JP3755049B2 - Process for producing optically active substance of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid - Google Patents
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体の製造方法に関する。詳細には、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に対して不斉加水分解能を有するエステラーゼを用いて、該エステル類から２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の１種の光学活性体を高い選択性をもって製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体は、医薬・農薬などの中間体として有用な化合物である。
【０００３】
従来より２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の製造方法として、例えばビニルハロゲナイド類およびジアゾ酢酸エステル類を反応させる方法（特開平６−９４９９号公報）などによって得られた２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を、アルカリもしくは酸を用いて加水分解する方法などが知られている。しかしながら、かかる方法に用いられる２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類は、その２つの不斉炭素原子を不斉中心とする４種類の光学活性体の全てを含む光学不活性なものであるため、その加水分解物である２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸も光学不活性なものとして得られる。従って、目的とする２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体を得るには、かかる光学不活性なカルボン酸を更に光学分割する必要があった。
【０００４】
このような状況のもとで、従来から２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の特定の光学活性体を簡便に取得する方法の開発が待望されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を出発原料として、高い選択性をもって特定の２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体を製造する生化学的な方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねていたところ、ある特定のエステラーゼを用いて２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を加水分解することによってかかる課題が解決することを見いだした。
【０００７】
即ち、本発明は、特定のエステラーゼが、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に含まれる特定の光学活性体に特異的に作用して加水分解することにより、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の特定の光学活性体を生成するという知見に基づいて完成されたものである。言い換えれば、本発明は、一般式（１）で示される２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に対して特異的な不斉加水分解能を有する酵素の新たな性質の発見に基づく。
【０００８】
なお、本発明で「不斉加水分解」とは、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類のうち特定の光学活性体に、エステラーゼが立体特異性をもって作用し、当該光学活性体をその不斉構造を維持しながら優先的もしくは選択的に加水分解することを意味するものである。
【０００９】
本発明は、一般式（１）
【００１０】
【化４】
（式中、Ｘは塩素原子，臭素原子またはヨウ素原子、Ｒは低級アルキル基、＊は不斉炭素原子を示す。）
で示される２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を、該エステル類に対して不斉加水分解能を有するエステラーゼを用いて不斉加水分解することを特徴とする一般式（２）
【００１２】
【化５】
（式中、Ｘ、＊はそれぞれ前記と同じ意味を示す。）
で示される２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸のうちの光学活性体の製造方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、上記エステラーゼが、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類（１）のシス体に対して不斉加水分解能を有するエステラーゼであることを特徴とする、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸のシス体の光学活性体の製造方法を提供するものである。
【００１５】
ここで、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類のシス体とは、具体的に（１Ｓ，２Ｒ）−２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル又は（１Ｒ，２Ｓ）−２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステルであり、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸のシス体（シス ２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸ともいう。）とは、具体的に（１Ｓ，２Ｒ）−２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸又は（１Ｒ，２Ｓ）−２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸である。
【００１６】
