JP3761294B2

JP3761294B2 - Electrode biosensor and manufacturing method thereof

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Publication number: JP3761294B2
Application number: JP23073397A
Authority: JP
Inventors: 哲志出口; 章夫清原
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 1997-08-27
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2017-08-27
Also published as: JPH1164270A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気絶縁性基板上に、電極と生体由来の分子識別素子からなるセンサー部を形成してなる電極型バイオセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサーは、検体に前処理を施すことなく、検体中の特定の成分を簡便に定性・定量することができるという特徴を有する。このようなバイオセンサーは、基本的には特定成分に対し選択的に反応する生体由来の分子識別素子と、特定成分が分子識別素子と反応した際における変化を捕らえ、最終的に電気信号に変換して出力するトランスデューサ（信号変換器）とで構成されている。そして、前記トランスデューサの受感部としては、トランジスタやサーミスタ、光デバイス等が使用されるが、一般には電極が使用されており、電極を用いたバイオセンサーは、電極型バイオセンサーと総称される。この電極型バイオセンサーは、更に使用する分子識別素子の種類によって、酵素センサー、免疫センサー、微生物センサー、オルガネラセンサー、組織センサー、レセプタセンサーなどに分類される。
【０００３】
ところで、上記した酵素センサー等の電極型バイオセンサーは、一般にシート状の電気絶縁性基板上に電極を形成し、この電極の周囲に生体由来の分子識別素子を固定する方法により製造されている。したがって、電気絶縁性基板と分子識別素子や電極との親和性（馴染み易さ）の良否が、この種のバイオセンサーの製造歩留りや性能の善し悪しを左右する。基板と分子識別素子や電極との親和性が悪いと、基板面に対し電極や分子識別素子を十分に密着させることができないため、基板面から電極や分子識別素子が剥離する等の問題が生じ、また測定精度がばらつく原因になるからである。
【０００４】
然るに、電極型バイオセンサーの基板材として、従来より用いられているセラミックス等の無機系材料や、ポリエチレンテレフタレート等の高分子系材料は、電極材料との親和性や密着性が十分でない。そこで、例えば基板面にコロナプラズマ等による放電処理を施したり、ニッケル、クロム、ＩＴＯ等からなるアンカーコーティング層を設けるなどの方法（前処理法）が、絶縁性基板と電極との密着性を改善する手段として従来より用いられている。
【０００５】
更に、絶縁性基板と生体由来の分子識別素子との密着性を改善する手段として、例えば基板面にアミノ基を有する重合性化合物を塗布し、これにプラズマを照射して基板面上に重合膜を形成したり、固体高分子電解質であるナフィオン（デュポン社の商標名）をコーティングしたり、或いは基板面にＣＭ−デキストリンをコーティングしたり、更には分子識別素子をセルロース等の被膜で包み込む方法等（後処理法）が用いられている。また、最近では、高分子樹脂の分子中にアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基などの極性基を導入して、分子識別素子に対する親和性を高める方法が提案されている。
【０００６】
これらの技術を用いて作製された電極型バイオセンサーであると、基板と電極および生物由来の分子識別素子との接着性・密着性がよいので、取扱時や測定時に分子識別素子や電極が基板から剥離する等の恐れが少ない。よって、精度よく特定成分の定性・定量を行うことができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記技術を採用した場合、バイオセンサーの製造工程が複雑化する。したがって、製造歩留り率が低下したり、製造コストが上昇したりする。更に、基板の材質や分子識別素子の種類によっては、上記技術を適用し難い場合もある。
【０００８】
また、電極型バイオセンサーは主に生体成分の定性・定量に使用されるものであるので、使用後のセンサーは病原菌等で汚染される場合があり、また識別素子が生物由来のものであるので、検体中の成分を吸着等し易い。よって、バイオセンサーは、検体ごとにセンサーを交換する使い捨て型の使用態様が好ましいが、この場合、公害防止の観点から、大量に発生する使用済センサーを如何に処分するかが問題となる。
【０００９】
ここにおいて、従来より絶縁性基板材料として使用されているポリエチレンテレフタレートなどの高分子樹脂は、焼却炉を破損する程に高温の焼却熱を発したり、完全に燃焼し切らない場合があり、またセラミックス等の無機質材料は、燃えないので焼却処分できない。更に両材料とも微生物等により分解を受け難い材質であるので、埋め立て処分すると、自然環境を害するという問題がある。つまり、従来の電極型バイオセンサーは、使用後においても課題を抱えている。
【００１０】
本発明は、上記に鑑みなされたものであり、電極や生体由来の分子識別素子を十分な密着性をもって定着でき、かつ廃棄に際しては速やかに熱分解または生分解される電気絶縁性基板を案出し、この基板を用いることにより、上記技術を適用しなくとも、使用時に高い信頼性をもって生体成分を定性・定量でき、かつ使用後においては廃棄公害を発生させない電極型バイオセンサーを安価に提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は次の構成を有する。
請求項１の発明は、電極と、前記電極の表面近傍に位置する生体由来の分子識別素子とで構成されるセンサー部が、電気絶縁性基板上に形成されてなる電極型バイオセンサーであって、前記電気絶縁性基板が、７０〜１７０℃の融点を有する全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分として組成されたものであることを特徴とする。
【００１２】
７０〜１７０℃の融点を有する全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分として組成された電気絶縁性基板は、電極材料に対する接着性・密着性がよく、特に生体由来の分子識別素子に対する親和性に優れる。したがって、上記構成の電極型バイオセンサーであると、基板上に電極や分子識別素子を定着し易いので、製造作業性がよいと共に、製品の歩留率が向上する。また、製品の取扱中に分子識別素子が剥離したり、測定に際し分子識別素子が検体液中に遊離してしまうといった現象が生じ難い。
【００１３】
更に、上記全脂肪族ポリエステル系樹脂は、熱分解すると共に微生物によって分解される性質を有するので、このような素材からなる絶縁性基板を用いた電極型バイオセンサーであると、焼却処分、埋め立て処分の何れをも選択でき、廃棄に際し自然環境を害しない。
【００１４】
以上から、上記構成によると、高い信頼性をもって生体成分を定量・定性できかつ環境性にも優れた電極型バイオセンサーが提供できる。
【００１５】
請求項２の発明は、請求項１記載の電極型バイオセンサーにおいて、前記全脂肪族ポリエステル系樹脂が、脂肪族ジオールと脂肪族ジカルボン酸とによる重縮合ポリマー、または２種の脂肪族ヒドロキシカルボン酸による共重合ポリマーのいずれかを主成分とするものであることを特徴とする。
【００１６】
脂肪族ジオールと脂肪族ジカルボン酸とによる重縮合ポリマー、または２種の脂肪族ヒドロキシカルボン酸による共重合ポリマーは、極性が高く生体由来の分子識別素子との親和性がよいと共に、微生物等の作用によって分解し得る性質（生分解性）を有している。したがって、このようなポリマーを主成分とする電気絶縁性基板を用いると、測定精度に優れ、かつ廃棄における無公害性に優れた電極型バイオセンサーが得られる。
【００１７】
請求項３の発明は、請求項１または２に記載の電極型バイオセンサーにおいて、前記分子識別素子が、酵素、抗体または抗原、微生物、オルガネラ、レセプタ、細胞組織よりなる群から選択されたものであることを特徴とする。
【００１８】
上記の生体由来の各素子は、分子識別素子として有用であり、他方、電気絶縁性基板の主材である全脂肪族ポリエステル系樹脂は、これらの生体由来の素子との親和性が極めて高い。したがって、酵素、抗体または抗原、微生物、オルガネラ、レセプタ、細胞組織よりなる群から測定したい物質に適合する好適な素子を選択し用いた電極型バイオセンサーであると、測定対象物質を高い信頼性をもって検知できる。
【００１９】
請求項４の発明は、請求項１ないし３に記載の電極型バイオセンサーにおいて、前記電極が、白金、金、またはカーボン導電体からなる２〜３極の電極で構成されていることを特徴とする。
【００２０】
白金、金は、極めて導電性に優れると共に、スパッタリング法や金属性凸版によるホットスタンピング法または塗布法を用いることにより、本発明にかかる基板上に容易に電極を形成することができる。また、カーボン導電体は、白金、金に比べると若干導電性に劣るものの、ペースト状となし基板に塗布等することにより、簡単に電極を形成することができる。
【００２１】
なお、これらの電極材料を用いて少なくとも作用極（分子識別素子を必須とする極）と対極を形成するか、作用極とその対極および参照極の合計３極を基板上に形成し、これらの２〜３極でセンサー単位を構成することになるが、電極型バイオセンサーの小型化のためには、作用極と対極からなるセンサー単位が好ましい。他方、測定の信頼性を高めるためには、参照極を加えた３極とするのがよい。
【００２２】
請求項５の発明は、請求項４に記載の電極型バイオセンサーにおいて、前記電極が、前記電気絶縁性基板面上に直接形成されており、前記分子識別素子が、少なくとも１極の検知領域を覆うようにして、前記電気絶縁性基板面に直接定着されていることを特徴とする。
【００２３】
この構成では、絶縁性基板面上に２〜３極の電極を直接形成すると共に、前記２〜３極の電極の少なくとも１つの電極（作用極に相当する電極）の検知領域が分子識別素子で覆われるように、前記絶縁性基板面に分子識別素子を直接定着させてあるが、電極や分子識別素子を基板面上に直接定着させるこの構成であると、基板と電極や分子識別素子との間に他の部材が介在しないので、その分、必要な原材料を少なくできると共に、工程数を少なくできる。よって、この構成によると、製造コストの低減を図れる。なお、上記検知領域とは、検体（測定対象物）に挿入または浸漬する電極部分を意味する。
【００２４】
ところで、上記構成は、電極材料や生体由来の分子識別素子に対する親和性や密着性に優れた全脂肪族ポリエステル系樹脂を主体とする絶縁性基板を用いて初めて可能になる。なぜなら、シリコンやポリエチレンテレフタレート等からなる従来の絶縁性基板では、電極材料や生体由来の分子識別素子との親和性・密着性が悪いため、このような基板の表面に直接電極や分子識別素子を定着した場合、僅かな外力が加わっても、電極や分子識別素子が基板から剥離してしまう。したがって、実質的に使用可能な電極型バイオセンサーが得られなかった。このため、前記した如く従来のバイオセンサーでは、電極や分子識別素子との親和性・密着性を改善するために、基板に予め他の素材を塗布する等の前処理を行うのが一般的であった。然るに、上記構成の本発明では、前処理を行わなくてもよいので、その分電極型バイオセンサーの生産コストを低減させることができることになる。
