JP3783790B2

JP3783790B2 - Laser microscope

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Publication number: JP3783790B2
Application number: JP29503395A
Authority: JP
Inventors: 秀之南; 久奥川
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: JPH09138353A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザービームを標本に照射してスキャニングを行い、標本からの光をコンピュータ処理して標本の映像をモニターするレーザー顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
今日、レーザー出力装置からのレーザービームを標本などの試料に照射し、標本からの光を光電子増倍管などの光電変換手段により輝度信号とし、この輝度信号をレーザービームのスキャニングタイミングと合わせて映像信号を形成し、この映像信号によりモニター装置のテレビ画面などに標本の映像を映し出すレーザー顕微鏡が使用されている。
【０００３】
このレーザー顕微鏡は、図１０に示すように、レーザー照射手段11とするレーザー出力装置12からのレーザービームを調光フィルタ部13のフィルタを通すことによりレーザービームのビーム強度を調整してレーザー照射手段11から出力するレーザービームの強度を設定し、このレーザー照射手段11から出力されたレーザービームをビームスプリッタ15を通した後、スキャナー17によりＸ方向及びＹ方向に振動させて標本21を走査するようにレーザービームの方向を制御しつつ対物レンズ19を通してレーザービームを標本21に照射するものである。そして、標本21からの光は、前記対物レンズ19及びスキャナー17を通してビームスプリッタ15に戻し、ビームスプリッタ15により照射光であるレーザービームと分離して光電子増倍管28に標本21からの光を送り、光電変換手段27としての光電子増倍管28で受光量に応じた輝度信号に変換し、画像処理装置31によりこの輝度信号をレーザービームの標本21への照射位置に合わせたＸＹ座標の各点の輝度として映像信号を形成してモニター装置33の画面に標本21の映像を映し出すものである。
【０００４】
尚、前記ＸＹスキャナー17は、スキャナー制御装置18により一定周期でＸ軸ミラーやＹ軸ミラーの各振動が制御されるものであり、スキャナー制御装置18は、ＸＹスキャナー17にＸ軸ミラー制御信号及びＹ軸ミラー制御信号を出力すると共に、このＸ軸ミラー制御信号とＹ軸ミラー制御信号とにあわせた座標基準信号を画像処理装置31に出力するものである。そして、画像処理装置31は、スキャナー制御装置18からの座標基準信号により標本21を走査するレーザービームのＸ座標及びＹ座標を算出し、光電変換手段27としての光電子増倍管28からの輝度信号をＸＹ座標に合わせてフレームメモリなどに記録することにより２次元の映像を形成する画像データとし、この画像データをＮＴＳＣ規格などに合わせて読み出すことにより映像信号を形成しているものである。
【０００５】
そして、このレーザー顕微鏡では、前述のように調光フィルタ部13のうちの使用するフィルタを切り換えることにより透過率の異なるフィルタを組み合わせて通過するレーザービームの強度を定め、レーザー出力装置12から照射される一定強度のレーザービームの強度を調光フィルタ部13を通過させることによりその強度を多段階に調整して標本21に照射するものである。又、近年では、レーザー出力装置12から照射するレーザービームの強度を調整可能としたものがある。
【０００６】
このように、レーザー出力装置12からの出力調整及び調光フィルタ部13による透過率の調整により、レーザー照射手段11から出力するレーザービームのビーム強度を調整して標本21とした試料の受光量を決定し、レーザービームの照射により標本21の変質や劣化を少なくしつつ、極力多くのレーザービームを照射して試料から多くの光を発光させ、明るい映像を得るようにしている。
【０００７】
更に、標本21からの光をビームスプリッタ15によりレーザービームと分離した後、光電子増倍管28に入力するに際して、ピンホール25を通過させることにより余分な光を遮断して鮮明な画像を得るようにすると共に、増倍管用電源装置29により光電子増倍管28に印加する印加電圧を調整し、光電子増倍管28の増幅率を調整して明るい画像を得るようにしている。
【０００８】
尚、調光フィルタ部13は、透過率の異なるフィルタに切り換えるようにしてレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度を定めるに際し、手動によりフィルタを切り換えてレーザービームのビーム強度を調整するもののほか、フィルタ切換え制御装置14に設けたスイッチの操作などにより、調光フィルタ部13おけるフィルタの切り換えを電動モーターにより行う電動式の調光フィルタが用いられることもある。又、ピンホール25も、その径を切り換えることを可能とし、ピンホール25の径を異なる径に変更するに際して手動式とするものと電動式とするものとがある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、レーザー顕微鏡では、主としてレーザー照射手段に組み込む調光フィルタ部により標本へのレーザービームの強度を調整し、ピンホールにより光電変換手段とした光電子増倍管への入射光量を調整し、光電子増倍管への印加電圧により光電子増倍管の増幅率を調整している。
【００１０】
そして、標本を観察するには、具体的な標本や試料によって個々にその像のコントラストが異なり、特に蛍光標本では、使用する蛍光色素や試料への染色方法の違いによって像コントラストが大きく異なるものである。従って、標本に応じてレーザー照射手段におけるフィルタの選択や光電変換手段とした光電子増倍管に印加する電圧の決定、及び、使用するピンホールの径の決定を行わなければならず、標本に応じて明るく鮮明な画像得るための調整に手数や労力を要する欠点があった。
【００１１】
又、手動式又は電動式の調光フィルタを調整して強いレーザービームを標本に照射すれば、標本から多くの蛍光など光を発光させることができるも、標本にダメージを与える危険性があり、標本によっては強いレーザービームの照射を避けなければならない場合がある。そして、光電子増倍管への印加電圧による増幅率の調整は、印加電圧を大きくすると画像を明るくできるも、ノイズが発生して画像が見辛くなる欠点がある。更に、手動式又は電動式のピンホールを用いることによりピンホール径を可変としたレーザー顕微鏡において、ピンホールの径を調整するに際しては、ピンホール径を小さくすると鮮明な画像をモニター装置の画面に映し出すことができるも、ピンホール径が小さくなると画像が暗くなり、又、ピンホール径を大きくすると画面を明るくできるも、画像が不鮮明になる欠点がある。従って、標本からの光量及び増幅率に合わせてピンホール径の調整を行わなければならなかった。
【００１２】
このため、標本の耐久性や染色方法に合わせてレーザー照射手段におけるフィルタの選択によるビーム強度の設定や、光電子増倍管への印加電圧の決定による光電変換手段における増幅率の設定、更にピンホール径の決定による光電変換手段の受光量調整など、複数の設定調整を行って標本の映像データを得るに際し、標本の損傷を極力少なくしつつ鮮明な画像を得るように配慮してフィルタの選択や印加電圧などの調整を行わなければならず、レーザー顕微鏡の調整設定に慣れていなければこの調整に手数と時間とを要することとなり、標本の分析を行うに際して顕微鏡の操作に多大な労力と時間とを費やすことになる欠点があった。
【００１３】
