JP3773339B2

JP3773339B2 - Chromatographic strip for immunoassay

Info

Publication number: JP3773339B2
Application number: JP30521197A
Authority: JP
Inventors: 宏育新井; 永治小林; 俊次片岩; 譲小林
Original assignee: アボットジャパン株式会社
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: JPH11142405A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を免疫反応を利用して検出又は測定するための免疫分析用クロマトグラフィストリップに関する。詳しくは、上記免疫分析用クロマトグラフィストリップの検出領域における分析対象物の検出又は測定結果の有効性を調べるために設けられている対照領域の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
よく知られているように、免疫分析用クロマトグラフィストリップは、一方の端に分析対象物を含む可能性がある被検試料液が添加される試料添加領域を有する。添加された被検試料液は、クロマトグラフィストリップ中を毛細管流により移動し、この被検試料液の移動に伴って、分析対象物及び分析対象物と特異的に結合する化合物が着色微粒子により標識されてなるトレーサーが、クロマトグラフィストリップの下流方向に移動する。
【０００３】
上記試料添加領域の下流には、分析対象物と特異的に結合する化合物が固定されている検出領域が設けられている。分析対象物は検出領域に固定されている化合物とトレーサーが有する化合物の両方に特異的に結合するので、分析対象物が検出領域に到着すると分析対象物の量に比例してトレーサーが検出領域に蓄積される。
【０００４】
トレーサーは着色微粒子を有するので、検出領域はトレーサーの蓄積量に応じて発色する。すなわち、検出領域の発色程度により、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を検出又は測定することができる。
【０００５】
このような免疫分析用クロマトグラフィーストリップは、特開昭６１−１４５４５９、特開昭６４−３２１６９、特開平１−１１３６６２、特開平１−２４４３７０、特開平１−６３８６５及び特表平１−５０３１７４等に記載されていて、これらの記載も、本明細書の記載の一部とする。
【０００６】
上記免疫分析用クロマトグラフィーストリップにおいては、もちろん、検出領域を被検試料液が通過しないと、被検試料液中に分析対象物が存在していても検出領域は発色しない。そこで、試料液体が検出領域を通過したことを知るために、検出領域の下流に対照領域を設けて、被検試料液が対照領域に到達したら、対照領域が発色するようにされている。例えば、対照領域にはｐＨ指示薬を固定し、試料液のｐＨにより発色させる。あるいは、対照領域にトレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定し、トレーサーを対照領域に蓄積させ、対照領域を発色させる。
【０００７】
しかし、従来の免疫分析装置においては、例えば、ｐＨ指示薬を使用した場合、被検試料液のｐＨにより、色合いが変動したり、あるいは充分な発色が得られないこともある。また、ｐＨ指示薬を使用した場合には、トレーサーの劣化又は失活を知ることができない。トレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定した場合、被検試料液中の分析対象物の量によって対照領域のトレーサーの蓄積量が変動し、対照領域の発色が変動するという欠点があった。
【０００８】
このように、従来の対照領域は改善する必要があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、上記従来のクロマトグラフィーストリップの対照領域における問題を解決し、被検試料液のｐＨや分析対象物の量に影響されることなく被検試料液が検出領域を通過したことを判定でき、かつトレーサーが有する化合物の劣化又は失活を、もしあれば、同時に知ることができる対照領域を有するクロマトグラフィーストリップを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、対照領域に、分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄが着色微粒子により標識されているトレーサーの化合物Ｄと特異的に結合する化合物Ｂと、分析対象物に特異的に結合する化合物Ｃの両方を固定することにより、被検試料液が検出領域を通過したことを被検試料液のｐＨや分析対象物の量に影響されることなく知ることができ、かつトレーサーの劣化又は失活を同時に知ることができることを、見いだした。すなわちこの発明は、分析対象物と特異的に結合する化合物Ａが固定されている検出領域の下流に設けられていて、化合物Ｂと化合物Ｃとが固定されている対照領域を有し、化合物Ｂは該分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄが着色微粒子により標識されてなるトレーサーの化合物Ｄと特異的に結合するものであり、化合物Ｃは該分析対象物と特異的に結合するものである、免疫分析用クロマトグラフィストリップである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップは、以下に説明する特定の対照領域を有する以外は、通常のものである。
【００１２】
すなわち、クロマトグラフィストリップは、よく知られているように、分析対象物及び後記トレーサー等の分析試薬を、分析対象物を含む可能性がある被検試料液のクロマトグラフィストリップ中の毛細管流による移動により、下流に移動させることができるものである。本発明のクロマトグラフィストリップのクロマトグラフィ担体として、このような性質を有する知られているいずれの担体も使用できる。