【００２５】
請求項６の発明は、請求項１ないし５に記載の電極型バイオセンサーにおいて、前記センサー部が、一枚の電気絶縁性基板上に所定の間隔で規則的に配設されていることを特徴とする。
【００２６】
この構成であると、多数のバイオセンサーを一度に効率よく製造できる。また、センサー部のそれぞれをトランスデューサに接続することにより、多数の検体を同時に測定処理できる測定装置と成すことができる。更に、この構成では、複数のセンサー部が所定の間隔で規則的に配設されているので、各々のセンサー部を順次移動（回転運動等）させてトランスデューサに接続する態様とすることもでき、このような態様の測定装置であると、多数の検体を連続的かつ自動的に測定処理することが可能となる。
【００２７】
請求項７の発明は、電極と、前記電極の表面近傍に位置する生体由来の分子識別素子とで構成されるセンサー部が、電気絶縁性基板上に形成されてなる電極型バイオセンサーの製造方法であって、７０〜１７０℃の融点を有する全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分として組成されたシート状の電気絶縁性基板に、スパッタリング法または金属性凸版によるホットスタンピング法によって、白金または金からなる２〜３極の電極を形成する工程と、前記電極のうち少なくとも１つの電極の検知領域が覆われるように、当該電極表面と当該電極の周囲の電気絶縁性基板面に、分子識別素子を含有した液状物を塗布する工程と、を備えることを特徴とする。
【００２８】
また請求項８の発明は、請求項７に記載の電極型バイオセンサーの製造方法において、前記全脂肪族ポリエステル系樹脂が、脂肪族ジオールと脂肪族ジカルボン酸とによる重縮合ポリマー、または２種の脂肪族ヒドロキシカルボン酸による共重合ポリマーのいずれかを主成分とするものであることを特徴とする。
【００２９】
更に請求項９の発明は、請求項７または８に記載の電極型バイオセンサーの製造方法において、前記分子識別素子が、酵素、抗体または抗原、微生物、オルガネラ、レセプタ、細胞組織よりなる群から選択されるものであることを特徴とする。
【００３０】
上記請求項７〜９に記載の製造方法によると、上記請求項１〜６の電極型バイオセンサーを効率良く製造できる。よって、これらの製造方法によると、電極型バイオセンサーの品質の向上と生産コストの低減が図れる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
まず、本発明が特徴とする全脂肪族ポリエステル系樹脂について説明する。
本発明にかかる全脂肪族ポリエステル系樹脂は、脂肪族基がエステル結合し、これが繰り返し単位となって、長鎖状ポリマーを形成したものをいい、分子中に芳香族基を有しないものをいう。なお、芳香族基を有する樹脂であると、生分解し難くなり、廃棄処分性が悪くなるので好ましくない。
【００３２】
本発明では、上記のような全脂肪族ポリエステル系樹脂のうち、融点が７０℃以上で１７０℃以下のものを使用する。融点が７０℃未満であると、十分な強度を持ったシートが得難くなると共に、ホットスタンピング法を用いて電極を形成する場合に熱変性する恐れがある。その一方、融点が１７０℃を越えるものは、分子量が大きくて生分解性が悪いと共に、生体由来の分子識別素子との親和性が悪くなる。よって、電極型バイオセンサー用の電気絶縁性基板の組成分としては、融点が７０℃〜１７０℃の全脂肪族ポリエステル系樹脂を用い、より好ましくは融点が９０〜１６０℃の高分子量体（数平均分子量Ｍｎで約３万以上）を用いる。
【００３３】
上記した全脂肪族ポリエステル系樹脂は、次の２つの方法により製造できる。その一つは、グリコール（脂肪族ジオール）と脂肪族ジカルボン酸との重縮合反応であり、他の一つは、脂肪族ヒドロキシカルボン酸の１種又は２種以上の重縮合反応である。そして、これらの製法を用い、重合度を適当に調整することにより、融点が７０〜１７０℃の単独重合又は共重合ポリマーを得ることができる。
【００３４】
上記製法を具体例で説明する。
まず、グリコールと脂肪族ジカルボン酸との重縮合反応の例としては、ジメチレングリコールとジメチレンカルボン酸又はオクタメチレンジカルボン酸の組合せ、テトラメチレングリコールとジメチレンカルボン酸との組合せ、デカメチレングリコールとジメチレン−、テトラメチレン−、ヘキサメチレン−又はオクタメチレン−の各ジカルボン酸との組合せ、エイコサメチレン（Ｃ＝２０）グリコールとジメチレン−、テトラメチレン−、ヘキサメチレン−又はオクタメチレン−の各ジカルボン酸との組合せが例示できる。
【００３５】
上記組み合わせにおいて、各々の成分を１種類とすると単独重合ポリマーが得られ、いずれか一方の成分を２種類以上用いて３成分以上で重縮合反応を行うと、共重合ポリマーが得られる。そして、各々の成分の組み合わせ方を変えることにより、融点を変化させることができる。このうち、成形性と成形物の強度の面から、次の組合せで反応させたポリマーが、本発明にかかる全脂肪族ポリエステル系樹脂として特に好適である。
【００３６】
即ち、ジメチレングリコールとジメチレンカルボン酸の組合せ、テトラメチレングリコールとジメチレンカルボン酸との組合せて反応させたポリマーであり、これらのポリマーの融点は、約１００〜１６０℃である。
【００３７】
次に、脂肪族ヒドロキシカルボン酸の重縮合反応について説明する。
１種類の脂肪族ヒドロキシカルボン酸を用いた重縮合反応では、分子内自己重縮合による単独重合ポリマーが得られ、２種類以上の脂肪族ヒドロキシカルボン酸を用いて重縮合反応を行った場合には、共重合ポリマーが得られる。具体的には、例えばグリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸、またはヒドロキシ吉草酸のそれぞれを単独で重縮合反応させた単独重合ポリマー、またはこれらのうち異なるもの同志を組み合わせて重縮合反応させた共重合ポリマー、またはこれらの１種類以上とε−カプロラクトン、δ−バレロラクトン、又はラクチド等の環状エステルとの組み合わせによる共重合ポリマーが例示できる。
【００３８】
そして、本発明にかかる電気絶縁性基板用の素材としては、成形性、強度の面から、単独重合ポリマーよりも、２成分以上を重縮合された共重合ポリマーが好ましい。具体的には、例えばヒドロキシ酪酸とヒドロキシ吉草酸とを組合せたものが好ましい。なお、２成分以上の共重合ポリマーの場合には、共重合比によって融点が変化するが、ヒドロキシ酪酸とヒドロキシ吉草酸との共重合ポリマーにおいては、ヒドロキシ吉草酸を２〜４０モル％の範囲とすると、約１７０℃から９０℃の融点を有するポリマーが得られる。
【００３９】
本発明にかかる電気絶縁性基板は、上記した全脂肪族ポリエステル系樹脂の一つを単独で使用したものであってもよく、また種類の異なる複数の全脂肪族ポリエステル系樹脂同志をブレンドして用いてもよい。異なる性質のポリマーをブレンドした場合、単独のポリマーでは得られない好適な性質（例えば成形性、強度、耐熱性など）が得られる場合があるからである。
【００４０】
更に、本発明にかかる電気絶縁性基板には、上記したポリマー（全脂肪族ポリエステル系樹脂）以外のポリマーやその他の物質を含めることもできる。このような成分としては例えば二酸化チタンが挙げられ、電気絶縁性基板に二酸化チタンを少量添加すると、絶縁性基板を白色化でき、基板上の付着物等の確認が容易になるという効果が得られる。但し、全脂肪族ポリエステル系樹脂以外の成分が多くなると、電気絶縁性基板の親和性や生分解性に悪影響を与えるので、全脂肪族ポリエステル系樹脂以外の添加成分は電気絶縁性基板重量に対し、５０重量％未満とするのがよい。５０重量％未満であれば、全脂肪族ポリエステル系樹脂の性質が基板の特性を決定する支配的要因となるからである。
【００４１】
全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分とする本発明にかかる電気絶縁性基板の技術的意義を更に説明する。
上記した如く、全脂肪族ポリエステル系樹脂は、電極や生体由来の分子識別素子との密着性・親和性に優れる。したがって、このような樹脂を主成分とする絶縁性基板であると、基板に対し予め特別な前処理を行わなくとも、基板面に直接、電極や分子識別素子を形成できる。そして、この基板は特に酵素や生体組織等の生体由来の素子（即ち分子識別素子）との親和性に優れ、他方これらの生体由来の素子は、通常ある程度の粘着力を有しているので、これらの生体由来の素子は、特別な粘着剤を使用しなくとも十分に実用に耐える付着力をもって基板に付着する。よって、分子識別素子を極めて作業性よく基板に定着でき、必要に応じて分子識別素子を基板に付着させた後、例えばメチルセルロース被膜等からなる保護膜で素子表面を覆えば、分子識別素子を一層強固に定着し得たバイオセンサーとできる。
【００４２】
また、上記の全脂肪族ポリエステル系樹脂は、生体成分に近似した性質を有するものであるので容易に燃焼すると共に、生分解性を有するので、土中に埋めて自然分解させることができる。よって、使用済のバイオセンサーの廃棄に際して、自然環境を害することがない。
【００４３】
これに対し、従来から実用に供され、または提案されている他の電気絶縁性基板材料、例えばシリコンなどの無機系基板、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート又はポリブチレンテレフタレートの半芳香族ポリエステル、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリエーテルサルホン、ポリアリレート、ポリエーテルケトン、ポリオレフィン等の合成樹脂からなる基板材料は、電極や生体由来の成分に対する親和性が低い。したがって、前処理や後処理を行うことなく、基板面に対し直接、分子識別素子を定着した場合、製品の取扱中や使用中（測定中）において、電極や分子識別素子が基体から剥離する。更に、これらの物質は、完全燃焼しなかったり、微生物耐性が高かったりするので、廃棄に際し自然環境を害する恐れがある。
【００４４】
なお、廃棄対象となるバイオセンサーは、基板と電極と分子識別素子で構成されているが、処分性の良否は基板材質の特性により概ね決定される。なぜなら、電極は、金や白金や炭素導電体などの素材からなり、かつ使用量が少ないので、自然環境を破壊することがない。また、生体由来物質である分子識別素子は、完全に焼却でき、埋め立てによっても容易に生分解して自然環境に同化するからである。
【００４５】
以上から、本発明バイオセンサーは、基板に対する前処理工程や後処理工程を必須としないので、従来のバイオセンサーに比べ低コストでもって製造できる。しかも、廃棄に際し公害を発生しないので、自然環境保全という社会性も備えている。なお、本発明バイオセンサーにおいても、前記した公知の前処理や後処理を施すことができることは勿論であり、これらの手段を用いることにより一層高品質の電極型バイオセンサーが得られる。
【００４６】
本発明で使用する分子識別素子としては、種々の生体由来の物質が使用でき、特に制限されるものではないが、通常、酵素、抗体または抗原、微生物、オルガネラ、レセプタ、細胞組織よりなる群から選択されるものが使用される。以下、具体例で説明する。
【００４７】
酵素センサーでは、検体の測定対象によって分子識別素子としての酵素の種類を変える。例えば測定対象がグルコースの場合はグルコースオキシターゼ、測定対象がエタノールの場合はアルコールオキシターゼ、測定対象が乳酸の場合は乳酸オキシターゼ、測定対象が尿酸の場合はウリカーゼを用いる。
【００４８】