更に、本発明は、エステラーゼとして、アルスロバクター属、アスペルギルス属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、クロモバクテリウム属、リゾプス属、キャンディダ属、ムコール属、ノカルディア属、コリネバクテリウム属、ペディオコッカス属、エンテロバクター属、シュードモナス属、ミクロコッカス属、バシルス属、ラクトバシルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ロドトルラ属、クリプトコッカス属、トルロプシス属、ピヒア属、ペニシリウム属、オーレオバシディウム属、アクチノムコール属、ストレプトミセス属及びハンゼヌラ属からなる群から選択されるいずれかの属に属する微生物、または動植物に起源するエステラーゼを使用することを特徴とする２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体を製造する方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の出発原料として用いられる一般式（１）の２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類において、置換基Ｒで示される低級アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基などの炭素原子数１〜６のアルキル基などが挙げられる。なお、アルキル基は直鎖状、分枝状、環状のいずれであってもよい。また、置換基Ｘとは塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれかであるが、通常は入手のし易さの点で、塩素原子が好ましく用いられる。
【００１８】
具体的には、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類としては、例えば２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸メチル、２−ブロモ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸メチル、２−ヨード−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸メチルおよび上記各化合物におけるメチル基がエチル基、プロピル基、ブチル基に置換してなる化合物などが挙げられる。
【００１９】
これらの２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類には、４種類の光学活性体、すなわち（１Ｓ，２Ｒ）体、（１Ｒ，２Ｓ）体、（１Ｒ，２Ｒ）体および（１Ｓ，２Ｓ）体が存在するが、本発明の出発原料としてはこれら光学活性体の２種以上を任意の割合で含むものが用いられ、例えばこれらの光学活性体の全てを含む光学不活性な２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を用いてもよいし、該エステル類から任意の光学活性体の一部ないしは全てを分離した後の光学活性な混合物を用いてもよい。ここで光学不活性な２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類は、例えば前記の特開平６−９４９９号公報に記載されるような公知の方法によって容易に製造することができる。
【００２０】
本発明で用いられるエステラーゼは、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に対して不斉加水分解能を有するものであれば特に制限されず、現在公知もしくは将来使用され得る微生物起源のエステラーゼ、動植物起源のエステラーゼなどが広く挙げられる。
【００２１】
具体的には、微生物起源のエステラーゼとしては、例えばアルスロバクター属、アスペルギルス属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、クロモバクテリウム属、リゾプス属、キャンディダ属、ムコール属、ノカルディア属、コリネバクテリウム属、ペディオコッカス属、エンテロバクター属、シュードモナス属、ミクロコッカス属、バシルス属、ラクトバシルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ロドトルラ属、クリプトコッカス属、トルロプシス属、ピヒア属、ペニシリウム属、オーレオバシディウム属、アクチノムコール属、ストレプトミセス属またはハンゼヌラ属などに属する微生物に由来するエステラーゼ、又はこれらの微生物が有するエステラーゼ遺伝子が導入されることによって形質転換された組換え微生物が産生するエステラーゼなどが挙げられる。
【００２２】
これらの中でも一般的には、アルスロバクター属、アスペルギルス属、アルカリゲネス属、アクロモバクター属、クロモバクテリウム属、リゾプス属、キャンディダ属、ムコール属、ノカルディア属、ブレビバクテリウム属、ペディオコッカス属、シュードモナス属又はバシルス属に属する微生物が生産するエステラーゼが適し、好ましくは、アルスロバクター属、クロモバクテリウム属、キャンディダ属、ノカルディア属、コリネバクテリウム属、ペディオコッカス属、シュードモナス属又はバシルス属に属する微生物が生産するエステラーゼが適する。
【００２３】
これらの微生物はいずれも通常の方法、例えば滅菌した液体培地に該微生物を接種し、２０〜４０℃で往復振とう培養する方法などによって容易に液体培養することができる。また、必要に応じて固体培養してもよい。
【００２４】
動植物起源のエステラーゼとしては、例えばステアプシン、パンクレアチン、ブタ肝臓エステラーゼ、小麦胚芽（Wheat Germ）エステラーゼなどが挙げられる。
【００２５】
これらのエステラーゼは、市販品であってもよい。例えば、微生物起源のエステラーゼの市販品としてはシュードモナス・セパシアのリパーゼ（リパーゼＰＳ、天野製薬社製）、アスペルギルス属のリパーゼ（リパーゼＡＰ、天野製薬社製）、ムコール属のリパーゼ（リパーゼＭ、天野製薬社製）、キャンディダ・シリンドラッセのリパーゼ（リパーゼＭＹ、名糖産業社製）、アクロモバクター属のリパーゼ（リパーゼＡＬ、名糖産業社製）、アルスロバクター属のリパーゼ（リパーゼＡＵ、住友化学社製）、クロモバクテリウム・ビスコサムのリパーゼ（リパーゼ、東洋醸造社製）、リゾプス・デレマのリパーゼ（タリパーゼ、田辺製薬社製）、リゾプス属のリパーゼ（リパーゼサイケン、大阪細菌研究所製）、キャンディダ・アンタークティカのエステラーゼ（ノボイザム４３５、ノボルディスク社製）などが挙げられる。また動植物起源のエステラーゼの市販品としては、小麦胚芽エステラーゼ（リパーゼ タイプ１、シグマ社製）などが挙げられる。
【００２６】
本発明において使用されるエステラーゼは、その純度により制限されるものではなく精製エステラーゼ、粗製エステラーゼのいずれをも使用することができる。従って、前述の微生物等を培養して得た培養物、培養濾液、菌体、菌体懸濁液、菌体抽出物などのエステラーゼ含有物あるいはそれらの処理物、例えば該エステラーゼ含有物を通常の方法によって樹脂等に固定化したもの等をそのまま用いることもできる。
【００２７】
