JP3766368B2

JP3766368B2 - Vacuum packed solid support and method for producing the same

Info

Publication number: JP3766368B2
Application number: JP2002308664A
Authority: JP
Inventors: 通文丹花; 浩岡村; 博文山野; 光芳大場; 修一亀井; 輝久市原
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2006-04-12
Anticipated expiration: 2022-10-23
Also published as: JP2004144567A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、真空パックされた真空パック固体支持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、既存の配列から核酸配列を合成する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、目的とするＤＮＡを１組のプライマーで挟み、ＤＮＡポリメラーゼを作用させることを繰り返し、プライマーで挟んだ領域を無限に増幅させることができる方法である。
【０００３】
ＰＣＲによれば、目的とする配列のみをかなり正確に多数増幅させることができ、しかも短時間で効率よく増幅することができるので、現在、生化学、医療分野等の各種研究、試験、検査等に広く用いられている。
【０００４】
従来より、ＰＣＲの原理は温度制御にあるとされ、その反応は加熱及び冷却の繰り返しにより進められている（サーマルサイクル）。即ち、増幅対象である二本鎖ＤＮＡ分子を相補的一本鎖に高温変性させた後、冷却して該ＤＮＡの一部に相補するように選択されたプライマーを鎖にアニールさせ、再び加熱してＤＮＡポリメラーゼによりプライマーの後ろにＤＮＡを伸長させるという風に、変性、アニール、伸長のプロセスを１サイクルとして複数サイクル繰り返すことにより二本鎖ＤＮＡを多数増幅することができる。
【０００５】
具体的には、１）二本鎖ＤＮＡの水素結合をほどくために試料の温度を９５℃に上昇させる、２）次いでＤＮＡを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度を４５℃に下降させる、３）更に耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させてＤＮＡを複製させるために試料の温度を７４℃に上昇させる、といった１）〜３）のサーマルサイクルを幾度も繰り返す必要があった。このようなＤＮＡの増幅反応では、試料を合成樹脂の容器などに入れ、この容器をアルミニウムブロックに収容し前記サーマルサイクルを行っていた。
【０００６】
しかし、前記サーマルサイクルは多大な時間がかかり、目的とする量のＤＮＡを得るには数時間を要していた。また、加熱、冷却による温度制御により反応を進めると、一瞬にして温度を変化させるには限界があり、各段階への切り替えがスムーズにいかず、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的とする以外のＤＮＡも複製される場合も考えられた。また、迅速な温度変化をさせるためには、特別の装置や技術が必要となるため、設備投資等の経済的な問題や技術的な問題があった。
【０００７】
このような問題に鑑み、ＤＮＡを容易に固定化できて、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するために適する支持体として、基板の表面に、表面処理層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修飾層を順次設けてなる固体支持体が開発されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００８】
更には近年、タンパク質を網羅的に解析する目的で、タンパク質を固定するための固体支持体も開発されている（例えば、特許文献４参照）。
このような固体支持体は、通常、複数枚を容器に収納し、密封した形態で市販されており、真空パックされた固体支持体は知られていない。
【０００９】
【特許文献１】
ＷＯ００／２２１０８
【特許文献２】
ＷＯ０２／１２８９１
【特許文献３】
特開２００２−８２１１６号公報
【特許文献４】
特表２０００−５１６７２７号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、基板上に、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基を有する固体支持体の保存安定性について、鋭意研究を重ねた結果、核酸分子と共有結合しうる官能基として活性エステル基を有する固体支持体は、空気中に放置したり、又は単に容器中に密封保存しただけでは、固定化できる核酸分子又はタンパク質の量が著しく低下することを見出し、更に、前記固体支持体を１枚ずつ真空パックすることにより、前記の低下を顕著に防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明の課題は、基板上に、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基として活性エステル基を有する固体支持体の保存安定性を向上させることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）基板上に、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基として活性エステル基を有する固体支持体が１枚ずつ真空パックされている真空パック固体支持体。
（２）固体支持体が、更に核酸分子又はタンパク質を静電的に引き寄せるための静電層を有する前記（１）に記載の真空パック固体支持体。
（３）核酸分子がＤＮＡである前記（１）又は（２）に記載の真空パック固体支持体。
（４）基板が、スライドガラス又は表面処理されたスライドガラスである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の真空パック固体支持体。
（５）活性エステル基が、カルボキシル基がスクシンイミジル化されてなる活性エステル基である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の真空パック固体支持体。
（６）基板上に、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基として活性エステル基を有する固体支持体を１枚ずつ真空パック用袋に入れ、真空パックすることを特徴とする、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の真空パック固体支持体の製造方法。
（７）前記固体支持体を５０〜２００℃で減圧乾燥後、真空パックする前記（６）に記載の製造方法。
（８）前記固体支持体を真空パック用袋に入れ、真空引き後、不活性ガスで圧戻しして再度真空引きする操作を少なくとも１回行った後、真空パックする前記（６）又は（７）に記載の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）、金属（例えば、ステンレス、ニッケル、チタン）が挙げられる。
【００１４】
基板の材料として前記のものを用いる場合には、表面処理層を施さなくてもよいが、核酸分子と共有結合しうる官能基、即ち活性エステル基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化するために、表面処理を施すことがより好ましい。
【００１５】
表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。
【００１６】
表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
【００１７】
表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ(Chemical Vapor Deposit)法、ＥＣＲＣＶＤ(Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、ＩＣＰ(Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ(Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００１８】
