JP3765959B2 - Hormone variant - Google Patents

Description

【００１４】
もちろん第１表の親ポリペプチド、類似体および標的物質は単に例である。また親ポリペプチドにはたとえばスクシニルコエンザイムＡシンセターゼ、ミトコンドリアＡＴＰａｓｅ、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グルタミンシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびアスパラテートトランスカルバモラーゼなどの１つ以上のサブユニットを含むたん白質性物質が含まれる（ハング（Huang)等（１９８２）Ann. Rcv. Biochem.５１、９３５−９７１参照）。このような多重サブユニット親ポリペプチドの場合、活性ドメインは親ポリペプチドの２つ以上のサブユニットにまがっている。したがって後により詳細に述べる方法は特定のポリペプチドの各サブユニットを探り、部分的には１つのサブユニット上に含まれかつ部分的には１つ以上の他のサブユニット上に含まれる特定の標的物質に対する活性ドメインおよび活性アミノ酸を確定するのに用い得る。
一般的に親ポリペプチドおよび類似体は機能に関する１つのポリペプチド群に属する。さらに通常このような親ポリペプチドおよび類似体はあるアミノ酸配列、すなわち保存残基を持つ。これらの配列ホモロジーは９０％以上のこともあるが約１５％〜２０％と低いこともある。
一次配列ホモロジーに加え、親ポリペプチドの類似体はポリペプチドおよびその類似体の三次元的枠組みでも限定される。したがって類似体はアミノ酸配列において親ポリペプチドからの多様性を示す場合もその分子の三次構造の全て、または一部の比較に基づき親ポリペプチドと構造的にホロモジーをもつこともある。チョシア（Chothia), C.等（１９８６）Embo. J. ５、８２３。
【００１５】
一般に三次構造類似体は、その類似体の三次元構造が親ポリペプチドの構造と一緒であることが知られている場合同一と見なし得る。α−炭素軸の二乗平均分析（ＲＭＳ）を行うことにより（たとえばサクリフ（Sutcliffe), M. J. 等（１９８７）Protein Engineering １、３７７−３８４）、もしあるとすれば三次元類似性をもつ領域の重なりが同定される。テスト類似体配列の好ましくは６０％以上に関し、もしα−炭素軸が親ポリペプチドのα−炭素軸と重っているかまたは約２Å〜約3.５ÅＲＭＳの内にある場合、そのテスト類似体は親ポリペプチドと三次元的に類似している。もちろんこのことは２つの配列の間に存在する挿入または欠失を除外する。
上述の親ポリペプチドおよび類似体は天然の分子の公開であるにもかかわらず、親ポリペプチドおよび類似体にはインビトロ組換え法で導入される配列中に天然の変異を含む変異体が含まれると理解すべきである。このように親ポリペプチドまたは類似体として用いる変異体はその親ポリペプチドまたは類似体において１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入および、または欠失を含む変異体を含む。このような変異体は本発明の方法を実行し活性ドメインおよび、または活性アミノ酸の同定または本発明のポリペプチド変異体の調製に使用し得る。したがってｈＧＨの天然の変異体またはＣＹＳ−１６５のＡｌａ置換を含む組換え変異体はそれらが標的に対して活性をもつ限り親ポリペプチドまたは類似体として使用し得る。このような天然および組換え変異体には他の親ポリペプチド中の特異的残基と等価の異なるアミノ酸残基が含まれ得る。これらの異なるアミノ酸はそれらの残基が一次配列または三次構造により構造的に類似している、またはそれらが機能的に等価であるならば等価であると云える。
さらに、多くの親ポリペプチドおよび類似体はその役割を交換し得ることは明白である。したがって非ヒト成長ホルモンおよびそれらの関連類似体群はそれぞれ親ポリペプチドとして使用できかつ同等にその活性ドメインを探ることができる。さらに、ＨＩＶウイルスに対するＣＤ−４レセプターなどの標的物質もＣＤ−４レセプター類似体に関する親ポリペプチドとしてＨＩＶ結合に寄与する活性ドメインおよび活性アミノ酸の同定やＣＤ−４変異体の調製に使用される。
【００１６】
本明細書で使用しているように、“標的”とは親ポリペプチドと相互作用する物質である。標的物質にはたん白質性ホルモン、酵素基質、たん白質性レセプターに対するホルモン、たん白質性結合たん白質に対する一般的リガンドおよびポリペプチドに接触し得る免疫系などが含まれる。ホルモンレセプターの例にはｈＧＨに対するソマトジェニックおよびラクトジェニックレセプターおよびｈＰＲＬに対するレセプターが含まれる。他の標的物質には抗体、プロテアーゼのインヒビター、たん白質性レセプターに結合するホルモンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に結合するフィブリンが含まれる。
一般に標的物質は親ポリペプチド上の“活性ドメイン”と接触することにより親ポリペプチドと相互作用を起こす。一般にこのような活性ドメインは該ポリペプチドの表面上に存在するか、もしくは三次元構造の変化によりそのポリペプチドの表面に導き出される。ポリペプチドの表面とは、生理的条件下、すなわちインビボまたはインビトロで発現した時と同様の条件下に存在する本来の構造について規定される。そのアミノ酸セグメントおよびアミノ酸残基はいくつかの方法で確認される。もしその三次元結晶構造が十分な分解能で分っているなら、そのポリペプチドの表面にあるアミノ酸残基は“表面接近可能”なアミノ酸残基である。これら表面接近可能残基にはその三次元構造の表面上に“転がる”理論上の水分子と接触する残基である。
ポリペプチドの表面上の活性ドメインはそのポリペプチドの一次アミノ酸配列の単一のセグメントに含まれる。しかしながら多くの場合天然型のポリペプチドの活性ドメインは親ポリペプチドの一次アミノ酸配列中の２つ以上のアミノ酸セグメントから構成される。たとえばヒト成長ホルモンのソマトジェニックレセプターへの活性ドメインを図５に示す。示されているように活性ドメインのドメインＡ，ＣおよびＦは各々ｈＧＨ分子の不連続なアミノ酸セグメント上に存在する。これらのアミノ酸セグメントは図４中Ａ，Ｃ，Ｆという文字で示されている。活性ドメインを構成する不連続なアミノ酸セグメントは活性ドメインおよび標的物質の間の相互作用に有意に関係しない多くのアミノ酸残基により分離されている。一般に不連続アミノ酸セグメント間の間隔は少なくともアミノ酸５残基分である。
【００１７】
本発明の方法は親ポリペプチドのアミノ酸配列中の未知活性ドメインの検出を目的としている。標的物質に関するポリペプチドの三次元結晶構造が入手できる場合、たとえばインヒビターまたは転移状態類似体に関する酵素の結晶構造が入手できる場合は除いて多くのポリペプチドのほとんどの活性ドメインは未知のままである。
本明細書で使用している“類似ポリペプチドセグメント”または“類似セグメント”とは親ポリペプチド中の対応する配列と置換して“セグメント置換ポリペプチド”とするアミノ酸配列を意味する。一般的に類似セグメントは親ポリペプチドにおいて１つ以上の異なるアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を起こすが親ポリペプチド中で置換する選択されたセグメント中の他の残基の相対的アミノ酸配列は維持される配列を有している。一般に類似セグメントは親ポリペプチドと類似体の全アミノ酸配列を両配列間の配列同一性が最大となるよう整列させることにより同定される。この配列整列に基づく類似セグメントは親ポリペプチドの対応する配列への置換用に選択される。同様に三次構造ホモロジーを示す類似体由来の類似セグメントは構造ホモロジーを示すこれらの領域から誘導し得る。このような類似セグメントは親ポリペプチド中の対応する配列と置換される。さらにたとえば構造低類似領域の隣接領域などの三次構造相同体の他の領域も類似セグメントとして用いられる。
もし可能ならば類似セグメントを選択してセグメント置換ポリペプチド中への不安定化アミノ酸残基の導入は避けるべきである。このような置換にはかさ高側鎖や疎水コア領域中へ親水性側鎖を導入するものが含まれる。
【００１８】
一般的に親ポリペプチドおよび類似体のアミノ酸配列は知られており、またある場合にはその３次元結晶構造も入手可能である。１つ以上の類似体と親ポリペプチドのアミノ酸配列の整列化により少なくとも予備分析で変化を受けていない配列中の保存されているアミノ酸残基を容易に見つけることができる。また配列整列化は１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含む配列変化領域も明らかにする。このような変化を含む領域により親ポリペプチド中のどのセグメントが類似セグメントと置換したかが決定される。それゆえ類似体の類似セグメントの置換はアミノ酸残基の置換だけでなく、アミノ酸残基の挿入および、または欠失も起こし得る。
もし３次元構造の情報が入手可能な場合は類似セグメントと置換すべきではない親ポリペプチド中の領域を同定することが可能となる。たとえば親ポリペプチド中の両親媒性ヘリックスの疎水性表面において過密領域が同定された場合は類似セグメントと置換すべきではない。そのように同定された残基はポリペプチド変異体中に保持されるべきでかつ表面残基のみが類似残基と置換されるべきである。
一般に類似セグメントは長さがアミノ酸３〜３０残基、好ましくは約３〜１５残基、もっとも好ましく約１０〜１５残基である。ある場合、類似セグメントの好ましい長さは相同または親ポリペプチドと比べて類似セグメントの１つ以上のアミノ酸残基の挿入および、または欠失のため変化もある。もし親ポリペプチドの３次元構造が入手できないときは一般に全部ではないにしろ親ポリペプチドのほとんどをカバーする類似セグメントに関するセグメント置換ポリペプチドを作る必要がある。しかし全アミノ酸配列のセグメント置換は必ずしも必要ではない。たとえば全アミノ酸配列の１部のみをカバーする偶然セグメント置換は特定標的物質に対する活性ドメインを同定するのに十分な情報を提供する。しかしほとんどの場合アミノ酸配列の約１５％以上が活性ドメイン同定のためセグメント置換を受けることが必要である。一般に約５０％、好ましくは約６０％、より好ましくは約７５％、もっとも好ましくは１００％のアミノ酸配列が構造情報がない場合にセグメント置換される。
【００１９】
ここで使用している“類似性アミノ酸残基”または“類似残基”とは親ポリペプチドの対応セグメント中の対応アミノ酸残基とは異なる類似セグメント中のアミノ酸残基を意味する。したがってもし類似セグメントの置換が１つのアミノ酸置換を起こすならそのアミノ酸残基は類似残基である。１度親ポリペプチドおよび１つ以上の類似体が同定されたならば１つ以上の類似体由来の類似セグメントを親ポリペプチド中の選択されたセグメントと置換し多くのセグメント置換ポリペプチドを作る。このような置換は組換えＤＮＡ技術を用い簡単に行なわれる。一般に親ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は簡便な宿主で発現されるようにクローン化およびその他の処理が行なわれる。親ポリペプチドコードＤＮＡは親ポリペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡから誘導されるか、または化学合成的にＤＮＡ配列を構築することによるゲノムライブラリーから入手し得る（マニアチス（Meniatis), T. 等（１９８２）Molecular Cloning 、コールドスプリングハーバーラボラトリー N. Y. )。
それからこの親ＤＮＡを適当なプラスミドまたはベクターに挿入し宿主細胞のトランスホームに使用される。ＤＮＡ配列のクローニングおよび発現により親ポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチドおよびポリペプチド変異体を作るのには原核生物が好ましい。たとえば、大腸菌ｋ１２２９４株（ＡＴＣＣ No.３１４４６）、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣNo. ３１５３７）および大腸菌ｃ６００株およびｃ６００ｈｆｌ株、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ^- ，γ^- , 独立栄養型、ＡＴＣＣ No.２７３２５）、枯草菌などのバチルス類およびサルモネラティムリウム（Salmonella typhimurlum) またはセラチアマルセサンス（Serratia marcesans) などその他の腸内細菌および種々のシュードモナス種が用いられる。好ましい原核生物は大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物中で発現したとき一般にポリペプチドはＮ−末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含みかつグリコシル化されていない。もちろんこれらの例は制限することでなく説明を意図したものである。
【００２０】
原核生物に加え、イースト培養物や多細胞生物由来の細胞などの眞核生物も使用される。原則としてこのような細胞の培養物も使用可能である。しかし脊椎細胞が最も興味深く、培養中（組織培養）の脊椎細胞の増殖は、反復が可能である（“組織培養”アカデミックプレス版、クルーズ（Kruse)およびパターソン（Patterson)編（１９７３））。これらの有用な宿主細胞系列の例にはＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系列がある。
一般に宿主細胞に適合する種由来の複製およびコントロール配列を含むプラスミドベクターがこれらの宿主と合せて使用される通常このベクターは複製部位およびトランスフホーム細胞に発現型選択を提供し得るたん白質をコードする配列を有している。たとえば大腸菌は大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２でトランスホームする（マンデル（Mandel), M. 等（１９７０）J. Mol. Biol. ５３、１５４）。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラチイクリン耐性遺伝子を含んでおり、そのため容易な選択手段を提供している。好ましいベクターはｐＢＯ４７５である実施例１参照。このベクターは宿主間での移動を可能にし、それにより突然変異誘発および発現を容易にするファージおよび大腸菌の複製オリジンを含んでいる。
“発現ベクター”とは適当な宿主中のＤＮＡの発現を可能にする適当なコントロール配列に機能的に結合する該ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。これらのコントロール配列には転写を可能にするブロモーター、そのような転写をコントロールするオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止をコントロールする配列が含まれる。ベクターはブラスミドでもファージ粒子でも、または単に潜在的ゲノム挿入物でもよい。１度適当な宿主にトランスホームすればそのベクターは宿主ゲノムとは独立に複製しかつ機能するかまたはある場合にはゲノムそれ自身の中に組込まれる。本明細書において“プラスミド”および“ベクター”はプラスミドが現在もっとも一般的に用いられているベクターであることからしばしば同義語的に使用される。しかし、本発明は同様に機能しかつ本分野でよく知られている他の形の発現ベクターも包含する。
【００２１】
２つのＤＮＡまたはポリペプチドの関係を述べるときの“機能的に結合した”という言葉はそれらが互いに機能的に関係することを意味する。たとえばおそらくシグナル配列の切断によりたん白質成熟型を分泌するプロセスにおいてシグナル配列として機能するなら該前配列はペプチドと機能的に結合している。プロモーターはコード配列の転写をコントロールするならその配列と機能的に結合している。リボゾーム結合部位は翻訳を可能とする位置にあるならそれはコード配列と機能的に結合している。
１度本ポリペプチドがクローン化されればそのクローン化親ＤＮＡについて部位特異的突然変異誘発（カーター（Carter), P. 等（１９８６）Nucl. Acids Res. １３、４３３１；ゾラー（Zoller), M. J.等（１９８２）Nucl. Acids Res.１０、６４８７）、カセット突然変異誘発（ウェルス（Wells), J. A. 等（１９８５）Gene ３４、３１５）、制限選択突然変異誘発（ウェルス（Wells), J. A. 等（１９８６）Philos, Trans. R. Soc. London Ser A, ３１７、４１５）または他の技術をほどこし置換した類似セグメントにより規定されるアミノ酸配列の変化をコードする“セグメント置換ＤＮＡ配列が作られる。適当な発現ベクターに機能的に結合しているとき、セグメント置換ポリペプチドが得られる。ある場合、親ポリペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドの回収は親ポリペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合する適当なシグナル配列を用いることにより発現宿主からそれらの分子を発現かつ分泌させることで可能となる。これらの技術は当分野でよく知られている。もちろん望ましいポリペプチドのインビトロ化学合成などそれらのポリペプチドおよびセグメント置換ポリペプチドの生成に別の方法も使用し得る（バラニー（Barany), G. 等（１９７９）“ペプチド”(E. グロス(Gross) および J. メイエンホーファー（Meienhofer) 編）アカデミックプレス版、N. Y. ２巻、３〜２５４頁）。
【００２２】
１度種々のセグメント置換ポリペプチドが生成されればそれらを標的物質に接触させ、もし、標的物質と各セグメント置換ポリペプチドとの相互作用があればそれを測定する。同じ標的物質に関するこれらの活性を親ポリペプチドの活性と比較する。もしその類似体が親ポリペプチドと比べその標的物質に関し異なる活性を有しているなら、それらのセグメント置換ポリペプチドは親ポリペプチド中の活性ドメインを規定する類似セグメントを含んでいると推定される。
もし１つの類似体が親ポリペプチドより大きい活性を有しているなら、複数のセグメント置換ポリペプチドがその標的物質に関し活性の増加を示す可能性がある。このような場合、類似体の活性ドメインおよびその標的物質に関する活性を増加するように修正し得る親ポリペプチドの適当な領域を効果的に同定できる。その標的との相互作用にかかわる類似体の領域が主に１つの連続するアミノ酸セグメント内に存在するとき、このような事象が起こりやすい。もし類似体の“活性ドメイン”が類似体アミノ酸配列の不連続領域に含まれるなら、活性の増加はセグメント置換ポリペプチドへ、類似体からの全ての活性ドメインを同時に導入しなければならないからそのセグメント置換ポリペプチドの活性の増加は起こりそうもない。
したがって、類似体は標的物質に対し親ポリペプチドよりも小さい活性をもつことが好ましい。このような場合、セグメント置換ポリペプチドには活性のロスがみられる。しかし、１度親ポリペプチド中の活性ドメインが決定されたら、このポリペプチドは連続的にまたは同時にそのような活性ドメインを置換して標的物質に関して第１親ポリペプチドの活性を欠いた第２親ポリペプチドとする類似体として使用できる。
【００２３】
ポリペプチド中の活性ドメインは標的物質に関するセグメント置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドのそれと比較することにより同定される。多くの分析測定が可能であるが標的物質の非触媒的結合についてはセグメント置換ポリペプチドと標的物質間に形成される複合体の解離定数Ｋｄを親ポリペプチドに関するＫｄと比べる方法が簡便なものの１つである。セグメント置換により類似置換残基あたり、約1.５、好ましくは約2.０のＫｄ値の増減は、置換セグメントがその標的物質と親ポリペプチドの相互作用の活性ドメインであることを示している。標的物質との触媒的相互作用の場合親酵素に対する活性を測定する適当なパラメーターはＫcat ／Ｋm 比を比較することである。親酵素に対し置換類似残基当り約1.５、好ましくは2.０のＫcat ／Ｋm 値の増減は活性ドメインの置換を示す。
本明細書で使用している“スキャンニングアミノ酸”とは親ポリペプチド内の活性アミノ酸を同定するのに用いられるアミノ酸のことである。“残基置換ポリペプチド”はスキャンニングアミノ酸に関する親ポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも単一置換を含むポリペプチド変異体である。“残基置換ＤＮＡ配列”は残基置換ポリペプチドをコードする。このようなＤＮＡおよびポリペプチドはセグメント置換ＤＮＡおよびポリペプチドの調製で述べた方法で調製される。
アミノ酸スキャンで同定した“活性アミノ酸残基”は一般的に標的物質と直接接触するものである。しかし、活性アミノ酸は他の残基またはＨ₂ Ｏのような小分子またはＮａ⁺ ，Ｃａ⁺²，Ｍｇ⁺²またはＺｎ⁺²などのイオン種で形成される塩橋を介して間接的に標的物質に接触することもある。
ある場合には、スキャンニングアミノ酸は親ポリペプチドの活性ドメイン中に同定されるアミノ酸と置換される。一般的に多くの残基置換ポリペプチドが調製され、その各々は活性ドメイン内の種々のアミノ酸残基の位置でスキャンニングアミノ酸の単一置換を含んでいる。特定の標的物質に関するそのような残基置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドの活性と比較し、標的物質との相互作用に関係する活性ドメイン中のアミノ酸残基を決定する。このような分析に用いられるスキャンニングアミノ酸は置換したものとは異なるアミノ酸、すなわちその他の１９種の天然のアミノ酸である。
【００２４】
【表２】

【００２５】
この表は各アミノ酸について以下の記号を使用している。

【００２６】
残基置換ポリペプチドの活性の効果がある場合、それを一様のスキャンニングアミノ酸残基への天然のアミノ酸残基の変化に系統的に帰着させることができるのでスキャンニングアミノ酸は各残基置換ポリペプチドと同じであることが最も望ましい。
ある場合、１つ以上の残基におけるスキャンニングアミノ酸置換は標的物質に関する活性の分析を行うのに十分な量の単離を可能にするレベルで発現しない残基置換ポリペプチドを生ずる。このような場合種々のアミノ酸、好ましくはアイソステリックなアミノ酸が用いられる。
最も好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸残基にはアラニン、グリシン、セリンおよびシスティンが含まれる。アラニンはベータ炭素からとび出た側鎖をもたず、かつ残基置換ポリペプチド主鎖構造が変化しにくいことからこのグループの中でも好ましいスキャンニングアミノ酸である。またアラニンはもっとも一般的なアミノ酸であることからも好ましい。さらにそれは、埋った形でも露出した形でも存在する（クレイトン（Creighton). T. E.,“たん白質”（W. H. フリーマン社版、N. Y. ) ; チォシア（Chothla), C.（１９７６）J. Mol. Biol. １５０、１）。もしアラニン置換が適当な量の残基置換ポリペプチドを生じない場合、アイソステリックアミノ酸が使用される。別に優先性が減る順番に以下のアミノ酸が使用される：Ｓer, ＡsnおよびＬeu 。
スキャンニングアミノ酸の使用はセグメント置換ポリペプチドの分析により確認される活性ドメイン中の活性アミノ酸の同定に限定されるわけではない。たとえば親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸が分っている場合か、または標的物質との相互作用に関っていると考えられる場合、その残基およびその囲りのアミノ酸残基を探るのにスキャンニングアミノ酸を使用することができる。さらにもし親ポリペプチドが小さいペプチド、すなわち約３〜５０アミノ酸残基であるなら、全分子にわたってスキャンニングアミノ酸分析を行ないうる。
【００２７】
１度活性アミノ酸残基が同定されたならアイソステリックアミノ酸に置換される。このアイソステリック置換は全ての場合に行う必要はないしまた活性アミノ酸が同定される前にも行なわれる。このアイソステリックアミノ酸残基はいくつかの置換が起こし得る構造への潜在的破壊効果が最小となるように行なわれる。アイソステリックアミノ酸を第II表に示す。
活性アミノ酸残基は標的物質に関する残基置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドと比較することにより同定し得る。一般に、Ｋｄ値の２倍の増減は置換残基が標的物質との相互作用に活性があることを示している。同様に標的物質との触媒的相互作用の場合、親酵素に対してＫcat ／Ｋm 値の２倍の増減は活性残基の置換を示している。
推定上の、または既知の活性アミノ酸残基をスキャンニングアミノ酸分析にかけるとき、その残基に隣接するアミノ酸残基をスキャンするべきである。その結果３残基置換ポリペプチドができる。１つは推定上または既知活性アミノ酸である部位Ｎにスキャンニングアミノ酸、好ましくはアラニンを含んでいる。他の２つは部位Ｎ＋１およびＮ−１にスキャンニングアミノ酸を含んでいる。各置換ポリペプチドが標的物質に対しＫｄまたはＫcat ／Ｋm 値に約２倍以上の効果を起こすならばそのスキャンニングアミノ酸は部位Ｎ＋２およびＮ−２で置換されている。このことをＫｄまたはＫcat ／Ｋm 値への効果が２倍以下となる少なくとも１個、好ましくは４個の残基が両方向について同定されるまでか、または親ポリペプチドの末端に到達するまでくり返す。このようにして、特定の標的物質との相互用に関係する連続するアミノ酸配列に沿って１つ以上のアミノ酸が同定され得る。
【００２８】
本発明の方法は特定の親ポリペプチドの１つ以上の標的物質に関する活性ドメインの検出に使用される。さらに種々の活性ドメイン内の活性アミノ酸もこの方法により同定される。１度２つ以上の活性ドメインおよび活性アミノ酸残基が特定のポリペプチドの種々の標的物質に関して同定されたならその親ポリペプチドに対して種々の修正を行って該ポリペプチドと１つ以上の標的物質間の相互作用を修正できる。たとえばｈＧＨ表面上の２つの活性ドメインはソマトジェニックレセプターおよびプロラクチンレセプターについても同定された。たの特殊な場合の活性ドメインは重複している。したがってソマトジェニックおよびプロラクチンレセプターと相互作用する多くの共通する活性アミノ酸残基が存在する。ｈＧＨに対する種々の修正は以後より詳しく説明する情報に基づいて行なわれる。ある場合に種々の標的物質に関する活性ドメインは重複していない。このような状況で１つのレセプターに関する親ポリペプチド中の活性アミノ酸の修正は種々のアミノ酸による置換で行なわれ、その結果その標的物質との活性ドメインの相互作用は減少または増加し、それらの変異体の生理作用が変化することになる。
本明細書で使用している“相互作用変化”とは１つ以上の活性ドメインが修正され標的物質とその変異体との相互作用が親ポリペプチドと比べて変化しているポリペプチド変異体について用いられる。相互作用変化とは親ポリペプチドと特定の標的物質との相互作用に比べポリペプチド変異体の相互作用が少なくとも２倍増減することで定義される。
【００２９】
標的物質と親ポリペプチド、ポリペプチド変異体、セグメント置換ポリペプチドおよび、または残基置換ポリペプチドとの相互作用はインビトロまたはインビボの簡便なアッセイで測定し得る。インビトロアッセイは標的物質とポリペプチド、たとえば酵素と基質、ホルモンとホルモンレセプター、抗体と抗原などの検出可能な相互作用を測定するのに用いられる。このような検出には色変化、放射性変化、溶解度変化、ゲル電気泳動法および、またはゲル排除法による分子量変化の測定などが含まれる。インビボアッセイには生理作用、たとえば体重変化、電解質バランスの変化、凝血時間の変化、血餅分解の変化および抗原応答の誘導などを検出するアッセイが含まれるが、以上に示したものに限定されるわけではない。一般に標的物質と目的ポリペプチド間の相互作用変化を測定する可変パラメーターが存在するかぎインビトロアッセイが使用される。
本発明の例としてはヒト成長ホルモンのソマトジェニックレセプターに関する該ホルモンの活性を決定する該ホルモンの活性ドメインおよび活性アミノ酸を同定する態様がある。本発明のこの態様を実施する場合、セグメント置換および残基置換ｈＧＨ変異体を含むヒト成長ホルモン変異体で成長ホルモンのソマトジェニックレセプターとの結合相互作用が天然のヒト成長ホルモンとは異なるものが調製または同定される。これらのヒト成長ホルモン変異体の少なくとも１つはソマトジェニックレセプターに関しより高いアフィニティーを有し、かつラットのソマトジェネシスに対しより高い能力を有している。他のものはソマトジェニックレセプターについて低い活性を有している。このようなｈＧＨ変異体はｈＧＨアゴニストまたはアンタゴニストとして有用であり、かつそれらの変異体はソマトジェニックレセプターとの実質的相互作用がないことからヒト成長ホルモンの他のレセプターを刺激するより高い能力を有している。さらにこれらの変異体はｈＧＨ標準またはトレーサーとしてｈＧＨのイムノアッセイにおいても有用である。たとえば抗ｈＧＨポリクローナル抗体を含むヒトおよびマウス血清との反応性が有意に低い変異体が同定されている別のものにはｈＧＨと同じソマトジェニックレセプターに対する結合アフィニティを有するが成長を刺激する能力がより高いものがある。
【００３０】
肝臓由来のソマトジェニックレセプターと相互作用するヒト成長ホルモンの活性ドメインを測定する方法を図１に示した。この方法では、ｈＧＨのセグメントを、クローン化ｈＧＨ肝臓レセプターおよびｈＧＨに対するモノクローナル抗体に対して非常にアフィニティーの小さいことが知られているｈＧＨ類似体由来の類似配列と系統的に置換した。このようなｈＧＨ類似体にはヒト胎盤ラクトゲン（ｐＰＬ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）およびヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）がある。これらの類似体はソマトジェニックｈＧＨレセプター（ｈＧＨｒ）と比べクローン化ｈＧＨレセプターに対しては約１００〜１００００倍も小さい結合アフィニティーを有する（ハリントン（Harrington), A. C.等（１９８６）J.Clin. Invest. ７７、１８１７；バウマン（Baumann), G., 等（１９８６）J.Clin. Endocrinol、 Metab.６２、１３７）。
相同たん白質はそれらが大きな配列多様性を有するときでさえ同様な三次元構造を有することが知られていることからこれらの類似体が使用される（チョシア（Chothia , C.等（１９８６）ＦＭＢＯ J. ５、８２３）。そのように行うと、類似配列置換をその分子の本来の構造を大きく破壊することなしに容易に適用できるという見込みが増す。ヒト成長ホルモンおよびその類似体ｈＰＬ、ｐＧＨおよびｈＰＲＬのアミノ酸配列を図２に示す。これらのうち最後の３個の類似体は各々８５％、６８％および２３％のレベルでｈＧＨとの配列同一性を共有する。
図１を参照すると、ヒトの成長ホルモンに対するソマトジェニックレセプター（ｈＧＨに対する“標準物質”）と相互作用するヒト成長ホルモン中の１つ以上の活性ドメインを同定する全戦術が示されている。示されているように、ｈＧＨは標的レセプター、この場合のソマトジェニックレセプターに対し正の結合活性を有している。しかしｈＰＲＬ、ｈＰＬおよびｐＧＨ類似体はマイナス記号で示されているにその標的物質に関し著しく活性が低い。文字ＡからＦで示されている６個のセグメント置換成長ホルモンはｈＧＨの選択されたアミノ酸セグメントをｈＰＲＬ類似体の類似アミノ酸セグメントによる置換で生成する。これらの選択されたセグメント各々は互いに異なり、これらを選択してｈＧＨの全アミノ酸配列または活性ドメインを含むことが期待される領域を探る。セグメント置換ヒト成長ホルモンの調製後各ｈＧＨソマトジェニックレセプターに関する検定を行ないその活性を測定する。ｈＧＨと比較したこれらの結果は図１のセグメント修正ヒト成長ホルモンの下の＋または−の記号で示した。図１から分るように、この図中のセグメント置換ヒト成長ホルモンＣおよびＦはソマトジェニックレセプターと結合しない。これらの結果に基づき、成長ホルモン変異体ＣおよびＦ中の類似体由来の類似セグメントに対応する成長ホルモン中の領域はｈＧＨのソマトジェニックレセプター結合に関する活性ドメインであると同定される。
【００３１】
示されているように、もし構造の情報または他のデータがある場合は必ずしもヒト成長ホルモンの全アミノ酸配列または他の親ポリペプチドを試験する必要はない。したがって結晶学からの低分解能または高分解能情報は類似物から選択されるアミノ酸セグメントの不安定化置換を避けるための重要な情報を提供し得る。たとえばヒト成長ホルモンのＸ線座標は得られていないがｐＧＨの低分解能Ｘ線結晶構造に基づくｐＧＨ構造モデルからのヘリックス投影図は４本のヘリックスのうちの３本（ヘリックス１，３および４）は強い疎水性モーメントをもつ両親媒性であることを明らかにした。図３参照。アイゼンバーグ（Elsenberg), D.等（１９８４） J. Mol. Biol. １７９、１２５。ポリペプチド中の疎水性コアは非常に密に存在するので（ポンダー（Ponder), J. W. 等（１９８７）J. Mol. Biol. １９３、７７５）、それらの埋没したアミノ酸残基の変化は一般に不安定化を招く（アルバー（Alber), T.等（１９８７）Biol. Chem. ２６、３７５４；レイダール−オルソン（Reidhaar - Olson), J. F.（１９８８）Science ２４１、５３）。
さらにポリペプチド群たとえばヒト成長ホルモン群の中のアミノ酸が非常によく保存されている領域は少なくとも最初に調べる必要はない。これはそのような保存配列の破壊はその分子の構造を破壊すると考えられるからである。さらに他のデータは親ポリペプチドのある領域は特定の標的物質との相互作用に関係しないことを示している場合がある。たとえば突然変異誘発によるｈＧＨのＮ末端１３残基アミノ酸の欠失（アシュケナン（Ashkenazi), A.等（１９８７）Bndocrlnology) １２１、４１４）および残基３２〜４６を欠失したｈＧＨの中立変異体（２０Ｋｄ変異体；ルイス（Lewis), U. J. 等（１９８０）Biochem. Blophys. Res. Commun.９２、５１１１）はソマトジェニックレセプターに対する結合性に大きく影響しないことが報告されている。さらに残基１３４と１４９の間の残基の一部または全てを欠失した制限たん白質分解によるｈＧＨの２本鎖誘導体の生成もソマトジェニックレセプターに対する結合に著しい影響を示さなかった。リ（Li), C. H.（１９８２）Mol. Cell. Biochem. ４６、３１；ミルス（Mills), J. B. 等（１９８０）Endocrinology １０７、３９１。
【００３２】
この情報に基づき、ｈＧＨのアミノ酸配列の６個のセグメントとが多くのｈＧＨ類似体由来の対応する類似アミノ酸セグメントとの置換に選ばれた。これらの選択されたセグメントは図２のウからＦに対応する。これらのセグメントをジスルフィド結合、二次構造の境界（図４参照）、成長ホルモン群中に高度に保存される配列の領域、またはそのソマトジェニックレセプターへの結合に関与しないことが以前に同定された領域によって分離した。ｈＧＨの１９１残基中の８５残基を集合的に置換した１７個のセグメント置換ｈＧＨ変異体を調製した。図２のＡからＦに割り当てた領域および各領域内のセグメントを置換したｈＧＨ変異体を第III 表にまとめた。
【００３３】
【表３】