エステラーゼは、目的とする２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体の種類に応じて適宜選択される。また、エステラーゼの使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えばエステラーゼとして上記したような市販品を用いる場合には、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類１００重量部に対して通常０．１〜１０重量部の範囲である。
【００２８】
不斉加水分解に際しては、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類とエステラーゼが適当な条件下で共存する状態であればよく、例えば簡便には、溶媒中で２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類およびエステラーゼを混合する方法が挙げられるが、エステラーゼを樹脂などに固定化して用いることもできる。
【００２９】
ここで溶媒としては、無機酸塩又は有機酸塩類の緩衝溶液が広く使用される。具体的には、リン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などの無機塩類の緩衝溶液、酢酸ナトリウム水溶液、クエン酸ナトリウム水溶液などの有機酸塩類の緩衝溶液などが例示される。その濃度は特に制限されないが、通常０．０１〜２Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍの範囲である。かかる溶媒の使用量は２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に対して通常１〜１００重量倍の範囲であることが好ましい。
【００３０】
また、反応に際して反応系内に非エステル系有機溶媒や、非エステル系界面活性剤などが添加されていてもよい。
【００３１】
反応温度は、低すぎると反応速度が低下し、高すぎるとエステラーゼの活性が低下する傾向にあるため、通常１０〜６５℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。
【００３２】
反応系内のｐＨは、それが低すぎるとエステラーゼの活性の低下や目的とする光学活性体の収率が低下し、またそれが高すぎると目的とする光学活性体の収率が低下するため、通常はｐＨ４〜９の範囲、好ましくは各エステラーゼの反応最適ｐＨの付近である。
【００３３】
かかる不斉加水分解によって、原料として用いる各種の光学活性体の混合物からなる２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類に含まれる特定の光学活性体が優先的にもしくは選択的に加水分解されて、２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の特定の光学活性体が生成する。
【００３４】
即ち本発明によれば、１種の２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体、即ち（１Ｓ，２Ｒ）体、（１Ｒ，２Ｓ）体、（１Ｒ，２Ｒ）体、または（１Ｓ，２Ｓ）体のいずれかをそれぞれ高い選択性をもって特異的に製造することができる。かかる光学活性体としては、具体的には（１Ｓ，２Ｒ）−２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ブロモ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヨード−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸が、また上記各化合物における（１Ｓ，２Ｒ）がそれぞれ（１Ｒ，２Ｓ）、（１Ｒ，２Ｒ）又は（１Ｓ，２Ｓ）に置き換えられてなる各化合物の（１Ｒ，２Ｓ）体、（１Ｒ，２Ｒ）体又は（１Ｓ，２Ｓ）体が挙げられる。
【００３５】
なお、以下において２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類またはその加水分解物である２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体の（１Ｒ，２Ｒ）体および（１Ｓ，２Ｓ）体をそれらのトランス体と呼び、前述するように（１Ｓ，２Ｒ）体および（１Ｒ，２Ｓ）体をそれらのシス体と呼ぶ。
【００３６】
本発明の方法で製造される２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体は、反応後の反応混合物から通常の方法、例えば、生成した２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体が塩を形成して水層に溶解している状態で、メチル−ｔ−ブチルエーテルなどの水に不溶の有機溶媒を用いる洗浄によって未反応の２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類を除去したのち、塩酸などの酸を加えて系内を酸性とし、次いでメチル−ｔ−ブチルエーテルなどの水に不溶の有機溶媒を用いて抽出処理して、得られた有機層を濃縮する方法などによって容易に取り出すことができる。また、得られた２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体は、更に精留、再結晶などの通常の方法によって精製されてもよい。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、光学活性体の混合物からなる２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エステル類から、高い選択性をもって２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の特定の光学活性体を製造することができる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
なお、実施例において用いた微生物はいずれも財団法人大阪醗酵研究所（ＩＦＯ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ，Ｏｓａｋａ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ、Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合センター（ＩＡＭ）に保存されており、これらの保存機関より入手することができる。
【００４０】
実施例１
５００ｍｌ肩付きフラスコに液体培地〔加糖ブイヨン培地（水１リットルにグルコース１０ｇ、ペプトン５ｇ、肉エキス５ｇ、食塩３ｇを溶解し、ｐＨ７．２とした。）〕１００ｍｌを入れ、て殺菌したのち、微生物〔アルスロバクター・ラモサス（ＩＦＯ １２９５８）〕を斜面培養から２白金耳接種し、３０℃で８０時間往復振とう培養して、培養液を得た。