又、レーザー顕微鏡によっては、試料にレーザービームを照射して１回の走査を行い、１フレームの画像データをフレームメモリに記憶するのに数十秒乃至数分の時間を要するものがあり、ビーム強度の変更や光電変換手段の増幅率の修正を行って新たに画像データを形成するには多くの時間を必要とし、更に、試料にレーザービームを照射することを繰り返すために、試料によっては変質や劣化などのダメージを与え、正確な検査の判断を行うことが困難となることもあった。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、レーザー照射手段と、レーザー照射手段から出力されたレーザービームを振ることにより蛍光標本を二次元走査するスキャナーと、蛍光標本から出た光を受光して輝度信号に変換し、輝度信号の増幅率を調整する増幅率調整装置を有する光電変換手段と、光電変換手段が出力する輝度信号により映像信号を形成する画像処理装置とを備えたレーザー顕微鏡において、前記レーザービームのビーム強度を調整するレーザービーム調整装置と、前記光電変換手段からの前記輝度信号が所定の値、又は所定の範囲内となるように、前記レーザー照射手段が出力するレーザービームのビーム強度と、前記光電変換手段が出力する輝度信号の増幅率との関係が設定された関数テーブルを記憶し、この関数テーブルに基づき、前記レーザービームのビーム強度を設定する強度制御信号と前記輝度信号の増幅率を決定する増幅率制御信号とを出力し、前記レーザー調整装置と前記光電変換手段の増幅率調整装置とを制御する自動調光装置を設けることとする。
【００１５】
このように、レーザー調整装置や光電変換手段の増幅率調整装置を制御するする自動調光装置であってレーザービーム調整装置や輝度信号の増幅率との関係が設定された関数テーブルを記憶する自動調光装置を設ける故、レーザービームの強度設定や光電変換手段における増幅率の決定制御などを自動化することができ、標準的な標本像を自動的に形成して標本の分析調査を容易に行うことを可能とすることができる。
又、請求項２に記載した発明のは、標本により異なる発光率について、発光率が異なる場合にも一定の輝度信号とするためのビーム強度と増幅率との関数テーブルを記憶させ、この関数テーブルにより輝度信号の値が設定値となるように標本の発光率に応じてビーム強度と増幅率とを算出して強度制御信号及び増幅制御信号を出力させる自動調光装置を設けるレーザー顕微鏡とするものである。
【００１６】
このように、発光率の異なる標本においても一定の輝度の標本像を得るための発光率とビーム強度と増幅率との関数テーブルを記憶した自動調光装置とすれば、一定の輝度の画像を形成するためのレーザー照射手段が出力するレーザービームの強度の決定と光電変換手段における増幅率の決定とを容易に自動化でき、標準的な明るさと鮮明度とを有する画像を容易に得ることができる。又、標準的な明るさの画像に基づき、レーザービームの照射強度の修正、又は、光電変換手段における増幅率の修正変更などを行うことにより、容易に標本の検査に最適な画像データをも容易に得ることができる。
【００１７】
更に、請求項３に記載した発明は、自動調光装置に記憶させる関数テーブルとして、標準設定の関数テーブルの他、退色防止優先モードの関数テーブルやノイズ防止優先モードの関数テーブルなど、複数の関数テーブルを記憶させるものである。
このように、複数の関数テーブルを記憶させておけば、試料に合わせた関数テーブルを使用することにより、試料に与えるダメージを少なくしつつ明るく比較的鮮明な標準画像を得ることができる。
【００１８】
又、請求項４に記載した発明は、退色防止優先モードの関数テーブルとして、標準設定の関数テーブルに比較して、同一の発光率の標本に関して同一の値となる輝度信号を得るための増幅率とビーム強度につき、光電変換手段の増幅率を大きくしてレーザービームの照射強度を低くした関数の関数テーブルとするものであり、又、ノイズ防止優先モードの関数テーブルは、標準設定の関数テーブルに比較して、同一の発光率の標本に関して同一の値となる輝度信号を得るための光電変換手段の増幅率を小さくしてレーザービームの照射強度を強くした関数の関数テーブルとするものである。
【００１９】
このように、予め標準設定の関数テーブルの他、退色防止優先モードの関数テーブルやノイズ防止優先モードの関数テーブルなどを記憶させておけば、関数テーブルを切り換えることによりレーザービームにより変質劣化しやすい試料では退色防止優先モードを選択して試料に損傷を余り与えることなく標準的な明るさの映像を得ることができ、又、レーザービームにより劣化し難い試料は、ノイズ防止優先モードを選択して比較的鮮明な映像の画像データを標準的に得ることができる。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るレーザー顕微鏡は、図１に示すように、調光フィルタ部13やフィルタ切換え制御装置14で構成した電動式調光フィルタとレーザー出力装置12とを組み合わせたレーザー照射手段11からのレーザービームをビームスプリッタ15やＸＹスキャナー17、及び、対物レンズ19を介して標本21に照射し、標本21から発せられた光を対物レンズ19及びＸＹスキャナー17を介してビームスプリッタ15に戻し、更にこの光をピンホール25を介して光電変換手段27とした光電子増倍管28に入力し、光電子増倍管28から出力される輝度信号とスキャナー制御装置18からの座標基準信号とに基づいて画像処理装置31により映像信号を形成することは従来のレーザー顕微鏡と同様である。
【００２４】
尚、光電変換手段27は、光電子増倍管28及び増倍管用電源装置29で構成し、増倍管用電源装置29により光電子増倍管28に印加する電圧を調整して光電子増倍管28の増幅率を調整することや、画像処理装置31によりフレームメモリなどを用いて形成した映像信号に基づいて、適宜、モニター装置33により標本21の映像を観察し得るようにすることも従来と同様である。
【００２５】
又、この顕微鏡の電動式調光フィルタは、フィルタ切換え制御装置14により使用するフィルタをセンサーで検出しつつフィルタ切換信号を調光フィルタ部13に出力してフィルタを切り換えるものとしている。即ち、フィルタを切り換えることによりビーム透過率を選択決定し、使用するフィルタの確認を行いつつフィルタの切り換え制御を行ってレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度を調整し得る顕微鏡としているものである。更に、ピンホール25も電動式とし、ホール径制御装置26により光電子増倍管28に入射する光量を調整するピンホール25の径を切り換えることのできる顕微鏡としているものである。
【００２６】
そして、このレーザー顕微鏡は、レーザー照射手段11におけるフィルタ切換え制御装置14を制御し、又、ピンホール25のホール径制御装置26、及び、光電変換手段27における増倍管用電源装置29を制御する自動調光装置35を更に有するものである。
この自動調光装置35は、コンピュータを使用し、画像処理装置31から映像信号をサンプル信号として読み込み、このサンプル信号の輝度平均値である検出輝度が所定値となるように、輝度情報とするサンプル信号に基づいてレーザー照射手段11のフィルタ切換え制御装置14に強度制御信号を出力して調光フィルタ部13のフィルタを切り換えさせ、且つ、光電変換手段27の増倍管用電源装置29に増幅制御信号を出力して増倍管用電源装置29を制御し、以て光電子増倍管28に印加する電圧を定めるものである。又、ホール径制御装置26にピンホール制御信号を出力してホール径制御装置26も制御し、ピンホール25の径を決定することも可能としているものである。
【００２７】
尚、この自動調光装置35に輝度情報を画像処理装置31から入力するに際しては、フレームメモリなどに記憶され、モニター装置33の画面に映し出す画像全体の映像信号を入力し、この映像信号の全平均値を求めて検出輝度とする場合の他、画面中央部分の輝度平均値を検出輝度とする場合や、得られた映像信号の内の最大値を検出輝度とする場合、更に、画面中央部分や又は画面上の輝度の高い部分などに重みを加重して画面全体の平均値を算出して検出輝度とする場合などがある。
【００２８】