免疫センサーでは、抗原抗体反応を利用し、例えばヒト血清アルブミンを測定する場合は、分子識別素子として抗アルブミンを用いる。なお、免疫センサーにおいては、抗原抗体複合体の形成によって変動する膜電位を捕らえることになる。
【００４９】
微生物センサーでは、分子識別素子として、例えばPseudomonas fluorescence（測定対象；グルコース）、Trichosporon brassicae（測定対象；エタノール）などの微生物を用いる。これらの微生物は、酸素呼吸（好気性）し、或いは酸素のない環境で代謝物を生成するので、酸素呼吸量または代謝産物を電位的にとらえることになる。
【００５０】
オルガネラセンサーでは、分子識別素子として細胞小器官を用いる。例えばミトコンドリアの電子伝達粒子を用いると、ＮＡＤＨが測定できる。この原理としては、ミトコンドリアの電子伝達粒子によりＮＡＤＨが酸化され、この際酸素が消費されるので、この酸素を指標としてＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを測定することができる。
【００５１】
レセプタセンサーでは、分子識別素子として受容体である例えば細胞膜などを用いる。検体としては、ホルモンとか神経トランスミックが対象となる。測定原理としては、受容の変化を電位に変換し、電極を通じて測定することになる。
【００５２】
組織センサーでは、分子識別素子として動植物の組織を用いる。動植物の組織としては、例えばカエルの皮膚とか、動物の肝切片、キウリ、バナナの皮などが使用できる。測定原理としては、例えばカエルの皮膚組織を用いたナトリウムセンサーでは、カエルの皮膚組織がナトリウムイオンを選択的に透過し、その際皮膚組織の電位が変化するので、この電位変化を測定しナトリウムイオン量を求める。
【００５３】
次に電極について説明する。
本発明電極型バイオセンサーにおいては、基板上に２〜３極の電極を形成し、これをセンサー単位とする。２極で１つのセンサー単位を構成する場合には、各々の電極は、作用極（分子識別素子を必須的に備える電極）と対極とを１組とし、３極で１つのセンサー単位を構成する場合には、他の一つの電極を参照極とする。２極とするか３極とするかは、分子識別素子の種類や測定原理等を考慮して望ましい形態を選択する。
【００５４】
上記電極の材質としては、白金、金、銀等の金属や、カーボン導電体（例えば導電性カーボン混入のペースト状樹脂）などが使用できる。好ましくは電気良導性であり腐蝕を受けにくく、かつ前記基板との密着性も良好であることから、白金、金またはカーボン導電体を用いる。
【００５５】
上記の２〜３極の電極は、図１、４に示すように、可能なかぎり近接させて配置すると共に、足部分（図１の矢印２１のリード部）よりも先端部分（図１の矢印２０）の大きい形状が良い。また、バイオセンサーでは、分子識別素子が生体由来の物質であり、一度測定に用いると検体成分で汚染され易い。よって、測定の度に新品と交換する使い捨て型の使用形態が好ましい。
【００５６】
使い捨て型の形態としては、例えば、対極や参照極は繰り返し使用でき、作用極のみを測定の度に脱着し新品に交換できる単品取替え方式とするのもよい。また、一枚の基板上に複数のセンサー部を形成した連設型のバイオセンサーとなし、この連設型バイオセンサーを用いることにより、複数の検体を連続的に測定する形態とするのもよい。
【００５７】
上記連設型バイオセンサーにおいては、好ましくは各センサー部およびセンサー部を構成する各電極を一定の間隔で規則的に配列する。このように配列した連設型のバイオセンサーであると、検液を各々のセンサー部の検知領域に滴下する方法により、同時または連続的な測定が可能になる。連設型バイオセンサーのセンサー部の配設数は特に限定されるものではないが、一般には１０〜２０個とする。そして、図１のごとくセンサー部を横列に配列するか、または図４のごとく円形状に配列する。センサー部が円形状に配設された連設型バイオセンサーであると、基板を回転する方法により連続的な使い捨て態様の測定が可能になる。更に、各センサー部の間隔としては、測定効率の面やコスト面から、好ましくは検液が隣のセンサー部にまで漏れ出ない範囲においてできるだけ狭くし、全体をコンパクトにするのがよい。
【００５８】
次に、本発明電極型バイオセンサーの製造方法について詳細に説明する。
【００５９】
まず、電気絶縁性基板として、全脂肪族ポリエステル系樹脂からなるシート状の基板を（厚さ約０．１〜２ｍｍ程度）を用意し、そのまま又は表面をアルコールで脱脂洗浄する。この基板に対し、導電性材料を用いて電極を形成する。導電性材料としては、金、白金、銀等の金属、或いは炭素導電体などが使用でき、金属を用いる場合には、スパッタリング法、金属性凸版によるホットスタンピング法を用いて電極形成を行う。具体的には次のようにして行う。
【００６０】
スパッタリング法においては、２つの方法が例示できる。その一つは、金属板等に所望する形状の電極パターンを形成したマスク板を予め作製しておき、このマスク板を前記基板面に密着させ、前記マスク板側を白金又は金などのインゴットからなるターゲットと対向させてスパッタリング装置内にセッティングし、該槽内をアルゴン等の不活性雰囲気で満たし、そこに直流電源又は高周波電源を印加する。そうすると、不活性ガスのイオンがターゲットに衝突し、ターゲットからはじき出された原子（スパッタリング粒子）が、マスキング板の貫通パターンを通って前記基板上に付着する。これにより、白金や金からなる所望形状の電極が形成できる。
【００６１】
他の一つは、マスキング板を用いずに行う方法である。先ず、上記と同様な方法により、基板片面の全面に金、白金等の薄膜を形成せしめる。次に、写真製版法とエッチング法を用いて、薄膜を所望形状に加工する。この方法は、一枚の基板面に多数の電極を一度に形成せしめる場合に有用である。尚、電極としての薄膜の厚さは任意に設定できるが、一般には１０００〜３０００Å程度とする。
【００６２】
ホットスタンピング法では、次のようにして電極を形成する。先ず、亜鉛、真鍮等の金属板に写真製版法とエッチング法を用いて、所望する電極パターン形状を凸状に形成する（凸版製版）。この凸版をホットスタンピング装置の台の上面に装着して前記凸版を転写可能な温度に加熱する。該台の下面に絶縁性基板をセットし、該台と基板との間に金又は白金を蒸着した転写箔を配置した後、所定速度で前記凸版を降下し転写箔を基板に加熱加圧する。これにより、転写箔の蒸着金または蒸着白金が凸版の形成パターンに切断、剥離されて基板面に転写され、白金または金からなる電極が基板上に形成される。
【００６３】
上記ホットスタンピング法における加熱温度、加圧力、加圧時間は、転写箔の種類や蒸着金属の種類を考量して適当に設定する必要があり、予備的実験により具体的条件について事前確認しておくのが良い。一般には温度１００〜１５０℃、圧力３〜６ｋｇ／ｃｍ²、維持時間０．１〜０．５秒程度とする。ホットスタンピング方法によると、前記スパッタリング方法による場合に比較して、電極と基板との密着性がよいと共に、基板面に直接的、連続的に電極を形成することができるという利点がある。よって、本発明においては、好ましくは電極材料として金、白金などを用い、電極形成手段として、ホットスタンピングを用いる。
【００６４】
但し、単に基板面に塗布するだけで電極が作製できること、低コストであること、および完全に燃焼する材質であることなどから、カーボン導電体で電極を形成するのもよい。なお、カーボン導電体からなる電極は、金や、白金からなる電極に比較した場合、導電性がやや悪いので、カーボン導電体が有する導電性で十分である使用用途において、カーボン導電体電極を採用する。カーボン導電体電極の形成方法としては、基板上に導電性カーボン粉体を含む樹脂のペースト状物を所望の電極パターンに塗布または印刷する方法により行うことができる。
【００６５】
次に、電極が形成された基板に分子識別素子を固定化する方法につい説明する。
【００６６】
本発明においては、分子識別素子の固定化方法や定着方法については特別な制限はなく、基板上に形成された２〜３極の電極の検知領域全体、または作用極とすべき電極の周囲に常法により固定化された分子識別素子を定着し、必要に応じてその上をアセチルセルロースなどの保護膜で覆えばよい。
【００６７】
ところで、前記したごとく、一般に生体由来の物質（分子識別素子）は粘着力が強く、他方、前記全脂肪族ポリエステル系樹脂を主体とする基板は、生体由来物質との親和性に優れる。よって、本発明においては、生体由来物質である分子識別素子をそのまま、或いは溶液状として電極の先端部分（検知領域となる部分）を中心にして基板にコーティング（デッピング、ロールコーティング等）、塗布、貼着等し、乾燥（常温又は加熱）する方法により、十分に基板面に密着固定させることができる。
【００６８】
なお、上記「十分に」とは、測定中や取扱い中に剥離することのない程度を意味する。また、バイオセンサーでは、せいぜい２〜３回の繰り返し使用ができれば十分であり、この程度の繰り返し使用であれば、担持体に担持させる方法を用いなくともよい場合が多い。但し、下記に例示するように、酵素等の分子識別素子材料をを担持体に担持させ塗布等してもよいことは勿論であり、このような方法を用いた場合においては、繰り返し使用に耐えるバイオセンサーが得られる。担持体に担持せしめる手段としては、例えば包括法、架橋法、担体結合法等が例示でき、本発明においてはこれらの各方法が使用可能であり、固定化法により制限を受けるようなことはない。
【００６９】
【実施例】
本発明の内容を実施例と比較例に基づいて、更に詳細に説明する。
（実施例１）
ヒドロキシ酪酸とヒドロキシ吉草酸との共重ポリエステル樹脂（融点約１５０℃）を少量の酸化チタンと共に１９０℃で溶融混練してペレット化し、このペレットを０．５ｍｍの厚さで押し出し成形し、縦８０ｍｍ×横５１ｍｍの大きさに切断して、白色の実施例１にかかる電気絶縁性基板を作製した。以下、この基板を基板１と称する。
【００７０】
他方、電極パターン形成用マスク板として、図３に示す縦１００ｍｍ×横６０ｍｍ、厚み０．１５ｍｍの大きさのステンレス板６を用意し、このステンレス板に写真製版法とエッチング法を用いて、３極を一組とし、これを横に５列並べた電極パターンを形成した。なお、電極パターンは、貫通された抜き型となっており、各電極相互のピッチ間隔は２ｍｍとしてある。また、図３中、７は作用極、７ａがその端子部分、８が対極、８ａがその端子部分、９が参照極、９ａがその端子部分の切り抜きを意味する。図３に示す電極パターン基板を電極パターン１とする。
【００７１】
次に、前記基板１上と電極パターン１とを重ね合わせて、下記条件で白金をターゲットとするスパッタリングを行ない、白金薄膜からなる５組の電極群を基板１上に形成した電極型バイオセンサー４個を作成した。
【００７２】
スパッタリング条件
・方式ＤＣスパッタ
・スパッタリング温度室温
・動作圧力７０×１０^-3Torr
・印加電圧６００Ｖ
・スパッタリング時間１０分
【００７３】
得られた白金薄膜の膜厚は１５００Åであり、形状、サイズはマスク板（電極パターン１）通りに忠実に再現されていた。この電極の形成された基板１を電極付基板１と称する。
電極付基板１について、電極と基板面との密着力を調べるために、５列の電極全体にセロテープ（登録商標）を張り付けて剥がす剥離テストを行った。その結果、５回の繰り返し剥離テストにおいては、電極の剥離が全く確認されなかった。
【００７４】
上記電極付基板１の電極（３極）の先端部全体に、次のようにして固定化したグルコースオキシターゼを添着した。先ず、ＰＨ＝７に調整したリン酸塩緩衝液に１５重量％の牛血漿アルブミンを溶解した溶液２００ｍｌを用意し、この溶液にグルコースオキシターゼ粉末を２０ｇ溶解し、担持体を含むグルコースオキシターゼ溶液（以下、酵素液１）を作製した。