【００４１】
この培養液から遠心分離によって集菌し、蒸留水で２回洗浄したのち、０．１Ｍリン酸緩衝液（水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．０に調整した。）３０ｍｌに懸濁させて、菌体懸濁液を得た。
【００４２】
この菌体懸濁液を超音波細胞破砕装置で処理して菌体を破砕し、遠心分離によって菌体破片を分離除去して、粗製エステラーゼ液を得た。
【００４３】
この粗製エステラーゼ液０．０５ｇを、窒素雰囲気下、３５℃で、０．２Ｍリン酸緩衝水溶液 ６０ｇ（水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．０に調整した。）に加えて同温度下で３０分間撹拌したのち、２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エチル〔純度９７％、シス体／トランス体比＝５７．７／４２．３、（１Ｓ，２Ｒ）体／（１Ｒ，２Ｓ）体比＝５０／５０〕１ｇを注加して、同温度下でさらに２時間撹拌した。
【００４４】
その後、メチル−ｔ−ブチルエーテル２０ｍｌおよび水２０ｍｌを加え、析出した固形物を濾別し、有機層を除去して水層を得た。次いで、この水層に濃塩酸を加えてそのｐＨを２としたのち、メチル−ｔ−ブチルエーテル２０ｍｌを用いて抽出し、得られた有機層を濃縮して、２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸（淡黄色粘稠液体、収率３７．１％）を得た。
【００４５】
この２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の収率およびシス体／トランス体比は、これを常法に従って２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸ベンジルエステルに誘導した後、ガスクロマトグラフ分析によって求めた。また、（１Ｓ，２Ｒ）体／（１Ｒ，２Ｓ）体比は光学活性カラム（スミキラルＯＡ−６０００、住化分析センター社製）を用いる高速液体クロマトグラフ分析（展開液：２ｍＭ硫酸銅水溶液に酢酸を加えてｐＨ４．８〜５に調整した水溶液）によって求めた。分析結果を表１に示す。
【００４６】
実施例２〜５
実施例１で得た粗製エステラーゼ液に代えて、表１に記載の微生物を用いて実施例１と同様に操作して得た菌体懸濁液を用いる以外は実施例１と同様に操作して、２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸を得た。このものの分析結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
実施例６〜８
微生物の粗製エステラーゼ液に代えて表２に記載の微生物起源のエステラーゼをそれぞれ０．０５ｇを用いる以外は実施例１と同様に操作して、２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸を得た。このものの分析結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
実施例９
微生物の粗製エステラーゼ液に代えて動植物起源のエステラーゼ（リパーゼタイプ１、シグマ社製）を０．０５ｇを用いる以外は実施例１と同様に操作して、２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸を得た。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
実施例１０〜１３
表４記載の各菌体をブイヨン培地５０ｍｌ中、３０℃で２４時間培養して遠心分離にて培地を除いた後、菌体を凍結乾燥して表４記載の各菌体の凍結乾燥菌体を得た。
【００５３】
１ｇの２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸エチルを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０；１００ｍｌ）に懸濁し、更に凍結乾燥菌体０．０５ｇを加えて静かに撹拌した。反応液のｐＨはカルボン酸の生成により低下するため、１Ｎ ＮａＯＨを添加することによりｐＨ７付近に保った。４時間後、反応液に酢酸エチル１００ｍｌを加えた後、セライトろ過を行い菌体を除いた。有機層を分離した後、水層を更に酢酸エチルで２回洗浄した。次に水層をｐＨ２に調整した（１０％ＨＣｌを使用）後、酢酸エチル１００ｍｌで３回抽出した。抽出液を乾燥した後、溶媒を留去することにより、目的のカルボン酸（２−クロロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸）を得た。
【００５４】
得られたカルボン酸のシス／トランス体比は、カルボン酸をジアゾメタン処理してメチルエステルに変換した後、以下の条件下でガスクロマトグラフィーを行うことにより分析した。
【００５５】
使用カラム：ＴＣ−ＷＡＸ ３０ｍ×０．２５ｍｍ（ＧＬサイエンス）
温 度：９０℃（オーブン）
１２０℃（検出器）
２００℃（注入）
流 速：１．０ｍｌ／分
得られたカルボン酸は、ｎ−Ｂｕ3ＳｎＨ／ＡＩＢＮで塩素原子を還元して２−フルオロシクロプロパンカルボン酸とし、さらにジアゾメタン処理によってメチルエステルに誘導して光学純度を算出した。
【００５６】
・光学異性体の分析条件（ガスクロマトクラフィー）
使用カラム：ＣＰ−Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−β−２３６Ｍ
２５ｍ×０．２５ｍｍ（ＧＬサイエンス）
温 度：７０℃（オーブン）
１００℃（検出器）
２００℃（注入）
流 速：１．０ｍｌ／分
結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing an optically active substance of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid. Specifically, by using an esterase having asymmetric hydrolysis ability with respect to 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters, one ester of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid is selected from the esters. The present invention relates to a method for producing an optically active substance with high selectivity.