【００３４】
1/ 制限選択−ウェルズ（Wells), J. A. 等（１９８６）
Philos. Trans. R. Soc. London Ser A 317, 415.
2/ カセット突然変異誘発−ウェルズ（Wells), J. A. 等（１９８５）
Gene 34, 315.
3/ 組換え突然変異誘発−グレー（Gray), G. L.等（１９８６）
J. Bacteriol. 166, 635.
【００３５】
一般にセグメント置換ｈＧＨ変異体はヒト成長ホルモン配列へ置換される類似セグメントにより決まる。しかしある場合には置換類似セグメント中の類似残基のすべてがその構築物中に維持されるわけではない。このように第III 表のｈＰＬ（１２−２５）はヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）のアミノ酸１２〜２５が親ｈＧＨのアミノ酸残基１２〜２５と置換したセグメント置換ｈＧＨ変異体のことである。この類似セグメントを置換した効果は、図２のこの領域中のｈＧＨとｈＰＬのアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。ｈＰＬ（１２−２５）変異体では４個のアミノ酸置換が生じているがなんの変化も起こらない。ｈＰＬ（１２−２５）の場合のこれらの残基は１２、１６、２０および２５である。
ｈＰＬ（１２−２５）変異体中の実際のアミノ酸置換および他のセグメント置換変異体を第III 表に示した。各置換は数字の前後に文字を付けて表わされる。第１の文字および数字は未修正ｈＧＨの残基番号におけるアミノ酸を示している。最後の文字はその位置で置換したアミノ酸を示している。したがってＮ２１ＨはｈＧＨの１２番のアスパラギンがｈＰＬ（１２−２５）変異体ではヒスチジンに置換していることを示している。
したがって導入された実際の置換のいくつかは図２における対応するセグメントで示される置換とは対応していない。このようにｈＰＬ（１２−２５）は全ｈＰＬ（１２−２５）セグメントが置換された場合４個の置換Ｎ１２Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｌ２０ＡおよびＦ２５Ｉを含むことになる。しかし、実際の変異体はＲ１６およびＬ２０は維持しており、導入される置換は第III 表に示されているように４個の置換のうちの２個、すなわちＮ１２ＨおよびＦ２５Ｉだけである。親ｈＧＨの１つ以上の残基を維持する他のセグメント置換変異体には領域ＡおよびＥを含むものおよびセグメント置換変異体ｈＰＬ（４６−５２）およびｐＧＨ（１６７−１８１）が含まれる。
【００３６】
各々のセグメント置換ヒト成長ホルモン変異体をクローン化可溶性ｈＧＨレセプターの細胞外領域からの( ¹²⁵ Ｉ）ｈＧＨの置換を用いたインビドロシステムで検定しそのソマトジェニックレセプターに対するセグメント置換変異体の相対的アフィニティーを定量した。レング（Leung), D. W. 等（１９８７）Nature 330,５３７。この短縮型のソマトジェニックレセプターは同膜型レセプターと比べ若干結合アフィニティーは小さいが（Ｋｄ−0.３ nＭ）同程度の活性を示す（スペンサー（Spencer), S. A. 等（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３、７８６２）。
実施例に詳細に述べられているように各々残基１１−１９，５４−７４および１６４−１９１を含む選択セグメントＡ，ＣおよびＦはソマトジェニックレセプターと相互作用するｈＧＨ分子の活性ドメインである。このことはこれらの領域内のｈＧＨ類似体の類似セグメントを含むほとんどのセグメント置換ｈＧＨ変異体に関し１０倍以上も低いＫｄ値が観測されたことに基づく。図４参照。もちろんこのことはこれらの活性ドメイン内の各アミノ酸残基がそのソマトジェニックレセプターの結合残基であることは意味しない。むしろそれらのドメインはそのような活性残基を見い出し得るアミノ酸配列を規定している。さらに活性ドメインＡ，ＣおよびＦの位置が決められた。たとえば変異体ｈＰＲＬ（１２−３３）をアミノ酸およびカルボキシ末端変異体ｈＰＲＬ（１２−１９）およびｈＰＲＬ（２２−３３）に分断した。この実験結果はｈＧＨの活性ドメインを残基１２〜１９にしぼり込んだ。同様に領域Ｆ（ｐＧＨ（１６７−１８１））のアミノ末端領域は結合アフィニティーの著しい低下を示した。最も著しい効果にはたった２個の突然変異Ｅ５６ＤおよびＲ５６Ｍが導入されたｈＰＬ（５６−６４）の結合よりも３０倍も小さいものがあった。領域Ａ，ＣおよびＦはｈＧＨの一次配列上では非常に離れているが、そのホルモンの三次構造はそれらを非常に接近させている。図５参照。これらの活性ドメインはヘリックス１のアミノ末端（活性ドメインＡ），Ｃｙｓ−５３からヘリックス２の開始までのループ（活性ドメインＣ）およびヘリックス４の中央領域（活性ドメインＦ）を含むバッチを形成している。
【００３７】
さらにｈＧＨに対する８個のＭａｂをセグメント置換ｈＧＨ変異体に対して検定しｈＧＨのエピトープの地図を作った。さらにそのＭａｂはｈＧＨおよびｈＧＨ変異体を用いた競争検定に用いｈＧＨに対するｈＧＨレセプター結合を阻害する各Ｍａｂの能力を評価した。
これらの実験結果を合せるとｈＧＨへの類似セグメントの置換は分子本来の構造を著しく破壊しないという証拠および観測される活性はソマトジェニックレセプターとレセプター置換ｈＧＨ変異体との相互作用に関する直接的効果によるものであるという証拠をいくつか提供している。まずセグメント置換変異体はそのソマトジェニックレセプターまたはＭａｂに対する結合を破壊することに関し非常に選択的である。第２にソマトジェニックレセプターおよびＭａｂは配列同様構造も認識する。該レセプターおよび少なくとも４個のＭａｂは該たん白質三次構造感受性の不連続エピトープを認識する。第３に精製変異体全ての円二色スペクトルは実際に野生型ｈＧＨと同じである。第４にｐＧＨ（１６４−１９０）を除いて全ての変異体は基本的に野生型と同量発現したインビボのたん白質分解耐性が構造完全性のスクリーニングに用いられている。ヘクト（Hecht), M. H.,等（１９８４）Proc. Natl. Acad. Scl.ＵＳＡ ８１、５６８５；ショートル（Shortle). D.等（１９８５）Genetics １１０，５３９
セグメント置換ｈＧＨ変異体の結合活性変化は必ずしもそれら変異体中の置換残基が直接ソマトジェニックレセプターと接していることを示しているとは限ぎらない。破壊的突然変異は好ましい相互作用がなくなるだけでなく、不都合なものも誘導する。たとえばｈＰＬ（１２−１９）セグメント置換ｈＧＨ変異体中のＮ１２Ｒ変異体はＡｓｎ１２の水素結合するアミド基を変化させるばかりでなく、Ａｒｇ置換は正に荷電したより大きい側鎖を導入する。さらに多くの結合性接触がその類似体間に保存されるのでその結果全ての接触ではないにしろある領域をセグメント置換ｈＧＨ変異体で探ることができる。
【００３８】
図２の活性ドメインＡ，ＣおよびＦ内の特定の活性アミノ酸を同定するためこれらの活性ドメインの精密構造分析を行った。この分析ではこれら３個の活性ドメインの残基を順番にアラニンと置換した。６３個の単一アラニン変異体を作り、各々の可溶性ｈＧＨレセプター（ｓｈＧＨｒ）に対する結合定数を測定した。レング（Leung), D. W. 等（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３、７８６２。
この分析に基づいて第IV表にリストしたアミノ酸残基はソマトジェニックレセプターとの相互作用に関して活性なｈＧＨ分子内の残基を構成している。これは、それらの残基のアラニン置換により誘導される相対的解離定数が野生型ｈＧＨに比べ４倍以上になることに基づいている。図７参照。
ｈＧＨ変異体を作るのに好ましいこれらの残基のアミノ酸置換を示す。
【００３９】
【表４】

【００４０】
ソマトジェニックレセプターに対しあまり活性でないその他のアミノ酸残基を
第Ｖ表に示す。一般にこれらの残基はアラニンと置換したとき相対的Ｋｄ値が２倍以下の増加を示す。
【００４１】
【表５】

【００４２】
アラニンと置換したとき相対的にＫｄ値が減少する（つまりソマトジェニックレセプターに対してはより大きいアフィニティーを示す）ｈＧＨ中のアミノ酸残基を第VI表にリストする。
【００４３】
【表６】
第 VI 表
Ｐ２ Ｅ６５ Ｓ１８４
Ｔ３ Ｑ６９ Ｅ１８６
Ｌ９ Ｌ７３ Ｓ１８８
Ｈ１８ Ｒ１６７ Ｆ１９１
Ｒ６４ Ｅ１７４
【００４４】
１残基置換ｈＧＨ変異体、Ｅ１７４Ａ、は驚くべきことにソマトジェニックレセプターに対する解離定数が有意に（ほぼ５倍）に減少する。ソマトジェニックレセプターに対する結合アフィニティを示すことに加え、この変異体はラットの体重検定においてｈＧＨと比べソマトジェニック能の増加を示した。この置換および1.４倍以上のソマトジェニック結合の増加を示す他の特定の残基置換を第VII 表に示す。
【００４５】
【表７】

【００４６】
図７には示されていないアラニン置換を含む他の変異体を第VIII表にリストする。
【００４７】
【表８】

【００４８】
注：ＮＥ−振とうフラスコ中容易に単離し得るほど発現されなかったもの（すなわち、野生型発現レベルの約５％以下）
同定後、ｈＧＨ中のソマトジェニックレセプターに対する活性アミノ酸残基を予備分析で行ったスキャンニングアミノ酸以外の種々のアミノ酸で置換することにより分析を行う。第IX表にその残基置換変異体を示した。
【００４９】
【表９】

【００５０】
注：ＮＥ−振とうフラスコ中容易に単離し得るレベルまで発現しなかったもの
（すなわち、野生型発現レベルの約５％以下）
調製したｈＧＨ変異体に加え、第Ｘ表にはｈＧＨ中の特定のアミノ酸残基と、生物学的機能が変化した変異体を生成することが予想される置換アミノ酸を示した。
【００５１】
【表１０】

【００５２】
別の態様においてはプロラクチンレセプターに対するｈＧＨの結合エピトープを決定した。ｈＧＨは成長ホルモンレセプターにもプロラクチン（ＰＲＬ）レセプターにも結合し得る。本明細書に示されているようにこれらのレセプターはｈＧＨへの結合に関し互いに競争し、このことはそれらの結合部位が重複していることを示している。スキャンニング突然変異誘発データはｈＰＲＬレセプターに対するｈＧＨのエピトープはヘリックス１の中央部（残基Ｐｈｅ２５およびＡｓｐ２６を含む）、ループ領域（Ｉｌｅ５８およびＡｒｇ６４を含む）およびヘリックス４の中央領域（残基Ｋ１６８，Ｋ１７２，Ｅ１７４およびＦ１７６を含む）にある決定基から成る。これらの残基はｈＧＨの構造モデル地図を作ったときのバッチを形成する。この結合バッチは本明細書で述べられ、かつＢ．Ｃ．カニンガム（cunningham) およびＪ．Ａ．ウェルズ（Wells)（１９８９）Sccince ２４４、１０８１−１０８５）により公表されたｈＧＨレセプターについて決定されたものと重複するが同一のものではない。ｈＧＨに関するこれらのレセプター結合部位の非重複領域に突然変異を起こすことにより、ｈＧＨの選択性が各レセプターへの結合アフィニティーを損失することなく、ｈＧＨレセプター側へ２０００倍以上またはＰＲＬレセプター側へ２０倍以上シフトした。同様に重複領域に突然変異を起こすことにより、両レセプターに対し同時に５００倍以上結合を減少させ得る。このようなｈＧＨのレセプター選択的変異体は、線型成長または泌乳などのｈＧＨの種々の生物学的活性と特異的レセプター結合現象を結びつける有用な分子プローブとなる。
【００５３】
別の態様ではヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のレセプター結合決定基を通常の非結合類似体、ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）中に入れた。本明細書およびカニンガム（Cunningham), B. C.およびウェルズ（Wells), J. A. ((１９８９）Sceince ２４４、１０８１−１０８５）で公表されたアラニンスキャンニング突然変異誘発は、ヒト肝臓からクローン化したｈＧＨレセプターに対する結合を調節するｈＧＨ中の重要な残基を同定した。ｈＰＲＬ由来の別の突然変異がｈＧＨに導入され、ｈＧＨレセプター結合部位内のｈＰＲＬ置換は結合能をほとんど破壊することを明らかにした。その後ｈＰＲＬのｃＤＮＡをクローン化し大腸菌で発現させた。それからレセプター結合に非常に重要と思われるｈＧＨからの置換を順次導入し突然変異を起こした。部位指定突然変異誘発を７回くり返した後、その会合定数がｈＧＨレセプターの１００００倍以上に強化された８個の突然変異を含むｈＰＲＬ変異体を同定した。このｈＰＲＬ変異体は野生型よりもわずか６倍結合が弱く一方ｈＧＨとの配列一致性はわずか２６％であった。これらの結果はｈＧＨおよびｈＰＲＬとの構造類似性を示し、ｈＧＨレセプターエピトープの同一性を確証している。さらに一般にこれらの実験はアゴニストまたはアンタゴニストなどの新しい性質をもつハイブリッドホルモンを設計するのに有効であることが分っている近縁でかつ機能的に多様なホルモン類からレセプター結合性を容易に借し得ることを示している。
以下に示すものは例であって本発明の範囲を制限するものではない。
【００５４】
【実施例】
実施例１
ｈＧＨ突然変異誘発および発現ベクター
効率的な突然変異誘発を行うためｈＧＨコード配列を変えることなく均等に分布する１８個の単独の制限部位をもつ合成ｈＧＨ遺伝子を作った。この合成ｈＧＨ ＤＮＡ配列を各々およそ６０塩基対長で隣接するカセットと１０bp重複する７個の合成ＤＮＡカセットをライゲーションすることにより組立てＮｓｉＩからＢｇｌ II でしめされる４０５bpのＤＮＡフラグメントを作った。この連続フラグメントをポリアクリルアミドゲルで精製し、これから溶出してアルカリホスファターゼプロモーターおよびＳｔｌｌシグナル配列（チャン（Chang), C. N. 等（１９８７）Gene ５５、１８９）、ファージｆｌの複製オリジンおよび複製オリジンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むbp１２０５から４３６１までのｐＢＲ３２２の領域を含む受容ベクターｐＢ０４７５を同様に切断したものにクローン化した。この配列はダイデオキシ分析により確認した（サンガー(Sanger), F.等（１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７４、５４６３）。
図９に示したようにｐＢ０４７５を構築した。長さ４７５bpのＤｒａＩ，ＲｓａＩフラグメント上に含まれる繊維上ファージ由来のｆｌ由来のＤＮＡをｐＢＲ３２２の単独のＰｖｕ II 部位にクローン化しプラスミドｐ６５２を作った。テトラサイクリン耐性遺伝子のほとんどはｐ６５２をＮｈｅＩおよびＮａｒＩを制限切断し、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰを用いてその粘着末端を充填し、かつ大きい方の３８５０bpのフラグメントそれ自体をライゲーションすることにより欠失させてプラスミドｐ△６５２を構築した。ｐ△６５２をＥcoＲＩ，ＥcoＲＶで切断し、その３６９０bpのフラグメントをアルカリホスファターゼプロモーター、ＳＴ II シグナル配列および中立ｈＧＨ遺伝子を含む phGH4R （チャン （Chang), C. N. 等（１９８７） Gcnc. ５５、１８９）由来の１３００bpＥcoＲＩ，ＥcoＲＶフラグメントはライゲーションした。この構築物をｐＢ０４７３と命名した。合成ＤＮＡを３種の様式でｐＢ０４７３にクローン化した。ベクターｐＢ０４７３をＮｓｉＩ，Ｇｇｌ II で切断し、両方とも合成ＤＮＡ由来の２４０bP ＮsiＩ、Ｈind III フラグメントおよび１１７０bP Ｈind II, ＢglIIフラグメントにライゲーションした。この構築物ｐＢ０４７５はｈＧＨの中立ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むがｈＧＨ遺伝子の突然変異誘発やその後の操作を可能にする多くの新しい単独制限部位を有している。ｈＧＨアミノ酸配列とともにｐＢ０４７５の全ＤＮＡ配列を図１０に示す。ｐＢ０４７５中のｈＧＨ配列内の単独制限部位は類似体ｐＧＨ，ｈＰＬおよびｈＰＲＬ由来の類似セグメントをコードするＤＮＡ配列を含む変異原カセットの挿入を可能にする（ウェルス（Wells), J. A. 等（１９８５）Gene ３４、３１５）。別にｈＧＨ配列を一本鎖ベクターｐＢ０４７５の部位指定突然変異誘発により修正し、つづいて単独制限部位の１つについての制限選択を行った（ウェルス（Wells), J. A. 等（１９８６）Philos. Trans. R. Soc. London Ser A ３１７、４１５）
【００５５】
第III 表にあげた１７種類のセグメント置換ｈＧＨ変異体を調製した。各々は野生型ｈＧＨと同様のレベルおよび後に述べるｈＧＨ−ｈＧＨハイブリッドをはるかに越えるレベルで大腸菌の細胞周辺腔に分泌された。ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体は低いリン酸最小倍地で生育した大腸菌Ｗ３１１０，ｔｏｎＡ株（ＡＴＣＣ２７３２５）で発現させた（チャン（Chang), C. N. 等（１９８７）Gene ５５、１８９）。
ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体は以下のように精製した。細胞ペレット２００ｇに４倍容（８００ml) の１０ mＭトリス（pH 8.0) を加えた。この混合物をペレットが溶解するまで室温でシェーカーにより振とうした。この混合物をホモジナイズして低温室で１時間攪拌した後、７０００ｇで１５分間遠心した。その上清をデカンテーションしてから４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え（２７７ｇ／リットル）、室温で１時間攪拌した。１１０００ｇ３０分間の遠心後、そのペレットを４０mlの１０ mＭトリス（pH 8.0) に懸濁した。この溶液を２リットルの１０ mＭトリス（pH 8.0) に対し一晩透析し、この試料を遠心または0.４５ミクロンメンブレンで濾過した。その後試料を１００mlのＤＥＡＥセルロース（ファーストフロー、ファルマシア製）カラムにかけた。カラム容量の８〜１０倍の１０ mＭトリス（pH 8.0) 中ゼロから３００ mＭ ＮａＣl の勾配を用いてカラムの溶出を行った。ＰＡＧＥで同定したｈＧＨフラクションを集めて１０ mＭトリス−ＨＣl(pH 8.0) に対し一晩透析した。この試料を Centri - Prep１０限外濾過によりおよそ１mg／mlになるまで濃縮した。
【００５６】
実施例２
ｈＧＨおよびｈＧＨの相同組換え体
ブタの成長ホルモンのＣ末端領域に結合したｈＧＨの種々の長さのＮ末端領域を含むランダムハイブリッドライブラリを直列に結合した遺伝子のランダム組換え法により構築した。グレー（Gray), G. L.等（１９８６） J. Bacteriol.１６６、６３５。
ｐＢ０４７５のＥcoＲＩ部位を該プラスミドのＥcoＲＩ制限処理により除去し、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰを添加することにより粘着末端を充填した後、このプラスミドをライゲーションした。つぎにｈＧＨ遺伝子の３′末端の直前に新しいＥcoＲＩ部位を導入した。これはＥcoＲＩ部位を含むｈＧＨ−４Ｒの３４５bp Ｂgl II , ＥcoＲＶフラグメントをＥcoＲＩ^- ｐＢ０４７５構築由来の同様の制限レクターにサブクローニングすることにより行った。それからｐＧＨ遺伝子（シーバーグ（Seeburg) P. H.等（１９８３）ＤＮＡ ２、３７）をこの構築物のｈＧＨ遺伝子の３′末端直後に導入した。これは先に述べた構築物のＥcoＲＩ，ＥcoＲＶ消化物の大きい方のフラグメントにｐＧＨｃＤＮＡを含むＥcoＲＩ、Ｈind III （充填）フラグメントを導入することにより行った。このプラスミドｐＢ０５０９は３′末端に単独のＥcoＲＩ部位をもつ本来のｈＧＨ遺伝子と、それに同じ方向でつづく本来のｐＧＨ遺伝子を含む。ｈＧＨ遺伝子とｐＧＨ遺伝子のホモロジーのためｐＢ０５０９の一部は大腸菌 rec⁺ ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）にトランスホームしたときインビボ組換えを起こしハイブリッドｈＧＨ／ｐＧＨを生ずる。これらの組換え体は集めたＤＮＡをＥcoＲＩで制限処理し、ＥcoＲＩ部位を失うような組換えを行わなかったプラスミドを線状にすることにより濃縮した。２回の制限選択および大腸菌 rec⁺ ＭＭ２９４へのトランスホーメーションの後、ほとんど全てのクローンがハイブリッドｈＧＨ／ｐＧＨ組換え体となった。２２個のクローンの配列分析は、ｈＧＨ／ｐＧＨハイブリッドがアミノ末端ｈＧＨ配列とそれにつづくアミノ酸残基＋１９，＋２９，＋４８，＋９４，＋１０５，＋１２３および＋１６４で始まるｐＧＨ配列を含んでいることを示した。
【００５７】
ｈＧＨ遺伝子に均等に分布する交叉点を有する７個のｈＧＨ−ｐＧＨハイブリッドが得られた。しかし極端なカルボキシ末端ハイブリッド（ｈＧＨ（１−１０３）−ｐＧＨ（１６４−１９１））のみが精製および分析に十分なレベルで大腸菌から分泌された。このｈＧＨ−ｐＧＨハイブリッドはヘリックス４の疎水面上に存在する３個の置換（Ｍ１７０Ｌ，Ｖ１７３ＡおよびＶ１８０Ｍ）を導入する。したがって図２のヘリックス領域Ａ，Ｄ，ＥおよびＦにおける配列変化のほとんどはヘリックスの疎水面上の残基の突然変異を避けるよう設計した。たとえば上述のハイブリッドｈＧＨ−ｐＧＨ変異体は、Ｍ１７０，Ｖ１７３，Ｆ１７６およびＶ１８０を維持するよう修正した。なぜならこれらの残基はヘリックス４の疎水面上内に存在するからである。
【００５８】
実施例３
可溶性ヒト成長ホルモンレセプターの大腸菌からの発現および精製
可溶性ヒト成長ホルモンレセプターｓｈＧＨｒをコードするクローン化ＤＮＡ配列（レング（Leung), D. W. 等（１９８７） Nature ３３０、５３７）をｐＢ０４７５にサブクローンしｐＪＩ４６６を作った（図１１および図１２参照）。
ベクターｐＣ１Ｓ，２ＳＨＣＨＲ（レング（Leung), D. W. 等（１９８７）Nature ３３０、５３７）をＸbaＩおよびＫpnＩで消化し、ｈＧＨの分泌シグナルおよび２４６コドンの細胞外領域をコードする1.０bpフラグメントを精製した（マニアチス（Maniatis), T. 等（１９８２）モレキュラークローニング、コールドスプリングハーバーラボライリー，Ｎ．Ｙ．）。このフラグメントを同様に切断したＭ１３mp１８にライゲーションし組換え体用に一本鎖ＤＮＡを精製した（メシング（Messing), J.（１９８３）Methods in Enzymology.１０１巻、２０頁）。部位指定突然変異誘発（カーター（Carter), P. 巻（１９８６）Nucleic Acids Res.１３、４３３１）を１８mer.ジゴヌクレオチド５′−Ａ−ＡＧＴ−ＡＧＴ−ＧＣＡ−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＧＧ−３′により行ないコドン＋１にＮsiＩを導入した。変異配列はダイデオキシ配列分析（サンガー（Sanger), F. 等 Proc.Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７４、５４６３）により確認した。変異体の二本鎖ＤＮＡを精製しＮsiＩおよびＳmaＩで切断した。ｈＧＨレセプターの２４６コドン細胞外領域を含む９００bpフラグメントを単離した。ｐＢ０４７５をＮsiＩおよびＥcoＲＶで切断し4.１kbフラグメント（合成ｈＧＨ遺伝子を欠く）を精製した。
レセプターの９００bpフラグメントおよび4.1 kbベクターフラグメントをライゲーションし、その組換えクローン（ｐＪ１４４６）を制限地図により確認した。これを大腸菌ＫＳ３０３（トランスホームし（ストローチ（Strauch), K.等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８５、１５７６）、ついで、低リン酸培地（チャン（Chang), C. N. 等（１９８７）Gene ５５、１８９）中３０°Ｃで成育した。レセプターフラグメントたん白質をｈＧＨアフィニティークロマトグラフィーで精製した（スペンサー（Spencer), S. A. 等（１９８８）J.Biol. Chem. ２６３、７８６２；レング（Leun g) D. W. 等（１９８７）Nature３３０、５３７）。ｐＪ１４４６の配列をクローン化レセプターのアミノ酸配列とともに図１２に示す。
【００５９】
大腸菌Ｗ３１１０，deg Ｐ株（ストローチ（strauch), K. L. 等（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５、１５７６）をｐＪ１４４６でトランスホームし、ファーメンター中低リン酸培地（チャン（Chang), C. N. 等（１９８７）Gene ５５、１８９）を用い３０°Ｃで生育させた。２４６アミノ酸のｈＧＨｒを用い予備データをとった。アミノ酸１〜２３８番を含むわずかに短かいｈＧＨｒを本明細書の実施例１で用いた。このレセプターについて得られた結果は２４６アミノ酸ｈＧＨｒで得た値と区別できなかった。
カルボキシル末端異質性の問題を避けるためにＧｌｎ２３８の後に停止コドンを入れたプラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）を構築した。ｐｈＧＨｒ（１−２３８）を含むＫＳ３３０培養物からは結合たん白質がｐｈＧＨｒ（１−２４６）を含む培養物からよりもわずかに高い収率でかつより均一なものが生成した（データ示さず）。湿重量0.２kgの細胞ペレットから始め７０〜８０パーセントの収率で２０〜４０mgの高純度結合たん白質がルーチンに単離された（２リットルの高密度細胞培養物から）。Ｎ末端シーケンシングおよび質量スペクトル分析と組合せたペプチドマッピングでその生成物は残基１から２３８に及んでいることが確認された。
ｐｈＧＨｒ（１−２４６）テンプレートの部位指定突然変異誘発をオリゴヌクレオチド

を用いて行ない（カーター（Carter),等（１９８６）Nucleic Acids Res.１３、４４３１−４４４３）ｐｈＧＨｒ（１−２４０，Ｃ２４１Ｒ）を作った（式中アステリスクはｐｈＧＨｒ（１−２４６）とのミスマッチを示し、下線は新しい単独のＭluＩ部位であり、ＣＧＴ−ＴＡＧはＣ２４１Ｒ突然変異とそれにつづく停止コドンを示す（第Ｘ表Ａ）。
【００６０】
【表１１】

＊は野生型テンプレートとのミスマッチを示す。
【００６１】
プラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）をＭluＩ部位（第Ｘ表（Ａ））に対する制限選択（ウェルス（Wells), 等（１９８６）Phil Trans. R. Soc. Lond. A. ３１７，４１５−４２３）を用いたｐｈＧＨｒ（１−２４０，Ｃ２４１Ｒ）テンプレートの部位指定突然変異誘発により生成した。簡単に云うとオリゴヌクレオチド

はＧln２３８（ＣＡＡトリプレット）の後に翻訳停止コドンを誘導しかつＭluＩ制限部位（下線）を修正した。ヘテロ二本鎖による最初のトランスフェクションから二本鎖ＤＮＡを回収した後、再トランスホームしてＤＮＡシーケンシングの前に目的とするｐｈＧＨｒ（１−２３８）プラスミドを増やした。
最終的にｐｈＧＨｒ（１−２３８）中にクローン化したｈＧＨ結合たん白質がｃＤＮＡ変異体またはクローニングアーテファクトを生じさせるＴ５１Ａ突然変異を含むことはＤＮＡシーケンシングで確認された。それゆえＡ５１Ｔリバータントは報告されている配列と同じである。（レング（Leung)等（１９８７）Nature(London) ３３０、５３７−５４３。部位５１にＴhrまたはＡlaを含むたん白質の精製および結合性は区別できない（データ示さず）。Ａla５１結合たん白質変異体は特性が明らかになっているのでひきつづく全ての分析用に選択された。ヒト血清から単離した天然の産物と大腸菌由来の組換えｈＧＨ結合たん白質の特異性を比較するため野生型と種々のｈＧＨ変異体のアフィニティーを測定した。
【００６２】
【表１２】

ａ．Ｋｄ値およびその標準偏差（ＳＤ）は、野生型ｈＧＨ（wt) および多くのｈＧＨ変異体を用いた競争結合分析（図２４）により測定した。
ｂ．各ｈＧＨ結合たん白質に対するｈＧＨ変異体および野生型ｈＧＨ（wt) の解離定数の比から計算される結合アフィニティーの減少。
ｃ．所定のｈＧＨ型の２つのｈＧＨ結合たん白質の解離定数の比。
【００６３】
両たん白質はｈＧＨと特定の化学両論比の複合体を形成した（図２４）。これから分るように野生型ｈＧＨおよびその変異体のアフィニティーは２つの結合たん白質間でほぼ同じであった（上述、右側欄）。組換えｈＧＨ結合たん白質はヒト血清由来の中立たん白質と比べ非常に高いアフィニティーを有している。このことは、その組換えたん白質の純度および均一性を反映している。ｈＧＨ結合たん白質に対する結合能を破壊するｈＧＨの４つのアラニン変異体に対する結合アフィニティーの変化によって示されるように両たん白質は同じ特異性を有している（上述Ｋｄ（変異体）／Ｋd （ｗｔ）。Ｔyr２４６にまで及び結合たん白質に対するｈＧＨのアフィニティー（Ｋd ＝0.３６±0.０８ nＭ）は実質的にＧln２３８の後で終っているものと同じであり（0.４０＋0.０３ｎＭ）、このことは、その分子の７個目のシステインを含む最後の８残基はｈＧＨの結合に関し重要ではないことを示している。
【００６４】
実施例４
レセプターおよびモノクローナル抗体結合検定
精製したｈＧＨまたはｈＧＨ変異体（９５％以上の純度）について、実施例３の可溶性ｈＧＨレセプターへの結合に関する検定を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のコーマージ染色ゲルのレーザーデンシトメータスキャンニングにより精製ホルモンの濃度を定量した。これらの値は２８０nmの吸光度による濃度（ε₂₃₀ ^1%＝0.９３）とよく一致した。解離定数（Ｋｄ）は２５°Ｃにおける可溶性ｈＧＨレセプターに結合する〔 ¹²⁵Ｉ〕ｈＧＨの競合置換に関するスキャッチャード分析から計算した。この〔 ¹²⁵Ｉ〕ｈＧＨはスペンサー（Spencer), S. A. 等（１９８８），J. Biochem. ２６３、７８６２）の方法に従って調製した。
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用い種々のセグメント置換および残基置換ｈＧＨ変異体に対する８個のモノクローナル抗体の結合を検定した。以下のＭａｂを使用した。
【００６５】