そしてこの自動調光装置35は、予め一定の検出輝度が得られる条件を登録しておくものであり、一定強度のレーザービームが照射されたときの発光量、即ち発光率の異なる複数の試験標本（例えば、レーザービームの照射により蛍光を発するガラスプレートなど）を用い、図２に示すように、発光率が１５の試験標本で光電子増倍管28から出力される輝度信号が一定の輝度となるレーザービームの照射強度と光電子増倍管28への印加電圧との関係を記憶させ、同様に発光率が２０や２５など、種々の発光率により一定の輝度となる標本へのレーザービームの照射強度と光電子増倍管28への印加電圧との関係を特性関数テーブルとして記憶させるものである。
【００２９】
この関係としては、発光率の低い標本21では、所定の検出輝度、即ち光電変換手段27とした光電子増倍管28が一定の値の輝度信号を出力するためには、標本21に照射するレーザービームのビーム強度を強くし、且つ、光電子増倍管28に印加する電圧として高い印加電圧が必要となり、又、発光率の高い標本21では、低いビーム強度と光電子増倍管28への低い印加電圧で足りるものである。従って、光電子増倍管28などの顕微鏡装置全体としての特性により多少異なるも、図２に示したように、縦軸にレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度を取り、横軸を光電子増倍管28への印加電圧としつつ印加電圧を順次低くするようにグラフを形成すると、発光率は右上がりの曲線としてその特性を表すことができる特性関数テーブルとなる。
【００３０】
そして、このように一定強度の輝度信号が得られるレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度と光電子増倍管28に印加する電圧との関係において、標準設定として、光電子増倍管28の暗電流などのノイズが比較的少なく且つ増幅率が比較的大きくなる最適使用範囲を中心にレーザービームの強度を大きく変化させる標準特性関数を設定し（図３参照）、図４に示すように、調光フィルタ部13のフィルタを順次切り換えてレーザービームの出力を１００％から順次低下させた際に一定のビーム強度において発光率が異なっても一定の輝度が得られる印加電圧の値の範囲を各々定め、このビーム強度と印加電圧との関係を標準設定関数テーブルとして自動調光装置35に記憶させておくものである。
【００３１】
従って、この標準設定関数テーブルを用いれば、標本21を顕微鏡の視野に入れて観察を行う際し、標本21に用いた蛍光色素や標本21の染色方法、及び、標本21の状態などにより、標本21毎に発光率が異なっている場合でも、先ず、レーザービームを３０％出力などの所定の照射強度とし、且つ、光電子増倍管28への印加電圧を一定の電圧として撮像を行い、このときの検出輝度により標本21とした検査すべき試料の発光率を知り、この発光率に応じて一定の輝度を得るためのレーザービームの強度、即ち所定の透過率とするための調光フィルタ部13で使用するフィルタの選択決定を行うと共に、光電子増倍管28への必要な印加電圧を決定するように、この自動調光装置35により関数テーブルから演算して容易に決定することができる。
【００３２】
即ち、この演算結果に基づいた強度制御信号をレーザー照射手段11に出力して強度制御信号により使用すべき所定のフィルタの指示をフィルタ切換え制御装置14に出力させ、且つ、増幅制御信号を光電変換手段27における増倍管用電源装置29に出力して光電子増倍管28に印加する電圧を決定し、レーザー照射手段11においてフィルタ切換え制御装置14に所定のフィルタに切り換えさせてレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度を調整し、光電子増倍管28に印加する電圧により光電子増倍管28の増幅率を調整して光電変換手段27とした光電子増倍管28が出力する輝度信号の大きさを調整することにより、一定の明るさの映像を自動的に決定することができる。
【００３３】
又、レーザービームのビーム強度及び光電子増倍管28への印加電圧の調整方法は、上述した以外に、以下に説明するような図３に示すビーム強度と印加電圧との関数に沿って各々の値を調整することもある。
即ち、先ず、自動調光装置35は図３に示す関数上のＡ点（ビーム強度が小さく印加電圧が小さい点）にビーム強度と印加電圧とを設定して標本21を撮像する。このとき、標本21の発光率が例えば８０であれば、光電子増倍管28から得られる輝度信号はほぼ所定値となり、ビーム強度と印加電圧との調整は終了する。しかし、標本21の発光率が３０程度の小さいものであれば、光電子増倍管28から得られる輝度信号は所定値よりも小さい値となる。自動調光装置35は光電子増倍管28から得られる輝度信号を常時モニターし、輝度信号が所定値よりも小さい場合、ビーム強度と印加電圧との関数上を沿うように徐々に上げていく。そして、光電子増倍管28から得られる輝度信号が所定値となったときにビーム強度と印加電圧との調整を終了させる。このような調整により、種々の発光率の標本21を一定の輝度で観察することが可能となる。ここで、調光フィルタ部13は連続的にレーザービームの透過率を変更することができる装置を使用することが望ましい。
【００３４】
又、所定の照射強度及び所定の印加電圧で得たサンプル信号による検出輝度が特定の値よりも低い場合、ホール径制御装置26にピンホール制御信号を出力し、ホール径制御装置26からピンホール切換信号を出力させてピンホール25の径を大きくするようにピンホール25を切り換えさせる。又、検出輝度が前記特定の値と異なる特定の値よりも高い場合には、ピンホール制御信号を出力してピンホール25の径を小さくするようにホール径制御装置26からピンホール切換信号を出力させることがある。
【００３５】
このように、ピンホール25の径を変更することにより検出輝度を変更換算して試料の発光率を求め、前記関数テーブルによりフィルタ係数即ち使用するフィルタの決定と光電子増倍管28に印加する電圧とを定めることもできる。
更に、この標準設定関数テーブルの使用に際し、キーボード36からの操作により使用可能なフィルタを制限し、図５に示すように、標本21に照射するレーザービームの使用強度範囲Ａを制限しておき、検出輝度が低く、発光率が小さいと判断された場合にも、レーザービームのビーム強度を強くすることや印加電圧を高くして増幅率を大きくすることを制限し、ピンホール25の径を大きくするように切り換えて光電子増倍管28への受光量を増加させ、この受光量の増加率に基づいてビーム強度と印加電圧とを修正換算して一定の値の輝度信号が得られるビーム強度と印加電圧とを算出し、試料に照射するレーザービームのビーム強度を大きくすることのない設定として標本21の変質劣化を防止することもある。
【００３６】
そして、関数テーブルとしては、前記標準設定の関数テーブルである標準設定関数テーブルの他、退色防止優先の関数テーブルや、ノイズ防止優先の関数テーブルもこの自動調光装置35に記憶させておくものである。
この退色防止優先の関数テーブルは、図３に示した標準特性関数と比較して、標本21の発光率が同一の試験標本につき、レーザービームの強度を低くすると共に光電子増倍管28の印加電圧を高くすることによって同一の値の輝度信号が得られる退色防止優先関数（図６参照）と標準設定関数テーブルとに基づいて定めるものである。従って、図７に示すように、印加電圧の高い範囲でフィルタを切り換えるようにしてレーザービームのビーム強度を変化させ、この各ビーム強度において光電子増倍管28に印加する電圧の関係を定めてビーム強度と増幅率との関係を関数テーブルとするものである。
【００３７】
又、ノイズ防止優先の関数テーブルは、図８に示すように、図３に示した標準特性関数と比較して、印加電圧の低い範囲で照射強度を変更して同一の輝度が得られるノイズ防止優先関数と標準設定関数テーブルとに基づき、図９に示すように、比較的光電子増倍管28への印加電圧の低い範囲でフィルタ係数を切り換えるようにするものである。