本発明に用いる基板としては、前記のように表面処理層を形成した構造だけでなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられ、また、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００１９】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００２０】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００２１】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳＢ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のＤＮＡプローブ等を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００２２】
本発明の固体支持体には、必要に応じて、核酸分子又はタンパク質を静電的に引き寄せるために静電層を設けてもよい。
【００２３】
タンパク質は、水溶液中において、等電点よりも酸性側では陰極側に、塩基性側では陽極側に引き寄せられる性質を有する。この性質を利用して、対象となるタンパク質の等電点に応じて、水溶液のｐＨ、静電層の種類（正荷電又は負荷電のいずれか）を適宜選択することにより、各種のタンパク質を静電的に引き寄せることができる。例えば、タンパク質の等電点よりも水溶液のｐＨが塩基性側にある場合（例えば、フィコシアニン（等電点４．４５〜４．７５）、β−ラクトグロブリンＢ（等電点５．１）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ（等電点６．０）、ヒトカルボニックアンヒドラーゼ（等電点６．５）をｐＨ７．０の水溶液中で反応させる場合）には、静電層として正荷電を有するものを用いればよい。
【００２４】
静電層としては、核酸分子又はタンパク質を静電的に引き寄せ、核酸分子又はタンパク質の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００２５】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ₂）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００２６】
静電層は、基板又は表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板又は表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
【００２７】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。
【００２８】
また、静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又は表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００２９】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又は表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００３０】
また、静電層が施された基板に核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００３１】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００３２】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸分子の固定化量がより向上する。
【００３３】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
基板表面には、必要に応じて、前記のようにして静電層を施した後、カルボキシル基を導入するため、化学修飾を施す。
【００３４】
カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ¹−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ¹は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ²−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ²は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ³−ＣＯ−Ｒ⁴−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ³は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ⁴は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ⁵−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ⁵は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００３５】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドの化合物で活性エステル化（スクシンイミジル化）することができる。
【００３６】
また、式：Ｘ−Ｃ（Ｒ⁶）Ｈ−ＣＯＯＲ⁷（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ⁶は水素原子、フェニル基又は炭素数１〜１２のアルキル基、Ｒ⁷は１価の炭化水素基を表す。）で示されるα−ハロカルボン酸エステルと反応させることにより、式：−ＣＯＯ−Ｃ（Ｒ⁶）Ｈ−ＣＯＯＲ⁷（式中、Ｒ⁶及びＲ⁷は前記と同義である。）で示される活性エステル基を導入することができる。
【００３７】
前記のようにして活性エステル基が導入された固体支持体は、空気中に放置したり、又は単に容器中に密封保存しただけでは、固定化できる核酸分子又はタンパク質の量が著しく低下する。
【００３８】
本発明は、前記固体支持体を１枚ずつ真空パック用袋に入れ、真空パックすることにより、前記の低下を顕著に防止するものである。
真空パック用袋の材料としては、水及び酸素を通さないものであれば、特に制限はなく、例えばポリエチレン、ポリエステル等の単層フィルム、ポリエチレンとポリエステルのラミネートフィルムあるいはこれらの樹脂にアルミニウムなどの金属を蒸着したものが挙げられる。
【００３９】
また、真空パック用袋に用いるフィルムの厚みも特に限定されず、内容物の重量等に応じて適宜の機械的強度のものを用いることができるが、通常２０〜３００μｍの厚さのものが好適である。２０μｍ未満の場合、機械的強度が不足する傾向があるからであり、また３００μｍを超えると、取扱性が劣るからである。
【００４０】
真空パック用袋の形態としては、真空パック用袋を構成するフィルムが２枚重なっていて、その３辺がラミネートされており、なおかつ内容物を個別入れるための仕切りが入っているような構造が好ましい。
【００４１】
本発明においては、前記固体支持体を真空パックする前に、前記固体支持体を減圧乾燥することが好ましい。減圧乾燥時の温度は、好ましくは５０〜２００℃、更に好ましくは７０〜１２０℃である。減圧乾燥時の圧力は、好ましくは１〜１×１０^-8torr、更に好ましくは１×１０^-1〜１×１０^-4torrである。
【００４２】
また、真空パック時の温度は、好ましくは１５〜１００℃、更に好ましくは２５〜５０℃である。真空パック時の圧力は、好ましくは１〜１×１０^-8torr、更に好ましくは１×１０^-1〜１×１０^-4torrである。
【００４３】
真空パック前に、真空引き後、不活性ガスで圧戻しして再度真空引きする操作を少なくとも１回行うことが好ましい。ここで用いる不活性ガスとしては、例えば窒素ガス、アルゴンガス、ネオンガス又はこれらの混合物が挙げられる。
前記固体支持体は、直接、真空パック用袋中に空間容積が極力少なくなるように封止することが好ましい。
【００４４】