[0002]
[Prior art]
The optically active form of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid is a useful compound as an intermediate for pharmaceuticals and agricultural chemicals.
[0003]
As a conventional method for producing 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, for example, 2-halo obtained by reacting vinyl halides and diazoacetates (Japanese Patent Laid-Open No. 6-9499) and the like. A method of hydrolyzing 2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters using an alkali or an acid is known. However, 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters used in such a method are optically inactive including all of the four types of optically active substances having the two asymmetric carbon atoms as asymmetric centers. Therefore, the hydrolyzate 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid can also be obtained as an optically inactive one. Therefore, in order to obtain the target optically active 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, it is necessary to further optically resolve the optically inactive carboxylic acid.
[0004]
Under such circumstances, the development of a method for easily obtaining a specific optically active substance of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid has been awaited.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is a biochemical process for producing an optically active form of a specific 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid with high selectivity, starting from 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters. It aims to provide a method.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and the problems are solved by hydrolyzing 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters using a specific esterase. I found something to do.
[0007]
That is, the present invention is a method in which a specific esterase specifically acts on a specific optically active substance contained in 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters to be hydrolyzed, thereby producing 2-halo-2. -It was completed based on the knowledge of producing a specific optically active form of fluorocyclopropanecarboxylic acid. In other words, the present invention is based on the discovery of a new property of an enzyme having an asymmetric hydrolysis ability specific to 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters represented by the general formula (1).
[0008]
In the present invention, “asymmetric hydrolysis” means that an esterase acts on a specific optically active substance of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters with stereospecificity, and the optically active substance is It means preferentially or selectively hydrolyzing while maintaining the asymmetric structure.
[0009]
The present invention relates to a general formula (1)
[0010]
[Formula 4]
(In the formula, X represents a chlorine atom, bromine atom or iodine atom, R represents a lower alkyl group, and * represents an asymmetric carbon atom.)
2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester represented by the general formula (2), characterized in that it is asymmetrically hydrolyzed using an esterase having asymmetric hydrolysis ability with respect to the ester.
[0012]
[Chemical formula 5]
(In the formula, each of X and * has the same meaning as described above.)
Among the 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acids represented by the formula (1).
[0014]
Further, the present invention provides the 2-halo ester, wherein the esterase is an esterase having asymmetric hydrolysis ability with respect to a cis isomer of the 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester (1). The present invention provides a method for producing a cis-optically active form of 2-fluorocyclopropanecarboxylic acid.
[0015]
Here, the cis isomer of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters specifically refers to (1S, 2R) -2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester or (1R, 2S)- 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester, which is a cis isomer of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid (also referred to as cis 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid). (1S, 2R) -2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid or (1R, 2S) -2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid.
[0016]
Further, the present invention provides an esterase as Arthrobacter, Aspergillus, Alkagenes, Achromobacter, Chromobacterium, Rhizopus, Candida, Mucor, Nocardia, Corynebacterium, Diococcus, Enterobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Lactobacillus, Trichoderma, Saccharomyces, Rhodotorula, Cryptococcus, Tolropsis, Pichia, Penicillium, Aureobasidium, Actinomucor A 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid characterized by using an esterase derived from a microorganism belonging to any genus selected from the group consisting of the genus, Streptomyces and Hansenula, or animals and plants A method of making a academic active forms.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester of the general formula (1) used as a starting material of the present invention, examples of the lower alkyl group represented by the substituent R include a methyl group, an ethyl group, and a propyl group. And alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms such as butyl group and pentyl group. The alkyl group may be linear, branched or cyclic. The substituent X is any one of a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, and usually a chlorine atom is preferably used from the viewpoint of easy availability.