【００１３】
また、本発明のクロマトグラフィストリップは、通常のものと同様、被検試料液が添加される試料添加領域、及び分析対象物と特異的に結合する化合物Ａが固定されている検出領域を、少なくとも有する。試料添加領域はクロマトグラフィストリップの一端（最上流）に配置され、検出領域は試料添加領域の下流に配置される。
【００１４】
さらに、クロマトグラフィストリップは、試料添加領域と検出領域との間に、トレーサーが毛細管流により移動可能なように置かれている標識領域を有することがある。クロマトグラフィストリップが標識領域を有しない場合には、トレーサーは、被検試料液と共に試料添加領域に添加される。
【００１５】
通常の免疫分析用クロマトグラフィストリップと同様、本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップも、試料添加領域の反対の端（最下流）に、添加された被検試料液の全部を吸収するのに充分な容量の吸収領域を有する。
【００１６】
本発明の分析対象物には、生体試料中等に含まれている抗原又は抗体等、通常の免疫反応を利用したクロマトグラフィストリップにより検出又は測定される分析対象物のいずれも含まれる。
【００１７】
化合物Ａは、よく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体、又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。ここで「異種動物」とは、分析対象物の抗体を産生した動物種と異なる種の動物をいう。
【００１８】
化合物Ａをクロマトグラフィ担体に固定するには、知られているいずれの方法も使用できる。例えば、微小ビーズに化合物Ａを固定して、このビーズをクロマトグラフィ担体に固定したり、又は化合物Ａをクロマトグラフィ担体に直接あるいはリンカーを介して結合させたりする。
【００１９】
トレーサーは、分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄを着色微粒子で標識したものである。
【００２０】
着色微粒子としては、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、金コロイド等の金属コロイド、着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等が知られている。
【００２１】
化合物Ｄもよく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Ｄは、化合物Ａと同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【００２２】
化合物Ｄを着色微粒子で標識するには、知られている通常の方法が使用できる。
【００２３】
本発明の対照領域は、検出領域の下流に配置され、化合物Ｄと特異的に結合する化合物Ｂと分析対象物と特異的に結合する化合物Ｃとが固定されている領域である。
【００２４】
化合物Ｂは、化合物Ｄが抗原又はその誘導体等である場合には、その抗原又は抗原誘導体等と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントであり、化合物Ｄが抗体又はそのフラグメントである場合には、その抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。
【００２５】
化合物Ｃは、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Ｃは、化合物ＡとＤのいずれか一方又は両方と同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【００２６】
対照領域に化合物Ｂ及びＣを固定する方法は、検出領域に化合物Ａを固定する方法と同じ方法であってもよいし、異なる方法であってもよい。例えば、リンカーを介してクロマトグラフィ担体に抗体及び抗原を共有結合させる方法、微粒子表面に抗体または抗原を吸着させてその微粒子を対照領域に置く方法等がある。
【００２７】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いて分析対象物を検出又は測定する方法は、従来の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いる場合と変わるところはない。ただし、対照領域の発色が、被検試料のｐＨや被検試料中の分析対象物の量に影響されることがないので、検出領域は被検試料液が通過したことを判定するために、被検試料のｐＨや被検試料中の分析対象物の量を管理する必要はない。
【００２８】
以下、実施例により、さらに本発明を説明する。
【００２９】
【実施例】
トレーサーを次のように調製した。９１ｍＭのＬ−アスコルビン酸ナトリウムと３２ｍＭの酸化セレニウムとを、約４℃で１５分、次いで約４２℃で７０時間攪拌して、セレニウムコロイドを調製した。得られたセレニウムコロイドを５５０ｎｍにおける吸光度が３０になるように１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。この希釈液にＨＩＶ―１ｐ４１抗原（１％）を添加し（トレーサーＡ）、又は添加せずに（トレーサーＢ、トレーサー劣化のモデル）、室温で１時間攪拌した。それぞれに、アルカリカゼイン（０．２％）を加えて室温で１時間攪拌して、セレニウムコロイドをアルカリカゼインで被覆し、次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。
【００３０】