本発明の真空パック固体支持体は、開封後、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれの核酸分子の固定化にも用いることができる。ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基数は、通常１〜２００、好ましくは５〜１５０である。また、ＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。また、種々のタンパク質の固定化にも用いることができる。
【００４５】
前記固体支持体は、核酸分子、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることができる。更に、前記固体支持体を用い、末端の活性エステル化されたカルボキシル基に、水素結合でオリゴ核酸の末端塩基を固定化し、更に、このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリーチップとして用いることもできる。また、ＤＮＡの代わりに、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、タンパク質等を固定化して、ライブラリーとすることもできる。
【００４６】
【実施例】
以下、製造例、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
（製造例１）
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後に、メタンガスをキャリアーガスとして５ｃｍ³／分の割合で１５℃に保温したエチレンジアミン中を通してチャンバーに導入した。作動圧を２Ｐａとして加速電圧０．５ｋｖでメタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる層を１０ｎｍの厚みに形成した。
【００４８】
その後、メタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる表面処理層のアミノ基に多価カルボン酸として無水ブタンテトラカルボン酸を縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００４９】
（製造例２）
２重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシランエタノール溶液にスライドガラスを１０分間浸漬した後、取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥した。次に、このアミノ基が導入された基板に無水コハク酸を縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００５０】
（製造例３）
スライドガラスに５％ポリアクリル酸水溶液を塗布乾燥後、６０分間紫外線照射して不溶化した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００５１】
（製造例４）
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガスをキャリアーガスとして５ｃｍ³／分の割合で１５℃に保温したエチレンジアミン中を通してチャンバーに導入した。作動圧を２Ｐａとして加速電圧０．５ｋｖでメタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる層を２０ｎｍの厚みに形成した。
【００５２】
その後、メタンとエチレンジアミンからなる表面処理層のアミノ基に多価カルボン酸としてポリアクリル酸を０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００５３】
（製造例５）
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。
【００５４】
その後、塩素ガス中で３０分間紫外線照射して塩素化した。その後、ポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に基板を浸漬して、静電層を形成した。
その後、静電層のアミノ基に多価カルボン酸としてポリアクリル酸を０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００５５】
（製造例６）
ＤＬＣを１０ｎｍの厚みに形成したスライドガラスに、５％ポリアクリル酸水溶液を塗布乾燥後、６０分間紫外線照射して不溶化した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。
【００５６】
（実施例１）
製造例１で得た活性エステル基を有する固体支持体を１００℃、１×１０^-2torrで乾燥した後、アルミニウムを蒸着したポリエチレンの袋に個別に入れて、真空パック装置を用いて、空間容積がないように１×１０^-2torrまで真空に引いた後にパックをした。この基板を４０℃に設定したオーブン中に３０日間保管した後に、オリゴヌクレオチド固定化量を測定した。その結果、オリゴヌクレオチドの固定化性能は初期性能とほぼ同等であった。
【００５７】
（比較例１）
製造例１で得た活性エステル基を有する固体支持体をスライドケースに５枚入れ、それをアルミニウムを蒸着したポリエチレンの袋に入れて、室温で真空パックした。この基板を４０℃に設定したオーブン中に３０日間保管した後に、オリゴヌクレオチド固定化量を測定した。その結果、初期性能と比較して著しく性能が劣化していた。
【００５８】
（試験例１）
実施例１で得た真空パック固体支持体に、Ｃｙ３標識したオリゴヌクレオチドが固定化される量（富士写真フイルム社製蛍光スキャナーＦＬＡ８０００による蛍光強度）の経時変化を調べた。
【００５９】
Ｃｙ３標識したオリゴヌクレオチドの固定化は以下のように行った。
０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌを、マイクロアレイ作成装置を用いて基板（開封された固体支持体）上にスポットした。その後、８０℃のオーブンで３時間加熱後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した後に、スポットしたＤＮＡの蛍光強度を測定した。
【００６０】
結果を以下に示す。
（１）活性化後、40℃で大気放置
活性化直後：37,000→１日後：29,100→１０日後：20,500→30日後：12,300
（２）活性化後、ケース中真空パック、40℃で保存。
活性化直後：37,200→１日後：33,000→１０日後：29,400→30日後：24,500
（３）活性化後、直接フィルム中に真空パック、40℃で保存
活性化直後：33,400→１日後：31,700→１０日後：30,400→30日後：31,000
なお、比較のため、市販の活性エステル基を有する固体支持体を空気中に放置した。
購入直後：30,000→１日後：22,600→１０日後：15,100→30日後：5,700
なお、図１に活性化直後あるいは購入直後の強度を１として、１日経時後、１０日経時後、３０日経時後のそれぞれの強度を活性化直後あるいは購入直後の強度で割った残存率を示した。図１より、直接フィルム中に真空パックしたサンプルは残存率が最も高く、３０日経時後でもほとんど変化してない。それに対して、大気中で放置したサンプルは、残存率が最も低く、経時劣化が大きいことが判明した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、基板上に、核酸分子又はタンパク質と共有結合しうる官能基として活性エステル基を有する固体支持体の保存安定性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１の結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a vacuum-packed vacuum packed solid support.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, polymerase chain reaction (PCR) is a method for synthesizing nucleic acid sequences from existing sequences. Polymerase chain reaction (PCR) is a method in which a target DNA is sandwiched between a pair of primers and a DNA polymerase is repeatedly actuated to amplify the region sandwiched between the primers indefinitely.