[0018]
Specifically, examples of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters include methyl 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylate, methyl 2-bromo-2-fluorocyclopropanecarboxylate, 2- Examples thereof include methyl iodo-2-fluorocyclopropanecarboxylate and compounds in which the methyl group in each of the above compounds is substituted with an ethyl group, a propyl group, or a butyl group.
[0019]
These 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters include four types of optically active substances, ie, (1S, 2R) form, (1R, 2S) form, (1R, 2R) form and (1S, 2S) isomers exist, but as the starting material of the present invention, those containing two or more of these optically active substances in an arbitrary ratio are used. For example, optically inactive 2-containing all of these optically active substances are used. Halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters may be used, or an optically active mixture obtained after separating any or all of the optically active substances from the esters may be used. Here, the optically inactive 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters can be easily produced by a known method as described in, for example, the above-mentioned JP-A-6-9499.
[0020]
The esterase used in the present invention is not particularly limited as long as it has asymmetric hydrolysis ability with respect to 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters, and is an esterase derived from a microorganism that is currently known or can be used in the future. Widely mentioned are esterases derived from animals and plants.
[0021]
Specific examples of the esterase derived from microorganisms include, for example, Arthrobacter, Aspergillus, Alkaligenes, Achromobacter, Chromobacterium, Rhizopus, Candida, Mucor, Nocardia, Corynebacterium Um, Pediococcus, Enterobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Lactobacillus, Trichoderma, Saccharomyces, Rhodotorula, Cryptococcus, Tolropsis, Pichia, Penicillium, Aureobasidium Produced by esterases derived from microorganisms belonging to the genus, Actinomucor, Streptomyces, Hansenula, etc., or recombinant microorganisms transformed by the introduction of esterase genes possessed by these microorganisms Such as esterase that, and the like.
[0022]
Among these, in general, Arthrobacter, Aspergillus, Alkagenes, Achromobacter, Chromobacterium, Rhizopus, Candida, Mucor, Nocardia, Brevibacterium, Pedio Esterases produced by microorganisms belonging to the genus Coccus, Pseudomonas or Bacillus are suitable, preferably Arthrobacter, Chromobacterium, Candida, Nocardia, Corynebacterium, Pediococcus, Pseudomonas Esterases produced by microorganisms belonging to the genus or Bacillus are suitable.
[0023]
Any of these microorganisms can be easily subjected to liquid culture by a conventional method, for example, a method in which the microorganism is inoculated into a sterilized liquid medium and reciprocally shaken at 20 to 40 ° C. In addition, solid culture may be performed as necessary.
[0024]
Examples of the esterase derived from animals and plants include steapsin, pancreatin, porcine liver esterase, wheat germ esterase and the like.
[0025]
These esterases may be commercially available products. For example, commercially available esterases derived from microorganisms include Pseudomonas cepacia lipase (Lipase PS, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Aspergillus lipase (Lipase AP, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Mucor lipase (Lipase M, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) ), Candida cylindrasse lipase (Lipase MY, manufactured by Meika Sangyo Co., Ltd.), Achromobacter lipase (Lipase AL, manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.), Arthrobacter lipase (Lipase AU, Sumitomo Chemical) Lipase of Chromobacterium viscosum (lipase, manufactured by Toyo Shuzo Co., Ltd.), lipase of lysopus derema (tallipase, manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd.), lipase belonging to the genus Rhizopus (manufactured by Osaka Bacteriological Research Institute), Candida antarctica esterase (Novoizam 435, Novor Disk Co., Ltd.) and the like. Examples of commercially available esterase derived from animals and plants include wheat germ esterase (lipase type 1, manufactured by Sigma).
[0026]
The esterase used in the present invention is not limited by its purity, and either purified esterase or crude esterase can be used. Accordingly, a culture obtained by culturing the aforementioned microorganisms, a culture filtrate, a bacterial cell, a bacterial cell suspension, a bacterial cell extract or other esterase-containing product or a processed product thereof, for example, the esterase-containing product is usually used. What was fixed to resin etc. by the method can also be used as it is.
[0027]
The esterase is appropriately selected according to the type of the optically active 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid. Further, the amount of esterase used is appropriately selected so as not to cause a delay in reaction time or a decrease in selectivity. For example, when using a commercially available esterase as described above, 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid is used. It is usually in the range of 0.1 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the acid ester.
[0028]
In the asymmetric hydrolysis, the 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid ester and the esterase may be in a state where they coexist under appropriate conditions. A method of mixing fluorocyclopropanecarboxylic acid esters and esterase can be mentioned, but esterase can also be used by immobilizing it on a resin or the like.
