JP3783060B2 - Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures - Google Patents
Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures Download PDFInfo
- Publication number
- JP3783060B2 JP3783060B2 JP2004055008A JP2004055008A JP3783060B2 JP 3783060 B2 JP3783060 B2 JP 3783060B2 JP 2004055008 A JP2004055008 A JP 2004055008A JP 2004055008 A JP2004055008 A JP 2004055008A JP 3783060 B2 JP3783060 B2 JP 3783060B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adsorbed
- chemical species
- dye
- metal
- spectrum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 title claims description 34
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims description 34
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 title claims description 28
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 title claims description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 56
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000004397 blinking Effects 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 8
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 3
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 79
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 47
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 41
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 41
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 33
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 14
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 description 7
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 6
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 6
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 argon ion Chemical class 0.000 description 2
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008364 bulk solution Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000010411 electrocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010249 in-situ analysis Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012821 model calculation Methods 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
この発明はナノスケールで特定の形状を有する金属表面に吸着した有機分子、無機分子およびそれらのイオン状態にあるものを、単一分子検出感度で検出し、かつそれらの化学種の存在状態を単一分子レベルで分析する原理と方法に関するものである。このような金属ナノ構造表面の特性を利用することによって生物・環境に関連する重要な物質、例えば高速DNA塩基配列解析、遺伝子診断、血液検査、有害ガス検知、環境ホルモン等を単一分子で測定し、定量、定性分析を行えるデバイスも含む。 The present invention detects organic molecules, inorganic molecules and their ionic state adsorbed on a metal surface having a specific shape on a nanoscale with single molecule detection sensitivity, and the existence state of these chemical species is simply detected. It relates to the principle and method of analysis at the molecular level. By utilizing such surface characteristics of metal nanostructures, important substances related to living organisms and the environment, such as high-speed DNA base sequence analysis, genetic diagnosis, blood tests, detection of harmful gases, environmental hormones, etc. can be measured with a single molecule. And devices that can perform quantitative and qualitative analysis.
種々の固液界面に存在する化学種の高感度分析は、燃料電池などの触媒反応の制御や、DNA塩基配列、蛋白の高次構造と機能の解析などに関連して注目されている。In situでの単一分子検出については、従来もっぱら蛍光法が適用されている。この方法は、例えばローダミン６Gのような強い蛍光を与える色素分子の単一分子感度での測定、あるいはそのような色素分子で標識した（DNAなどの目的箇所に蛍光分子を化学的に結合させ、蛍光測定により目的分子が存在することを検出できるようにすること）DNAなどの生体分子の特定部位の観察などで、幅広く利用されている。しかし、この方法では強い蛍光を発しない分子の検出が不可能であり、蛍光スペクトルで得られる情報が、ブロードなピーク波長などに限られていることから、あらかじめマーカとしてラベルされている場合を除き、未知物質の同定をはじめとする状態分析は困難である。これに対して、ラマン散乱を利用した場合、入射光が分子にあたるとその分子内または分子間の結合に基く固有の振動エネルギー状態を反映した光（散乱光のエネルギー＝入射光のエネルギー±振動エネルギー）が放射される。単純に言って結合の数だけ異なる振動が存在し、それによりラマン散乱スペクトルが与えられる。このラマン散乱スペクトルのピーク強度は、分子の固有の振動モード及びその配向が決まれば一義的に決まる。そのため、従来より知られているように、ラマンバンドピーク波数やピーク間の相対強度を分子が無秩序に配向したバルク溶液中や、規則的に配向した単結晶でのデータと比較することで、分子内の結合の強さや、分子の配向性のほか、立体構造や周囲の化学種との相互作用に関する情報が得られる。この意味で、化学種の定性、定量的な状態分析のために、ラマン分光は蛍光法よりも原理的に有用である。しかし、一般的にラマン散乱の信号光は蛍光に比べて圧倒的に弱いので（増強ないときのラマン信号強度/蛍光強度≒10-14）、単一分子での測定は不可能である。ところが、表面増強ラマン散乱を利用することによって、ラマン信号強度は単一分子に匹敵するくらい大きく増強される場合があることが、いくつかのグループ、たとえば、NieらによってScience誌 1997年第107巻pp1102-1106などに報告されている。 High-sensitivity analysis of chemical species present at various solid-liquid interfaces has attracted attention in connection with control of catalytic reactions such as fuel cells, and analysis of DNA base sequences, protein higher-order structures and functions. Conventionally, the fluorescence method has been applied exclusively to single molecule detection in situ. In this method, for example, a dye molecule that gives strong fluorescence such as rhodamine 6G is measured with single molecule sensitivity, or labeled with such a dye molecule (a fluorescent molecule is chemically bound to a target site such as DNA, (It is possible to detect the presence of a target molecule by fluorescence measurement) It is widely used for observing specific sites of biomolecules such as DNA. However, this method cannot detect molecules that do not emit strong fluorescence, and the information obtained in the fluorescence spectrum is limited to broad peak wavelengths, etc., unless it is previously labeled as a marker. State analysis including identification of unknown substances is difficult. On the other hand, when Raman scattering is used, when incident light hits a molecule, the light reflects the inherent vibration energy state based on the intramolecular or intermolecular bond (scattered light energy = incident light energy ± vibration energy). ) Is emitted. Simply speaking, there are vibrations that differ by the number of bonds, thereby giving a Raman scattering spectrum. The peak intensity of the Raman scattering spectrum is uniquely determined if the inherent vibration mode of the molecule and its orientation are determined. Therefore, as is conventionally known, the Raman band peak wave number and the relative intensity between the peaks are compared with data in a bulk solution in which molecules are randomly aligned or in a regularly oriented single crystal. In addition to the strength of the bonds, the orientation of the molecules, information on the three-dimensional structure and interactions with surrounding chemical species can be obtained. In this sense, Raman spectroscopy is more useful in principle than fluorescence for qualitative and quantitative state analysis of chemical species. However, in general, the signal light of Raman scattering is overwhelmingly weaker than fluorescence (Raman signal intensity when not enhanced / fluorescence intensity≈10 −14 ), so measurement with a single molecule is impossible. However, by utilizing surface-enhanced Raman scattering, the Raman signal intensity can be enhanced to a degree comparable to a single molecule, but several groups, such as Nie et al. It is reported in pp1102-1106.
1970年代初めにFleishmannやVan Duyneらにより発見された表面増強ラマン散乱(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)は,粗い金属表面に吸着した化学種のラマン散乱スペクトル信号が、局在金属表面プラズモン（Localized Surface Plasmon, LSP）および金属表面と吸着種との間の電子移動に基づく化学増強メカニズムにより信号が増強されることである。しかし、実際に用いられる種々の金属表面でこれらの2つのメカニズムがどのように増強に寄与するかは、金属表面のナノスケールでの詳細な構造や、局所的な電子状態に依存することから、十分明らかになっていなかった。このため、SERSは、検出された信号強度が目的化学種の量だけでは決まらないため定量分析手法として用いることはできなかった。また、どのようなサイトに吸着しているのかを直接知ることはできなかった。 Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) discovered by Fleishmann and Van Duyne et al. In the early 1970s is a localized metal surface plasmon (Localized Surface). The signal is enhanced by Plasmon, LSP) and chemical enhancement mechanism based on electron transfer between metal surface and adsorbed species. However, how these two mechanisms contribute to the enhancement of various metal surfaces actually used depends on the detailed structure of the metal surface at the nanoscale and the local electronic state. It was not clear enough. For this reason, SERS cannot be used as a quantitative analysis method because the detected signal intensity is not determined only by the amount of the target chemical species. Moreover, it was not possible to know directly what kind of site it was adsorbed.