[0003]
According to PCR, it is possible to amplify a large number of target sequences fairly accurately and efficiently in a short time, so various researches, tests, examinations, etc. in biochemistry, medical fields, etc. Widely used in
[0004]
Conventionally, the principle of PCR is based on temperature control, and the reaction proceeds by repeated heating and cooling (thermal cycle). That is, the double-stranded DNA molecule to be amplified is denatured to a complementary single strand at high temperature, and then the primer selected so as to complement a part of the DNA is cooled and annealed to the strand, and then heated again. Thus, a large number of double-stranded DNAs can be amplified by repeating the cycles of denaturation, annealing, and extension as one cycle, such that DNA is extended behind the primer by DNA polymerase.
[0005]
Specifically, 1) the temperature of the sample is raised to 95 ° C. to undo the hydrogen bonding of the double-stranded DNA, and 2) the temperature of the sample is then changed to 45 ° C. to recombine with the primer for replicating the DNA. 3) Further, it was necessary to repeat the thermal cycle 1) to 3) several times, such as increasing the temperature of the sample to 74 ° C. in order to replicate the DNA by extending the primer with a thermostable polymerase. In such a DNA amplification reaction, a sample is put in a synthetic resin container or the like, and the container is accommodated in an aluminum block to perform the thermal cycle.
[0006]
However, the thermal cycle takes a lot of time, and it takes several hours to obtain the target amount of DNA. In addition, when the reaction is advanced by temperature control by heating and cooling, there is a limit to changing the temperature in an instant, and switching to each stage does not go smoothly, and the accuracy of the sequence of the nucleic acid to be amplified is affected. In some cases, DNA other than the target DNA may be replicated. Moreover, in order to change temperature rapidly, special equipment and technology are required, so there have been economic and technical problems such as capital investment.
[0007]
In view of such a problem, as a support suitable for replicating DNA by a DNA amplification reaction, which can easily fix DNA, a surface treatment layer, and a functional group capable of covalently bonding with a nucleic acid molecule A solid support in which a chemically modified layer having sequentially provided has been developed (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
[0008]
Furthermore, in recent years, a solid support for immobilizing proteins has also been developed for the purpose of comprehensive analysis of proteins (see, for example, Patent Document 4).
Such a solid support is usually marketed in a sealed form in which a plurality of solid supports are stored in a container, and a vacuum-packed solid support is not known.
[0009]
[Patent Document 1]
WO00 / 22108
[Patent Document 2]
WO02 / 12891
[Patent Document 3]
JP 2002-82116 A
[Patent Document 4]
Special Table 2000-516727
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
As a result of intensive studies on the storage stability of a solid support having a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid molecule or protein on a substrate, the present inventors have been active as a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid molecule. The solid support having an ester group has been found to be significantly reduced in the amount of nucleic acid molecules or proteins that can be immobilized if it is left in the air or simply sealed and stored in a container. It was found that the above-mentioned decrease can be remarkably prevented by vacuum-packing the sheets one by one, and the present invention has been completed.
[0011]
That is, an object of the present invention is to improve the storage stability of a solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein on a substrate.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present invention includes the following inventions.
(1) A vacuum-packed solid support in which a solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein is vacuum-packed one by one on a substrate.
(2) The vacuum-packed solid support according to (1), wherein the solid support further has an electrostatic layer for electrostatically attracting nucleic acid molecules or proteins.
(3) The vacuum-packed solid support according to (1) or (2), wherein the nucleic acid molecule is DNA.
(4) The vacuum packed solid support according to any one of (1) to (3), wherein the substrate is a slide glass or a surface-treated slide glass.
(5) The vacuum packed solid support according to any one of (1) to (4), wherein the active ester group is an active ester group in which a carboxyl group is succinimidylated.
(6) The above-mentioned (1), wherein the solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein is placed on a substrate one by one in a vacuum-packing bag and vacuum-packed. )-(5) The manufacturing method of the vacuum packed solid support body in any one of.
(7) The production method according to (6), wherein the solid support is dried under reduced pressure at 50 to 200 ° C. and then vacuum-packed.
(8) The solid support is placed in a vacuum packing bag, vacuumed, then decompressed with an inert gas and vacuumed again, and then vacuum packed. (6) or (7 ) Manufacturing method.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the substrate material used in the present invention include silicon, glass, fiber, wood, paper, ceramics, plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon, and acrylic resin. , Fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin) and metal (for example, stainless steel, nickel, titanium).