【００６６】
ｈＧＨに対するウサギポリクローナル抗体をアフィニティー精製し、0.００５Ｍ炭酸ナトリウム（pH１０）中最終２μg ／mlの濃度、２４°Ｃ、１６〜２０ｈマイクロプレート（Ｎunc プレート、インターメド社、デンマーク）をコーティングした。このプレートをバッファＢ中（５０mMトリス〔pH 7.5〕、0.１５ＭＮa Ｃl 、２mM ＥＤＴＡ，５mg／ml ＢＳＡ，0.０５％トウィーン２０，0.０２％アジ化ナトリウム）0.１μg ／mlの各ｈＧＨと２５°Ｃ、２時間反応させた。プレートを洗浄後バッファＢで１５０〜0.００２ nＭに段階的に希釈した指示Ｍabとインキュベートした。２時間後プレートを洗浄し、ホースラディッシュバーオキシダーゼ結合抗マウス抗体で染色して検定した。得られた値は各ｈＧＨ変異体への最高結合量の半値を与えるのに必要な各Ｍabの濃度を表わしている。
抗ｈＧＨ ＭabによるｈＧＨからのｈＧＨレセプターの競合置換は以下のように測定した。この検定は先に述べたように抗ＧＨウサギポリクローナル抗体をコートしたマイクロプレートにおける野生型ｈＧＨの固定化により行った。レセプター（１０ nＭで固定）および所定の抗ｈＧＨ Ｍab（１５０〜0.００２ nＭの範囲で希釈）をｈＧＨコートマイクロプレートに入れ２５°Ｃで１６〜２０時間インキュベートし、その後未結合成分を洗浄した。結合レセプター量はｈＧＨと該レセプターとの結合を阻害しないホースディッシュパーオキシダーゼに結合させた抗レセプターＭabを加えることにより定量した。標準化置換値はプレート上のｈＧＨを飽和するのに必要なＭab濃度の半値に対する該レセプターの５０％を置換するのに必要なＭab濃度の比から計算した。この値は各Ｍabの該レセプター置換能の比較に用いた。
【００６７】
実施例５
ソマトジェニックレセプター結合の活性ドメイン
実施例３の可溶性ソマトジェニックレセプターおよび実施例４で述べたモノクローナル抗体への結合に関し、実施例１および２で述べた１７個のセグメント置換ｈＧＨ変異体を検定した。ソマトジェニックレセプターに対する結合検定の結果を第III 表に示す。これから分るように結合能をほとんど破壊するセグメント置換は図４および図５の領域Ａ，ＣおよびＦ内のものである。さらにこれらの領域をさらに小さいセグメントにしばり込みソマトジェニックレセプターへの結合に関係するｈＧＨ分子の活性ドメインの位置を決定した。第III 表からの最も重要な結果を図４に示す。この図は、類似体ｈＰＲＬ、ｈＰＬおよびｂＧＨ由来の類似配列の置換による可溶性ｈＧＨレセプターへの結合における相対的減少を示した棒グラフである。各々アミノ酸残基１２−１９、５４−７４および１６４−１９０を含む３つの活性ドメイン領域Ａ，ＣおよびＦが同定された。これらの領域は図５のｈＧＨ分子の３次元に示されている。
これから分るように、３つの活性ドメインＡ，ＣおよびＦはｈＧＨのアミノ酸配列中では不連続であるけれどもｈＧＨに関するソマトジェニック結合部位を規定する分子構造においては連続領域を形成している。
【００６８】
実施例６
ｈＧＨエピトープマッピング
特定のセグメント置換ｈＧＨ変異体に対する８種のモノクローナル抗体の結合を第XI表に示す。
【００６９】
【表１３】

【００７０】
ｐＧＨ（１６７−１９０）変異体は除いて各モノクローナル抗体に対する結合能の破壊は著しくかつ非常に選択的である。図１３〜２０はｈＧＨの３次元構造内の各Ｍabに対するエピトープの位置を示してる。図６はソマトジェニックレセプターに対する結合部位に対するエピトープを示している。
たとえばｈＰＲＬ（８８−９５），ｈＰＲＬ（９７−１０４），ｈＰＬ（１０９−１１２）およびｈＰＲＬ（１１１−１２９）変異体はＭabＩに結合しないが、それらの領域以外の他のセグメント置換ｈＧＨは野生型ｈＧＨと同様の効率で結合した。Ｍab２，３，４，５および６への結合は一次配列の不連続であるが、ホルモン３次元構造においては近接している領域の突然変異により阻害された（図６および図１４〜１９参照）。これと対照的にＭab１，７および８は図１３、図１９および図２０に示したように連続的配列で規定される突然変異により阻害された。さらに所定のモノクローナル抗体への結合を阻害する領域を、特定のセグメント置換ｈＧＨ領域のサブドメインへの細分化または特定のＭabにすでに結合した共通の置換を有する変異体の分析により解析した。たとえばｐＧＨ（１１−３３）はＭab４への強固な結合を維持しているがｈＰＲＬ（１２−３３）は結合能を失っていた。したがって、ｈＰＲＬ（１２−３３）変異体における破壊的突然変異はｐＧＨ（１１−３３）では変異していない残渣：Ｎ１２，Ｌ１５，Ｒ１６、Ｄ２６およびＥ３０に限定し得る。さらにｈＰＲＬ（１２−１９）変異体は結合能を失ったがｈＰＲＬ（２２−２３）は失なわなかったことから（図１６参照）、これはＮ１２、Ｌ１５およびＲ１６に限定される。Ｎ１２Ｈ突然変異がｐＧＨ（１１−３３）とは共通しない変異であることからこれでＭab４への結合の阻害を説明し得る。このことをＡsn−１２のアラニン置換でテストした。Ｎ１２Ａ残基置換ｈＧＨ変異体へのＭab３またはＭab４の結合は１００倍以上も減少したが他のＭabへの結合は影響を受けなかった。
【００７１】
このセットのｈＧＨ変異体を用いることにより、８個のＭabのほとんどの結合が共通セットの突然変異により阻害されたとしてもこれらのＭab全てのエピトープを解明し得る。たとえばｈＰＲＬ（１２−１９）はＭab２，３および４への結合を示さないが、他の変異体はこれらのＭabが種々の構造を認識することを示した。特にＭab２および３はｐＧＨ（１１−３３）により阻害されるがＭab４は影響を受けなかった。Ｍab３および４の結合はｈＰＬ（１２−２５）により阻害されたがＭab２への結合は影響を受けなかった。このように８個の抗体は重複するが完全に重ならないエピトープを有する。結合を乱す突然変異はヘリックスおよびループの両方に存在し、かつ常にホルモン構造において近接している。
合せて考えてみると、８個のＭabセットのエピトープはこのホルモンのほとんどをカバーする。しかしなおＭabが結合しない領域がある。たとえば２０個の変異体のうちの３個はテストしたＭab（ｈＰＲＬ（２２−３３）、ｐＧＨ（４８−５２）およびｈＰＲＬ（１２６−１３６）のいずれに対する結合も有意に乱さなかった。
抗体エピトープとレセプター結合部位には有意な差がある。第１に阻害的突然変異により規定されるバッチはどのＭabに関してよりもレセプターに関するものの方が大きい。第２の差はレセプターがＭabよりもホルモンの阻害的置換に対しより耐性が強い。これはどの変異体のレセプターへの結合に関してもその最大の減少は約７０倍であるがほとんど全ての抗体にはＮ１２Ａなどの単一置換の結果の場合のように１０００倍の結合の減少をひき起こす少なくとも１つの変異体がある。
【００７２】
実施例７
ＭabおよびｓｈＧＨｒの競合的結合
レセプター結合を乱す多くの変異体は１つ以上のＭabの結合も乱す。すれゆえ、ｈＧＨに対するｈＧＨレセプターの結合を阻害する８個のＭabの各々の能力を評価した。この検定の結果を第XII 表に示す。
【００７３】
【表１４】

【００７４】
表から分るようにＭab５および６はｈＧＨレセプターの結合を阻害する上で最も効率がよい。このことはそれらのＭabがレセプターに対する決定基と密接に重複する残基５４−７４までのレープおよびヘリックス４内に存在する抗原決定基を有することによる（図５、図６、図１７および図１８参照）。Ｍab２は次に競合的な抗体であり、かつレセプターと共通する阻害的突然変異を共有する（ｈＰＲＬ（１２−１９））。これに対しＭab３および４はＭab２に比べおおよそ１０００倍競争力が小さいがそれらはまたヘリックス１中にレセプターと重複する阻害的突然変異を共有している。図１５および図１６参照。Ｍab３および４を乱すヘリックス１中の突然変異がＭab２またはレセプターへの結合を乱す残基と異なるならこの見かけ上の差は容易に解決されよう。事実、１つの変異体（Ｎ１２Ａ）はＭab２またはそのレセプターへの結合に影響することなくＭab３または４の結合を乱す。
Ｍab７はｈＧＨに対してそのレセプターと比較的強く競合し、またたとえばｈＰＬ（４６−５２）などレセプター結合をわずかに乱すセグメント置換ｈＧＨ変異体により阻害される。したがってＭab２および７はレセプター結合部位の境界上に存在するように思える。Ｍab１および８はレセプターの検出可能な置換を与えられなかったまた予想されるようにこれらはレセプターと重複する抗原決定基を含んでいない。これらの競合結合データは直接的エピトープマッピングデータおよびレセプター結合データとともに図５に示されるようなレセプター結合部位の一般的位置を強く支持している。
【００７５】
実施例８
レセプター活性アミノ酸残基
実施例５、６および７におけるｈＧＨの分析はレセプター結合に重要なヘリックス１のアミノ末端領域（残基１１−１９）を含んでいる。さらに残基５４−７４および１６７−１９１もレセプター結合に重要であることが分った。レセプター結合に活性なこれらのドメイン中のアミノ酸の同定は全部で６３個の単一アラニン変異体を分析することにより行った。第XIII表、第XIV 表、および第XV表参照。
【００７６】
【表１５】

【００７７】
【表１６】

【００７８】
【表１７】

【００７９】
アミノ末端残基位置の不明確さのためアラニン置換は残基２−１９を含むように行った（アブデル−メギド（Abdel-Meguid), S. S.等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４，６４３４）。実際に結合のもっとも著しい減少はＦ１０Ａ（６倍）でつづいてヘリックス１のＮ末端の残基４−６のアラニン置換で起こった（図２１参照）。結合に関して実質的により大きい効果（２０倍以上）は残基５４〜７４のループおよびカルボキシ末端配列１６７−１９１内の特異的アラニン置換で起った。いくつかのアラニン変異体の結合は4.５倍に増加した。最も劇的な例は多くの破壊的アラニン突然変異の中間に位置するＥ１７４Ａであった。図４、図７および図２１参照。
ほとんどの破壊的アラニン置換はＦ１０からＲ６４およびＤ１７１からＶ１８５に広がる約２５Å角のバッチをホルモン上に形成する（図２１参照）。さらにこれらの側鎖はその分子の同じ方向を向いているようである。たはえばヘリックス４に関する結合に最も影響する全てのアラニン変異体（Ｄ１７１Ａ，Ｋ１７２Ａ，Ｅ１７４Ａ，Ｆ１７６Ａ，１１７９Ａ，Ｃ１８２ＡおよびＲ１８３Ａ）はこのヘリックスの３回半に限られまたそれらの側鎖はこのヘリックスの同じ面から突き出ている（図２１参照）。このモデルに基づいて、Ｔ１７５およびＲ１７８は、図２１で示されているように中央位置を占めていることから結合に関与していることが予想される。
Ｔ１７５Ａ変異体は振とうフラスコ中検定するのに十分な収率で発現されないけれども、より保存的変異体（Ｔ１７５Ｓ）であった。したがってＴ１７５Ｓ変異体はレセプター結合が１６倍減少した。同様に、Ｒ１７８Ａはあまり発現されないにもかかわらずＲ１７８Ｎは分析可能な収量で発現した。Ｒ１７８Ｎは結合アフィニティーが４倍以上減少した。
【００８０】
カルボキシ末端における次に破壊的変異体はＶ１８５Ａであった。Ｖ１８５Ａはヘリックス４の外にあるけれども、このモデルによりヘリックス４内の破壊的突然変異を同じ方向を向いていることが予想される。これに対し結合バッチ外のアラニン突然変異またはその中にあり上述のものと反対を向いているアラニン突然変異（Ｒ１６７Ａ，Ｋ１６８Ａ，Ｖ１８０Ａ、Ｑ１８１Ａ，Ｓ１８４Ａ，Ｅ１８６Ａ，Ｓ１８８Ａ）は一般にレセプター結合に関して影響しないか、またはほとんど影響しない。
ヘリックス１におけるアラニン変異体は並みの効果しかもたないがこれにも同様の分析を行った。このヘリックス内でもっとも結合を破壊するアラニン置換はこのヘリックスの同じ面に存在する残基６，１０および１４のものであった。もっとも小さい破壊的アラニン突然変異（Ｌ９Ａ，Ｎ１２ＡおよびＬ１５Ａ）ヘリックス１の反対の面に存在する。さらにこのことはｈＧＨに対する結合をレセプターと競合しない抗ｈＧＨ Ｍab３および４の両方がＡsn−１２に結合するという事実により確認される。第XVI 表参照。
【００８１】
【表１８】

【００８２】
５４−７４ループ内の側鎖の相対的位置はそれらがヘリックス１および４内の側鎖のように固定しえない。しかし偶数残基の突然変異は奇数残基に比べ結合を大きく阻害するという結合において著しい周期性がある。特にこのことはこの領域の最初の部分によくてはまり（５４−５９）かつ偶数残基はレセプターの方に突き出ておりかつ奇数残基は反対を向いているという構造を反映している。
【００８３】
実施例９
アラニン置換ｈＧＨ変異体の構造完全性および結合エネルギー
いくつかの証拠はレセプター結合を乱すアラニン置換は分子の構造をゆがめることによりそれを起こすのではないことを示している。第１に８種のＭabはｈＧＨに関して同様レセプターへの結合の破壊を起こすほとんどすべてのアラニン変異体と反応する。先の第XII 表参照。
例外は各々個ｈＧＨ Ｍab６および５への結合を瀬洗濯的に破壊するＲ６４ＡおよびＣ１８２Ａである。これら２つのＭabは以前にｈＧＨへの結合に関しソマトジェニックレセプターと競合することが示された。さらにレセプター結合に影響しない２つのアラニン変異体を作った。１つは２つのＭabの結合に影響し（Ｎ１２Ａ）、もう１つはＭabのいずれにも影響しない（Ｋ１６８Ａ）。このデータはＭabもしくはレセプターへの結合が変異体構造の非常に局所的ゆらぎにより破壊されることを示している。さらに全てのｈＧＨ変異体の遠紫外円二色スペクトルは野生型ｈＧＨと実質的に同じであった。
振とうフラスコ中、アラニン変異体の約２０％（Ｄ１１Ａ、Ｔ６０Ａ，Ｐ６１Ａ，Ｔ６７Ａ，Ｎ７２Ａ，Ｅ７４Ａ，Ｄ１６９Ａ，Ｍ１７０Ａ，Ｖ１７３Ａ，Ｔ１７５Ａ，Ｌ１７７Ａ，Ｋ１７８Ａ，Ｃ１８９Ａ，Ｇ１９０Ａ）は単離および分離するのに十分なレベルで分泌されなかった。このような変異体をコードする遺伝子は同じベクターで発現され、かつその発現は特定のアラニンコドンとは独立しているので定常的発現レベルの変化は、おそらく分泌レベルの差および、またはｈＧＨ変異体のたん白質分解を反映したものである。ヘリックス４における非発現性アラニン変異体のいくつかはヘリックスの疎水性側面を白で示した図２１に示されている疎水性面上に存在する（Ｍ１７０Ａ，Ｖ１７３ＡおよびＬ１７７Ａ）。しかしいくつかのアラニン置換がヘリックス１（Ｌ６Ａ，Ｌ９Ａおよびけ１０Ａ）およびヘリックス４（Ｆ１７６ＡおよびＶ１８０Ａ）の疎水性面内で容認されていることからこのことは一般的な効果ではない。
【００８４】
さらにｈＧＨ変異体の発現の減少は荷電または中性アミノ酸がアラニンと置換したときにしばしば観察される（Ｄ１１Ａ，Ｔ６０Ａ，Ｔ６７Ａ，Ｎ７２Ａ，Ｆ７４Ａ，Ｄ１６９Ａ，Ｔ１７５Ａ，Ｒ１７８Ａ）。水素結合基をその部位に保存するＴ１７５ＳおよびＲ１７８Ｎのような突然変異はたとえあったとしても野生型よりも低いレベルで発現される。非発現性のＣ１８９Ａ変異体はカルボキシ末端スルフィドを破壊し、かつその相対物（Ｃ１８２Ａ）も野生型よりもはるかに低いレベルで発現する。他のいくつかの非発現性アラニン変異体（Ｔ６０Ａ，Ｔ６１ＡおよびＴ６７Ａ）はループ構造内に存在する。したがって低レベル発現または非発現は多くの構造効果に由来するが単一構造的または単一機能的置換によって回避し得る。
結合に１０倍以上の効果を示す置換（１５８Ａ，Ｒ６４Ａ，Ｋ１７２Ａ，Ｔ１７５Ｓ，Ｆ１７６Ｓ，Ｆ１７６Ａ）は直接結合に関与しているようである。天然に存在する（ファーシュト（Fersht), A. R.（１９７２）J. Mol. Biol. ６４，４９７；ブラウン（Brown), L. R. 等（１９７８）Eur. J. Biochem. ８８、８７；マリバー（Malivor), R.等（１９７３） J. Mol. Biol. ７６、１２３）または部位指定突然変異誘発で作り上げられた（ファーシュト（Fersht), A. R.等（１９８５）Nature ３１４、２２５；ブライアン（Bryan), P.等（１９８６）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８３、３７４３；ウェルズ（Wells), J. A. 等（１９８７）Proc. Nstl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４、１２１９；クロニン（Cronin), O. N.等（１９８７）J. Am. Chem. Soc. １０９、２２２２；グラフ（Graf), L. 等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８５、４９６１）水素結合または塩橋の強さは微環境に依存して１〜５Ｋcal/mol の範囲に広く分布している。ｈＧＨに関する結合自由エネルギーの減少はＥ５６，Ｑ６８，Ｄ１７１，Ｋ１７２およびＲ６４の各アラニン置換に対し0.８、1.０、1.２、1.６および1.８Ｋcal ／mol （△△Ｇ結合＝＋Ｒ_T lnＫd （変異体）／Ｋd (wt)であった。疎水性側鎖のたん白質中への埋没のエネルギーはエダノール中への転移の自由エネルギーに対応する傾向がある（エステル（Estoll), D. A.等（１９８６）Science ２３３、６５９；キザキ（Nozaki), Y. 等（１９８０）“疎水性効果”（ウィリー版、Ｎ．Ｙ．４〜２１頁）。
したがってＦ１７５Ａ，Ｆ１０Ａ，Ｐ５４Ａ，１５８ＡおよびＶ１８５Ａの結合自由エネルギーの減少は各々1.６、1.０、0.９、1.７および0.９Ｋcal ／mol であった。これらの値はＰhe , I le またはＶalからＡlaへの置換における疎水性自由エネルギーの予想値、各々2.０、2.４および1.０Ｋcal ／mol よりもわずかに小さい。この分析により、Ｔ１７５Ｓ変異体の効果（△△Ｇ結合＝1.６Ｋcal ／mol ）はガンマメチル基の損失に期待される効果（△△Ｇ疎水性＝0.７Ｋcal ／mol ）よりも大きい。ｈＧＨとそのソマトジェニックレセプターとの分子接触の性質を十分把握するために直接的構造の情報が必要である。しかし、これらアラニン変異体の結合エネルギーはそれらが全く別のシステムにおける接触残基について行った以前の測定の範囲内にあることを示している。事実、レセプター結合に最も破壊的であるＣ１８２Ａを除いたアラニン置換変異体の結合自由エネルギーの総和は（−１3.２Ｋcal ／mol ）、ｈＧＨとそのレセプター間の総結合自由エネルギーと一致している（−１３Ｋcal ／mol ）。
【００８５】
実施例１０
ｈＧＨ変異体の抗ｈＧＨポリクローナルとの反応性
ｈＧＨ変異ｈＰＲＬ（２２−２３）、Ｅ１７４ＡおよびｈＰＲＬ（８８−９５）をラットの体重検定でテストした。この検定の結果を図２２に示す。これから分るようにｈＰＲＬ（２２−３３）以外の変異体は生育的１４日後減少能を有している。成長のレベルダウンは生物学的効果を中和する種々の成長ホルモンに対する抗体の発現に寄因する。ｈＰＲＬ（２２−３３）変異体が成長しつづけたという事実はそれが野生型ｈＧＨまたは使用した他の変異体と同じ免疫原性をもたないことを示している。
ｈＧＨに対する種々のｈＧＨ変異体の反応性をポリクローナル抗体を含むヒトおよびマウスの血清と比較した結果を第XVII表に示す。
【００８６】
【表１９】

【００８７】
表から分るように残基２２〜３３の領域内に置換を含む変異体は野生型ｈＧＨに対し各ヒトおよびマウス抗血清との結合活性が実質的に減少しているか、またはある場合には活性をもたない。
変異体ｐＧＨ５７−７３を除いて、他の領域の置換を含む変異体は有意な反応性の減少を示さない。残基１１および３３の間のセグメント置換変異体はソマトジェニックレセプターへの結合能を維持しているので、このような変異体はソマトジェネシスの推進能は維持しているが他の性質、この場合抗ｈＧＨポリクローナル抗体への反応性を変化させた変異体の生成を示している。
【００８８】
実施例１１
Ｋd と能力の関係
特定のｈＧＨ変異体のＫd （変異体）／Ｋd （野生型）の比とラット体重検定におけるこれら変異体の能力のセミログプロットを図２３に示す。これから分るように線型関係の存在はソマトジェニックレセプターへの結合アフィニティーの減少は能力の減少を示している。
図から分るように、ｈＧＨ変異体Ｅ１７４Ａはソマトジェニックレセプターに関し野生型ｈＧＨよりも高い結合アフィニティーを有している。また、この能力は野生型ｈＧＨよりも約１２％大きい。
さらに変異体ＰＲＬ（９４−１０４）は基本的に野生型と同じ結合定数を有しているが能力は約2.７倍大きい。
【００８９】
実施例１２
プロラクチンレセプター結合に関するｈＧＨの活性ドメイン
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は模型成長、泌乳、窒素遅延、糖尿病誘発性およびインシュリン様効果およびマクロファージ活性化など多くの生理効果を示す。R. K. チョウラ（Chawla), J. S.パークス（Parks)および D. ラドマン（Rudman), Annu. Rev. Med. ３４、５１９−５４７（１９８３）； O. G. P. イサクソン（Isaksson),等（１９８５），Annu. Rev. Physiol. ４７、４８３−４９９； C. K.エドワーズ（Edwards)等（１９８８） Science ２３９、７６９−７７１。これらの効果は各々ｈＧＨと特異的細胞レセプターとの相互作用で始まる。J. P. ハイス（Hughe) 等（１９８５）Annu. Rev. Physiol. ４７、４６９−４８２。これまでのｈＧＨと結合する生成物を作るクローン化遺伝子の肝臓のｈＧＨレセプター（A. W. レング（Leung), 等（１９８７）Nature（ロンドン）３３０、５３７−５４３）および乳線のヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）レセプター（J. M. ブーチン（Boutin) 等、（１９８８）Cell ５３、６９−７７）のみであった。ｈＰＲＬレセプターへのｈＧＨのレセプター“スピルオーバー”は高レベルのｈＧＨを生産する先端巨大症が、通常レベルのｈＰＲＬを有するにもかかわらず過プロラクチン症となる場合の臨床的徴候である（ J. E. フラドキン（Fradkin)等（１９８９）New Engl. J. Mcd. ３２０、６４０−６４４）。しかしｈＧＨと結合する他のレセプターが存在し、これらには胎盤ラクトゲン（ＰＬ）レセプター（ M. フリーマーク（Freemark) 等（１９８７）Endocrinology) １２０、１８６５−１８７２）。これらのレセプターに関するｈＧＨ上の結合部位が同一のものであるかどうか、またはどのレセプター（レセプター群）が薬学効果を担っているかは分っていなかった。これらの問題を解くためにｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプター結合部位の位置決めがなされた。得られた結果はこれらのレセプター結合部位は重複しているが、同一のものではないことを示している。このことはｈＧＨのレセプター特異的変異体の合理的設計を可能にする。
【００９０】
ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターには３２％の配列ホモロジーをもつ細胞外ホモロジー結合ドメイン、単一のトランスメンブレンドメインおよび配列の長さも様々である細胞質内ドメインがある。ｈＧＨレセプターの細胞外結合ドメインは大腸菌中で発現され、かつ可溶性血清結合たん白質など天然に見られるものと同一の結合性を有する（ S. A. スペンサー（Spencer)等（１９８８) J. Biol. Chem.２６３、７８６２−７８６７）。同様にｈＰＲＬレセプターの細胞外ドメインは大腸菌内で発現されかつ精製された。ｈＰＲＬレセプターフラグメントは残基 Ｇln１からＴhr 2 1 1にわたり、単一のトランスメンブレンドメインの直前で終っている。それは完全な長さのレセプターと実質的に同じ高い結合アフィニティーおよび特異性を有している。この実験で用いているｈＰＲＬレセプターをコードする遺伝子はカナダ モントリオール マクギル大学、ケリー(Kelly), P. A.博士により提供された。このＤＮＡ配列はヒト乳線ｃＤＮＡライブラリーから入手し、プロラクチンレセプター群の交叉種メンバーのうち既知の保存領をカバーするプローブで同定された。たとえばダビエス（Davies) J. A. 等（１９８９）Mol. Endrocrinology ３、６７４−６８０；エデリー（Edery)等（１９８９） Proc. Natl. Acad. Scl. ＵＳＡ ８６、２１１２−２１１６；ジオリコアー（Jolicoeur)等（１９８９）Mol. Endrocrinology ３、８９５−９００参照。これらの短縮型で高純度のレセプターはｈＧＨ変異体の結合アフィニティーの迅速かつ正確な検定に非常に有用な試薬である。
【００９１】
ｈＰＲＬおよびｈＧＨレセプター結合部位の関係
ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターのエピトープが重複しているかどうかを測定するため我々はｈＰＲＬレセプターフラグメントがｈＧＨ由来のｈＧＨレセプターフラグメントと置換し得るかどうか分析した（データ示さず）、事実、ｈＰＲＬレセプターフラグメントはｈＧＨレセプター結合部位に関し見かけ上のＫd 値１ nＭで競合する。これはｈＧＨに対するｈＰＲＬレセプターの直接的結合で測定されたアフィニティーと実質的に同じである（結果示さず）。
第III 表のセグメント置換ｈＧＨ変異体のうちの７つを用いｈＰＲＬレセプターに関するｈＧＨ上のエピトープの位置を決定した。この実験にはｈＧＨ△３２−４６変異体を用いた。方法はｈＧＨｓの代りにｈＰＲＬｒをレセプターとして用いたこと以外に述べたｈＧＨレセプターに対するｈＧＨ上のエピトープの決定に用いた方法、すなわちｈＧＨ変異体の結合への影響により行った。上述の１２個のセグメント置換ｈＧＨ変異体の結果を第XVIII 表に示す。
【００９２】
【表２０】
第 XVIII 表
ｈＰＲＬレセプター（ｈＰＲＬｒ）の細胞外ドメインに対するホモログースキャンニング突然変異誘発により調製したｈＧＨ変異体の結合、変異体は種々のｈＧＨ類似体：ｐＧＨ、ｈＲＬ、またはｈＲＬから置換したセグメントに従って命名した。導入された突然変異の正確な記述はコンマで区切られた一連の単一変異体で与えられる。各単一変異体は野生型残基の１文字コードとそれにつづく成熟ｈＧＨ中のそのコドンの位置および変異体残基で示される。ｈＧＨの変異体を先に述べた方法で生産し、精製下。ｈＰＲＬｒへの結合は基本的にｈＧＨｒについて述べた方法で測定した（スペンサー（Spencer), S. A. 等（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３、７８６２−７８６７）。もっともこの方法ではｈＰＲＬｒに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を用いキャリヤーたん白質としてギブコ製ＢＳＡ（粗）を使ってｈＰＲＬｒ複合体を沈殿させた。一般にＫ_D 値の標準偏差は報告されている値の２０以下であった。ｈＧＨｒに対する結合アフィニティーの相対的減少（Ｋ_D （変異体）／Ｋ_D （ｈＧＨ））は第III 表から得られたものである。レセプター選択性の変化はｈＧＨｒに対する結合アフィニティーをｈＰＲＬｒと比較した相対的減少比で計算した。ＷＴ−野生型。

【００９３】
表から分るようにｐＧＨ（１１−３３）およびｐＧＨ（５７−７３）はｈＰＲＬレセプター結合アフィニティーに大きな影響を及ぼす一方ｐＧＨ（４８−５２）は影響をもたない。ｈＧＨレセプターとは異なりｈＰＲＬレセプターはｈＰＲＬおよびｈＰＬとは結合するがｐＧＨとは結合しない。予想されるように、結合競合ホルモンｈＰＬまたはｈＰＬ由来の実質的に全ての置換は結合に影響しなえった。唯一の例外はｈＰＬレセプターへの結合アフィニティーが７０倍以上減少するｈＰＲＬ（２２−３３）である。このようにｈＰＲＬレセプターはｈＧＨ中ヘリックス１の中央領域および残基５７および７３の間のループ付近の突然変異に非常に敏感である。
またホモログースキャンデータによりｈＰＲＬおよびｈＧＨレセプターエピトープはいくつかのセグメント置換変異体がレセプター結合選択性に大きな変化を与えることから同一ではないことが示された（第XVIII 表）。たとえばｐＧＨ（１１−３３）またはｈＰＲＬ（２２−３３）により引き起こされる結合への影響はｈＧＨレセプターに対してよりもｈＰＲＬレセプターに対しての方が約１００倍大きい。一方、ｈＰＬ（５６−６４）およびｈＰＲＬ（５４−７４）はｈＰＲＬレセプターに関してほとんど影響しない一方それらは各々１７倍および６９倍ｈＧＨレセプターへの結合が弱くなった。さらにこれらの選択的結合効果（先に議論したモノクローナル抗体の結合とともに）はレセプター結合アフィニティーの減少はｈＧＨの変異体における局所的であり、全体的構造変化によらないことを実証している。
【００９４】
ｈＰＲＬレセプターへの結合を強く調節するｈＧＨ中の特定の側鎖をアラニンスキャンニング突然変異誘発および相同的置換により同定した。第XIX 表に示したｈＧＨ変異体を調製した。ｈＰＲＬ置換、Ｆ２５ＳおよびＤ２６Ｅはヘリックス１における結合アフィニティーの最も大きい減少を引き起こした（各々２１および４５倍）。これらの残基はヘリックス１の親水性面から突き出ており、かつ結合に緩やかな効果を与えるヘリックス１中の他の突然変異（主にＨ１８ＡおよびＦ１０Ａ）と同じ側に存在する。
ｈＧＨレセプターの結合に影響することが知られているループ領域（５４〜６８）中の４個の残基ならびに近接しているがｈＧＨレセプター結合に影響しないこの領域に先行する２つの残基（Ｑ４９ＡおよびＴ５０Ａ）をテストした。最も破壊的な変異体は１５８ＡおよびＲ６４Ａであり、これらは各々結合アフィニティーが３２倍および６倍減少している。他の４個の突然変異の影響は無視できる。
ヘリックス１およびループ領域（５８−６４）がｈＰＲＬレセプターに対する強力な結合決定基を含むという事実はヘリックス４と関係する。というのはこのヘリックスはこれら２つの構造の間に押し込まれているためである（図２５Ｂ）。事実、Ｃ１６５〜Ｖ１８５に結合するジスルフィド間のヘリックス４領域のアラニンスキャンニングは強力な結合決定基を明らかにした（第XIX 表）。最も破壊的突然変異はほとんど４個のヘリックスターン、Ｒ１６７〜Ｒ１７８に分布しており、かつ同じ親水性面に存在する。
【００９５】
【表２１】
第 XIX 表
ｈＰＲＬまたはｈＧＨレセプターフラグメント（ｈＰＲＬｒまたはｈＧＨｒ）に対するｈＧＨの単一変異体の結合。部位指定突然変異誘発で作ったＱ２２Ｎ，Ｆ２５Ｓ，Ｄ２６Ｅ，Ｑ２９ＳおよびＥ３３Ｋ以外のｈＧＨの変異体は先に述べたように調製及び精製した（カニンガム（Cunningham), B. C. およびウェルズ（Wells), J. A. （１９８９）Science ２４４、１３３０−１３３５； ゾラー（Zoller), M. J. およびスミス（Smith), M. (１９８２）Nucleic Acids Res.１０、６４８７−６４９９）。レセプター結合アッセイおよび変異体の名称を第XVIII に示す。ｈＧＨｒに対する結合アフィニティーの減少のデータは第III 表からとった。ＮＤは測定しなかったことを示す。

