JP3781689B2

JP3781689B2 - Genetic diagnostic apparatus and genetic diagnostic method

Info

Publication number: JP3781689B2
Application number: JP2002042943A
Authority: JP
Inventors: 一芳森; 英明橋本; 毅西田; 瑞夫前田; 佳樹片山
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2006-05-31
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: JP2002340859A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子異常の有無を簡単、正確に検出できる遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての疾患には、遺伝性要因と環境要因が種々の確率で関与しているが、先天性代謝異常症・癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマー・自己免疫疾患・アトピー・肥満・アルコール依存などの疾患は、遺伝性要因が非常に大きな割合を占めている。一方、環境要素の寄与が大きい疾患は感染症や外傷の後遺症から誘因される疾患等である。
【０００３】
ところで、近年分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素、すなわち遺伝子の関与がかなり正確に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。現在、最も注目されているのはＳＮＰｓ（スニップス）と呼ばれるものである。これは、ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、個人間の遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。
【０００４】
人を含め地球上の全ての生命体遺伝子（または遺伝子の全集合体を意味するゲノム）は、共通の４つの塩基から成り立っており、この塩基の配列によって様々なタンパク質が作られ、各生物特有の生命活動が行われている。全ての生物に共通する４つの塩基とは、アデニン（Ａと表記される）、グアニン（Ｇと表記される）、チミン（Ｔと表記される）、シトシン（Ｃと表記される）である。人の遺伝子は、約３０〜３２億塩基配列で構成されているといわれているが、各個人で数百から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で他の人と１つの塩基が異なっている場所が存在する。通常、この１塩基の変化が、あるヒト集団の全人口中１％以上の頻度で存在しているものを、ＳＮＰｓと呼んでいる。
【０００５】
従って、全遺伝子（ゲノム）中には、３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しているといわれ、現在世界中でＳＮＰｓの探索が続けられている。ＳＮＰｓが注目されている理由は、ＳＮＰｓの分類により、統計的に各個人の遺伝子が関与しているといわれている多くの疾患に対する罹患率が推測できると考えられているからである。例えば、乳がんを例にとると、乳がんにかかった患者群と正常な群とのＳＮＰｓの比較により、乳がんにかかりやすい人に共通のＳＮＰｓを特定することができる。そして、健康診断時に、遺伝子を調査しそのＳＮＰｓを持った人、すなわち現在は正常でも将来乳がんにかかりやすい体質の人を見つけることが可能になる。
【０００６】
この診断によって、乳がんにかかりやすい体質の人は、頻繁に検査をすることで万一癌に罹患しても、超早期に治療が行え生存の可能性が向上する。それと同様のことが、糖尿病や高血圧などの生活習慣病についても言え、世界中で多くの人が苦しんでいる病気に対して発病の前から食事や生活指導を正確にすることが可能になる。
【０００７】
また、病気の治療に用いている薬剤に関してもＳＮＰｓは重要な役割を期待されている。治療の際に用いられる薬剤は全ての人に均等に効果を示すものではない。一般に薬剤は、ある割合の人には効果があっても他の人には全く効果が無く、かえって副作用等で逆の結果を招くことがあることも広く知られている。因みに、アメリカにおける死亡原因の中で薬剤による副作用が上位に位置しているのは周知のことである。薬剤の効果はその人がもつ体質に深く関与しており、その体質もＳＮＰｓの分類によって区別可能であると言われている。すなわち、ＳＮＰｓの解析による分類で、ある薬剤に対してあらかじめ効果や感受性が予測でき適正な処方をすることが可能になり、患者個々人の体質に合わせた最適な薬剤の投与や副作用の危険性の回避が期待されている。このような医療のことをテーラーメイド医療またはオーダーメイド医療と呼び、将来の実用化が確実視されている。
【０００８】
また癌は、正常な細胞においては重要な役割をする遺伝子上の特定の部位に例えば紫外線や変異原性物質の作用によって突然変異が生じることによって引き起こされることがわかっている。ある特定の遺伝子上の変異を読み取ることで細胞が癌化しているか否かを早い段階から診断できるようになる。そして、犯罪捜査における犯人の特定や曖昧な親子関係の確定さらには本人であるか否かの識別にもＳＮＰｓは、威力を発揮する。前述したように、各個人には３００万〜１０００万のＳＮＰｓが存在しており、両親からそれぞれ別々のＳＮＰｓを引き継ぐため、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓをもつ人間は絶対に存在しないと言われている。これが個人の完全な特定を可能にする理由である。
【０００９】
このように、特定の遺伝子中の１塩基に起きた変異を観察することで医療をはじめ様々の事柄に多大な貢献をもたらす可能性がある。しかしながら現在、特定の遺伝子の変異を観察する方法は以下に述べるような非常に複雑な操作あるいは高価な装置を必要とし、ランニングコストも非常に嵩むため、広く利用されるまでには至っていない状況にある。
【００１０】
現在最も一般的に用いられているＳＮＰｓを調べる方法は、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）と呼ばれている方法である。遺伝子は１種類のタンパク質を形成するための塩基配列情報をもったＤＮＡの単位であるから、塩基配列を端から読んでいけばＳＮＰｓが解明することができる。シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、最も一般的に行われているのは以下に述べるジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。この方法を含めいずれの方法も、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動かキャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別できる技術が基になって成り立っている。
【００１１】
ジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）は、酵素的シーケンシングとも呼ばれ、１本鎖鋳型ＤＮＡの相補的鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを用い、さらに人工的につくった特殊な４種類のジデオキシヌクレオチドを利用するのが特徴である。シーケンシング操作としては、塩基配列を行いたい１本鎖ＤＮＡの３’末端を相補する合成塩基配列をプライマーとして用い、そのプライマーからＤＮＡポリメラーゼと均等に加えられたデオキシヌクレオチドを酵素反応によって伸長させる操作を行うが、この時同時に４つの反応容器を準備しておき、それぞれにＡＴＧＣ４つの塩基の３’末端に水酸基を持たない、従ってこれ以上ＤＮＡ伸長反応を続けることができない塩基アナログであるジデオキシヌクレオチドを別々に少量混入させておく。これにより、伸長中のＤＮＡの末端にジデオキシヌクレオチドが付加された時点でＤＮＡ合成がストップし、それぞれの反応容器中に様々な長さを持った、しかし端は必ず加えた塩基アナログである２本鎖ＤＮＡが形成される。この反応容器にＳ１エンドヌクレアーゼを反応させ、１本鎖ＤＮＡを全て消化し２本鎖ＤＮＡのみとする。こうして得られた４つの反応容器のＤＮＡ鎖をゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動し、分離されたＤＮＡを短い方（速く移動したもの）から順に読めば、鋳型鎖と相補的なＤＮＡの塩基配列がわかる。この際、泳動結果の識別は、例えば加えるジデオキシヌクレオチドのリンまたはイオウを放射性標識したり蛍光を発する化学物質を結合させたりして行う。放射性標識の場合はフィルムへの露光での検出、蛍光化学物質の場合はレーザービームを照射し蛍光を検出する。最近では、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの４種類の塩基アナログを、それぞれ４種類の蛍光波長の異なる試薬により標識し、その４色の蛍光を同時に検出する方法も開発されている。
【００１２】
このように、従来は被験者から分離・精製した遺伝子の正確な塩基配列をこのジデオキシシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ法）あるいはその他の塩基配列決定法により決定し、正常あるいは標準的な塩基配列と比較することによってＳＮＰｓの有無や突然変異の有無の確認、個人の識別等を行っている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、従来からの遺伝子配列決定法を利用した、遺伝子診断や遺伝子による個人の識別は、ターゲットとする遺伝子を単離したのち、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定用装置を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行っていたため、実験に膨大な作業量と非常に長い時間、さらには多大のランニングコストを要していた。また塩基配列決定のための自動化した装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、しかも高価な試薬を大量に必要とするものであった。
【００１４】
そこで、従来のこのような問題を解決するため本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる遺伝子診断装置を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判定できる遺伝子診断方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明の遺伝子診断装置は、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして連絡した密閉流路と、可変電源部を制御して第２電極と第１電極間に印加する電圧の絶対値を増加させる制御部と、内部を通過するＤＮＡの通過量を検出する検出部を備え、さらに密閉流路は、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡ試料とを備え、電圧の絶対値を増加させることにより密閉流路内のＤＮＡ試料が電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする。
【００１７】
これにより、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に検出することができ、小型、軽量、安価に、しかも非常に少ないランニングコストで、診断を自動化することができる。
【００１８】
また、本発明の遺伝子診断方法は、第１容器に緩衝液を収容して第１電極を浸漬するとともに第２容器にも緩衝液を収容して第２電極を浸漬し、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして密閉流路で連絡し、次いで、該密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、ＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極と第１電極間の電圧の絶対値を増加させて、密閉流路内のＤＮＡ試料を電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率もしくは異常ＤＮＡを検出することを特徴とする。
【００１９】
これにより、一塩基以上の遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判定することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載された発明は、緩衝液を収容し第１電極が浸漬された第１容器と、緩衝液を収容し第２電極が浸漬された第２容器と、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして連絡した密閉流路と、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加する可変電源部と、可変電源部を制御して第２電極と第１電極間に印加する電圧の絶対値を増加させる制御部と、密閉流路に設けられ、内部を通過するＤＮＡの通過量を検出する検出部を備え、さらに密閉流路は、緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートと、ＤＮＡ試料とを備え、電圧の絶対値を増加させることにより密閉流路内のＤＮＡ試料が電気泳動され、検出部が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの通過量をそれぞれ測定することを特徴とする遺伝子診断装置であるから、第２電極と第１電極間に電圧を印加して電圧の絶対値を増加させると、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させることができる。よって、分離用ＤＮＡコンジュゲートの作用を受けないノイズＤＮＡはほぼそのままの速度で泳動させることができる。
【００２１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の各濃度調整および分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００２２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながらこの分離用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧の絶対値を増加させたとき、最も低い（絶対値が最も小さい）電圧で一番先に且つ速い速度で泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、もう少し高い電圧（絶対値が大きい）にしないとこの作用を振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、更に高い電圧にしないとコンジュゲートの作用を振り切れないため、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより絶対値を増加させた電圧に比例した３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００２３】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ電圧の絶対値を増加させるから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。
【００２４】
請求項２に記載された発明は、密閉流路が、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液で充たされ、且つ該緩衝液の中に分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とが分離状態で、リニアポリマーを挟んでこの順序で充填された分離用密閉流路カートリッジであって、該分離用密閉流路カートリッジを交換可能に装着する分離部が設けられたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子診断装置であるから、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００２５】
請求項３に記載された発明は、密閉流路が１以上設けられたことを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝子診断装置であるから、密閉流路ごとに分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００２６】
請求項４に記載された発明は、ＤＮＡコンジュゲートがビニル化したＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００２７】
請求項５に記載された発明は、密閉流路内の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００２８】
請求項６に記載された発明は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００２９】
請求項７に記載された発明は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子診断装置であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００３０】
請求項８に記載された発明は、第１容器に緩衝液を収容して第１電極を浸漬するとともに第２容器にも緩衝液を収容して第２電極を浸漬し、第１容器と第２容器間をリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液を充たして密閉流路で連絡し、次いで、該密閉流路内の緩衝液の中に、ＤＮＡ試料に水素結合可能な第１の塩基配列と高分子化合物とが結合し、結合力の差からＤＮＡ試料を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填し、続いて、ＤＮＡ試料を加え、その後、第２電極に正電位を印加するとともに第１電極に負電位を印加し、該第２電極と第１電極間の電圧の絶対値を増加させて、密閉流路内のＤＮＡ試料を電気泳動させ、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離し、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの比率もしくは異常ＤＮＡを検出することを特徴とする遺伝子診断方法であるから、第２電極と第１電極間に電圧を印加して電圧の絶対値を増加させると、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させることができる。よって、分離用ＤＮＡコンジュゲートの作用を受けないノイズＤＮＡはほぼそのままの速度で泳動させることができる。
【００３１】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の各濃度調整および分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００３２】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながらこの分離用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧の絶対値を増加させたとき、最も低い（絶対値が最も小さい）電圧で一番先に且つ速い速度で泳動されて検出部で検出される。しかし、異常ＤＮＡには、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの結合力（但し、正常ＤＮＡに比べて一塩基分弱い）が作用し、もう少し高い（絶対値が大きい）電圧にしないとこの作用を振り切れず、ノイズＤＮＡよりも遅れて泳動され、ノイズＤＮＡの次に検出部で検出される。正常ＤＮＡには最大の結合力が作用し、更に高い電圧にしないとコンジュゲートの作用を振り切れないため、ノイズＤＮＡは勿論のこと、異常ＤＮＡよりも遅れて泳動され、最後に検出部で検出される。これにより絶対値を増加させた電圧に比例した３つのＤＮＡの検出時間に差を生じさせることができる。
【００３３】
このように電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ電圧の絶対値を増加させるから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。
【００３４】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図、図２は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図、図３は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の電気泳動部を含む装置構成図、図４は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図、図５は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図である。
【００３５】
図１において、１は遺伝子診断装置の電源スイッチ、２は装置の種々の操作を行うための操作ボタン、３は表示パネル、４は上蓋、５は装置の筐体である。図２、図３、図４において、６は電気泳動を行うための電気泳動部、７は電気泳動部６を支える支持台、８は電気泳動を行うための制御や後述する吸引ポンプ２０、検出部１５の制御を行い、検出したデータを演算する基板からなる制御演算部である。９は電源ボックス、９ａは電源ボックス９内に設けられた可変電源部である。本遺伝子診断装置ではＤＮＡの種類や濃度、処理条件ごとに異なった最適印加電圧値が存在するため、後述のＤＮＡ試料２３から異常ＤＮＡと正常ＤＮＡを分離するのに最も適した泳動が行えるように、制御演算部８が可変電源部９ａを制御して印加電圧の絶対値を増加させ、最も高分解能の分離が行える電圧に調整する。１０はＤＮＡの２重螺旋（以下、２本鎖）を引き離すための高温部、１１は高温部１０と後記する分離部１２の温度を独立にするための断熱部、１２は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡとを分離するための所定温度に調整するとともに、この部分でＤＮＡを３つのＤＮＡに分離する分離部、１３は高温部１０の温度を調整する第１温調器、１４は分離部１２の温度を調整する第２温調器である。
【００３６】
この分離部１２内の構成の詳細については後述するが、測定開始時には、図５に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が分離部１２の位置から断熱部１１付近、ＤＮＡ試料２３が高温部１０付近になるように配置する。そして、このように設定された配置と電圧制御、濃度調整、温度制御等を行うことにより、電気泳動させながら本遺伝子診断装置はＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに数分〜十数分で分離するものである。
【００３７】
このうちＤＮＡ試料２３は、本実施の形態１においては２本鎖を備えたまま高温部１０に充填、配置され、第１温調器１３を用いて（９０℃以上の所定温度±５℃）の温度になるように加熱、制御される。この加熱により導入されたＤＮＡの２本鎖が１本鎖に自動的に分離される。続いて、分離部１２から断熱部１１にかけては分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が泳動作用を受けながら水素結合の結合力の差によってＤＮＡ試料２３を正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より少なくとも１０℃低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離するためにはＤＮＡの分離に適したこの所定の温度から±１℃の範囲で制御するのがよい。断熱部１１は、本来、分離部１２と高温部１０の間を熱的に遮断して温度調整するために設けられるものであるが、温度的には高温部１０の９０°以上の温度と分離部１２の２０℃〜６０℃の温度との中間温度に置かれ、この温度下での水素結合の結合力差により分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が泳動作用を受けながら正常ＤＮＡと異常ＤＮＡをノイズＤＮＡから分離する。
【００３８】