最近の走査型プローブ顕微鏡や高感度光検出器の発達により、個々の金属ナノ粒子の構造をナノスケールで測定し、同時に粒子間を十分大きくすることで、微量分子の吸着した特定の粒子のみからの分光信号を検出することが可能になってきた。SERSを用いたラマン散乱信号もそのひとつで、大きな増強度を与える（信号増強のために最適な形状を有する）金属ナノ粒子のみを観測することで、例えば、Journal of Physical Chemistry B2003年107巻9964-9972頁やAnalytical Chemistry 2003年75巻6171-6176頁のように1010-1014の単一分子感度に匹敵する巨大な増強度も報告されている。しかし、これまでに報告されている巨大SERS増強度はすべて、クエン酸などの還元剤を用いて硝酸塩などの金属イオンから還元生成された種々の形状やサイズからなる金属ナノ粒子及びその集合体について得られたものである。その場合には、上記の多粒子・多分子系と同様に、巨大な増強を与えるメカニズムや関連して観測されるBlinking(SERS信号強度が、時間とともに突然かつ繰り返し示す強度変化。数回／秒の周波数でおきる)のオリジンは明らかになっていなかった。 With the recent development of scanning probe microscopes and high-sensitivity photodetectors, the structure of individual metal nanoparticles can be measured at the nanoscale, and at the same time, the space between the particles can be made sufficiently large, so that only specific particles with trace molecules adsorbed It has become possible to detect the spectral signal. The Raman scattering signal using SERS is one of them. For example, Journal of Physical Chemistry B 2003, Vol.1074, 9964 is observed by observing only metal nanoparticles that give large enhancement (having an optimal shape for signal enhancement). As shown in page -9972 and Analytical Chemistry 2003, volume 75, pages 6171-6176, huge enhancements comparable to single molecule sensitivities of 10 10 -10 14 have been reported. However, all of the giant SERS enhancements reported so far are related to metal nanoparticles and aggregates of various shapes and sizes produced by reduction from metal ions such as nitrates using reducing agents such as citric acid. It is obtained. In this case, as in the case of the multi-particle / multi-molecular system described above, the mechanism that gives a huge enhancement and the related Blinking (SERS signal intensity changes suddenly and repeatedly with time. Several times / second. The origin (which occurs at the frequency of
この主な原因は以下の2つである。1）金属ナノ構造の形成方法に関連して、金属ナノ構造1個当たり1-10個程度の分子が吸着しているときに、それを実験的に直接確かめる方法がないために、検出されたSERS信号が1個の分子からのものであることを明言できない。２）そのために巨大増強を与えるメカニズムや、最適な形状を有する金属ナノ構造が、明確に解明されていないことによる。 There are two main reasons for this. 1) In relation to the formation method of metal nanostructures, when 1-10 molecules per metal nanostructure were adsorbed, there was no method to confirm this directly experimentally. I cannot say that the SERS signal is from one molecule. 2) For that reason, the mechanism that gives a huge enhancement and the metal nanostructure having the optimum shape are not clearly elucidated.
そこで、われわれは、巨大なSERS増強度を与える金属ナノ構造を原子間力顕微鏡により直接観測し、またLSP吸収スペクトルと対応付けること、さらにその金属ナノ構造にSERS測定のためのレーザ光を照射したときにナノ構造表面に形成される局所電場強度を数値計算により求めることで、巨大増強度を与える金属ナノ構造を明らかにしてきた（Journal of Physical Chemistry B, 2003年107巻7607-7617ページ, 同2004年108巻673-678ページ）。この結果によると、（１）単一分子感度に匹敵する巨大な増強度は、孤立粒子ではなく、2粒子以上の集合体でのみ得られる。その場合、接合軸に平行な偏光を用いたとき、垂直な偏光に比べて著しく大きな増強度が得られる。これに対応して、集合体では個々のLSP吸収スペクトルが重なり合うために、用いた488nmの励起波長により効率的なLSP励起が行える。これによく対応して、局所電場計算では、(1)孤立した球状、楕円状、及び円筒状の金属ナノ粒子では、104-105のSERS増強しか得られない。(2)これに対して、これらの形状を有するナノ粒子の接合部では、粒子サイズによらず最適波長では1010以上の単一分子感度に匹敵する増強度が得られた。接合粒子の接合部から離れた一般的なサイトでは、孤立粒子と同様に104-105のSERS増強が得られた。このことから、単一分子感度の巨大増強度が金属ナノ粒子集合体、かつその接合部で得られることが明らかになった。また、（２）吸着色素分子を銀ナノ粒子1個当たり数分子−1分子以下にしたとき、SERS信号強度のBlinkingが観測された。これは、室温から７７Kまで冷却することにより抑制され、室温まで再加熱すると再開した。このことから、Blinkingは、吸着分子が銀ナノ粒子の接合部と他の一般的なサイトの間で熱拡散することによるものと推定される。 Therefore, we observed the metal nanostructure that gives a huge SERS enhancement intensity directly with an atomic force microscope, matched it with the LSP absorption spectrum, and irradiated the laser beam for SERS measurement to the metal nanostructure. We have clarified metal nanostructures that give enormous enhancement by numerically calculating the local electric field strength formed on the surface of nanostructures (Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107, 7607-7617, 2004) 108, 673-678, year). According to this result, (1) a huge enhancement comparable to single molecule sensitivity can be obtained only with aggregates of two or more particles, not isolated particles. In that case, when polarized light parallel to the junction axis is used, a remarkably large enhancement can be obtained as compared with perpendicular polarized light. Correspondingly, since the individual LSP absorption spectra overlap in the aggregate, efficient LSP excitation can be performed with the excitation wavelength of 488 nm used. Correspondingly to this, local electric field calculations (1) provide only SERS enhancement of 10 4 -10 5 for isolated spherical, elliptical, and cylindrical metal nanoparticles. (2) On the other hand, in the joint part of nanoparticles having these shapes, an enhancement comparable to a single molecule sensitivity of 10 10 or more was obtained at the optimum wavelength regardless of the particle size. The SERS enhancement of 10 4 -10 5 was obtained at the general site distant from the junction of the bonded particles, similar to the isolated particles. From this, it has been clarified that a giant enhancement with single molecule sensitivity can be obtained at the metal nanoparticle aggregate and its junction. In addition, (2) Blinking of the SERS signal intensity was observed when the number of adsorbed dye molecules was several molecules to one molecule or less per silver nanoparticle. This was suppressed by cooling from room temperature to 77K and resumed when reheated to room temperature. From this, Blinking is presumed to be due to the thermal diffusion of adsorbed molecules between the junction of silver nanoparticles and other general sites.
このような実験事実から、銀ナノ粒子接合部に色素などの分子1個が吸着しているとき、その分子のラマンスペクトルが観測され、その強度は銀ナノ構造表面の熱拡散のためにBlinkingするものとして解釈できる。しかしながら、種々の実験事実からこのように解釈できるものの、巨大なSERS増強度を与えるときに吸着した分子が実際に銀ナノ粒子接合部に存在するかどうかは、それを直接観測する分析方法がないために、明確にできなかった。 From these experimental facts, when one molecule such as a dye is adsorbed to the silver nanoparticle junction, the Raman spectrum of that molecule is observed, and its intensity Blinking due to thermal diffusion on the surface of the silver nanostructure Can be interpreted. However, although it can be interpreted in this way from various experimental facts, there is no analytical method for directly observing whether or not the adsorbed molecules actually exist at the silver nanoparticle junction when giving a huge SERS enhancement. Therefore, it was not possible to clarify.
本発明の中で使用する用語について定義する。 Terms used in the present invention are defined.
