passing through the detector according to the above a), and to the above b) Accordingly, the fourth column eluate is guided to the first component receiver via the second component detector. Thus, until the elution of the third component in the first column eluate is detected, each time the second component detector detects, the flow path according to “other cases” of a) and b) above Changes will be made.
In this way, component detection and flow path change by each detector are performed independently according to a) and b). Such component detection and flow path change can be similarly performed regardless of the number of detectors and columns.
[0020]
In addition, after all the detectors or columns are used, the use is started again from the first detector or column. For example, when three detectors are used, the eluate that has been detected by the third detector is then detected by the first detector. In this way, continuous separation is possible.
The change of the flow path accompanying detection by the detector can be performed using any method well known to those skilled in the art. The simplest and preferred method is control by a valve. For example, as in the chromatograph shown in FIG. 1, a valve (21-28) is installed at the outlet of the column (13-20), and a predetermined valve is designated for each detection by the detector (29, 30). There is a way to control the computer so that it is in the right direction.
[0021]
In carrying out the continuous separation method of the present invention, the setting conditions may be changed for each column as long as elution of each component starts in order from the column into which the sample is first introduced. That is, when the sample is introduced in the order of the first column, the second column, and the third column, elution of components to be separated in the order of the first column, the second column, and the third column starts. The volume, flow rate, shape, amount of introduced sample, etc. may be appropriately changed. In other words, the conditions of each column do not necessarily need to be unified, and even if there are variations in conditions within a range that does not vary in the order of component elution, it is allowed. Since the range of acceptable conditions is affected by the concentration of the component to be separated in the sample, elution time, etc., it should be determined by conducting preliminary tests for each specific case. Thus, the continuous separation method of the present invention is not necessarily required to strictly unify the conditions of each column to be used, so even if the chromatogram fluctuates due to sudden disturbance, it is hardly affected. Has features. Further, since strictness is not required, there is an advantage that it is relatively easy to prepare a chromatograph for carrying out the present invention. In addition, when strict separation is required, it is preferable to unify the conditions of each column.
[0022]
If the continuous separation method of the present invention is used, there is an advantage that the number of detectors used can be reduced. In the conventional chromatograph, detectors are connected to the column outlets, and the eluate is analyzed for each column. Therefore, detectors for the number of columns are required. For this reason, when the number of columns is increased, the processing capability is increased, but a large number of expensive detectors are required, and there is a problem that a valve control device or the like corresponding to the detection is required for each detector. For this reason, increasing the number of columns complicates the chromatograph and increases costs, but there is a dilemma that if the number of columns is reduced, sufficient processing capacity cannot be obtained.
According to the continuous processing method of the present invention, even if the number of columns is increased, the number of detectors is limited to the number of components to be separated, so such a problem does not occur. This is because components are eluted from each column in the order of sample introduction, and each time an elution of a component is detected, the operation of connecting a detector to the column outlet where the elution of the component is scheduled next is repeated. is there. Therefore, the continuous separation method of the present invention is characterized in that a complicated chromatograph is not required and the cost can be suppressed.
[0023]
Further, in the continuous separation method of the present invention, it is preferable to avoid a loss of purity due to a pipe pool.
When a component is detected by the detector, the eluate containing the component is already contained in the pipe from the column outlet to the detector. For this reason, if the detection of the next column eluate is started while this is left unattended, the eluate in this pipe pool will be mixed into the component receiver as an impurity. For example, if the next column eluate is circulated as it is after the second component detector detects the second component, the second component in the pipe pool flows into the first component receiver. There is no problem as long as the deterioration in purity is within an allowable range, but when it is necessary to separate the pipe with a purity as high as possible, it is necessary to perform a cleaning process for guiding the pipe reservoir to a predetermined component receiver. is there. In addition, when the particle size of the filler is small, it is preferable to perform the washing step because it is easily affected by the piping pool.
[0024]
The washing step can be performed by flowing an eluent through a pipe reservoir toward a predetermined component receiver. The washing eluent may flow toward the detector or in the opposite direction. When the washing eluent is allowed to flow toward the detector, a valve is preferably provided at the detector outlet so that the washing liquid flows into a predetermined component receiver. For example, when the chromatograph of FIG. 1 is used, in order to put the eluate mainly composed of the second component collected in the pipe before the entrance of the second component detector (29) into the second component receiver (32). The valve (33) is opened in the G direction, the valve (35) is opened, and the pump (37) is operated. The washing time is set in a range not exceeding the sample introduction time to each column. In particular, it is preferable to set it to 40% or less of the sample introduction time to the column.
When this washing step is performed, the flow path changing operation a) is performed when the detector detects a component, and b) is performed when the detector is completely cleaned. When the (m + 1) th component detector is being cleaned, it corresponds to the “other case” of the condition a). In this way, automatic control incorporating cleaning is possible. By including such a washing step in the continuous separation method of the present invention, the purity of the components to be separated can be further increased.
[0025]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The configuration of the chromatograph, the sample composition, the operating conditions, the operating sequence, and the like shown in the following examples can be appropriately changed without departing from the spirit of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the specific examples shown in the following examples.
In this example, the chromatogram shown in FIG. 1 was used to optically resolve a racemate consisting of cemotiazyl fumarate (R-form) having the following structure and its optical isomer (S-form) (R-form and S-form). Distribution coefficient difference of 1 or more).
[Chemical 1]