１５は電気泳動するＤＮＡ試料の通過量を測定する検出部である。図４に基づいて検出部１５について説明すると、１５ａは紫外線を照射するＤ₂ランプ、１５ｂは紫外線を受光するフォトダイオード、１５ｃはフォトダイオード１５ｂが検出した微弱電流を増幅するプリアンプ、１５ｄはデジタル量に変換するＡ／Ｄコンバータである。これらの詳細は後述する。１６は電気泳動のときに正電位を印加する電極（本発明の第２電極）、１７は電気泳動のときに負電位を印加する電極（本発明の第１電極）であり、制御演算部８が可変電源部９ａを制御し、電極１６と電極１７との間の電圧の絶対値を増加させ、電気泳動の強さを変化させることができる。図３、図４、図５において、１８は電気泳動のときの電荷の運搬とＤＮＡ試料のｐＨを安定させるための緩衝液、１８ａは緩衝液１８を収容する陰極側の容器（本発明の第１容器）、１８ｂは緩衝液１８を収容する陽極側の容器（本発明の第２容器）、１８ｄはＤＮＡ結合制御剤とリニアポリマーを緩衝液１８に添加したリニアポリマーゲルであり、電気泳動時にＤＮＡ試料２３が早い速度で泳動しないように泳動を邪魔する働きを持つものである。この働きにより、ＤＮＡ試料２３は分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とキャピラリー管１９内で充分遭遇する機会を持つことが可能となる。なお、１９は電気泳動のときにＤＮＡ試料２３を泳動するためのキャピラリー管（本発明の密閉流路）、２０はキャピラリー管１９の中に緩衝液１８やＤＮＡ試料２３、リニアポリマーゲル１８ｄなどの試薬を注入するための吸引ポンプである。容器１８ａの緩衝液１８の中には電極１７が浸漬され、容器１８ｂの緩衝液１８の中に電極１６が浸漬される。容器１８ａと容器１８ｂ内の緩衝液１８は、キャピラリー管１９内の緩衝液１８によって連通される。従って、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１にも緩衝液１８が液のベースとして混入しており、キャピラリー管１９中全ての部分で同じ濃度の緩衝液１８が存在している。電極１６と電極１７間に電圧を印加すると、キャピラリー管１９内に電気泳動が誘発され、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料２３は負に帯電しているため、容器１８ａ側から容器１８ｂ側へ分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料２３が移動するが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１には分子量が大きい高分子がついているため、電気泳動によってＤＮＡ試料２３の移動量と比較するとほとんど移動はしない。
【００３９】
次に、本発明の遺伝子診断装置で測定を行うために必要な詳細について説明する。本遺伝子診断装置で測定するＤＮＡ試料２３は、人の細胞や血液等から入手したＤＮＡである。約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの方法を利用して目的の部分を目的の長さに切り出して測定用に数を増加させる作業が必要である。ただ、このＰＣＲに関しては本遺伝子診断装置の説明に必要がないため具体的な説明を省略する。
【００４０】
ＰＣＲなどで取り出した目的のＤＮＡは塩基数でいうと６個程度〜１０００個程度であるが、約３０億塩基対あるといわれるヒト・ゲノムＤＮＡの中に、同じＤＮＡ配列が存在しないと確率的に考えられる個数としては、５０個程度であればよい。しかし、これは総数が５０個程度あればよいということであるから、数回に分けてＤＮＡを切り取る場合は６個〜１２個ずつに分けるのでもよい。そして、本発明者らの実験によると、本遺伝子診断装置で正常ＤＮＡと１塩基違いの異常ＤＮＡを分離する場合、塩基の個数は６個〜１２個が最も効率よく分離できるという結果を得ている。ただ、この異常ＤＮＡの分離はＤＮＡ試料２３の濃度（μＭ、但し、Ｍ＝モル／リットル）、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡの濃度（モル％）、測定温度、その他と密接な関係があるため、適正な条件にしないと分離が起こらないから、このような条件を設定することができるか否かに留意する必要がある。例えば、ＤＮＡ試料２３の濃度は１〜１０（μＭ）が適当であり、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に含まれるＤＮＡが、基本となるリニアポリマーのモルに対して０．０００２〜０．０５（モル％）程度が適当であるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料２３の濃度の２０〜６００倍とするのが望ましい。以上説明したように本遺伝子診断装置のＤＮＡ試料は上述のＰＣＲなどにより前処理によって得られる６個程度〜１０００個程度の塩基配列を持つＤＮＡ試料が必要であり、適正な条件設定が必要である。
【００４１】
次に、図３、図４、図５のキャピラリー管１９について説明すると、キャピラリー管１９にゲルを入れて電気泳動を行うと、電気浸透流と呼ばれる液の流れが発生してしまうため、本遺伝子診断装置ではこの現象が起きないようにする必要がある。このためキャピラリー管１９の内壁をアクリルアミドなどでコーティングするのがよい。電気浸透流の発生が阻止できるならコーティング方法は他の方法でもよい。例えば、一般に販売されているコーティングキャピラリー管を使用するのでもよい。なお、キャピラリー管１９としては内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管が、紫外線を９０％以上透過でき、且つ後述するように紫外線を利用してＤＮＡを検出するとき、紫外線の通過量を容易に検出できるから最も適当である。そして、溝のある板と、紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせでキャピラリー管１９に相当する密閉流路を構成するのでも、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出を容易に行うことができる。なお、溝のある板を紫外線が透過可能な板にした場合は透過光を検出し、溝のある板を紫外線が不透過の板にした場合は、異常ＤＮＡを反射光で検出する。反射光を検出する場合には溝形状を均一な反射面とするため矩形断面にする等の工夫が必要である。
【００４２】
容器１８ａ，１８ｂの中やキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８は、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．２〜ｐＨ８程度）緩衝液等を利用するのが適当である。このうちキャピラリー管１９に収容する緩衝液１８に必要に応じて混入されるＤＮＡ結合制御剤としては、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に対するＤＮＡの結合を促進する塩化マグネシウム等の結合促進剤と、離脱を促す尿素等の離脱剤の２種類が存在する。この２種類のＤＮＡ結合制御剤は、２種類の混合割合や、物質（例えば、結合促進剤として他の電解質）を選ぶことで、ＤＮＡに対する多様な泳動速度の制御が可能になるものである。リニアポリマーゲル１８ｄに含まれるリニアポリマーとしては、ポリアクリルアミドを用いることができ、これは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のコンジュゲート作成にも利用されるため、相性がよく適当である。
【００４３】
次に、キャピラリー管１９への充填順序であるが、図５に示すように先ずキャピラリー管１９内にリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤と緩衝液１８を含んだリニアポリマーゲル１８ｄを導入し、続いて以下詳述する分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を加える。分離用ＤＮＡコンジュゲート２１導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよい。図５の場合導入後に分離状態で導入している。その後、緩衝液１８もしくは純水で希釈したＤＮＡ試料２３を導入して電気泳動する。ＤＮＡ試料２３導入後にリニアポリマーゲル１８ｄを導入してもよく、図５の場合導入後に分離状態で導入している。
【００４４】
本実施の形態１では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を作成するのにアクリルアミドとＤＮＡを重合させているため、ＤＮＡとの重量差、構造差は大きく、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１の泳動速度（０．６ｃｍ／分〜０．７ｃｍ／分）は、ＤＮＡの最適の泳動速度（１３ｃｍ／分〜２０ｃｍ／分）の１／２０〜１／３０程度であって、非常に動きが鈍く相対的に擬似的に固定されているといってもよいような状態が実現される。従って、測定開始時、充填物を収容したキャピラリー管１９を高温部１０、断熱部１１、分離部１２の間で位置を調整しながら、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を分離部１２から断熱部１１付近に配置し、高温部１０には後述のＤＮＡ試料２３を配置する。このようにすることにより、高温部１０でＤＮＡ試料２３の２本鎖を１本鎖に分離できる。そして断熱部１１から分離部１２にかけて分離用ＤＮＡコンジュゲート２１を充填したので速度差で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離し、ノイズＤＮＡも分離することができる。
【００４５】
なお、遺伝子診断装置のキャピラリー管１９にＤＮＡ試料や分離用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液を交換的に導入する機構、例えば図３に示した吸引ポンプ２０のほかに、各ＤＮＡ試料や分離用ＤＮＡコンジュゲート、リニアポリマーの各溶液をそれぞれ保管する容器と、その容器を自動的に交換し、それをキャピラリー管１９に接続する機構を装備するのが望ましい。
【００４６】
さらに、キャピラリー管１９を１本または複数本単位でユニット化し、これを交換用の分離用密閉流路カートリッジとして、分離部１２と高温部１０、断熱部１１に装着可能にし、分離部１２内の第２温調器１４、あるいは高温部１０内の第１温調器１３で温度制御するようにするのも適当である。キャピラリー管１９内に、予めリニアポリマーゲル１８ｄとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液１８を充填し、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料２３を分離状態で充填して分離用密閉流路カートリッジとして用意しておくことが可能になる。このように構成することで、測定を行うたびに分離用密閉流路カートリッジごと交換するため、分離用密閉流路カートリッジごとに分離用ＤＮＡコンジュゲート２１、ＤＮＡ試料２３の配置を予め設定できるから、測定が簡単に行え、且つ正確な測定が行える。なお、この分離用密閉流路カートリッジでは、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料２３を分離状態にするため、その間にリニアポリマーゲル１８ｄを挟んで充填している。それぞれの中にリニアポリマーゲル１８ｄを混合させて充填するのでもよい。
【００４７】
続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１について説明する。図６は本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図である。図６において、２１は分離用ＤＮＡコンジュゲートである。ＤＮＡは二本鎖を形成するものとこれを分離した一本鎖のものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合し易い性質をもち、ＤＮＡの二本鎖においてはＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一本鎖のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）と配列されている場合、残りの鎖のＤＮＡは、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）という塩基配列をもっている。この関係は相補的関係と呼ばれるもので、この相補関係を充たす限り、ＡとＴ、ＧとＣがそれぞれ水素結合により結合し、二本鎖を形成する。本発明ではこの関係を利用するために、図６に示すように分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分にはＤＮＡ試料の正常ＤＮＡに相補的な塩基配列を持たせている。従って、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの塩基配列がＡＴＣＧＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号１に記載）を含み、異常ＤＮＡがＡＴＣＡ^*ＣＧＴＣＴＡＧＣ（配列番号３に記載）で、＊で示した部分で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの塩基が異なっている場合、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ部分の配列（本発明の第１の塩基配列）をＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）とすると、異常ＤＮＡはＡ^*において分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と相補的ではなくなるため水素結合せず、水素結合全体の結合力はＤＮＡ試料の正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより１塩基分の結合力分だけ大きくなる。その結果、後で説明する電気泳動時に正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより強い結合力で長い時間分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と結合するため、正常ＤＮＡは異常ＤＮＡより相対的に遅延するようになる。というのは、電気泳動時結合力だけでなく電気泳動による引離力も作用するから、多数のＤＮＡが断続的に結合と離脱を繰り返すような結合状態となるからである。そして、この泳動速度を平均的にみると、長い時間結合する正常ＤＮＡの方が異常ＤＮＡより泳動速度が低下することになる。ＤＮＡ試料の中には、２本鎖のＤＮＡのうち測定対象ではない分離した残りの１本鎖ＤＮＡのように正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ以外のＤＮＡも含まれており、このＤＮＡが後で説明する電気泳動時にノイズとして作用するが、このノイズＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡとはほとんど無反応で結合しないから、最も速い泳動速度をもち分離されることになる。なお、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡ総量は、ＤＮＡ試料の濃度の２０〜６００倍とするのが適当である。
【００４８】
次に、このような分離用ＤＮＡコンジュゲート２１の作成・合成方法について説明する。ビニル化ＤＮＡを合成するために、ＰＣＲによって、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１用のＤＮＡを切り出す。上述の例では、ＴＡＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ（配列番号２に記載）が分離用ＤＮＡコンジュゲート２１のＤＮＡである。次に、目的の塩基配列を有するＤＮＡの５’末端をアミノ化（通常は、ヘキシル基を介してアミノ化）する。このようにして得られたアミノ化ＤＮＡを２．６ｍＭになるように滅菌した超純水を加えて希釈する。次いで、ＭＯＳＵ（メタクリロイドオキシスクシンイミド）を７１．３８８ｍＭになるようにＤＭＳＯ（ディメチルスルオキシド）で希釈する。そして、このようにして得たアミノ化ＤＮＡとＭＯＳＵを１：５０の比率になるように加えて調整する。さらに、この調整溶液に対して、ｐＨ調整用としてｐＨ９になるように炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムで調整した溶液を、アミノ化ＤＮＡの量と等量加える。
【００４９】
そして、得られた溶液を一晩振とうする。その後、ＨＰＬＣ（ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速液体クロマトグラフィー）を使用して、振とうした溶液中のビニル化ＤＮＡを、アミノ化ＤＮＡ，ＭＯＳＵ，その他と分離する。ビニル化ＤＮＡは溶離液（ＴＥＡＡ；トリエチルアミン−酢酸とアセトニトリルの混合溶液）を含んでいるため、さらに真空乾燥機能を持った遠心エバポレーターで減圧濃縮する。
【００５０】
次いで、重合溶液である１０％のＡＡＭ（アクリルアミド）を５３μｍｏｌ窒素置換する。さらに、重合開始剤である１．３４％のＴＥＭＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。これを重合開始剤である１．３４％のＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）を同じく超音波で脱気した滅菌超純水で希釈する。さらに濃縮したビニル化ＤＮＡを滅菌した超純水で希釈する。そして、１００μｌの分離用ＤＮＡコンジュゲートを合成するために、上記のＡＡＭを３４μｌ、上記のＴＥＭＤとＡＰＳを各々５μｌ、ビニル化ＤＮＡがＡＡＭに対して０．０１％モル〜０．０５％モルになるように加え、１００μｌになるように滅菌超純水を追加して、６０分程度放置しておくとアクリルアミド化された分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が得られる。
【００５１】
なお、未反応のビニル化ＤＮＡを除去するために、適当な大きさの孔径選択したゲルろ過を数十回に分けて行うと、純度の高いＤＮＡコンジュゲートが得られる。
【００５２】
続いて、本実施の形態１の遺伝子診断装置の動作について説明する。先ず遺伝子診断装置内に、ＤＮＡ試料や各溶液を導入したキャピラリー管１９をセットし、図３、図４に示すように両端に容器１８ａ，１８ｂ内の緩衝液１８を浸す。この電極１６と電極１７間に可変電源部９ａによって電圧の絶対値が増加するように印加する。最大電圧の大きさとして望ましくは１０〜２０キロボルトが好ましいが、電解質や電極の状態により１００ボルト〜３０キロボルトでもよい。例えば、低電解質濃度の場合や、電極面積が大きな場合には電圧を低電圧にする。そして、最初から電圧の絶対値を増加させるのではなく、まず準備用の３０キロボルト以上の高電圧を印加し、ノイズＤＮＡをいち早く分離すれば、測定を迅速に行うことができる。そして、その後徐々に電圧の絶対値を増加させて、高電圧を印加して行く。また、徐々に電圧の絶対値を増加させる場合、規則的或いは不規則に増加させても良いが、特に好ましい方法は、電圧を掃引して印加することである。掃引とは、電圧を単位時間あたり一定値で変化させる事であり、例えば、０ボルトから１キロボルト／秒で掃引を開始すれば、１０秒後には１０キロボルト印加することになる。
【００５３】
ここで、印加電圧を掃引する理由を説明すると、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に対するＤＮＡ試料２３の結合力と、電気泳動力による引離力との差が、ＤＮＡの泳動速度や移動差に大きな影響を与えるため、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡの分離が最も効果的に行われる電圧を調整するため掃引するものである。掃引により最も泳動速度に差が生じる電圧が分かったら、この電圧を保てばよい。印加電圧を掃引することで、分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整できると言う効果が得られる。
【００５４】
というのは、ノイズＤＮＡは、掃引電圧が低い段階で一番先に泳動されて検出部で検出されるが、異常ＤＮＡは分離用ＤＮＡコンジュゲート２１に対して一塩基分弱い結合力を有するため少し高電圧にならないと、これを振り切って離脱できない。さらに、正常ＤＮＡはもっと電圧を高くしないと離脱できない。この付近の電圧を印加しておけば、ノイズＤＮＡと異常ＤＮＡと正常ＤＮＡは明確に分離される。但し、これより掃印電圧を上げると、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分解能が低下するため、正常ＤＮＡが泳動を開始する電圧付近に電圧を保つのが最適となる。
【００５５】
そして、当初３０キロボルト程度以上の準備電圧を短時間印加した後、掃引開始電圧を簡単に通常０ボルトから開始するのでよいが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料の結合条件によっては、３０キロボルト以上を印加した後、５キロボルト〜７キロボルトから掃引を開始してもよい。なお、キャピラリー管１９内のＤＮＡは陽極側に進むため、可変電源部９ａは電極１６を正電位、電極１７を負電位になるように印加する必要がある。
【００５６】
電圧が掃引されるとＤＮＡ試料２３は泳動され、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１は正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとの結合力に一塩基分の差があり、泳動されていくとき両者間に移動速度差が生じ、ノイズＤＮＡとの間で大きな移動差を生じる。なお、掃引に当たっては、あまりにゆっくりとした掃引は泳動時間を長くしすぎることになり、キャピラリー管１９内で緩衝液１８が乾燥するので避けなければならない。
【００５７】
次に、分離が行われる高温部１０と分離部１２、断熱部１１の説明を行う。上述したように、高温部１０でＤＮＡの２本鎖を離すために９０℃以上の（所定温度±５℃）になるように第１温調器１３を用いて制御する。また、分離部１２では、ＤＮＡ試料の状態によっても異なるが、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料の結合力の差に基づいて正常ＤＮＡや異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡを分離できるように、高温部１０の温度より１０℃程度低温、すなわち１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保たなければならない。実施の形態１の遺伝子診断装置では、キャピラリー管１９を覆っている分離部１２の下部に、シリコンラバーヒーターやニクロム線等と熱電対やサーマル等の温度センサーを配置し、第２温調器１４で所定の温度±１℃以下になるように管理する。ただ、環境温度によっては室温が目的の所定温度を超える場合もあり、シリコンラバーヒーターやニクロム線等に代えて、ペルチェ素子等の暖・冷可能な部品を使うのがよい。また、断熱部１１はガラスウールや発砲剤、雲母、多孔質セラミックス等の断熱材もしくは、中身を真空にしたものを使用するのでもよい。断熱部１１付近では高温部１０と分離部１２の中間温度となるから、これを利用して分離用ＤＮＡコンジュゲート２１で正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとをノイズＤＮＡから分離することができる。
【００５８】
続いて、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１の作用で泳動速度に差を生じ、移動差が生じた正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡを、どのようにして検出するか説明する。図７は、泳動開始からの経過時間を横軸にして吸光度を縦軸にしたときの経過時間と吸光度の関係図である。検出は紫外線の照射が正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ、ノイズＤＮＡによって遮光されたときの吸光度を測定することで行う。実施の形態１においては、図５に示すようにキャピラリー管１９の一部でガラス部を露出させ、Ｄ₂ランプ１５ａから波長２６０ｎｍの紫外線を照射し、このとき得られる紫外線照射光をフォトダイオード１５ｂで検出し、吸光度を測定している。制御演算部８によって可変電源部９ａを制御してＤ₂ランプ１５ａを発光させ、フォトダイオード１５ｂで検出した電流はプリアンプ１５ｃで増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５ｄでデジタル量として吸光度に制御演算部８で換算される。制御演算部８はタイマ（図示しない）を内蔵し、泳動開始時間からの経過時間を測定することができる。図７において、時間的に早い方（Ｉ）が、ＤＮＡコンジュゲートと結合しないノイズＤＮＡ、時間が中位の（ＩＩ）が異常ＤＮＡ、時間が遅い（ＩＩＩ）が正常ＤＮＡである。
【００５９】