本明細書内で使用する「表面増強ラマン散乱（SERS）」とはナノスケールの粗さを有する金属表面に吸着した化学種に、可視領域の波長を有するレーザ光を照射したとき、あらゆる方向に放射されるラマン散乱が、金属表面の局在表面プラズモン（LSP）や金属表面の電子状態と吸着種の電子状態の相互作用により、バルク状態に比べて104-105以上増強される現象をいう。ここで、ラマン散乱信号光は、入射光のエネルギーに比べて分子の振動エネルギー分だけ異なる散乱光で、分子内の結合の振動モードのエネルギーを与える。振動モードのうちラマンスペクトル測定で観測されるものは、分子の対称性に依存すること、およびそれらの相対強度は、分子の構造・対称性・電子状態など固有の特性を反映するので、このラマンスペクトルの解析により、分子の構造やその微小変化、分子の配向性や周辺化学種との相互作用に関する情報が得られる。 “Surface-enhanced Raman scattering (SERS)” used in this specification is a chemical species adsorbed on a metal surface having nanoscale roughness, and is irradiated in any direction when irradiated with laser light having a wavelength in the visible region. The phenomenon in which the emitted Raman scattering is enhanced by 10 4 -10 5 or more compared to the bulk state due to the interaction between the localized surface plasmon (LSP) on the metal surface and the electronic state of the metal surface and the electronic state of the adsorbed species. Say. Here, the Raman scattered signal light is scattered light that differs from the incident light energy by the vibration energy of the molecule, and gives the energy of the vibration mode of the bond in the molecule. Of the vibration modes, those observed by Raman spectrum measurement depend on the symmetry of the molecule, and their relative intensities reflect specific properties such as the structure, symmetry, and electronic state of the molecule. Analysis of the spectrum provides information on the structure of the molecule, its minute changes, the orientation of the molecule, and its interaction with surrounding chemical species.
本明細書内で使用する「ナノ粒子」とはその半径(r)が1ナノメートル< r < 1000ナノメートル (1ナノメートル＝10-9メートル)の球を示す。 As used herein, “nanoparticle” refers to a sphere having a radius (r) of 1 nanometer <r <1000 nanometers (1 nanometer = 10 −9 meters).
本明細書内で使用する「Blinking」とは単一分子に由来する表面増強ラマン散乱信号の強度が、時間とともに数ヘルツの周期で繰り返し点滅することを示す。 As used herein, “Blinking” indicates that the intensity of a surface-enhanced Raman scattering signal derived from a single molecule repeatedly flashes with a period of several hertz over time.
本明細書内で使用する「LSP」（Localized Surface Plasmon）とは、金属ナノ粒子に局在する表面プラズモンで、可視領域の適切な波長の光照射により励起される。このとき、金属ナノ粒子表面に巨大な電場が形成され、それにより金属表面に吸着した化学種のラマン散乱信号が増強される。これはLSPによる表面増強ラマン散乱である。 “LSP” (Localized Surface Plasmon) used in the present specification is a surface plasmon localized in metal nanoparticles, and is excited by light irradiation with an appropriate wavelength in the visible region. At this time, a huge electric field is formed on the surface of the metal nanoparticle, thereby enhancing the Raman scattering signal of the chemical species adsorbed on the metal surface. This is surface enhanced Raman scattering by LSP.
in situ分析法とは、非破壊の試料の本来存在する条件下、例えば電極触媒表面であれば、固液界面で電極の電位が制御された状態下で、生体分子であればそれが生体中で存在している状態のままで分析する方法。 The in situ analysis method is a condition in which a non-destructive sample originally exists, for example, if it is an electrocatalyst surface, under a state where the potential of the electrode is controlled at the solid-liquid interface, and if it is a biomolecule, A method of analysis in the existing state.
金属ナノ粒子集合体の接合部に単一分子レベルのごく少数の分子が存在することを分光学的に確かめる方法を提供する。さらには、金属ナノ粒子集合体の接合部にごく少数の分子が存在するときに、そのSERS信号が巨大な増強を得ることを、実験的に確かめる方法を提供する。また、それを利用した単一分子のラマンスペクトル測定による状態分析の方法及びそれを利用したデバイスを提供する。 A method for spectroscopically confirming that a very small number of molecules at a single molecule level exist at the junction of a metal nanoparticle assembly is provided. Furthermore, it provides a way to experimentally verify that the SERS signal gains a huge enhancement when there are very few molecules at the junction of the metal nanoparticle assembly. In addition, the present invention provides a state analysis method using a Raman spectrum measurement of a single molecule using the same and a device using the method.
金属ナノ粒子集合体の接合部にごく少数の分子が存在するときに、そのSERS信号が単一分子感度を与えるように著しく増強される一方、吸着分子が接合部中心から熱拡散等で他のサイトに離れていったときにSERS信号強度が大きく低下する。このSERS信号強度の変化に対応して、われわれが見出した同じ試料について同時に観測した白色光を照射したときの弾性散乱スペクトルが明確な変化を示すことを利用する。より具体的には(1)巨大な増強度を与えるとき色素分子が接合部に存在し、それにより色素の吸収による付加的な弾性散乱ピークが観測されること、及び(2)SERS信号が増大されないとき、その弾性散乱ピークが消失することを利用する。これにより、単一分子レベルでの色素分子の位置の同定とそのときの分子の状態分析をSERSスペクトル解析により行える。また、このような巨大なSERS増強度を与える構造は、先に述べたように孤立した銀ナノ三角柱構造でも得られるので、全く同様の方法で、銀ナノ三角柱構造のエッジに吸着する分子の状態分析を単一分子感度で行うことができる。 When a small number of molecules are present at the junction of a metal nanoparticle assembly, the SERS signal is significantly enhanced to give single molecule sensitivity, while the adsorbed molecule is thermally diffused, etc. The SERS signal strength is greatly reduced when you are away from the site. Corresponding to this change in the SERS signal intensity, we use the fact that the elastic scattering spectrum shows a clear change when we irradiate the same sample we have found and simultaneously observe white light. More specifically, (1) dye molecules are present at the junction when giving a large enhancement, thereby causing additional elastic scattering peaks due to dye absorption, and (2) increasing the SERS signal If not, take advantage of the disappearance of its elastic scattering peak. This enables identification of the position of the dye molecule at the single molecule level and analysis of the state of the molecule at that time by SERS spectrum analysis. In addition, as described above, a structure that gives such a large SERS enhancement can also be obtained with an isolated silver nanotriangular prism structure, so the state of molecules adsorbed on the edge of the silver nanotriangular prism structure is exactly the same. Analysis can be performed with single molecule sensitivity.
金属ナノ粒子集合体についてこの方法による解析は具体的には以下のとおりである。
(1)周知の還元法により形成した銀ナノ粒子にカチオン性色素分子と塩化物イオンを吸着させる。これをシリコン基板表面などに固定する。(2)この色素の吸着した銀ナノ粒子／基板試料の弾性散乱イメージ、及び弾性散乱スペクトル、ラマン散乱イメージ及びラマン散乱スペクトルを同一の顕微鏡と高感度CCD検出器付分光器により構成された分光装置により測定する。光学イメージ測定は、顕微鏡に付設のCCDカメラで、分光スペクトルは分光器に接続された高感度分光用CCD検出器により測定される。ラマンイメージ及びラマンスペクトル測定の際には、励起光を除去するためのノッチフィルタを用いる。顕微鏡でラマンイメージ、-スペクトル及び弾性散乱イメージが観測された個々の銀ナノ粒子は、AFMによりそのナノスケールでの形状が詳細に観察される。これは、基板上に描かれた縦横それぞれ30ミクロン間隔の格子を用いることではじめて可能になる。そのとき、個々の格子内部の銀ナノ粒子の数は、基板上に展開する銀ナノ粒子の粒子密度の制御で、また吸着色素分子の数密度（1銀ナノ粒子あたりの吸着分子の数）は、銀粒子に対する色素分子数の制御により調整される。
The analysis by this method for the metal nanoparticle aggregate is specifically as follows.