The racemate was placed in the sample reservoir (2) as a 4 wt% ethanol solution. Further, 100% ethanol was used as an eluent, and it was put in an eluent storage tank (1).
As the column, eight Chiralpak AS (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd .: filler particle diameter 10 μm) having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 250 mm were used. In addition, in order to detect R-form and S-form, a detector was set to measure the change in absorbance by irradiating the eluate with 300 nm ultraviolet rays.
[0026]
The direction of each valve installed at the column inlet of the chromatograph was the F direction only for the valve (5), and the other valves (6 to 12) were the E direction. Moreover, the direction of each valve | bulb installed in the column exit made the valve | bulb (21) into the A direction, and made the valves (22-28) into the D direction. The direction of the valves (33, 34) installed at the detector outlet was the H direction. The valves (35, 36) installed in the flow path for the washing eluent were both closed.
The pump (4) was operated and the racemic solution in the sample storage tank (2) was introduced from the first column (13) in order at 0.6 ml / min. The introduction time to each column was 2 minutes. When the introduction to one column is completed, the eluent introduction is started with the inlet valve of that column in the E direction, and the introduction of the racemic solution is started simultaneously with the inlet valve of the next column in the F direction. did. In this way, the introduction into the eighth column (20) was completed 16 minutes after the introduction of the racemic solution into the first column (13) was started. Thereafter, the racemic solution was continuously introduced from the first column (13) in the same manner, and the introduction was conducted for a total of 1 hour. Thereafter, the eluent was continuously introduced into the column until R-form and S-form were eluted from all columns.
[0027]
The direction of the column outlet valves (21-28) was controlled according to the following a) and b). Conditions a) and b) are generalized descriptions for the case where the m-th component is detected in the eluate of the n-th column by the m-th component detector (the first component is R-form and the second component is Corresponding to S). When the components were detected, the valve was operated according to a), and the detector cleaning was started immediately. When the cleaning of the detector was completed, the valve was further operated according to b). In the following a) and b), when m + 1 exceeds 2, m + 1 is set to 1, and when n + 1 exceeds 8, n + 1 is set to 1.
a) When the eluate of the other column is not introduced into the (m + 1) th component detector, the nth column eluate is led to the (m + 1) th component detector, and otherwise, the nth column eluate is used as the mth component. Led to the receiver.
b) When the (n + 1) th column eluate was not introduced to any detector, the (n + 1) th column eluate was introduced to the mth component detector.
[0028]
When the components are detected, the eluent pump (37) is driven, the valves (35, 36) are opened, the detector outlet valves (33, 34) are set in the G direction, and the detector is washed. Was run for 30 seconds at 3.6 ml / min. At the end of washing, the pump (37) was stopped, the valves (35, 36) were closed, and the detector outlet valves (33, 34) were returned to the H direction.
According to this method, the racemic solution was continuously introduced to the column for 1 hour, and then the system was stopped when elution of all the R-form and S-form was completed by flowing the eluent. When the purity of the R-form contained in the first component receiver and the purity of the S-form contained in the second component receiver were measured, both purity exceeded 99%. The purity in the present specification is a value obtained by dividing the concentration difference between the R and S isomers by the total concentration of the R and S isomers.
Further, when the racemate solution introduction time was extended to 3 hours by the same method, the purity of the R and S forms was not deteriorated.
[0029]
Furthermore, for comparison, separation is performed using a method in which the valve (21 to 28) at the column outlet is automatically switched every time a predetermined time elapses from the start of the introduction of the racemic solution into the column without using a detector. Was done. The timing for switching the valves (21 to 28) was the timing for switching the outlet valve (21) when the first racemic solution was introduced into the first column of the above example. This method was performed using the chromatograph of FIG. 1, but the valves (33, 34) were always in the H direction and the valves (35, 36) were kept closed. The conditions for introducing the racemic solution into the column were the same as in the above example, and the separation was performed for 1 hour. As a result, the purity of the R and S isomers obtained was about 96%.
[0030]
【The invention's effect】
According to the continuous separation method by chromatography of the present invention, a large amount of samples can be efficiently separated without being affected by disturbance. In addition, the continuous separation method of the present invention can be used without being restricted by the difference in the distribution coefficient of the components and the particle size of the filler. Furthermore, the purity of the components to be separated can be further increased by washing the pipe pool accumulated between the detector and the column outlet as the valve is switched and guiding it to a predetermined receiver. If the chromatograph of this invention is used, the continuous separation method of this invention can be implemented favorably.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a chromatograph of the present invention.
FIG. 2 is a schematic view of valves (21-28) connected to the column outlet.
FIG. 3 is a schematic view of valves (5-12) connected to the column inlet.
FIG. 4 is a schematic view of valves (33, 34) connected to the detector outlet.
[Explanation of symbols]
1: Eluent storage tank
2: Sample storage tank
3, 4, 37: Pump
5-12: Valve (3-way valve: see Fig. 3)
13-20: Column
21 to 28: Valve (5-way valve: see Fig. 2)
29: Second component detector
30: First component detector
31: First component receiver
32: Second component receiver
33, 34: Valve (3-way valve: see Fig. 4)
35, 36: Open / close valve