この関係図よりピークの高さと時間とピークの数を読み取れば、ピークの数からＤＮＡ試料に異常ＤＮＡが含まれていることが分かる。すなわち、ピークの数から異常ＤＮＡが存在するか否かが判定できる。なお、印加する電圧やＤＮＡ濃度、ＤＮＡの長さ（塩基の個数）によってはピークの数を異常ＤＮＡとノイズＤＮＡだけにすることができるから、このときは異常ＤＮＡの通過量だけを測定する。また、ピークの高さを比べるのは、同じ条件下で電気泳動されたＤＮＡ中の泳動速度差のある２つの集合の吸光度差を示すから、異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの存在比率に相当し、存在比率の判定が可能になる。異常ＤＮＡの存在量の判定は、標準ＤＮＡ試料の検出ピーク波形から得られた標準データを制御演算部８に予め入力しておき、そのデータと測定したデータを比較して換算すればよい。
【００６０】
以上説明したように、本実施の形態１の遺伝子診断装置と遺伝子診断方法によれば、細胞や血液等から取り出したＤＮＡの中で、特定のＤＮＡを制限酵素などで取り出したＤＮＡ試料中に含まれる正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの存在比率等が分かることにより、遺伝子診断、判定ができる。
【００６１】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置及び遺伝子診断方法について図１，図２，図４〜図８に基づいて説明する。図８は本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図である。実施の形態２の遺伝子診断装置は、実施の形態１の遺伝子診断装置をＤＮＡ試料としてＤＮＡの１本鎖のものに対応させたものであり、基本的に実施の形態１の遺伝子診断装置と同一であるから、特徴部分の説明を行うにとどめ、詳細な説明は実施の形態１に譲って省略する。
【００６２】
図８に示すように、実施の形態２の遺伝子診断装置では、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１と１本鎖のＤＮＡ試料２３を直接分離部１２内に導入する。すなわち、電気泳動部６を基本的に分離部１２だけで構成している。実施の形態１の高温部１０、断熱部１１は存在しない。分離用密閉流路カートリッジの形式で導入する場合は、この順序で分離用ＤＮＡコンジュゲート２１とＤＮＡ試料２３が充填されたキャピラリー管１９を、測定ごとに交換して分離部１２に装着する。
【００６３】
実施の形態１においては、２本鎖のＤＮＡ試料２３が供給され、これを自動的に１本鎖にするために高温部１０が設けられている。しかし、実施の形態２においてはＤＮＡ試料２３として供給されるのが１本鎖のＤＮＡであり、２本鎖のＤＮＡを分離する必要がないため高温部１０と断熱部１１が不要になっている。従って、測定開始時に、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１が分離部１２内、ＤＮＡ試料２３が分離部１２の入口付近になるように配置さえすれば、測定を直ちに実行できる。そして、分離部１２の第２温調器１４は、実施の形態１と同様に１５℃〜８０℃、望ましくは２０℃〜６０℃の温度範囲の所定温度に保つように制御される。このように温度制御することで、ＤＮＡ試料２３を、分離用ＤＮＡコンジュゲート２１によって、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとノイズＤＮＡに分離することができる。
【００６４】
このように、実施の形態２の遺伝子診断装置は、高温部１０と断熱部１１が不要であるから、診断装置の構成が簡単化でき、制御も容易で、扱い易いものとすることができる。
【００６５】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、以下のような有利な効果が得られる。
【００６６】
請求項１に記載された遺伝子診断装置は、第２電極と第１電極間に電圧の絶対値を増加させて印加すると、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させることができる。よって、分離用ＤＮＡコンジュゲートの作用を受けないノイズＤＮＡはほぼそのままの速度で泳動させることができる。
【００６７】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の各濃度調整および分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００６８】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながらこの分離用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧の絶対値を増加させたとき、最も低い電圧で一番先に検出部で検出されるが、異常ＤＮＡは、少し高い電圧で検出され、正常ＤＮＡは更に高い電圧で検出される。これにより３つのＤＮＡに、絶対値を増加させた電圧に比例した検出時間の差を生じさせることができる。
【００６９】
電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ電圧の絶対値を増加させるから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができ、小型、軽量、低ランニングコストの安価な装置とすることができ、診断の自動化がきわめて容易である。
【００７０】
これにより、癌・糖尿病・高血圧・アルツハイマーなどの様々な遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、発症前の予防あるいは極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、突然変異が起き癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定して利用することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を遺伝子診断装置によって付与することができる。
【００７１】
請求項２に記載された遺伝子診断装置は、予めリニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤を含む緩衝液と、分離用ＤＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ試料とを充填した分離用密閉流路カートリッジを用意しておくことができ、測定毎に分離部に分離用密閉流路カートリッジを交換して装着すればよく、測定を簡単に且つ容易に行うことができる。
【００７２】
請求項３に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路ごとに分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ結合制御剤を変化させて、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡの分離環境を密閉流路ごとに変化させることができる。
【００７３】
請求項４に記載された遺伝子診断装置は、ＤＮＡ試料の正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを明確に分離して測定することが可能となる。
【００７４】
請求項５に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路内の液体を２０℃〜６０℃に調整して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを分離するから、正常ＤＮＡと異常ＤＮＡを温度調整により分離用ＤＮＡコンジュゲートに結合したり離脱させたりすることが可能であり、結合力を温度で調整でき、分離後それぞれを検出部で測定することが可能となる。
【００７５】
請求項６に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が内径５０〜１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリー管であるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７６】
請求項７に記載された遺伝子診断装置は、密閉流路が溝のある板と紫外線が９０％以上透過する板との組み合わせであるから、紫外線を９０％以上透過でき、紫外線の通過量を検出することで異常ＤＮＡの検出が容易にできる。
【００７７】
請求項８に記載された遺伝子診断方法は、第２電極と第１電極間に電圧の絶対値を増加させて印加すると、ＤＮＡ試料は電気泳動することができるが、分離用ＤＮＡコンジュゲートは高分子化合物と結合したものであるから、泳動速度はＤＮＡ試料と比較すると数％にすぎず（但し、高分子化合物の種類と長さに依存する）、相対的には擬似固定状態にすることができる。従って、ＤＮＡ試料は電気泳動によって、分離用ＤＮＡコンジュゲート部分を通過する。その際に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとの水素結合力差を利用して正常ＤＮＡと異常ＤＮＡ群の泳動速度をノイズＤＮＡに対して低下させることができる。よって、分離用ＤＮＡコンジュゲートの作用を受けないノイズＤＮＡはほぼそのままの速度で泳動させることができる。
【００７８】
なお、ＤＮＡ試料を遅延させる方法としてアフィニティＤＮＡがあるが、アフィニティＤＮＡはキャピラリー管等の密閉流路の壁面に固定することが一般的であり、その固定処理は難しく、一度使用すると通常密閉流路を使い捨てにしなければならないが、本発明によれば擬似固定であるため使い捨てにする必要はなく、分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の各濃度調整および分離用ＤＮＡコンジュゲートや試料の混合比率の調整がきわめて容易になる。
【００７９】
正常ＤＮＡ及び異常ＤＮＡは移動しながらこの分離用ＤＮＡコンジュゲートの結合力の作用を受け、この作用を受けないノイズＤＮＡは、電圧の絶対値を増加させたとき、最も低い電圧で一番先に検出部で検出されるが、異常ＤＮＡは、少し高い電圧で検出され、正常ＤＮＡは更に高い電圧で検出される。これにより３つのＤＮＡに、絶対値を増加させた電圧に比例した検出時間の差を生じさせることができる。
【００８０】
電気泳動とＤＮＡの水素結合を利用するから数分〜十数分という短時間のうちにＤＮＡを分離でき、且つ電圧の絶対値を増加させるから分解能の高い最適電圧にきわめて簡単に調整でき、正確にＤＮＡの異常の有無を検出することができる。この遺伝子診断方法によれば、遺伝子の変異に起因する疾患に関して、その疾患に対する発症の危険性を予知し、予防と極めて早期の発見をすることができる。また、各個人が持つ遺伝子の多様性を調査することで、薬品の副作用と効果の有無をあらかじめ推測し、各個人に最も適合した医薬品を提供することが可能になる。さらに、癌化してしまった組織から採取した遺伝子の変異を速やかに決定することができる。個人を特定し、犯罪捜査や親子関係の特定、各個人のセキュリティーの確保に決定的な信頼性を与えることができる。
【００８１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の外観図
【図２】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の上蓋開放外観図
【図３】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の電気泳動部を含む装置構成図
【図４】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の制御回路要部図
【図５】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との導入状態図
【図６】本発明の実施の形態１における遺伝子診断装置の密閉流路内の分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料との関係概念図
【図７】経過時間と吸光度の関係図
【図８】本発明の実施の形態２における遺伝子診断装置の装置構成図
【符号の説明】
１電源スイッチ
２操作ボタン
３表示パネル
４上蓋
５筐体
６電気泳動部
７支持台
８制御演算部
９電源ボックス
９ａ可変電源部
１０高温部
１１断熱部
１２分離部
１３第１温調器
１４第２温調器
１５検出部
１５ａＤ₂ランプ
１５ｂフォトダイオード
１５ｃプリアンプ
１５ｄＡ／Ｄコンバータ
１６，１７電極
１８緩衝液
１８ａ，１８ｂ容器
１８ｄリニアポリマーゲル
１９キャピラリー管
２０吸引ポンプ
２１分離用ＤＮＡコンジュゲート
２３ＤＮＡ試料[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a genetic diagnostic apparatus and a genetic diagnostic method that can easily and accurately detect the presence or absence of a genetic abnormality.
[0002]
[Prior art]
All diseases involve genetic factors and environmental factors with various probabilities, but diseases such as congenital metabolic disorders, cancer, diabetes, hypertension, Alzheimer, autoimmune diseases, atopy, obesity, and alcoholism Hereditary factors account for a very large proportion. On the other hand, diseases that have a large contribution of environmental factors include diseases caused by infections and aftereffects of trauma.
[0003]
By the way, due to the rapid development of molecular biology in recent years, genetic elements, that is, gene involvement in various diseases have been elucidated fairly accurately, and attention has been focused on gene-targeted medicine. Yes. At present, what is attracting the most attention is SNPs (snips). This is an abbreviation for single nucleotide polymorphism, which is generally translated as “single nucleotide polymorphism”, and is a general term for differences in one code (one base) in genes between individuals.
[0004]
All life-form genes on earth, including humans (or the genome that means the entire collection of genes), are composed of four common bases, and various proteins are created by the sequence of these bases. Life activities are taking place. The four bases common to all organisms are adenine (denoted as A), guanine (denoted as G), thymine (denoted as T), and cytosine (denoted as C). Human genes are said to be composed of about 3 to 3.2 billion base sequences, but each individual has a base that is different from other people at a rate of about one in several hundred to 1000 bases. Exists. Usually, this single base change is present at a frequency of 1% or more in the total population of a certain human population, and is called SNPs.
[0005]
Therefore, it is said that there are 3 to 10 million SNPs in all genes (genome), and the search for SNPs is currently continued all over the world. The reason why SNPs are attracting attention is that it is considered that the morbidity rate for many diseases, which are said to be statistically related to the genes of each individual, can be estimated by the classification of SNPs. For example, taking breast cancer as an example, SNPs common to those who are likely to have breast cancer can be identified by comparing SNPs between a group of patients with breast cancer and a normal group. At the time of a health examination, it becomes possible to find a person who has investigated the gene and has the SNPs, that is, a person who is normal but is likely to have breast cancer in the future.
[0006]
With this diagnosis, a person with a constitution that is likely to have breast cancer can be treated very early, and the possibility of survival can be improved even if he / she suffers from cancer. The same can be said for lifestyle-related diseases such as diabetes and hypertension, and it is possible to accurately diet and guide living before the onset of diseases that many people around the world suffer.
[0007]
In addition, SNPs are expected to play an important role regarding drugs used for treatment of diseases. Drugs used during treatment are not equally effective for everyone. In general, it is well known that drugs are effective for a certain proportion of people but not for others at all, and may cause adverse results due to side effects. Incidentally, it is well known that drug side effects are at the top of the causes of death in the United States. The effect of the drug is deeply related to the constitution of the person, and the constitution is said to be distinguishable by the classification of SNPs. That is, the classification based on the analysis of SNPs makes it possible to predict the effect and sensitivity of a certain drug in advance and make an appropriate prescription, and the optimal drug administration and risk of side effects according to the individual patient's constitution. Avoidance is expected. Such medical care is called tailor-made medical care or tailor-made medical care, and future practical use is surely expected.
[0008]
In addition, it is known that cancer is caused by a mutation occurring at a specific site on a gene that plays an important role in normal cells, for example, by the action of ultraviolet rays or mutagenic substances. By reading a mutation on a specific gene, it becomes possible to diagnose from an early stage whether or not a cell is cancerous. SNPs are also effective in identifying criminals in criminal investigations, determining ambiguous parent-child relationships, and identifying whether or not they are individuals. As described above, there are 3 to 10 million SNPs in each individual, and since there are separate SNPs from parents, there are absolutely no humans on the planet who have the same SNPs even if they are parents and siblings. It is said not to. This is the reason why complete identification of individuals is possible.
[0009]
In this manner, observing a mutation that occurs at one base in a specific gene may greatly contribute to various matters including medical treatment. However, at present, the method of observing a mutation of a specific gene requires a very complicated operation or an expensive apparatus as described below, and the running cost is very high, so that it has not yet been widely used. is there.
[0010]