【００７５】
他方、架橋剤液として、２５重量％のグルタルアルデヒドを溶解した水溶液２００ｍｌを用意した（架橋剤液１）。そして、前記酵素液１の１００ｍｌを用い、該液に３極の先端部分（図１の点線内；検知領域）を浸漬して、先端部分を酵素液で濡らした後、該液から上げて１．５分間の乾燥を行った。次に、今度は架橋剤液１を１００ｍｌ採取し、この液に上記先端部分を浸漬した後、上記と同様にして１．５分間乾燥した。このような酵素液と架橋剤液に対する浸漬・乾燥のサイクルを２回繰り返した後、先端部分をＰＨ＝７のリン酸塩緩衝液で洗浄し、乾燥した。これにより、グルコースオキシターゼのコーティング（定着操作）を完了した。この操作により形成されたグルコースオキシターゼ膜の膜厚は、２０〜２２μｍであった。
【００７６】
上記で定着させたグルコースオキシターゼ膜の電極面または基板面に対する密着力を、上記と同様、テープを用いた剥離テストで調べた。その結果、グルコースオキシターゼ膜は、２回の繰り返しで電極面からの部分的な剥離（剥離個数１０／電極数２０）が観察され、３回の繰り返しにおいては、基板面から部分的な剥離（剥離箇所２／基板数４）が観察された。なお、部分的な剥離とは、電極面積の１／２〜１／４程度の剥離を意味する。
【００７７】
図１、２に、基板１上に形成された電極及びグルコースオキシターゼ膜（分子識別素子）の形状を示した。図１は平面図であり、図１中、１は電気絶縁性基板１であり、２は作用極、３は対極、４は参照極である。５（斜線を施した部分）は、グルコースオキシターゼ膜が定着された部分であり、この部分が検知領域となる。また、図１中、２０（矢で示す箇所）は、電極の足部であり、２１はリード部である。リード部２１は、検知領域５で検知した電気信号をトランスデューサ本体に伝える役割を担っている。なお、一般に足部２０はリード部２１よりも幅太に形成される。更に図２の２ａは、作用極２、対極３および参照極４からなる一組の電極群（センサー部）の部分拡大平面図であり、図２の２ｂは２ａにおけるＡ−Ａ線断面図、図２の２ｃは２ａにおけるＢ−Ｂ線断面図である。
【００７８】
図１、図２の２ａ〜２ｃに示すように、実施例１の電極型バイオセンサーは、作用極２、対極３、参照極４が一組となってセンサー部（センサー単位）を形成し、このセンサー部が合計５個横列に配列された形状になっている。そして、分子識別素子は、前記電極群の検知領域（５）を覆うようにして、基板１と電極の表面に定着されている。このような構造の電極型バイオセンサーであると、基板と電極と分子識別素子以外の部材を必要としないので、作製が容易である。また、本発明にかかる基板は、生体由来の分子識別素子（この例ではグルコースオキシターゼ）と親和性がよいので、分子識別素子を基板に強力に密着させることができる。
【００７９】
なお、５個横列に配列されたセンサー部の各々を切り離して一個のバイオセンサーとして使用することができ、切り離すことなく使用することもできることは勿論である。
【００８０】
（比較例１）
実施例１の基板１に代えて、厚さ１８０μｍのポリエチレンテレフタレートフィルムからなる基板を用いたこと以外は、実施例１と同様にして比較例１にかかる電極型バイオセンサー４個を作製した。この比較例１においても、外見上、グルコースオキシターゼ膜は実施例１と同様に良好な形状にコーティングされていた。そこで、実施例１と同様にして、セロテープ（登録商標）による剥離テストを各バイオセンサーについて行って基板等に対する密着力を調べた。その結果は次の通りであった。
【００８１】
１回の剥離テストで、グルコースオキシターゼ膜が、フィルム基板面からも電極面からも部分的に剥離した。次に、フィルム基板と電極との密着力を調べるために、グルコースオキシターゼ膜を完全に除去してフィルム基板面上を電極のみとなし、電極にセロテープ（登録商標）を張り付けて剥離テストを行った。その結果、２回目で全ての電極がフィルム基板面から剥離した。
【００８２】
実施例１と比較例１における剥離テストの結果から、実施例１にかかる基板は、比較例１にかかるポリエチレンテレフタレートフィルム基板に比較し、電極やグルコースオキシターゼ膜に対する親和性・密着性が顕著に優れることが実証できた。
【００８３】
（実施例２）
テトラメチレンジオールとジエチレンジカルボン酸との重縮合反応によって得た融点１１０〜１２０℃の脂肪族ポリエステル樹脂をペレット化し、これを厚さ０．５ｍｍのシートに溶融成形したものを直径５０ｍｍの円盤状に切断したものを、電気絶縁性基板とした。以下、この基板を円形基板２と称する。
【００８４】
他方、図４に示す通りの作用極と対極からなる一組の電極群を２０個配列した電極パターンを円盤状のマスキングフィルム（ネガフィルム）に形成した。そして、このマスキングフィルムを使って、厚さ３ｍｍの真鍮板に写真製版法とエッチング法を用いて、凸版（深度１ｍｍ）の対応画像を形成し、これをホットスタンピング用凸版と成した（以下、これを真鍮凸版と称する）。
【００８５】
更に、転写箔として、離型用シリコーンをコーティングした厚さ２５μｍのポリエチレンテレフタレートフィルム上に、白金を厚さ約５００Åに真空蒸着し、更に白金蒸着面にアクリル系の接着剤をコーティングした白金転写箔を作製した。
【００８６】
次いで、ホットスタンピング機の上盤に、前記真鍮凸版をセットし、１３５℃に加熱すると共に、受台上に円形基板２を配置し、前記凸版と円形基板２との間に白金転写箔を配置した後、上盤を降下し、前記凸版を円形基板２に対し５ｋｇ／ｃｍ²の圧力で０．３秒の間押圧した。これにより、円形基板２に白金転写箔が転写されて、マスキングフィルムの電極パターン画像と１対１の関係の電極群が形成された。
【００８７】
このようにして電極が形成された円形基板２に対し、実施例１と同様にして、セロテープ（登録商標）による剥離テストを行った。その結果、５回の繰り返しの剥離テストにおいて、基板からの電極の剥離が剥離個数５／全数２０の割合で観察された。
【００８８】
他方、前記電極付き円形基板２を用い、２０組の電極群の先端部全体（図４の点線の外側；この部分が検知領域となる）に、分子識別素子としてのウリカーゼ（尿酸測定用酵素）をコーティングし、定着させた。具体的には、ウリカーゼを若干のエチルアルコールを加えて超純水に溶解して溶液と成し、この溶液を電極の形成された円形基板２の検知領域に塗布し、乾燥するサイクルを３回繰り返した。定着したウリカーゼ膜の膜厚は、２０μｍであった。
【００８９】
次に、ウリカーゼ膜の密着力を上記と同様にして、剥離テストにより調べた。その結果、２回目に剥離個数１５／全数２０の割合で部分的な剥離（ウリカーゼ膜面積の約１／４）が観察された。この結果からして、ウリカーゼ膜（分子識別素子）の密着力は、前記実施例１のグルコースオキシターゼ膜よりも弱いことが判った。但し、２回目で部分剥離する程度の密着力があれば、取扱い中や測定中において分子識別素子が剥離または離脱してしまう程度ではなく、十分に実用に耐える程度の密着力である。
【００９０】
上記方法で作製した円盤状の電極型バイオセンサーの形状を図４に示した。図４中、１０はテトラメチレンジオールとジエチレンジカルボン酸との重縮合反応によって得た融点１１０〜１２０℃の脂肪族ポリエステル樹脂からなる円形基板２であり、１１は作用極、１２は対極である。また１１ａは作用極の外部側端子、１２ａは対極の外部側端子であり、この１１ａ、１２ａを介して電極に電圧が印加されると共に、検知された電気信号がトランスデューサ側に入力されることになる。なお、図４の点線の外側は、ウリカーゼが定着された検知領域である。また、この図４に対応するマスキングフィルムは、像部が透明で、他の部分が光不透過となるように描写されている。
【００９１】
（比較例２）
実施例２の円形基板２に代えて、０．５ｍｍのポリカーボネートシートを用いたこと以外は、実施例２と同様にしてポリカーボネートシート基板に電極群を形成した。そして、実施例２と同様にして、電極に対するセロテープ（登録商標）による剥離テストを行った。その結果、３回の剥離テストにおいて基板からの電極の剥離が剥離個数６／全数２０の割合で観察された。
【００９２】
他方、実施例２と同様にして電極の形成されたポリカーボネートシート基板に対し、ウリカーゼ溶液を電極先端部に塗布して、膜厚２１μｍのウリカーゼ膜を形成した。このウリカーゼ膜についても、実施例２と同様にして剥離テストを行った。その結果、ウリカーゼ膜は１回の剥離テストで電極から完全に剥離してしまった。
【００９３】
以上の実施例２と比較例２との剥離テストの結果から、テトラメチレンジオールとジエチレンジカルボン酸とを重縮合させた全脂肪族ポリエステル系樹脂を用いた本発明にかかる電気絶縁性基板は、ポリカーボネートシートからなる基板に比較し、電極及び酵素との密着力が高いことが実証された。
【００９４】
なお、本発明者らは、実施例１にかかる基板１および実施例２にかかる円形基板２は、完全に燃焼させることができ、また土中に埋めた場合、土壌微生物の作用を受け６ヶ月程度で分解することを確認している。
【００９５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、電極型バイオセンサーの電気絶縁性基板として全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分とする基板を用いる本発明によると、従来の電極型バイオセンサーに比較して、次のような優れた効果が得られる。
【００９６】
(1)上記電気絶縁性基板は、電極や生体由来の分子識別素子との親和性・密着性がよいので、基板に対し特別な部材（前処理）を施すことなく、基板面上に直接的に電極や分子識別素子を形成した場合であっても、十分に実用に耐える密着力が確保できる。したがって、本発明によると、簡単な構造でもって高品質のバイオセンサーが実現できる。
【００９７】
(2) 電極や分子識別素子に対する親和性に優れた上記基板を用い、スパッタリング法やホットスタンピング法で電極を形成する本発明製造方法によると、複雑な工程を経ることなく、一度に複数のバイオセンサーを歩留りよく生産できる。したがって、本発明製造方法によると、高品質のバイオセンサーが安価に提供できる。
【００９８】
(3) 更に、全脂肪族ポリエステル系樹脂を主成分とする本発明にかかる電気絶縁性基板は、熱焼却が容易であると共に、生分解性であるので土中に埋め自然分解させることもできる。したがって、本発明によると、廃棄における公害問題が解消できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の電極型バイオセンサーの平面図である。
【図２】実施例１の電極型バイオセンサーの形状を説明するための図であり、２ａは図１の部分拡大図、２ｂは２ａのＡ−Ａ線断面図、２ｃは２ａのＢ−Ｂ線断面図である
【図３】実施例１にかかる電極パターン形成用マスク板の平面図である。
【図４】実施例２の電極型バイオセンサー（円形形）の平断面図である。
【符号の説明】
１基板１
２作用極
３対極
４参照極
５グルコースオキシターゼ膜
６ステンレス板
７作用極部分
７ａ作用極の足部分
８対極部分
８ａ対極の足部分
９参照極部分
９ａ参照極の足部分
１０円形基板２
１１作用極
１２対極
１１ａ作用極端子
１２ａ対極端子[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrode-type biosensor formed by forming a sensor part composed of an electrode and a biological molecular identification element on an electrically insulating substrate.