このように、退色防止優先の関数テーブルやノイズ防止優先の関数テーブルをも記憶させた自動調光装置35は、キーボード36から退色防止優先モードとして退色防止優先の関数テーブルの使用を指示することにより、レーザービームにより変質し易い標本21を検査するとき、レーザービームの照射強度を低く抑えつつ一定の明るさの映像を得ることができる。又、レーザービームによって余り変質しない標本21を検査する場合には、ノイズ防止優先の関数テーブルを選択すれば、レーザービームのビーム強度を比較的高くし、ノイズの少ない鮮明な映像をモニターに映し出して標本21を検査することができる。
【００３８】
尚、レーザー出力装置12から出力されるレーザービームの強度調整が可能なレーザー出力装置12と多段に透過率を調整することのできる電動式調光フィルタとを組み合わせたレーザー照射手段11など、レーザー照射手段11が出力するレーザービームの強度を連続的に調整可能としたレーザー照射手段11を用いる場合は、関数テーブルとして、図３及び図６や図８に示した関数をそのまま関数テーブルとすることもできる。
【００３９】
又、光電変換手段27には光電子増倍管28を用いる場合のみでなく、所定の波長帯に適した出力特性を有する固体撮像素子と増幅率の調整可能な増幅器とを組み合わせて用いることもある。
上述のように、コンピュータを用いてレーザー照射手段11が出力するレーザービームのビーム強度と光電変換手段27の増幅率とを自動設定する自動調光装置35を使用すれば、１回の試験的レーザーの照射で標本21とした試料の発光率を知ることができ、標準的な明るさと鮮明度の画像データを得るために必要なビーム強度と増幅率とを算出してこの画像データを形成することができるゆえ、試料にダメージを与えることなく迅速に標本21の映像をモニター装置33に映し出すことができる。
【００４０】
そして、レーザー照射手段11における調光フィルタ部13のフィルタを透過するレーザービームの強度、及び、光電変換手段27とした光電子増倍管28の増幅率を定める印加電圧を主として調整し、必要に応じてピンホール25の径を調整して画像の明るさを一定とするようにしておけば、所定の明るさの比較的鮮明な映像を容易に得ることができる。
【００４１】
又、明るさの標準値を予め設定しておき、この明るさを基準としてキーボード36から標準値よりも大きな値を自動調光装置35に基準値として入力することができるようにすることにより、モニターに映し出された映像の明るさの変更も容易に可能となる。そして、キーボード36を使用することによりノイズ防止優先モードを選択して鮮明な映像の観察を行うことや、退色防止優先モードを選択することにより標本21の劣化を防止する観察も容易に行うことができる。
【００４２】
更に、レーザービームを標本21に照射して複数回の走査を行うことにより１フレームの画像データを形成する累積加算を行う場合でも、検出輝度の値を走査回数に応じて乗じるように変換すれば、同一の関数テーブルにより適切なビーム強度と増幅率とを容易に算出できる。
そして、ビーム強度と増幅率との関係特性や関数テーブルを予め設定記憶させておくことにより、ピンホール25の径を手動操作により設定して鮮明度を優先しつつ所定の明るさの映像を得ることも容易であり、又、ビーム強度の上限値を設定して標本21の保護を優先しつつ増幅率とピンホール25径とを自動制御して所定の明るさの映像を得るなど、標本21に適した検査を容易に行うことができることになる。
【００４３】
【発明の効果】
本願発明は、蛍光標本に強いレーザービームを照射するとダメージを与える危険や光電変換手段の増幅率を高めると画像のノイズが増える傾向にあることを考慮し、ビーム強度と増幅率との関係特性を関数テーブルに予め記憶させ、その関数テーブルに従ってレーザービームの強度と光電変換手段の増幅率を制御できるようにしたので、一定の輝度の蛍光標本像を得るための、レーザー照射手段が出力するレーザービームの強度の決定と光電変換手段における増幅率の決定とを容易に自動化でき、標本にダメージを与えることなく、標準的な明るさと鮮明度とを有する画像を容易に得ることができる。
【００４４】
そして、請求項２に記載した発明は、自動調光装置に予め関数テーブルを設定しておくものである故、容易且つ迅速に標準的な明るさの映像を自動的に形成することができると共に、必要に応じて明るさや鮮明度などを微調整するのみで検査に適した標本の最適な画像データを得ることができる。
更に、請求項３に記載した発明は、複数の関数テーブルを有する故、この関数テーブルを切り換えることにより試料などに適した映像を容易に得ることができる。
【００４５】
又、請求項４に記載した発明は、標準設定の関数テーブルの他、退色防止優先モードの関数テーブルとして標準設定よりもビーム強度が低く同一輝度の映像を得るテーブルを有し、ノイズ防止優先モードの関数テーブルとして標準設定よりも印加電圧が低く同一輝度の映像を得るテーブルを有している故、レーザービームにより変質劣化しやすい試料などを予め痛めないように設定しつつ退色防止優先モードによって標準的な明るさの映像を自動的に得ることができ、又、レーザービームに対して耐久性のある試料ではノイズ防止優先モードによって鮮明な映像を自動的に得ることができる。そして、微調整により検査に一層適した映像を容易に得ることができることになる。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るレーザー顕微鏡の主要ブロック図。
【図２】レーザー顕微鏡の映像輝度を示す図。
【図３】本実施の態様であるレーザービーム強度と像倍管電圧との関係を示す図。
【図４】本実施の態様である調光フィルタの選択と像倍管電圧との関数テーブルを示す図。
【図５】本実施の態様である調光フィルタの選択と像倍管電圧との関数テーブルの使用例を示す図。
【図６】本実施の態様におけるレーザービーム強度と像倍管電圧との他の関係を示す図。
【図７】本実施の態様である調光フィルタの選択と像倍管電圧との他の関数テーブルを示す図。
【図８】本実施の態様におけるレーザービーム強度と像倍管電圧との更に他の関係を示す図。
【図９】本実施の態様におけるレーザービーム強度と像倍管電圧との更に他の関数テーブルを示す図。
【図１０】従来のレーザー顕微鏡の一例を示す主要ブロック図。
【符号の説明】
１１レーザー照射手段１２レーザー出力装置
１３調光フィルタ部１４フィルタ切換え制御装置
１５ビームスプリッタ
１７ＸＹスキャナー１８スキャナー制御装置
２１標本
２５ピンホール２６ホール径制御装置
２７光電変換手段２８光電子増倍管
２９増倍管用電源装置
３１画像処理装置３３モニター装置
３５自動調光装置３６キーボード[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a laser microscope that performs scanning by irradiating a specimen with a laser beam and monitors the picture of the specimen by computer processing light from the specimen.
[0002]
[Prior art]
Today, a sample such as a specimen is irradiated with a laser beam from a laser output device, and the light from the specimen is converted into a luminance signal by photoelectric conversion means such as a photomultiplier tube, and this luminance signal is combined with the scanning timing of the laser beam to produce an image. A laser microscope that forms a signal and projects an image of a specimen on a television screen of a monitor device by using this video signal is used.