[0029]
Here, a buffer solution of inorganic acid salt or organic acid salt is widely used as the solvent. Specific examples include buffer solutions of inorganic salts such as aqueous sodium phosphate solution and aqueous potassium phosphate solution, and buffer solutions of organic acid salts such as aqueous sodium acetate solution and aqueous sodium citrate solution. The concentration is not particularly limited, but is usually 0.01 to 2M, preferably 0.05 to 0.5M. The amount of the solvent used is preferably in the range of usually 1 to 100 times the weight of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters.
[0030]
In addition, a non-ester organic solvent, a non-ester surfactant, or the like may be added to the reaction system during the reaction.
[0031]
If the reaction temperature is too low, the reaction rate decreases, and if it is too high, the activity of esterase tends to decrease. Therefore, it is usually in the range of 10 to 65 ° C, preferably 20 to 50 ° C.
[0032]
If the pH in the reaction system is too low, the activity of the esterase will decrease and the yield of the target optically active substance will decrease. If it is too high, the yield of the target optically active substance will decrease. In general, the pH is in the range of 4 to 9, preferably in the vicinity of the optimum reaction pH of each esterase.
[0033]
Due to such asymmetric hydrolysis, specific optically active substances contained in 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters comprising a mixture of various optically active substances used as raw materials are hydrolyzed preferentially or selectively. As a result, a specific optically active form of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid is produced.
[0034]
That is, according to the present invention, one optically active form of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, ie, (1S, 2R) form, (1R, 2S) form, (1R, 2R) form, or ( Any one of the 1S and 2S) isomers can be specifically produced with high selectivity. Specific examples of the optically active substance include (1S, 2R) -2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, (1S, 2R) -2-bromo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, (1S, 2R) -2-iodo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid, and (1S, 2R) in each of the above compounds is replaced with (1R, 2S), (1R, 2R) or (1S, 2S), respectively. Examples include (1R, 2S) isomer, (1R, 2R) isomer or (1S, 2S) isomer of each compound.
[0035]
In the following, optically active (1R, 2R) isomers of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters or 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid which is a hydrolyzate thereof and (1S, The (2S) isomers are referred to as their trans isomers, and the (1S, 2R) and (1R, 2S) isomers are referred to as their cis isomers as described above.
[0036]
The optically active form of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid produced by the method of the present invention can be obtained from the reaction mixture after the reaction by a conventional method such as 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid produced. In the state in which the optically active compound in the form of a salt is dissolved in the aqueous layer, unreacted 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid is washed by washing with an organic solvent insoluble in water such as methyl-t-butyl ether. After removing the acid esters, acid such as hydrochloric acid is added to make the system acidic, followed by extraction with an organic solvent insoluble in water such as methyl-t-butyl ether, and the resulting organic layer is concentrated. It can be easily taken out by a method to do so. Further, the obtained optically active form of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid may be further purified by a usual method such as rectification or recrystallization.
[0037]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, the specific optical activity of 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid with high selectivity from 2-halo-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid esters consisting of a mixture of optically active substances. The body can be manufactured.
[0038]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
[0039]
In addition, all the microorganisms used in the examples are Osaka Fermentation Institute (IFO, Institute for Fermentation, Osaka), American Type Culture Collection (ATCC), RIKEN Microbiology System Preservation Facility (JCM, Japan Collection of Microorganism). It is stored in the Institute for Applied Microbiology, the University of Tokyo's Institute for Microbial Microalgae (IAM) and can be obtained from these storage institutions.
[0040]
Example 1
A 500 ml shoulder flask was placed in a liquid medium [sweetened bouillon medium (glucose 10 g, peptone 5 g, meat extract 5 g, and salt 3 g dissolved in 1 liter of water to obtain pH 7.2)] 100 ml. [Arslobacter ramosas (IFO 12958)] was inoculated with 2 platinum ears from the slope culture and cultured with reciprocal shaking at 30 ° C. for 80 hours to obtain a culture solution.
[0041]
Bacteria were collected from this culture by centrifugation, washed twice with distilled water, suspended in 30 ml of 0.1 M phosphate buffer (sodium hydroxide was added to adjust to pH 7.0), and the bacteria were collected. A body suspension was obtained.
[0042]
The bacterial cell suspension was treated with an ultrasonic cell crushing device to crush the bacterial cells, and the bacterial cell fragments were separated and removed by centrifugation to obtain a crude esterase solution.