The most commonly used method for examining SNPs at present is a method called sequencing (determining the base sequence) in which the base sequence of DNA is directly read from the end. Since a gene is a unit of DNA having base sequence information for forming one kind of protein, SNPs can be elucidated by reading the base sequence from the end. There are several reports on the sequencing method, but the most commonly performed method is dideoxy sequencing (Sanger method) described below. All of these methods, including this method, are based on a technique that can separate and identify the difference in length of one base length by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis with high resolution.
[0011]
The dideoxy sequencing (Sanger method), also called enzymatic sequencing, uses DNA polymerase to synthesize complementary strands of single-stranded template DNA, and then produces four special types of dideoxynucleotides artificially created. The feature is to use. As a sequencing operation, a synthetic base sequence that complements the 3 'end of the single-stranded DNA to be sequenced is used as a primer, and deoxynucleotides added equally from the primer to DNA polymerase are extended by an enzymatic reaction. At this time, four reaction vessels were prepared at the same time, and each did not have a hydroxyl group at the 3 'end of the ATGC four bases, and therefore dideoxynucleotide, a base analog that could not continue the DNA extension reaction any more. Mix a small amount separately. As a result, DNA synthesis was stopped when dideoxynucleotide was added to the end of the extending DNA, and each reaction vessel had various lengths, but the ends were always added base analogs. Stranded DNA is formed. The reaction vessel is reacted with S1 endonuclease to digest all the single-stranded DNA into only double-stranded DNA. If the DNA strands of the four reaction vessels thus obtained are subjected to gel electrophoresis or capillary electrophoresis, and the separated DNA is read in order from the shorter one (moved faster), the base sequence of the DNA complementary to the template strand will be Recognize. At this time, the electrophoresis results are identified by, for example, radioactively labeling the added dideoxynucleotide phosphorus or sulfur or binding a fluorescent chemical substance. In the case of a radioactive label, detection is performed by exposure to a film. In the case of a fluorescent chemical substance, fluorescence is detected by irradiating a laser beam. Recently, a method has been developed in which four types of base analogs A, T, G, and C are labeled with four types of reagents having different fluorescence wavelengths, and the four colors of fluorescence are simultaneously detected.
[0012]
In this way, the conventional base sequence of a gene isolated and purified from a subject is determined by this dideoxy sequencing (Sanger method) or other base sequence determination method, and compared with a normal or standard base sequence. Confirmation of the presence of SNPs and mutations, identification of individuals, etc.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, genetic diagnosis and identification of individuals by gene using conventional gene sequencing methods are performed by isolating the target gene, then amplifying and purifying it, and using a device for determining the base sequence of the gene. Since it was performed by reading the base sequence of the target gene, the experiment required a huge amount of work, a very long time, and a great running cost. In addition, an automated apparatus for determining a base sequence is very expensive, occupies a large space, and requires a large amount of expensive reagents.
[0014]
Therefore, in order to solve such a conventional problem, the present invention can detect a genetic abnormality of one or more nucleotides in a short time, easily and accurately, and is small, light and inexpensive, and has a very low running cost. An object of the present invention is to provide a genetic diagnosis apparatus capable of automating diagnosis.
[0015]
Furthermore, an object of the present invention is to provide a genetic diagnosis method that can easily and accurately determine a gene abnormality of one or more nucleotides in a short time.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the genetic diagnosis apparatus of the present invention controls a sealed flow path in which the first container and the second container are filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, and a variable power supply unit. And a control unit for increasing the absolute value of the voltage applied between the second electrode and the first electrode, and a detection unit for detecting the amount of DNA passing through the second electrode. In addition, a DNA conjugate for separation, wherein a base sequence capable of hydrogen bonding and a high molecular weight compound are bonded to a DNA sample, and the DNA sample is separated into normal DNA, abnormal DNA and noise DNA from the difference in binding strength; The DNA sample in the sealed channel is electrophoresed by increasing the absolute value of the voltage, and the detection unit measures the passing amount of normal DNA and abnormal DNA, respectively.
[0017]
Thereby, a genetic abnormality of one base or more can be detected easily and accurately in a short time, and the diagnosis can be automated with a small size, light weight, low cost, and very low running cost.
[0018]
In the genetic diagnosis method of the present invention, the buffer solution is accommodated in the first container and the first electrode is immersed, the buffer solution is also accommodated in the second container and the second electrode is immersed, and the first container and the first electrode are immersed in the first container. Between the two containers, a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent is filled and communicated through a sealed channel, and then the first base capable of hydrogen bonding to the DNA sample is placed in the buffer in the sealed channel. The sequence and the polymer compound are combined, and a DNA sample for separation is separated from the difference in binding force to separate the DNA sample into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA. Subsequently, the DNA sample is added, and then the second sample is added. Increase the absolute value of the voltage between the electrode and the first electrode, DNA sample And normal DNA, abnormal DNA and noise DNA are separated, and the ratio of normal DNA to abnormal DNA or abnormal DNA is detected.
[0019]
Thereby, it is possible to determine a gene abnormality of one base or more in a short time, easily and accurately.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The invention described in claim 1 includes a first container in which a buffer solution is stored and the first electrode is immersed, a second container in which the buffer solution is stored and the second electrode is immersed, a first container, and a second container. A sealed channel in which a container is filled with a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent, a variable power supply unit that applies a positive potential to the second electrode and a negative potential to the first electrode, and a variable power source A control unit that controls the unit to increase the absolute value of the voltage applied between the second electrode and the first electrode, and a detection unit that is provided in the sealed flow path and detects the amount of DNA passing through the inside, In addition, the closed channel separates the DNA sample into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA based on the difference in binding force, in which the base sequence capable of hydrogen bonding to the DNA sample and the polymer compound are bound in the buffer solution. A DNA conjugate for use with a DNA sample, Since the DNA sample in the sealed channel is electrophoresed by increasing the counter value, and the detection unit measures the passing amount of normal DNA and abnormal DNA, respectively, the second electrode When a voltage is applied between the first electrodes to increase the absolute value of the voltage, the DNA sample can be electrophoresed. However, since the separating DNA conjugate is bound to a polymer compound, the migration speed is Compared to the DNA sample, it is only a few percent (however, it depends on the type and length of the polymer compound), and can be relatively pseudo-fixed. Thus, the DNA sample passes through the separating DNA conjugate portion by electrophoresis. At that time, the migration speed of the normal DNA and the abnormal DNA group can be reduced with respect to the noise DNA by utilizing the difference in hydrogen bond strength with the separation DNA conjugate. Therefore, noise DNA that is not affected by the separation DNA conjugate can be migrated at almost the same speed.
[0021]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is possible to adjust the concentration of the separation DNA conjugate and the sample, and to adjust the mixing ratio of the separation DNA conjugate and the sample. It becomes extremely easy.
[0022]
Normal DNA and abnormal DNA are affected by the binding force of the separating DNA conjugate while moving, and noise DNA that is not affected by this is the lowest when the absolute value of voltage is increased (the absolute value is smallest). ) Electrophoresis is performed first at a voltage and at a high speed, and is detected by the detection unit. However, the binding force to the DNA conjugate for separation (however, it is weaker by one base compared to normal DNA) acts on abnormal DNA, and this action cannot be completely shaken unless the voltage is set a little higher (absolute value is large). Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on the normal DNA, and the action of the conjugate cannot be shaken unless the voltage is further increased. Therefore, the DNA is migrated later than the abnormal DNA, and is finally detected by the detection unit. The As a result, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs in proportion to the voltage whose absolute value is increased.
[0023]
Since DNA and DNA hydrogen bonds are used in this way, DNA can be separated in a short time of several minutes to tens of minutes, and the absolute value of the voltage is increased. Therefore, it is possible to accurately detect the presence / absence of DNA abnormality, to be a small, lightweight, low-cost apparatus with low running cost, and it is very easy to automate diagnosis.
[0024]
In the invention described in claim 2, the sealed channel is filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, and the DNA conjugate for separation and the DNA sample are separated in the buffer solution. 2. A separation sealed flow path cartridge filled in this order with a linear polymer interposed therebetween, wherein a separation portion is provided to replaceably attach the separation closed flow path cartridge. Since it is the described genetic diagnostic apparatus, it is possible to prepare a separation sealed flow path cartridge filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding controller, a separation DNA conjugate, and a DNA sample in advance, What is necessary is just to replace | exchange and mount the isolation | separation closed flow path cartridge in a separation part for every measurement, and can perform a measurement easily and easily.
[0025]
Since the invention described in claim 3 is the genetic diagnostic apparatus according to