(1) Adsorb cationic dye molecules and chloride ions to silver nanoparticles formed by a known reduction method. This is fixed to the silicon substrate surface or the like. (2) Spectroscopic device composed of the same microscope and spectroscope with high-sensitivity CCD detector for the elastic scattering image, and the elastic scattering spectrum, Raman scattering image, and Raman scattering spectrum of the silver nanoparticle / substrate sample adsorbed with this dye Measure with Optical image measurement is performed by a CCD camera attached to a microscope, and a spectral spectrum is measured by a high-sensitivity spectral CCD detector connected to the spectrometer. When measuring a Raman image and a Raman spectrum, a notch filter for removing excitation light is used. Individual silver nanoparticles whose Raman image, -spectrum, and elastic scattering image were observed with a microscope can be observed in detail at the nanoscale by AFM. This can only be achieved by using a grid with 30 micron spacing on the substrate. At that time, the number of silver nanoparticles inside each lattice is controlled by the density of silver nanoparticles on the substrate, and the number density of adsorbed dye molecules (number of adsorbed molecules per silver nanoparticle) is It is adjusted by controlling the number of dye molecules for silver particles.
(3)このような方法で、1個1個の銀ナノ粒子のSERSスペクトル、弾性散乱スペクトル、LSP吸収スペクトル及びそれらのイメージ、さらにAFMによるナノスケールでの詳細な形状が解析される。この最適粒子探索により、まず1銀ナノ粒子あたり数10分子の色素吸着量のときに巨大なSERS増強を与える粒子を、SERSイメージ測定により明るいスポットとして見出す。(4)この巨大なSERS信号は、時間の経過とともに吸着分子が接合部からずっと遠い表面へ熱拡散することや完全な脱離のために、強弱を繰り返しながら、次第に強度低下し、およそ10-30分で完全に強度を消失する。その後再び信号を出すことはない。このSERS活性が変化する過程でSERS測定と同時に白色光による弾性散乱スペクトル測定を行うと、色素が吸着した銀ナノ粒子が巨大なSERS活性を与えるときのみ、銀のLSPピーク以外に付加的な散乱スペクトルピークが観測される。SERS活性が失われると、この付加的な散乱ピークは失われ、銀ナノ粒子のLSPピークのみが観測される。(5)この付加的な散乱ピークは、色素の吸収によるものである。銀ナノ粒子のLSPと電磁気学的カップリングをすることにより、色素のバルク状態での吸収波長よりも長波長側にシフトしている。このことは、後で述べるように銀ナノ粒子／色素系の白色光照射時の局所電場及び遠方電磁場をMaxwell方程式の数値計算により求めた結果で明瞭に確かめられた。重要なことは、ごくわずかな色素分子でも、接合部に存在している限り、色素が存在しないときに比べて、有意の散乱スペクトル変化を与える。これに対して、同じ量の色素分子が銀ナノ粒子表面に吸着していても、接合部以外の一般的なサイトに存在する場合には、そのような散乱スペクトル変化を与えない。より詳細には、接合部中心から7.5nm以上動いたとき、散乱スペクトルは色素が吸着していないときと全く同じものになる。従って、白色光による散乱スペクトル測定を用いれば色素分子が銀ナノ粒子集合体の接合部に存在すること、および色素分子が接合部からどの程度外れた位置に吸着しているかを明示することができる。 (3) By such a method, the SERS spectrum, elastic scattering spectrum, LSP absorption spectrum and their images of each silver nanoparticle, and the detailed shape at the nanoscale by AFM are analyzed. By this optimum particle search, first, a particle that gives a huge SERS enhancement when a dye adsorption amount of several tens of molecules per silver nanoparticle is found as a bright spot by SERS image measurement. (4) This huge SERS signal gradually decreases in strength as the adsorbed molecules heat and diffuse to the surface far from the junction and completely desorbs over time, and gradually decreases in strength. The strength disappears completely in 30 minutes. After that, no signal is sent again. When the elastic scattering spectrum measurement with white light is performed simultaneously with the SERS measurement in the process of changing the SERS activity, additional scattering is performed in addition to the silver LSP peak only when the silver nanoparticles adsorbed with the dye give a huge SERS activity. A spectral peak is observed. When the SERS activity is lost, this additional scattering peak is lost and only the LSP peak of the silver nanoparticles is observed. (5) This additional scattering peak is due to dye absorption. By electromagnetic coupling with LSP of silver nanoparticles, the dye is shifted to the longer wavelength side than the absorption wavelength in the bulk state. This was clearly confirmed by the results of calculating the local electric field and the far electromagnetic field when the silver nanoparticles / dye system was irradiated with white light by numerical calculation of the Maxwell equation as described later. Importantly, very few dye molecules, as long as they are present at the junction, give significant changes in the scattering spectrum compared to when no dye is present. On the other hand, even if the same amount of the dye molecule is adsorbed on the surface of the silver nanoparticle, such a change in the scattering spectrum is not given if it is present at a general site other than the junction. More specifically, when moving from the center of the junction by 7.5 nm or more, the scattering spectrum is exactly the same as when the dye is not adsorbed. Therefore, by using white light scattering spectrum measurement, it is possible to clearly indicate that the dye molecules are present at the junction of the silver nanoparticle aggregate and how far the dye molecules are adsorbed from the junction. .
ここで用いた電磁気学数値計算についてまとめる。これは、試料系（ここでは色素の吸着した銀ナノ粒子）に光を照射したときに形成される電磁場を与える基本式であるMaxwell方程式が微分方程式であるために、対称な系や比較的簡単な幾何学的構造を有する試料系についてのみ解析解が得られることから、非対称なナノ構造体や複雑な試料系での電磁場計算に広く用いられている方法である。これは、簡略化したモデル計算ではなく、試料系のMaxwell式と境界条件をそのまま微分方程式から時間及び空間変数を含む差分方程式に変形して、数値計算により解を求める方法である。従って、十分細かい空間・時間の分割幅を用いる限り、計算精度の問題は抑えられ、原理的に常に正しい解を得ることができる。今回の試料系では、以下の実施形態に詳しく述べるように銀ナノ粒子表面の種々の位置にごくわずかな吸着分子（１銀ナノ粒子あたり数分子−数10分子）を配置したときの散乱スペクトル（入射光強度に対する試料遠方での電磁場の比）を計算して、色素の吸着による変化とそのときのSERS増強度を求めるものである。 The electromagnetic numerical calculation used here is summarized. This is because the Maxwell equation, which is the basic formula that gives the electromagnetic field formed when light is applied to the sample system (here, the silver nanoparticles adsorbed with the dye) is a differential equation, so it is a symmetric system or relatively simple. Since an analytical solution can be obtained only for a sample system having a simple geometric structure, this method is widely used for electromagnetic field calculations in asymmetric nanostructures and complex sample systems. This is not a simplified model calculation, but a method in which the Maxwell equation and the boundary conditions of the sample system are transformed as they are from a differential equation into a differential equation including time and space variables, and a solution is obtained by numerical calculation. Therefore, as long as a sufficiently small space / time division width is used, the problem of calculation accuracy can be suppressed, and in principle, a correct solution can be obtained. In this sample system, as will be described in detail in the following embodiments, scattering spectra when few adsorbed molecules (several molecules to several tens of molecules per silver nanoparticle) are arranged at various positions on the surface of the silver nanoparticles ( The ratio of the electromagnetic field at the distance of the sample to the incident light intensity is calculated, and the change due to adsorption of the dye and the SERS enhancement at that time are obtained.