[0014]
When the above-mentioned materials are used as the substrate material, a surface treatment layer may not be provided, but a functional group capable of covalently bonding with a nucleic acid molecule, that is, a compound for introducing an active ester group is firmly formed on the substrate. In order to fix, it is more preferable to perform a surface treatment.
[0015]
For the surface treatment, synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (eg, diamond-like carbon), amorphous carbon, carbon-based material (eg, graphite, fullerene, carbon nanotube), a mixture thereof, or It is preferable to use a laminate of them. Further, carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used. Here, the soft diamond is a generic term for an imperfect diamond structure that is a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited.
[0016]
As an example of the surface-treated substrate, a substrate obtained by forming a soft diamond film on a slide glass can be given. Such a substrate is preferably prepared by ionized vapor deposition of diamond-like carbon in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of the remaining methane gas.
[0017]
The thickness of the surface treatment layer is preferably 1 nm to 100 μm.
The surface treatment layer of the substrate is formed by a known method, for example, microwave plasma CVD (Chemical Vapor Deposit) method, ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit) method, ICP (Inductive Coupled Plasma) method, DC sputtering method, ECR (Electric Cyclotron Resonance) A sputtering method, an ion plating method, an arc ion plating method, an EB (Electron Beam) vapor deposition method, a resistance heating vapor deposition method, an ionization vapor deposition method, an arc vapor deposition method, a laser vapor deposition method, or the like.
[0018]
As the substrate used in the present invention, not only the structure in which the surface treatment layer is formed as described above, but also synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon; gold, silver, Metals such as copper, aluminum, tungsten, molybdenum; plastics (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin) , Epoxy resin, vinyl chloride resin); the above-mentioned metal powder, ceramic powder, etc. mixed with the above resin as a binder, and formed by bonding; The include those sintered at high temperatures, also, the laminate or composite of said materials (e.g., complex with diamond and other materials, (eg 2-phase body)) may be used.
[0019]
Although the shape and size of the substrate are not particularly limited, examples of the shape include a flat plate shape, a thread shape, a spherical shape, a polygonal shape, a powder shape, and the size is usually 0.1 mm in width when a flat plate shape is used. ˜100 mm, length 0.1˜100 mm, thickness 0.01˜10 mm.
[0020]
Further, a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, Cr, TiC, TiN, or a composite film thereof may be formed on the front surface or the back surface of the substrate as a reflective layer. Since the thickness of the reflective layer needs to be uniform throughout, it is preferably 10 nm or more, more preferably 100 nm or more.
[0021]
When glass is used as the substrate, the surface thereof is preferably intentionally roughened in the range of 1 nm to 1000 nm with Ra (JIS B 0601). Such a roughened surface is advantageous in that the surface area of the substrate is increased and a large amount of DNA probes and the like can be immobilized at a high density.
[0022]
The solid support of the present invention may be provided with an electrostatic layer as needed to attract nucleic acid molecules or proteins electrostatically.
[0023]
In an aqueous solution, protein has a property of being attracted to the cathode side on the acidic side and to the anode side on the basic side from the isoelectric point. By utilizing this property, various proteins can be statically selected by appropriately selecting the pH of the aqueous solution and the type of electrostatic layer (either positively charged or negatively charged) according to the isoelectric point of the target protein. Can be drawn electronically. For example, when the pH of the aqueous solution is more basic than the isoelectric point of the protein (for example, phycocyanin (isoelectric point 4.45 to 4.75), β-lactoglobulin B (isoelectric point 5.1), Bovine carbonic anhydrase (isoelectric point 6.0) and human carbonic anhydrase (isoelectric point 6.5) are reacted in an aqueous solution at pH 7.0) and have a positive charge as an electrostatic layer. What is necessary is just to use.
[0024]
The electrostatic layer is not particularly limited as long as it attracts nucleic acid molecules or proteins electrostatically and improves the amount of immobilized nucleic acid molecules or proteins. For example, the electrostatic layer has a positive charge such as an amino group-containing compound. It can be formed using a compound.
[0025]
Examples of the amino group-containing compound include an unsubstituted amino group (—NH ₂ ), Or a compound having an amino group (-NHR; R is a substituent) monosubstituted by an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as ethylenediamine, hexamethylenediamine, n-propylamine, monomethylamine, dimethylamine, Monoethylamine, diethylamine, allylamine, aminoazobenzene, aminoalcohol (eg ethanolamine), acrinol, aminobenzoic acid, aminoanthraquinone, amino acids (glycine, alanine, valine, leucine, serine, threonine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan, Tyrosine, proline, cystine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, arginine, histidine), aniline, or a polymer thereof (eg, polyallylamine, Ririshin) and copolymers; 4,4 ', 4 "- triamino triphenyl methane, triamterene, spermidine, spermine, and polyamines such as putrescine (polyamine) is.
[0026]
The electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, or may be formed to be covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer.
[0027]
In the case where the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, for example, when the surface treatment layer is formed, the amino group-containing compound is introduced into the film forming apparatus to thereby form an amino group. A carbon-based film containing is formed. Ammonia gas may be used as the compound introduced into the film forming apparatus. Further, the surface treatment layer may be a multi-layer structure in which a film containing an amino group is formed after the adhesion layer is formed, and in this case, it may be performed in an atmosphere containing ammonia gas.
[0028]
Further, when the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, the affinity between the electrostatic layer and the substrate or the surface treatment layer, that is, the adhesion is improved on the substrate. It is preferable to introduce a functional group capable of being covalently bonded to a nucleic acid molecule after vapor-depositing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group and a carbon compound. The carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane which are gases at normal temperature are preferable. As a method of vapor deposition, ionized vapor deposition is preferable, and as conditions for ionized vapor deposition, it is preferable that an operating pressure is 0.1 to 50 Pa and an acceleration voltage is in a range of 200 to 1000 V.
[0029]
When the electrostatic layer is formed by covalently bonding to the substrate or the surface treatment layer, for example, the surface of the substrate or the substrate to which the surface treatment layer is applied is chlorinated by irradiating with ultraviolet rays in chlorine gas, and then the amino group. Among the contained compounds, for example, a polyamine such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ′, 4 ″ -triaminotriphenylmethane, triamterene and the like are reacted to form an amino group at the terminal not bonded to the substrate. By introducing, an electrostatic layer can be formed.
[0030]
In addition, when a reaction for introducing a functional group capable of covalently bonding with a nucleic acid molecule or protein (for example, introduction of a carboxyl group using a dicarboxylic acid or a polyvalent carboxylic acid) is performed in a solution on a substrate provided with an electrostatic layer It is preferable to introduce a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein after immersing the substrate in a solution containing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group. Examples of the solvent for the solution include water, N-methylpyrrolidone, and ethanol.
[0031]
When a carboxyl group is introduced into a substrate on which an electrostatic layer is applied using dicarboxylic acid or polyvalent carboxylic acid, it is activated with N-hydroxysuccinimide and / or carbodiimide in advance, or the reaction is N -It is preferable to carry out in the presence of hydroxysuccinimide and / or carbodiimides.
[0032]
When forming an electrostatic layer by immersing the substrate in a solution containing a compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, when polyallylamine is used as the amino group-containing compound, the substrate is in close contact with the substrate. This improves the amount of nucleic acid molecules immobilized.
[0033]
The thickness of the electrostatic layer is preferably 1 nm to 500 μm.
If necessary, the substrate surface is subjected to chemical modification in order to introduce a carboxyl group after applying the electrostatic layer as described above.
[0034]
As a compound used for introducing a carboxyl group, for example, the formula: X-R ¹ -COOH (wherein X is a halogen atom, R ¹ Represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms. ), For example, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC-R ² -COOH (wherein R ² Represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms. ) Dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, phthalic acid; polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, butanetetracarboxylic acid; : R ^Three -CO-R ^Four -COOH (wherein R ^Three Is a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, R ^Four Represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms. A keto acid or aldehyde acid represented by the formula: X-OC-R ^Five -COOH (wherein X is a halogen atom, R ^Five Represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms. ) Monocarboxylic acid monohalides such as succinic acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride .
[0035]
The carboxyl group introduced as described above is an active ester formed by a compound of a dehydration condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) and N-hydroxysuccinimide. (Succinimidylation).
[0036]
Further, the formula: X-C (R ⁶ ) H-COOR ⁷ (Wherein X is a halogen atom, R ⁶ Is a hydrogen atom, a phenyl group or an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, R ⁷ Represents a monovalent hydrocarbon group. By reacting with an α-halocarboxylic acid ester represented by the formula: —COO—C (R ⁶ ) H-COOR ⁷ (Wherein R ⁶ And R ⁷ Is as defined above. ) Can be introduced.
[0037]
If the solid support having the active ester group introduced therein as described above is left in the air or simply sealed and stored in a container, the amount of the nucleic acid molecule or protein that can be immobilized significantly decreases.
[0038]
According to the present invention, the above-mentioned decrease is remarkably prevented by putting the solid support one by one in a vacuum packing bag and vacuum packing.
The material for the vacuum packaging bag is not particularly limited as long as it does not allow water and oxygen to pass through. For example, a single layer film such as polyethylene or polyester, a laminate film of polyethylene and polyester, or a metal such as aluminum for these resins. Can be mentioned.
[0039]
Moreover, the thickness of the film used for the vacuum-pack bag is not particularly limited, and a film having an appropriate mechanical strength can be used according to the weight of the contents, but a film having a thickness of usually 20 to 300 μm is preferable. It is. This is because if it is less than 20 μm, the mechanical strength tends to be insufficient, and if it exceeds 300 μm, the handleability is poor.