[0002]
[Prior art]
The biosensor has a feature that a specific component in a specimen can be easily qualitatively and quantitatively analyzed without pre-treating the specimen. Such a biosensor basically captures a molecular identification element derived from a living body that selectively reacts with a specific component, and changes when the specific component reacts with the molecular identification element, and finally converts it into an electrical signal. And a transducer (signal converter) for output. A transistor, thermistor, optical device or the like is used as the sensing part of the transducer. Generally, an electrode is used, and a biosensor using the electrode is generically called an electrode-type biosensor. The electrode-type biosensor is further classified into an enzyme sensor, an immunosensor, a microorganism sensor, an organelle sensor, a tissue sensor, a receptor sensor, and the like depending on the type of molecular identification element to be used.
[0003]
By the way, the electrode-type biosensor such as the enzyme sensor described above is generally manufactured by a method in which an electrode is formed on a sheet-like electrically insulating substrate, and a living body-derived molecular identification element is fixed around the electrode. Therefore, the quality of the affinity (ease of familiarity) between the electrically insulating substrate, the molecular identification element, and the electrode determines the production yield and performance of this type of biosensor. If the affinity between the substrate and the molecular identification element or electrode is poor, the electrode or molecular identification element cannot be sufficiently adhered to the substrate surface, causing problems such as separation of the electrode or molecular identification element from the substrate surface. This is because the measurement accuracy varies.
[0004]
However, conventionally used inorganic materials such as ceramics and polymer materials such as polyethylene terephthalate as substrate materials for electrode-type biosensors do not have sufficient affinity and adhesion with electrode materials. Therefore, for example, a method (pretreatment method) such as applying a discharge treatment with corona plasma on the substrate surface or providing an anchor coating layer made of nickel, chromium, ITO, etc., improves the adhesion between the insulating substrate and the electrode. Conventionally, it is used as a means to do this.
[0005]
Furthermore, as means for improving the adhesion between the insulating substrate and the biological molecular identification element, for example, a polymerizable compound having an amino group is applied to the substrate surface, and this is irradiated with plasma to form a polymer film on the substrate surface. Coating, Nafion (trade name of DuPont), which is a solid polymer electrolyte, or coating a substrate with CM-dextrin, and further enveloping the molecular identification element with a film of cellulose, etc. (Post-processing method) is used. Recently, a method has been proposed in which a polar group such as an amino group, a hydroxy group, or a carboxyl group is introduced into a molecule of a polymer resin to increase the affinity for a molecular identification element.
[0006]
Electrode biosensors made using these technologies have good adhesion and adhesion between the substrate and the electrodes and biological molecular identification elements. There is little fear of peeling from the surface. Therefore, it is possible to perform qualitative and quantitative determination of specific components with high accuracy.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, when the above technique is adopted, the biosensor manufacturing process becomes complicated. Therefore, the manufacturing yield rate decreases and the manufacturing cost increases. Furthermore, depending on the material of the substrate and the type of molecular identification element, it may be difficult to apply the above technique.
[0008]
In addition, since the electrode-type biosensor is mainly used for qualitative and quantitative determination of biological components, the sensor after use may be contaminated with pathogenic bacteria, and the identification element is derived from a living organism. It is easy to adsorb components in the specimen. Therefore, the biosensor is preferably a disposable use mode in which the sensor is replaced for each specimen. In this case, however, from the viewpoint of pollution prevention, how to dispose of a large amount of used sensors becomes a problem.
[0009]
Here, polymer resins such as polyethylene terephthalate, which has been used as an insulating substrate material in the past, may generate high-temperature incineration heat to the extent that the incinerator is damaged or may not burn out completely. Inorganic materials such as do not burn and cannot be incinerated. Furthermore, since both materials are materials that are difficult to be decomposed by microorganisms or the like, there is a problem that the disposal of landfills will harm the natural environment. That is, the conventional electrode-type biosensor has a problem even after use.
[0010]
The present invention has been made in view of the above, and has devised an electrically insulating substrate that can fix an electrode and a molecular identification element derived from a living body with sufficient adhesion, and that can be rapidly pyrolyzed or biodegraded upon disposal. By using this substrate, it is possible to provide an electrode-type biosensor that can qualitatively and quantitatively determine biological components at the time of use without causing the application of the above technique and that does not cause waste pollution after use. With the goal.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention has the following configuration.
The invention according to claim 1 is an electrode-type biosensor in which a sensor unit including an electrode and a biological molecular identification element located near the surface of the electrode is formed on an electrically insulating substrate. The electrical insulating substrate is composed of a total aliphatic polyester resin having a melting point of 70 to 170 ° C. as a main component.
[0012]
An electrically insulating substrate composed mainly of an all-aliphatic polyester resin having a melting point of 70 to 170 ° C. has good adhesion and adhesion to electrode materials, and is particularly excellent in affinity to a molecular identification element derived from a living body. . Therefore, the electrode-type biosensor having the above-described structure facilitates fixing of the electrode and the molecular identification element on the substrate, so that the manufacturing workability is good and the product yield is improved. In addition, it is difficult to cause a phenomenon in which the molecular identification element is peeled off during the handling of the product or the molecular identification element is released into the sample liquid during measurement.
[0013]
Furthermore, since the total aliphatic polyester-based resin has the property of being thermally decomposed and decomposed by microorganisms, incineration disposal and landfill disposal are electrode-type biosensors using an insulating substrate made of such a material. Any of these can be selected, and does not harm the natural environment upon disposal.
[0014]
From the above, according to the above configuration, it is possible to provide an electrode-type biosensor that can quantify and qualify biological components with high reliability and is excellent in environmental performance.
[0015]
The invention according to claim 2 is the electrode biosensor according to claim 1, wherein the total aliphatic polyester resin is a polycondensation polymer of an aliphatic diol and an aliphatic dicarboxylic acid, or two aliphatic hydroxycarboxylic acids. It is characterized in that it is mainly composed of any of the copolymerized polymers.
[0016]
Polycondensation polymer of aliphatic diol and aliphatic dicarboxylic acid or copolymer of two kinds of aliphatic hydroxycarboxylic acid has high polarity and good affinity for biological molecular identification elements, and also acts as a microorganism It has a property (biodegradability) that can be degraded by Therefore, when an electrically insulating substrate containing such a polymer as a main component is used, an electrode-type biosensor excellent in measurement accuracy and non-polluting in disposal can be obtained.
[0017]
The invention according to claim 3 is the electrode type biosensor according to claim 1 or 2, wherein the molecular identification element is selected from the group consisting of an enzyme, an antibody or an antigen, a microorganism, an organelle, a receptor, and a cell tissue. It is characterized by being.
[0018]
Each element derived from the living body is useful as a molecular identification element. On the other hand, the all-aliphatic polyester resin, which is the main material of the electrically insulating substrate, has extremely high affinity with these elements derived from the living body. Therefore, an electrode-type biosensor that selects and uses a suitable element that matches the substance to be measured from the group consisting of enzymes, antibodies or antigens, microorganisms, organelles, receptors, and cell tissues can be used with high reliability. It can be detected.
[0019]
The invention according to claim 4 is the electrode type biosensor according to any one of claims 1 to 3, wherein the electrode is composed of two to three electrodes made of platinum, gold, or carbon conductor. To do.
[0020]
Platinum and gold are extremely excellent in conductivity, and an electrode can be easily formed on the substrate according to the present invention by using a sputtering method, a hot stamping method using a metallic relief, or a coating method. Further, although the carbon conductor is slightly inferior in conductivity compared to platinum and gold, an electrode can be easily formed by applying it to a paste and a substrate.
[0021]
These electrode materials are used to form at least a working electrode (an electrode that requires a molecular identification element) and a counter electrode, or a working electrode, its counter electrode, and a reference electrode are formed on a substrate, and these electrodes are formed. Although the sensor unit is composed of two to three electrodes, a sensor unit composed of a working electrode and a counter electrode is preferable for miniaturization of the electrode-type biosensor. On the other hand, in order to increase the reliability of measurement, it is preferable to use three poles including a reference pole.
[0022]
According to a fifth aspect of the present invention, in the electrode-type biosensor according to the fourth aspect, the electrode is directly formed on the surface of the electrically insulating substrate, and the molecular identification element has at least one polar detection region. It is directly fixed on the surface of the electrically insulating substrate so as to cover it.
[0023]
In this configuration, two to three electrodes are directly formed on the insulating substrate surface, and the detection region of at least one of the two to three electrodes (an electrode corresponding to a working electrode) is a molecular identification element. The molecular identification element is directly fixed on the insulating substrate surface so as to be covered, but in this configuration in which the electrode or molecular identification element is directly fixed on the substrate surface, the substrate and the electrode or molecular identification element are Since no other member is interposed between them, the necessary raw materials can be reduced accordingly, and the number of steps can be reduced. Therefore, according to this configuration, the manufacturing cost can be reduced. In addition, the said detection area means the electrode part inserted or immersed in a test substance (measuring object).
[0024]
By the way, the said structure becomes possible only by using the insulating substrate which has as a main the all aliphatic polyester-type resin excellent in the affinity and adhesiveness with respect to an electrode material or a biological-derived molecular identification element. This is because conventional insulating substrates made of silicon, polyethylene terephthalate, etc. have poor affinity and adhesion to electrode materials and biological molecular identification elements, so electrodes and molecular identification elements are directly attached to the surface of such substrates. In the case of fixing, the electrode and the molecular identification element are peeled off from the substrate even if a slight external force is applied. Therefore, a practically usable electrode-type biosensor could not be obtained. For this reason, as described above, in the conventional biosensor, in order to improve the affinity / adhesion with the electrode and the molecular identification element, it is common to perform a pretreatment such as applying other materials to the substrate in advance. there were. However, in the present invention having the above-described configuration, the pretreatment need not be performed, and accordingly, the production cost of the electrode type biosensor can be reduced.
[0025]
A sixth aspect of the present invention is the electrode type biosensor according to any one of the first to fifth aspects, wherein the sensor section is regularly arranged at a predetermined interval on a single electrically insulating substrate. And
[0026]
With this configuration, a large number of biosensors can be efficiently manufactured at one time. Further, by connecting each of the sensor units to a transducer, it is possible to form a measuring apparatus that can measure and process a large number of samples simultaneously. Further, in this configuration, since the plurality of sensor units are regularly arranged at a predetermined interval, each sensor unit can be sequentially moved (rotating motion or the like) and connected to the transducer. With the measurement apparatus of such an aspect, it becomes possible to continuously and automatically measure a large number of specimens.
[0027]
The invention according to claim 7 is a method for producing an electrode-type biosensor in which a sensor unit including an electrode and a biological molecular identification element located in the vicinity of the surface of the electrode is formed on an electrically insulating substrate. A sheet-like electrical insulating substrate composed mainly of an all-aliphatic polyester resin having a melting point of 70 to 170 ° C. is formed from platinum or gold by sputtering or hot stamping using a metallic relief. And forming a molecular identification element on the surface of the electrode and the electrically insulating substrate around the electrode so as to cover the detection region of at least one of the electrodes. And a step of applying the contained liquid material.
[0028]
The invention according to claim 8 is the method for producing an electrode-type biosensor according to claim 7, wherein the total aliphatic polyester resin is a polycondensation polymer of an aliphatic diol and an aliphatic dicarboxylic acid, or two kinds of It is characterized by comprising as a main component any one of copolymers of aliphatic hydroxycarboxylic acids.