claim

1 or 2 characterized in that one or more sealed flow paths are provided, a DNA conjugate for separation is provided for each sealed flow path. By changing the DNA binding control agent, the separation environment of normal DNA and abnormal DNA of the DNA sample can be changed for each sealed channel.
[0026]
The invention described in claim 4 is the genetic diagnostic apparatus according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the DNA conjugate is a vinylated DNA. DNA can be clearly separated and measured.
[0027]
The invention described in claim 5 is characterized in that the normal DNA and the abnormal DNA are separated by adjusting the liquid in the closed flow path to 20 ° C. to 60 ° C. Since it is a genetic diagnosis device, it is possible to bind normal DNA and abnormal DNA to or separate from the DNA conjugate for separation by adjusting the temperature, and the binding force can be adjusted by temperature. It becomes possible to measure.
[0028]
The invention described in claim 6 is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm. One of Therefore, the detection of abnormal DNA can be facilitated by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough.
[0029]
The invention described in claim 7 is characterized in that the sealed flow path is a combination of a grooved plate and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays. One of 5 Therefore, the detection of abnormal DNA can be facilitated by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough.
[0030]
According to the eighth aspect of the present invention, the buffer solution is stored in the first container and the first electrode is immersed, the buffer solution is also stored in the second container and the second electrode is immersed, and the first container and the first container are immersed in the first container. Between the two containers, a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent is filled and communicated through a sealed channel, and then the first base capable of hydrogen bonding to the DNA sample is placed in the buffer in the sealed channel. The sequence and the polymer compound are combined, and a DNA sample for separation is separated from the difference in binding force to separate the DNA sample into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA. Subsequently, the DNA sample is added, and then the second sample is added. A positive potential is applied to the electrode and a negative potential is applied to the first electrode to increase the absolute value of the voltage between the second electrode and the first electrode. DNA sample Is separated from normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA, and the ratio of normal DNA to abnormal DNA or the detection of abnormal DNA is detected between the second electrode and the first electrode. When the voltage is applied to increase the absolute value of the voltage, the DNA sample can be electrophoresed, but the separation speed is compared with the DNA sample because the DNA conjugate for separation is bound to the polymer compound. Then, it is only a few percent (however, depending on the type and length of the polymer compound), and it can be relatively quasi-fixed. Thus, the DNA sample passes through the separating DNA conjugate portion by electrophoresis. At that time, the migration speed of the normal DNA and the abnormal DNA group can be reduced with respect to the noise DNA by utilizing the difference in hydrogen bond strength with the separation DNA conjugate. Therefore, noise DNA that is not affected by the separation DNA conjugate can be migrated at almost the same speed.
[0031]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is possible to adjust the concentration of the separation DNA conjugate and the sample, and to adjust the mixing ratio of the separation DNA conjugate and the sample. It becomes extremely easy.
[0032]
Normal DNA and abnormal DNA are affected by the binding force of the separating DNA conjugate while moving, and noise DNA that is not affected by this is the lowest when the absolute value of voltage is increased (the absolute value is smallest). ) Electrophoresis is performed first at a voltage and at a high speed, and is detected by the detection unit. However, the binding force with the DNA conjugate for separation (however, it is weaker by one base compared to normal DNA) acts on abnormal DNA, and this effect cannot be completely shaken unless the voltage is set a little higher (absolute value is large). Electrophoresis is performed later than the noise DNA, and is detected by the detection unit next to the noise DNA. The maximum binding force acts on the normal DNA, and the action of the conjugate cannot be shaken unless the voltage is further increased. Therefore, the DNA is migrated later than the abnormal DNA, and is finally detected by the detection unit. The As a result, a difference can be caused in the detection time of the three DNAs in proportion to the voltage whose absolute value is increased.
[0033]
Since DNA and DNA hydrogen bonds are used in this way, DNA can be separated in a short time of several minutes to tens of minutes, and the absolute value of the voltage is increased. It is possible to accurately detect the presence or absence of DNA abnormality.
[0034]
(Embodiment 1)
FIG. 1 is an external view of a genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention, FIG. 2 is an external view of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention, and FIG. 3 is a gene according to Embodiment 1 of the present invention. FIG. 4 is a main part diagram of the control circuit of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention, and FIG. 5 is a sealed flow of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention. It is an introduction state figure of the DNA conjugate for separation in a way, and a DNA sample.
[0035]
In FIG. 1, 1 is a power switch of the genetic diagnosis apparatus, 2 is an operation button for performing various operations of the apparatus, 3 is a display panel, 4 is an upper lid, and 5 is a casing of the apparatus. 2, 3, and 4, 6 is an electrophoresis unit for performing electrophoresis, 7 is a support base that supports the