[0040]
The form of the vacuum pack bag is a structure in which two films constituting the vacuum pack bag are overlapped, the three sides are laminated, and there is a partition for containing the contents individually. preferable.
[0041]
In the present invention, it is preferable that the solid support is dried under reduced pressure before vacuum packing the solid support. The temperature during drying under reduced pressure is preferably 50 to 200 ° C, more preferably 70 to 120 ° C. The pressure during drying under reduced pressure is preferably 1 to 1 × 10 ^-8 torr, more preferably 1 × 10 ^-1 ~ 1x10 ^-Four torr.
[0042]
Moreover, the temperature at the time of vacuum packing becomes like this. Preferably it is 15-100 degreeC, More preferably, it is 25-50 degreeC. The pressure during vacuum packing is preferably 1-1 × 10 ^-8 torr, more preferably 1 × 10 ^-1 ~ 1x10 ^-Four torr.
[0043]
Before vacuum packing, it is preferable to perform at least one operation of evacuating and then evacuating again with an inert gas and then evacuating again. Examples of the inert gas used here include nitrogen gas, argon gas, neon gas, and mixtures thereof.
The solid support is preferably sealed directly in the vacuum pack bag so that the space volume is minimized.
[0044]
The vacuum-packed solid support of the present invention can be used for immobilization of DNA or RNA nucleic acid molecules after opening. The number of bases of DNA and RNA is usually 1 to 200, preferably 5 to 150. In addition, DNA can be immobilized either single-stranded or double-stranded. It can also be used to immobilize various proteins.
[0045]
The solid support can be used for an extension reaction of a nucleic acid molecule, for example, DNA. Furthermore, by using the solid support, the terminal base of the oligonucleic acid is immobilized by hydrogen bonding to the terminal active esterified carboxyl group, and further, DNA having a complementary base sequence to the oligonucleic acid is immobilized, It can also be used as a DNA library chip. Further, instead of DNA, nucleotides, oligonucleotides, DNA fragments, proteins and the like can be immobilized to form a library.
[0046]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to production examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
[0047]
(Production Example 1)
A DLC layer with an acceleration voltage of 0.5 kV using a gas mixture of 25 mm (width) x 75 mm (length) x 1 mm (thickness) slide glass mixed with 95 volume% methane gas and 5 volume% hydrogen by ionization deposition Was formed to a thickness of 10 nm. After that, 5cm using methane gas as carrier gas ^Three It was introduced into the chamber through ethylenediamine kept at 15 ° C. at a rate of / min. A layer composed of C, N, and H was formed to a thickness of 10 nm using methane and ethylenediamine as raw materials at an operating pressure of 2 Pa and an acceleration voltage of 0.5 kv.
[0048]
Then, after condensing anhydrous butanetetracarboxylic acid as polyvalent carboxylic acid to the amino group of the surface treatment layer composed of C, N, and H using methane and ethylenediamine as raw materials, it was added to 300 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6). A solid support having an active ester group is obtained by immersing in an activation solution in which 1M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide are dissolved for 30 minutes. It was.
[0049]
(Production Example 2)
The slide glass was immersed in a 2 wt% 3-aminopropyltriethoxysilane ethanol solution for 10 minutes, then taken out, washed with ethanol, and dried at 110 ° C. for 10 minutes. Next, succinic anhydride is condensed on the substrate into which the amino group has been introduced, and then 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-l in 300 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6). A solid support having an active ester group was obtained by immersing in an activation solution in which ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved for 30 minutes.
[0050]
(Production Example 3)
After applying 5% polyacrylic acid aqueous solution to the slide glass and drying, it was insolubilized by irradiation with ultraviolet rays for 60 minutes. Thereafter, 30 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6) in an activation solution in which 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved. A solid support having an active ester group was obtained by soaking for a minute.
[0051]
(Production Example 4)
On a glass slide of 25 mm (width) x 75 mm (length) x 1 mm (thickness), 5 cm using methane gas as a carrier gas by ionized vapor deposition. ^Three It was introduced into the chamber through ethylenediamine kept at 15 ° C. at a rate of / min. A layer composed of C, N and H was formed to a thickness of 20 nm using methane and ethylenediamine as raw materials at an operating pressure of 2 Pa and an acceleration voltage of 0.5 kv.
[0052]
After condensing polyacrylic acid as a polyvalent carboxylic acid in the presence of 0.1M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide to the amino group of the surface treatment layer composed of methane and ethylenediamine. 30 minutes in an activation solution of 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide dissolved in 300 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 6) A solid support having an active ester group was obtained by immersion.
[0053]
(Production Example 5)
A DLC layer with an acceleration voltage of 0.5 kV using a gas mixture of 25 mm (width) x 75 mm (length) x 1 mm (thickness) slide glass mixed with 95 volume% methane gas and 5 volume% hydrogen by ionization deposition Was formed to a thickness of 10 nm.
[0054]
Thereafter, it was chlorinated by irradiation with ultraviolet rays in chlorine gas for 30 minutes. Thereafter, the substrate was immersed in an aqueous polyallylamine solution (0.1 g / l) to form an electrostatic layer.