【００９６】
機能地勢図はｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターの位置に基づいて導びいた（図２８）。ｈＰＲＬレセプターに対する最高のエピトープ部分は、（図２５Ｂ）。結合アフィニティーの２倍以上の減少を示す突然変異が割り振られる。この基準によりｈＰＲＬレセプターのエピトープは基本的にＦ１０〜Ｑ２９のヘリックス１の前面、Ｆ５４〜Ｑ６８のループおよびＲ１６７からＲ１７８のヘリックス４の親水性面に限定される。一方、ｈＧＨレセプターエピトープ（図２５Ａ）はアミノ末端領域から１４〜Ｍ１４のヘリックスの前面、Ｆ５４からＳ７１のヘリックス１の前面およびＤ１７１からＶ１８５のヘリックス４の親水性面の残基を含む。さらに変異分析がｈＰＲＬエピトープに残存するギャップを満たすのに必要であるがこのエピトープがｈＧＨレセプターのエピトープと重複するが同一のものではないことは明らかである。これらのデータはｈＧＨを認識する結合決定基の全てがｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターに関しその細胞外結合ドメインと３２％のホモロジーを持つにもかかわらず同一のものではていことを示している。
レセプター結合アフィニティーに大きな変化を起こす残基は間接的な構造効果によってそれを行っている。しかしこれら破壊的効果のほとんどがテストした全ての単一変異体が８個のｈＧＨモノクローナル抗体群に対し完全な結合アフィニティーを維持しており、かつしばしばレセプター選択性の変化に導くがレセプターアフィニティーに均一な影響を与えないことから局所的な効果によるものと考えられている（第XIX 表および以下参照）。
【００９７】
ｈＧＨのレセプター特異的変異体の設計
多くの単一ｈＧＨ変異体はレセプター結合選択性に多くの変化を起こす（第XIX 表）。最も顕著なのはｈＧＨレセプターに対するアフィニティーの４倍増加を導くがｈＰＲＬレセプターの結合は２０倍以上減少するＥ１７４Ａである。このことはレセプター選択性の１２０倍の変化を示している。別の突然変異は（主にＲ１７８ＮおよびＩ１７９Ｍ）はｈＧＨを選択的にｈＰＲＬレセプターに結合させる。一般的にレセプター特異性を最も変化させる変異体は２つのレセプターエピトープの非重複領域に存在する。
レセプター結合の自由エネルギー変化が加算的であるならわずかな突然変異をもつｈＧＨの非常に特異的な変異体を設計することができると考えられる。事実２つの最もｈＧＨレセプター選択的な単一変異体（Ｋ１６８ＡおよびＥ１７４Ａ）を合せると、その二重変異体はｈＧＨレセプターへの結合に関し２３００倍の選択性を示す（第XX表）。先に指摘したようにｈＰＬ（５６−６４）の結合選択性はわずか２０の突然変異Ｅ５６ＤおよびＲ６４Ｍを含むｈＰＬ（５６−６４）によりほぼ２０倍増加し得る（第ＸIII 表）。これらのｈＧＨ変異体（Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４ＡまたはＥ５６Ｄ、Ｒ６４Ｍ）は実質的に好ましいレセプター、各々ｈＧＨまたはｈＰＲＬに対する選択性を減少していない。また同時に両レセプターの結合を減らすこともできる。
【００９８】
【表２２】
第 XX 表
ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプター（ｈＧＨｒおよびｈＰＲＬｒ）を識別するよう設計されたｈＧＨき二重変異体の結合、ｈＧＨ変異体の部位指定突然変異誘発により調製し、精製し、かつ第XIII表に述べた方法でｈＧＨｒまたはｈＰＲＬｒへの結合を検定した。Ｋ_D 測定値の標準偏差は報告されている値の±１００％であった１０Ｍ以上の値以外報告されている値の２０％以下であった。

【００９９】
たとえば個々にｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターへの結合アフィニティーを大きく減少させるＫ１７２ＡおよびＦ１７６Ａを合せると各々５５０および１５０００倍のアフィニティーの破壊を生む。
全ての場合において結合自由エネルギー変化（△△Ｇ結合）は驚くべきほどに加算的である（第XXI 表）。突然変異の加算的効果は酵素−基質相互作用にもみられ（P. J. カーター（Carter) 等（１９８４）Cell ３８、８３５−８４０；J.A.ウェルズ（Wells)等、（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４、５１６７−５１７１）、プロテアーゼ−プロテアーゼインヒビター相互作用（M.ラスコウスキー（Laskowaki)等、“プロテアーゼインヒビター：医学および生化学的特徴”（１９８３）、 N．カツヌマ（Katunuma) 編、ジャパンサイエイスサイアティー版、東京、５５〜６８）およびたん白質の安定性（D.ショートル（Shortlo)等、（１９８６）Protein,１、８１−８９（１９８６）： M. M.メクト(Mecht)、 J. M.スターテバント（Sturtevant) および R. T.ソーアー（Sawer) Protein １、４３−４６）にもみられ、またこれらの参考文献で公表されているように変異残基が独立に機能しかつ互いに接しているときは一般に身うけられる。このことは多くのｈＧＨ変異体中で対を作っている残基は独立に機能していることを示している。このような加算性は望ましいレセプター結合アフィニティーおよび特異性をもつｈＧＨ変異体を作る上で非常に予想可能な状況を作り出している。
【０１００】
【表２３】
第 XXI 表
ｈＧＨまたはｈＰＲＬレセプター（ｈＧＨｒまたはｈＰＲＬｒ）への結合に関するｈＧＨ中の変異の加算効果。野生型ｈＧＨに対する変異体の結合自由エネルギー変化（△△Ｇ結合）は
△△Ｇ結合＝ＲＴ ｌｎ〔ＣＫ_D ( 変異体）／Ｋ_D （ｈＧＨ）〕
に従い結合アフィニティーの減少から計算した。単一または多重変異ホルモンのＫ_D （変異体）／Ｋ_D （ｈＧＨ）値は第XIII表−第XX表から得た。

【０１０１】
ｈＧＨと同様にアドレナリンレセプター（R. J. レフコウィッツ（Lefkowitz)および M. G.キャロン（Caron)（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３、４９９３−４９９６）、ＩＣＦ−１レセプター（ M. A.カサイエリ（Cascieri) 等、（１９８９）J. Biol. Chem. ２６４、２１９９−２２０２）、ＩＬ−２レセプター（R. J. ロブ（Robb) 等（１９８４）J. Exp. Med. １６０、１１２６−１１４６； R. J. ロブ（Robb) 等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８５、５６５４−５６５８）およびＡＮＰレセプター（ D. ロー（Lowe) およびD.ゴーデル（Goeddel)、非公開）など２つ以上のレセプターまたはレセプターサブタイプが存在する多くの例がある。これらの場合、特定のレセプター機能を特定の薬学的効果と結びつけるのは難しい。しかしレセプター特異的ホルモン類似体の使用でこの仕事を非常に簡便化できる。たとえばカテコールアミン類似体はβ−アドレナリンレセプターサブタイプの特性を明らかにし、かつレセプター機能を生理的応答に結びつけるのに使われる（ R. J. レフコウィッツ（Lefkowitz)等、（１９８３）Annu. Rev. Biochem. ５２、１５９−１８６）同様に、ｈＧＨのレセプター特異的変異体はｈＧＨの他のレセプターの同定やｈＧＨの複合体薬理学におけるｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターの働きを探る上での重要な道具を提供する。この研究はレセプター特異的変異体の合理的設計を可能にするホルモンにおけるレセプター結合部位を同定するための系統的方法を示している。
【０１０２】
実施例１３
ヒト成長ホルモンに結合するヒトプロラクチンの作製
プロラクチン（ＰＲＬ）は成長ホルモン（ＧＨ）、胎盤ラクトゲン（ＰＬ）およびプロリフェリンを含む相同ホルモン群の１員である。ニコル（Nicoll), C. S.等（１９８６）Endocrlnol. Rev. ７、１６９−２０３。集合的にこのグループのホルモンは成長、分化、電解質バランスなどに関する巾広い生理効果を調節する。チョウラ（Chawla), R. K.等（１９８３）Ann. Rev. Med.３４、５１９−５４７；イサクソン（Isaksson) O. G. P.等（１９８５）Ann. Rev. Physiol.４７、４８３−４９９。これらの薬理学的効果は特定の細胞レセプターへの結合で始まる。たとえばｈＰＲＬはラクトジェニックレセプターには結合するがソマトジェニックレセプターには結合せず、また泌乳に活性化するが骨成長は活性化しない。ｈＧＨはラクトジェニックレセプターおよびソマトジェニックレセプターの両方と結合し、かつ泌乳および骨成長の両方を活性化する。レセプター結合特異性の差の分子的基礎はまだ理解てされていない。
ｈＰＲＬのクローニングと発現
ｈＰＲＬのｃＤＮＡをλgt１０中のヒトの脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーから（ハイン（Huynh), T. V. 等（１９８５）“ＤＮＡクローニング技術−方法”１巻、D. M. グローバー（Glover) 編（オックスフォードＩＲＬプレス）、４９−７８）公表されたＤＮＡ配列の５′および３′末端に対応するオリゴヌクレオチドを用いた（コーク（cooke)、N. E. 等（１９８１）J. Biol. Chem.２５６、４００７−４０１６）ハイブリダイゼーションにより（マニアチス（Maniatis),T. 等編（１９８２）“モレキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ））クローニングした。ほぼ全長のｃＤＮＡクローンが同定され、またコドン２２から停止コドンの下流５５bpまでの７２０bpＢst II −Ｈind III フラグメントをｐＪＣ１１８にサブクローン化した。この配列をダイデオキシ法（サンガー（Sanger), F. 等（１９７７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７）により決定したところ以前に報告されていたものと全く一致した（コーク（Cookた), K. E. 等（１９８１）J. Biol. Chem. ２５６、４００７−４０１６）。
【０１０３】
標準法により細胞内発現ベクターｐＢＯ７６０（図２６）を作った（マニアチス（Maniatis), T. 等編（１９８２）モレキュラークローニングラボラトリーマニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）。ｈＰＲＬ遺伝子の転写にｐＨＧＨ２０７−１由来の大腸菌 trpプロモーターを用いた（デボア（deboer), H. A.等（１９８２）“プロモーターの構造と機能”ロドリゲス（Rodriguez), R. L. およびチャンベリ（Chamberlin), M. J.編（プラガー版、ニューヨーク）、４６２−４８１）。ｈＰＲＬコード配列は４７bp ＸbaＩ−ＢstＥ II 合成ＤＮＡカセットおよびｈＰＲＬ ｃＤＮＡ由来の７２０bp ＢstＥ II −Ｈind III フラグメントを含んでいる。合成ＤＮＡカセットは

という配列であり、開始コドンはアステリスクで示してある。ファージｆｌオリジン、ｐＢＲ複製オリジンおよびｐＢＲ３２２β−ラクタマーゼ遺伝子はｐＢＯ４７５に由来する（カニンガム（Cunningham), B. C.等（１９８９）Science２４３、１３３０−１３３５）。
ｐＢＯ７６０を含む大腸菌（ＭＭ２９４）を１５μｇ／mlカルベニシリン添加Ｍ９ハイケース培地１００mlを含む0.５Ｌ振とうフラスコ中３７°Ｃで４時間増殖させた（初期対数期；Ａ₅₅₀ ＝0.1 〜0.3 ）（ミラー（Miller), J. H.( １９７２）“分子遺伝学実験”（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）。インドルアクリル酸を添加し（最終５０μｇ／ml）tep プロモーターを誘導した。細胞をさらに６〜８ｈ増殖した後遠心で収穫した。細胞分画実験はｈＰＲＬはほとんど排他的に包含粒子中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してみると全細胞たん白質中の２〜５％にあたることを示した（データ示さず）。
【０１０４】
ｈＰＲＬの精製および再生。ｈＰＲＬを含む包含粒子を基本的に報告されている方法で単離した（ウィンクラー（Winkler), M. E. 等（１９８６）Biochemistry ２５、４０４１−４０４５）。簡単に云うと、湿細胞ペレット５０ｇを0.２５リットルの１０mMトリス（pH 8.0）、１mM ＥＤＴＡ（ＴＥパッファ）に懸濁し、激しい超音波処理で細胞を分解した。不溶性の物質で遠心（10,000×ｇ 15分間）で集め２５mlのＴＥバッファに懸濁した。このサスペンションを５０％グリセリン0.２リットルのクッション上に重層し、９０００×ｇ２５分間の遠心によりｈＰＲＬ包含粒子をペレット化した。この包含粒子由来のｈＰＲＬ（純度約２０％）を５mlのＴＥバッファに懸濁した。
ＴＥバッファ中0.３ｇの還元グルタチオン（シグマ）を含む８ＮＧn ＨＣl 溶液１５６mlに包含粒子を溶かすことによりｐＰＲＬを再生した。室温で３０分間緩やかに攪拌した後この混合物を０°Ｃに冷やし、0.６ｇの酸化グルタチオンを含む冷ＴＥバッファ８４４mlで希釈した。この溶液を４°Ｃで一晩ゆっくりと攪拌した後、２４時間に３回外液を変える４リットルのＴＥバッファを用いた透析を行った。不溶性物質を遠心で除去した（10,000×ｇ ２０分間）。
さらに再生し可溶化したｈＰＲＬを４５％飽和の（NH₄)₂SO₄の添加および室温2.５時間の攪拌による沈殿化で精製した。この沈殿を遠心（１2,０００×ｇ 3０分間）で集め５mlのＴＥバッファに溶解した。室温３０分後この溶液を清澄化した後（１0,０００×ｇ １０分間）、ミリポアフィルターで濾過した（0.45μm)。この溶液を４°Ｃで一晩0.５リットルのＴＥバッファに対して透析した。最後にこのｈＰＲＬ（純度８５％）を基本的にｈＧＨの精製について述べた方法と同じＤＥＡＥ高速マトリックスを用いたＦＰＬＣにより均一となるまで（＞９５％）精製した（カニンガム（Cunningham) 、B. C. 等（１９８９）Science 、２４３、１３３０−１３３５）。
【０１０５】
ｈＧＨおよびｈＰＲＬ変異体の突然変異誘発および結合性部位指定突然変異誘発（ゾラー（Zoller)、 M. J.等（１９８２）Nucleic Acids Res., １０、６４８７−６５００）は大腸菌のメチル化修復欠損株ＭutＬを用いて行った（クレーマー（Kramer)、 B. 等（１９８４）Cell ３８、８７９−８８７）。変異体クローンの濃縮化は、インビボ生成ヘテロ二本鎖のトランスホーメーション後に得られた最初のプラスミドＤＮＡプールに制限精製または制限選択を応用し得るように各々単独制限部位を導入または除外する変異原オリゴヌクレオチドを設計することにより行った（ウェルス（Wells), J. A. 等（１９８６）Phil. Trans. R.Soc. Lond. A ３１７、４１５−４２３）。全てのオリゴヌクレオチドはもっとも上流のミスマッチの５′側に正確にマッチする１２bpおよびもっとも下流のミスマッチの３′側に正確にマッチする１０bpを有するよう設計する。ｈＧＨの突然変異誘発の場合、先に述べたｈＧＨ合成遺伝子は多くの制限部位を含んでおり、これをプラスミドｐＢＯ４７５にクローン化した。ｈＧＨの変異体は大腸菌の細胞周辺腔に分泌され（チャン（Chang), C. N. 等（１９８７）Gene ５５、１８９−１９６）先に述べたように精製した。
各類似体のＫd 値は本明細書およびスペンサー（Spencer), S. A. 等（１９８８）、J. Biol. Chem.２６３、７８６２−７８６７に述べられている精製組換えｈＧＨ結合たん白質に結合した(¹²⁵Ｉ）ｈＧＨの競合的置換により測定した。先に述べたｈＧＨ結合たん白質（クローン化ヒト肝臓レセプターの残基１〜２３８を含む）をフー（Fuh)、G.等（１９８９）、提出）により述べられている方法により大腸菌から分泌させ精製した。置換曲線を３回作成し、またＫd 値の標準偏差は一般に報告値の２０％以下であり、Ｋd 値が１０μＭ以上となる場合を除いて報告値の５０％を越えることはなかった。
ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ変異体の濃度は吸光係数＋Ｓ（0.１％、２８０）＝0.９（ウェトローファー（Wetlaufer)、 D. B. （１９６２）Adv. in Prot. Chem. １７、３０３−３９０）を用いたＡ₂₃₀ で測定した。これは変異体が芳香族残基における突然変異を含む場合はそれに応じて調整した。吸光度により測定した濃度値はＳＤＳ−ＰＡＧＥとｈＧＨのコマージブルーによる染色を用いたレーザーデンシトメトリーによって測定した値と１０％以内の誤差で一致していた。円二色スペクトルはアビブキャリー６０スペクトロポーラリメーターを用いて測定した。
ｈＰＲＬ中の残基がｈＧＨレセプターへの結合にもっとも破壊的であるかを探るため（図２７）、まず多くのｈＰＲＬ残基をｈＧＨ中に導入した（第XXII表）。
【０１０６】
【表２４】

【０１０７】
ｈＧＨ中部位５８、６４、１７６および１７８の単一アラニン置換はレセプター結合を著しく破壊するが、これらの部位におけるｈＰＲＬ残基の置換はほとんど影響しなかった。ｈＰＲＬ置換の最も大きい効果は部位１７６および１７８を含むヘリックス４残基中に存在した。これらのデータはｈＰＲＬのヘリックス４領域における残基がｈＧＨレセプターへの結合の欠除を最もよく説明し得ることを示している。
組換えｈＰＲＬは天然様の構造および機能性を維持していた。まず近および遠紫外線ＣＤスペクトル（図２８）は天然のｈＰＲＬのスペクトルと同じであった（ビューリー（Bewiey) 、T. A. （１９７９）“ホルモン研究の最近の進歩”35巻、１５５〜２１３頁、アカデミープレス、N. Y. ) 、遠紫外線スペクトルはｈＧＨと同じであり、このことは２０８nmおよび２２４nmにおける平均残基だ円率の重要な差がしられているが同様の４−ヘリックス束構造の存在を示している。これらのホルモンの芳香族残基の数や微環境の差を反映する近紫外ＣＤは著しく異なる。別の研究で組換えｈＰＲＬはｈＰＲＬ ＥＬＩＳＡにおいて十分な免疫学的交叉反応性を維持しており（データ示さず）、またラットのリンパ種Ｎｂ２細胞を繁殖させることにおいてｈＧＨと等価であった（タナカ（Tanaka), T. 等（１９８０）J. Clin. Endo. Metab. ５１、１０５８−１０６３）。還元すると精製ｈＰＲＬはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度の著しい減少を起こし（ｈＧＨでもみられる）、このことはジスルフィド結合の形成を示している（ポリット（Poliitt), S.等（１９８３）J. Bacteriol。 １５３、２７−３２）。アミノ末端配列分析は細胞内発現ｈＰＲＬはアミノ酸末端メチオニンを維持していることを示した。しかし、メチオニルｈＧＨと同様このことは見かけ上その構造や機能に影響しない。
ｈＧＨ結合たん白質へのｈＰＲＬの結合はｈＧＨと比較して１０⁵ 倍以上も減少し（第XXIII 表）、これは結合アッセイの検出限界以下である。
【０１０８】
【表２５】

【０１０９】
1. 先に述べたようにｈＰＲＬ変異体を生成、精製および分析した。多くの変異体はコロンで区切られた一連の単一変異体で示される（第XXII表）。コドン番号はｈＧＨ配列に基づいている（図２）。
2. 平均標準誤差は、それが５０％ほどになるＫd 値が１μM を越える場合を除いて報告値の２０％以下であった。この誤差はＫd 値が１０μM を越えるとさらに大きくなる。
ｈＧＨ由来のヘリックス４中の３つの残基を組合せて（Ｈ１７１Ｄ、Ｎ１７５ＴおよびＹ１７６Ｆ）、ｈＰＲＬに導入した。アラニンスキャンニング突然変異誘発およびｈＰＲＬ置換（第XXII表）はこれらの残基がｈＧＨのｈＧＨレセプターへの結合に非常に重要であっことを示している。ｈＰＲＬのこの三重変異体はｈＧＨよりは１４０００倍も弱いがｈＧＨ結合たん白質に検出可能な結合を起こした。さらにテトラ変異体を作るため他の重要なヘリックス４残基（Ｋ１７８Ｒ）を導入すると、これは野生型よりわずか６６０倍低いだけのレベルの結合に強められた（第ＸIII 表の変異体Ｂ）。ｈＰＲＬ変異体ＢへのｈＧＨ残基１８４〜１８８の導入はｈＧＨ結合たん白質への結合を強化しなかった。しかしｈＰＲＬ変異体Ｃを与えるＥ１７４Ａの導入（第XXIII 表）はＥ１７４ＡがｈＧＨに組込まれたときと同じようにｈＧＨ結合たん白質への結合アフィニティーをさらに3.５倍増加した。
【０１１０】
ヘリックス４領域への結合力をもつことから残基５４〜７４を含むループ領域を分析した。ｈＰＲＬ中のループ領域をｈＧＨ由来の配列（第ＸIII 表のｈＧＨ（５４−７４））で完全に置換することはｈＧＨ結合たん白質へのかろうじて検出可能な結合を与える。この変異体を変異体Ｂと合せたとき結合アフィニティーが実質的に増加する。しかし、この新しい変異体（Ｂ＋ｈＧＨ（５４−７４））の結合アフィニティーは変異体Ｂ単独のときよりもほとんど１０倍減少する。したがって５４−７４ループ中のいくつかのｈＧＨ残基はヘリックス４中のｈＧＨ置換と適合しなかった。我々はｈＧＨの５４−７４ループからアラニンスキャンニング突然変異誘発によりもっとも結合に影響することが示された７個の残基を選択した。ｈＧＨのＲ６４Ａ突然変異は結合アフィニティー４２０倍以上減少させるが、ｈＧＨのＲ６４Ｋ変異体（ｈＰＲＬ置換）はｈＧＨ結合たん白質への結合がわずかに多い（第XXII表）。それゆえｈＰＲＬ中のＬys６４は変化しないままであった。結果としてｈＧＨにおいてアラニンへの変化が最も破壊的であった７個の置換のうちの６個をｈＰＲＬへ組込んだ。この新しい変異体（Ｂ＋Ｈ６５Ｆ：Ｓ５６Ｅ：Ｌ５８Ｉ：Ｅ５６Ｓ：Ｄ６８Ｎ：Ｑ６６Ｅ）はＢ＋ｈＧＨ（５４−７４）よりも５０倍も強く結合するが野生型ｈＧＨの結合アフィニティーよりもわずかに１１０倍小さいだけである。しかし、これは変異体Ｂ単独よりもわずかな改善を示したのみで（６倍）、先にｈＧＨのループ領域において観察された強い相互作用に期待されるほどではなかった。それゆえ、ループ内の６個の突然変異をさらに分断し、Ｈ５４Ｆ：Ｓ５６Ｅ：Ｌ５８Ｉ＋変異体Ｂの組合せが変異体よりも３倍も結合が弱いことが明らかになった。最後に変異体Ｃへの突然変異Ｅ６２Ｓ：Ｄ６３Ｎ：Ｑ６６Ｅの組込みは（変異体Ｄ）はｈＧＨに比べ結合アフィニティーがわずかに６倍低いだけの最も高いアフィニティーをもつ類似体を生ずる。別の単一突然変異（Ｈ５４Ｆ、Ｓ５６Ｅ、Ｌ５８Ｉ、Ａ５９Ｐ、Ｎ７１ＳおよびＬ１７９Ｉ）はｈＧＨ結合たん白質へのｈＰＲＬ変異体Ｄの結合アフィニティーを高めることはなかった。変異体Ｄの構造は事実上ＣＤスペクトル分析（図２８）またはＥＬＩＳＡ活性（データ示さず）によって天然のｈＰＲＬと区別できなかった。
【０１１１】
これらの研究は部位指定突然変異誘発実験由来の機能情報のみを用いた遠い関係の類似体の結合性を回復させ得る可能性を示した。ｈＧＨのアラニンスキャンニング突然変異誘発はｈＧＨのレセプターへの結合を調節するのに重要な側鎖の系統的分析を提供した（図２７）。この情報はｈＧＨレセプター結合し得ないことを説明するｈＰＲＬ中の多くの残基を浮き立たせた（図２９）。しかしさらに分析することでｈＧＨ中のアラニン置換がｈＧＨ中のｈＰＲＬ置換よりもより破壊的であることが示された（第XXII表）。さらにいくつかのｈＰＲＬ置換は、特にｈＰＲＬ中により大きい側鎖が存在するとき結合アフィニティーに関し他のものよりかなり破壊的であった。たとえばｈＧＨ中の保存的（しかしより大きい）Ｆ１７６Ｙ置換はｈＧＨレセプターに関する結合アフィニティーに８倍の減少を引き起こすが、一方より小さいＲ６４Ｋ置換は結合アフィニティーのわずかな増加を示した。このようにｈＧＨ中の破壊的ｈＰＲＬ置換の分析は最初にｈＰＲＬへの結合アフィニティーを遂行するヘリックス４中の残基クラスターの導入を示している。このことは野生型ｈＰＲＬによるｈＧＨレセプターへの結合が観察されないことから非常に重要であり、使用した検定の範囲内の結合アフィニティーをもたらすため（Ｋd ≦５０μM ）ｈＰＲＬ中に同時にいくつかのｈＧＨ置換を導入することが必要である。
ヘリックス４に機能的に重要な残基を導入することによりｈＰＲＬに容易に検出可能な結合アフィニティーを導入された。しかし、５４−７４間のループ領域を作り出すことはより困難であることが分った。ｈＧＨの全ループをｈＰＲＬに組込むことによる結合の増加は期待されたよりも小さく、至適化されたヘリックス４変異体Ｂと組合せたときは結合に対して破壊的であった。我々のデータはｈＰＲＬの５４−７４ループ構造はこのたん白質中の他の相互作用により支持されることを示している。この問題は段階的に解決された。まず、ｈＧＨ中のｈＰＲＬ置換を伴アラニン置換で重要であると同定されたｈＧＨ由来の６個のループ残基をｈＰＲＬに導入した。これはその状況を改善したにもかかわらずいくつかのｈＧＨ突然変異（Ｈ４３Ｆ、Ｓ５６ＥおよびＬ５８Ｉにしぼった）の組合せはｈＰＲＬに対して破壊的であった。これらのデータはループ中のいくつかの残基がその構造に重要でありそのまま残した方がより安定でしることを示している。
【０１１２】
突然変異誘発の多くの反復サイクルがｈＰＲＬのｈＧＨレセプターへの堅い結合を可能にする残基の組合せを一本化するのに必要であった。この戦術は変異効果が実際に観察されるように加算的であるという仮定に依存している。たとえばＥ１７４Ａ突然変異がｈＰＲＬ変異体ＣまたはｈＧＨに加えられたとき結合を３〜５倍増加した。さらに変異体Ｄに対するＨ５４Ｆ、Ｓ５６Ｅ、およびＬ５８Ｉ単一変異体の破壊的効果は（4.４倍）変異体Ｂに付加された３つの全ての突然変異の組合せによって引き起こされる破壊とほぼ同じであった（３倍）。
変異体Ｄの結合アフィニティーはわずか６倍減少するだけであるにもかかわらず変異体Ｄに組込んでさらに結合を改善する試みを行いうるＶ１４ＮおよびＨ１８５Ｖなどいくつかの他の残基がある。すなわちｈＧＨ中のアラニン置換がｈＧＨの結合を２〜３倍の減少を起こす部位がある（図２９）。高分解能の構造が設計過程の助けとなるが、それは明らかに基本的なものではない。突然変異効果の累積性は天然の変化および淘汰サイクルによるたん白質進化と同じ様式で結合性を収れんさせうる。
従来のたん白質工学実験は高分解能構造分析を用いて基質接触残基による天然の変異体酵素の基質特異性の実際的変換が可能であることを示した（ウェルズ（Wells) J. A.等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４、５１６７−５１７１；ウィルクス（Wilks), H. M. 等（１９８８）Science ２４２、１５４１−１５４４）。同様に他のものは結合性は抗原結合ループ（ジョーンズ（Jones), P. T. 等（１９８６） Nature ３２１、５２２−５２５）またはＤＮＡレセプターヘリックス（ワートン（Wharton), R. P. 等（１９８５）Nature ３１６、６０１−６０５）を含む二次構造ユニットの全ユニットの置換により産み出し得ることを示した。しかし、ｈＰＲＬにｈＧＨレセプター結合性を与えるにはｈＰＲＬの構造枠組内の選択的残基置換を必要とする。さらにＣＤスペクトルデータはｈＰＲＬ変異体Ｄの全構造はそれぞれがｈＧＨと同様の結合性は維持しているにもかかわらず、ｈＰＲＬの構造には非常によく似ているがｈＧＨには似ていない。
【０１１３】
ｈＧＨレセプターへの結合特異性がｈＰＲＬに組込まれ得るという事実はソマトジェニックレセプター結合に対する特性の残基の機能的重要性を確認している。またこれらの研究はｈＧＨとｈＰＲＬがわずか２３％の一致しかもたないにもかかわらず両者の構造的関係に対する動かぬ証拠を提供する。これは成長ホルモン、プロラクチン、プロリフェリンまたは胎盤ラクトゲン構造を始めとするこのホルモン群内に含まれる新しいレセプター結合機能に近づく合理的方法を提供する。このようなハイブリッドはレセプターサブタイプの薬理学的重要性とともにレセプター結合および活性化を区別する上で有用である。これらの類似体はアゴニストまたはアンタゴニストとしてより有用な性質をもつ新しいレセプター特異的ホルモンの設計に導く。
【０１１４】
実施例１４
ヒト胎盤ラクトゲンへのヒト成長ホルモンの結合性の付与
ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）のｈＧＨレセプターに対する結合アフィニティーはｈＧＨに比べ３０倍小さい（G.バウマン（Baumann)等（１９８６）J. Clin. Endocrinol. Metab. ６２、１３４； A. G.ヘリントン（Herington)、等（１９８６）J. Clin. Invest. ７７、１８１７）。以前の変異実験はｈＧＨレセプターに対するｈＧＨの結部位は基本的にアミノ末端（残基４−１４）付近のいくつかのマイナーな決定基とともに２つの領域（残基５４−７４および１７１−１８５を含む）内に存在する。ｈＰＬの全配列はｈＧＨと８５％が同じである。ｈＧＨ上のレセプター結合エピトープを広く構成している３つの領域内でｈＰＬはわずか７箇所で異なり以下の置換を含む：Ｐ２Ｑ、１４Ｖ、Ｎ１２Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｅ５６Ｄ、Ｒ６４Ｍ、および１１７９Ｍ。（この命名法では野生型ｈＧＨの残基を１文字コードで示し、つづいて成熟ｈＧＨの部位番号およびｈＰＬ中の残基を示した）。これら７個の各部位においてｈＧＨの単一アラニン置換を作った。これらのうち、４つのアラニン置換、１４Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｒ６４Ａ、およびＩ１７９Ａは結合アフィニティーの２倍以上の減少を引き起こすことが分った。一般にアラニン置換は結合に関しヒトプロラクチン由来の相同的置換よりも大きい効果を有している。それゆえ、ｈＧＨに導入されたｈＰＬ由来の置換のいくつかの効果を研究した。Ｉ１７９Ａ置換はアフィニティーの2.７倍の減少を起こした一方、Ｉ１７９Ｍはわずか1.7 倍の効果しか示さなかった。しかし、Ｒ６４ＡおよびＲ６４Ｍ置換は結合アフィニティーの同一およびより大きい減少（約２０倍を引き起こした。さらに、ｈＧＨの二重変異体（Ｅ５６Ｄ：Ｒ６４Ｍ）のアフィニティーはさらに計３０倍の減少を示した（第１表）。このようにＥ５６ＤおよびＲ６４Ｍは基本的にｈＧＨとｈＰＬのレセプター結合アフィニティーの差を決定する。それゆえｈＰＬの二重変異体Ｄ５６Ｅ、Ｍ６４Ｒは実質的にｈＧＨレセプターへの結合アフィニティーが増加している。Ｍ１７９ＩおよびＶ４１のような付加的修正もｈＰＬのｈＧＨレセプターへの結合を高める。
【０１１５】
実施例１５
ヒト成長ホルモンへの結合に関する部位１７４でのアミノ酸置換の効果
先に示されているように、Ｇlu１７４のＡlaによる置換（Ｅ１７４Ａ）はヒト成長ホルモンのそのレセプターへのアフィニティーを４倍以上増加させる。部位１７４における至適置換残基を決めるため他の１２個の残基で置換したｈＧＨ変異体を作りｈＧＨ結合たん白質とのアフィニティーを測定した（第XXIV表）。荷電ではなく側鎖の大きさが結合アフィニティーを決定する主要要素である。アラニンが至適置換を起こし、Ser 、 Gly 、 Gln 、 Asn 、 Glu 、 His 、 Lys 、 Leu 、 そしてTyr の順でつづいている。
【０１１６】
【表２６】