electrophoresis unit

6, 8 is a control for performing electrophoresis, a suction pump 20 described later, and detection. It is a control calculation part which consists of a board | substrate which controls the part 15 and calculates the detected data. Reference numeral 9 denotes a power supply box, and 9a denotes a variable power supply section provided in the power supply box 9. In this genetic diagnosis apparatus, there are optimum applied voltage values that differ depending on the DNA type, concentration, and processing conditions, so that the most suitable electrophoresis can be performed for separating abnormal DNA and normal DNA from the DNA sample 23 described later. Then, the control calculation unit 8 controls the variable power supply unit 9a to increase the absolute value of the applied voltage and adjust the voltage to the highest resolution. 10 is a high temperature part for separating the double helix (hereinafter, double strand) of DNA, 11 is a heat insulating part for making the temperature of the high temperature part 10 and the separation part 12 described later independent, and 12 is normal DNA and abnormal DNA And a separation unit that separates the DNA into three DNAs at this portion, 13 is a first temperature controller that regulates the temperature of the

high temperature unit

10, and 14 is a separation unit. It is the 2nd temperature controller which adjusts the temperature of 12.
[0036]
Although details of the configuration in the separation unit 12 will be described later, at the start of measurement, as shown in FIG. 5, the separation DNA conjugate 21 is located near the heat insulation unit 11 from the position of the separation unit 12, and the DNA sample 23 is in the high temperature unit 10. Arrange them so that they are close. Then, by performing the arrangement, voltage control, concentration adjustment, temperature control, and the like set in this way, the present gene diagnosis apparatus converts the DNA sample 23 into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA for several minutes to 10 minutes while performing electrophoresis. It will separate in minutes.
[0037]
Among them, the DNA sample 23 is filled and arranged in the high temperature part 10 with double strands in the first embodiment, and the first temperature controller 13 is used (predetermined temperature of 90 ° C. or higher ± 5 ° C.). It is heated and controlled so that the temperature becomes. The double strands of DNA introduced by this heating are automatically separated into single strands. Subsequently, from the separation unit 12 to the heat insulation unit 11, the DNA sample 23 can be separated from normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA by the difference in hydrogen bonding strength while the separation DNA conjugate 21 is subjected to an electrophoretic action. The temperature is controlled to be at least 10 ° C. lower than the temperature of the high temperature portion 10, that is, at a predetermined temperature in the temperature range of 15 ° C. to 80 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C. In order to separate normal DNA from abnormal DNA, it is preferable to control within a range of ± 1 ° C. from this predetermined temperature suitable for DNA separation. The heat insulating part 11 is originally provided to adjust the temperature by thermally blocking between the separating part 12 and the high temperature part 10, but in terms of temperature, it is separated from the temperature of 90 ° or more of the high temperature part 10. It is placed at an intermediate temperature between 20 ° C. and 60 ° C. of the part 12, and the normal DNA and abnormal DNA are converted into noise DNA while the separating DNA conjugate 21 is subjected to an electrophoretic action due to the difference in hydrogen bond strength at this temperature. Separate from.
[0038]
Reference numeral 15 denotes a detection unit that measures the passing amount of the DNA sample to be electrophoresed. The detection unit 15 will be described with reference to FIG. ₂ A lamp, 15b is a photodiode that receives ultraviolet light, 15c is a preamplifier that amplifies a weak current detected by the photodiode 15b, and 15d is an A / D converter that converts it into a digital quantity. Details of these will be described later. Reference numeral 16 denotes an electrode that applies a positive potential during electrophoresis (second electrode of the present invention), and 17 denotes an electrode that applies a negative potential during electrophoresis (first electrode of the present invention). Can control the variable power supply unit 9a, increase the absolute value of the voltage between the electrode 16 and the electrode 17, and change the intensity of electrophoresis. 3, 4, and 5, 18 is a buffer solution for carrying charge during electrophoresis and stabilizing the pH of the DNA sample, and 18 a is a cathode-side container containing the buffer solution 18 (the first embodiment of the present invention). 1 container), 18b is a container on the anode side (second container of the present invention) containing the