[0029]
Furthermore, the invention of claim 9 is the electrode biosensor manufacturing method according to claim 7 or 8, wherein the molecular identification element is selected from the group consisting of an enzyme, an antibody or an antigen, a microorganism, an organelle, a receptor, and a cell tissue. It is characterized by being.
[0030]
According to the manufacturing method of the said Claims 7-9, the electrode type biosensor of the said Claims 1-6 can be manufactured efficiently. Therefore, according to these manufacturing methods, the quality of the electrode-type biosensor can be improved and the production cost can be reduced.
[0031]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
First, the all aliphatic polyester resin characteristic of the present invention will be described.
The all aliphatic polyester resin according to the present invention refers to a resin in which an aliphatic group is ester-bonded and this is a repeating unit to form a long-chain polymer, and does not have an aromatic group in the molecule. . A resin having an aromatic group is not preferable because biodegradation is difficult and disposal property is deteriorated.
[0032]
In the present invention, among all aliphatic polyester resins as described above, those having a melting point of 70 ° C. or higher and 170 ° C. or lower are used. If the melting point is less than 70 ° C., it is difficult to obtain a sheet having sufficient strength, and there is a risk of thermal denaturation when an electrode is formed using a hot stamping method. On the other hand, when the melting point exceeds 170 ° C., the molecular weight is large and the biodegradability is poor, and the affinity with the molecular identification element derived from a living body is deteriorated. Therefore, as the composition of the electrically insulating substrate for the electrode-type biosensor, a total aliphatic polyester resin having a melting point of 70 ° C. to 170 ° C. is used, more preferably a high molecular weight body having a melting point of 90 to 160 ° C. Average molecular weight Mn is about 30,000 or more).
[0033]
The above-mentioned all aliphatic polyester resin can be produced by the following two methods. One is a polycondensation reaction between glycol (aliphatic diol) and an aliphatic dicarboxylic acid, and the other is a polycondensation reaction of one or more aliphatic hydroxycarboxylic acids. And the homopolymerization or copolymerization of 70-170 degreeC of melting | fusing point can be obtained by adjusting a polymerization degree suitably using these manufacturing methods.
[0034]
The said manufacturing method is demonstrated with a specific example.
First, examples of the polycondensation reaction of glycol and aliphatic dicarboxylic acid include a combination of dimethylene glycol and dimethylene carboxylic acid or octamethylene dicarboxylic acid, a combination of tetramethylene glycol and dimethylene carboxylic acid, and decamethylene glycol. Combination with dimethylene-, tetramethylene-, hexamethylene- or octamethylene-dicarboxylic acids, eicosamethylene (C = 20) glycol and dimethylene-, tetramethylene-, hexamethylene- or octamethylene-dicarboxylic acids The combination with can be illustrated.
[0035]
In the above combination, when each component is one type, a homopolymer polymer is obtained. When two or more components are used and a polycondensation reaction is performed with three or more components, a copolymer polymer is obtained. And melting | fusing point can be changed by changing how to combine each component. Among these, from the viewpoint of moldability and strength of the molded product, a polymer reacted in the following combination is particularly suitable as the all aliphatic polyester resin according to the present invention.
[0036]
That is, it is a polymer reacted by a combination of dimethylene glycol and dimethylene carboxylic acid, or a combination of tetramethylene glycol and dimethylene carboxylic acid, and the melting point of these polymers is about 100 to 160 ° C.
[0037]
Next, the polycondensation reaction of aliphatic hydroxycarboxylic acid will be described.
In the polycondensation reaction using one kind of aliphatic hydroxycarboxylic acid, a homopolymerized polymer is obtained by intramolecular self-polycondensation, and when a polycondensation reaction is carried out using two or more kinds of aliphatic hydroxycarboxylic acids. A copolymer is obtained. Specifically, for example, a homopolymer polymer obtained by subjecting glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, or hydroxyvaleric acid alone to a polycondensation reaction, or a copolymer polymer polymerizing a polycondensation reaction by combining different ones of them. Or a copolymer of a combination of one or more of these and a cyclic ester such as ε-caprolactone, δ-valerolactone, or lactide.
[0038]
The material for the electrically insulating substrate according to the present invention is preferably a copolymer obtained by polycondensation of two or more components rather than a homopolymer from the viewpoint of moldability and strength. Specifically, for example, a combination of hydroxybutyric acid and hydroxyvaleric acid is preferable. In the case of a copolymer of two or more components, the melting point changes depending on the copolymerization ratio. However, in the copolymer of hydroxybutyric acid and hydroxyvaleric acid, the content of hydroxyvaleric acid ranges from 2 to 40 mol%. A polymer having a melting point of about 170 ° C. to 90 ° C. is then obtained.
[0039]
The electrically insulating substrate according to the present invention may be one using one of the above-mentioned all aliphatic polyester resins alone, or may be a blend of a plurality of different types of all aliphatic polyester resins. It may be used. This is because, when polymers having different properties are blended, suitable properties (for example, moldability, strength, heat resistance, etc.) that cannot be obtained with a single polymer may be obtained.
[0040]
Furthermore, the electrically insulating substrate according to the present invention may contain a polymer other than the above-described polymer (total aliphatic polyester resin) and other substances. An example of such a component is titanium dioxide. When a small amount of titanium dioxide is added to an electrically insulating substrate, the insulating substrate can be whitened, and the effect of facilitating confirmation of deposits on the substrate can be obtained. . However, if the amount of components other than the total aliphatic polyester resin increases, the affinity and biodegradability of the electrically insulating substrate will be adversely affected. , Less than 50% by weight. This is because if it is less than 50% by weight, the properties of the total aliphatic polyester resin become the dominant factor for determining the characteristics of the substrate.
[0041]
The technical significance of the electrically insulating substrate according to the present invention comprising all aliphatic polyester resin as the main component will be further described.
As described above, the all aliphatic polyester-based resin is excellent in adhesion and affinity with the electrode and the biological molecular identification element. Therefore, in the case of an insulating substrate containing such a resin as a main component, an electrode and a molecular identification element can be formed directly on the substrate surface without performing special pretreatment on the substrate in advance. And this substrate is particularly excellent in affinity with biologically derived elements (i.e., molecular identification elements) such as enzymes and biological tissues, while these biologically derived elements usually have a certain degree of adhesive strength. These bio-derived elements adhere to the substrate with an adhesive force that can be used practically without using a special adhesive. Therefore, the molecular identification element can be fixed to the substrate with extremely good workability. If the molecular identification element is attached to the substrate as necessary, and the surface of the element is covered with a protective film made of, for example, a methylcellulose coating, the molecular identification element is further increased. The biosensor can be firmly established.
[0042]
In addition, since the above-mentioned all aliphatic polyester-based resin has properties close to those of biological components, it easily burns and has biodegradability, so it can be buried in the soil and decomposed naturally. Therefore, when the used biosensor is discarded, the natural environment is not harmed.
[0043]
On the other hand, other electrically insulating substrate materials that have been conventionally used or proposed, for example, inorganic substrates such as silicon, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate or polybutylene terephthalate semi-aromatic polyester, polycarbonate, Substrate materials made of synthetic resins such as polyimide, polyamideimide, polyethersulfone, polyarylate, polyetherketone, and polyolefin have low affinity for electrodes and biological components. Therefore, when the molecular identification element is directly fixed to the substrate surface without performing pre-treatment or post-treatment, the electrode and the molecular identification element are peeled off from the substrate during handling or use (measurement) of the product. In addition, these substances do not burn completely or have high microbial resistance, which may harm the natural environment upon disposal.
[0044]
A biosensor to be discarded is composed of a substrate, an electrode, and a molecular identification element, but the quality of disposal is generally determined by the characteristics of the substrate material. This is because the electrode is made of a material such as gold, platinum, or a carbon conductor and has a small amount of use, so that the natural environment is not destroyed. In addition, the molecular identification element, which is a biological substance, can be completely incinerated and easily biodegraded by landfill and assimilated into the natural environment.
[0045]
As described above, the biosensor of the present invention does not require a pre-treatment process or a post-treatment process for the substrate, and can be manufactured at a lower cost than conventional biosensors. Moreover, since it does not cause pollution at the time of disposal, it also has the sociality of natural environment conservation. The biosensor of the present invention can be subjected to the known pre-treatment and post-treatment as described above, and a higher quality electrode-type biosensor can be obtained by using these means.
[0046]
As the molecular identification element used in the present invention, various biological substances can be used, and is not particularly limited, but is usually selected from the group consisting of enzymes, antibodies or antigens, microorganisms, organelles, receptors, and cell tissues. The one that is selected is used. A specific example will be described below.
[0047]
In the enzyme sensor, the type of enzyme serving as a molecular identification element is changed depending on the object to be measured. For example, glucose oxidase is used when the measurement target is glucose, alcohol oxidase is used when the measurement target is ethanol, lactate oxidase is used when the measurement target is lactic acid, and uricase is used when the measurement target is uric acid.
[0048]
An immunosensor utilizes an antigen-antibody reaction, and for example, when measuring human serum albumin, anti-albumin is used as a molecular identification element. In an immunosensor, a membrane potential that varies depending on the formation of an antigen-antibody complex is captured.
[0049]
In the microorganism sensor, microorganisms such as Pseudomonas fluorescence (measuring object: glucose) and Trichosporon brassicae (measuring object: ethanol) are used as molecular identification elements. Since these microorganisms breathe oxygen (aerobic) or produce metabolites in an oxygen-free environment, they take oxygen respiration rate or metabolites in an electric potential.
[0050]
Organelle sensors use organelles as molecular identification elements. For example, NADH can be measured by using mitochondrial electron transfer particles. As this principle, NADH is oxidized by mitochondrial electron transfer particles, and oxygen is consumed at this time. Therefore, NADH and NADPH can be measured using this oxygen as an index.
[0051]
In the receptor sensor, a receptor such as a cell membrane is used as a molecular identification element. Specimens include hormones and neurotransmission. As a measurement principle, a change in acceptance is converted into a potential and measured through an electrode.
[0052]
Tissue sensors use animal and plant tissues as molecular identification elements. As animal and plant tissues, for example, frog skin, animal liver slices, cucumbers, banana peels and the like can be used. As a measurement principle, for example, in a sodium sensor using frog skin tissue, the frog skin tissue selectively permeates sodium ions, and the potential of the skin tissue changes at that time. Find the amount.
[0053]
Next, the electrode will be described.
In the electrode-type biosensor of the present invention, two to three electrodes are formed on a substrate and used as a sensor unit. When one sensor unit is constituted by two poles, each electrode is composed of a working electrode (an electrode provided with a molecular identification element) and a counter electrode, and one sensor unit is constituted by three poles. In this case, the other one electrode is used as a reference electrode. Whether to use two or three poles is selected in consideration of the type of molecular identification element, the measurement principle, and the like.
[0054]
As the material of the electrode, metals such as platinum, gold, and silver, carbon conductors (for example, a paste-like resin mixed with conductive carbon), and the like can be used. Platinum, gold, or carbon conductor is preferably used because it is electrically conductive, hardly corroded, and has good adhesion to the substrate.
[0055]
As shown in FIGS. 1 and 4, the above-described two- to three-pole electrodes are arranged as close as possible, and the tip portion (the arrow portion in FIG. 1) is more distal than the foot portion (the lead portion of the arrow 21 in FIG. 1). 20) A large shape is preferable. Further, in the biosensor, the molecular identification element is a substance derived from a living body, and once used for measurement, it is easily contaminated with the sample component. Therefore, a disposable usage pattern in which a new one is exchanged for each measurement is preferable.