【０１１７】
a. 突然変異はｐＢＯ４７５にクローン化した部位１７８にＫpnＩ部位を含むｈＧＨ遺伝子の変異体に部位指定突然変異誘発を行うことにより生成させた（カーター（Carter), P. 等（１９８６）Nucleic Acids Res.１３、４４３１−４４４３）。突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、

で表わされる配列を有している。ここでＮＮＮは部位１７４の新しいコドンを表わし、またアステリスクはコドン１７８で始まるＫpnＩ部位を除外するミスマッチを示している。変異コドンは次に示すものである：Ｇln, ＣＡＣ；Ａsn, ＡＡＣ；Ｓer, ＡＧＣ；Ｌys, ＡＡＡ；Ａrg, ＡＧＧ；Ｈls, ＣＡＣ；Ｇly, ＧＧＧ；Ｖal, ＧＴＧ；Ｌeu, ＣＴＧ。ヘテロ日本鎖合成につづいて野生型配列のバックグランドを減少させるためおＫpnＩによる制限処理でプラスミドプールの突然変異を濃縮した。全ての変異体配列はダイオキシ配列分析で確認した（サンガー（Sanger), F. 等（１９７７）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ７４、５４６３−５４６７）。
ｂ．側鎖バッキング値は C. コチア(Chotia)((１９８４）Annu. Rev. Biochem. ５３、５３７）のデータによる。
ｃ．解離定数は先に述べたようなｈＧＨ結合たん白質による(¹²⁵Ｉ）ｈＧＨの競合適置換により測定した。ＮＦは変異ホルモンが単離および検定するには低すぎるレベルで発現することを示している。
実施例１６
第XXV 表に示したｈＧＨ変異体を構築した。野生型ｈＧＨに対するこれらの相対的能力を示す。
【０１１８】
【表２７】

本発明の好ましい態様を述べてきたがこれら公開した態様を種々に変化させうること、およびこのような修正は本発明の範囲内にあることは当業者にとって明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】活性ドメインの同定に使用する戦術を示している。
【図２】ｈＧＨ、ｈＰＬ、ｐＧＨおよびｈＰＲＬのアミノ酸配列中の保存性および可変性アミノ酸残基を示している。
【図３】ｈＧＨの推定される低分解能構造および各ヘリックスに対しＮ末端開始残基から見たラセン投影図を示している。疎水性、中性および荷電残基は各々〇、■および●で示されている。
【図４】可溶性ｈＧＨレセプターに対する種々のセグメント置換ｈＧＨ変異体の結合に関する相対的減少を示す棒グラフである。
【図５】ソマトジェニックｈＧＨレセプターと相互作用する活性ドメインＡ、ＣおよびＦにおける類似アミノ酸を示す。
【図６】ソマトジェニックレセプターの相対的結合位置およびｈＧＨに対する８個のモノクローナル抗体を示す。
【図７】種々のアラニン置換ｈＧＨ変異体の可溶性ｈＧＨソマトジェニックレセプターに対する結合の相対的増減を示す棒グラフである。Ｔ１７５の斜線棒はアラニンではなくセリンが置換していることを示している。Ｒ１７８の縞棒はアラニンではなくアスパラギンが置換されていることを示している。
【図８】実施例で用いているｈＧＨ遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。
【図９】合成ｈＧＨ遺伝子を含むベクターｐＢＯ４７５の構築を示している。
【図１０】ｈＧＨのアミノ酸配列を示すｐＢＯ４７５のＤＮＡ配列である。
【図１１】ベクターｐＪ１４４６の構築を示している。
【図１２】肝臓由来のソマトジェニックレセプターの可溶性部分のアミノ酸配列を示すｐＪ１４４６のＤＮＡ配列である。
【図１３】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１４】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１５】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１６】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１７】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１８】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図１９】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図２０】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。
【図２１】ｈＧＨ中のソマトジェニックレセプターに対する結合に関与する活性アミノ酸およびヘリックス１および４に関するラセン投影図を示している。
【図２２】ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体を５０マイクログラム／kg／日で投与したラットの経時的体重増加を示している。
【図２３】野生型ｈＧＨと比較したｈＧＨ変異体の活性に対するＫd 比のセミログプロットである。
【図２４】ヒト血清（〇）またはプラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）を発現する大腸菌ＫＳ３３０培養物から単離したｈＧＨ結合たん白質に対する(¹²⁵Ｉ）ｈＧＨおよび未標識ｈＧＨの競合結合曲線である。棒は平均値からの標準偏差を示す。挿入図は競合結合曲線から導びいたスキャッチャードプロットを示している。ヒト血清および大腸菌由来の結合たん白質の濃度は各々0.１ nＭおよび0.０８ nＭであった。
【図２５】 2.８Å分解能のＸ線構造から決定したｐＧＨの構造に基づくｈＧＨの構造モデルである。パネルＡはｈＧＨレセプターエピトープの機能性等高線地図を示しパネルＢはｈＰＬレセプターエピトープについて測定された同地図を示している。黒丸の大きさは各残基のアラニン置換に関する破壊効果の大きさを示している。小さな丸は２倍以上の破壊を示し、大きい丸は１０倍以上の破壊を示す。ｈＧＨレセプターエピトープにおける▲は（バネルＡ）結合親和性が４倍以上増加させるＥ１７４Ａ Ｋ位置を示している。
【図２６】大腸菌におけるｈＰＲＬの細胞内発現に使用したプラスミドｐＢＯ７６０を示している。
【図２７】ｈＧＨ結合たん白質に対する結合に強く影響するｈＧＨ中の残基の位置を示している。結合親和性の１０倍以上の減少（〇）、４〜１０倍の減少（■）または４倍以上の増加（▲）を引き起こすアラニン置換（Ｔ１７５またはＲ１７８の場合は各々セリンまたはアスパラギン）が示されている。α−ヘリックス領域のラセン投影図はそれらの両親媒性およびヘリックス４において最も重要な決定因子は親水性面（影部分）に存在するという事実を明らかにしている。
【図２８】ｈＧＨ（−）、野生型ｈＰＲＬ（−−）およびｈＰＲＬ変異体Ｄ（−−−−）の遠紫外（パネルＡ）または近紫外（パネルＢ）における円二色スペクトルを示している。
【図２９】同類およびアラニンスキャンニング突然変異誘発により限定された結合に重要な領域に関するｈＧＨとｈＰＲＬの配列比較を示している。同一残基は影を付け、またその番号はｈＧＨ配列に基づいている。変異したとき結合親和性が４倍以上変化する残基には丸を付けた。残基の上のアステリスクは変異が結合親和性を２〜４倍減少させる部位を示している。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
This application is a continuation of US patent application Ser. No. 07 / 264,611, Oct. 28, 1988.
The present invention relates to methods for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides. The invention also relates to hormone variants.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Polypeptides or peptides and proteins include a wide range of biological molecules each having a specific amino acid sequence, structure and function. Most polypeptides interact with specific substrates to perform their functions. Thus, enzymes with subtilisin, amylase, and tissue plasminogen activator interact with specific substrates and undergo hydrolysis at specific cleavage sites, whereas protein hormones such as human growth hormone and insulin are specific. It interacts with receptors and regulates growth and metabolism. There are also interactions between a polypeptide and a substance that is not the main target of the polypeptide, such as an immunogenic receptor. Many polypeptides are multifunctional in that they contain distinct regions that interact with distinct ligands or receptors that produce distinct biological effects. For example, human growth hormone (hGH) is involved in glucose and lipid metabolism in adults and induces long bone growth in children.
[0003]
Efforts have been made to improve the function of natural polypeptides by modifying the amino acid sequence. One method is to substitute one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide with another amino acid. Examples have been reported in which protein engineering by in vitro mutagenesis or expression of cloned genes has been applied to improve the thermal or oxidative stability of various proteins. Villafranca, J. E. et al. (1983) Science222782-788; Perry, L. J. et al. (1984) Science.226555-557; Estell, D. A. et al. (1985) J. Biel. Chem.2606518-6521; Rosenberg, S. et al. (1985) Nature (London).31277-80; Courtney, M. et al. (1985) Nature (London),313149-157. Furthermore, it has been reported that such a method is applied to produce an enzyme with altered substrate specificity. Estell, D. A. et al. (1986) Science223655-663; Craik, C. S. et al. (1985) Science,228291-297; Farsht, A. R. et al. (1985) Nature (London)314235-238; Winther, J. R. (1985) Carisberg Res. Commun.50273-284; Wells, J. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.841219-1223. The determination of the amino acid to be corrected is mainly based on the crystal structure of the polypeptide, the effect of chemical correction on the function of the polypeptide, or the interaction of various substrates with the polypeptide to confirm the mode of action of the polypeptide. It is done. In some cases, amino acid substitutions may be induced based on specific amino acid residues of related polypeptides, such as differences in amino acid sequences in the substrate binding regions of subtilisins having different substrate specificities. Wells, J. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 5767. In other cases it has also been reported to modify the amino acid sequence of a known active region of a molecule to be the amino acid sequence of a known active region of a second molecule. Wharton R. P. et al. (1985) Nature 316, 601-605, and Wharton R. P. et al. (1984) Cell38361-369 (replacement of the phage receptor recognition helix with another receptor recognition helix); Jones, P. T. et al. (1986) Nature321522-525 (replacement of the variable region of human myeloma protein with the equivalent region of the mouse antibody). While this method may provide some predictions about the properties that change with substitution, it is not a method that guarantees the evaluation of all regions and residues that determine a particular property. At best, an empirical estimate of the energy for the molecular contact force of the substituted residue is made. Hydrogen bonding to specific modified residues (Farsht, A. R. et al. (1985) Nature314235; Bryan, P. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA833743; Wells, J. A. et al. (1986) Philos. Trans. R. Soc. London A.317415), electrostatic mutual use (Wells, J. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA841219; Cronin, C. N., et al. (1987) J. Am. Chem. Soc.1092222) and hydrophobic and steric effects (Estell, D. A. et al. (1986) Science233659; Chen, J. T. et al. (1987) Biochomistry26, 4093) was estimated. These and other reports (Laskowski, M. et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.52545: Wells, J. A. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 5167; Jeans, P. T. et al. (1986) Nature321522; Wharton R. P. et al. (1985) Nature316601) concluded that mutagenesis of known contact residues has a large effect on binding, whereas mutagenesis of non-contact residues has a relatively small effect.
[0004]
A second method for understanding the relationship between amino acid sequence and function is by the generation of a hybrid DNA sequence encoding a hybrid polypeptide utilizing in vivo homologous recombination between related genes. Such hybrid polypeptides include trpB and trpA (Schneider, W. P. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA from E. coli and Salmonella typhimurium.782169-2173); alpha 1 and alpha 2 leukocyte interferons (Weber, H. and Weissmann, C. (1983) Nuc. Acids Res.115661); outer membrane pore protein ompC and phoE of E. coli K-12 (thommassen, J. et al. (1985) EMBO)41583-1587); and thermophilic alpha-amylase from Bacillusstearothermophilus and Bacilluslichiniformis (Gray, G. L. et al. (1986) J. Bacteriol.166635-643), which are reported to be obtained by homologous recombination. Such methods can provide useful information about useful hybrid polypeptides in addition to amino acid sequence and function as reported for hybrid alpha amylases, but systematically study a given polypeptide to identify one of the target substances. In particular, it is difficult to use these methods to measure detailed regions and amino acid residues in a polypeptide exhibiting activity. This comes from the fact that the site of cross-recombination that defines the DNA and amino acid sequences of the hybrid basically depends on the DNA sequence of the target gene and the recombination mechanism of the host cell. These methods are routinely and methodically determined by corresponding segments from another gene of a relatively small segment of DNA encoding one polypeptide other than the accidental environment in which crossover occurs near the 5 'or 3' end of the gene. It does not provide the necessary substitution.
[0005]
There have been reports of studies on the interaction between proteinaceous hormones and their receptors in several ways. One method used hormone peptide fragments to determine the location of the receptor binding site on the hormone. Another method uses the competition between neutralizing monoclonal antibodies and peptide fragments to determine the location of the receptor binding site by epitope mapping. Examples of these methods include studies reported for human growth hormone (hGH).
Human growth hormone (hGH) is involved in many regulation in normal human growth and development. This 22,000 dalton pituitary hormone exhibits many biological effects including linear growth (body development), lactation, macrophage activation, other insulin-like and diabetes-inducing effects. Chawla, R. K. (1983) Ann. Rev. Med.34519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science239769; Thorner, M. O. et al. (1988) J. Clin. Invest.81745. Growth hormone deficiency in children causes dwarfism, which has been successfully treated with hGH for over a decade. In addition, to distinguish between genetic and post-translationally modified forms of hGH, to investigate the immunological response to hGH when administered clinically, and to quantify circulating levels of this hormone, the antigenicity of hGH is also used. Interesting (Lewis, UJ (1984) Ann. Rcv. Physiol.4633).
[0006]
hGH is a member of a group of homologous hormones including placental lactogen, prolactin and other growth hormone genes and species variants. Nichol, C. S. et al. (1986) Endocrine Reviews7169. hGH exhibits broad species specificity and is monomerically cloned somatogenic (Leung, D. W., et al. (1987) Nature330537) or prolactin receptor (Boutin, J. W. et al. (1988) Cell5369) is unusual among these groups in that it binds to 69). The cloned gene of hGH is expressed as an E. coli endocrine type (Chang. C. N. et al. (1987) Gene55189) and its DNA and amino acid sequences have also been reported (Goeddel et al. (1979) Nature281544; Gray et al. (1985) Gene39247). The three-dimensional structure of hGH is also unknown. However, the three-dimensional folding pattern of porcine growth hormone has been reported with moderate resolution and accuracy (Abdel-Meguid, S. S. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.846434).
A peptide fragment derived from hGH was used to locate the receptor junction site of hGH. (Li), C.H. (1982) Mol. Cell. Biochem.4631; Mills, J. B., et al. (1980) Endocrinology,107391. In other reports, fragments of residues 96-133 were isolated after protein degradation of bovine growth hormone. Yamasakin et al. (1970) Biochemistry91107. However, no detectable binding activity was observed when a larger fragment containing residues 1-133 was made recombinantly. Krivi, G. G. et al. International Symposium on Growth Hormono: Basic and Clinical Aspects, Abstract I-18, Final Program, Serono Symposia, USA, June 14-18, 1987. Clearly these results are contradictory, and peptide fragments are used to locate receptor binding sites for protein hormones, particularly those whose binding sites consist of two or more discontinuous epitopes and / or structure-dependent epitopes. Use indicates that it is not reliable.
The use of neutralizing monoclonal antibodies for localization of receptor binding sites by epitope mapping has similar limitations. For example, there are reports of using monoclonal antibodies to compete with hGH receptors for peptides consisting of residues 98-128 of hGH in receptor binding assays. It was proposed that this region contains a receptor binding site based on these competition experiments even though only the peptide of hGH hormone 98-128 binds to the neutralizing monoclonal antibody. Retegin, L. A., et al. (1982) Endocrinology111668.
[0007]
Similar methods have been used in attempts to identify the antigenic site of the hGH hormone. Epitope mapping of 24 different monoclonal antibodies against hGH by competitive binding reported reported that the antigenic sites on the hormone were classified into only 4 types. Surowy, T. K. et al. (1984) Mol. Immunol. 21, 345; Aston, R. et al. (1985) Pharmac. Ther.27403. However, this tactic did not locate the epitope on the amino acid sequence of the hormone.
Another way to define antibody sites is to test antibody binding to short linear peptides on the target protein. Geysen, H. M. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Scl. USA813998; Geyson, H. M. (1985) Immunol. Today.6364. However, this method is subject to the same limitations as using linear peptide fragments to position the receptor binding site. In order to be useful, this linear sequence must retain the structure found in the antigen of this antibody in order to recognize it. Furthermore, based on the site of the antibody epitope revealed by X-ray crystallography (Scheriff, S. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA848075; Amit, A. G., et al. (1986) Science.233747) Virtually all antibody binding sites are partially discontinuous (Barlow, D. J. et al. (1986) Nature.322747) and as a result, it has been postulated that linear fragments cannot mimic these structures well. Peptide fragments of hGH have also been studied by non-covalent binding of these fragments. Several researchers have reported analyzes combined with relatively long fragments containing the natural amino acid sequence of human growth hormone or chemically modified peptides. Burstein, S. et al. (1979) J. of Endo. Met.48964 (a combination of amino terminal fragment hGH-1-134) and carboxyl terminal fragment hGH- (141-191))); Li (C) H. et al. (1982) Mol, Cell. Biochem.4631, Mills, J. B., et al. (1980) Endocrinology107391 (subtilisin cleaved double stranded form of hGH). Similarly, the chemically modified fragment hGH- (1-134) and the chemically modified carboxy terminal fragment (hCS- (141-191)) derived from human chorionic somatomamotropin (also called placental lactogen) are also chemically modified fragment hCS- (1 -133) and hGH- (141-191). U.S. Pat. No. 4,189,426. These researchers falsely reported that the binding determinant to the liver growth hormone receptor was the first 134 amino terminal residues of growth hormone (Burstein, et al. (1978) Proc. Natl. Acad. . Sci. USA755391-5394). Obviously these methods lead to wrong results. In addition, by using two large fragments, this method potentially allows the two fragments used in these combinations to be identified without identifying specific residues or regions that are actually involved in a particular interaction. It is possible to assign that function to either. A review of the above methods and experiments for hGH has been reported. Nichol, C. S. et al. (1986) Endocrine Rev.7169-203.
[0008]
Another method has been reported in which a 7-residue peptide fragment derived from a “deleted peptide” of hGH (hGH-32-46) has been modified to include amino acid residues from similar segments of other mammalian growth hormones. However, no such substitution effect has been reported. See U.S. Pat. No. 4,699,897. Nevertheless, the shortcomings of using short peptide fragments are obvious because the linear sequence of those fragments must be incorporated so that the structures found in the native growth hormone can be recognized both in vitro and in vivo.
Many natural hGH variants have been identified. Among these are hGH-V (Seeberg, P. H. (1982) DNA.1239; U.S. Pat. Nos. 4,446,235, 4,670,393 and 4,665,180) and 20K hGH containing deletions of residues 32-46 of hGH (Kostyo, J. L. et al. (1987) Biochemica et Biophysica Acta925314; Lewis, U. J., et al. (1978) J. Biol. Chem.2532679).
One investigator reported the disruption of a disulfide bond that normally forms between Cys-53 and Cys-165, which replaces the cysteine at position 165 in hGH with alanine. Tokunaga, T., et al. (1985) Eur. J. Biochem.153445. This single substitution apparently maintained the tertiary structure of hGH and resulted in a variant recognized by the hGH receptor.
Other researchers have reported in vitro synthesis of hGH on solid resin supports. The first report of this researcher published an incorrect 188 amino acid sequence of hGH. Li, C. H. et al. (1966) J. Am. Chem. Soc.882050; and US Pat. No. 3,853,832. The second report published a 190 amino acid sequence. US Pat. No. 3,853,833, the latter arrangement is also incorrect. In particular, the hGH sequence contains glutamine after site 68, site 73 is glutamic acid instead of glutamine, site 106 is aspartic acid instead of asparagine, and site 108 is asparagine rather than aspartic acid.
[0009]
In addition to those shown above, hybrid interferons with altered binding to specific monoclonal antibodies have also been reported. Camble, R. et al., "Peptide; Structure and Function" Properties of interferon-α2 analogues generated from synthetic genes, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium, (1985) Deber et al., Pierce Chemical Company Chicago, III., 375-384. As published in the literature, amino acid residues 101-114 of α-1 interferon or residues 98-114 of γ-interferon are substituted with α-2 interferon. α-2 interferon binds NK-2 monoclonal antibody but not α-1 interferon. This particular region in α-2 interferon was selected because seven of the 27 amino acid differences between α-1 and α-2 interferon are present in this region. As reported, the hybrids thus obtained have substantially reduced activity with the NK-2 monoclonal antibody. When tested for antiviral activity, these hybrids showed antiviral activity comparable to that of wild-type α-2 interferon. Substitution of smaller sections within this region has also been reported. Continuous substitutions of 3-7 alanine residue clusters have also been reported. However, only one analog [Ala-30, 32, 33] IFN-α2 has been published.
Alanine substitutions within small peptide fragments of chicken egg white lysozyme and the effects of these substitutions on stimulation of 2All or 3A9 cells have also been reported. Allen, P. M. et al. (1987) Nature327713-715.
All secondary structural units including antigen binding loops (Jones, P. T. et al. (1986) Nature321522-525) or DNA recognition helix (Wharton, R. P. et al. (1985) Nature.316, 601-605), there is also another report on the manipulation of connectivity.
The above references are provided solely for publication prior to the date of registration of this application, and due to the priority based on the prior invention or previously registered applications, these publications will be lost due to their earlier publication date. There is nothing that can be interpreted as a confession.
[0010]
Clearly, an effective systematic analysis of polypeptides is necessary to clarify the relationship between structure and function given the circumstances indicated by the above references. The aim here is therefore to provide a method for identifying active domains within a polypeptide that contribute to the functional activity of the polypeptide.
A further object of the present invention is to provide a method for measuring active amino acids to determine functional activity.
It is a further object of the present invention to provide a method for systematically identifying biologically active domains within a polypeptide.
A further object is to provide hormone variants having desirable biological, biochemical and immunogenic properties that are different from the original hormone.
A further object is to provide hormonal variants having reduced activity for one biological function and having substantial or increased activity for a second target substance.
A further object of the present invention is to provide hGH variants with altered binding activity and / or biological activity and increased efficacy for somatogenic receptors for hGH.
It is a further object to provide hGH variants that retain one or more desirable biological properties but have reduced diabetic inducing activity.
A further object is to provide hPRL and hPL with increased binding activity for the somatogenic receptor of hGH.
A further object is to provide DNA sequences, vectors and expression hosts containing the vectors used for cloning and expression of polypeptide variants, including hGH variants.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In one aspect, the present invention provides a systematic analysis of polypeptide structure and function by identifying unknown active domains that affect the activity of the polypeptide with respect to the first target substance. These unknown active domains contain at least two discontinuous amino acid segments in the primary amino acid sequence of the polypeptide. The active domain is determined by replacing selected amino acid segments of the polypeptide (referred to as the parent polypeptide) with similar amino acid segments derived from analogs of the polypeptide. This analog has an activity different from that of the parent peptide with respect to the target substance. The activity of each segment-substituted polypeptide thus generated with respect to the target substance is assayed. These activities are compared with those of the parent polypeptide. Such a comparison of activities provides an indication of the position of the active domain in the parent polypeptide, since this structurally similar amino acid segment is derived from analogs that interact differently with respect to the target substance.
The method further includes the identification of active amino acids in the active domain of the parent polypeptide. The method includes a substitution of each amino acid residue in the active domain of the parent polypeptide for each amino acid, and an assay for the target substance of the residue-substituted polypeptide. The activity of each residue-substituted polypeptide is compared to that of the parent polypeptide. These steps are repeated for various amino acids in the active domain until an active amino acid residue is identified.
Another feature of the present invention is to provide a method for identifying various active domains and active amino acid residues for various target substances. These methods include iterations of the methods described above for the second target.
[0012]
Following the method described above, polypeptide variants are identified that have different activities relative to the parent polypeptide for one or more target substances. These variants are made based on the identification of the active domain or active amino acid residue in the active domain that determines the activity of the parent polypeptide with respect to the target substance.
The invention further includes growth hormone, prolactin and placental lactogen variants consisting of at least three parts. The first part corresponds to at least part of the amino acid of the parent hormone, the third part corresponds to at least part of the parent hormone, and the second part corresponds to the amino acid sequence of the analog of the parent hormone. The second part is an analog of the amino acid residue of the parent hormone that is not included between the first and third parts of the polypeptide variant.
The present invention also includes certain human growth hormone, human prolactin and human placental lactogen variants, including hGH segment substitution and residue substitution variants.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In one embodiment, the method of the present invention systematizes a parent polypeptide, such as human growth hormone or human prolactin, to determine one or more active domains in the polypeptide with respect to the interaction between the parent polypeptide and the target substance Provide analysis. In employing the method of the present invention, the target substance of interest must have one or more analogs to the polypeptide that exhibit different activities.
Thus, as used herein, “parent polypeptide:” means a polypeptide in which there exists an “analog” that exhibits activity towards a different target substance than the parent polypeptide. Examples of analogs and target substances are shown in Table 1.
[Table 1]
Table 1