Then, after condensing polyacrylic acid as a polyvalent carboxylic acid on the amino group of the electrostatic layer in the presence of 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide, Activity by immersing in 300 ml of acid buffer (pH 6) in an activation solution in which 0.1M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide are dissolved for 30 minutes. A solid support having an ester group was obtained.
[0055]
(Production Example 6)
A 5% polyacrylic acid aqueous solution was applied to a slide glass having a DLC thickness of 10 nm, dried, and then insolubilized by ultraviolet irradiation for 60 minutes. Thereafter, 30 ml of 0.1M phosphate buffer (pH 6) in an activation solution in which 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide and 20 mM N-hydroxysuccinimide were dissolved. A solid support having an active ester group was obtained by soaking for a minute.
[0056]
(Example 1)
The solid support having an active ester group obtained in Production Example 1 was used at 100 ° C., 1 × 10 ^-2 After drying with torr, put them individually in polyethylene bags vapor-deposited with aluminum, and use a vacuum packing device so that there is no space volume. ^-2 Packed after pulling vacuum to torr. The substrate was stored in an oven set at 40 ° C. for 30 days, and the amount of oligonucleotide immobilized was measured. As a result, the oligonucleotide immobilization performance was almost equal to the initial performance.
[0057]
(Comparative Example 1)
Five solid supports having an active ester group obtained in Production Example 1 were placed in a slide case, which was placed in a polyethylene bag vapor-deposited with aluminum and vacuum-packed at room temperature. The substrate was stored in an oven set at 40 ° C. for 30 days, and the amount of oligonucleotide immobilized was measured. As a result, the performance was significantly degraded as compared with the initial performance.
[0058]
(Test Example 1)
The time course of the amount of Cy3-labeled oligonucleotide immobilized on the vacuum-packed solid support obtained in Example 1 (fluorescence intensity with a fluorescence scanner FLA8000 manufactured by Fuji Photo Film) was examined.
[0059]
The Cy3-labeled oligonucleotide was immobilized as follows.
About 1 nl of 500 bp Cy3-labeled double-stranded DNA amplified by PCR using λDNA prepared at 0.1 μg / μl as a template was spotted on a substrate (opened solid support) using a microarray production apparatus. Then, after heating in an oven at 80 ° C. for 3 hours and washing with 2 × SSC / 0.2% SDS, the fluorescence intensity of the spotted DNA was measured.
[0060]
The results are shown below.
(1) After activation, leave in air at 40 ° C
Immediately after activation: 37,000 → 1 day later: 29,100 → 10 days later: 20,500 → 30 days later: 12,300
(2) After activation, store in a vacuum-packed case at 40 ° C.
Immediately after activation: 37,200 → 1 day later: 33,000 → 10 days later: 29,400 → 30 days later: 24,500
(3) After activation, store directly at 40 ° C in a vacuum pack in the film
Immediately after activation: 33,400 → 1 day later: 31,700 → 10 days later: 30,400 → 30 days later: 31,000
For comparison, a commercially available solid support having an active ester group was left in the air.
Immediately after purchase: 30,000 → 1 day later: 22,600 → 10 days later: 15,100 → 30 days later: 5,700
In FIG. 1, the strength immediately after activation or immediately after purchase is assumed to be 1, and the residual ratios obtained by dividing the strength after 1 day, after 10 days, and after 30 days by the strength immediately after activation or immediately after purchase, respectively. Indicated. As shown in FIG. 1, the sample vacuum-packed directly in the film has the highest remaining rate and hardly changes even after 30 days. On the other hand, it was found that the samples left in the atmosphere had the lowest remaining rate and the deterioration over time was large.
[0061]
【The invention's effect】
According to the present invention, the storage stability of a solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein on a substrate can be improved.
[Brief description of the drawings]
1 is a diagram showing the results of Test Example 1. FIG.

Claims

A vacuum-packed solid support in which a solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule or protein is vacuum-packed one by one on a substrate.

The vacuum-packed solid support according to claim 1, wherein the solid support further has an electrostatic layer for electrostatically attracting nucleic acid molecules or proteins.

The vacuum-packed solid support according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid molecule is DNA.

The vacuum packed solid support according to any one of claims 1 to 3, wherein the substrate is a slide glass or a surface-treated slide glass.

The vacuum pack solid support according to any one of claims 1 to 4, wherein the active ester group is an active ester group obtained by succinimidylation of a carboxyl group.

The solid support having an active ester group as a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid molecule or protein is placed on a substrate one by one in a vacuum pack bag and vacuum packed. The manufacturing method of the vacuum-packed solid support body of any one of Claims 1.

The manufacturing method according to claim 6, wherein the solid support is vacuum-packed after being dried at 50 to 200 ° C. under reduced pressure.

The manufacturing method according to claim 6 or 7, wherein the solid support is put in a vacuum packing bag, vacuumed, then decompressed with an inert gas and vacuumed again at least once, and then vacuum packed. .