[0056]
As a disposable type, for example, a counter electrode or a reference electrode can be used repeatedly, and a single item replacement system in which only the working electrode can be detached and replaced with a new one at every measurement may be adopted. In addition, a continuous biosensor in which a plurality of sensor portions are formed on a single substrate may be used, and a plurality of specimens may be continuously measured by using this continuous biosensor. .
[0057]
In the continuous biosensor, preferably, each sensor part and each electrode constituting the sensor part are regularly arranged at regular intervals. In the case of the continuous biosensor arranged in this way, simultaneous or continuous measurement is possible by the method of dropping the test solution onto the detection region of each sensor unit. The number of sensor units provided in the continuous biosensor is not particularly limited, but is generally 10 to 20. Then, the sensor units are arranged in a row as shown in FIG. 1 or arranged in a circle as shown in FIG. When the sensor unit is a continuous biosensor in which the sensor unit is arranged in a circular shape, it is possible to perform continuous disposable measurement by a method of rotating the substrate. Furthermore, the interval between the sensor units is preferably as narrow as possible within the range in which the test solution does not leak to the adjacent sensor unit from the viewpoint of measurement efficiency and cost, and the whole should be compact.
[0058]
Next, the manufacturing method of the electrode type biosensor of the present invention will be described in detail.
[0059]
First, a sheet-like substrate (thickness of about 0.1 to 2 mm) made of a fully aliphatic polyester resin is prepared as an electrically insulating substrate, and the surface is degreased and washed with alcohol as it is. An electrode is formed on the substrate using a conductive material. As the conductive material, a metal such as gold, platinum, silver, or a carbon conductor can be used. In the case of using a metal, electrodes are formed using a sputtering method or a hot stamping method using a metallic relief. Specifically, this is performed as follows.
[0060]
In the sputtering method, two methods can be exemplified. One is that a mask plate in which an electrode pattern of a desired shape is formed on a metal plate or the like is prepared in advance, the mask plate is brought into close contact with the substrate surface, and the mask plate side is made of an ingot such as platinum or gold. It is set in a sputtering apparatus so as to face the target, and the tank is filled with an inert atmosphere such as argon, and a DC power source or a high frequency power source is applied thereto. Then, ions of the inert gas collide with the target, and atoms (sputtering particles) ejected from the target adhere to the substrate through the penetration pattern of the masking plate. Thereby, an electrode having a desired shape made of platinum or gold can be formed.
[0061]
The other is a method that does not use a masking plate. First, a thin film such as gold or platinum is formed on the entire surface of one side of the substrate by the same method as described above. Next, the thin film is processed into a desired shape using a photoengraving method and an etching method. This method is useful when a large number of electrodes are formed on one substrate surface at a time. In addition, although the thickness of the thin film as an electrode can be set arbitrarily, it is generally about 1000 to 3000 mm.
[0062]
In the hot stamping method, electrodes are formed as follows. First, a desired electrode pattern shape is formed in a convex shape on a metal plate such as zinc or brass using a photoengraving method and an etching method (letterplate making). The relief printing plate is mounted on the upper surface of a hot stamping apparatus and heated to a temperature at which the relief printing plate can be transferred. An insulating substrate is set on the lower surface of the table, a transfer foil on which gold or platinum is deposited is disposed between the table and the substrate, and then the relief plate is lowered at a predetermined speed to heat and press the transfer foil onto the substrate. As a result, the deposited gold or deposited platinum of the transfer foil is cut and peeled into a relief pattern, transferred to the substrate surface, and an electrode made of platinum or gold is formed on the substrate.
[0063]
The heating temperature, pressure, and pressurization time in the above hot stamping method need to be set appropriately taking into account the type of transfer foil and the type of vapor deposition metal, and specific conditions are confirmed in advance by preliminary experiments. Is good. Generally, the temperature is 100 to 150 ° C., the pressure is 3 to 6 kg / cm.²The maintenance time is about 0.1 to 0.5 seconds. Compared with the sputtering method, the hot stamping method has the advantages that the adhesion between the electrode and the substrate is good and that the electrode can be formed directly and continuously on the substrate surface. Therefore, in the present invention, gold, platinum or the like is preferably used as the electrode material, and hot stamping is used as the electrode forming means.
[0064]
However, the electrode may be formed of a carbon conductor because the electrode can be produced simply by applying it to the substrate surface, the cost is low, and the material is completely combusted. In addition, the carbon conductor electrode is used in applications where the electrical conductivity of the carbon conductor is sufficient because the electrode made of the carbon conductor is slightly poorer in conductivity than the electrode made of gold or platinum. To do. The carbon conductor electrode can be formed by a method in which a resin paste containing conductive carbon powder is applied or printed on a desired electrode pattern on a substrate.
[0065]
Next, a method for immobilizing the molecular identification element on the substrate on which the electrode is formed will be described.
[0066]
In the present invention, there are no particular limitations on the immobilization method or fixing method of the molecular identification element, and the entire detection region of the electrode having two or three electrodes formed on the substrate, or around the electrode to be the working electrode. A molecular identification element immobilized by a conventional method is fixed, and if necessary, it may be covered with a protective film such as acetylcellulose.
[0067]
By the way, as described above, generally, a substance derived from a living body (molecular identification element) has a strong adhesive force, while the substrate mainly composed of the all aliphatic polyester-based resin is excellent in affinity with the substance derived from a living body. Therefore, in the present invention, the molecular identification element, which is a biological substance, is used as it is or in the form of a solution, coating the substrate (dipping, roll coating, etc.), It can be sufficiently adhered and fixed to the substrate surface by a method such as sticking and drying (room temperature or heating).
[0068]
The term “sufficiently” means a degree that does not peel during measurement or handling. In addition, in the biosensor, it is sufficient that it can be used repeatedly two to three times at most, and in such a repeated use, there is often no need to use a method of supporting the carrier. However, as exemplified below, it is a matter of course that a molecular identification element material such as an enzyme may be supported on a carrier and applied, and when such a method is used, it can withstand repeated use. A biosensor is obtained. Examples of means for supporting the carrier include, for example, a comprehensive method, a crosslinking method, a carrier binding method, and the like. In the present invention, each of these methods can be used and is not limited by the immobilization method. .
[0069]
【Example】
The contents of the present invention will be described in more detail based on examples and comparative examples.
(Example 1)
A copolyester resin of hydroxybutyric acid and hydroxyvaleric acid (melting point: about 150 ° C) is melt-kneaded with a small amount of titanium oxide at 190 ° C to form a pellet, and the pellet is extruded to a thickness of 0.5 mm, length 80 mm X Cut to a size of 51 mm wide to produce a white electrically insulating substrate according to Example 1. Hereinafter, this substrate is referred to as a substrate 1.
[0070]
On the other hand, as a mask plate for forming an electrode pattern, a stainless steel plate 6 having a size of 100 mm × 60 mm and a thickness of 0.15 mm shown in FIG. 3 is prepared, and photolithography and etching are used for this stainless steel plate. An electrode pattern was formed in which five poles were arranged side by side as a set of poles. In addition, the electrode pattern is a penetrating die, and the pitch interval between each electrode is 2 mm. In FIG. 3, 7 is a working electrode, 7a is a terminal portion, 8 is a counter electrode, 8a is a terminal portion, 9 is a reference electrode, and 9a is a cutout of the terminal portion. The electrode pattern substrate shown in FIG.
[0071]
Next, the electrode-type biosensor 4 in which the substrate 1 and the electrode pattern 1 are overlapped and sputtering is performed using platinum as a target under the following conditions to form five sets of electrode groups made of platinum thin films on the substrate 1. Created.
[0072]
Sputtering conditions
・ Method DC sputtering
・ Sputtering temperature Room temperature
・ Operating pressure 70 × 10^-3Torr
・ Applied voltage 600V
・ Sputtering time 10 minutes
[0073]
  The obtained platinum thin film had a thickness of 1500 mm, and the shape and size were faithfully reproduced according to the mask plate (electrode pattern 1). The substrate 1 on which the electrodes are formed is referred to as an electrode-equipped substrate 1.
  For the substrate with electrode 1, in order to investigate the adhesion between the electrode and the substrate surface, the cellophane tape is applied to the entire five rows of electrodes.(Registered trademark)A peel test was performed to peel off the film. As a result, in the repeated peeling test of 5 times, no peeling of the electrode was confirmed.
[0074]
Glucose oxidase immobilized as follows was attached to the entire tip of the electrode (3 electrodes) of the substrate with electrode 1. First, 200 ml of a solution containing 15% by weight of bovine plasma albumin dissolved in a phosphate buffer adjusted to PH = 7 is prepared, 20 g of glucose oxidase powder is dissolved in this solution, and a glucose oxidase solution (hereinafter referred to as a carrier) containing a carrier is obtained. An enzyme solution 1) was prepared.
[0075]
On the other hand, 200 ml of an aqueous solution in which 25% by weight of glutaraldehyde was dissolved was prepared as a crosslinking agent solution (crosslinking agent solution 1). Then, 100 ml of the enzyme solution 1 was used, and the tip portion of the three electrodes (inside the dotted line in FIG. 1; detection region) was immersed in the solution to wet the tip portion with the enzyme solution, Dry for 5 minutes. Next, 100 ml of the crosslinking agent solution 1 was sampled, the tip portion was immersed in this solution, and then dried for 1.5 minutes in the same manner as described above. After such immersion / drying cycle with respect to the enzyme solution and the crosslinking agent solution was repeated twice, the tip portion was washed with a phosphate buffer solution of PH = 7 and dried. Thus, the glucose oxidase coating (fixing operation) was completed. The film thickness of the glucose oxidase film formed by this operation was 20 to 22 μm.
[0076]
The adhesion force of the glucose oxidase film fixed above to the electrode surface or the substrate surface was examined by a peel test using a tape as described above. As a result, the glucose oxidase film was partially peeled from the electrode surface (10 peels / 20 electrodes) after 2 repetitions, and partially peeled (peeled) from the substrate surface after 3 repetitions. Location 2 / number of substrates 4) was observed. In addition, partial peeling means peeling about 1/2 to 1/4 of the electrode area.
[0077]
1 and 2 show the shapes of the electrode and glucose oxidase film (molecular identification element) formed on the substrate 1. 1 is a plan view. In FIG. 1, 1 is an electrically insulating substrate 1, 2 is a working electrode, 3 is a counter electrode, and 4 is a reference electrode. Reference numeral 5 (shaded portion) denotes a portion where the glucose oxidase film is fixed, and this portion serves as a detection region. Moreover, in FIG. 1, 20 (location indicated by an arrow) is a foot portion of the electrode, and 21 is a lead portion. The lead portion 21 plays a role of transmitting the electrical signal detected in the detection area 5 to the transducer body. In general, the foot portion 20 is formed wider than the lead portion 21. Further, 2a in FIG. 2 is a partially enlarged plan view of a set of electrodes (sensor unit) including a working electrode 2, a counter electrode 3 and a reference electrode 4, and 2b in FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA in 2a. 2c in FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line BB in 2a.
[0078]
As shown to 2a-2c of FIG. 1, FIG. 2, the electrode-type biosensor of Example 1 forms a sensor part (sensor unit) with the working electrode 2, the counter electrode 3, and the reference electrode 4 as a set, A total of five sensor portions are arranged in a row. The molecular identification element is fixed to the surface of the substrate 1 and the electrode so as to cover the detection region (5) of the electrode group. The electrode-type biosensor having such a structure is easy to manufacture because members other than the substrate, the electrode, and the molecular identification element are not required. In addition, since the substrate according to the present invention has a good affinity with a living body-derived molecular identification element (glucose oxidase in this example), the molecular identification element can be strongly adhered to the substrate.