[0003]
As shown in FIG. 10, the laser microscope adjusts the beam intensity of the laser beam by passing the laser beam from the laser output device 12 serving as the laser irradiation means 11 through the filter of the dimming filter section 13, thereby adjusting the laser irradiation means. The intensity of the laser beam output from 11 is set, and the laser beam output from the laser irradiation means 11 passes through the beam splitter 15 and is then oscillated by the scanner 17 in the X and Y directions to scan the specimen 21. In addition, the sample 21 is irradiated with the laser beam through the objective lens 19 while controlling the direction of the laser beam. Then, the light from the specimen 21 returns to the beam splitter 15 through the objective lens 19 and the scanner 17, and is separated from the laser beam as the irradiation light by the beam splitter 15, and the light from the specimen 21 is sent to the photomultiplier tube 28. Each point of the XY coordinates is converted into a luminance signal corresponding to the amount of received light by a photomultiplier tube 28 as a photoelectric conversion means 27, and this luminance signal is matched with the irradiation position of the sample 21 of the laser beam by the image processing device 31. An image signal is formed as the luminance of the image and the image of the specimen 21 is displayed on the screen of the monitor device 33.
[0004]
The XY scanner 17 controls the vibrations of the X-axis mirror and the Y-axis mirror at a constant cycle by the scanner control device 18. The scanner control device 18 sends an X-axis mirror control signal and A Y-axis mirror control signal is output, and a coordinate reference signal in accordance with the X-axis mirror control signal and the Y-axis mirror control signal is output to the image processing device 31. Then, the image processing device 31 calculates the X coordinate and the Y coordinate of the laser beam that scans the sample 21 based on the coordinate reference signal from the scanner control device 18, and the luminance signal from the photomultiplier tube 28 as the photoelectric conversion means 27. Is recorded in a frame memory or the like in accordance with the XY coordinates to form image data for forming a two-dimensional image, and a video signal is formed by reading out the image data in accordance with the NTSC standard or the like.
[0005]
In this laser microscope, as described above, the intensity of the laser beam that passes through a combination of filters having different transmittances is determined by switching the filter to be used in the dimming filter unit 13, and is irradiated from the laser output device 12. By passing the intensity of a laser beam having a certain intensity through the light control filter unit 13, the intensity of the laser beam is adjusted in multiple stages and the sample 21 is irradiated. In recent years, there has been a technique in which the intensity of a laser beam emitted from the laser output device 12 can be adjusted.
[0006]
In this way, by adjusting the output from the laser output device 12 and adjusting the transmittance by the dimming filter unit 13, the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11 is adjusted, and the received light amount of the sample as the specimen 21 is adjusted. The laser beam irradiation reduces the deterioration and deterioration of the specimen 21 and irradiates as much laser beam as possible to emit a lot of light from the sample to obtain a bright image.
[0007]
Further, after the light from the specimen 21 is separated from the laser beam by the beam splitter 15, when entering the photomultiplier tube 28, excess light is blocked by passing through the pinhole 25 to obtain a clear image. In addition, the voltage applied to the photomultiplier tube 28 is adjusted by the power supply device 29 for the multiplier tube, and the amplification factor of the photomultiplier tube 28 is adjusted to obtain a bright image.
[0008]
The dimming filter unit 13 adjusts the beam intensity of the laser beam by manually switching the filter when determining the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11 by switching to a filter having a different transmittance. In addition, an electric dimming filter that uses an electric motor to switch the filter in the dimming filter unit 13 by operating a switch provided in the filter switching control device 14 may be used. Also, the pinhole 25 can be switched in diameter, and there are a manual type and an electric type when changing the diameter of the pinhole 25 to a different diameter.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the laser microscope, the intensity of the laser beam to the specimen is adjusted mainly by the dimming filter part incorporated in the laser irradiation means, and the incident light quantity to the photomultiplier tube used as the photoelectric conversion means is adjusted by the pinhole. The amplification factor of the photomultiplier tube is adjusted by the voltage applied to the photomultiplier tube.
[0010]
When observing a specimen, the contrast of the image differs depending on the specific specimen or sample. In particular, in the case of a fluorescent specimen, the image contrast varies greatly depending on the fluorescent dye used and the method of staining the specimen. is there. Therefore, it is necessary to select the filter in the laser irradiation means according to the sample, determine the voltage applied to the photomultiplier tube used as the photoelectric conversion means, and determine the diameter of the pinhole to be used. In other words, the adjustment for obtaining a bright and clear image has a drawback that requires labor and labor.
[0011]
In addition, if a sample is irradiated with a strong laser beam by adjusting a manual or electric dimming filter, a lot of light such as fluorescence can be emitted from the sample, but there is a risk of damaging the sample. Depending on the specimen, it may be necessary to avoid irradiation with a strong laser beam. The adjustment of the amplification factor by the applied voltage to the photomultiplier tube has a drawback that although the image can be brightened by increasing the applied voltage, noise is generated and the image is difficult to see. Furthermore, when adjusting the pinhole diameter in a laser microscope in which the pinhole diameter is variable by using a manual or electric pinhole, if the pinhole diameter is reduced, a clear image is displayed on the screen of the monitor device. Although the image can be projected, if the pinhole diameter is reduced, the image becomes dark, and if the pinhole diameter is increased, the screen can be brightened, but there is a drawback that the image becomes unclear. Therefore, the pinhole diameter must be adjusted in accordance with the amount of light from the sample and the amplification factor.
[0012]
Therefore, in accordance with specimen durability and staining method, setting of beam intensity by selecting a filter in laser irradiation means, setting of amplification factor in photoelectric conversion means by determining applied voltage to photomultiplier tube, and pinhole When obtaining sample image data by performing multiple settings adjustments, such as adjusting the amount of light received by the photoelectric conversion means by determining the diameter, filter selection and consideration should be given to obtain a clear image while minimizing damage to the sample. Adjustments such as applied voltage must be made, and if you are not familiar with the adjustment settings of the laser microscope, this adjustment will take time and labor, and it will take a lot of effort and time to operate the microscope when analyzing the specimen. Had the disadvantage of spending money.
[0013]
Some laser microscopes require several tens of seconds to several minutes to irradiate a sample with a laser beam, scan once, and store one frame of image data in the frame memory. It takes a lot of time to form new image data by changing the intensity or correcting the amplification factor of the photoelectric conversion means, and in addition, depending on the sample, the quality of the sample may change due to repeated irradiation of the sample with a laser beam. In some cases, it is difficult to make an accurate inspection judgment due to damage such as deterioration.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a laser irradiation means, a scanner for two-dimensionally scanning a fluorescent specimen by shaking a laser beam output from the laser irradiation means, receiving light emitted from the fluorescent specimen and converting it into a luminance signal, Adjusting the beam intensity of the laser beam in a laser microscope comprising a photoelectric conversion means having an amplification factor adjustment device for adjusting the amplification factor of the image and an image processing device for forming a video signal by a luminance signal output from the photoelectric conversion means A laser beam adjusting device, a beam intensity of a laser beam output from the laser irradiation unit, and the photoelectric conversion unit so that the luminance signal from the photoelectric conversion unit is within a predetermined value or a predetermined range. A function table in which a relationship with the amplification factor of the luminance signal to be output is set is stored, and based on this function table, the laser beam is stored. An automatic light control device that outputs an intensity control signal for setting the beam intensity of the laser beam and an amplification factor control signal for determining the amplification factor of the luminance signal, and controls the laser adjustment device and the amplification factor adjustment device of the photoelectric conversion means Will be provided.