標識領域を次のように調製した。上記トレーサーＡ又はトレーサーＢを１％カゼイン含有１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入れ、波長５５０ｎｍの吸光度が３．０になるようにしてトレーサー懸濁液を得た。この懸濁液中にガラス繊維膜（米国ＬＹＤＡＬＬ社製「Ｌｙｐｏｒｅ９５２４」を浸し懸濁液を充分しみ込ませた後、ガラス繊維膜を乾燥した。
【００３１】
検出領域を次のように調製した。ＨＩＶ―１ｐ４１抗原を、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。一方、クロマトグラフィ担体として０．４ｘ４．５ｃｍの長方形の細孔５μｍのニトロセルロース膜（米国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、０．４ｘ６．０ｃｍの水不透性のストリップ支持体に長い辺を縦としたときに上端が揃うように貼付した。ストリップ支持体に貼付したニトロセルロース膜の下端から約１ｃｍのところに線状にＨＩＶ−１ｐ４１抗原の溶液を滴下した後、充分乾燥させ、ＨＩＶ―１ｐ４１抗原を固定した。
【００３２】
対照領域として、抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体とＨＩＶ―１ｐ４１抗原の両方が固定されている対照領域Ｃ、及び抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体のみが固定されている対照領域Ｄを調製した。抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体及びＨＩＶ―１ｐ４１抗原の両方又は抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体を、０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に各１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにし、これを上記ニトロセルロース膜の検出領域から約１ｃｍ離れた上端側に線状に滴下した後、ニトロセルロース膜を充分乾燥させた。ｐＨ指示薬を固定した対照領域Ｅは次のように調製した。０．１３％ブロモチモールブルー、４．０％ヒドロキシエチルセルロース、０．５％ビニルブチラール樹脂を含む１２０ｍＭニトリロートリス（メチレンスルホン酸）溶液をニトロセルロース膜の検出領域から約１ｃｍ離れた上端側に線状に滴下し、ニトロセルロース膜を充分乾燥した。
【００３３】
クロマトグラフィストリップを次のように調製した。上記検出領域としたニトロセルロース膜の下端部のストリップ支持体上に、０．４ｘ０．４ｃｍの正方形に切断した上記標識領域（トレーサーＡ及びＢ）を、ニトロセルロース膜と僅かに接するように貼付した。標識領域下端のストリップ支持体上に試料添加領域として、０．４ｘ１．３ｃｍの不織布（米国Ｄｕｐｏｎｔ社製「Ｓｏｎｔａｒａ８８０１」）を標識領域と接するように貼付した。さらに、０．４ｘ５．１ｃｍの長方形の保護膜フィルム（Ｌｉｎｔｅｃ社製「ＰＥＴ２５ＰＥＬＲ００７４Ａ」）を長い辺を縦としたときに上辺がニトロセルロース膜の上端に揃うように貼付し、これをクロマトグラフィストリップとした。
【００３４】
使用された被検試料液は、ＨＩＶ抗体強陽性であることが予め確認されているヒト血清０．５ｍｌと２０ｍＭリン酸ｐＨ緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍｌとが混合された被検試料液Ｆ及び上記ヒト血清０．１ｍｌと上記ｐＨ緩衝液９．９ｍｌとが混合された被検試料液Ｇである。
【００３５】
各被検試料液５０μＬを上記クロマトグラフィストリップの試料添加領域に添加し、１５分後に検出領域及び対照領域の発色を目視により測定した。
【００３６】
結果を下表に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
表から明らかなように、本発明の対照領域である対照領域Ｃを用いた場合には（実験番号１及び２）、被検試料中の分析対象物の濃度とは無関係に対照領域は強く発色したが、対照領域がＤである場合には（実験番号３、４）、分析対象物の濃度に依存して対照領域の発色程度が異なった。また、トレーサーが分析対象物と結合できない場合、本発明の対照領域の場合は（実験番号５）、対照領域は発色しなく異常があることを知らせたが、ｐＨ指示薬を固定した対照領域Ｅでは（実験番号６）、対照領域が発色し異常を知らせなかった。
【００３９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の免疫分析用クロマトグラフィーストリップを用いることにより、被検試料液が検出領域を通過したことを、被検試料のｐＨや被検試料液中分析対象物の濃度に影響されることなく判定することができる。加えて、トレーサーの劣化又は失活があれば、同時に知ることができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a chromatographic strip for immunoassay for detecting or measuring the presence or amount of an analyte in a test sample solution using an immune reaction. More specifically, the present invention relates to an improvement in a control region provided for examining the detection of an analyte or the effectiveness of measurement results in the detection region of the chromatography strip for immunoassay.
[0002]
[Prior art]
As is well known, a chromatographic strip for immunoassay has a sample addition region to which a test sample solution that may contain an analyte is added at one end. The added test sample solution moves in the chromatographic strip by capillary flow, and as the test sample solution moves, the analyte and the compound that specifically binds to the analyte are labeled with colored microparticles. The tracer is moved downstream of the chromatography strip.
[0003]
A detection region in which a compound that specifically binds to the analyte is fixed is provided downstream of the sample addition region. Since the analyte specifically binds to both the compound immobilized on the detection region and the compound possessed by the tracer, when the analyte reaches the detection region, the tracer moves to the detection region in proportion to the amount of the analyte. Accumulated.
[0004]
Since the tracer has colored fine particles, the detection region is colored according to the amount of accumulated tracer. That is, the presence / absence or amount of the analyte in the test sample liquid can be detected or measured depending on the color development degree of the detection region.
[0005]
Such immunochromatographic strips are disclosed in JP-A-61-145459, JP-A-64-32169, JP-A-1-113366, JP-A-1-244370, JP-A-1-63865, JP-A-1-503174, and the like. These descriptions are also part of the description of this specification.
[0006]
In the chromatography strip for immunoassay, of course, if the test sample solution does not pass through the detection region, the detection region does not develop color even if the analyte is present in the test sample solution. Therefore, in order to know that the sample liquid has passed through the detection region, a control region is provided downstream of the detection region, and when the test sample solution reaches the control region, the control region is colored. For example, a pH indicator is fixed in the control region, and color is developed depending on the pH of the sample solution. Alternatively, a compound that specifically binds to a compound that the tracer has is immobilized in the control region, the tracer is accumulated in the control region, and the control region is developed.
[0007]
However, in conventional immunoanalyzers, for example, when a pH indicator is used, the hue may vary or sufficient color may not be obtained depending on the pH of the test sample solution. Further, when a pH indicator is used, it is impossible to know the deterioration or inactivation of the tracer. When a compound that specifically binds to the compound possessed by the tracer is immobilized, the accumulated amount of the tracer in the control region varies depending on the amount of the analyte in the test sample solution, and the color development in the control region varies. It was.
[0008]
Thus, the conventional control area needed to be improved.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to solve the problem in the control region of the conventional chromatography strip, and that the test sample solution passes through the detection region without being affected by the pH of the test sample solution or the amount of the analyte. It is an object of the present invention to provide a chromatographic strip having a control region that can determine the deterioration or inactivation of a compound possessed by the tracer, if any, at the same time.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In the control region, the present inventors specifically include a compound B that specifically binds to the compound D of the tracer in which the compound D that specifically binds to the analyte is labeled with colored microparticles, and a compound D that specifically binds to the analyte. By immobilizing both of the compounds C to be bound, it is possible to know that the test sample solution has passed through the detection region without being affected by the pH of the test sample solution or the amount of the analyte, and the tracer It was found that deterioration or deactivation can be known at the same time. That is, the present invention has a control region that is provided downstream of the detection region to which the compound A that specifically binds to the analyte is fixed, the compound B and the compound C are fixed, and the compound B Is a compound that specifically binds to the analyte and a compound D of the tracer that is labeled with colored fine particles, and compound C specifically binds to the analyte. A chromatography strip for immunoassay.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The chromatographic strip for immunoassay of the present invention is normal except that it has a specific control region as described below.
[0012]
That is, as is well-known, the analytical strip and the later-described tracer and other analytical reagents are transferred by capillary flow in the chromatographic strip of the sample liquid that may contain the analyte, as is well known. It can be moved downstream. Any known carrier having such properties can be used as the chromatography carrier of the chromatography strip of the present invention.
[0013]
Further, the chromatography strip of the present invention has at least a sample addition region to which the test sample solution is added and a detection region to which the compound A that specifically binds to the analyte is fixed, as in the normal case. . The sample addition region is disposed at one end (uppermost stream) of the chromatography strip, and the detection region is disposed downstream of the sample addition region.
[0014]
In addition, the chromatographic strip may have a label area between the sample addition area and the detection area, where the tracer is placed so that it can be moved by capillary flow. If the chromatographic strip does not have a label area, the tracer is added to the sample addition area along with the test sample solution.
[0015]
Similar to a conventional immunoanalytical chromatography strip, the immunoanalytical chromatographic strip of the present invention has a capacity sufficient to absorb all of the added sample liquid at the opposite end (downstream) of the sample addition region. Has an absorption region.
[0016]
The analysis object of the present invention includes any analysis object that is detected or measured by a chromatography strip using a normal immune reaction, such as an antigen or an antibody contained in a biological sample.
[0017]
As is well known, compound A is an antibody, or a fragment of an antibody thereof, that specifically binds to the antigen when the analyte is an antigen. If the analyte is an antibody, the animal is sensitized with an antigen that specifically binds to the antibody, or a derivative of the antigen, a fragment of the antigen or a derivative of the fragment, or an antibody of the analyte. It is an antibody obtained in this way. Here, the “heterologous animal” refers to an animal of a species different from the animal species that produced the antibody to be analyzed.
[0018]
Any known method can be used to immobilize Compound A on the chromatographic support. For example, compound A is immobilized on microbeads and the beads are immobilized on a chromatographic support, or compound A is bound directly to a chromatographic support or via a linker.
[0019]
The tracer is obtained by labeling compound D that specifically binds to the analyte with colored fine particles.
[0020]
Known colored fine particles include non-metallic colloids such as selenium colloids, metallic colloids such as gold colloids, colored resin particles, dye colloids, and colored liposomes.
[0021]
As is well known, when the analyte is an antigen, it is an antibody or a fragment of the antibody that specifically binds to the antigen. If the analyte is an antibody, sensitize a heterologous animal with an antigen that specifically binds to the antibody, or a derivative of the antigen, a fragment of the antigen or a derivative of the fragment, or an antibody of the analyte It is the antibody obtained by doing. Compound D may be the same as compound A, but may be different.
[0022]
In order to label compound D with colored fine particles, known ordinary methods can be used.
[0023]
The control region of the present invention is a region that is arranged downstream of the detection region and to which compound B that specifically binds to compound D and compound C that specifically binds to the analyte are fixed.
[0024]
Compound B is an antibody or a fragment of an antibody that specifically binds to the antigen or antigen derivative when compound D is an antigen or a derivative thereof, etc., and Compound D is an antibody or a fragment thereof And an antigen or a derivative of the antigen, a fragment of the antigen or a derivative of the fragment, or an antibody obtained by sensitizing a heterologous animal with the antibody, which specifically binds to the antibody or antibody fragment.
[0025]
Compound C is an antibody or a fragment of an antibody that specifically binds to the antigen when the analyte is an antigen. When the analyte is an antibody, it is obtained by sensitizing a heterologous animal with an antigen that specifically binds to the antibody, or a derivative of the antigen, a fragment of the antigen or a derivative of the fragment, or the antibody. Antibody. Compound C may be the same as one or both of compounds A and D, but may be different.
[0026]
The method for immobilizing compounds B and C in the control region may be the same method as the method for immobilizing compound A in the detection region, or may be a different method. For example, there are a method in which an antibody and an antigen are covalently bonded to a chromatography carrier via a linker, a method in which the antibody or antigen is adsorbed on the surface of the fine particles, and the fine particles are placed in a control region.
[0027]
The method for detecting or measuring the analyte using the immunoanalytical chromatography strip of the present invention is not different from the case of using the conventional immunoanalytical chromatography strip. However, since the color development of the control region is not affected by the pH of the test sample or the amount of the analyte in the test sample, the detection region is used to determine that the test sample solution has passed. There is no need to control the pH of the test sample or the amount of the analyte in the test sample.
[0028]
Hereinafter, the present invention will be further described by way of examples.
[0029]
【Example】
A tracer was prepared as follows. Selenium colloid was prepared by stirring 91 mM sodium L-ascorbate and 32 mM selenium oxide at about 4 ° C. for 15 minutes and then at about 42 ° C. for 70 hours. The obtained selenium colloid was diluted with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) so that the absorbance at 550 nm was 30. HIV-1p41 antigen (1%) was added to this diluted solution (tracer A) or not added (tracer B, model of tracer deterioration) and stirred at room temperature for 1 hour. Alkaline casein (0.2%) was added to each, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to coat the selenium colloid with alkaline casein, and then washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4).
[0030]
The labeling area was prepared as follows. Tracer suspension was obtained by putting the tracer A or tracer B in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1% casein so that the absorbance at a wavelength of 550 nm was 3.0. A glass fiber membrane (“Lypore 9524” manufactured by LYDALL, USA) was immersed in this suspension to sufficiently saturate the suspension, and then the glass fiber membrane was dried.
[0031]
The detection area was prepared as follows. HIV-1 p41 antigen was prepared to a concentration of 0.15 mg / ml in 0.1 M carbonate buffer (pH 7.4). On the other hand, when a 0.4 × 4.5 cm rectangular pore 5 μm nitrocellulose membrane (Millipore Inc., USA) is used as a chromatographic support, a 0.4 × 6.0 cm water-impermeable strip support with a long side vertically Affixed so that the top ends were aligned. A solution of HIV-1 p41 antigen was dripped linearly at a position about 1 cm from the lower end of the nitrocellulose membrane affixed to the strip support, and then sufficiently dried to fix the HIV-1 p41 antigen.
[0032]
As control regions, a control region C in which both the anti-HIV-1p41 antibody and the HIV-1p41 antigen were immobilized, and a control region D in which only the anti-HIV-1p41 antibody was immobilized were prepared. Both the anti-HIV-1p41 antibody and the HIV-1p41 antigen or the anti-HIV-1p41 antibody were adjusted to a concentration of 1 mg / ml in 0.01 M carbonate buffer (pH 7.4), and this was added to the nitrocellulose membrane. Then, the nitrocellulose membrane was sufficiently dried after being dripped linearly on the upper end side which was about 1 cm away from the detection region. Control region E with a fixed pH indicator was prepared as follows. A 120 mM nitrilotris (methylene sulfonic acid) solution containing 0.13% bromothymol blue, 4.0% hydroxyethyl cellulose, and 0.5% vinyl butyral resin is lined on the upper end side about 1 cm away from the detection region of the nitrocellulose membrane. The nitrocellulose membrane was sufficiently dried.
[0033]
Chromatographic strips were prepared as follows. On the strip support at the lower end of the nitrocellulose membrane serving as the detection region, the labeling regions (tracers A and B) cut into a square of 0.4 × 0.4 cm were attached so as to be in slight contact with the nitrocellulose membrane. . On the strip support at the lower end of the labeling region, a non-woven fabric of 0.4 × 1.3 cm (“Sontara 8801” manufactured by Dupont, USA) was attached as a sample addition region so as to contact the labeling region. Furthermore, a rectangular protective film of 0.4 × 5.1 cm (“PET25 PE LR0074A” manufactured by Lintec) was attached so that the upper side was aligned with the upper end of the nitrocellulose membrane when the long side was vertical, and this was applied to the chromatographic strip. It was.
[0034]
The test sample solution used was a test sample in which 0.5 ml of human serum previously confirmed to be strongly positive for HIV antibody and 0.5 ml of 20 mM phosphate pH buffer (pH 7.4) were mixed. A test sample solution G in which solution F and 0.1 ml of the above human serum and 9.9 ml of the above pH buffer solution are mixed.
[0035]
50 μL of each test sample solution was added to the sample addition region of the chromatography strip, and the color development in the detection region and the control region was visually measured after 15 minutes.
[0036]
The results are shown in the table below.
[0037]
[Table 1]

[0038]
As is apparent from the table, when the control region C, which is the control region of the present invention, was used (Experiment Nos. 1 and 2), the control region developed strongly regardless of the concentration of the analyte in the test sample. However, when the control region was D (Experiment Nos. 3 and 4), the degree of color development in the control region differed depending on the concentration of the analyte. In addition, when the tracer could not bind to the analyte, in the case of the control region of the present invention (Experiment No. 5), the control region was informed that there was an abnormality without color development. (Experiment No. 6), the control area was colored and no abnormality was reported.
[0039]
【The invention's effect】
As described above, by using the chromatographic strip for immunoassay of the present invention, the fact that the test sample solution has passed through the detection region is determined by the pH of the test sample and the concentration of the analyte in the test sample solution. It can be determined without being affected. In addition, if there is deterioration or deactivation of the tracer, it can be known at the same time.

Claims

A control region in which compound B and compound C are immobilized, provided downstream of the detection region to which compound A that specifically binds to the analyte is immobilized; compound B is the analyte Compound D that specifically binds to the tracer is specifically bound to Compound D of a tracer that is labeled with colored microparticles, and Compound C specifically binds to the analyte. Chromatographic strip.