[0079]
Of course, each of the five sensor units arranged in a row can be separated and used as a single biosensor, and can be used without being separated.
[0080]
  (Comparative Example 1)
  Four electrode-type biosensors according to Comparative Example 1 were produced in the same manner as in Example 1 except that a substrate made of a polyethylene terephthalate film having a thickness of 180 μm was used in place of the substrate 1 of Example 1. Also in Comparative Example 1, in appearance, the glucose oxidase film was coated in a good shape as in Example 1. Therefore, in the same manner as in Example 1, the cello tape(Registered trademark)A peel test was conducted on each biosensor to examine the adhesion to the substrate. The results were as follows.
[0081]
  In one peel test, the glucose oxidase film was partially peeled from both the film substrate surface and the electrode surface. Next, in order to investigate the adhesion between the film substrate and the electrode, the glucose oxidase film is completely removed to make only the electrode on the surface of the film substrate, and the cellotape is applied to the electrode.(Registered trademark)Was peeled off and a peel test was conducted. As a result, all the electrodes were peeled off from the film substrate surface at the second time.
[0082]
From the results of the peel test in Example 1 and Comparative Example 1, the substrate according to Example 1 is significantly superior in affinity and adhesion to the electrode and glucose oxidase film as compared with the polyethylene terephthalate film substrate according to Comparative Example 1. I was able to prove that.
[0083]
(Example 2)
An aliphatic polyester resin having a melting point of 110 to 120 ° C. obtained by polycondensation reaction of tetramethylenediol and diethylenedicarboxylic acid is pelletized, and this is melt-molded into a sheet having a thickness of 0.5 mm into a disk shape having a diameter of 50 mm. The cut one was used as an electrically insulating substrate. Hereinafter, this substrate is referred to as a circular substrate 2.
[0084]
On the other hand, an electrode pattern in which 20 sets of electrode groups each having a working electrode and a counter electrode as shown in FIG. 4 were arranged was formed on a disk-shaped masking film (negative film). Then, using this masking film, a corresponding image of a relief plate (depth 1 mm) was formed on a brass plate having a thickness of 3 mm by using a photoengraving method and an etching method, and this was formed as a relief stamp for hot stamping (hereinafter referred to as “a relief stamp”). This is called a brass relief).
[0085]
Furthermore, as a transfer foil, a platinum transfer foil in which platinum is vacuum-deposited to a thickness of about 500 mm on a 25 μm-thick polyethylene terephthalate film coated with a release silicone, and an acrylic adhesive is coated on the platinum-deposited surface. Was made.
[0086]
Next, the brass relief plate is set on the upper plate of the hot stamping machine, heated to 135 ° C., the circular substrate 2 is arranged on the cradle, and the platinum transfer foil is arranged between the relief plate and the circular substrate 2. After that, the upper board is lowered, and the letterpress is 5 kg / cm with respect to the circular substrate 2.²For 0.3 seconds. As a result, the platinum transfer foil was transferred to the circular substrate 2, and an electrode group having a one-to-one relationship with the electrode pattern image of the masking film was formed.
[0087]
  For the circular substrate 2 on which the electrodes are formed in this manner, the cello tape is applied in the same manner as in Example 1.(Registered trademark)A peel test was performed. As a result, in five repeated peeling tests, peeling of the electrode from the substrate was observed at a ratio of peeling number 5 / total number 20.
[0088]
On the other hand, using the circular substrate 2 with electrodes, uricase (enzyme for measuring uric acid) as a molecular identification element is formed on the entire tip part of 20 groups of electrodes (outside the dotted line in FIG. 4; this part becomes a detection region). Was coated and fixed. Specifically, uricase is dissolved in ultrapure water by adding a little ethyl alcohol to form a solution, and this solution is applied to the detection region of the circular substrate 2 on which the electrode is formed and dried three times. Repeated. The film thickness of the fixed uricase film was 20 μm.
[0089]
Next, the adhesion of the uricase film was examined by a peel test in the same manner as described above. As a result, partial peeling (about ¼ of the uricase membrane area) was observed at a ratio of 15 peeled / total 20 in the second time. From this result, it was found that the adhesion of the uricase membrane (molecular identification element) was weaker than that of the glucose oxidase membrane of Example 1. However, if there is an adhesive force that can be partially peeled at the second time, the adhesion force is sufficient to withstand practical use, not to the extent that the molecular identification element is peeled or detached during handling or measurement.
[0090]
The shape of the disc-shaped electrode type biosensor produced by the above method is shown in FIG. In FIG. 4, 10 is a circular substrate 2 made of an aliphatic polyester resin having a melting point of 110 to 120 ° C. obtained by a polycondensation reaction of tetramethylenediol and diethylenedicarboxylic acid, 11 is a working electrode, and 12 is a counter electrode. 11a is an external terminal of the working electrode, and 12a is an external terminal of the counter electrode. A voltage is applied to the electrodes via the electrodes 11a and 12a, and a detected electric signal is input to the transducer side. Become. In addition, the outside of the dotted line in FIG. 4 is a detection region where uricase is fixed. Further, the masking film corresponding to FIG. 4 is depicted such that the image portion is transparent and the other portions are opaque.
[0091]
  (Comparative Example 2)
  An electrode group was formed on the polycarbonate sheet substrate in the same manner as in Example 2 except that a 0.5 mm polycarbonate sheet was used instead of the circular substrate 2 of Example 2. And in the same manner as in Example 2, the cellophane for the electrode(Registered trademark)A peel test was performed. As a result, peeling of the electrode from the substrate was observed at a ratio of the number of peeled 6 / the total number of 20 in the three peel tests.
[0092]
On the other hand, a uricase solution was applied to the tip of the electrode on a polycarbonate sheet substrate on which electrodes were formed in the same manner as in Example 2 to form a uricase film having a thickness of 21 μm. The uricase membrane was also subjected to a peel test in the same manner as in Example 2. As a result, the uricase membrane was completely peeled from the electrode in a single peel test.
[0093]
From the results of the peel test between Example 2 and Comparative Example 2 above, the electrically insulating substrate according to the present invention using the all aliphatic polyester resin obtained by polycondensation of tetramethylenediol and diethylenedicarboxylic acid is polycarbonate. It was demonstrated that the adhesion between the electrode and the enzyme was higher than that of the substrate made of a sheet.
[0094]
In addition, the present inventors can completely burn the substrate 1 according to the example 1 and the circular substrate 2 according to the example 2, and when buried in the soil, it is subjected to the action of soil microorganisms for 6 months. It is confirmed that it decomposes to a certain extent.
[0095]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, according to the present invention using a substrate mainly composed of an all-aliphatic polyester-based resin as an electrically insulating substrate of an electrode-type biosensor, compared to a conventional electrode-type biosensor, As a result, an excellent effect can be obtained.
[0096]
(1) Since the above-mentioned electrically insulating substrate has good affinity and adhesion with the electrode and the molecular identification element derived from a living body, it is directly on the substrate surface without applying a special member (pretreatment) to the substrate. Even when an electrode or a molecular identification element is formed on the substrate, it is possible to secure a sufficient adhesive strength to withstand practical use. Therefore, according to the present invention, a high-quality biosensor can be realized with a simple structure.
[0097]
(2) According to the manufacturing method of the present invention in which the electrode is formed by the sputtering method or the hot stamping method using the above-mentioned substrate having excellent affinity for the electrode and the molecular identification element, a plurality of biodies can be obtained at once without complicated processes. Sensors can be produced with high yield. Therefore, according to the production method of the present invention, a high-quality biosensor can be provided at low cost.
[0098]
(3) Furthermore, the electrically insulating substrate according to the present invention comprising a wholly aliphatic polyester resin as a main component is easy to incinerate by heat and is biodegradable so that it can be buried in the soil and decomposed naturally. . Therefore, according to the present invention, the pollution problem in disposal can be solved.
[Brief description of the drawings]
1 is a plan view of an electrode-type biosensor of Example 1. FIG.
2 is a view for explaining the shape of the electrode-type biosensor of Example 1, wherein 2a is a partially enlarged view of FIG. 1, 2b is a sectional view taken along line AA of 2a, and 2c is BB of 2a. It is line sectional drawing
FIG. 3 is a plan view of an electrode pattern forming mask plate according to Example 1;
4 is a plan sectional view of an electrode-type biosensor (circular shape) of Example 2. FIG.
[Explanation of symbols]
1 Substrate 1
2 working electrode
3 Counter electrode
4 Reference pole
5 Glucose oxidase membrane
6 Stainless steel plate
7 Working electrode part
7a Foot part of working electrode
8 Counter electrode part
8a The opposite leg
9 Reference pole part
9a Leg part of reference pole
10 Circular substrate 2
11 Working electrode
12 Counter electrode
11a Working electrode terminal
12a Counter electrode terminal

Claims

A sensor unit composed of an electrode and a biological molecular identification element located near the surface of the electrode is an electrode-type biosensor formed on an electrically insulating substrate,
The electrode-type biosensor, wherein the electrically insulating substrate is mainly composed of an all aliphatic polyester resin having a melting point of 70 to 170 ° C.

The total aliphatic polyester resin is mainly composed of either a polycondensation polymer of an aliphatic diol and an aliphatic dicarboxylic acid or a copolymer of two aliphatic hydroxycarboxylic acids. The electrode-type biosensor according to claim 1.

The electrode-type biosensor according to claim 1 or 2, wherein the molecular identification element is selected from the group consisting of an enzyme, an antibody or an antigen, a microorganism, an organelle, a receptor, and a cell tissue.

The electrode-type biosensor according to any one of claims 1 to 3 , wherein the electrode is a two- to three-electrode electrode made of platinum, gold, or carbon conductor.

The electrode is formed directly on the surface of the electrically insulating substrate, and the molecular identification element is directly fixed on the surface of the electrically insulating substrate so as to cover at least one pole detection region. The electrode-type biosensor according to claim 4, which is characterized.

The electrode-type biosensor according to any one of claims 1 to 5 , wherein the sensor section is regularly arranged at a predetermined interval on a single electrically insulating substrate.

A method for producing an electrode-type biosensor in which a sensor unit composed of an electrode and a biological molecular identification element located near the surface of the electrode is formed on an electrically insulating substrate,
All aliphatic polyester resin sheet of electrically insulating substrate which is a composition as a main component having a melting point of 70 to 170 ° C., by Hottosuta emissions ping method by sputtering or metal letterpress, 2 made of platinum or gold Forming a tripolar electrode;
Applying a liquid material containing a molecular identification element to the surface of the electrode and the electrically insulating substrate surface around the electrode so as to cover a detection region of at least one of the electrodes. Type biosensor manufacturing method.

The total aliphatic polyester resin is mainly composed of either a polycondensation polymer of an aliphatic diol and an aliphatic dicarboxylic acid or a copolymer of two aliphatic hydroxycarboxylic acids. The method for producing an electrode-type biosensor according to claim 7.

The method for producing an electrode-type biosensor according to claim 7 or 8, wherein the molecular identification element is selected from the group consisting of an enzyme, an antibody or an antigen, a microorganism, an organelle, a receptor, and a cell tissue.