[0015]
Thus, an automatic light control device that controls the laser adjustment device and the amplification factor adjustment device of the photoelectric conversion means, and that automatically stores the function table in which the relationship between the laser beam adjustment device and the luminance signal amplification factor is set. Because the light control device is provided, it is possible to automate the laser beam intensity setting and amplification factor determination control in the photoelectric conversion means, etc., and standard specimen images are automatically formed to facilitate specimen analysis and investigation. Can be possible.
According to the second aspect of the present invention, a function table of beam intensity and amplification factor for storing a constant luminance signal is stored even when the light emission rate varies depending on the sample. A laser microscope equipped with an automatic light control device that calculates the beam intensity and the amplification factor according to the light emission rate of the sample so that the luminance signal value becomes the set value and outputs the intensity control signal and the amplification control signal It is.
[0016]
As described above, if the automatic light control device stores the function table of the light emission rate, the beam intensity, and the amplification factor for obtaining a sample image having a constant luminance even in samples having different light emission rates, an image having a constant luminance can be obtained. Determination of the intensity of the laser beam output from the laser irradiation means for forming and the determination of the amplification factor in the photoelectric conversion means can be easily automated, and an image having standard brightness and sharpness can be easily obtained. . In addition, based on the standard brightness image, it is possible to easily obtain the optimal image data for specimen inspection by correcting the irradiation intensity of the laser beam or changing the correction of the amplification factor in the photoelectric conversion means. Can get to.
[0017]
Furthermore, the invention described in claim 3 includes a plurality of functions such as a function table in a fading prevention priority mode and a function table in a noise prevention priority mode in addition to a standard function table as a function table stored in the automatic light control device. The table is stored.
If a plurality of function tables are stored in this way, a bright and relatively clear standard image can be obtained while reducing damage to the sample by using a function table that matches the sample.
[0018]
Further, the invention described in claim 4 is an amplification factor for obtaining a luminance signal having the same value with respect to a sample having the same light emission rate as a function table of the fading prevention priority mode as compared with a standard function table. For the beam intensity, the function table of the function in which the amplification factor of the photoelectric conversion means is increased and the irradiation intensity of the laser beam is decreased, and the function table of the noise prevention priority mode is a standard function table. In comparison, the function table is a function in which the amplification factor of the photoelectric conversion means for obtaining the luminance signal having the same value with respect to the samples having the same light emission rate is reduced and the irradiation intensity of the laser beam is increased.
[0019]
In this way, if the function table in the fading prevention priority mode, the function table in the noise prevention priority mode, or the like is stored in advance in addition to the standard function table, the sample is likely to be deteriorated and deteriorated by the laser beam by switching the function table. Can select the fading prevention priority mode to obtain a standard brightness image without causing much damage to the specimen, and select the noise prevention priority mode for the samples that are difficult to deteriorate due to the laser beam. Image data of a clear image can be obtained as a standard.
[0020]
[0021]
[0022]
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As shown in FIG. 1, a laser microscope according to the present invention includes a laser from a laser irradiation means 11 in which an electric dimming filter composed of a dimming filter unit 13 and a filter switching control device 14 and a laser output device 12 are combined. The beam is irradiated onto the specimen 21 via the beam splitter 15, the XY scanner 17 and the objective lens 19, and the light emitted from the specimen 21 is returned to the beam splitter 15 via the objective lens 19 and the XY scanner 17. Light is input to the photomultiplier tube 28 as the photoelectric conversion means 27 through the pinhole 25, and image processing is performed based on the luminance signal output from the photomultiplier tube 28 and the coordinate reference signal from the scanner control device 18. Forming a video signal by the device 31 is the same as in a conventional laser microscope.
[0024]
The photoelectric conversion means 27 includes a photomultiplier tube 28 and a power supply device 29 for the multiplier tube, and the voltage applied to the photomultiplier tube 28 is adjusted by the power supply device 29 for the multiplier tube to adjust the voltage of the photomultiplier tube 28. As in the past, the amplification factor is adjusted, and the video of the specimen 21 can be appropriately observed by the monitor device 33 based on the video signal formed by the image processing device 31 using a frame memory or the like. is there.
[0025]
In addition, the electric dimming filter of this microscope is configured to switch the filter by outputting a filter switching signal to the dimming filter unit 13 while detecting a filter to be used by the filter switching control device 14 with a sensor. That is, the microscope is capable of selecting and determining the beam transmittance by switching the filter, and controlling the filter switching while checking the filter to be used to adjust the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11. It is. Further, the pinhole 25 is also an electric type, and is a microscope in which the diameter of the pinhole 25 for adjusting the amount of light incident on the photomultiplier tube 28 can be switched by the hole diameter control device 26.
[0026]
The laser microscope automatically controls the filter switching control device 14 in the laser irradiation means 11, and also controls the hole diameter control device 26 of the pinhole 25 and the power supply device 29 for the multiplier tube in the photoelectric conversion means 27. A light control device 35 is further provided.
This automatic light control device 35 uses a computer, reads a video signal from the image processing device 31 as a sample signal, and samples the luminance information so that the detected luminance that is the average luminance value of the sample signal becomes a predetermined value. Based on the signal, an intensity control signal is output to the filter switching control device 14 of the laser irradiation means 11 to switch the filter of the dimming filter unit 13, and the amplification control signal is sent to the power supply device 29 for the multiplier tube of the photoelectric conversion means 27 Is output to control the power supply device 29 for the multiplier tube, thereby determining the voltage to be applied to the photomultiplier tube 28. In addition, a pinhole control signal is output to the hole diameter control device 26 so that the hole diameter control device 26 can also be controlled to determine the diameter of the pinhole 25.
[0027]
When the luminance information is input to the automatic light control device 35 from the image processing device 31, a video signal of the entire image that is stored in a frame memory and displayed on the screen of the monitor device 33 is input, and all of the video signals are input. In addition to the case where the average value is obtained and set as the detected luminance, the average luminance value in the center portion of the screen is set as the detected luminance, or the maximum value of the obtained video signal is set as the detected luminance. Alternatively, there is a case in which a weight is applied to a portion with high luminance on the screen and the average value of the entire screen is calculated to obtain the detected luminance.
[0028]
The automatic light control device 35 registers conditions for obtaining a constant detection luminance in advance, and a plurality of test samples having different light emission amounts, that is, light emission rates when a laser beam with a constant intensity is irradiated. (For example, a glass plate that emits fluorescence when irradiated with a laser beam), as shown in FIG. 2, the luminance signal output from the photomultiplier tube 28 in a test sample having a light emission rate of 15 has a constant luminance. The relationship between the irradiation intensity of the laser beam and the voltage applied to the photomultiplier tube 28 is memorized, and the irradiation intensity of the laser beam to the specimen having a constant luminance due to various emission ratios such as 20 and 25 similarly. And the voltage applied to the photomultiplier tube 28 As characteristic function table It will be memorized.
[0029]
As for this relationship, in the specimen 21 having a low light emission rate, in order for the photomultiplier 28 serving as the photoelectric conversion means 27 to output a predetermined luminance value, that is, a constant value of the luminance signal, the laser that irradiates the specimen 21 is used. It is necessary to increase the beam intensity of the beam and to apply a high applied voltage as a voltage applied to the photomultiplier tube 28. In addition, in the specimen 21 having a high light emission rate, a low beam intensity and a low applied voltage to the photomultiplier tube 28 are required. The voltage is sufficient. Accordingly, although it varies somewhat depending on the characteristics of the entire microscope apparatus such as the photomultiplier tube 28, as shown in FIG. 2, the vertical axis represents the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11, and the horizontal axis represents the photoelectron. When a graph is formed so that the applied voltage is successively lowered while applying the voltage to the multiplier tube 28, the luminous efficiency can be expressed as an upward curve. It becomes a characteristic function table .
[0030]
Then, in the relationship between the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11 that obtains a luminance signal of constant intensity in this way and the voltage applied to the photomultiplier tube 28, as a standard setting, the photomultiplier tube 28 The intensity of the laser beam is greatly changed around the optimum use range where the noise such as dark current is relatively small and the amplification factor is relatively large. Standard characteristics The function is set (see FIG. 3), and as shown in FIG. 4, when the filter of the dimming filter unit 13 is sequentially switched and the output of the laser beam is sequentially decreased from 100%, the light emission rate is constant at a constant beam intensity. The range of the applied voltage value that can obtain a constant brightness even if different is defined, and the relationship between the beam intensity and the applied voltage is determined. Standard settings This is stored in the automatic light control device 35 as a function table.
[0031]
So this Standard settings Using the function table, when observing specimen 21 in the microscope's field of view, the emission rate for each specimen 21 depends on the fluorescent dye used in specimen 21, the staining method of specimen 21, and the state of specimen 21. Even when the laser beam is different, first, imaging is performed with the laser beam set to a predetermined irradiation intensity such as 30% output and the voltage applied to the photomultiplier tube 28 as a constant voltage. Knowing the light emission rate of the sample to be inspected as 21 and the intensity of the laser beam for obtaining a certain luminance according to this light emission rate, that is, the filter used in the dimming filter unit 13 for obtaining a predetermined transmittance This automatic dimming device 35 can be easily determined by calculating from the function table so as to make a selection decision and to determine a necessary applied voltage to the photomultiplier tube 28.
[0032]
That is, an intensity control signal based on this calculation result is output to the laser irradiation means 11 so that an instruction of a predetermined filter to be used is output to the filter switching control device 14 by the intensity control signal, and the amplification control signal is photoelectrically converted. The voltage applied to the photomultiplier tube 28 is determined by outputting to the multiplier tube power supply device 29 in the means 27, and the laser irradiation means 11 outputs the laser irradiation means 11 by switching the filter switching control device 14 to a predetermined filter. The magnitude of the luminance signal output from the photomultiplier tube 28 as the photoelectric conversion means 27 by adjusting the beam intensity of the laser beam and adjusting the amplification factor of the photomultiplier tube 28 by the voltage applied to the photomultiplier tube 28 By adjusting the height, an image with a certain brightness can be automatically determined.
[0033]
The method for adjusting the beam intensity of the laser beam and the voltage applied to the photomultiplier tube 28 is not limited to the above-described method, but can be adjusted according to the function of the beam intensity and the applied voltage shown in FIG. The value may be adjusted.
That is, first, the automatic light control device 35 images the specimen 21 by setting the beam intensity and the applied voltage at the point A (the point where the beam intensity is small and the applied voltage is small) on the function shown in FIG. At this time, if the light emission rate of the sample 21 is 80, for example, the luminance signal obtained from the photomultiplier tube 28 is almost a predetermined value, and the adjustment of the beam intensity and the applied voltage is completed. However, if the light emission rate of the sample 21 is as small as about 30, the luminance signal obtained from the photomultiplier tube 28 is a value smaller than a predetermined value. The automatic dimming device 35 constantly monitors the luminance signal obtained from the photomultiplier tube 28, and when the luminance signal is smaller than a predetermined value, gradually increases it along the function of the beam intensity and the applied voltage. Then, when the luminance signal obtained from the photomultiplier tube 28 reaches a predetermined value, the adjustment of the beam intensity and the applied voltage is terminated. By such adjustment, it becomes possible to observe the specimen 21 having various light emission rates with a constant luminance. Here, it is desirable to use a device that can continuously change the transmittance of the laser beam as the dimming filter unit 13.
[0034]
In addition, when the detected luminance by the sample signal obtained at a predetermined irradiation intensity and a predetermined applied voltage is lower than a specific value, a pinhole control signal is output to the hole diameter control device 26, and the pinhole control device 26 outputs a pinhole. The pinhole 25 is switched so as to increase the diameter of the pinhole 25 by outputting a switching signal. When the detected luminance is higher than a specific value different from the specific value, a pinhole control signal is output from the hole diameter control device 26 so as to reduce the diameter of the pinhole 25 by outputting a pinhole control signal. May be output.
[0035]
In this way, the detection luminance is changed and converted by changing the diameter of the pinhole 25 to obtain the luminous rate of the sample, and the filter coefficient, that is, the filter to be used is determined by the function table and the voltage applied to the photomultiplier tube 28. Can also be determined.
Furthermore, this Standard settings When using the function table, the filters that can be used are limited by the operation from the keyboard 36, and as shown in FIG. 5, the use intensity range A of the laser beam applied to the specimen 21 is limited, the detection luminance is low, Even when it is judged that the light emission rate is small, it is restricted to increase the beam intensity of the laser beam or increase the applied voltage to increase the amplification factor, and switch to increase the pinhole 25 diameter. The amount of light received by the photomultiplier tube 28 is increased, and the beam intensity and the applied voltage are calculated based on the rate of increase in the amount of received light. However, the deterioration of the specimen 21 may be prevented as a setting that does not increase the beam intensity of the laser beam applied to the sample.
[0036]
And as the function table, the standard function table Default function table In addition, a function table for fading prevention priority and a function table for noise prevention priority are also stored in the automatic light control device 35.
The function table for preventing discoloration is shown in FIG. Standard characteristics Compared with the function, for the test sample with the same emission rate of the sample 21, the intensity signal of the same value can be obtained by lowering the intensity of the laser beam and increasing the voltage applied to the photomultiplier tube 28. Priority on fading prevention Function (see Figure 6) And the default function table It is determined based on. Therefore, as shown in FIG. 7, the beam intensity of the laser beam is changed by switching the filter in a high applied voltage range, and the relationship between the voltages applied to the photomultiplier tube 28 is determined at each beam intensity. The relationship between intensity and amplification factor is a function table.
[0037]
Also, the noise prevention priority function table is as shown in FIG. Compared to the standard characteristic function shown in FIG. The same brightness can be obtained by changing the irradiation intensity in the low applied voltage range. Noise prevention priority function And the default function table Based on the above, as shown in FIG. 9, the filter coefficient is switched in a relatively low range of the voltage applied to the photomultiplier tube.
In this way, the automatic light control device 35 that also stores the fading prevention priority function table and the noise prevention priority function table instructs the use of the fading prevention priority function table from the keyboard 36 as the fading prevention priority mode. When inspecting the specimen 21 that is easily altered by the laser beam, it is possible to obtain an image with a certain brightness while keeping the irradiation intensity of the laser beam low. In addition, when inspecting the specimen 21 that is not significantly altered by the laser beam, if the noise prevention priority function table is selected, the beam intensity of the laser beam is made relatively high and a clear image with little noise is displayed on the monitor. Specimen 21 can be examined.
[0038]
Laser irradiation such as laser irradiation means 11 combining laser output device 12 capable of adjusting the intensity of the laser beam output from laser output device 12 and electric light control filter capable of adjusting transmittance in multiple stages. When using the laser irradiation means 11 in which the intensity of the laser beam output from the means 11 can be continuously adjusted, the functions shown in FIGS. 3, 6, and 8 may be used as the function table as a function table. it can.