[0043]
0.05 g of this crude esterase solution was added to 60 g of a 0.2M phosphate buffer aqueous solution (adjusted to pH 7.0 by adding sodium hydroxide) at 35 ° C. under a nitrogen atmosphere and stirred at the same temperature for 30 minutes. Then, ethyl 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylate [purity 97%, cis isomer / trans isomer ratio = 57.7 / 42.3, (1S, 2R) isomer / (1R, 2S) isomer ratio = 50/50] 1 g was added, and the mixture was further stirred at the same temperature for 2 hours.
[0044]
Thereafter, 20 ml of methyl-t-butyl ether and 20 ml of water were added, the precipitated solid was separated by filtration, and the organic layer was removed to obtain an aqueous layer. Subsequently, concentrated hydrochloric acid is added to this aqueous layer to adjust its pH to 2, and then extraction is performed using 20 ml of methyl-t-butyl ether. The obtained organic layer is concentrated to give 2-chloro-2-fluorocyclopropane. Carboxylic acid (light yellow viscous liquid, yield 37.1%) was obtained.
[0045]
The yield and cis / trans ratio of the 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid were obtained by derivatizing 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid benzyl ester according to a conventional method, followed by gas chromatographic analysis. Sought by. The (1S, 2R) isomer / (1R, 2S) isomer ratio is high performance liquid chromatographic analysis using an optically active column (Sumichiral OA-6000, manufactured by Sumika Chemical Analysis Co., Ltd.) (developing solution: acetic acid in 2 mM copper sulfate aqueous solution). And an aqueous solution adjusted to pH 4.8 to 5). The analysis results are shown in Table 1.
[0046]
Examples 2-5
Instead of the crude esterase solution obtained in Example 1, the same procedure as in Example 1 was used, except that the cell suspension obtained by the same procedure as in Example 1 was used using the microorganisms listed in Table 1. Thus, 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid was obtained. The analysis results of this product are shown in Table 1.
[0047]
[Table 1]
Examples 6-8
2-Chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid was obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.05 g of each of the microorganism-derived esterases listed in Table 2 was used instead of the crude microorganism esterase solution. . The analysis results of this product are shown in Table 2.
[0049]
[Table 2]
Example 9
2-Chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.05 g of an esterase of animal or plant origin (lipase type 1, manufactured by Sigma) was used instead of the crude microbial esterase solution. Got. The results are shown in Table 3.
[0051]
[Table 3]
Examples 10-13
Each bacterial cell described in Table 4 was cultured in 50 ml of broth medium at 30 ° C. for 24 hours, and after removing the medium by centrifugation, the bacterial cells were lyophilized and freeze-dried bacterial cells of each bacterial cell described in Table 4 Got.
[0053]
1 g of ethyl 2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylate was suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0; 100 ml), and 0.05 g of lyophilized cells were added and gently stirred. Since the pH of the reaction solution was lowered due to the formation of carboxylic acid, it was kept around pH 7 by adding 1N NaOH. After 4 hours, 100 ml of ethyl acetate was added to the reaction solution, followed by celite filtration to remove the cells. After separating the organic layer, the aqueous layer was further washed twice with ethyl acetate. The aqueous layer was then adjusted to pH 2 (using 10% HCl) and extracted three times with 100 ml of ethyl acetate. After the extract was dried, the solvent was distilled off to obtain the target carboxylic acid (2-chloro-2-fluorocyclopropanecarboxylic acid).
[0054]
The cis / trans isomer ratio of the obtained carboxylic acid was analyzed by gas chromatography under the following conditions after the carboxylic acid was treated with diazomethane to convert it to a methyl ester.
[0055]
Column used: TC-WAX 30m x 0.25mm (GL Science)
Temperature: 90 ° C (oven)
120 ° C (detector)
200 ° C (injection)
Flow rate: 1.0 ml / min The obtained carboxylic acid was reduced to a 2-fluorocyclopropane carboxylic acid by reducing the chlorine atom with n-Bu 3 SnH / AIBN, and further converted to a methyl ester by diazomethane treatment to obtain an optical purity. Was calculated.
[0056]
・ Optical isomer analysis conditions (gas chromatography)
Column used: CP-Cyclodextrin-β-236M
25m x 0.25mm (GL Science)
Temperature: 70 ° C (oven)
100 ° C (detector)
200 ° C (injection)
Flow rate: 1.0 ml / min.
[0057]
[Table 4]
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