この発明はナノスケールで特定の形状を有する金属表面に吸着した有機分子、無機分子およびそれらのイオン状態にあるものを、単一分子検出感度で検出し、かつそれらの化学種の存在状態を単一分子レベルで分析する原理と方法に関するものである。このような金属ナノ構造表面の特性を利用することによって遺伝子診断、血液検査、有害ガス検知、環境ホルモン等、生体系及び環境汚染などに関連する重要な物質を単一分子感度で測定し、定量、定性分析を行うことができる。より具体的には以下のとおり。例えば、ボトムアップナノテクノロジーの利用により分子レベルのデバイスを構築するときに、構成要素である分子やイオンなど化学種の構造や、配向性・電子状態などの存在状態は、近傍化学種との相互作用などのために、孤立分子状態あるいはバルク状態とは大きく異なるものと考えられる。これらの点は、ナノデバイスの構造と機能を制御するために重要で、ナノデバイスの精密な制御のために明らかにする必要がある。最新の走査型プローブ顕微鏡などの進んだ分析法でも、構造についての情報はある程度得られるが、これらの点をin situで解析することはできない。本発明によれば、最適金属ナノ構造をナノデバイスの基板あるいは電極として用いることで、任意の化学種の単一分子レベルでの存在位置の同定と、その状態分析が可能になる。 The present invention detects organic molecules, inorganic molecules and their ionic state adsorbed on a metal surface having a specific shape on a nanoscale with single molecule detection sensitivity, and the existence state of these chemical species is simply detected. It relates to the principle and method of analysis at the molecular level. By using such surface characteristics of metal nanostructures, important substances related to biological systems and environmental pollution such as genetic diagnosis, blood tests, detection of harmful gases, environmental hormones, etc. can be measured and quantified. Qualitative analysis can be performed. More specifically: For example, when building a device at the molecular level by using bottom-up nanotechnology, the structure of chemical species such as molecules and ions that are constituent elements, and the existence state such as orientation and electronic state are related to each other. It is considered that it is greatly different from the isolated molecular state or the bulk state due to the action. These points are important for controlling the structure and function of the nanodevice, and need to be clarified for precise control of the nanodevice. Advanced analysis methods such as the latest scanning probe microscopes can provide some information about the structure, but these points cannot be analyzed in situ. According to the present invention, by using the optimal metal nanostructure as a substrate or electrode of a nanodevice, it is possible to identify the position of any chemical species at the single molecule level and analyze its state.
以下、本発明の内容について発明の実施の形態の例について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態の例のみについて限定されるものではない。 Hereinafter, examples of embodiments of the invention will be described in detail with respect to the contents of the present invention. In addition, this invention is not limited only about the example of the following embodiment.
（１）SERS活性色素吸着した銀ナノ粒子試料の調製法：(1)室温で、既知の方法（J. Physical Chemistry 1982年86巻3391頁）により硝酸銀をクエン酸ナトリウムで還元して形成した銀ナノ粒子にカチオン性色素分子と塩化物イオンを吸着させる。これをシリコン基板表面などにアミノシランカップラーなどを用い固定する。このとき、銀表面の塩化物イオンによる負電荷と色素のカチオン、及びアミノ基の部分的負電荷の間の静電的相互作用により、色素分子の吸着した銀ナノ粒子は十分な機械的安定性を持って、基板表面に固定することができる。(2)この色素の吸着した銀ナノ粒子／基板試料の弾性散乱イメージ、及び弾性散乱スペクトル、ラマン散乱イメージ及びラマン散乱スペクトルを同一の顕微鏡（Olympus）とそれに光学的に結合された分光器（Renishaw）により構成された分光装置（図1）により測定する。図１はラマン散乱・弾性散乱観測用分光装置を示しており、このラマン散乱・弾性散乱観測用分光装置は白色光源１、CCDカメラ２、PC３、散乱光イメージ、ラマンイメージ４、ノッチフィルタ５、色素を吸着した銀ナノ粒子試料６、可動ミラー７、分光器８、干渉フィルタ９、アルゴンイオンレーザ（488nm）１０、CCD検出器１１、PC１２、ラマンスペクトル、散乱スペクトル１３、偏光子１４、顕微光学系１５を備えている。光学イメージ測定は、顕微鏡に付設のCCDカメラ（Sony, DSC-50C）で、分光スペクトルは分光器に接続された高感度分光用CCD検出器により測定される。ラマンイメージ及びラマンスペクトル測定の際には、妨害となる励起光を除去するためのノッチフィルタ（Kaiser）を用いる。顕微鏡で観測された個々の銀ナノ粒子は、AFMによりそのナノスケールでの形状が詳細に観察される。これは、基板上に描かれた縦横それぞれ30ミクロン間隔の格子を用いることではじめて可能になった。また個々の格子内部の銀ナノ粒子の数は、基板上に展開する銀ナノ粒子の粒子密度の制御で、また吸着色素分子の数密度（1銀ナノ粒子あたりの吸着分子の数）は、銀粒子に対する色素分子数の制御により調整される。
(1) Preparation method of silver nanoparticle sample adsorbed with SERS active dye: (1) Silver formed by reducing silver nitrate with sodium citrate by a known method (J. Physical Chemistry, 1982, 86, 3391) at room temperature Cationic dye molecules and chloride ions are adsorbed on the nanoparticles. This is fixed to the silicon substrate surface using an aminosilane coupler or the like. At this time, due to the electrostatic interaction between the negative charge of chloride ions on the silver surface, the cation of the dye, and the partial negative charge of the amino group, the silver nanoparticles adsorbed to the dye molecule have sufficient mechanical stability. Can be fixed to the substrate surface. (2) Elastic scattering image of silver nanoparticle / substrate sample adsorbed with this dye, and elastic scattering spectrum, Raman scattering image and Raman scattering spectrum of the same microscope (Olympus) and a spectrometer optically coupled to it (Renishaw) ) Is measured with a spectroscopic device (Fig. 1). FIG. 1 shows a spectroscopic device for observing Raman scattering / elastic scattering. The spectroscopic device for observing Raman scattering / elastic scattering includes a
(3)このような方法で、1個1個の銀ナノ粒子のSERSスペクトル、弾性散乱スペクトル、LSP吸収スペクトル及びそれらのイメージ、さらにAFMによるナノスケールでの詳細な形状が解析される。その結果、まず1銀ナノ粒子あたり数10分子の色素吸着量のときに巨大なSERS増強を与える粒子を見出す。そしてその白色光による弾性散乱スペクトル測定を行う。(4)例えば図2cに示すようにこのような巨大なSERS増強度を与える銀ナノ粒子のAFMによるナノスケールでの形状は、予想通り集合体であり、このとき観測された1654, 1574, 1510, 1365, 1313, 1190 cm-1などのラマンバンドは、すべて用いた色素であるローダミン6G（R6G）によるバンドであることが、バルク状態のスペクトル（1647, 1568, 1534, 1504, 1365, 1308, 1195cm-1）との比較から確かめられた。このように単一分子から得られたスペクトルとバルク状態でのスペクトルとは１：１に対応づけられる。観測された有意のピーク波数のずれや相対強度の違いは、この分子が存在している局所的な環境を反映しているので、この様なスペクトル違いを、R6Gの単結晶や特定の方向に配向した試料のラマンスペクトルとの比較、及びラマンスペクトルの理論計算などにより解析することで、単一分子レベルでの状態分析（分子の構造のバルクとの違い、配向性、周囲との相互作用など）が可能になる。
このSERSスペクトルは、時間の経過とともに吸着分子が接合部からずっと遠い表面へ熱拡散することや完全な脱離のために、強弱を繰り返しながら、次第に強度低下し、およそ10-30分で完全に強度を消失する。例えば図2aに示すのは、巨大な増強度を与える銀ナノ粒子からのSERSスペクトルと、それが強度変化を繰り返しながら次第に低下し、約30分後に強度を消失したときのラマンスペクトルである。この後再び信号を出すことはない。この過程でSERS測定と同時に白色光による弾性散乱スペクトル測定を行うと、色素がごくわずかな量（数分子−数10分子）吸着した銀ナノ粒子が巨大なSERS活性を与えるときのみ、銀のLSPピーク(525nm, 730nm)以外に付加的な散乱ピークが630nm付近に観測される（図2b）。SERS活性が失われると、この付加的な散乱ピークは失われ、銀ナノ粒子のLSPピークのみが観測される（図2b, c）。この付加的なピークの波長630nmは、色素のバルク固相での吸収ピーク波長560nmと比べるとより長波長側に観測されている。この付加的なバンドのピーク波長は、粒子ごとにわずかに異なるが、常に色素バルクの吸収ピーク波長よりも長波長側に観測される。(5)全く同様の変化が単一分子レベルの吸着量のときに観測された。図3aに示すように銀ナノ粒子あたり約3分子のR6Gが吸着している系で、blinkingする銀ナノ粒子を見出した。この粒子もやはり数個の粒子の集合体である。Blinkingを示すとき、475nm及び 630nmのLSP吸収によるピークのほかに、590nm付近に別の散乱ピークが観測された。SERS活性が失われると、LSPピークもわずかに強度及びピーク波長が変化するが、590nmの付加的なバンドは全く観測されなくなる。