buffer solution

18, and 18d is a linear polymer gel in which a DNA binding control agent and a linear polymer are added to the buffer solution 18. The DNA sample 23 has a function of hindering migration so that it does not migrate at a high speed. By this function, the DNA sample 23 can have a chance to be sufficiently encountered in the separation DNA conjugate 21 and the capillary tube 19. Reference numeral 19 denotes a capillary tube (a sealed channel of the present invention) for electrophoresis of the DNA sample 23 during electrophoresis, and 20 denotes a buffer solution 18, a DNA sample 23, a linear polymer gel 18 d, etc. in the capillary tube 19. A suction pump for injecting a reagent. The electrode 17 is immersed in the buffer solution 18 of the container 18a, and the electrode 16 is immersed in the buffer solution 18 of the container 18b. The buffer 18 in the container 18a and the container 18b is communicated with the buffer 18 in the capillary tube 19. Therefore, the buffer solution 18 is also mixed in the separation DNA conjugate 21 as the base of the solution, and the buffer solution 18 having the same concentration is present in all portions of the capillary tube 19. When a voltage is applied between the electrode 16 and the electrode 17, electrophoresis is induced in the capillary tube 19, and the separation DNA conjugate 21 and the DNA sample 23 are negatively charged. Therefore, from the container 18a side to the container 18b side. The separation DNA conjugate 21 and the DNA sample 23 move. However, since the separation DNA conjugate 21 is provided with a polymer having a large molecular weight, it hardly moves compared to the movement amount of the DNA sample 23 by electrophoresis.
[0039]
Next, details necessary for performing measurement with the genetic diagnosis apparatus of the present invention will be described. The DNA sample 23 measured by this genetic diagnostic apparatus is DNA obtained from human cells, blood, or the like. It is necessary to cut out the target portion from the human genomic DNA, which is said to have about 3 billion base pairs, to a target length using a method such as PCR (polymerase chain reaction) and increase the number for measurement. However, since this PCR is not necessary for the description of the present gene diagnostic apparatus, a specific description is omitted.
[0040]
The target DNA extracted by PCR or the like is about 6 to 1000 in terms of the number of bases, but it is probable that the same DNA sequence does not exist in human genomic DNA which is said to have about 3 billion base pairs. The number considered is about 50. However, this means that the total number should be about 50. Therefore, when the DNA is cut out in several times, it may be divided into 6 to 12 pieces. According to the experiments of the present inventors, when separating normal DNA and abnormal DNA having one base difference with this genetic diagnosis apparatus, the result is that the number of bases can be separated most efficiently from 6 to 12. Yes. However, the separation of the abnormal DNA is closely related to the concentration of the DNA sample 23 (μM, where M = mol / liter), the concentration of the DNA of the separating DNA conjugate 21 (mol%), the measurement temperature, and the like. Therefore, since separation does not occur unless appropriate conditions are used, it is necessary to pay attention to whether such conditions can be set. For example, the concentration of the DNA sample 23 is suitably 1 to 10 (μM), and the DNA contained in the separation DNA conjugate 21 is 0.0002 to 0.05 (moles) relative to the moles of the basic linear polymer. %) Is appropriate, but the total DNA amount of the separating DNA conjugate 21 is preferably 20 to 600 times the concentration of the DNA sample 23. As described above, the DNA sample of this genetic diagnostic apparatus requires a DNA sample having a base sequence of about 6 to about 1000 obtained by pretreatment by the above-described PCR or the like, and appropriate conditions must be set. .
[0041]
Next, the capillary tube 19 shown in FIGS. 3, 4 and 5 will be described. When a gel is placed in the capillary tube 19 and electrophoresis is performed, a liquid flow called electroosmotic flow is generated. It is necessary to prevent this phenomenon from occurring in the diagnostic apparatus. For this reason, it is preferable to coat the inner wall of the capillary tube 19 with acrylamide or the like. As long as the generation of the electroosmotic flow can be prevented, another coating method may be used. For example, a commercially available coated capillary tube may be used. As the capillary tube 19, a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm can transmit ultraviolet rays of 90% or more, and when DNA is detected using ultraviolet rays as will be described later, the amount of passing ultraviolet rays is easy. It is most suitable because it can be detected. Further, even if a closed channel corresponding to the capillary tube 19 is configured by a combination of a plate with a groove and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays, it can transmit 90% or more of ultraviolet rays and detect the amount of passing ultraviolet rays. Thus, abnormal DNA can be easily detected. When the grooved plate is made a plate that can transmit ultraviolet rays, transmitted light is detected. When the grooved plate is made a plate that does not transmit ultraviolet rays, abnormal DNA is detected by reflected light. When detecting the reflected light, it is necessary to devise a rectangular cross section to make the groove shape a uniform reflecting surface.
[0042]
As the buffer solution 18 accommodated in the containers 18a and 18b or the capillary tube 19, it is appropriate to use a Tris-Borate (pH 7.2 to pH 8) buffer solution or the like. Among these, as a DNA binding control agent mixed as needed in the buffer solution 18 accommodated in the capillary tube 19, a binding promoter such as magnesium chloride that promotes the binding of DNA to the DNA conjugate 21 for separation, There are two types of release agents such as urea to promote. These two types of DNA binding control agents can control various migration speeds for DNA by selecting two types of mixing ratios and substances (for example, other electrolytes as binding promoters). As the linear polymer contained in the linear polymer gel 18d, polyacrylamide can be used, which is also used for preparing a conjugate of the separation DNA conjugate 21, and is therefore compatible and suitable.
[0043]
Next, the order of filling the capillary tube 19 is as follows. First, as shown in FIG. 5, a linear polymer gel 18d containing a linear polymer, a DNA binding control agent and a buffer solution 18 is introduced into the capillary tube 19, and then Add the DNA conjugate for separation 21 detailed below. The linear polymer gel 18d may be introduced after the DNA conjugate 21 for separation is introduced. In the case of FIG. 5, it is introduced in a separated state after introduction. Thereafter, DNA sample 23 diluted with buffer 18 or pure water is introduced and electrophoresed. The linear polymer gel 18d may be introduced after the DNA sample 23 is introduced. In the case of FIG. 5, the linear polymer gel 18d is introduced in a separated state.
[0044]
In the first embodiment, since acrylamide and DNA are polymerized to produce the separation DNA conjugate 21, the weight difference and the structure difference from the DNA are large, and the migration speed (0 of the separation DNA conjugate 21 is 0). .6 cm / min to 0.7 cm / min) is about 1/20 to 1/30 of the optimal migration speed of DNA (13 cm / min to 20 cm / min), and is relatively slow and relatively pseudo A state that can be said to be fixed is realized. Therefore, at the start of measurement, the capillary tube 19 containing the packing is adjusted between the high temperature part 10, the heat insulation part 11, and the separation part 12, while the separation DNA conjugate 21 is moved from the separation part 12 to the vicinity of the heat insulation part 11. The DNA sample 23 described later is placed in the high temperature part 10. By doing so, the double strands of the DNA sample 23 can be separated into single strands in the high temperature part 10. Since the separation DNA conjugate 21 is filled from the heat insulating portion 11 to the separation portion 12, normal DNA and abnormal DNA can be separated by the speed difference, and noise DNA can also be separated.
[0045]
In addition to the mechanism for exchangeably introducing each solution of DNA sample, DNA conjugate for separation, and linear polymer into the capillary tube 19 of the genetic diagnosis apparatus, for example, the suction pump 20 shown in FIG. It is desirable to equip a container for storing each solution of the DNA conjugate for use and the linear polymer, and a mechanism for automatically replacing the container and connecting it to the capillary tube 19.
[0046]
Furthermore, the capillary tube 19 is unitized in units of one or a plurality of units, and this can be attached to the separation unit 12, the high temperature unit 10, and the heat insulation unit 11 as a separation sealed channel cartridge for replacement. It is also appropriate to control the temperature with the second temperature controller 14 or the first temperature controller 13 in the high temperature part 10. A capillary tube 19 is preliminarily filled with a linear polymer gel 18d and a buffer solution 18 containing a DNA binding control agent, and a separation DNA conjugate 21 and a DNA sample 23 are filled in a separated state to prepare a sealed flow path cartridge for separation. It becomes possible to keep. By configuring in this way, each separation sealed flow path cartridge is replaced every time measurement is performed, and therefore the arrangement of the separation DNA conjugate 21 and the DNA sample 23 can be set in advance for each separation sealed flow path cartridge. Measurement can be performed easily and accurately. In this separation closed flow channel cartridge, the separation DNA conjugate 21 and the DNA sample 23 are separated and filled with a linear polymer gel 18d interposed therebetween. The linear polymer gel 18d may be mixed and filled in each of them.
[0047]
Next, the separation DNA conjugate 21 will be described. FIG. 6 is a conceptual diagram showing the relationship between the DNA conjugate for separation and the DNA sample in the closed flow path of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention. In FIG. 6, 21 is a DNA conjugate for separation. There are two types of DNA: one that forms a double strand and one that separates the DNA, but the four bases A, T, C, and G of DNA have hydrogen bonds A and T and G and C, respectively. It has an easy property, and the double strand of DNA is paired with AT and GC. Therefore, when the single-stranded DNA is arranged as ATCGCGTCTAGC (described in SEQ ID NO: 1), the remaining DNA has a base sequence of TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2). This relationship is called a complementary relationship. As long as this complementary relationship is satisfied, A and T and G and C are bonded by hydrogen bonds to form a double strand. In the present invention, in order to utilize this relationship, as shown in FIG. 6, the DNA portion of the separating DNA conjugate 21 has a base sequence complementary to the normal DNA of the DNA sample. Therefore, the normal DNA base sequence of the DNA sample contains ATCGCGTCTAGC (described in SEQ ID NO: 1), and the abnormal DNA is ATCA. ^* In CGTTAGAGC (described in SEQ ID NO: 3), when the bases of normal DNA and abnormal DNA are different in the part indicated by *, the DNA part sequence of the DNA conjugate for separation 21 (first base sequence of the present invention) Is TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2), the abnormal DNA is A ^* In FIG. 2, hydrogen bonds do not occur because they are no longer complementary to the separation DNA conjugate 21, and the binding force of the entire hydrogen bond is larger by the binding force of one base than the abnormal DNA in the normal DNA of the DNA sample. As a result, during electrophoresis described later, normal DNA binds to separation DNA conjugate 21 for a longer time with a stronger binding force than abnormal DNA, so normal DNA is delayed relatively than abnormal DNA. This is because not only the binding force during electrophoresis but also the pulling force due to electrophoresis acts, so that a large number of DNAs are in a binding state that repeats binding and detachment intermittently. When this migration speed is viewed on average, the migration speed of normal DNA that binds for a long time is lower than that of abnormal DNA. The DNA sample includes DNAs other than normal DNA and abnormal DNA, such as the remaining separated single-stranded DNA that is not the target of measurement, out of double-stranded DNA, and this DNA will be described later. Although it acts as noise during electrophoresis, the noise DNA is hardly reacted with the DNA of the DNA conjugate for separation 21 and binds with the fastest migration speed. The total DNA amount of the separation DNA conjugate 21 is suitably 20 to 600 times the concentration of the DNA sample.
[0048]
Next, a method for producing and synthesizing such a separation DNA conjugate 21 will be described. In order to synthesize vinylated DNA, the DNA for separating DNA conjugate 21 is cut out by PCR. In the above example, TAGCGCAGATCG (described in SEQ ID NO: 2) is the DNA of the DNA conjugate 21 for separation. Next, the 5 ′ end of the DNA having the desired base sequence is aminated (usually aminated via a hexyl group). The aminated DNA thus obtained is diluted by adding ultrapure water sterilized to 2.6 mM. Next, MOSU (methacryloid oxysuccinimide) is diluted with DMSO (dimethyl sulfoxide) to 71.388 mM. Then, the aminated DNA thus obtained and MOSU are added and adjusted so as to have a ratio of 1:50. Further, a solution adjusted with sodium hydrogen carbonate and sodium hydroxide so as to have a pH of 9 for pH adjustment is added to this adjusted solution in an amount equal to the amount of aminated DNA.
[0049]
The resulting solution is then shaken overnight. Thereafter, the vinylated DNA in the shaken solution is separated from the aminated DNA, MOSU, and others using HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Since vinylated DNA contains an eluent (TEAA; mixed solution of triethylamine-acetic acid and acetonitrile), it is further concentrated under reduced pressure by a centrifugal evaporator having a vacuum drying function.
[0050]
Then, 53 μmol of nitrogen is substituted for 10% AAM (acrylamide) as a polymerization solution. Further, 1.34% of TEMD (N, N, N′N′-tetramethylethylenediamine) which is a polymerization initiator is diluted with sterilized ultrapure water deaerated by ultrasonic waves. This is diluted with sterilized ultrapure water in which 1.34% APS (ammonium persulfate), which is a polymerization initiator, is similarly degassed by ultrasonic waves. Furthermore, the concentrated vinylated DNA is diluted with sterilized ultrapure water. Then, in order to synthesize 100 μl of the DNA conjugate for separation, 34 μl of the above AAM, 5 μl each of the above TEMD and APS, and vinylated DNA in 0.01% to 0.05% mol with respect to AAM In addition, sterilized ultrapure water is added to 100 μl, and the mixture is allowed to stand for about 60 minutes, whereby an acrylamideated DNA conjugate for separation 21 is obtained.
[0051]
In addition, in order to remove the unreacted vinylated DNA, a DNA conjugate having a high purity can be obtained by performing gel filtration with an appropriate pore size selected in several tens of times.
[0052]
Subsequently, the operation of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment will be described. First, a capillary tube 19 into which a DNA sample or each solution has been introduced is set in the genetic diagnosis apparatus, and the buffer solution 18 in the containers 18a and 18b is immersed at both ends as shown in FIGS. The voltage is applied between the electrode 16 and the electrode 17 by the variable power supply unit 9a so that the absolute value of the voltage increases. The maximum voltage is desirably 10 to 20 kilovolts, but may be 100 to 30 kilovolts depending on the state of the electrolyte and electrodes. For example, when the electrolyte concentration is low or the electrode area is large, the voltage is lowered. Then, instead of increasing the absolute value of the voltage from the beginning, first, by applying a high voltage of 30 kilovolts or more for preparation and separating the noise DNA quickly, the measurement can be performed quickly. After that, the absolute value of the voltage is gradually increased and a high voltage is applied. Further, when the absolute value of the voltage is gradually increased, it may be increased regularly or irregularly, but a particularly preferable method is to sweep and apply the voltage. The sweep is to change the voltage at a constant value per unit time. For example, if the sweep is started from 0 to 1 kilovolt / second, 10 kilovolts are applied after 10 seconds.
[0053]
Here, the reason why the applied voltage is swept will be explained. The difference between the binding force of the DNA sample 23 to the separation DNA conjugate 21 and the separation force due to the electrophoretic force has a great influence on the migration speed and movement difference of DNA. Therefore, sweeping is performed to adjust a voltage at which separation of normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA is most effectively performed. If the voltage that causes the difference in the migration speed most by the sweep is known, this voltage may be maintained. By sweeping the applied voltage, it is possible to obtain an effect that it can be adjusted very easily to an optimum voltage with high resolution.
[0054]
This is because noise DNA is migrated first at a stage where the sweep voltage is low and is detected by the detection unit, but abnormal DNA has a weak binding force for one base to the DNA conjugate 21 for separation. If it doesn't become a little high voltage, it can't be removed. In addition, normal DNA cannot be removed without increasing the voltage. If a voltage in the vicinity is applied, noise DNA, abnormal DNA, and normal DNA are clearly separated. However, since the resolution of normal DNA and abnormal DNA is lowered when the sweep voltage is increased, it is optimal to keep the voltage near the voltage at which normal DNA starts to migrate.
[0055]
Then, after a preparation voltage of about 30 kilovolts or more is initially applied for a short time, the sweep start voltage may be simply started from 0 volts normally. However, depending on the binding conditions between the DNA conjugate for separation 21 and the DNA sample, 30 kilovolts may be used. After applying the above, the sweep may be started from 5 kilovolts to 7 kilovolts. Since the DNA in the capillary tube 19 proceeds to the anode side, the variable power supply unit 9a needs to apply the electrode 16 so as to have a positive potential and the electrode 17 have a negative potential.
[0056]
When the voltage is swept, the DNA sample 23 is migrated, and the separating DNA conjugate 21 has a difference of one base in the binding force between the normal DNA and the abnormal DNA. And a large movement difference is generated from the noise DNA. It should be noted that, when sweeping, too slow sweeping would make the migration time too long and the buffer solution 18 would dry in the capillary tube 19 and should be avoided.
[0057]
Next, the high temperature part 10 where the separation is performed, the separation part 12, and the heat insulating part 11 will be described. As described above, in order to release the double strands of DNA in the high temperature part 10, the temperature is controlled using the first temperature controller 13 so that the temperature becomes 90 ° C. or higher (predetermined temperature ± 5 ° C.). Further, in the separation unit 12, although it depends on the state of the DNA sample, the high-temperature unit 10 can be used to separate normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA based on the difference in binding force between the separation DNA conjugate 21 and the DNA sample. It must be kept at a predetermined temperature in the temperature range of about 10 ° C., that is, 15 ° C. to 80 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C. In the genetic diagnosis apparatus of the first embodiment, a silicon rubber heater, a nichrome wire, etc., and a temperature sensor such as a thermocouple, thermal, etc. are disposed below the separation unit 12 covering the capillary tube 19, and the second temperature controller 14. The temperature is controlled to be a predetermined temperature ± 1 ° C. or less. However, depending on the environmental temperature, the room temperature may exceed the target predetermined temperature, and it is preferable to use a component that can be heated and cooled, such as a Peltier element, instead of a silicon rubber heater or nichrome wire. Further, the heat insulating part 11 may be made of a heat insulating material such as glass wool, a foaming agent, mica, porous ceramics or the like whose contents are evacuated. In the vicinity of the heat insulating portion 11, the temperature is intermediate between the high temperature portion 10 and the separation portion 12, so that normal DNA and abnormal DNA can be separated from noise DNA by using the separation DNA conjugate 21.
[0058]
Next, a description will be given of how normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA in which a difference in migration speed is caused by the action of the separation DNA conjugate 21 and a movement difference is detected are detected. FIG. 7 is a graph showing the relationship between the elapsed time and the absorbance when the elapsed time from the start of electrophoresis is plotted on the horizontal axis and the absorbance is plotted on the vertical axis. The detection is performed by measuring the absorbance when ultraviolet irradiation is shielded by normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA. In the first embodiment, as shown in FIG. 5, the glass portion is exposed at a part of the capillary tube 19, and D ₂ An ultraviolet ray having a wavelength of 260 nm is irradiated from the lamp 15a, and the ultraviolet irradiation light obtained at this time is detected by a photodiode 15b, and the absorbance is measured. The variable power supply unit 9a is controlled by the control calculation unit 8 and D ₂ The current detected by the photodiode 15b by causing the lamp 15a to emit light is amplified by the preamplifier 15c, and converted into the absorbance as a digital amount by the A / D converter 15d by the control calculation unit 8. The control calculation unit 8 has a built-in timer (not shown), and can measure the elapsed time from the migration start time. In FIG. 7, the earliest in time (I) is the noise DNA that does not bind to the DNA conjugate, the middle time (II) is abnormal DNA, and the late time (III) is normal DNA.
[0059]
From this relationship diagram, if the peak height, time, and number of peaks are read, it can be seen from the number of peaks that the DNA sample contains abnormal DNA. That is, it can be determined from the number of peaks whether abnormal DNA exists. Since the number of peaks can be limited to abnormal DNA and noise DNA depending on the applied voltage, DNA concentration, and DNA length (number of bases), only the passing amount of abnormal DNA is measured at this time. In addition, comparing peak heights shows the difference in absorbance between two groups with different migration speeds in DNA electrophoresed under the same conditions, which corresponds to the abundance ratio of abnormal DNA and normal DNA. The ratio can be determined. To determine the abundance of abnormal DNA, standard data obtained from the detection peak waveform of a standard DNA sample may be input in advance to the control calculation unit 8, and the data may be compared with the measured data for conversion.
[0060]
As described above, according to the genetic diagnosis apparatus and the genetic diagnosis method of the first embodiment, among DNA extracted from cells, blood, etc., a specific DNA is included in a DNA sample extracted with a restriction enzyme or the like. By knowing the abundance ratio of normal DNA and abnormal DNA to be detected, genetic diagnosis and determination can be made.
[0061]
(Embodiment 2)
A genetic diagnostic apparatus and a genetic diagnostic method according to Embodiment 2 of the present invention will be described with reference to FIGS. 1, 2, and 4 to 8. FIG. 8 is an apparatus configuration diagram of the genetic diagnosis apparatus according to the second embodiment of the present invention. The genetic diagnostic apparatus of the second embodiment corresponds to the single-stranded DNA of the DNA diagnostic apparatus of the first embodiment as a DNA sample and is basically the same as the genetic diagnostic apparatus of the first embodiment. Therefore, only the characteristic part will be described, and the detailed description will be omitted to the first embodiment.
[0062]
As shown in FIG. 8, in the genetic diagnosis apparatus of the second embodiment, the separation DNA conjugate 21 and the single-stranded DNA sample 23 are directly introduced into the separation unit 12. That is, the electrophoresis unit 6 is basically composed of only the separation unit 12. The high temperature part 10 and the heat insulation part 11 of Embodiment 1 do not exist. In the case of introduction in the form of a separation sealed flow path cartridge, the capillary tube 19 filled with the separation DNA conjugate 21 and the DNA sample 23 in this order is exchanged and attached to the separation unit 12 for each measurement.
[0063]
In the first embodiment, a double-stranded DNA sample 23 is supplied, and a high-temperature unit 10 is provided to automatically make this a single-stranded DNA. However, in the second embodiment, the single-stranded DNA is supplied as the DNA sample 23 and there is no need to separate the double-stranded DNA, so that the high temperature part 10 and the heat insulating part 11 are not required. . Accordingly, when the measurement is started, if the separation DNA conjugate 21 is arranged in the separation unit 12 and the DNA sample 23 is located near the inlet of the separation unit 12, the measurement can be immediately executed. And the 2nd temperature controller 14 of the isolation | separation part 12 is controlled so that it may maintain at the predetermined temperature of 15 to 80 degreeC similarly to Embodiment 1, desirably 20 to 60 degreeC. By controlling the temperature in this manner, the DNA sample 23 can be separated into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA by the separation DNA conjugate 21.
[0064]
Thus, since the genetic diagnostic apparatus of Embodiment 2 does not require the high temperature part 10 and the heat insulating part 11, the configuration of the diagnostic apparatus can be simplified, can be easily controlled, and can be handled easily.
[0065]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the following advantageous effects can be obtained.
[0066]
In the genetic diagnosis apparatus according to claim 1, when an absolute value of the voltage is increased between the second electrode and the first electrode and applied, the DNA sample can be electrophoresed, but the separation DNA conjugate is high. Since it is bound to a molecular compound, the migration speed is only a few percent compared to a DNA sample (however, it depends on the type and length of the polymer compound), and it can be relatively immobile. it can. Thus, the DNA sample passes through the separating DNA conjugate portion by electrophoresis. At that time, the migration speed of the normal DNA and the abnormal DNA group can be reduced with respect to the noise DNA by utilizing the difference in hydrogen bond strength with the separation DNA conjugate. Therefore, noise DNA that is not affected by the separation DNA conjugate can be migrated at almost the same speed.
[0067]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is possible to adjust the concentration of the separation DNA conjugate and the sample, and to adjust the mixing ratio of the separation DNA conjugate and the sample. It becomes extremely easy.
[0068]
Normal DNA and abnormal DNA are affected by the binding force of this separating DNA conjugate while moving, and noise DNA that does not receive this action is the first at the lowest voltage when the absolute value of the voltage is increased. Although detected by the detection unit, abnormal DNA is detected at a slightly higher voltage, and normal DNA is detected at a higher voltage. Thereby, the difference of the detection time proportional to the voltage which increased the absolute value can be made to three DNA.
[0069]
DNA can be separated in a short time of a few minutes to a few dozen minutes using electrophoresis and DNA hydrogen bonding, and the absolute value of the voltage is increased. In addition, it is possible to detect the presence or absence of DNA abnormality, and it is possible to provide a small, lightweight, low-cost apparatus with low running cost, and the diagnosis can be automated very easily.
[0070]
As a result, with respect to diseases caused by mutations in various genes such as cancer, diabetes, hypertension, and Alzheimer, it is possible to predict the risk of onset for the disease and prevent it before onset or detect it at an extremely early stage. In addition, by investigating the diversity of genes possessed by each individual, it becomes possible to presume in advance the presence or absence of side effects and effects of the drug, and to provide a drug most suitable for each individual. Furthermore, it is possible to quickly determine and use gene mutations collected from tissues that have undergone mutation and have become cancerous. The genetic diagnostic device can be used to identify individuals, identify criminal investigations, identify parent-child relationships, and ensure the security of each individual.
[0071]
The genetic diagnostic apparatus according to claim 2 is prepared in advance with a separation sealed flow path cartridge filled with a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent, a separation DNA conjugate, and a DNA sample. It is only necessary to replace and attach the separation sealed flow path cartridge to the separation portion for each measurement, and the measurement can be performed easily and easily.
[0072]
The genetic diagnostic device according to claim 3 changes the separation environment of normal DNA and abnormal DNA of a DNA sample for each sealed channel by changing the separation DNA conjugate and the DNA binding control agent for each sealed channel. Can be made.
[0073]
The genetic diagnostic apparatus according to claim 4 can measure the normal DNA and abnormal DNA of the DNA sample clearly separated.
[0074]
Since the genetic diagnosis apparatus according to claim 5 separates normal DNA and abnormal DNA by adjusting the liquid in the sealed flow path to 20 ° C. to 60 ° C., the normal DNA and the abnormal DNA are separated by adjusting the temperature. It can be bound to or detached from the conjugate, the binding force can be adjusted by temperature, and each can be measured by the detector after separation.
[0075]
The genetic diagnosis apparatus described in claim 6 is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 μm, so that it can transmit ultraviolet light of 90% or more, and detect abnormal DNA by detecting the amount of ultraviolet light passing therethrough. Can be easily detected.
[0076]
The genetic diagnosis apparatus according to claim 7 is a combination of a plate having a groove with a groove and a plate that transmits 90% or more of ultraviolet rays. By doing so, abnormal DNA can be easily detected.
[0077]
In the genetic diagnosis method according to claim 8, when the voltage sample is applied by increasing the absolute value of the voltage between the second electrode and the first electrode, the DNA sample can be electrophoresed. Since it is bound to a molecular compound, the migration speed is only a few percent compared to a DNA sample (however, it depends on the type and length of the polymer compound), and it can be relatively immobile. it can. Thus, the DNA sample passes through the separating DNA conjugate portion by electrophoresis. At that time, the migration speed of the normal DNA and the abnormal DNA group can be reduced with respect to the noise DNA by utilizing the difference in hydrogen bond strength with the separation DNA conjugate. Therefore, noise DNA that is not affected by the separation DNA conjugate can be migrated at almost the same speed.
[0078]
Although there is affinity DNA as a method for delaying a DNA sample, it is common to fix affinity DNA on the wall surface of a closed channel such as a capillary tube, and the fixing process is difficult. However, according to the present invention, since it is pseudo-fixed, it is not necessary to make it disposable, and it is possible to adjust the concentration of the separation DNA conjugate and the sample, and to adjust the mixing ratio of the separation DNA conjugate and the sample. It becomes extremely easy.
[0079]
Normal DNA and abnormal DNA are affected by the binding force of this separating DNA conjugate while moving, and noise DNA that does not receive this action is the first at the lowest voltage when the absolute value of the voltage is increased. Although detected by the detection unit, abnormal DNA is detected at a slightly higher voltage, and normal DNA is detected at a higher voltage. Thereby, the difference of the detection time proportional to the voltage which increased the absolute value can be made to three DNA.
[0080]
DNA can be separated in a short time of a few minutes to a few dozen minutes using electrophoresis and DNA hydrogen bonding, and the absolute value of the voltage is increased. In addition, the presence or absence of DNA abnormality can be detected. According to this genetic diagnosis method, it is possible to predict the risk of onset of a disease caused by a gene mutation, prevent it, and detect it at an extremely early stage. In addition, by investigating the diversity of genes possessed by each individual, it is possible to presume in advance whether there are side effects and effects of the drug, and to provide the drug most suitable for each individual. Furthermore, it is possible to quickly determine a mutation of a gene collected from a tissue that has become cancerous. Individuals can be identified, and criminal investigations, identification of parent-child relationships, and the security of each individual can be given definitive reliability.
[0081]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an external view of a genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 2 is an external view of the open top lid of the genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 3 is an apparatus configuration diagram including an electrophoresis unit of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a main part diagram of the control circuit of the genetic diagnosis apparatus according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 5 is an introduction state diagram of a DNA conjugate for separation and a DNA sample in a sealed channel of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 6 is a conceptual diagram of the relationship between a DNA conjugate for separation and a DNA sample in a sealed channel of the genetic diagnostic apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
FIG. 7 is a relationship diagram between elapsed time and absorbance.
FIG. 8 is an apparatus configuration diagram of a genetic diagnosis apparatus according to Embodiment 2 of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Power switch
2 Operation buttons
3 Display panel
4 Top cover
5 Case
6 Electrophoresis part
7 Support stand
8 Control operation part
9 Power box
9a Variable power supply
10 High temperature part
11 Heat insulation part
12 Separation part
13 First temperature controller
14 Second temperature controller
15 detector
15a D ₂ lamp
15b photodiode
15c preamplifier
15d A / D converter
16, 17 electrodes
18 Buffer
18a, 18b container
18d linear polymer gel
19 Capillary tube
20 Suction pump
21 DNA conjugate for separation
23 DNA samples

Claims

A first container containing a buffer solution and immersed in the first electrode;
A second container containing a buffer solution and immersed in the second electrode;
A sealed flow path in which the first container and the second container are filled and filled with a buffer containing a linear polymer and a DNA binding control agent;
A variable power supply unit that applies a positive potential to the second electrode and applies a negative potential to the first electrode;
A control unit that controls the variable power supply unit to increase an absolute value of a voltage applied between the second electrode and the first electrode;
Provided in the closed flow path, provided with a detection unit for detecting the amount of DNA passing through the inside,
Further, the closed channel is in the buffer solution,
A DNA conjugate for separation, wherein a base sequence capable of hydrogen bonding and a high molecular weight compound are bonded to a DNA sample, and the DNA sample is separated into normal DNA, abnormal DNA and noise DNA based on the difference in binding strength. ,
A genetic diagnostic apparatus characterized in that by increasing the absolute value of the voltage, a DNA sample in the sealed channel is electrophoresed, and the detection unit measures the passing amount of normal DNA and abnormal DNA, respectively.

The sealed channel is filled with a buffer solution containing a linear polymer and a DNA binding control agent, and the separation DNA conjugate and the DNA sample are separated in the buffer solution, and the linear polymer is sandwiched between them. 2. The genetic diagnosis apparatus according to claim 1, wherein the separation sealed flow path cartridge is filled in order, and is provided with a separation unit for mounting the separation closed flow path cartridge in a replaceable manner.

The genetic diagnosis apparatus according to claim 1, wherein one or more of the sealed flow paths are provided.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA conjugate for separation is vinylated DNA.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein a normal DNA and an abnormal DNA are separated by adjusting a liquid in the sealed channel to 20 ° C to 60 ° C.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 5 , wherein the sealed channel is a fused silica capillary tube having an inner diameter of 50 to 100 µm.

The genetic diagnosis apparatus according to any one of claims 1 to 5, wherein the sealed flow path is a combination of a plate having a groove and a plate that transmits ultraviolet light of 90% or more.

A buffer solution is stored in the first container and the first electrode is immersed, and a buffer solution is also stored in the second container and the second electrode is immersed, and a linear polymer and DNA are interposed between the first container and the second container. Filled with a buffer containing a binding control agent and communicated in a sealed channel, and then the first base sequence capable of hydrogen bonding to the DNA sample and the polymer compound are contained in the buffer in the sealed channel. A DNA conjugate for separation that separates the DNA sample into normal DNA, abnormal DNA, and noise DNA from the difference in binding strength, and then adds the DNA sample, and then applies a positive potential to the second electrode. And applying a negative potential to the first electrode, increasing the absolute value of the voltage between the second electrode and the first electrode, causing the DNA sample in the sealed channel to electrophores, and detecting abnormalities from normal DNA DNA and noise DNA are separated and normal DN Gene diagnosis method characterized by detecting a ratio or abnormal DNA of the abnormal DNA and.