[0014]
Of course, the parent polypeptides, analogs and target substances in Table 1 are merely examples. The parent polypeptide also includes a protein comprising one or more subunits such as succinyl coenzyme A synthetase, mitochondrial ATPase, aminoacyl tRNA synthetase, glutamine synthetase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and aspartate transcarbamolase. (Huang et al. (1982) Ann. Rcv. Biochem.51935-971). In such multi-subunit parent polypeptides, the active domain spans more than one subunit of the parent polypeptide. Thus, the method described in more detail below explores each subunit of a particular polypeptide and is partially contained on one subunit and partly on one or more other subunits. It can be used to determine the active domain and active amino acids for a target substance.
In general, parent polypeptides and analogs belong to a group of polypeptides related to function. In addition, such parent polypeptides and analogs usually have some amino acid sequence, ie, conserved residues. These sequence homologies can be as high as 90% or as low as about 15% to 20%.
In addition to primary sequence homology, analogs of the parent polypeptide are also limited in the three-dimensional framework of the polypeptide and its analogs. Thus, an analog may show diversity from the parent polypeptide in the amino acid sequence or may have a structural homology with the parent polypeptide based on a comparison of all or part of the tertiary structure of the molecule. Chothia, C. et al. (1986) Embo. J.5823.
[0015]
In general, tertiary structural analogs may be considered identical if the three-dimensional structure of the analog is known to be the same as that of the parent polypeptide. By performing a root mean square analysis (RMS) of the α-carbon axis (eg, Sutcliffe, M. J. et al. (1987) Protein Engineering1377-384), if any, overlaps of regions with three-dimensional similarity are identified. Preferably for more than 60% of the test analog sequence, if the α-carbon axis overlaps with the α-carbon axis of the parent polypeptide or is within about 2 Å to about 3.5 Å RMS, the test analog is It is three-dimensionally similar to the parent polypeptide. This of course excludes insertions or deletions present between the two sequences.
Although the parent polypeptides and analogs described above are publicly available molecules, the parent polypeptides and analogs include variants that contain natural mutations in sequences introduced by in vitro recombination methods. Should be understood. Thus, variants used as parent polypeptides or analogs include variants that contain substitutions, insertions, or deletions of one or more amino acid residues in the parent polypeptide or analog. Such variants can be used to perform the methods of the invention to identify active domains and / or active amino acids or to prepare polypeptide variants of the invention. Thus, natural variants of hGH or recombinant variants containing CYS-165 Ala substitutions can be used as parent polypeptides or analogs as long as they are active against the target. Such natural and recombinant variants may contain different amino acid residues that are equivalent to specific residues in other parent polypeptides. These different amino acids can be said to be equivalent if their residues are structurally similar by primary sequence or tertiary structure, or if they are functionally equivalent.
Furthermore, it is clear that many parent polypeptides and analogs can exchange their roles. Thus, non-human growth hormones and their related analog groups can each be used as parent polypeptides and explore their active domains equally. Furthermore, target substances such as CD-4 receptor for HIV virus are also used as parent polypeptides for CD-4 receptor analogs to identify active domains and amino acids that contribute to HIV binding and to prepare CD-4 variants.
[0016]
As used herein, a “target” is a substance that interacts with a parent polypeptide. Target substances include proteinaceous hormones, enzyme substrates, hormones for protein receptors, general ligands for protein binding proteins, and immune systems that can contact polypeptides. Examples of hormone receptors include somatogenic and lactogenic receptors for hGH and receptors for hPRL. Other target substances include antibodies, protease inhibitors, hormones that bind to protein receptors, and fibrin that binds to tissue plasminogen activator (t-PA).
In general, a target substance interacts with a parent polypeptide by contacting an “active domain” on the parent polypeptide. In general, such active domains are present on the surface of the polypeptide or are derived on the surface of the polypeptide by changes in the three-dimensional structure. The surface of a polypeptide is defined in terms of the native structure that exists under physiological conditions, i.e., conditions similar to when expressed in vivo or in vitro. The amino acid segment and amino acid residue are identified in several ways. If the three-dimensional crystal structure is known with sufficient resolution, the amino acid residues on the surface of the polypeptide are “surface accessible” amino acid residues. These surface accessible residues are those that make contact with a theoretical water molecule that "rolls" on the surface of its three-dimensional structure.
The active domain on the surface of a polypeptide is contained in a single segment of the polypeptide's primary amino acid sequence. In many cases, however, the active domain of a native polypeptide is composed of two or more amino acid segments in the primary amino acid sequence of the parent polypeptide. For example, the active domain of human growth hormone for somatogenic receptors is shown in FIG. As shown, the active domain domains A, C and F are each present on a discontinuous amino acid segment of the hGH molecule. These amino acid segments are indicated by letters A, C and F in FIG. The discontinuous amino acid segments constituting the active domain are separated by a number of amino acid residues that are not significantly related to the interaction between the active domain and the target substance. In general, the spacing between discontinuous amino acid segments is at least 5 amino acid residues.
[0017]
The method of the present invention is aimed at detecting unknown active domains in the amino acid sequence of the parent polypeptide. If the three-dimensional crystal structure of the polypeptide for the target substance is available, for example, the crystal structure of the enzyme for the inhibitor or transition state analog is available, most active domains of many polypeptides remain unknown.
As used herein, “similar polypeptide segment” or “similar segment” refers to an amino acid sequence that replaces the corresponding sequence in a parent polypeptide to form a “segment replacement polypeptide”. Generally, a similar segment results in the substitution, insertion or deletion of one or more different amino acid residues in the parent polypeptide but the relative amino acid sequence of other residues in the selected segment that are substituted in the parent polypeptide Has a maintained sequence. In general, similar segments are identified by aligning the entire amino acid sequence of the parent polypeptide and analog so that sequence identity between the sequences is maximized. Similar segments based on this sequence alignment are selected for substitution of the parent polypeptide with the corresponding sequence. Similarly, similar segments from analogs that exhibit tertiary structural homology can be derived from these regions that exhibit structural homology. Such similar segments are replaced with the corresponding sequences in the parent polypeptide. In addition, other regions of tertiary structure homologues such as regions adjacent to low structural similarity regions are also used as similar segments.
If possible, similar segments should be selected to avoid introducing destabilizing amino acid residues into the segment-substituted polypeptide. Such substitutions include those that introduce a hydrophilic side chain into the bulky side chain or hydrophobic core region.
[0018]
In general, the amino acid sequences of the parent polypeptides and analogs are known, and in some cases their three-dimensional crystal structures are also available. By aligning the amino acid sequences of one or more analogs and the parent polypeptide, one can easily find conserved amino acid residues in the sequence that have not been altered at least in preliminary analysis. Sequence alignment also reveals regions of sequence variation that include substitutions, insertions or deletions of one or more amino acid residues. The region containing such changes determines which segment in the parent polypeptide has replaced a similar segment. Thus, substitution of similar segments of analogs can cause not only amino acid residue substitutions, but also amino acid residue insertions and / or deletions.
If three-dimensional structural information is available, it is possible to identify regions in the parent polypeptide that should not be replaced with similar segments. For example, if a congested region is identified on the hydrophobic surface of an amphipathic helix in the parent polypeptide, it should not be replaced with a similar segment. Residues so identified should be retained in the polypeptide variant and only surface residues should be replaced with similar residues.
Generally, similar segments are 3 to 30 amino acids in length, preferably about 3 to 15 residues, and most preferably about 10 to 15 residues. In some cases, the preferred length of a similar segment may also vary due to the insertion and / or deletion of one or more amino acid residues of the similar segment relative to a homologous or parent polypeptide. If the three-dimensional structure of the parent polypeptide is not available, it is generally necessary to create a segment replacement polypeptide for similar segments that cover most if not all of the parent polypeptide. However, segment substitution of the entire amino acid sequence is not always necessary. For example, an accidental segment substitution covering only a part of the entire amino acid sequence provides sufficient information to identify the active domain for a particular target substance. In most cases, however, about 15% or more of the amino acid sequence needs to undergo segment substitution to identify the active domain. In general, about 50%, preferably about 60%, more preferably about 75%, and most preferably 100% of amino acid sequences are segment substituted when there is no structural information.
[0019]
As used herein, “similar amino acid residue” or “similar residue” means an amino acid residue in a similar segment that is different from the corresponding amino acid residue in the corresponding segment of the parent polypeptide. Thus, if a similar segment substitution results in one amino acid substitution, that amino acid residue is a similar residue. Once the parent polypeptide and one or more analogs are identified, similar segments from one or more analogs are replaced with selected segments in the parent polypeptide to create a number of segment replacement polypeptides. Such substitutions are easily performed using recombinant DNA technology. In general, the DNA sequence encoding the parent polypeptide is cloned and otherwise processed so that it can be expressed in a convenient host. Parent polypeptide-encoding DNA can be derived from mRNA of cells expressing the parent polypeptide or can be obtained from genomic libraries by chemically synthesizing DNA sequences (Meniatis, T. et al. ( 1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory NY).
This parental DNA is then inserted into an appropriate plasmid or vector and used to transform host cells. Prokaryotes are preferred for making parental, segmental, polypeptide, and polypeptide variants by cloning and expression of DNA sequences. For example, E. coli k12294 strain (ATCC No. 31446), E. coli B strain, E. coli X1776 strain (ATCC No. 31537), E. coli c600 strain and c600hfl strain, E. coli W3110 (F^- , Γ^- , Autotrophic, ATCC No. 27325), Bacillus such as Bacillus subtilis and other enteric bacteria such as Salmonella typhimurlum or Serratia marcesans and various Pseudomonas species. A preferred prokaryotic organism is E. coli W3110 (ATCC 27325). When expressed in prokaryotes, the polypeptide generally contains an N-terminal methionine or formyl methionine and is not glycosylated. Of course, these examples are intended to be illustrative rather than limiting.
[0020]
In addition to prokaryotes, rodents such as yeast cultures and cells from multicellular organisms are also used. In principle, a culture of such cells can also be used. However, spinal cells are of most interest, and proliferation of spinal cells in culture (tissue culture) can be repeated ("Tissue Culture" Academic Press Edition, edited by Kruse and Patterson (1973)). Examples of these useful host cell lines include VERO and HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, W138, BHK, COS-7 and MDCK cell lines.
In general, plasmid vectors containing replication and control sequences from species compatible with the host cell are used in conjunction with these hosts. This vector usually encodes a protein that can provide expression type selection to the replication site and to the transformant cell. Has an array. For example, E. coli is transformed with pBR322, a plasmid derived from E. coli (Mandel, M. et al. (1970) J. Mol. Biol.53154). Plasmid pBR322 contains ampicillin and tetrathicycline resistance genes, thus providing an easy selection tool. A preferred vector is pBO475, see Example 1. This vector contains phage and E. coli replication origins that allow transfer between hosts, thereby facilitating mutagenesis and expression.
“Expression vector” means a DNA construct comprising a DNA sequence operably linked to a suitable control sequence that allows expression of the DNA in a suitable host. These control sequences include a promoter that allows transcription, an operator sequence that controls such transcription, a sequence that encodes an appropriate mRNA ribosome binding site, and a sequence that controls termination of transcription and translation. The vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector replicates and functions independently of the host genome or, in some cases, integrates into the genome itself. In the present specification, “plasmid” and “vector” are often used synonymously because plasmid is the most commonly used vector at present. However, the invention also encompasses other forms of expression vectors that function similarly and are well known in the art.
[0021]
The term “functionally linked” when describing the relationship between two DNAs or polypeptides means that they are functionally related to each other. For example, the pre-sequence is operably linked to the peptide if it functions as a signal sequence in the process of secreting the mature form of the protein, possibly by cleavage of the signal sequence. A promoter is operably linked to a coding sequence if it controls transcription of that sequence. A ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is in a position that allows translation.
Once the polypeptide has been cloned, site-directed mutagenesis of the cloned parent DNA (Carter, P. et al. (1986) Nucl. Acids Res.134331; Zoller, M. J. et al. (1982) Nucl. Acids Res.106487), cassette mutagenesis (Wells, J. A. et al. (1985) Gene.34315), restriction selective mutagenesis (Wells, J. A. et al. (1986) Philos, Trans. R. Soc. London Ser A,317415) or other techniques are used to create a “segment replacement DNA sequence that encodes an amino acid sequence change defined by a similar segment. When operably linked to an appropriate expression vector, a segment replacement poly sequence is generated. In some cases, the recovery of the parent polypeptide or segment-corrected polypeptide can be accomplished from the expression host by using an appropriate signal sequence that is operably linked to the DNA sequence encoding the parent polypeptide or segment-corrected polypeptide. These techniques are well known in the art and, of course, alternative methods for the production of those polypeptides and segment-substituted polypeptides, such as in vitro chemical synthesis of the desired polypeptides. Can also be used (Barany, G. etc. 1979) "peptide" (E. Gross (Gross) and J. Mei en Fraunhofer (Meienhofer) ed.) Academic Press edition, N. Y. 2, pp. 3-254).
[0022]
Once various segment-substituted polypeptides are produced, they are brought into contact with the target substance, and if there is an interaction between the target substance and each segment-substituted polypeptide, it is measured. These activities for the same target substance are compared with those of the parent polypeptide. If the analog has a different activity with respect to the target substance compared to the parent polypeptide, it is presumed that those segment-substituted polypeptides contain similar segments that define the active domain in the parent polypeptide .
If an analog has more activity than the parent polypeptide, multiple segment-substituted polypeptides may exhibit increased activity with respect to the target substance. In such cases, appropriate regions of the parent polypeptide that can be modified to increase activity with respect to the active domain of the analog and its target substance can be effectively identified. Such an event is likely to occur when the region of the analog involved in its interaction with the target is present primarily within one continuous amino acid segment. If the “active domain” of the analog is included in a discontinuous region of the analog amino acid sequence, the increased activity must simultaneously introduce all active domains from the analog into the segment-substituted polypeptide. An increase in the activity of the replacement polypeptide is unlikely.
Therefore, it is preferred that the analog has a smaller activity on the target substance than the parent polypeptide. In such cases, there is a loss of activity in the segment-substituted polypeptide. However, once an active domain in a parent polypeptide is determined, the polypeptide can replace such active domain sequentially or simultaneously to a second parent that lacks the activity of the first parent polypeptide with respect to the target substance. It can be used as an analog that is a polypeptide.
[0023]
The active domain in the polypeptide is identified by comparing the activity of the segment replacement polypeptide with respect to the target substance to that of the parent polypeptide. Although many analytical measurements are possible, for non-catalytic binding of the target substance, it is easy to compare the dissociation constant Kd of the complex formed between the segment-substituted polypeptide and the target substance with the Kd of the parent polypeptide 1 One. An increase or decrease in the Kd value of about 1.5, preferably about 2.0 per similar substituted residue due to segment substitution indicates that the substituted segment is the active domain of the interaction between its target substance and the parent polypeptide. . A suitable parameter for measuring activity against the parent enzyme in the case of catalytic interaction with the target substance is to compare the Kcat / Km ratio. An increase or decrease in the Kcat / Km value of about 1.5, preferably 2.0, per substitution-like residue relative to the parent enzyme indicates substitution of the active domain.
As used herein, a “scanning amino acid” is an amino acid that is used to identify an active amino acid within a parent polypeptide. A “residue substitution polypeptide” is a polypeptide variant that contains at least a single substitution of an amino acid in a parent polypeptide with respect to the scanning amino acid. A “residue replacement DNA sequence” encodes a residue replacement polypeptide. Such DNAs and polypeptides are prepared as described in the preparation of segment substituted DNAs and polypeptides.
The “active amino acid residue” identified by the amino acid scan is generally in direct contact with the target substance. However, the active amino acid can be other residues or H₂ Small molecules such as O or Na⁺ , Ca⁺², Mg⁺²Or Zn⁺²In some cases, the target substance may be contacted indirectly via a salt bridge formed by an ionic species such as.
In some cases, the scanning amino acid is replaced with an amino acid identified in the active domain of the parent polypeptide. In general, many residue-substituted polypeptides are prepared, each containing a single substitution of a scanning amino acid at various amino acid residue positions within the active domain. The activity of such residue substitution polypeptides for a particular target substance is compared with the activity of the parent polypeptide to determine the amino acid residues in the active domain that are involved in the interaction with the target substance. The scanning amino acids used in such analyzes are amino acids that are different from the substituted ones, ie the other 19 natural amino acids.
[0024]
[Table 2]

[0025]
This table uses the following symbols for each amino acid:

[0026]
If there is an effect on the activity of the residue substitution polypeptide, it can be systematically attributed to the change of the natural amino acid residue to a uniform scanning amino acid residue, so that the scanning amino acid replaces each residue Most desirably it is the same as the polypeptide.
In some cases, a scanning amino acid substitution at one or more residues results in a residue-substituted polypeptide that is not expressed at a level that allows isolation of a sufficient amount to perform activity analysis on the target substance. In such a case, various amino acids, preferably isosteric amino acids are used.
The most preferred scanning amino acids are relatively small neutral amino acids. Such amino acid residues include alanine, glycine, serine and cysteine. Alanine is a preferred scanning amino acid in this group because it does not have a side chain protruding from the beta carbon, and the residue-substituted polypeptide backbone structure is unlikely to change. Alanine is also preferred because it is the most common amino acid. In addition, it exists in both buried and exposed forms (Creighton. TE, “Protein” (WH Freeman Edition, NY); Chothla, C. (1976) J. Mol. Biol.1501). If an alanine substitution does not yield an appropriate amount of a residue-substituted polypeptide, an isosteric amino acid is used. The following amino acids are used in order of decreasing preference: Ser, Asn and Leu.
The use of scanning amino acids is not limited to the identification of active amino acids in the active domain confirmed by analysis of segment-substituted polypeptides. For example, if one or more amino acids in a parent polypeptide are known or thought to be involved in an interaction with a target substance, search for that residue and its surrounding amino acid residues. Scanning amino acids can be used. Furthermore, if the parent polypeptide is a small peptide, ie about 3-50 amino acid residues, a scanning amino acid analysis can be performed across the entire molecule.
[0027]
Once an active amino acid residue is identified, it is replaced with an isosteric amino acid. This isosteric substitution need not be made in all cases, but before the active amino acid is identified. This isosteric amino acid residue is made to minimize the potential disruptive effect on the structure where several substitutions can occur. The isosteric amino acids are shown in Table II.
Active amino acid residues can be identified by comparing the activity of the residue-substituted polypeptide with respect to the target substance to the parent polypeptide. In general, a two-fold increase or decrease in the Kd value indicates that the substituted residue is active in the interaction with the target substance. Similarly, in the case of catalytic interaction with the target substance, a two-fold increase / decrease in Kcat / Km value relative to the parent enzyme indicates substitution of the active residue.
When a putative or known active amino acid residue is subjected to scanning amino acid analysis, the amino acid residue adjacent to that residue should be scanned. The result is a 3-residue substituted polypeptide. One contains a scanning amino acid, preferably alanine, at site N, which is a putative or known active amino acid. The other two contain scanning amino acids at sites N + 1 and N-1. If each substituted polypeptide has an effect of about twice or more on the Kd or Kcat / Km value for the target substance, the scanning amino acid is substituted at sites N + 2 and N-2. This is repeated until at least 1, preferably 4 residues are identified in both directions that have an effect on the Kd or Kcat / Km value of less than 2 times, or until the end of the parent polypeptide is reached. . In this way, one or more amino acids can be identified along a contiguous amino acid sequence that is relevant for reciprocal use with a particular target substance.
[0028]
The methods of the invention are used to detect active domains for one or more target substances of a particular parent polypeptide. In addition, active amino acids within the various active domains are also identified by this method. Once two or more active domains and active amino acid residues have been identified for various target substances of a particular polypeptide, various modifications are made to its parent polypeptide to produce the polypeptide and one or more targets. The interaction between substances can be modified. For example, two active domains on the hGH surface have also been identified for somatogenic and prolactin receptors. In other special cases, the active domains overlap. There are therefore many common active amino acid residues that interact with somatogenic and prolactin receptors. Various modifications to the hGH are made based on information described in more detail below. In some cases, the active domains for different target substances do not overlap. In this situation, the modification of the active amino acid in the parent polypeptide for one receptor is performed by substitution with various amino acids, so that the interaction of the active domain with its target substance is reduced or increased, and variants thereof Physiological action of will change.
As used herein, “interaction change” refers to a polypeptide variant in which one or more active domains are modified and the interaction between the target substance and its variant is altered compared to the parent polypeptide. Used. An interaction change is defined by an increase or decrease in the interaction of the polypeptide variant by at least a factor of 2 compared to the interaction between the parent polypeptide and a specific target substance.
[0029]
  The interaction of the target substance with the parent polypeptide, polypeptide variant, segment-substituted polypeptide and / or residue-substituted polypeptide can be measured in a convenient assay in vitro or in vivo. In vitro assays are used to measure detectable interactions between target substances and polypeptides, such as enzymes and substrates, hormones and hormone receptors, antibodies and antigens. Such detection includes color change, radioactive change, solubility change, gel electrophoresis and / or measurement of molecular weight change by gel exclusion. In vivo assays include, but are not limited to, those that detect physiological effects such as weight changes, changes in electrolyte balance, changes in clotting time, changes in clot degradation, and induction of antigenic responses. Do not mean. In general, an in vitro assay is used as long as there is a variable parameter that measures the interaction change between the target substance and the target polypeptide.
  Examples of the present invention include embodiments in which the active domain and active amino acids of the hormone that determine the activity of the hormone with respect to the somatogenic receptor for human growth hormone are identified. When practicing this aspect of the invention, segment substitutions and residuesReplaceHuman growth hormone mutants, including hGH mutants, are prepared or identified that have growth hormone binding interactions with somatogenic receptors that differ from natural human growth hormone. At least one of these human growth hormone variants has a higher affinity for the somatogenic receptor and a higher capacity for rat somatogenesis. Others have low activity on somatogenic receptors. Such hGH variants are useful as hGH agonists or antagonists, and these variants interact with somatogenic receptors.SubstantialIt has a higher ability to stimulate other receptors for human growth hormone due to the lack of interaction. In addition, these variants are also useful in hGH immunoassays as hGH standards or tracers. For example, another variant has been identified that is significantly less reactive with human and mouse sera, including anti-hGH polyclonal antibodies, but has the same binding affinity for somatogenic receptors as hGH, but is more capable of stimulating growth. There is something expensive.
[0030]
A method for measuring the active domain of human growth hormone that interacts with liver-derived somatogenic receptors is shown in FIG. In this method, segments of hGH were systematically replaced with similar sequences from hGH analogs known to have very low affinity for the cloned hGH liver receptor and monoclonal antibodies to hGH. Such hGH analogs include human placental lactogen (pPL), porcine growth hormone (pGH) and human prolactin (hPRL). These analogs have a binding affinity about 100 to 10,000 times lower for cloned hGH receptors compared to somatogenic hGH receptor (hGHr) (Harrington, AC et al. (1986) J. Clin. Invest.771817; Baumann, G., et al. (1986) J. Clin. Endocrinol, Metab.62137).
These analogs are used because homologous proteins are known to have a similar three-dimensional structure even when they have large sequence diversity (Chothia, C. et al. (1986) FMBO J.5823). Doing so increases the likelihood that similar sequence substitutions can be easily applied without significantly destroying the original structure of the molecule. The amino acid sequences of human growth hormone and its analogs hPL, pGH and hPRL are shown in FIG. Of these, the last three analogs share sequence identity with hGH at levels of 85%, 68% and 23%, respectively.
Referring to FIG. 1, a full strategy for identifying one or more active domains in human growth hormone that interact with a somatogenic receptor for human growth hormone (a “standard” for hGH) is shown. As shown, hGH has a positive binding activity for the target receptor, in this case the somatogenic receptor. However, hPRL, hPL and pGH analogues are markedly less active with respect to their target substances, as indicated by the minus sign. Six segment-substituted growth hormones, indicated by letters A through F, generate selected amino acid segments of hGH by substitution with similar amino acid segments of hPRL analogs. Each of these selected segments is different from each other and is selected to explore regions that are expected to contain the entire amino acid sequence or active domain of hGH. After the preparation of segment-substituted human growth hormone, an assay for each hGH somatogenic receptor is performed to determine its activity. These results compared to hGH are indicated by a + or − symbol under the segment modified human growth hormone in FIG. As can be seen from FIG. 1, the segment-substituted human growth hormones C and F in this figure do not bind to somatogenic receptors. Based on these results, the region in growth hormone corresponding to a similar segment from the analog in growth hormone variants C and F is identified as the active domain for somatogenic receptor binding of hGH.
[0031]
As indicated, if there is structural information or other data, it is not necessary to test the entire amino acid sequence of human growth hormone or other parent polypeptides. Thus, low or high resolution information from crystallography can provide important information to avoid destabilizing substitution of amino acid segments selected from analogs. For example, the x-ray coordinates of human growth hormone are not available, but the helix projections from the pGH structural model based on the low-resolution X-ray crystal structure of pGH are 3 of 4 helices (helix 1, 3 and 4) It was revealed that it is amphiphilic with a strong hydrophobic moment. See FIG. Elsenberg, D. et al. (1984) J. Mol. Biol.179125. Since the hydrophobic core in polypeptides is very dense (Ponder, J. W. et al. (1987) J. Mol. Biol.193775), changes in their buried amino acid residues generally lead to destabilization (Alber, T. et al. (1987) Biol. Chem.263754; Reidhaar-Olson, J. F. (1988) Science.24153).
Furthermore, it is not necessary to at least first examine regions in which amino acids in a group of polypeptides such as human growth hormones are very well conserved. This is because such destruction of the conserved sequence is thought to destroy the structure of the molecule. Still other data may indicate that certain regions of the parent polypeptide are not involved in interaction with a particular target substance. For example, deletion of 13 amino acids at the N-terminal of hGH by mutagenesis (Ashkenazi, A. et al. (1987) Bndocrlnology)121414) and hGH neutral mutants lacking residues 32-46 (20 Kd mutant; Lewis, U. J. et al. (1980) Biochem. Blophys. Res. Commun.925111) have not been reported to significantly affect the binding to somatogenic receptors. Furthermore, the production of a double-stranded derivative of hGH by restriction protein degradation lacking some or all of the residues between residues 134 and 149 also did not significantly affect binding to the somatogenic receptor. Li, C. H. (1982) Mol. Cell. Biochem.4631; Mills, J. B. et al. (1980) Endocrinology107391.
[0032]
Based on this information, six segments of the amino acid sequence of hGH were chosen for replacement with corresponding similar amino acid segments from many hGH analogs. These selected segments correspond to C through F in FIG. These segments were previously identified as not involved in disulfide bonds, secondary structure boundaries (see Figure 4), regions of sequence highly conserved in growth hormone groups, or their binding to somatogenic receptors. Separated by area. Seventeen segment-substituted hGH variants were prepared that collectively substituted 85 of the 191 residues of hGH. The regions assigned to A to F in FIG. 2 and hGH mutants in which the segments in each region are replaced are summarized in Table III.
[0033]
[Table 3]

[0034]
1 / Restriction selection-Wells, J. A. et al. (1986)
Philos. Trans. R. Soc. London Ser A317, 415.
2 / Cassette mutagenesis-Wells, J. A. et al. (1985)
Gene34315.
3 / Recombinant mutagenesis-Gray, G. L. et al. (1986)
J. Bacteriol.166, 635.
[0035]
In general, segment-substituted hGH variants are determined by similar segments that are substituted into human growth hormone sequences. However, in some cases, not all of the similar residues in a substituted similar segment are maintained in the construct. Thus, hPL (12-25) in Table III is a segment-substituted hGH variant in which amino acids 12-25 of human placental lactogen (hPL) are replaced with amino acid residues 12-25 of the parent hGH. The effect of replacing this similar segment can be determined by comparing the amino acid sequences of hGH and hPL in this region of FIG. The hPL (12-25) mutant has 4 amino acid substitutions but no change. These residues in the case of hPL (12-25) are 12, 16, 20 and 25.
The actual amino acid substitutions in the hPL (12-25) mutant and other segment substitution mutants are shown in Table III. Each substitution is represented by a letter before and after the number. The first letter and number indicate the amino acid at the residue number of unmodified hGH. The last letter indicates the amino acid substituted at that position. Therefore, N21H indicates that the 12th asparagine of hGH has been replaced with histidine in the hPL (12-25) mutant.
Thus, some of the actual substitutions that have been introduced do not correspond to the substitutions indicated by the corresponding segments in FIG. Thus, hPL (12-25) has four substitutions N12H, R16Q, L20A and F25 when all hPL (12-25) segments are replaced.IWill be included. However, the actual mutant retains R16 and L20, and the substitutions introduced are two of the four substitutions as shown in Table III, namely N12H and F25.IOnly. Other segment substitution variants that maintain one or more residues of the parent hGH include those containing regions A and E and segment substitution variants hPL (46-52) and pGH (167-181).
[0036]
  Each segment-substituted human growth hormone variant was cloned from the extracellular region of the cloned soluble hGH receptor.( ¹²⁵ I)The in vitro system with hGH substitution was used to quantify the relative affinity of the segment substitution mutant for its somatogenic receptor. Leung, D. W. et al. (1987) Nature330,537. This truncated somatogenic receptor has a slightly lower binding affinity (Kd-0.3 nM) than the membrane receptor, but exhibits similar activity (Spencer, SA et al. (1988) J. Biol. Chem. .2637862).
  As described in detail in the Examples, selected segments A, C, and F, which contain residues 11-19, 54-74, and 164-191, respectively, are the active domains of hGH molecules that interact with somatogenic receptors. This is based on the fact that Kd values of more than 10 times were observed for most segment-substituted hGH variants, including similar segments of hGH analogs in these regions. See FIG. Of course, this does not mean that each amino acid residue in these active domains is a binding residue of the somatogenic receptor. Rather, these domains define amino acid sequences from which such active residues can be found. In addition, the positions of active domains A, C and F were determined. For example, mutant hPRL (12-33) was split into amino acid and carboxy terminal mutants hPRL (12-19) and hPRL (22-33). The results of this experiment narrowed the active domain of hGH to residues 12-19. Similarly, the amino terminal region of region F (pGH (167-181)) showed a marked decrease in binding affinity. The most striking effect was 30 times smaller than the binding of hPL (56-64) in which only two mutations E56D and R56M were introduced. Regions A, C and F are very distant on the primary sequence of hGH, but the tertiary structure of the hormone makes them very close together. See FIG. These active domains form a batch containing the amino terminus of helix 1 (active domain A), the loop from Cys-53 to the start of helix 2 (active domain C) and the central region of helix 4 (active domain F). Yes.
[0037]
In addition, 8 Mabs against hGH were assayed against segment-substituted hGH mutants to map the epitopes of hGH. In addition, the Mabs were used in competition assays using hGH and hGH mutants to assess the ability of each Mab to inhibit hGH receptor binding to hGH.
Combined with these experimental results, evidence that substitution of similar segments to hGH does not significantly disrupt the original structure of the molecule and the observed activity is due to direct effects on the interaction between somatogenic receptors and receptor-substituted hGH mutants. Provides some evidence that First, segment substitution mutants are very selective with respect to breaking their binding to somatogenic receptors or Mabs. Second, somatogenic receptors and Mabs recognize structures as well as sequences. The receptor and at least four Mabs recognize the protein tertiary structure sensitive discontinuous epitopes. Third, the circular dichroic spectra of all purified mutants are actually the same as wild type hGH. Fourth, with the exception of pGH (164-190), in vivo protein degradation resistance, which is expressed in essentially the same amount as that of the wild type, is used for screening for structural integrity. Hecht, M. H., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Scl. USA815585; Shortle. D. et al. (1985) Genetics110539
Changes in the binding activity of segment-substituted hGH mutants do not necessarily indicate that the substituted residues in those mutants are in direct contact with the somatogenic receptor. Destructive mutations not only eliminate favorable interactions, but also induce inconveniences. For example, the N12R variant in the hPL (12-19) segment substituted hGH variant not only changes the hydrogen-bonding amide group of Asn12, but Arg substitution introduces a larger positively charged side chain. In addition, more binding contacts are conserved between the analogs so that some, if not all, contacts can be explored with segment-substituted hGH variants.
[0038]
In order to identify specific active amino acids within the active domains A, C and F of FIG. 2, a detailed structural analysis of these active domains was performed. In this analysis, the residues of these three active domains were replaced with alanine in order. 63 single alanine mutants were made and the binding constant for each soluble hGH receptor (shGHr) was measured. Leung, D. W. et al. (1988) J. Biol. Chem.2637862.
Based on this analysis, the amino acid residues listed in Table IV constitute residues within the hGH molecule that are active for interaction with somatogenic receptors. This is based on the fact that the relative dissociation constant induced by alanine substitution of those residues is more than 4 times that of wild-type hGH. See FIG.
Amino acid substitutions of these residues that are preferred for making hGH variants are shown.
[0039]
[Table 4]

[0040]
Other amino acid residues that are not very active against somatogenic receptors
It is shown in Table V. In general, these residues show a relative Kd increase of less than 2-fold when substituted with alanine.
[0041]
[Table 5]

[0042]
Table VI lists the amino acid residues in hGH that relatively decrease in Kd value when substituted with alanine (ie, exhibit greater affinity for somatogenic receptors).
[0043]
[Table 6]
              Table VI
P2 E65 S184
T3 Q69 E186
L9              L73 S188
H18 R167 F191
R64 E174
[0044]
The single residue substituted hGH mutant, E174A, surprisingly has a significant (approximately 5 fold) decrease in the dissociation constant for the somatogenic receptor. In addition to showing binding affinity for the somatogenic receptor, this mutant showed increased somatogenic capacity compared to hGH in rat body weight assays. Other specific residue substitutions showing this substitution and a 1.4-fold increase in somatogenic binding are shown in Table VII.
[0045]
[Table 7]

[0046]
Other mutants containing alanine substitutions not shown in FIG. 7 are listed in Table VIII.
[0047]
[Table 8]

[0048]
Note: NE--not expressed enough to be easily isolated in shake flasks (ie less than about 5% of wild-type expression level)
After identification, analysis is performed by substituting the active amino acid residues for the somatogenic receptor in hGH with various amino acids other than the scanning amino acids performed in the preliminary analysis. Table IX shows the residue substitution mutants.
[0049]
[Table 9]

[0050]
Note: NE-Not expressed to a level that can be easily isolated in shake flasks
(Ie, about 5% or less of the wild type expression level)
In addition to the prepared hGH variants, Table X shows the specific amino acid residues in hGH and the substituted amino acids that are expected to produce variants with altered biological function.
[0051]
[Table 10]

[0052]
In another embodiment, the binding epitope of hGH for the prolactin receptor was determined. hGH can bind to both growth hormone and prolactin (PRL) receptors. As shown herein, these receptors compete with each other for binding to hGH, indicating that their binding sites overlap. Scanning mutagenesis data show that the epitope of hGH for the hPRL receptor is center part of helix 1 (including residues Phe25 and Asp26), loop region (including Ile58 and Arg64) and central region of helix 4 (residues K168, K172) , E174 and F176). These residues form a batch when making a structural model map of hGH. This combined batch is described herein and B.I. C. Cunningham and J.M. A. Overlapping but not identical to that determined for the hGH receptor published by Wells (1989) Sccince 244, 1081-1085). By mutating non-overlapping regions of these receptor binding sites for hGH, the selectivity of hGH is 2000 times or more to the hGH receptor side or 20 times to the PRL receptor side without losing the binding affinity to each receptor. Shifted above. Similarly, mutations in the overlapping region can reduce binding to both receptors simultaneously by more than 500-fold. Such receptor-selective mutants of hGH represent useful molecular probes that link various biological activities of hGH such as linear growth or lactation with specific receptor binding events.
[0053]
In another embodiment, the receptor binding determinant of human growth hormone (hGH) was placed in the normal unbound analog, human prolactin (hPRL). This specification and Cunningham, B. C. and Wells, J. A. ((1989) Sceince244, 1081-1085), alanine scanning mutagenesis has identified key residues in hGH that regulate binding to hGH receptors cloned from human liver. Another mutation from hPRL was introduced into hGH, revealing that hPRL substitution within the hGH receptor binding site almost destroys the binding ability. The hPRL cDNA was then cloned and expressed in E. coli. Then, substitutions from hGH, which seem to be very important for receptor binding, were introduced sequentially to cause mutations. After 7 site-directed mutagenesis iterations, hPRL variants were identified that contained 8 mutations whose association constants were enhanced over 10,000 times that of the hGH receptor. This hPRL variant was only 6-fold weaker than the wild type, while the sequence identity with hGH was only 26%. These results show structural similarity with hGH and hPRL, confirming the identity of the hGH receptor epitope. More generally, these experiments readily borrow receptor binding from closely related and functionally diverse hormones that have been shown to be effective in designing hybrid hormones with new properties such as agonists or antagonists. It shows you can.
The following are examples and do not limit the scope of the present invention.
[0054]
【Example】
Example 1
hGH mutagenesis and expression vector
A synthetic hGH gene with 18 single restriction sites distributed evenly without changing the hGH coding sequence was made for efficient mutagenesis. This synthetic hGH DNA sequence was assembled by ligating seven synthetic DNA cassettes each overlapping by about 60 base pairs in length and a 10 bp overlap with a contiguous cassette to form a 405 bp DNA fragment clamped with NsiI to BglII. This continuous fragment was purified on a polyacrylamide gel and eluted from it by alkaline phosphatase promoter and Stll signal sequence (Chang, C. N. et al. (1987) Gene.55189), the cloned origin of the phage fl replication origin and pB0475 containing the region of pBR322 from bp 1205 to 4361 containing the replication origin and β-lactamase gene. This sequence was confirmed by dideoxy analysis (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.74, 5463).
PB0475 was constructed as shown in FIG. The fl-derived phage-derived DNA contained on the 475 bp long DraI, RsaI fragment was cloned into the single Pvu II site of pBR322 to create plasmid p652. Most tetracycline resistance genes are deleted by plasmid p652 by restriction digesting NheI and NarI, filling its sticky ends with DNA polymerase and dNTPs, and ligating the larger 3850 bp fragment itself. Δ652 was constructed. pΔ652 was cleaved with EcoRI and EcoRV, and the 3690 bp fragment was phGH4R containing the alkaline phosphatase promoter, ST II signal sequence and neutral hGH gene (Chang, C. N. et al. (1987) Gcnc.55189) -derived 1300 bp EcoRI and EcoRV fragments were ligated. This construct was named pB0473. Synthetic DNA was cloned into pB0473 in three ways. The vector pB0473 was digested with NsiI, GglII and both were ligated to the 240bP NsiI, HindIII fragment and 1170bP HindII, BglII fragment derived from synthetic DNA. This construct, pB0475, contains DNA encoding the neutral polypeptide of hGH, but has many new single restriction sites that allow mutagenesis and subsequent manipulation of the hGH gene. The complete DNA sequence of pB0475 along with the hGH amino acid sequence is shown in FIG. A single restriction site within the hGH sequence in pB0475 allows for the insertion of a mutagen cassette containing DNA sequences encoding similar segments from the analogs pGH, hPL and hPRL (Wells, JA et al. (1985) Gene34315). Separately, the hGH sequence was modified by site-directed mutagenesis of the single-stranded vector pB0475, followed by restriction selection for one of the single restriction sites (Wells, JA et al. (1986) Philos. Trans. R. . Soc. London Ser A317415)
[0055]
Seventeen segment-substituted hGH variants listed in Table III were prepared. Each was secreted into the periplasmic space of E. coli at levels similar to wild-type hGH and well beyond the hGH-hGH hybrid described below. hGH and hGH mutants were expressed in E. coli W3110, tonA strain (ATCC 27325) grown in low phosphate minimum media (Chang, C. N. et al. (1987) Gene55189).
hGH and hGH variants were purified as follows. Four volumes (800 ml) of 10 mM Tris (pH 8.0) was added to 200 g of the cell pellet. The mixture was shaken on a shaker at room temperature until the pellets were dissolved. The mixture was homogenized and stirred for 1 hour in a cold room, and then centrifuged at 7000 g for 15 minutes. The supernatant was decanted and ammonium sulfate was added (277 g / liter) to 45% saturation and stirred at room temperature for 1 hour. After centrifugation at 11000 g for 30 minutes, the pellet was suspended in 40 ml of 10 mM Tris (pH 8.0). The solution was dialyzed overnight against 2 liters of 10 mM Tris (pH 8.0) and the sample was centrifuged or filtered through a 0.45 micron membrane. The sample was then applied to a 100 ml DEAE cellulose (First Flow, Pharmacia) column. The column was eluted using a gradient from zero to 300 mM NaCl in 10 mM Tris (pH 8.0) 8-10 times the column volume. The GH fraction identified by PAGE was collected and dialyzed overnight against 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). This sample was concentrated to approximately 1 mg / ml by Centri-Prep 10 ultrafiltration.
[0056]
Example 2
hGH and homologous recombinants of hGH
Random hybrid libraries containing various lengths of the N-terminal region of hGH linked to the C-terminal region of porcine growth hormone were constructed by random recombination of genes linked in series. Gray, G. L. et al. (1986) J. Bacteriol.166635.
The EcoRI site of pB0475 was removed by EcoRI restriction of the plasmid, the sticky ends were filled by adding DNA polymerase and dNTP, and then this plasmid was ligated. Next, a new EcoRI site was introduced just before the 3 'end of the hGH gene. This is a 345 bp BglII, EcoRV fragment of hGH-4R containing the EcoRI site.^- This was done by subcloning into a similar restriction letter derived from the construction of pB0475. Then the pGH gene (Seeburg P. H. et al. (1983) DNA237) was introduced immediately after the 3 'end of the hGH gene of this construct. This was done by introducing the EcoRI, Hind III (packing) fragment containing the pGH cDNA into the larger fragment of the EcoRI, EcoRV digest of the construct described above. This plasmid pB0509 contains the original hGH gene with a single EcoRI site at the 3 'end and the original pGH gene followed in the same direction. Because of the homology between the hGH gene and the pGH gene, part of pB0509 is E. coli rec⁺ When transformed into MM294 (ATCC 31446), in vivo recombination occurs resulting in a hybrid hGH / pGH. These recombinants were concentrated by constraining the collected DNA with EcoRI and linearizing plasmids that had not undergone recombination to lose the EcoRI site. 2 restriction selections and E. coli rec⁺ After transformation into MM294, almost all clones became hybrid hGH / pGH recombinants. Sequence analysis of 22 clones showed that the hGH / pGH hybrid contained an amino terminal hGH sequence followed by pGH sequences starting at amino acid residues +19, +29, +48, +94, +105, +123 and +164.
[0057]
Seven hGH-pGH hybrids with crossover points evenly distributed in the hGH gene were obtained. However, only the extreme carboxy-terminal hybrid (hGH (1-103) -pGH (164-191)) was secreted from E. coli at levels sufficient for purification and analysis. This hGH-pGH hybrid introduces three substitutions (M170L, V173A and V180M) present on the hydrophobic face of helix 4. Therefore, most of the sequence changes in helix regions A, D, E and F in FIG. 2 were designed to avoid mutation of residues on the hydrophobic face of the helix. For example, the hybrid hGH-pGH mutant described above was modified to maintain M170, V173, F176 and V180. This is because these residues are present on the hydrophobic surface of helix 4.
[0058]
Example 3
Expression and purification of soluble human growth hormone receptor from Escherichia coli.
A cloned DNA sequence encoding the soluble human growth hormone receptor shGHr (Leung, D. W. et al. (1987) Nature330537) was subcloned into pB0475 to create pJI466 (see FIGS. 11 and 12).
Vector pC1S, 2SHCHR (Leung, D. W. et al. (1987) Nature330537) was digested with XbaI and KpnI and a 1.0 bp fragment encoding the secretion signal of hGH and the extracellular region of the 246 codon was purified (Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. Lab Riley, NY). This fragment was ligated to similarly cut M13mp18, and single-stranded DNA was purified for the recombinant (Messing, J. (1983) Methods in Enzymology. Vol. 101, p. 20). Site-directed mutagenesis (Carter, P. Volume (1986) Nucleic Acids Res.134331) was performed with 18mer. Digigonucleotide 5'-A-AGT-AGT-GCA-TTT-TCT-GG-3 ', and NsiI was introduced at codon +1. Mutated sequences were analyzed by dideoxy sequencing (Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463). Mutant double-stranded DNA was purified and cut with NsiI and SmaI. A 900 bp fragment containing the 246 codon extracellular region of the hGH receptor was isolated. pB0475 was cut with NsiI and EcoRV and a 4.1 kb fragment (which lacks the synthetic hGH gene) was purified.
The 900 bp fragment and 4.1 kb vector fragment of the receptor were ligated and the recombinant clone (pJ1446) was confirmed by restriction map. This was transformed into E. coli KS303 (transformed (Struch, K. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA).851576), and then grown at 30 ° C. in a low phosphate medium (Chang, C. N. et al. (1987) Gene 55, 189). The receptor fragment protein was purified by hGH affinity chromatography (Spencer, S. A. et al. (1988) J. Biol. Chem.2637862; Leung D. W. et al. (1987) Nature.330537). The sequence of pJ1446 is shown in FIG. 12 along with the amino acid sequence of the cloned receptor.
[0059]
E. coli W3110, deg P strain (strauch, K. L. et al. (1988) PNAS USA851576) with pJ1446 and fermenter medium low phosphate medium (Chang, C. N. et al. (1987) Gene.55189) and grown at 30 ° C. Preliminary data were taken using 246 amino acids of hGHr. A slightly shorter hGHr containing amino acids 1-238 was used in Example 1 herein. The results obtained for this receptor were indistinguishable from the values obtained with 246 amino acids hGHr.
In order to avoid the problem of carboxyl terminal heterogeneity, a plasmid phGHr (1-238) was constructed in which a stop codon was inserted after Gln238. KS330 cultures containing phGHr (1-238) produced slightly higher yield and more uniform protein binding than cultures containing phGHr (1-246) (data not shown). Starting with a wet pellet of 0.2 kg cell pellets, 20-40 mg of high purity bound protein was routinely isolated in 70-80 percent yield (from 2 liters of high density cell culture). Peptide mapping combined with N-terminal sequencing and mass spectral analysis confirmed that the product spanned residues 1 to 238.
Oligonucleotides for site-directed mutagenesis of the phGHr (1-246) template

(Carter, et al. (1986) Nucleic Acids Res.13, 4431-4443) phGHr (1-240, C241R) was made (where the asterisk indicates a mismatch with phGHr (1-246), the underline is a new single MluI site, and CGT-TAG is a C241R mutation. And the subsequent stop codon (Table X).
[0060]
[Table 11]

* Indicates a mismatch with the wild-type template.
[0061]
Restriction selection of plasmid phGHr (1-238) against the MluI site (Table X (A)) (Wells, et al. (1986) Phil Trans. R. Soc. Lond. A.317, 415-423) by site-directed mutagenesis of the phGHr (1-240, C241R) template. In short, oligonucleotides

Introduced a translation stop codon after Gln238 (CAA triplet) and corrected the MluI restriction site (underlined). Double stranded DNA was recovered from the initial transfection with heteroduplexes and then retransformed to enrich for the desired phGHr (1-238) plasmid prior to DNA sequencing.
It was confirmed by DNA sequencing that the hGH binding protein finally cloned into phGHr (1-238) contains a T51A mutation that gives rise to cDNA variants or cloning artifacts. The A51T revertant is therefore identical to the reported sequence. (Leung et al. (1987) Nature (London)330537-543. The purification and binding of proteins containing Thr or Ala at site 51 cannot be distinguished (data not shown). The Ala51 binding protein variant was selected for all subsequent analysis as it was characterized. To compare the specificity of the natural product isolated from human serum with the recombinant hGH-binding protein from E. coli, the affinity of wild type and various hGH variants was determined.
[0062]
[Table 12]

a. Kd values and their standard deviation (SD) were determined by competitive binding analysis (FIG. 24) using wild type hGH (wt) and a number of hGH variants.
b. Reduction of binding affinity calculated from the ratio of the dissociation constants of hGH variant and wild type hGH (wt) for each hGH binding protein.
c. Ratio of dissociation constants of two hGH binding proteins of a given hGH type.
[0063]
Both proteins formed a specific stoichiometric complex with hGH (FIG. 24). As can be seen, the affinity of wild-type hGH and its mutants was approximately the same between the two binding proteins (above, right column). Recombinant hGH binding protein has a much higher affinity than neutral protein from human serum. This reflects the purity and homogeneity of the recombinant protein. Both proteins have the same specificity as shown by changes in binding affinity for the four alanine mutants of hGH that disrupt the binding ability to the hGH binding protein (described above for Kd (mutant) / Kd (wt The affinity of hGH up to and including Tyr246 (Kd = 0.36 ± 0.08 nM) is substantially the same as that ending after Gln238 (0.40 + 0.03 nM). This indicates that the last 8 residues, including the seventh cysteine of the molecule, are not important for hGH binding.
[0064]
Example 4
Receptor and monoclonal antibody binding assays
The purified hGH or hGH mutant (purity of 95% or higher) was assayed for binding to the soluble hGH receptor of Example 3. The concentration of purified hormone was quantified by laser densitometer scanning of combed-stained gel after SDS-PAGE. These values are determined by the absorbance at 280 nm (ε₂₃₀ ^1%= 0.93). The dissociation constant (Kd) binds to soluble hGH receptor at 25 ° C [¹²⁵I] Calculated from Scatchard analysis for competitive displacement of hGH. this〔 ¹²⁵I] hGH is Spencer, S. A. et al. (1988), J. Biochem.263, 7862).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to assay the binding of 8 monoclonal antibodies to various segment-substituted and residue-substituted hGH variants. The following Mabs were used.
[0065]

[0066]
Rabbit polyclonal antibody against hGH was affinity purified and coated at a final concentration of 2 μg / ml in 0.005 M sodium carbonate (pH 10), 24 ° C., 16-20 h microplate (Nunc plate, Intermed, Denmark). This plate was placed in buffer B (50 mM Tris [pH 7.5], 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide) 0.1 μg / ml of each hGH. And 25 ° C. for 2 hours. Plates were washed and incubated with indicated Mabs serially diluted in buffer B to 150-0.002 nM. After 2 hours, the plates were washed and assayed by staining with horseradish bar oxidase-conjugated anti-mouse antibody. The values obtained represent the concentration of each Mab required to give half the maximum amount of binding to each hGH variant.
Competitive displacement of hGH receptor from hGH by anti-hGH Mab was measured as follows. This assay was performed by immobilizing wild-type hGH on a microplate coated with anti-GH rabbit polyclonal antibody as described above. Receptor (fixed at 10 nM) and a given anti-hGH Mab (diluted in the range of 150-0.002 nM) were placed in hGH-coated microplates and incubated at 25 ° C. for 16-20 hours, after which unbound components were washed. . The amount of bound receptor was quantified by adding anti-receptor Mab conjugated to horse dish peroxidase that does not inhibit the binding of hGH to the receptor. The normalized displacement value was calculated from the ratio of the Mab concentration required to replace 50% of the receptor to half the Mab concentration required to saturate hGH on the plate. This value was used to compare the ability of each Mab to replace the receptor.
[0067]
Example 5
Active domain of somatogenic receptor binding
The 17 segment substituted hGH variants described in Examples 1 and 2 were assayed for binding to the soluble somatogenic receptor of Example 3 and the monoclonal antibody described in Example 4. The results of the binding assay for somatogenic receptors are shown in Table III. As can be seen, the segment substitutions that almost destroy the binding ability are those in regions A, C and F of FIGS. In addition, these regions were narrowed into smaller segments to determine the location of the active domain of the hGH molecule involved in binding to the somatogenic receptor. The most important results from Table III are shown in FIG. This figure is a bar graph showing the relative decrease in binding to soluble hGH receptors by substitution of similar sequences from analogs hPRL, hPL and bGH. Three active domain regions A, C and F were identified, each containing amino acid residues 12-19, 54-74 and 164-190. These regions are shown in the three dimensions of the hGH molecule in FIG.
As can be seen, the three active domains A, C and F are discontinuous in the amino acid sequence of hGH but form a continuous region in the molecular structure defining the somatogenic binding site for hGH.
[0068]
Example 6
hGH epitope mapping
The binding of 8 monoclonal antibodies to specific segment-substituted hGH variants is shown in Table XI.
[0069]
[Table 13]

[0070]
With the exception of the pGH (167-190) mutant, the disruption of the binding capacity for each monoclonal antibody is significant and very selective. Figures 13-20 show the location of the epitope for each Mab within the three-dimensional structure of hGH. FIG. 6 shows the epitope for the binding site for the somatogenic receptor.
For example, hPRL (88-95), hPRL (97-104), hPL (109-112) and hPRL (111-129) mutants do not bind to Mabl, but other segment substituted hGHs other than those regions are wild type It bound with the same efficiency as hGH. Binding to Mabs 2, 3, 4, 5 and 6 is discontinuous in the primary sequence but was inhibited by mutations in adjacent regions in the hormone three-dimensional structure (see FIGS. 6 and 14-19). . In contrast, Mabs 1, 7 and 8 were inhibited by mutations defined by sequential sequences as shown in FIGS. 13, 19 and 20. In addition, regions that inhibit the binding to a given monoclonal antibody were analyzed by subdividing specific segment-substituted hGH regions into subdomains or analyzing variants with common substitutions already bound to specific Mabs. For example, pGH (11-33) maintained strong binding to Mab4, but hPRL (12-33) lost binding ability. Thus, disruptive mutations in the hPRL (12-33) mutant may be limited to residues that are not mutated in pGH (11-33): N12, L15, R16, D26 and E30. Furthermore, the hPRL (12-19) mutant lost its binding ability but did not lose hPRL (22-23) (see FIG. 16), which is limited to N12, L15 and R16. This may explain the inhibition of binding to Mab4 since the N12H mutation is not a common mutation with pGH (11-33). This was tested with alanine substitution of Asn-12. Mab3 or Mab4 binding to N12A residue-substituted hGH mutants was reduced more than 100-fold, but binding to other Mabs was not affected.
[0071]
By using this set of hGH variants, it is possible to elucidate the epitopes of all these Mabs, even though the binding of most of the 8 Mabs was inhibited by a common set of mutations. For example, hPRL (12-19) does not show binding to Mabs 2, 3 and 4, but other mutants have shown that these Mabs recognize various structures. In particular, Mabs 2 and 3 were inhibited by pGH (11-33), but Mab 4 was not affected. Binding of Mabs 3 and 4 was inhibited by hPL (12-25), but binding to Mab 2 was not affected. Thus, 8 antibodies have overlapping but not completely overlapping epitopes. Mutations that disrupt binding are present in both the helix and loop and are always close in hormonal structure.
Taken together, the eight Mab sets of epitopes cover most of this hormone. However, there are still areas where Mabs do not bind. For example, 3 out of 20 mutants did not significantly disrupt binding to any of the tested Mabs (hPRL (22-33), pGH (48-52) and hPRL (126-136)).
There are significant differences between antibody epitopes and receptor binding sites. First, the batch defined by the inhibitory mutation is larger for the receptor than for any Mab. The second difference is that the receptor is more resistant to hormonal inhibitory displacement than Mab. This is about a 70-fold reduction in the maximum binding of any variant to the receptor, but almost all antibodies have a 1000-fold reduction in binding, as in the case of a single substitution such as N12A. There is at least one variant that occurs.
[0072]
Example 7
Competitive binding of Mab and shGHr
Many variants that disrupt receptor binding also disrupt the binding of one or more Mabs. Therefore, the ability of each of the 8 Mabs to inhibit hGH receptor binding to hGH was evaluated. The results of this test are shown in Table XII.
[0073]
[Table 14]

[0074]
As can be seen from the table, Mabs 5 and 6 are most efficient at inhibiting hGH receptor binding. This is due to the fact that their Mabs have rape up to residues 54-74 that closely overlap with the determinants for the receptor and antigenic determinants present in helix 4 (FIGS. 5, 6, 17, and 18). reference). Mab2 is then a competitive antibody and shares an inhibitory mutation in common with the receptor (hPRL (12-19)). In contrast, Mabs 3 and 4 are approximately 1000 times less competitive than Mab 2, but they also share an inhibitory mutation that overlaps with the receptor in helix 1. See FIG. 15 and FIG. If the mutation in helix 1 that disrupts Mabs 3 and 4 differs from the residue that disrupts binding to Mab 2 or the receptor, this apparent difference will be easily resolved. In fact, one variant (N12A) disrupts the binding of Mab3 or 4 without affecting the binding to Mab2 or its receptor.
Mab7 competes relatively strongly with its receptor for hGH and is inhibited by segment-substituted hGH variants that slightly perturb receptor binding such as hPL (46-52). Thus, Mabs 2 and 7 appear to be on the boundaries of the receptor binding site. Mabl and 8 were not given a detectable substitution of the receptor and as expected they do not contain antigenic determinants overlapping with the receptor. These competitive binding data strongly support the general location of the receptor binding site as shown in FIG. 5 along with direct epitope mapping data and receptor binding data.
[0075]
Example 8
Receptor active amino acid residues
Analysis of hGH in Examples 5, 6 and 7 contains the amino terminal region of helix 1 (residues 11-19) important for receptor binding. Residues 54-74 and 167-191 were also found to be important for receptor binding. The identification of amino acids in these domains active for receptor binding was performed by analyzing a total of 63 single alanine variants. See Tables XIII, XIV, and XV.
[0076]
[Table 15]

[0077]
[Table 16]

[0078]
[Table 17]

[0079]
Due to the ambiguity of the amino terminal residue position, alanine substitutions were made to include residues 2-19 (Abdel-Meguid, S. S. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.84, 6434). In fact, the most significant decrease in binding occurred with F10A (6-fold) followed by alanine substitution at residues 4-6 at the N-terminus of helix 1 (see FIG. 21). A substantially greater effect on binding (more than 20-fold) occurred with specific alanine substitutions within the loop of residues 54-74 and the carboxy terminal sequence 167-191. The binding of some alanine mutants increased 4.5-fold. The most dramatic example was E174A, located in the middle of many destructive alanine mutations. See FIG. 4, FIG. 7 and FIG.
Most destructive alanine substitutions form a batch of about 25 ° on the hormone that spans F10 to R64 and D171 to V185 (see FIG. 21). Furthermore, these side chains appear to point in the same direction of the molecule. For example, all alanine variants (D171A, K172A, E174A, F176A, 1179A, C182A, and R183A) that most affect binding for helix 4 are limited to three and a half of this helix and their side chains are It protrudes from the same surface (see FIG. 21). Based on this model, T175 and R178 are expected to be involved in binding because they occupy a central position as shown in FIG.
Although the T175A mutant was not expressed in sufficient yield to assay in shake flasks, it was a more conservative mutant (T175S). Thus, the T175S mutant had a 16-fold decrease in receptor binding. Similarly, R178N was expressed in analyzable yield even though R178A was less expressed. R178N had a 4-fold decrease in binding affinity.
[0080]
The next destructive mutant at the carboxy terminus was V185A. Although V185A is outside helix 4, this model is expected to point the destructive mutation in helix 4 in the same direction. In contrast, are alanine mutations outside of the binding batch or alanine mutations within it facing the opposite (R167A, K168A, V180A, Q181A, S184A, E186A, S188A) generally not affecting receptor binding? Or little effect.
The alanine mutant in helix 1 has a comparable effect, but a similar analysis was performed for this. The alanine substitution that breaks the bond most in this helix was at residues 6, 10 and 14 on the same face of the helix. The smallest disruptive alanine mutation (L9A, N12A and L15A) is present on the opposite side of helix 1. This is further confirmed by the fact that both anti-hGH Mabs 3 and 4 that do not compete with the receptor for binding to hGH bind to Asn-12. See Table XVI.
[0081]
[Table 18]

[0082]
The relative positions of the side chains in the 54-74 loop cannot be fixed as they are in the side chains in helices 1 and 4. However, even residue mutations have a significant periodicity in binding, which greatly inhibits binding compared to odd residues. In particular, this applies well to the first part of this region (54-59) and reflects the structure in which even residues protrude towards the receptor and odd residues face the opposite.
[0083]
Example 9
Structural integrity and binding energy of alanine-substituted hGH mutants
Some evidence indicates that alanine substitutions that disrupt receptor binding do not cause it by distorting the structure of the molecule. First, the eight Mabs react with almost all alanine mutants that cause breakage of the receptor binding as well as for hGH. See Table XII above.
Exceptions are R64A and C182A, which destructively break the binding to the individual hGH Mabs 6 and 5, respectively. These two Mabs have previously been shown to compete with somatogenic receptors for binding to hGH. In addition, two alanine variants that did not affect receptor binding were made. One affects the binding of the two Mabs (N12A) and the other does not affect any of the Mabs (K168A). This data indicates that binding to Mabs or receptors is disrupted by very local fluctuations in the mutant structure. Furthermore, the far ultraviolet circular dichroism spectra of all hGH mutants were substantially the same as wild type hGH.
In shake flasks, about 20% of the alanine variants (D11A, T60A, P61A, T67A, N72A, E74A, D169A, M170A, V173A, T175A, L177A, K178A, C189A, G190A) are sufficient to isolate and isolate Not secreted at any level. Since the gene encoding such a variant is expressed in the same vector and its expression is independent of a specific alanine codon, changes in the constant expression level are likely to be due to differences in secretion levels and / or hGH variants. It reflects protein degradation. Some of the non-expressing alanine mutants in helix 4 are present on the hydrophobic side shown in FIG. 21 with the hydrophobic side of the helix shown in white (M170A, V173A and L177A). However, this is not a general effect because several alanine substitutions have been accepted in the hydrophobic face of helix 1 (L6A, L9A and 10A) and helix 4 (F176A and V180A).
[0084]
Furthermore, decreased expression of hGH mutants is often observed when charged or neutral amino acids are replaced with alanine (D11A, T60A, T67A, N72A, F74A, D169A, T175A, R178A). Mutations such as T175S and R178N that conserve the hydrogen bonding group at that site are expressed at lower levels than the wild type, if any. The non-expressing C189A mutant disrupts the carboxy terminal sulfide and its counterpart (C182A) is also expressed at a much lower level than the wild type. Several other non-expressing alanine variants (T60A, T61A and T67A) are present in the loop structure. Thus, low level expression or non-expression can result from many structural effects but can be avoided by single structural or single functional substitutions.
Substitutions (158A, R64A, K172A, T175S, F176S, F176A) that have more than a 10-fold effect on binding appear to be directly involved in binding. Naturally occurring (Fersht, A. R. (1972) J. Mol. Biol.64497; Brown, L. R. et al. (1978) Eur. J. Biochem.8887; Malivor, R. et al. (1973) J. Mol. Biol.76123) or site-directed mutagenesis (Fersht, A. R. et al. (1985) Nature314225; Bryan, P. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA833743; Wells, J. A. et al. (1987) Proc. Nstl. Acad. Sci. USA841219; Cronin, ON N. et al. (1987) J. Am. Chem. Soc.1092222; Graf, L. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA854961) The strength of hydrogen bonds or salt bridges is widely distributed in the range of 1 to 5 Kcal / mol depending on the microenvironment. The reduction in binding free energy for hGH is 0.8, 1.0, 1.2, 1.6 and 1.8 Kcal / mol (ΔΔG binding =) for each alanine substitution of E56, Q68, D171, K172 and R64. + R_T lnKd (mutant) / Kd (wt). The energy of burying hydrophobic side chains in proteins tends to correspond to the free energy of transfer into edanol (Estoll, D. A. et al. (1986) Science.233659; Nozaki, Y. et al. (1980) “Hydrophobic effect” (Willie edition, NY 4-21).
Therefore, the decrease in binding free energy of F175A, F10A, P54A, 158A and V185A was 1.6, 1.0, 0.9, 1.7 and 0.9 Kcal / mol, respectively. These values are slightly less than the expected values of the hydrophobic free energy in the substitution of Phe, Ile or Val to Ala, 2.0, 2.4 and 1.0 Kcal / mol, respectively. According to this analysis, the effect of the T175S mutant (ΔΔG binding = 1.6 Kcal / mol) is greater than the effect expected for the loss of gamma methyl group (ΔΔG hydrophobicity = 0.7 Kcal / mol). In order to fully understand the nature of molecular contact between hGH and its somatogenic receptor, direct structural information is required. However, the binding energies of these alanine mutants indicate that they are within the range of previous measurements made for contact residues in a completely different system. In fact, the sum of the binding free energies of the alanine substitution mutants except for C182A, which is the most destructive for receptor binding (-13.2 Kcal / mol), is consistent with the total binding free energy between hGH and its receptor ( −13 Kcal / mol).
[0085]
Example 10
Reactivity of hGH mutant with anti-hGH polyclonal
hGH mutations hPRL (22-23), E174A and hPRL (88-95) were tested in a rat body weight test. The result of this test is shown in FIG. As can be seen, mutants other than hPRL (22-33) have the ability to decrease after 14 days of growth. The level of growth is attributed to the expression of antibodies against various growth hormones that neutralize biological effects. The fact that the hPRL (22-33) mutant continued to grow indicates that it is not as immunogenic as wild type hGH or other mutants used.
The results of comparing the reactivity of the various hGH variants to hGH with human and mouse sera containing polyclonal antibodies are shown in Table XVII.
[0086]
[Table 19]

[0087]
As can be seen from the table, mutants containing substitutions in the region of residues 22-33 have substantially reduced or in some cases binding activity to each human and mouse antiserum against wild-type hGH. It has no activity.
With the exception of mutant pGH57-73, mutants containing substitutions in other regions do not show a significant decrease in reactivity. Since segmental substitution mutants between residues 11 and 33 retain the ability to bind to somatogenic receptors, such mutants retain the ability to drive somatogenesis but have other properties, in this case The production of mutants with altered reactivity to anti-hGH polyclonal antibodies is shown.
[0088]
Example 11
Relationship between Kd and ability
A semilog plot of the Kd (mutant) / Kd (wild type) ratio of specific hGH variants and the ability of these variants in rat body weight assays is shown in FIG. As can be seen, the presence of a linear relationship indicates that a decrease in binding affinity to the somatogenic receptor indicates a decrease in ability.
As can be seen, hGH variant E174A has a higher binding affinity for somatogenic receptors than wild type hGH. This ability is also about 12% greater than wild type hGH.
Furthermore, mutant PRL (94-104) has basically the same binding constant as wild type but is about 2.7 times greater in capacity.
[0089]
Example 12
Active domain of hGH for prolactin receptor binding
Human growth hormone (hGH) exhibits many physiological effects such as model growth, lactation, nitrogen delay, diabetes-inducing and insulin-like effects and macrophage activation. R. K. Chawla, J. S. Parks and D. Rudman, Annu. Rev. Med.34519-547 (1983); O. G. P. Isaksson, et al. (1985), Annu. Rev. Physiol.47483-499; C. K. Edwards et al. (1988) Science239769-771. Each of these effects begins with the interaction of hGH with specific cell receptors. J. P. Hughe et al. (1985) Annu. Rev. Physiol.47469-482. A cloned gene liver hGH receptor (A. W. Leung, et al. (1987) Nature (London)330537-543) and the human prolactin (hPRL) receptor of milk lines (J. M. Boutin et al., (1988) Cell5369-77) only. The receptor “spillover” of hGH to the hPRL receptor is a clinical sign when acromegaly producing high levels of hGH becomes hyperprolactinosis despite having normal levels of hPRL (JE Hradkin (Fradkin (1989) New Engl. J. Mcd.320640-644). However, there are other receptors that bind to hGH, including placental lactogen (PL) receptors (M. Freemark et al. (1987) Endocrinology).120, 1865-1872). It was not known whether the binding sites on hGH for these receptors were the same or which receptors (receptors) were responsible for the pharmacological effect. To solve these problems, the hGH and hPRL receptor binding sites were positioned. The results obtained indicate that these receptor binding sites are overlapping but not identical. This allows for rational design of receptor specific variants of hGH.
[0090]
The hGH and hPRL receptors have an extracellular homology binding domain with 32% sequence homology, a single transmembrane domain, and an intracytoplasmic domain that also varies in sequence length. The extracellular binding domain of the hGH receptor is expressed in E. coli and has the same binding properties as those found in nature, such as soluble serum binding proteins (S. A. Spencer et al. (1988) J. Biol. Chem.2637862-7867). Similarly, the extracellular domain of the hPRL receptor was expressed and purified in E. coli. The hPRL receptor fragment spans residues Gln1 to Thr 2 1 1 and ends just before a single transmembrane domain. It has substantially the same high binding affinity and specificity as the full length receptor. The gene encoding the hPRL receptor used in this experiment was provided by Dr. Kelly, PA, Montreal University, Montreal, Canada. This DNA sequence was obtained from a human breast milk cDNA library and identified with a probe covering a known conserved region among the cross-species members of the prolactin receptor group. For example, Davies J. A. et al. (1989) Mol. Endrocrinology3674-680; Edery et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Scl. USA862112-2116; Jolicoeur et al. (1989) Mol. Endrocrinology3895-900. These truncated, high purity receptors are very useful reagents for rapid and accurate assays of the binding affinity of hGH variants.
[0091]
Relationship between hPRL and hGH receptor binding sites
In order to determine whether the epitopes of hGH and hPRL receptors overlap, we analyzed whether hPRL receptor fragments can be replaced with hGH-derived hGH receptor fragments (data not shown). In fact, hPRL receptor fragments are hGH receptors. Compete with an apparent Kd value of 1 nM for the binding site. This is substantially the same as the affinity measured by direct binding of hPRL receptor to hGH (results not shown).
Seven of the segment-substituted hGH variants in Table III were used to determine the location of the epitope on hGH for the hPRL receptor. In this experiment, hGHΔ32-46 mutant was used. The method was carried out by the method used for the determination of the epitope on hGH to the hGH receptor described above except that hPRLr was used as a receptor instead of hGHs, that is, the effect on the binding of hGH mutants. The results for the 12 segment substituted hGH variants described above are shown in Table XVIII.
[0092]
[Table 20]
Table XVIII
Binding of hGH mutants prepared by homologous scanning mutagenesis to the extracellular domain of the hPRL receptor (hPRLr), the mutants were named according to various hGH analogs: pGH, hRL, or segments displaced from hRL. The exact description of the introduced mutation is given in a series of single variants separated by commas. Each single variant is indicated by the one letter code for the wild type residue followed by its codon position in the mature hGH and the variant residue. A variant of hGH was produced by the method described above and under purification. Binding to hPRLr was measured essentially as described for hGHr (Spencer, S. A. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7862-7867). However, in this method, an affinity-purified rabbit polyclonal antibody against hPRLr was used to precipitate the hPRLr complex using Gibco BSA (crude) as a carrier protein. Generally K_D The standard deviation of the values was 20 or less of the reported value. Relative decrease in binding affinity for hGHr (K_D (Mutant) / K_D (HGH)) is obtained from Table III. The change in receptor selectivity was calculated as the relative reduction ratio of binding affinity for hGHr compared to hPRLr. WT-wild type.

[0093]
As can be seen from the table, pGH (11-33) and pGH (57-73) have a significant effect on hPRL receptor binding affinity, while pGH (48-52) has no effect. Unlike the hGH receptor, the hPRL receptor binds hPRL and hPL, but not pGH. As expected, virtually all substitutions from the binding competitor hormone hPL or hPL could not affect binding. The only exception is hPRL (22-33), which reduces the binding affinity to the hPL receptor by more than 70-fold. The hPRL receptor is thus very sensitive to mutations in the central region of helix 1 in hGH and near the loop between residues 57 and 73.
Homolog scan data also indicated that the hPRL and hGH receptor epitopes were not identical because some segment substitution mutants caused significant changes in receptor binding selectivity (Table XVIII). For example, the binding effects caused by pGH (11-33) or hPRL (22-33) are about 100 times greater for the hPRL receptor than for the hGH receptor. On the other hand, hPL (56-64) and hPRL (54-74) had little effect on the hPRL receptor, while they were 17-fold and 69-fold weaker binding to the hGH receptor, respectively. Furthermore, these selective binding effects (along with the binding of monoclonal antibodies discussed above) demonstrate that the decrease in receptor binding affinity is local in the mutant of hGH and not global structural changes.
[0094]
Specific side chains in hGH that strongly regulate binding to the hPRL receptor were identified by alanine scanning mutagenesis and homologous substitution. The hGH variants shown in Table XIX were prepared. hPRL substitutions, F25S and D26E caused the greatest decrease in binding affinity in helix 1 (21 and 45 fold, respectively). These residues protrude from the hydrophilic face of helix 1 and are on the same side as the other mutations in helix 1 (mainly H18A and F10A) that give a modest effect on binding.
Four residues in the loop region (54-68) that are known to affect hGH receptor binding as well as two residues preceding this region that do not affect hGH receptor binding (Q49A) And T50A). The most disruptive mutants are 158A and R64A, which have a 32-fold and 6-fold decrease in binding affinity, respectively. The effects of the other four mutations are negligible.
The fact that helix 1 and the loop region (58-64) contain strong binding determinants for the hPRL receptor is related to helix 4. This is because the helix is pushed between these two structures (FIG. 25B). In fact, alanine scanning of the helix 4 region between disulfides binding to C165-V185 revealed a strong binding determinant (Table XIX). Most destructive mutations are distributed in almost 4 helix turns, R167-R178, and are on the same hydrophilic surface.
[0095]
[Table 21]
Table XIX
Binding of a single variant of hGH to hPRL or hGH receptor fragment (hPRLr or hGHr). Mutants of hGH other than Q22N, F25S, D26E, Q29S and E33K made by site-directed mutagenesis were prepared and purified as previously described (Cunningham, BC and Wells, JA (1989) ) Science244, 1330-1335; Zoller, M. J. and Smith, M. (1982) Nucleic Acids Res.106487-6499). The names of the receptor binding assays and variants are given in XVIII. Data for decreased binding affinity for hGHr were taken from Table III. ND indicates not measured.

[0096]
A functional topographic map was derived based on the location of hGH and hPRL receptors (FIG. 28). The highest epitope portion for the hPRL receptor is (FIG. 25B). Mutations that show more than a 2-fold decrease in binding affinity are assigned. By this criterion, the epitope of the hPRL receptor is basically limited to the front face of helix 1 of F10 to Q29, the loop of F54 to Q68 and the hydrophilic face of helix 4 of R167 to R178. On the other hand, the hGH receptor epitope (FIG. 25A) contains residues from the amino terminal region to the front of helix 14 to M14, the front of helix 1 from F54 to S71 and the hydrophilic face of helix 4 from D171 to V185. Further mutation analysis is necessary to fill the remaining gap in the hPRL epitope, but it is clear that this epitope overlaps but is not identical to the epitope of the hGH receptor. These data indicate that all of the binding determinants that recognize hGH are the same for the hGH and hPRL receptors despite having 32% homology with their extracellular binding domains.
Residues that cause large changes in receptor binding affinity do so by indirect structural effects. However, all single mutants tested for most of these disruptive effects maintain full binding affinity for the 8 hGH monoclonal antibody populations, and often lead to changes in receptor selectivity but are uniform in receptor affinity. It is considered to be a local effect because it does not have a significant impact (see Table XIX and below).
[0097]
Design of receptor-specific mutants of hGH
Many single hGH variants cause many changes in receptor binding selectivity (Table XIX). Most striking is E174A, which leads to a 4-fold increase in affinity for the hGH receptor but hPRL receptor binding is reduced by more than 20-fold. This indicates a 120-fold change in receptor selectivity. Another mutation (mainly R178N and I179M) selectively binds hGH to the hPRL receptor. In general, the variant that most changes the receptor specificity is present in the non-overlapping region of the two receptor epitopes.
It would be possible to design very specific variants of hGH with slight mutations if the free energy change of the receptor binding is additive. In fact, when the two most hGH receptor selective single mutants (K168A and E174A) are combined, the double mutant shows 2300-fold selectivity for binding to the hGH receptor (Table XX). As pointed out above, the binding selectivity of hPL (56-64) can be increased almost 20-fold by hPL (56-64) containing only 20 mutations E56D and R64M (Table XIII). These hGH variants (K168A, E174A or E56D, R64M) have not substantially reduced selectivity for the preferred receptors, hGH or hPRL, respectively. At the same time, the binding of both receptors can be reduced.
[0098]
[Table 22]
Table XX
hGH mutants designed to discriminate between hGH and hPRL receptors (hGHr and hPRLr), prepared by site-directed mutagenesis of hGH mutants, purified, and as described in Table XIII Binding to hGHr or hPRLr was assayed. K_D The standard deviation of the measured values was ± 100% of the reported value and 20% or less of the reported value other than the value of 10M or more.

[0099]
For example, the combination of K172A and F176A, which individually greatly reduce the binding affinity to hGH and hPRL receptors, results in 550 and 15000-fold affinity breaks, respectively.
In all cases, the binding free energy change (ΔΔG bond) is surprisingly additive (Table XXI). The additive effects of mutations are also seen in enzyme-substrate interactions (P. J. Carter et al. (1984) Cell38835-840; J.A. Wells et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA845167-5171), protease-protease inhibitor interaction (M. Laskowaki et al., “Protease inhibitors: medical and biochemical characteristics” (1983), edited by N. Katunuma, Japan Sci-Sci. Tea version, Tokyo, 55-68) and protein stability (D. Shortlo et al., (1986) Protein,181-89 (1986): M. M. Mecht, J. M. Sturtevant and R. T. Sawer Protein143-46), and as published in these references, it is generally worn when mutated residues function independently and touch each other. This indicates that the pairing residues in many hGH mutants function independently. Such additivity creates a very predictable situation for creating hGH variants with desirable receptor binding affinity and specificity.
[0100]
[Table 23]
Table XXI
The additive effect of mutations in hGH on binding to hGH or hPRL receptors (hGHr or hPRLr). Change in binding free energy (ΔΔG binding) of mutants to wild-type hGH
△△ G bond = RT ln [CK_D (Mutant) / K_D (HGH)]
And calculated from the decrease in binding affinity. Single or multiple mutant hormone K_D (Mutant) / K_D (HGH) values were obtained from Tables XIII-XX.

[0101]
Adrenergic receptors (R. J. Lefkowitz and M. G. Caron (1988) J. Biol. Chem. as well as hGH.2634993-4996), ICF-1 receptor (MA Cascieri et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 2199-2202), IL-2 receptor (RJ Robb et al. (1984) J. Biol. Exp. Med.1601126-1146; R. J. Robb et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA855654-5658) and the ANP receptor (D. Lowe and D. Goeddel, unpublished), there are many examples in which more than one receptor or receptor subtype exists. In these cases, it is difficult to link a specific receptor function with a specific pharmaceutical effect. However, the use of receptor-specific hormone analogs can greatly simplify this task. For example, catecholamine analogs are used to characterize the β-adrenergic receptor subtype and to link receptor function to physiological responses (R. J. Lefkowitz et al. (1983) Annu. Rev. Biochem.52159-186) Similarly, receptor-specific mutants of hGH provide important tools for identifying other receptors in hGH and for exploring the role of hGH and hPRL receptors in hGH complex pharmacology. This study shows a systematic method for identifying receptor binding sites in hormones that allow rational design of receptor-specific variants.
[0102]
Example 13
Production of human prolactin that binds to human growth hormone
Prolactin (PRL) is a member of a group of homologous hormones including growth hormone (GH), placental lactogen (PL) and proliferin. Nicoll, C. S. et al. (1986) Endocrlnol. Rev.7169-203. Collectively, this group of hormones regulates a wide range of physiological effects on growth, differentiation, electrolyte balance, and the like. Chawla, R. K. et al. (1983) Ann. Rev. Med.34519-547; Isaksson O. G. P. et al. (1985) Ann. Rev. Physiol. 47, 483-499. These pharmacological effects begin with binding to specific cellular receptors. For example, hPRL binds to lactogenic receptors but not somatogenic receptors, and is activated by lactation but not bone growth. hGH binds to both lactogenic and somatogenic receptors and activates both lactation and bone growth. The molecular basis for the difference in receptor binding specificity is not yet understood.
Cloning and expression of hPRL
hPRL cDNA from a human pituitary cDNA library in λgt10 (Huynh, TV et al. (1985) “DNA Cloning Technology-Methods”, Volume 1, edited by DM Glover (Oxford IRL Press), 49 -78) Oligonucleotides corresponding to the 5 'and 3' ends of the published DNA sequence were used (cooke, NE et al. (1981) J. Biol. Chem.256, 4007-4016) cloned by hybridization (Maniatis, T. et al. (1982) “Molecular Cloning, Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)). The 720 bp Bst II-Hind III fragment from codon 22 to 55 bp downstream of the stop codon was subcloned into pJC118, which was subjected to the dideoxy method (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. . Sci. USA745463-5467) exactly in agreement with those previously reported (Cook et al., K. E. et al. (1981) J. Biol. Chem.2564007-4016).
[0103]
Intracellular expression vector pBO760 (Fig. 26) was prepared by standard methods (Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). For transcription of hPRL gene. E. coli trp promoter derived from pHGH207-1 was used (deboer, HA et al. (1982) “Promoter structure and function”, Rodriguez, RL and Chamberlin, MJ (Pragger version, New York), 462-481) The hPRL coding sequence contains a 47 bp XbaI-BstE II synthetic DNA cassette and a 720 bp BstE II-Hind III fragment derived from hPRL cDNA.

The start codon is indicated by an asterisk. The phage fl origin, pBR replication origin and pBR322β-lactamase genes are derived from pBO475 (Cunningham, B. C. et al. (1989) Science.243, 1330-1335).
Escherichia coli (MM294) containing pBO760 was grown for 4 hours at 37 ° C. in an 0.5 L shake flask containing 100 ml of M9 high case medium supplemented with 15 μg / ml carbenicillin (initial log phase; A₅₅₀ = 0.1-0.3) (Miller, JH (1972) "Molecular Genetics Experiment" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) Add indolacrylic acid (final 50 μg / ml) tep promoter Cells were grown for an additional 6-8 h and then harvested by centrifugation.Cell fractionation experiments showed that hPRL was almost exclusively present in the inclusion particles and was analyzed by SDS-PAGE in whole cell proteins. 2-5% (data not shown).
[0104]
Purification and regeneration of hPRL. Inclusion particles containing hPRL were isolated by basically reported methods (Winkler, M. E. et al. (1986) Biochemistry.254041-4045). Briefly, 50 g of wet cell pellet was suspended in 0.25 liter of 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (TE puffer), and the cells were degraded by vigorous sonication. Insoluble material was collected by centrifugation (10,000 × g for 15 minutes) and suspended in 25 ml of TE buffer. This suspension was layered on a 0.2 liter cushion of 50% glycerin, and hPRL-containing particles were pelleted by centrifugation at 9000 × g for 25 minutes. HPRL (purity about 20%) derived from the inclusion particles was suspended in 5 ml of TE buffer.
PPRL was regenerated by dissolving the inclusion particles in 156 ml of 8NGn HCl solution containing 0.3 g of reduced glutathione (Sigma) in TE buffer. After gently stirring at room temperature for 30 minutes, the mixture was cooled to 0 ° C. and diluted with 844 ml of cold TE buffer containing 0.6 g of oxidized glutathione. This solution was slowly stirred overnight at 4 ° C., and then dialyzed using 4 liters of TE buffer for changing the external solution three times in 24 hours. Insoluble material was removed by centrifugation (10,000 × g for 20 minutes).
Further, the regenerated and solubilized hPRL is 45% saturated (NH_Four)₂SO_FourAnd precipitation by stirring at room temperature for 2.5 hours. This precipitate was collected by centrifugation (12,000 × g for 30 minutes) and dissolved in 5 ml of TE buffer. After 30 minutes at room temperature, the solution was clarified (10,000 × g for 10 minutes) and then filtered through a Millipore filter (0.45 μm). This solution was dialyzed against 0.5 liter TE buffer overnight at 4 ° C. Finally, this hPRL (purity 85%) was purified by FPLC using the same DEAE high speed matrix as the method described for hGH purification until it was uniform (> 95%) (Cunningham, BC et al. ( 1989) Science,243, 1330-1335).
[0105]
Mutagenesis and binding site-directed mutagenesis of hGH and hPRL variants (Zoller, M. J. et al. (1982) Nucleic Acids Res.,106487-6500) was performed using the methylation repair deficient strain MutL of E. coli (Kramer, B. et al. (1984) Cell.38879-887). Enrichment of mutant clones is a mutagen that introduces or excludes each single restriction site so that restriction purification or restriction selection can be applied to the initial plasmid DNA pool obtained after transformation of the in vivo generated heteroduplex. Designed by designing oligonucleotides (Wells, JA et al. (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A317415-423). All oligonucleotides are designed to have 12 bp that exactly matches the 5 'end of the most upstream mismatch and 10 bp that exactly matches the 3' end of the most downstream mismatch. In the case of hGH mutagenesis, the previously described hGH synthetic gene contained a number of restriction sites that were cloned into the plasmid pBO475. A variant of hGH is secreted into the periplasmic space of E. coli (Chang, C. N. et al. (1987) Gene55189-196) Purified as described above.
The Kd values for each analog are described herein and Spencer, S. A. et al. (1988), J. Biol. Chem.263, 7862-7867 bound to the purified recombinant hGH binding protein (¹²⁵I) Measured by competitive displacement of hGH. Secreted and purified from the previously described hGH binding protein (containing residues 1 to 238 of the cloned human liver receptor) from E. coli by the method described by Fuh, G. et al. (1989). did. A substitution curve was generated three times, and the standard deviation of the Kd value was generally 20% or less of the reported value, and did not exceed 50% of the reported value except when the Kd value was 10 μM or more.
Concentrations of hPRL and hPRL variants are extinction coefficient + S (0.1%, 280) = 0.9 (Wetlaufer, D. B. (1962) Adv. in Prot. Chem.17, 303-390)₂₃₀ Measured with This was adjusted accordingly if the variant contained a mutation in an aromatic residue. The concentration value measured by absorbance was consistent with the value measured by laser densitometry using SDS-PAGE and hGH staining with Comedi Blue with an error within 10%. The circular dichroic spectrum was measured using an Aviv carry 60 spectropolarimeter.
In order to investigate which residues in hPRL are most disruptive to binding to the hGH receptor (FIG. 27), a number of hPRL residues were first introduced into hGH (Table XXII).
[0106]
[Table 24]

[0107]
Single alanine substitutions at sites 58, 64, 176 and 178 in hGH significantly disrupted receptor binding, but replacement of hPRL residues at these sites had little effect. The greatest effect of hPRL substitution was in the helix 4 residue containing sites 176 and 178. These data indicate that residues in the hPRL helix 4 region can best explain the lack of binding to the hGH receptor.
Recombinant hPRL maintained its natural-like structure and functionality. First, the near- and far-UV CD spectra (FIG. 28) were the same as those of natural hPRL (Bewiey, TA (1979) “Recent Advances in Hormone Research”, 35, 155-213, Academy Press. , NY), the far-ultraviolet spectrum is the same as hGH, indicating the presence of a similar 4-helix bundle structure with significant differences in mean residue ellipticity at 208 nm and 224 nm. . Near UV CDs that reflect differences in the number of aromatic residues and microenvironment of these hormones are markedly different. In another study, recombinant hPRL maintained sufficient immunological cross-reactivity in hPRL ELISA (data not shown) and was equivalent to hGH in propagating rat lymphoid Nb2 cells (Tanaka). (Tanaka), T. et al. (1980) J. Clin. Endo. Metab.511058-1063). Upon reduction, purified hPRL causes a significant decrease in mobility in SDS-PAGE (also seen in hGH), indicating disulfide bond formation (Poliitt, S. et al. (1983) J. Bacteriol.15327-32). Amino terminal sequence analysis showed that intracellularly expressed hPRL maintained the amino acid terminal methionine. However, like methionyl hGH, this apparently does not affect its structure or function.
The binding of hPRL to hGH binding protein is 10% compared to hGH.^Five It is reduced by more than a factor (Table XXIII), which is below the detection limit of the binding assay.
[0108]
[Table 25]

[0109]
1. hPRL variants were generated, purified and analyzed as described above. Many mutants are represented by a series of single mutants separated by colons (Table XXII). Codon numbers are based on the hGH sequence (Figure 2).
2. The average standard error was less than 20% of the reported value except when the Kd value at which it becomes about 50% exceeds 1 μM. This error is further increased when the Kd value exceeds 10 μM.
Three residues in hGH-derived helix 4 were combined (H171D, N175T and Y176F) and introduced into hPRL. Alanine scanning mutagenesis and hPRL substitution (Table XXII) indicate that these residues are very important for hGH binding to the hGH receptor. This triple mutant of hPRL caused detectable binding to the hGH binding protein although it was 14000 times weaker than hGH. In addition, the introduction of another important helix 4 residue (K178R) to create a tetra mutant enhanced this to a level of binding that was only 660 times lower than the wild type (variant B in Table XIII). Introduction of hGH residues 184-188 into hPRL variant B did not enhance binding to hGH binding proteins. However, the introduction of E174A to give hPRL variant C (Table XXIII) further increased the binding affinity to hGH binding protein by a factor of 3.5 in the same manner as when E174A was incorporated into hGH.
[0110]
The loop region containing residues 54-74 was analyzed because it has binding power to the helix 4 region. Complete replacement of the loop region in hPRL with a sequence derived from hGH (hGH (54-74) in Table XIII) provides barely detectable binding to the hGH binding protein. When this mutant is combined with mutant B, the binding affinity is substantially increased. However, the binding affinity of this new mutant (B + hGH (54-74)) is almost 10 times less than that of mutant B alone. Thus, some hGH residues in the 54-74 loop were incompatible with hGH substitutions in helix 4. We selected 7 residues from the 54-74 loop of hGH that were shown to most affect binding by alanine scanning mutagenesis. While the hGH R64A mutation reduces binding affinity by more than 420-fold, the hGH R64K mutant (hPRL substitution) has slightly more binding to the hGH-binding protein (Table XXII). Therefore, Lys64 in hPRL remained unchanged. As a result, 6 of the 7 substitutions where the change to alanine was the most disruptive in hGH were incorporated into hPRL. This new mutant (B + H65F: S56E: L58I: E56S: D68N: Q66E) binds 50 times stronger than B + hGH (54-74), but only 110 times less than the binding affinity of wild type hGH. However, this only showed a slight improvement over mutant B alone (6-fold), not as expected for the strong interaction previously observed in the loop region of hGH. Therefore, further disruption of the 6 mutations in the loop revealed that the combination of H54F: S56E: L58I + variant B was 3 times weaker than the mutant. Finally, incorporation of mutation E62S: D63N: Q66E into variant C (mutant D) yields the analog with the highest affinity with only 6-fold lower binding affinity compared to hGH. Another single mutation (H54F, S56E, L58I, A59P, N71S and L179I) did not increase the binding affinity of hPRL variant D to the hGH binding protein. The structure of variant D was virtually indistinguishable from native hPRL by CD spectral analysis (FIG. 28) or ELISA activity (data not shown).
[0111]
These studies showed the potential to restore the binding of distantly related analogues using only functional information from site-directed mutagenesis experiments. Alanine scanning mutagenesis of hGH provided a systematic analysis of the side chains important in regulating hGH binding to the receptor (FIG. 27). This information highlighted many residues in hPRL that explain the inability to bind the hGH receptor (FIG. 29). However, further analysis showed that alanine substitution in hGH is more disruptive than hPRL substitution in hGH (Table XXII). In addition, some hPRL substitutions were considerably more destructive than others with respect to binding affinity, especially when larger side chains were present in hPRL. For example, a conservative (but larger) F176Y substitution in hGH caused an 8-fold decrease in binding affinity for the hGH receptor, whereas a smaller R64K substitution showed a slight increase in binding affinity. Thus, analysis of destructive hPRL substitutions in hGH first indicates the introduction of a residue cluster in helix 4 that performs binding affinity to hPRL. This is very important since no binding to the hGH receptor by wild-type hPRL is observed, and several hGH substitutions are made simultaneously in hPRL to give binding affinity within the range of the assay used (Kd ≦ 50 μM). It is necessary to introduce.
By introducing functionally important residues into helix 4, a readily detectable binding affinity was introduced into hPRL. However, it has proven more difficult to create a loop region between 54-74. The increase in binding by incorporating the entire hGH loop into hPRL was less than expected and was destructive to binding when combined with optimized helix 4 variant B. Our data indicate that the hPRL 54-74 loop structure is supported by other interactions in this protein. This problem was solved in stages. First, six loop residues derived from hGH identified as important for alanine substitution with hPRL substitution in hGH were introduced into hPRL. Despite this improved the situation, combinations of several hGH mutations (reduced to H43F, S56E and L58I) were disruptive to hPRL. These data indicate that some residues in the loop are important to the structure and remain more stable if left intact.
[0112]
Many repeated cycles of mutagenesis were required to unify the combination of residues that allowed hPRL to bind tightly to the hGH receptor. This tactic relies on the assumption that the mutation effect is additive as observed in practice. For example, binding was increased 3-5 fold when the E174A mutation was added to hPRL variant C or hGH. Furthermore, the disruptive effects of the H54F, S56E, and L58I single mutants on mutant D were (4.4 times) almost the same as the disruption caused by the combination of all three mutations added to mutant B. (3 times).
There are several other residues such as V14N and H185V that can be incorporated into variant D and attempt to improve binding even though the binding affinity of variant D is only reduced by a factor of 6. That is, there is a site where alanine substitution in hGH causes a 2-3-fold decrease in hGH binding (FIG. 29). A high-resolution structure helps the design process, but it is clearly not fundamental. The cumulative nature of the mutational effect can converge the binding in the same manner as protein evolution by natural changes and selection cycles.
Previous protein engineering experiments have shown that the substrate specificity of natural mutant enzymes can be practically converted by substrate contact residues using high resolution structural analysis (Wells JA et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 5167-5171; Wilks, H. M. et al. (1988) Science.242, 1541-1544). Similarly, the other is binding antigen binding loop (Jones, P. T. et al. (1986) Nature321522-525) or DNA receptor helix (Wharton, R. P. et al. (1985) Nature.316, 601-605), it can be produced by replacement of all the secondary structural units. However, conferring hGH receptor binding to hPRL requires selective residue substitution within the structural framework of hPRL. Furthermore, CD spectral data are very similar to the structure of hPRL but not similar to hGH, although the entire structure of hPRL variant D maintains the same binding properties as hGH.
[0113]
The fact that the binding specificity for the hGH receptor can be incorporated into hPRL confirms the functional importance of the characteristic residues for somatogenic receptor binding. These studies also provide immense evidence for the structural relationship between hGH and hPRL, which are only 23% identical. This provides a rational way to approach new receptor binding functions contained within this group of hormones, including growth hormone, prolactin, proliferin or placental lactogen structures. Such hybrids are useful in distinguishing receptor binding and activation as well as the pharmacological significance of the receptor subtype. These analogs lead to the design of new receptor-specific hormones with more useful properties as agonists or antagonists.
[0114]
Example 14
Conjugating human growth hormone to human placental lactogen
The binding affinity of human placental lactogen (hPL) to the hGH receptor is 30 times smaller than that of hGH (G. Baumann et al. (1986) J. Clin. Endocrinol. Metab.62134; A. G. Herington, et al. (1986) J. Clin. Invest.771817). Previous mutation experiments have shown that the binding site of hGH to the hGH receptor basically includes two regions (residues 54-74 and 171-185) with some minor determinants near the amino terminus (residues 4-14). ). The entire sequence of hPL is 85% identical to hGH. Within the three regions that make up the receptor binding epitopes on hGH, hPL differs in only 7 places and includes the following substitutions: P2Q, 14V, N12H, R16Q, E56D, R64M, and 1179M. (In this nomenclature, the residues of wild-type hGH are indicated by a one-letter code followed by the site number of mature hGH and the residues in hPL). A single alanine substitution of hGH was made at each of these seven sites. Of these, four alanine substitutions, 14A, E56A, R64A, and I179A were found to cause more than a 2-fold decrease in binding affinity. In general, alanine substitution has a greater effect on binding than homologous substitution from human prolactin. Therefore, several effects of substitutions derived from hPL introduced into hGH were studied. The I179A substitution caused a 2.7-fold decrease in affinity, while I179M showed only a 1.7-fold effect. However, the R64A and R64M substitutions caused the same and greater reduction in binding affinity (approximately 20-fold. In addition, the affinity of the double mutant of hGH (E56D: R64M) also showed a total of 30-fold reduction (first number). Table 1) Thus, E56D and R64M basically determine the difference in receptor binding affinity between hGH and hPL, so the double mutants of hPL, D56E and M64R, have substantially increased binding affinity to the hGH receptor. Additional modifications such as M179I and V41 also enhance hPL binding to the hGH receptor.
[0115]
Example 15
Effect of amino acid substitution at site 174 on binding to human growth hormone
As previously indicated, replacement of Glu174 with Ala (E174A) increases the affinity of human growth hormone for its receptor more than 4-fold. In order to determine the optimal substituted residue at site 174, hGH mutants substituted with other 12 residues were made and the affinity with the hGH binding protein was measured (Table XXIV). Side chain size, not charge, is a key factor in determining binding affinity. Alanine causes optimal substitution, followed by Ser, Gly, Gln, Asn, Glu, His, Lys, Leu, and Tyr.
[0116]
[Table 26]

[0117]
 Mutations were generated by site-directed mutagenesis of mutants of the hGH gene containing the KpnI site at site 178 cloned into pBO475 (Carter, P. et al. (1986) Nucleic Acids Res. .13, 4431-4443). The oligonucleotide used for mutagenesis is

It has the arrangement | sequence represented by these. Here NNN represents the new codon at site 174, and the asterisk indicates a mismatch that excludes the KpnI site starting at codon 178. Mutant codons are as follows: Gln, CAC; Asn, AAC; Ser, AGC; Lys, AAA; Arg, AGG; Hls, CAC; Gly, GGG; Val, GTG; Following heterozygous Japanese chain synthesis, plasmid pool mutations were enriched by restriction with KpnI to reduce the background of the wild-type sequence. All mutant sequences were confirmed by dioxy sequence analysis (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.745463-5467).
b. The side chain backing value is C.Chotia ((1984) Annu. Rev. Biochem.53537).
c. The dissociation constant depends on the hGH binding protein as described above (¹²⁵I) Measured by competitive replacement of hGH. NF indicates that the mutant hormone is expressed at a level that is too low for isolation and assay.
Example 16
The hGH variants shown in Table XXV were constructed. These relative capacities for wild type hGH are shown.
[0118]
[Table 27]

While preferred embodiments of the invention have been described, it will be apparent to those skilled in the art that these published embodiments can be varied in many ways and such modifications are within the scope of the invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 illustrates the tactics used to identify active domains.
FIG. 2 shows conserved and variable amino acid residues in the amino acid sequences of hGH, hPL, pGH and hPRL.
FIG. 3 shows a putative low resolution structure of hGH and a helical projection as seen from the N-terminal starting residue for each helix. Hydrophobic, neutral and charged residues are indicated by ○, ■ and ●, respectively.
FIG. 4 is a bar graph showing the relative decrease in binding of various segment-substituted hGH variants to soluble hGH receptors.
FIG. 5 shows similar amino acids in active domains A, C and F that interact with somatogenic hGH receptors.
FIG. 6 shows the relative binding position of the somatogenic receptor and 8 monoclonal antibodies against hGH.
FIG. 7 is a bar graph showing the relative increase or decrease in binding of various alanine-substituted hGH variants to soluble hGH somatogenic receptors. The hatched bar at T175 indicates that serine is substituted instead of alanine. The R178 stripes indicate that asparagine is substituted instead of alanine.
FIG. 8 shows the DNA and amino acid sequences of the hGH gene used in the examples.
FIG. 9 shows the construction of vector pBO475 containing a synthetic hGH gene.
FIG. 10 is the DNA sequence of pBO475 showing the amino acid sequence of hGH.
FIG. 11 shows the construction of vector pJ1446.
FIG. 12 is the DNA sequence of pJ1446 showing the amino acid sequence of the soluble portion of the liver-derived somatogenic receptor.
FIG. 13 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 14 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 15 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 16 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 17 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 18 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 19 shows the epitope binding sites on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 20 shows the epitope binding site on hGH for each of 8 different monoclonal antibodies.
FIG. 21 shows helical projections for active amino acids and helices 1 and 4 involved in binding to somatogenic receptors in hGH.
FIG. 22 shows weight gain over time for rats dosed with hGH and hGH variants at 50 microgram / kg / day.
FIG. 23 is a semi-log plot of Kd ratio versus activity of hGH mutant compared to wild type hGH.
FIG. 24 shows hGH binding protein isolated from E. coli KS330 cultures expressing human serum (◯) or plasmid phGHr (1-238) (¹²⁵I) Competitive binding curve of hGH and unlabeled hGH. The bar indicates the standard deviation from the mean value. The inset shows a Scatchard plot derived from a competitive binding curve. The concentrations of binding protein from human serum and E. coli were 0.1 nM and 0.08 nM, respectively.
FIG. 25 is a structural model of hGH based on the structure of pGH determined from an X-ray structure with 2.8-resolution. Panel A shows a functional contour map of the hGH receptor epitope and Panel B shows the same map measured for the hPL receptor epitope. The size of the black circle indicates the magnitude of the destructive effect regarding the alanine substitution of each residue. Small circles indicate more than twice the destruction and large circles indicate more than 10 times the destruction. The triangles in the hGH receptor epitope indicate the E174A K position that increases (Bannel A) binding affinity more than 4-fold.
FIG. 26 shows plasmid pBO760 used for intracellular expression of hPRL in E. coli.
FIG. 27 shows the positions of residues in hGH that strongly affect binding to hGH binding proteins. Shown are alanine substitutions (serine or asparagine in the case of T175 or R178, respectively) that cause a 10-fold or greater decrease in binding affinity (◯), a 4-10 fold decrease (■), or a 4-fold increase (▲). ing. A helical projection of the α-helix region reveals their amphipathic and fact that the most important determinant in helix 4 is in the hydrophilic surface (shadow area).
FIG. 28 shows circular dichroism spectra of hGH (−), wild type hPRL (−−) and hPRL variant D (−−−−) in the far ultraviolet (panel A) or near ultraviolet (panel B). .
FIG. 29 shows a sequence comparison of hGH and hPRL for regions critical for binding limited by conservative and alanine scanning mutagenesis. Identical residues are shaded and their numbers are based on the hGH sequence. Residues whose binding affinity changes by a factor of 4 or more when mutated are circled. An asterisk above the residue indicates the site where the mutation reduces binding affinity by 2-4 fold.

Claims (3)

A human growth hormone variant having a non-naturally occurring amino acid sequence and derived by substitution of at least one amino acid residue of human growth hormone with a different amino acid, wherein the amino acid substitution is H18A, R64K, E65A, L73A, E174A, N, Q, S or G, selected from the group consisting of T175S, E186A, S188A and F191A, the variant is not HGH-V and the variant is an affinity for somatogenic receptors of human growth hormone A variant of human growth hormone that binds to somatogenic receptors with a different affinity than sex.   The growth hormone variant according to claim 1, wherein the amino acid substitution is selected from the group consisting of H18A, R64K, E65A, L73A, E174A, N, Q, S or G, E186A, S188A and F191A.   The growth hormone variant according to claim 1, wherein the amino acid substitution is selected from the group consisting of E174A and T175S.

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