[0039]
The photoelectric conversion means 27 may be used not only when the photomultiplier tube 28 is used, but also in combination with a solid-state imaging device having output characteristics suitable for a predetermined wavelength band and an amplifier whose gain can be adjusted. .
As described above, when the automatic light control device 35 that automatically sets the beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation means 11 and the amplification factor of the photoelectric conversion means 27 using a computer is used, one test laser is obtained. The light emission rate of the sample 21 as a sample can be known by irradiating, and the image data is formed by calculating the beam intensity and amplification factor necessary for obtaining standard brightness and sharpness image data. Therefore, the image of the specimen 21 can be quickly displayed on the monitor device 33 without damaging the sample.
[0040]
Then, mainly adjust the applied voltage that determines the intensity of the laser beam that passes through the filter of the dimming filter unit 13 in the laser irradiation unit 11 and the amplification factor of the photomultiplier tube 28 that serves as the photoelectric conversion unit 27, as necessary. If the diameter of the pinhole 25 is adjusted to make the brightness of the image constant, a relatively clear image with a predetermined brightness can be easily obtained.
[0041]
In addition, by setting a standard value of brightness in advance, a value larger than the standard value can be input as a reference value from the keyboard 36 to the automatic light control device 35 based on this brightness. The brightness of the image projected on the monitor can be easily changed. Then, by using the keyboard 36, the noise prevention priority mode can be selected to observe a clear image, and the fading prevention priority mode can be selected to easily prevent the specimen 21 from being deteriorated. it can.
[0042]
Furthermore, even when performing cumulative addition for forming one frame of image data by irradiating the specimen 21 with a laser beam and performing scanning a plurality of times, if the detection luminance value is converted to be multiplied according to the number of scans Thus, it is possible to easily calculate an appropriate beam intensity and amplification factor using the same function table.
Then, by setting and storing the relationship characteristics between the beam intensity and the amplification factor and the function table in advance, the diameter of the pinhole 25 is set by manual operation to obtain an image with a predetermined brightness while giving priority to the sharpness. It is also easy to set the upper limit value of the beam intensity and give priority to the protection of the specimen 21 while automatically controlling the amplification factor and the diameter of the pinhole 25 to obtain an image with a predetermined brightness. It is possible to easily perform inspection suitable for the above.
[0043]
【The invention's effect】
The present invention takes into account the danger of damaging a fluorescent specimen when irradiated with a strong laser beam and the fact that there is a tendency for image noise to increase if the amplification factor of the photoelectric conversion means is increased. The laser beam output from the laser irradiation means for obtaining a fluorescent specimen image with a constant brightness is stored in advance in the function table, and the intensity of the laser beam and the amplification factor of the photoelectric conversion means can be controlled according to the function table. The determination of the intensity and the determination of the amplification factor in the photoelectric conversion means can be easily automated, and an image having standard brightness and sharpness can be easily obtained without damaging the specimen.
[0044]
In the invention described in claim 2, since a function table is set in advance in the automatic light control device, an image with standard brightness can be automatically and quickly formed. Therefore, it is possible to obtain optimum image data of a specimen suitable for inspection only by finely adjusting the brightness and the sharpness as required.
Furthermore, since the invention described in claim 3 has a plurality of function tables, an image suitable for a sample or the like can be easily obtained by switching the function tables.
[0045]
In addition to the standard setting function table, the invention described in claim 4 includes a table for obtaining an image having a beam intensity lower than that of the standard setting and having the same luminance as the function table for the fading prevention priority mode. As a function table, the applied voltage is lower than the standard setting and a table that obtains the same brightness image is obtained. A bright image can be automatically obtained, and a clear image can be automatically obtained by a noise prevention priority mode in a sample durable to a laser beam. Then, an image more suitable for inspection can be easily obtained by fine adjustment.
[0046]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a main block diagram of a laser microscope according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing image brightness of a laser microscope.
FIG. 3 is a diagram showing a relationship between laser beam intensity and image tube voltage according to the present embodiment.
FIG. 4 is a diagram showing a function table of dimming filter selection and image tube voltage according to the present embodiment.
FIG. 5 is a diagram illustrating a usage example of a function table of dimming filter selection and image tube voltage according to the present embodiment;
FIG. 6 is a diagram showing another relationship between the laser beam intensity and the image multiplier voltage in this embodiment.
FIG. 7 is a diagram showing another function table of dimming filter selection and image tube voltage according to the present embodiment.
FIG. 8 is a diagram showing still another relationship between laser beam intensity and image multiplier tube voltage in the present embodiment.
FIG. 9 is a view showing still another function table of laser beam intensity and image multiplier tube voltage in the present embodiment.
FIG. 10 is a main block diagram showing an example of a conventional laser microscope.
[Explanation of symbols]
11 Laser irradiation means 12 Laser output device
13 Dimming filter section 14 Filter switching control device
15 Beam splitter
17 XY scanner 18 Scanner control device
21 specimens
25 pinhole 26 hole diameter control device
27 Photoelectric conversion means 28 Photomultiplier tube
29 Multiplier tube power supply
31 Image processing device 33 Monitor device
35 Automatic dimmer 36 Keyboard

Claims

Laser irradiation means, a scanner that scans the fluorescent specimen two-dimensionally by shaking the laser beam output from the laser irradiation means, and the light emitted from the fluorescent specimen by irradiation with the laser beam is received and converted into a luminance signal. A laser microscope comprising: a photoelectric conversion unit having an amplification factor adjustment device that adjusts an amplification factor of the luminance signal; and an image processing device that forms a video signal by the luminance signal output from the photoelectric conversion unit,
A laser beam adjusting device for adjusting the beam intensity of the laser beam;
The beam intensity of the laser beam output from the laser irradiation unit and the amplification factor of the luminance signal output from the photoelectric conversion unit so that the luminance signal from the photoelectric conversion unit falls within a predetermined value or a predetermined range. And a function table in which the relationship is set, and based on this function table, an intensity control signal for setting the beam intensity of the laser beam and an amplification factor control signal for determining the amplification factor of the luminance signal are output, A laser microscope comprising: an automatic light control device that controls the laser beam adjustment device and an amplification factor adjustment device of the photoelectric conversion means.

The function table automatic light device stores is a function table in which the relationship between the beam intensity and the amplification factor is set for even samples of different emission rates of the luminance signal with a constant value, In addition, the automatic light control device determines a value of an intensity control signal for setting a beam intensity of a laser beam and a gain of the luminance signal so that the value of the luminance signal becomes a set value based on the light emission rate of each specimen. 2. The gain control signal to be determined is calculated, an intensity control signal is output to the laser beam adjustment device, and an amplification control signal is output to the gain adjustment device. Laser microscope.

The automatic light control device stores a plurality of function tables such as a function table in a fading prevention priority mode and a function table in a noise prevention priority mode in addition to a function table set as a standard setting as the function table. The laser microscope according to claim 1.

The function table of the fading prevention priority mode stored in the automatic light control device has the same value for samples having the same light emission rate by increasing the amplification factor of the photoelectric conversion means compared to the function table set as the standard setting. A function table for obtaining a luminance signal, and the function table for the noise prevention priority mode has the same value for samples having the same light emission rate by reducing the amplification factor of the photoelectric conversion means compared to the function table set as the standard setting. The laser microscope according to claim 3, wherein the function table is used to obtain a luminance signal of the following.