(3) By such a method, the SERS spectrum, elastic scattering spectrum, LSP absorption spectrum and their images of each silver nanoparticle, and the detailed shape at the nanoscale by AFM are analyzed. As a result, we first find particles that give a huge SERS enhancement when the amount of dye adsorption is several tens of molecules per silver nanoparticle. And the elastic scattering spectrum measurement by the white light is performed. (4) For example, as shown in FIG.2c, the shape of the nano-scale of silver nanoparticles giving such a large SERS enhancement by AFM is an aggregate as expected, and 1654, 1574, 1510 observed at this time , 1365, 1313, 1190 cm -1 etc., all of which are due to rhodamine 6G (R6G), the dye used, the bulk state spectrum (1647, 1568, 1534, 1504, 1365, 1308, It was confirmed by comparison with 1195cm -1 ). Thus, the spectrum obtained from a single molecule and the spectrum in the bulk state are associated with 1: 1. The observed significant shift in peak wavenumber and difference in relative intensity reflect the local environment in which this molecule exists, so this spectral difference can be attributed to single crystals of R6G and specific directions. State analysis at the single molecule level (compared to the bulk of the molecular structure, orientation, interaction with the surroundings, etc.) by analyzing by comparison with the Raman spectrum of the oriented sample and theoretical calculation of the Raman spectrum ) Becomes possible.
This SERS spectrum gradually decreases in intensity as the adsorbed molecules thermally diffuse to the surface far from the junction and complete desorption over time. Loss strength. For example, FIG. 2a shows a SERS spectrum from a silver nanoparticle that gives a huge enhancement, and a Raman spectrum when the intensity gradually decreases while repeating the intensity change and disappears after about 30 minutes. After this, no signal is output again. In this process, when the elastic scattering spectrum measurement with white light is performed simultaneously with the SERS measurement, the silver LSP is only obtained when the silver nanoparticles adsorbed in a very small amount (several molecules to several tens of molecules) give a huge SERS activity. In addition to the peaks (525nm, 730nm), an additional scattering peak is observed around 630nm (Fig. 2b). When the SERS activity is lost, this additional scattering peak is lost and only the LSP peak of the silver nanoparticles is observed (Fig. 2b, c). This additional peak wavelength of 630 nm is observed on the longer wavelength side compared to the absorption peak wavelength of 560 nm in the bulk solid phase of the dye. The peak wavelength of this additional band is slightly different for each particle, but is always observed on the longer wavelength side than the absorption peak wavelength of the dye bulk. (5) Exactly the same change was observed when the amount of adsorption at the single molecule level. As shown in Fig. 3a, silver nanoparticles that blink were found in a system in which about 3 molecules of R6G were adsorbed per silver nanoparticle. This particle is also an aggregate of several particles. When showing Blinking, in addition to the peaks due to LSP absorption at 475 nm and 630 nm, another scattering peak was observed around 590 nm. When SERS activity is lost, the LSP peak also changes slightly in intensity and peak wavelength, but no additional band at 590 nm is observed.
(6)この付加的な散乱ピークは、色素の吸収によるものである。銀ナノ粒子のLSPピークと電磁気学的カップリングをすることにより、色素のバルク状態での吸収波長よりも長波長側にシフトし、かつ大きな強度を与えている。このことは、銀ナノ粒子／色素系の白色光照射時の局所電場及び遠方電磁場を上記数値計算法により求めた結果により確かめられた。まず孤立銀ナノ粒子系での計算結果では、粒子形状を80×80×40nmの回転楕円体として、単軸方向から光を入射（長軸に平行な直線偏光を使用）したとき、図4aに示すようにLSPの吸収波長は430nmである。この銀ナノ粒子表面にローダミン色素（吸収波長590nm）を異なる厚さ吸着させる。このとき、銀及び色素の誘電率としては、300-800nmの約25nm間隔の約20点の計算波長における文献値を用いた（銀の誘電率：Palik著「Handbook of Optical Constants of Solids」(Academic Press, 1985), ローダミンの誘電率：Optics Letters, 1981年6巻248-250））。色素分子は銀ナノ粒子表面を均一に覆っている。電磁場の散乱断面積は、先の入射光が照射されたときに、この粒子から遠方に放射される放射光エネルギー（入射光エネルギーで規格化されている）として数値計算により与えられる。入射光波長を300nm-800nmで変えることで、散乱スペクトルが得られる。(7)その結果は、図４aに示すように、孤立粒子については色素膜厚が8nmとかなり厚くてもLSPバンドが強度を増加する以外は、色素による長波長側のピークは出現するものの無視できるくらい弱い。これは実測スペクトルの付加的なピーク強度と比較してもごく小さい。この付加的なバンドの強度は色素の吸収波長をLSP吸収波長に590nmから500nm, 450nmと近づけていくと、次第に増加し、450nmのときLSP吸収強度のおよそ1/4に増大する。この結果は、LSPと色素の吸収が近いほどLSPとのカップリングが大きくなり、お互いの強度やピーク波長が大きく変化することを示している。しかし、色素の吸収は実際には560nm付近にあるはずなので、このように吸収波長を変えるのは、あくまでもその寄与を調べるためであり、ここでR6G／銀粒子の試料についての実測値と対応付けられない。
(8)これに対して、銀ナノ粒子集合体（ここでは2粒子接合体）での計算結果は大きく異なっている。図5に示すように、ここでは、半径40nmの形状を有する円筒（無限長）2個が近接して置かれている系を試料とする。3次元計算を行わないでも、ここで示した２次元断面（円）内の偏光及び入射方向については、2次元計算で正しい解が得られること（Journal of Physical Chemistry B, 2003年107巻7607-7617ページ）を利用して、計算時間を節約するために、2次元で取り扱っている。この接合部及び他の一般的なサイト、例えば一方の粒子の接合部とは反対側端面などに、ごくわずかな色素分子（590nmに吸収を持つとして、2粒子間のギャップサイズ g (nm)をちょうど埋めるようにg×gnm2の面積）をおいた場合及びおかない場合の散乱スペクトルを計算する。結果は、図5aに示すように、ギャップサイズ8nmのとき左側の粒子の左端（接合部とは反対側）に色素分子（８×８nm2）をおいたとき、色素のない銀ナノ粒子のみの場合と全く同じ散乱スペクトルを与える（黒丸：色素のないとき、逆三角：左端に色素を置いたとき）。これに対して、2粒子の接合部に色素をおいたとき、散乱スペクトルはこれらとは全く異なる。この結果は、色素分子が接合部に満たされることで、左、右の銀ナノ粒子のLSPがまるでギャップがないかのように、極めて効率的にカップリングすることによる。実際にここで色素を接合部においたときに得られる散乱スペクトルは、全く同じ銀ナノ粒子をギャップなしに接触させたときのLSP散乱スペクトルと非常によく一致している（Journal of Physical Chemistry B, 2003年107巻7607-7617ページ）。この結果は、色素分子が銀ナノ粒子のLSP吸収波長と近い吸収ピークを有することによって保障されている。実際、もし色素の代わりに色素と同等の屈折率実部を有するガラスなどの材料をギャップにおいても、ここで得られたような大きなスペクトル変化は観測されず、ギャップに何も存在しないときと全く同じスペクトルが得られた。
(9)同様にギャップを4nm, 2nm, 1nmと小さくしたとき、色素をギャップに置いたときの散乱スペクトルの変化は、吸着した色素の量が4×4nm2, 2×2nm2, 1×1nm2と少なくなるためもあり、8nmのときに比べると小さいが、銀ナノ粒子の430nm付近のLSPピーク強度に比肩しうる色素の吸収による付加的なピークが、600-800nm付近に観測された。また、これらの場合でも色素分子を接合部以外の周縁領域においたとき、色素がないときと全く同じ散乱スペクトルが得られることが確かめられた。
(10)さらに、色素位置を詳細に変えたとき、重要な結果が得られた。まずギャップサイズ1nmのとき、色素分子1×1nm2≒1分子相当）をギャップ中央においたとき、660nmに付加的なバンドが観測される。これに対して、色素を接合部中央から上方（接合軸に垂直な方向）に5nm, 7.5nm, 10nmずらしたときの散乱スペクトルを計算したところ、10nm, 7.5nmでは色素が存在しないときとほぼ一致するスペクトルが得られた。すなわちこれらの場合、長波長側の色素の吸収による散乱ピークが観測されない。対照的に、5nmずらしたときには接合部中心においたときと、色素のないときのちょうど中間的なスペクトル変化が観測された。すなわちこのとき760nm付近に色素の吸収によるピークが接合部中央に置いたときの約1/2の強度で観測された。