Claims

The following steps (1) to (3) are included in a chromatographic continuous separation method in which samples are introduced into a plurality of columns connected in parallel, and the components to be eluted are detected by a detector and the necessary components are separated. A continuous separation method by chromatography characterized by the above.
(1) The same number of detectors and component receivers as the number of components to be separated are prepared, and the eluate eluted from the first column outlet is guided to the first component receiver via the second component detector. Step of initial setting so that the eluate passing through the (m + 1) -th component detector is guided to the m-component receiver (2) The sample is sequentially introduced from the first column with a delay in order, and further introduced into the last column. Step (3) Repeating the operation of introducing the sample in order from the first column After the start of sample introduction in step (2), the m-th component is detected in the n-th column eluate introduced into the m-th component detector. Every time
a) When the eluate of the other column is not introduced into the (m + 1) th component detector, the nth column eluate is led to the (m + 1) th component detector, and otherwise, the nth column eluate is used as the mth component. Lead to the receiver,
b) When the (n + 1) th column eluate is not guided to any detector, the (n + 1) th column eluate is guided to the mth component detector.
In each of the steps of repeating the operation ((1) to (3), m is an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to the number of detectors, and when m + 1 exceeds the number of detectors, m + 1 is set to 1. n is greater than or equal to 1 column. (It is an integer equal to or less than the number. If n + 1 exceeds the number of columns, n + 1 is set to 1.)

2. The continuous separation method according to claim 1, wherein the sample introduction start time into each column in the step (1) is delayed at regular intervals.

The continuous separation method according to claim 1 or 2, wherein the sample introduction time into each column in step (1) is unified to a certain length.

The continuous separation according to any one of claims 1 to 3, wherein the step (3) b) is performed after the pipe reservoir between the n-th column outlet and the m-th component detector is guided to the m-th component receiver. Law.

5. The continuous separation method according to claim 4, wherein the pipe reservoir is guided to the m-th component receiver by flowing an eluent.

6. The continuous separation method according to claim 5, wherein the time for flowing the eluent to guide the pipe reservoir to the (m + 1) th component receiver is 40% or less of the sample introduction time to each column in step (1).

7. The continuous separation method according to claim 1, wherein the number of components to be separated is 2, 3 or 4.

A chromatograph for continuously separating components contained in a sample,
At least a number of detectors (29, 30) and component receivers (31, 32) equal to the number of components to be separated, two or more columns (13-20) connected in parallel,
A valve (5 to 12) for selectively introducing either the eluent (1) or the sample (2) is installed at the inlet of each column.
Valves (21 to 28) for selectively introducing the eluate to either the detector (29, 30) or the component receiver (31, 32) are installed at the outlet of each column. A chromatograph.

A valve (33, 34) for selectively introducing the eluate to any one of the component receivers (31, 32) is installed at the outlet of the detector (29, 30). 8 chromatograph.

The chromatograph according to claim 9, further comprising means for guiding an eluate accumulated in a pipe from the valve to the detector in accordance with switching of the valve installed at the column outlet to a predetermined component receiver.

11. The chromatograph according to claim 10, further comprising means for introducing the eluent into the pipe to guide the eluate accumulated in the pipe to a predetermined component receiver.

The chromatograph according to any one of claims 8 to 11, wherein the number of components to be separated is 2, 3 or 4.