(6) This additional scattering peak is due to dye absorption. By electromagnetically coupling with the LSP peak of the silver nanoparticles, the dye shifts to a longer wavelength side than the absorption wavelength in the bulk state, and gives a large intensity. This was confirmed by the results of calculating the local electric field and the far electromagnetic field when the silver nanoparticle / dye system was irradiated with white light by the above numerical calculation method. First, in the calculation results for the isolated silver nanoparticle system, when the particle shape is a spheroid of 80 x 80 x 40 nm and light is incident from a single axis direction (using linearly polarized light parallel to the long axis), Fig. 4a As shown, the absorption wavelength of LSP is 430 nm. Rhodamine dyes (
(8) On the other hand, the calculation results for the silver nanoparticle aggregate (here, the two-particle assembly) are very different. As shown in FIG. 5, here, a sample is a system in which two cylinders (infinite length) having a radius of 40 nm are placed close to each other. Even if 3D calculation is not performed, the correct solution can be obtained by 2D calculation for the polarization and incident direction in the 2D section (circle) shown here (Journal of Physical Chemistry B, 2003, Vol. 107, 7607-). 7617) is used in order to save calculation time. At this junction and other general sites, such as the end face opposite to the junction of one particle, a very small amount of dye molecules (assuming absorption at 590 nm, the gap size g (nm) between the two particles is The scattering spectrum is calculated with and without the g × gnm 2 area so as to be filled. As shown in FIG. 5a, when the gap size is 8 nm, when the dye molecule (8 × 8 nm 2 ) is placed on the left end of the left particle (opposite the junction), only the silver nanoparticle without the dye is present. Gives exactly the same scattering spectrum as the case (black circle: when there is no dye, inverted triangle: when a dye is placed at the left end). On the other hand, when a pigment is placed at the junction of two particles, the scattering spectrum is completely different from these. This result is due to the fact that the LSP of the left and right silver nanoparticles is coupled very efficiently as if there is no gap when the dye molecules fill the junction. Actually, the scattering spectrum obtained when the dye is placed at the junction here is very similar to the LSP scattering spectrum when the same silver nanoparticles are contacted without gap (Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107, 7607-7617). This result is ensured by the fact that the dye molecule has an absorption peak close to the LSP absorption wavelength of the silver nanoparticles. In fact, if a material such as glass having a real part of the refractive index equivalent to that of the dye is used in the gap instead of the dye, the large spectral change as obtained here is not observed, and when there is nothing in the gap. The same spectrum was obtained.
(9) Similarly, when the gap is reduced to 4 nm, 2 nm, and 1 nm, the change in the scattering spectrum when the dye is placed in the gap indicates that the amount of adsorbed dye is 4 × 4 nm 2 , 2 × 2 nm 2 , 1 × 1 nm An additional peak due to dye absorption comparable to the LSP peak intensity around 430 nm of silver nanoparticles was observed around 600-800 nm, although it was smaller than 8 nm. Also in these cases, it was confirmed that when the dye molecules were placed in the peripheral region other than the junction, the same scattering spectrum as that obtained without the dye was obtained.
(10) Furthermore, important results were obtained when the dye position was changed in detail. First, when the gap size is 1 nm, an additional band is observed at 660 nm when the dye molecule is 1 × 1 nm 2 ≈1 molecule). In contrast, when the scattering spectrum was calculated when the dye was shifted 5 nm, 7.5 nm, and 10 nm upward (perpendicular to the bonding axis) from the center of the junction, it was almost the same as when no dye was present at 10 nm and 7.5 nm. A matching spectrum was obtained. That is, in these cases, a scattering peak due to absorption of the dye on the long wavelength side is not observed. In contrast, a spectral change just halfway between the center of the junction and the absence of dye was observed when shifted by 5 nm. That is, at this time, a peak due to absorption of the dye was observed at around 760 nm at an intensity about half that when placed at the center of the junction.
(11)これらの結果から、数分子とごくわずかな色素分子(1nm×1nm≒1分子相当)でも接合部にある限り、色素が存在しないときに比べて、有意の散乱スペクトル変化（600-800nmの付加的なバンド）を与える。これに対して、同じ量の色素分子が銀ナノ粒子表面に吸着していても、接合部以外の一般的なサイトに存在する場合には、そのような散乱スペクトル変化を与えない。より詳細には、接合部中心から7.5nm以上動いたとき、散乱スペクトルは色素が吸着していないときと全く同じものになる。従って散乱スペクトル変化から、色素分子の吸着サイトが接合部中央に存在していること、あるいは接合部からどれくらいの距離離れているかを明示することができる。
(12)先に示した実験事実、すなわち銀ナノ粒子接合体が巨大なSERS増強度を与えるとき、弾性散乱スペクトルが長波長側に付加的なバンドを与え、SERS増強度が時間とともに消失したとき、この付加的な散乱ピークも消失することと複合して考えると以下のことが結論づけられる。巨大なSERS活性を与える銀ナノ粒子集合体が、白色光入射に対する弾性散乱スペクトルで長波長側に付加的な散乱ピークを与えるのは、色素分子が銀ナノ粒子接合部に存在するからである。吸着分子が時間とともに接合部から次第に遠ざかったり、あるいは完全に脱離すると、銀ナノ粒子間は有意のギャップが開くので、ここのLSPのカップリングが消失し、それとともに長波長側の散乱ピークが失われる。
(13)この結果を用いると、SERS信号と弾性散乱スペクトルの同時測定により、SERS信号のBlinkingから単一分子が吸着しており、白色光に対する散乱スペクトルからその分子が銀ナノ粒子接合部に存在していることが証明される。同時に、そのときのSERSスペクトルから目的化学種の存在状態を単一分子レベルで解析することができる。さらにこの結果を利用すると、還元法により形成した金属ナノ粒子集合体に限らず、ナノ粒子リソグラフィ法（関連特許、特願2004-32098）により形成された金属ナノ構造のエッジ部分に、目的化学種が吸着していることを単一分子感度で検出し、かつそのラマンスペクトル測定から分子構造のバルク状態からの微小な変化、配向性、周辺化学種との相互作用など状態分析を行うことができる。
(11) From these results, as long as several molecules and very few dye molecules (equivalent to 1 nm × 1 nm ≒ 1 molecule) are present at the junction, a significant change in the scattering spectrum (600-800 nm) compared to when no dye is present. Of additional bands). On the other hand, even if the same amount of the dye molecule is adsorbed on the surface of the silver nanoparticle, such a change in the scattering spectrum is not given if it is present at a general site other than the junction. More specifically, when moving from the center of the junction by 7.5 nm or more, the scattering spectrum is exactly the same as when the dye is not adsorbed. Therefore, it can be clearly shown from the change in the scattering spectrum that the dye molecule adsorption site exists in the center of the junction or how far away from the junction.
(12) The experimental facts shown earlier, that is, when the silver nanoparticle conjugate gives a huge SERS enhancement, the elastic scattering spectrum gives an additional band on the long wavelength side, and the SERS enhancement disappears with time In combination with the disappearance of this additional scattering peak, the following can be concluded. The reason why the silver nanoparticle aggregate that gives a huge SERS activity gives an additional scattering peak on the long wavelength side in the elastic scattering spectrum with respect to the incidence of white light is that the dye molecule exists at the silver nanoparticle junction. When the adsorbed molecules gradually move away from the junction with time or completely desorbed, a significant gap opens between the silver nanoparticles, so the coupling of the LSP here disappears, and a scattering peak on the long wavelength side is also produced. Lost.
(13) Using this result, a single molecule is adsorbed from the Blinking of the SERS signal by simultaneous measurement of the SERS signal and the elastic scattering spectrum, and the molecule is present at the silver nanoparticle junction from the scattering spectrum for white light. It is proved that At the same time, the existence state of the target chemical species can be analyzed at the single molecule level from the SERS spectrum at that time. Furthermore, using this result, not only the metal nanoparticle aggregates formed by the reduction method but also the edge of the metal nanostructure formed by the nanoparticle lithography method (related patent, Japanese Patent Application No. 2004-32098), the target chemical species Can be detected with single-molecule sensitivity, and state analysis such as minute changes from the bulk state of the molecular structure, orientation, and interaction with surrounding chemical species can be performed from the Raman spectrum measurement. .
１ 白色光源
２ CCDカメラ
３ PC
４ 散乱光イメージ、ラマンイメージ
５ ノッチフィルタ
６ 色素を吸着した銀ナノ粒子試料
７ 可動ミラー
８ 分光器
９ 干渉フィルタ
１０ アルゴンイオンレーザ（488nm）
１１ CCD検出器
１２ PC
１３ ラマンスペクトル、散乱スペクトル
１４ 偏光子
１５ 顕微光学系
1
4 Scattered light image,
11
13 Raman spectrum, scattering
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004055008A JP3783060B2 (en) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004055008A JP3783060B2 (en) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006005501A Division JP2006106014A (en) | 2006-01-13 | 2006-01-13 | Method for detecting chemical species adsorbed to metal nanostructure with sensitivity of single molecule, and method for analyzing that state thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005241598A JP2005241598A (en) | 2005-09-08 |
| JP3783060B2 true JP3783060B2 (en) | 2006-06-07 |
Family
ID=35023457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004055008A Expired - Lifetime JP3783060B2 (en) | 2004-02-27 | 2004-02-27 | Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3783060B2 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100947262B1 (en) | 2008-02-28 | 2010-04-01 | 한국표준과학연구원 | Detection Method Using Metallic Nano Pattern and the Apparatus Thereof |
| CN109238989A (en) * | 2018-11-06 | 2019-01-18 | 长春黄金研究院有限公司 | A kind of analysis method of Silver From Ore object phase |
| CN112525877A (en) * | 2019-09-17 | 2021-03-19 | 深圳市新零壹科技有限公司 | Metal ion dynamic detection and regulation method based on Raman spectrum |
| CN111579543B (en) * | 2020-05-15 | 2023-06-30 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | Detection method and application of ultralow-temperature enhanced Raman spectrum signal |
-
2004
- 2004-02-27 JP JP2004055008A patent/JP3783060B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005241598A (en) | 2005-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fazio et al. | SERS detection of Biomolecules at Physiological pH via aggregation of Gold Nanorods mediated by Optical Forces and Plasmonic Heating | |
| Lepinay et al. | Improved detection limits of protein optical fiber biosensors coated with gold nanoparticles | |
| US9797842B2 (en) | Device and method utilizing a metallic nanoparticle assembly structure for detecting a target substance | |
| Miao et al. | High-sensitivity nanophotonic sensors with passive trapping of analyte molecules in hot spots | |
| Doherty et al. | Wavelength dependence of Raman enhancement from gold nanorod arrays: quantitative experiment and modeling of a hot spot dominated system | |
| Hossain et al. | Surface-enhanced Raman scattering: realization of localized surface plasmon resonance using unique substrates and methods | |
| KR101168654B1 (en) | Optical sensor with layered plasmon structure for enhanced detection of chemical groups by sers | |
| Chen et al. | Plasmonic vertically coupled complementary antennas for dual-mode infrared molecule sensing | |
| Kolodny et al. | Spatially correlated fluorescence/AFM of individual nanosized particles and biomolecules | |
| Rastogi et al. | Engineering electromagnetic hot-spots in nanoparticle cluster arrays on reflective substrates for highly sensitive detection of (bio) molecular analytes | |
| Wang et al. | Silver nanoparticles as optical sensors | |
| JP3783060B2 (en) | Single molecule sensitivity detection and state analysis of chemical species adsorbed on metal nanostructures | |
| Canpean et al. | Multifunctional plasmonic sensors on low-cost subwavelength metallic nanoholes arrays | |
| Cui et al. | Bulk phase-encoded gold nanoparticles: the fourth-generation surface-enhanced Raman scattering tag for Hg2+ ion detection | |
| JP2006106014A (en) | Method for detecting chemical species adsorbed to metal nanostructure with sensitivity of single molecule, and method for analyzing that state thereof | |
| Tang et al. | Effect of molecular position and orientation on adsorbate-induced shifts of plasmon resonances | |
| Serrano et al. | Supercritical angle Raman microscopy: a surface-sensitive nanoscale technique without field enhancement | |
| Ma et al. | Capillary Tube Surface-Enhanced Raman Scattering Substrate and High-Sensitivity Molecule Detection | |
| JP6373553B2 (en) | Measuring device using array type sensor | |
| JP2017191109A (en) | Measurement method and measurement device using array type sensor used with enhanced electromagnetic field | |
| Foti et al. | 4.1 Molecular and biomolecular SERS detection in liquid environment | |
| Laible et al. | 3.1 Localized surface plasmon resonance shift sensing | |
| Lim et al. | Large available volume particles for enhanced deep UV local Raman sensing | |
| Wei et al. | A study of localized surface plasmon resonance nanoslit array and applications for chip-based protein detection | |
| Manzato | Development of multi-functional nanostructured membranes for airborne particles collection, fluidic sensing and co-localized plasmonic enhancement |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051115 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060113 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060214 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3783060 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |