JP3754299B2 - Adipocyte complement-related protein homolog ZACRP3 - Google Patents

Description

【００７５】
【表２】

【００７６】
当該技術分野の普通の技術の者は、各アミノ酸をコードしているすべての可能なコドンの代表、縮重コドンの決定において、いくつかのあいまいさが導入されていることがわかるであろう。たとえば、セリン(WSN）の縮重コドンは、ある状況においてはアルギニン(AGR）をコードすることが可能であり、アルギニンの縮重コドン(MGN）は、ある状況においてはセリン(AGY）をコードすることができる。同様の関係が、フェニルアンラニンおよびロイシンをコードしているコドンの間に存在する。このように、縮重配列によって含まれるいくつかのポリペプチドは変異したアミノ酸配列をコードしてよいが、当該技術分野の普通の技術の者は、配列番号２のアミノ酸配列を参照することによりかかる変異配列を容易に同定することができる。変異配列は、本文に述べられたように機能性について容易に検査されることが可能である。
【００７７】
また当該技術分野の普通の技術の者は、異なる種が「優先的なコドンの用法」を示すことが可能であることも理解するであろう。全般的には、Granthamら、Nuc. Acids Res. 8 : 1893 - 912、1980 ；Haasら、Curr. Biol. 6 : 315 - 24、 1996；Wain-Hobsonら、Gene 13 : 355 - 64、 1981 ；GrosjeanおよびFiers、Gene 18 : 199 - 209、1982 ；Holm、Nuc. Acids Res. 14 : 3075 - 87、1986；Ikemura、J. Mol. Biol. 158 : 573 - 97、1982参照のこと。本文において用いられたように、「優先的なコドンの用法」または「優先コドン」という用語は、ある種類の細胞において最も頻繁に用いられるタンパク質翻訳コドンを指している技術用語であり、このように、各々のアミノ酸をコードしている可能なコドンの一つまたは少数の代表物を好む（表２参照）。
【００７８】
たとえば、アミノ酸トレオニン(Thr）は、ACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされてよいが、哺乳類細胞においてはACCが最も一般的に使用されるコドンであり；他の種類、たとえば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌においては、異なるThrコドンが選好性であってよい。特定の種に対する優先コドンは、当該技術において周知の種々の方法により、本発明のポリヌクレオチドに導入されることが可能である。
【００７９】
組換えDNAへの優先コドンの導入は、たとえば、特定の細胞型または種類の中でのタンパク質の翻訳をより効率的にすることにより、当該タンパク質の産生を増強することが可能である。したがって、配列番号10において開示された縮重コドン配列は、当該技術において一般的に用いられかつ本文において開示された種々の細胞型および種類における、ポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先コドンを含んでいる配列は種々の種類における発現のため検査および最適化され、さらに本文において開示されたように機能性について検査されることが可能である。
【００８０】
さらに本発明は、他の種類からの相対物を代表する変異したポリペプチドならびに核酸分子を提供する（オルソログ）。これらの種は、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、および他の脊椎および無脊椎動物を含むが、これに限定されない。特に興味深いのは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類のポリペプチドを含めた、他の哺乳類の種からのzacrp3ポリペプチドである。マウスのzacrp2相同物（配列番号12）は同定されている。このマウスzacrp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号11に開示されている。
【００８１】
ヒトのzacrp3のオルソログは、本発明により提供される情報ならびに組成物を、通常のクローニング技術と組合せて用いることにより、クローン化されることが可能である。たとえば、cDNAは本文において開示されたようなzacrp3を発現する組織または細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化されることが可能である。mRNAの適当な供給源は、本文において開示された配列から設計されたプローブを用いたノーザンブロットをプローブすることにより、同定されることが可能である。次いで、ポジティブな組織または細胞のmRNAから、ライブラリーが作成される。
【００８２】
次いでzacrp3をコードしているcDNAは、ヒトの完全なまたは部分的なcDNAを用いるか、または開示された配列に基づく縮重プローブの一つまたはそれより多いセットを用いたプロービングなどの、種々の方法により単離されることが可能である。またcDNAは、本文において開示された代表的なヒトのzacrp3配列から設計されたプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化されることが可能である。付加的な方法の範囲内で、宿主細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトするべく、cDNAライブラリーが用いられることが可能であり、興味のcDNAの発現は、zacrp3ポリペプチドに対する抗体を用いて検出されることが可能である。また同様の技術が、ゲノムクローンを単離するべく用いられることも可能である。
【００８３】
当業者は、配列番号１に開示された配列がヒトzacrp3の一つのアレルを表していること、およびアレルの変異および代わりのスプライシングが起ることが予期されることを理解するであろう。この配列のアレルの変異は、cDNAかまたは異なる個体からのゲノムライブラリーを標準的な方法によりプローブすることにより、クローン化されることが可能である。配列番号１に示されており、サイレント突然変異を含むものと、突然変異が結果としてアミノ酸配列の変化を生じるものとを含んでいるポリペプチド配列のアレル変異体は、配列番号２のアレル変異体であるタンパク質であるため、本発明の範囲内にある。
【００８４】
二者択一的にスプライスされたmRNAから生成され、zacrp3ポリペプチドの特性を保持しているcDNA分子は、本発明の範囲内に含まれ、かかるcDNAおよびmRNAによりコードされたポリペプチドもそうである。これらの配列のアレル変異体およびスプライス変異体は、cDNAかまたは異なる個体または組織からのゲノムライブラリーを、当該技術において周知の標準的な方法によりプローブすることによってクローン化されることが可能である。
【００８５】
本発明の好ましい態様の範囲内において、単離された核酸分子は、緊縮条件下に、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子か、または配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズすることが可能である。一般的に、緊縮条件は定められたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列についての熱融点（Ｔ_m）よりも約５℃低くなるように選ばれる。Ｔ_mは、完全に一致するプローブに対して標的配列の50％がハイブリダイズする温度である（定められたイオン強度およびpH下）。
【００８６】
DNA−DNA、RNA−RNA、およびDNA−RNAといった核酸分子のペアは、もしヌクレオチド配列がある程度の相補性を有していればハイブリダイズすることができる。ハイブリッドは二重らせんにおける不適正塩基対に耐えることができるが、ハイブリッドの安定性は不正対合の程度によって影響される。不正対合されたハイブリッドのＴ_mは、１〜1.5％の塩基対の不正対合ごとに１℃ずつ低下する。ハイブリダイゼーションの条件の緊縮性を変えることは、ハイブリッドに存在するであろう不正対合の程度についての制御を可能にする。緊縮の程度は、ハイブリダイゼーションの温度が上がるほど、またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が下がるほど増加する。
【００８７】
緊縮性のハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのＴ_mより約５〜25℃低い温度と、１ＭまでのNa⁺を有するハイブリダイゼーション緩衝液とを含む。より低い温度におけるより高い緊縮の度合は、緩衝液中の１％ホルムアミドごとにハイブリッドのＴ_mを約１℃低下させるホルムアミドの添加によって成し遂げられることが可能である。一般的に、かかる緊縮条件は20〜70℃の温度と、６xまでのSSCと０〜50％のホルムアミドとを含んでいるハイブリダイゼーション緩衝液を含む。より高度の緊縮性は、40から70℃の温度において４倍までのSSCと０から50％のホルムアミドとを有する緩衝液を用いて行なわれることが可能である。
【００８８】
高度の緊縮条件は、典型的には１xまでのSSCと０〜50％のホルムアミドとを有するハイブリダイゼーション緩衝液とともに42〜70℃の温度を含む。標的配列に対する最大の特異的結合を遂行するべく、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を通じて異なる程度の緊縮性が用いられることが可能である。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するべく、増大された緊縮度において行なわれる。
【００８９】
上記の条件は指標として役立つことを意図したものであり、これらの条件を特定のポリペプチドハイブリッドを用いた用途に適合させることは、当業者の力量の範囲内で充分可能である。特定の標的配列のためのＴ_mは、完全に適合するプローブ配列に対して標的配列の50％がハイブリダイズするであろう温度である（定められた条件下）。Ｔ_mに影響する条件は、ポリヌクレオチドプローブの大きさと塩基対含有量、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、およびハイブリダイゼーション溶液中の不安定化剤の存在を含む。
【００９０】
Ｔ_mを算定するための多くの方程式がこの技術において周知であり、DNA、RNA、およびDNA−RNAハイブリッド、ならびに長さを変えたポリヌクレオチドプローブ配列に特異的である（たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning（分子クローニング）：A Labolatory Manual（ラボラトリーマニュアル）、第２版、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）1989）；Ausubelら、（共編）、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最近のプロトコール（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）社1987）；Berger およびKimmel（共編）Guide to Molecular Clonig Techniques（分子クローニング技術への手引き）（アカデミックプレス社、1987）；およびWetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26 : 227（1990）参照のこと）。
【００９１】
OLIGO 6.0（LSR；ロングレーク、ミネソタ州）およびPrmer Primer 4.0（プライマー・バイオソフト・インターナショナル；パロアルト、カリフォルニア州）といった配列分析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、所与の配列を分析するため、およびユーザー定義基準に基づきＴ_mを算定するための入手可能な手段である。またかかるプログラムは、所与の配列を被定義条件下に分析し、かつ適当なプローブ配列を同定することも可能である。
【００９２】
典型的には、＞50塩基対の、より長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、算定されたＴ_mより約20〜25℃低い温度において行なわれる。＜50塩基対の、より小さいプローブについては、ハイブリダイゼーションは典型的にはＴ_mにおいてか、または５〜10℃下げて行なわれる。このことは、DNA−DNAおよびDNA−RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーションの最大速度を可能にする。
【００９３】
ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度ならびに安定性に影響する。＜50塩基対の、より小さいプローブ配列は、すばやく相補配列との平衡に達するが、安定性の小さいハイブリッドを形成してよい。数分から数時間のあたりのインキュベーション時間が用いられることが可能である。より長いプローブはよりゆっくりと平衡に達するが、より低い温度においてであっても、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは一晩またはそれより長く続くことが可能である。一般的には、インキュベーションは算定されたコット時間と同じから３倍までに等しい期間にわたり行なわれる。コット時間は、ポリヌクレオチド配列が再結合に要する時間であり、この技術において周知の方法により、特定の配列について算定されることが可能である。
【００９４】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成は、ハイブリッド複合体の熱安定性に影響するであろうし、それによりハイブリダイゼーション温度ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度の選択に影響を及ぼす。塩化ナトリウムを含んでいる水溶液中では、Ａ−ＴペアはＧ−Ｃペアよりも不安定である。したがって、Ｇ−Ｃ含量が高いほどハイブリッドはより安定している。配列内のＧおよびＣ残基の分布さえも、ハイブリッドの安定性に対してポジティブに寄与する。
【００９５】
さらに、所与の配列のＴ_mを変えるべく、塩基対組成が操作されることが可能である。たとえば、Ｔ_mを高めるべく、５−メチルデオキシシチジンはデオキシシチジンに対して置換されることが可能であり、５−ブロモデオキシウリジンはチミジンに対して置換されることができ、一方Ｔ_mへの依存性を減じるべく、７−deazz−２´−デオキシグアノシンがグアノシンに対して置換されることが可能である。
【００９６】
またハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度も、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にデンハート溶液（Denhardt’s solution)（シグマケミカル社、ミズーリ州、セントルイス）などの遮断薬、変性サケ精子DNA、tRNA、粉乳（ブロット（BLOTTO）ヘパリンまたはSDS、およびSSC（１xのSSC：0.15Ｍ塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）またはSSPE（１xのSSPE：1.8M NaCl、10mM NaH₂PO₄、1mM EDTA，pH7.7）といったNa⁺の供給源を含む。緩衝液のイオン濃度を減じることにより、ハイブリッドの安定性は増加する。
【００９７】
典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は10mMから１Ｍの間のNa⁺を含む。ホルムアミド、テトラルキル（tetralkyl）アンモニウム塩、グアニジニウム陽イオン、またはチオシアネート陽イオンといった不安定化または変性剤の、ハイブリダイゼーション溶液への添加は、ハイブリッドのＴ_mを変えるであろう。典型的には、ホルムアミドはより使いやすい、より低い温度においてインキュベーションが行なわれるようにするため、50％までの濃度にて用いられる。またホルムアミドは、RNAプローブを用いた場合の非特異的なバックグラウンドを減じるべく作用する。
【００９８】
一つの例として、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、50％ホルムアミド、５xのSSC（１xのSSC：0.15Ｍ塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、５倍のデンハート溶液（100倍のデンハート溶液：２％（w/v）フィコール400、２％（w/v）ポリビニルポリロドン、および２％（w/v）ウシ血清アルブミン）、10％硫酸デキストラン、および20μｇ／mlの変性され、剪断されたサケ精子DNAを含んでいる溶液中で、42℃において一晩ハイブリダイズされることが可能である。
【００９９】
当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件のバリエーションを工夫することが可能である。たとえば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液中で約65℃というように、より高いかまたはより低い温度において、インキュベートされることが可能である。さらに、予混ハイブリダイゼーション溶液（たとえば、クロンテック（CLONTECH）・ラボラトリーズ社からのEXPRESSHYBハイブリダイゼーションソリューション）が市販されており、製造業者の使用説明書にしたがってハイブリダイゼーションが行なわれることが可能である。
【０１００】
ハイブリダイゼーションに続き、ハイブリダイズしない核酸を除去するべく、核酸分子は緊縮条件下に、あるいは高度の緊縮条件下に洗浄されることが可能である。典型的な緊縮洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いた0.5〜２xのSSCの溶液中での洗浄を含む。すなわち、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズされ、その洗浄の緊縮性は、55℃での0.1％SDSを用いた0.5xのSSCか、または65℃での0.1％ SDSを用いたx倍のSSCを含めて、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.5x〜２xのSSCに等しい。当業者は、たとえば洗浄溶液中のSSCをSSPEに置換することにより、同等の条件を容易に工夫することができる。
【０１０１】
典型的な高度に緊縮性の洗浄条件は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いた0.1〜0.2xのSSCの溶液中での50〜60℃における洗浄を含む。言い換えれば、変異体zacrp3ポリペプチドをコードしている核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、高度に緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズされ、その洗浄の緊縮性は、50℃での0.1％ SDSを用いた0.1xのSSCか、または65℃での0.1％ SDSを用いた0.2xのSSCを含めて、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.1x〜0.2xのSSCに等しい。
【０１０２】
また本発明は、配列番号２のポリペプチドかまたはそのオルソログと実質的に類似した配列同一性を有する、単離されたzacrp3ポリペプチドも提供する。「実質的に類似した配列同一性」という用語は、本文においては、配列番号２に示された配列か、またはそのオルソログに対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドを意味するべく用いられる。また本発明は、配列番号２のアミノ酸残基51〜246の配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも含む。さらに本発明は、かかるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。パーセント同一性の測定法は以下に述べられる。
【０１０３】
また本発明は、二つの基準：コードされたポリペプチドと配列番号２のアミノ酸配列との間の類似性の測定と、前文に述べたようなハイブリダイゼーションアッセイとを用いて同定されることが可能なzacrp3変異体核酸も含む。かかるzacrp3変異体は、
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズし、その洗浄の緊縮性が、50〜65℃における0.1％ SDSを用いた0.5x〜２xSSCに等しく、さらに
（２）配列番号２の配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子を含む。
【０１０４】
別法として、zacrp3変異体は
（１）配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子（またはその相補体）と、高い緊縮性の洗浄条件下にハイブリダイズし、その洗浄の緊縮性が50〜65℃での0.1％ SDSを用いた0.1x〜0.2xSSCに等しく、さらに
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または95％より高い配列同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子として特徴づけられることが可能である。
【０１０５】
配列同一性のパーセントは通常の方法により測定される。たとえば、Altschulら、Bull. Math. Bio. 48 : 603 、 1986、およびHenikoff および Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915、1992参照。手短に言えば、二つのアミノ酸配列は、ギャップオープニングペナルティ10、ギャップエクステンションペナルティ１、および表３（アミノ酸は標準的な１文字コードによって示されている）に示されたような、Henikoffおよび Henikoff （同書）の「BLOUSUM62」スコアリングマトリックスを用いて、アライメントスコアを最適化するべく配列される。次に同一性のパーセントが計算される：[ 同一の対合総数 ]／[より長い配列の長さ、プラス、二つの配列をアライメントするべく、より長い配列に導入されたギャップの数 ]）（100）。
【０１０６】
【表３】

【０１０７】
当業者は、二つのアミノ酸配列をアライメントするための多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。パーソン・アンド・リップマン（Pearson and Lipman）の「FASTA」相同性検索アルゴリズムは、本文において開示されたアミノ酸配列と推定上の変異体zacrp3のアミノ酸配列とによって共有される、同一性のレベルを検査するために適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Person および Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444、1988、および Person、Meth. Enzymol. 183 : 63、1990により記述されている。
【０１０８】
手短に言えば、FASTAはまず、最も高密度の同一性か（ktup変数が１であれば）、または同一性のペア（ktup変数が２であれば）のいずれかを有する、疑わしい配列（たとえば配列番号２）と検査配列とによって共有される領域を同定することにより、保存性のアミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、配列の類似性を特徴づける。次いで、最も高密度の同一性をもつ10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、ペアにされた全アミノ酸の類似性を比較することにより再スコアされ、当該領域の末端は「刈込まれ」、最高のスコアに寄与するような残基だけを含むようにする。
【０１０９】
もし「カットオフ」値（配列の長さとｋｔｕｐ値とに基づきあらかじめ定められた式により算定される）よりも大きいスコアをもつ領域がいくつか存在すれば、刈込まれた最初の領域が検査され、当該領域がギャップをもつ隣接したアライメントを形成するべく結合されることが可能かどうかが決定される。最後に、二つのアミノ酸配列の最も高いスコアリング領域が、アミノ酸の挿入および欠失を考慮するニードルマン・ヴンシュ・セラーズ（Needlman-Wunsch-Sellers）アルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48 : 444、1970；Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26 : 787、1974）の変法を用いてアライメントされる。
【０１１０】
FASTA分析のための代表的なパラメーターは；ktup＝１、ギャップオープニングペナルティ＝10、ギャップエクステンションペナルティ＝１、および置換マトリックス＝BLOSUM62である。これらのパラメーターは、Person、Meth. Enzymol. 183 : 63、1990の付録２に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「SMATRIX」）を修正することによってFASTAプログラムに導入されることが可能である。
またFASTAは、前文に開示されたような比を用いて核酸分子の配列同一性を決定するべく用いられることが可能である。ヌクレオチド配列の比較用には、ktup値が１と６の間が可能であり、好ましくは４から６の範囲である。
【０１１１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に比較して、一つまたはそれより多い「保存性のアミノ酸置換」を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。保存性のアミノ酸置換はアミノ酸の化学的性質に基づくことが可能である。すなわち、配列番号２の一つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含んでおり、そのアルキルアミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つのアルキルアミノ酸を置換しているか、芳香族アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの芳香族アミノ酸を置換しているか、含硫アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの含硫アミノ酸を置換しているか、含ヒドロキシアミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの含ヒドロキシアミノ酸を置換しているか、酸性アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの酸性アミノ酸を置換しているか、塩基性アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの塩基性アミノ酸を置換しているか、または2塩基１カルボン酸アミノ酸がzacrp3アミノ酸配列の一つの２塩基１カルボン酸アミノ酸を置換している変異体が取得されることが可能である。
【０１１２】
共通なアミノ酸のうち、たとえば「保存性のアミノ酸置換」は、以下の各々の群の中でのアミノ酸の間の置換によって説明される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リジン、アルギニン、およびヒスチジン。
【０１１３】
BLOUSM62テーブルは、500グループより多い関連タンパク質の、高度に保存された領域を代表している、タンパク質配列セグメントの約2,000の局所の多重アライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスである（Henikoff および Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915、1992）。したがって、BLOUSM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入されてよい保存性のアミノ酸置換を定義するべく用いられることが可能である。化学的性質のみに基づいて（前文に議論したように）アミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存性のアミノ酸置換」という言葉は、好ましくは−１より大きいBLOUSUM62値によって表される置換を指す。
【０１１４】
たとえば、一つのアミノ酸置換は、もし当該アミノ酸置換が０、１、２、または３のBLOUSUM62値によって特徴づけられるなら、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性のアミノ酸置換は、少なくとも１（たとえば１、２、または３）のBLOUSUM62値によって特徴づけられるが、さらに好ましい保存性のアミノ酸置換は、少なくとも２（たとえば２または３）のBLOUSUM62値によって特徴づけられる。
【０１１５】
zacrp3遺伝子における保存性のアミノ酸の変化は、ヌクレオチドを、配列番号１において列挙されたヌクレオチドに対して置換することにより導入されることが可能である。かかる「保存性のアミノ酸」の変異体は、たとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた突然変異誘発、およびその他により取得可能である（Ausubel（1995）8 - 10〜8 - 22頁；およびMcPherson（編）、Directed Mutagenesis（特異的突然変異誘発）：A Practical Approach（実用的なアプローチ）（IRLプレス 1991）参照）。かかる変異体が、エネルギー均衡の調整または野性型タンパク質の他の性質を促進する能力は、本文において述べられた検定法のような、標準的な方法を用いて測定されることが可能である。別法として、変異体zacrp3ポリペプチドは、抗zacrp3抗体と特異的に結合する能力によって同定されることが可能である。
【０１１６】
また本発明のタンパク質は、非天然性のアミノ酸残基を含むことも可能である。非天然性のアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチル−グリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、および４−フルオロフェニエルアラニンを、制限することなく含む。非自然性に生じるアミノ酸残基をタンパク質に取り込むための、いくつかの方法がこの技術において周知である。
【０１１７】
たとえば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス突然変異が抑制されるインヴィトロの系が用いられることが可能である。アミノ酸およびアミノアシル化されたtRNAを合成する方法は、この技術において周知である。ナンセンス突然変異を含んでいるプラスミドの転写および翻訳は、典型的には、大腸菌のS30抽出物と、市販の酵素および他の試薬とを含んで成る無細胞系において行なわれる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。たとえば、Robertsonら、J. Amer. Chem. Soc. 113 : 2722、1991、Ellmanら、Methods Enzymol. 202 : 301、1991、Chungら、Science 259 : 806 、1993、およびChungら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10145、1993参照。
【０１１８】
第２の方法においては、翻訳はアフリカツメガエルの卵母細胞内において、突然変異されたmRNAと化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAとのマイクロインジェクションにより行なわれる（Turcattiら、J. Biol. Chem. 271 : 19991、1996）。第３の方法においては、大腸菌細胞は置き変えられるべき天然のアミノ酸（たとえば、フェニルアラニン）の不在下に、および所望の非自然性に生じるアミノ酸（たとえば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニエルアラニン）の存在下に、培養される。
【０１１９】
非自然性に生じるアミノ酸は、その天然の対応物の場所において当該タンパク質に取り込まれる。Koideら、Biochem. 33 : 7470、1994参照。天然に生じるアミノ酸残基は、インヴィトロの化学修飾により、非自然性に生じる種類に変えられることが可能である。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡大するべく、部位特異的突然変異誘発と結び付けられることが可能である（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2 : 395、1993））。
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、非自然性に生じるアミノ酸、および非自然性アミノ酸が、zacrp3アミノ酸残基用に対して置換されてよい。
【０１２０】
Reidhaar-OlsonおよびSauer（Science 241 : 53、1988）、またはBowieおよびSauer（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 2152、1989）により開示された、突然変異誘発およびスクリーニングといった周知の方法を用いて、多数のアミノ酸置換が作成および検査されることが可能である。手短に言えば、これらの筆者らは、一つのポリペプチドにおける二つまたはそれより多い位置を同時にランダム化し、機能性のポリペプチドを選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドをシーケンシングして、各位置において許される置換の範囲を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法は、ファージディスプレイ（たとえば、Lowmanら、Biochem. 30: 10832、1991、Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Huse、国際公開番号 WO92/06204、および部位特異的突然変異誘発（Derbyshireら、Gene 46 : 145、1986、およびNer ら、DNA 7 : 127、1988）を含む。
【０１２１】
また開示されたzacrp3ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変異体は、Stemmer、Nature 370 : 389 、1994、Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 10747 、1994、および国際公開番号 WO97/20078によって開示されたようなDNAシャフリングを介して生成されることも可能である。手短に言えば、変異体DNA分子は、親のDNAのランダムなフラグメント化とそれに続くPCRを用いた再構築による、インヴィトロの相同組換えによって生成され、結果としてランダムに導入された点突然変異を生じる。
【０１２２】
この技術は、アレル変異体または異なる種からのDNA分子といった、一群の親DNA分子を用いることによって改造されることが可能であり、このプロセスにさらなる変異性が導入される。所望の活性についての選択またはスクリーニングと、それに続く付加的な突然変異誘発ならびに検定は、望ましい突然変異を選択することとともに、好ましくない変化に対して同時に選択することにより、配列の迅速な「進化」を提供する。
【０１２３】
本文に開示されたような突然変異誘発法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異原化されたポリペプチドの活性を検出するべく、自動化されたハイスループットスクリーニング法と結びつけられることが可能である。生物活性のあるポリペプチドか、または抗zacrp3抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異原化されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、最新の設備を用いて迅速にシーケンスされることが可能である。これらの方法は、興味のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性についての迅速な決定を可能にし、また未知の構造をもつポリペプチドに適用されることが可能である。
【０１２４】
本発明のポリペプチドにおける重要なアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発かまたはアラニンスキャニング突然変異誘発といった、この技術において周知の方法により同定されることができる（CunninghamおよびWells、Science 244 : 1081、1989、Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 4498、1991、CoombsおよびCorey、「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering（部位特異的突然変異誘発とタンパク質工学）」、Proteins: Analysis and Design（タンパク質：分析と設計）、Angeletti（編）、259 - 311頁（アカデミック・プレス社1998））。
【０１２５】
後者の技術においては、単一のアラニンの突然変異が分子内のすべての残基に導入され、結果として得られた突然変異体分子が、当該分子の活性にとって決定的であるアミノ酸残基を同定するべく、下文に開示されたような生物活性について検査される。またHiltonら、J. Biol. Chem. 271 : 4699、1996、も参照のこと。また当該重要なアミノ酸も、zacrp3を用いたホモロジーの分析から推測されることが可能である。
【０１２６】
zacrp3の受容体結合ドメインの位置は、推定される接触部位のアミノ酸についての突然変異とともに、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識といった技術により測定されるような、物理的分析法により同定されることが可能である。たとえば、de Vosら、Science 255 : 306、1992、Smithら、J. Mol. Biol. 224 : 899、1992、およびWlodaverら、FEBS Lett. 309 : 509、1992参照。さらに、ビオチンまたはFITCで標識されたzacrp3は、zacrp3受容体の発現クローニングに使用されることが可能である。
【０１２７】
また本発明は、本文において開示されたzacrp3ポリペプチドのエピトープをもつ部分を含んでいるポリペプチドフラグメントまたはペプチドも提供する。かかるフラグメントまたはペプチドは、「免疫原性エピトープ」を含んでよく、それはタンパク質全体が免疫原として用いられた場合に、抗体反応を誘起するタンパク質の一部分である。免疫原性エピトープをもつペプチドは、標準的な方法により同定されることが可能である（たとえば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3998、1983参照）。
【０１２８】
対照的に、ポリペプチドフラグメントまたはペプチドは「抗原性エピトープ」を含んでよく、それは抗体が特異的にそこに結合することが可能なタンパク質分子の一領域である。あるエピトープは直鎖かまたは連続した一続きのアミノ酸から成っており、かかるエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを模すことが可能な、比較的短い合成エピトープが、当該タンパク質に対する抗体の産生を刺激するべく用いられることができることは、この技術において周知である（たとえば、Sutcliffeら、Science 219 : 660、1983参照）。したがって、本発明の抗原性エピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、本文において開示されたポリペプチドと結合する抗体を高めるために有用である。
【０１２９】
抗原性エピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、配列番号２の好ましくは少なくとも４〜10個のアミノ酸か、少なくとも10〜15個のアミノ酸か、または約15〜30個のアミノ酸を含む。かかるエピトープをもつペプチドならびにポリペプチドは、zacrp3ポリペプチドのフラグメント化によるか、または本文において開示されたような化学的ペプチド合成により産生されることが可能である。さらに、エピトープはランダムなペプチドライブラリーのファージディスプレイにより選択されることが可能である（たとえば、LaneおよびStephen、Curr. Opin. Immunol. 5 : 268、1993、およびCorteseら、Curr. Opin. Biotechnol. 7 : 616、1996参照）。
【０１３０】
エピトープを同定するため、およびエピトープを含む小さいペプチドから抗体を産生するための方法は、たとえばMoleによる、「Epitope Mapping（エピトープマッピング）、Methods in Molecular Biology、第10巻、Manson（編）、105 - 16頁（ザ・ヒューマン・プレス社1992）、Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies（合成ペプチド由来の抗体の産生および特徴づけ）」、Monoclonal Antibodies : Production, Engineering, and Clinical Application（モノクローナル抗体：産生、工学、および臨床応用）、Ritter およびLadyman（共編）、60 - 84頁（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス1995）、およびColiganら、（共編）Current Protocols in Immunology（免疫学における最近のプロトコール）、9.3.1. - 9.3.5.頁および9.4.1 - 9.4.11頁（ジョン・ウィリー＆サンズ(John Wikley &Sons) 1997）に述べられている。
【０１３１】
変異体zacrp3遺伝子の特定のヌクレオチド配列にかかわらず、当該遺伝子は、そのエネルギー平衡調整活性か、または野性型タンパク質の他の活性によるか、あるいは抗zacrp3抗体に対して特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドをコードしている。さらに明確には、変異体zacrp3遺伝子は、本文において開示されたヒトzacrp3遺伝子によってコードされているポリペプチドの、少なくとも50％、および好ましくは70、80、または90％より多い活性を示す。
【０１３２】
変異体ならびに融合タンパク質を含めて、いかなるzacrp3ポリペプチドについても、当該技術分野の普通の技術の者は、上記の表１および２に示された情報を用いて、当該変異体をコードしている完全に縮重したポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本文に述べられたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づき、標準的なソフトウェアを使用してzacrp3変異体を発明することができる。したがって、本発明は以下の配列の内の少なくとも一つを提供するデータ構造とともにコード化された、コンピューターが読み取り可能な媒体を含む：配列番号１、配列番号２、および配列番号10。
【０１３３】
コンピューターが読み取り可能な媒体の適当な形状は、磁気媒体および光学的に読み取り可能な媒体を含む。磁気媒体の実例は、ハードまたは固定ドライブ、ランダムアクセスメモリー(RAM）チップ、フロッピーディスク、ディジタルリニアテープ（DLT）、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクを含む。光学的に読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（たとえば、CD−リードオンリイメモリー(ROM）、CD−リライタブル（書き直し可能）（RW）、およびCD−レコーダブル（記録可能））、およびディジタル ヴァーサチル（汎用）／ビデオ ディスク(DVD）によって例示される（たとえば、DVD-ROM、DVD-RAM、およびDVD+RW）。
【０１３４】
また本発明は、zacrp3融合タンパク質も提供する。たとえば、本発明の融合タンパク質は、
（１）（ａ）アミノ酸残基１(Met）、23(Gln）、または51(Gly）から、アミノ酸残基246(Lys）までの、配列番号２に示されたようなアミノ酸残基の配列を含むポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号２の、アミノ酸51(Gky）からアミノ酸113(Pro）に及ぶポリペプチド分子、コラーゲン様ドメインか、または２量体化またはオリゴマー化することが可能な当該コラーゲン様ドメインの一部分を含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分；
【０１３５】
（ｃ）配列番号２の、アミノ酸114(Pro）から246(Lys）に及ぶポリペプチド分子、Clqドメインか、またはClqドメインの活性部分を含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分；または
（ｄ）アミノ酸51(Gly）から246(Lys）に及ぶポリペプチド分子、コラーゲン様ドメインとClqドメインとを含んでいるzacrp3ポリペプチドの一部分、より成る群から選ばれるポリペプチド；および
（２）別のポリペプチド、
を含む。
【０１３６】
別のポリペプチドは、代替または付加的なClqドメイン、代替または付加的なコラーゲン様ドメイン、融合タンパク質の分泌を促進するためのシグナルペプチド、またはその他であってよい。zacrp3ポリペプチド、フラグメント、または融合物の球形ドメインは、一つの類似した役割を有してもよい。
【０１３７】
アミノ酸１(Met）からアミノ酸246(Lys）に及ぶ、zacrp3ポリペプチド； アミノ酸23(Gln）からアミノ酸246(Lys）に及ぶ、成熟したzacrp3ポリペプチド、；またはその分泌リーダーフラグメントで、アミノ酸１(Met）からアミノ酸22(Cys）に及ぶフラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌の研究において使用されてよい。本発明のこの観点についての好ましい態様においては、成熟したポリペプチドは、推定される分泌シグナル配列との融合タンパク質として形成され；当該融合タンパク質の発現を指示することが可能な調節領域をもつプラスミドが、検査細胞に導入され；さらに、成熟したタンパク質の分泌が監視される。監視は、HPLCなどの当該技術において周知の技術により行なわれてよい。
【０１３８】
完全長のタンパク質、そのフラグメント、および融合タンパク質を含む、本発明のポリペプチドは、通常の技術に従って、遺伝学的に工作された宿主細胞において産生されることが可能である。適当な宿主細胞は、外来性のDNAを用いてトランスフォームまたはトランスフェクトされ、かつ培養において増殖されることが可能な細胞型のものであり、細菌、真菌細胞、および培養された高等な真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化されたDNAを操作するための、および外来性のDNAを種々の宿主細胞へ導入するための技術は、Sambrookら、同書、およびAusubelら、同書により開示されている。
【０１３９】
一般的に、本発明のzacrp3ポリペプチドをコードしているDNA配列は、その発現に必要な、一般的には一つの発現ベクター内に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、他の遺伝学的要素に対して、操作可能に結合されている。また当該ベクターは、通常一つまたはそれより多い選択マーカーと、一つまたはそれより多い複製の起点とを含むが、当業者は、ある系においては、選択可能なマーカーが別々のベクター上に供されてよく、また外来性のDNAの複製が宿主細胞のゲノムへの組込みによって供されてもよいことを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、および他の要素の選択は、当該技術分野の普通の技術の者のレベルの範囲内での日常の設計の問題である。多くのかかる要素が文献に述べられており、商業的な供給者を通じて入手される。
【０１４０】
zacrp3ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、シグナル配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られている）が発現ベクター内に提供される。分泌シグナル配列は、zacrp3ポリペプチドのそれでよく、あるいは別の分泌されたタンパク質（たとえばt-PA）に由来するか、またはドゥノボに合成されてもよい。分泌シグナル配列は、正しい読取り枠において、zacrp3ポリペプチドのDNA配列に結合される。
【０１４１】
一般に分泌シグナル配列は、興味のポリペプチドをコードしているDNA配列の５´に置かれるが、あるシグナル配列は興味のDNA配列内のどこに置かれてもよい（たとえば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,413,830号参照）。逆に、zacrp3ポリペプチドのシグナル配列部分（配列番号２のアミノ酸残基１〜22）は、類似した方法によって代替タンパク質の分泌を指示するために用いられてもよい。
【０１４２】
本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路内に指向させるべく使用されることが可能である。本発明は、かかる融合ポリペプチドに対して必要な手段をもつ。配列番号２のアミノ酸残基１〜22に由来する分泌シグナル配列は、この技術において周知でありかつ本文に開示された方法を用いて、別のポリペプチドに対して操作可能に結合された、シグナル融合ポリペプチドが作成されることが可能である。
【０１４３】
本発明の融合ポリペプチドに含まれている分泌シグナル配列は、好ましくは付加的なペプチドに対しアミノ末端に融合され、当該付加的なペプチドを分泌経路内に向けるようにする。かかる構築物は、この技術において周知の多くの使用法を有する。たとえば、これらの新規な分泌シグナル配列融合構築物は、受容体などの正常には分泌されないタンパク質の活性成分の分泌を指示することができる。かかる融合物は、ペプチドが分泌経路を通るように指向させるべく、インヴィヴォまたはインヴィトロにおいて使用されてよい。
【０１４４】
培養された哺乳類細胞は、本発明の範囲内の適当な宿主である。外来性のDNAを哺乳類の宿主細胞へ導入する方法は、リン酸カルシウムを介するトランスフェクションを含む（Wiglerら、Cell 14 : 725、1978；CorsaroおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7 : 603、1981；GrahamおよびVan der Eb、Virology 52 : 456、1973）、電気穿孔（Neumannら、EMBO J. 1 : 841 - 5、1982）、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら、同書）、およびリポソーム媒介トランスフェクション（Hawley - Nelsonら、Focus 15 : 73、1993；Ciccaroneら、Focus 15 : 80、1993、およびウイルスベクター（MillerおよびRosman、BioTechniques 7 : 980 - 90、1989；WangおよびFiner、Nature Med. 2 : 714- 6、1996）を含む。
【０１４５】
培養哺乳類細胞における組換えポリペプチドの産生は、たとえばLevinsonら、米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。適当な培養哺乳類細胞は、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、BHK（ATCC CRL 1632）、BHK570（ATCC CRL 10314）、293（ATCC CRL 1573）；Grahamら、J. Gen. Virol. 36 : 59 - 72、1977）およびチャイニーズハムスター卵巣（たとえばCHO-K1；ATCC CCL 61）細胞系を含む。
【０１４６】
さらなる適当な細胞系はこの技術において周知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、マナサス、などの公の寄託機関から入手可能である。一般に、SV-40またはサイトメガロウイルスからのプロモーターなどの、強力な転写プロモーターが好ましい。たとえば、米国特許第4,956,288号を参照のこと。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）、およびアデノウイルスの主要後期プロモーターを含む。
【０１４７】
一般的に薬物選択は、外来性DNAが挿入されている培養哺乳類細胞を選択するために用いられる。かかる細胞は普通「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択薬剤の存在下に培養されており、かつ興味の遺伝子をその子孫に渡すことができる細胞は「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性をコードしている遺伝子である。選択は、G-418またはその他といったネオマイシン型の薬剤の存在下に行なわれる。また選択系は、「増幅」と呼ばれる興味の遺伝子の発現レベルを増強するプロセスのために用いられてよい。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選択薬剤の存在下に培養することと、次に、導入された遺伝子産物を高レベルに産生する細胞を選択するべく、選択薬剤の量を増やすことによって行なわれる。
【０１４８】
好ましい増幅可能な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼであり、それはメトトレキセートに対する抵抗性を与える。他の薬剤耐性遺伝子（たとえば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用されることが可能である。緑色の蛍光タンパク質か、あるいはCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼといった細胞表面タンパク質などの、別の表現型を導入する代替のマーカーは、FACS選別や磁気ビーズ分離法などの手段により、トランスフェクトされた細胞をトランスフェクトされていない細胞から選別するべく用いられてよい。
【０１４９】
植物細胞、昆虫細胞、および鳥類細胞を含めた、他のより高等な真核細胞も宿主として用いられることが可能である。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarら、J. Biosci.（Bangalore) 11 : 47 - 58、1987によって総説されている。昆虫のトランスフォーメーションおよびそこでの外来性ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開 WO94/06463により開示されている。
【０１５０】
昆虫細胞は、一般にオートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV）から由来する、組換えバキュロウイルスにより感染されることが可能である。KingおよびPossee、「TheBaculovirus Expression System：A Laboratory Guide（バキュロウイルス発現系：ラボラトリーガイド）」、ロンドン、チャプマン・アンド・ホール（Chapman & Hall）；O’Reillyら、Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual（バキュロウイルス発現ベクター：ラボラトリーマニュアル）、ニューヨーク、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、1994；およびRichardson, C. D. 、編、Baculovirus Expression Protocols： Methods in Molecular Biology（バキュロウイルス発現プロトコール：分子生物学における方法）, ニュージャージー州、トトワ、ヒューマナ（Humana）・プレス、1995参照のこと。
【０１５１】
組換えzacrp3バキュロウイルスを作成する第２の方法は、Luckou（Luckowら、J. Virol. 67 : 4566 - 79、1993）によって述べられたトランスポゾンを主体とする系を利用する。転移ベクターを用いるこの系は、Bac-to-Bac^TMキット（ライフ・テクノロジーズ、メリーランド州、ロックビル）において販売されている。この系は、zacrp3ポリペプチドをコードしているDNAを、「バクミド（Bacmid）」と呼ばれる大きいプラスミドとして大腸菌の中に維持されたバキュロウイルスゲノム内に移動させるための、Tn7トランスポゾンを含んでいるトランスファーベクター、pFastBac1^TM（ライフ・テクノロジーズ）を利用している。
【０１５２】
pFastBac1^TMトランスファーベクターは、興味の遺伝子、この場合にはzacrp3の発現を駆動するため、AcNPVのポリヘドリンプロモーターを利用する。しかしながら、pFastBac1^TMは、かなりの程度まで修正されることが可能である。ポリヘドリンプロモーターは、除去され、バキュロウイルスの塩基性タンパク質プロモーター（Pcor、p6.9、またはMPプロモーター）で置換されること可能であるが、それはバキュロウイルス感染の初期に発現され、かつ分泌タンパク質の発現にとって好都合であることが示されている。Hill-PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 71 : 971 - 6、1990；Bonningら、J. Gen. Virol. 75 : 1551 - 6、1994；および、ChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Che. 270 : 1543 - 9、1995参照。
【０１５３】
かかるトランスファーベクター構築物においては、短いかまたは長い型の塩基性タンパク質プロモーターが使用されてよい。さらに、天然のzacrp3分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質由来の分泌シグナル配列を用いて置き換えるトランスファーベクターが構築されることが可能である。たとえば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチメリチン（インヴィトロジェン、カリフォルニア州、カールズバッド）、またはバキュロウイルスgp67（ファーミンゲン（PharMingen）、カリフォルニア州、サンディエゴ）は、天然のzacrp3分泌シグナル配列を置換するべく、構築物において使用されることが可能である。
【０１５４】
さらに、トランスファーベクターは、発現されたzacrp3ポリペプチドのＣ−またはＮ−末端におけるエピトープタグ、たとえば、Glu-Gluエピトープタグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 7952 -4、1985）をコードしているDNAとのフレーム内融合を含むことができる。当該技術分野において周知の技術を用いることにより、zacrp3を含んでいるトランスファーベクターは大腸菌内ヘトランスフォームされ、組換えバキュロウイルスの指標である分断されたlacZ遺伝子を含むバクミドについてスクリーンされる。
【０１５５】
組換えバキュロウイルスゲノムを含んでいるバクミドDNAは、一般的な技術を用いて単離され、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、たとえばSf9細胞をトランスフェクトするべく用いられる。zacrp3を発現する組換えウイルスが実質的に産生される。組換えウイルスのストックは、この技術（ ）一般的に用いられる方法により作成される。
【０１５６】
組換えウイルスは、宿主細胞、典型的にはフォール・アーミウォーム（fall armyworm、ヨトウムシの一種）、スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞系を感染させるべく用いられる。全般的には、GlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA（分子生物工学：組換えDNAの原理と応用）、ASMプレス、ワシントン、1994参照のこと。もう一つの適当な細胞系は、トリコロプルシア・ニ（Trochoplusia ni）（米国特許第5,300,435号）由来のHigh FiveO^TM細胞系（インヴィトロジェン）である。市販の無血清培地が、当該細胞を増殖ならびに維持するべく用いられる。
【０１５７】
適当な培地は、Sf9細胞用にはSf900 II^TM（ライフ・テクノロジーズ）か、またはESF 921^TM（エクスプレッション（Expression）・システムズ）であり；またT.ni細胞用にはEX-cellO405^TM（JRH バイオサイエンス、カンザス州、ルネクサ（Lenexa））か、またはExpress FiveO^TM（ライフ・テクノロジーズ）である。細胞は約２〜５x10⁵細胞の播種密度から、１〜２x10⁶細胞の密度まで増殖され、この時点で組換えウイルスのストックが、0.1〜10の、さらに典型的にはほぼ３の感染多重度(MOI）で添加される。使用される方法は、全般的に市販のラボラトリーマニュアル（King および Possee、同書；O’Reillyら、同書；Richardson、同書）に述べられている。次に続く、上清からのzacrp3ポリペプチドの精製は、本文に述べられた方法を用いて行なわれることが可能である。
【０１５８】
酵母細胞を含めた真菌細胞も、本発明の範囲内で使用されることができる。この点において特に興味深い酵母の種類は、サッカロミケス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）を含む。外来性のDNAを用いてＳ．セレビシエ細胞をトランスフォームし、さらにそれより組換えポリペプチドを産生する方法は、たとえば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；およびMurraytら、米国特許第4,845,075号によって開示されている。
【０１５９】
トランスフォームされた細胞は、選択可能なマーカー、一般には薬剤耐性かまたは特定の栄養素（たとえば、ロイシン）の不在下に成育する能力、によって決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビジエにおいて用いるための好ましいベクター系は、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）により開示されたPOT1ベクター系であり、それはトランスフォームされた細胞が、含グルコース培地中での成育によって選ばれることを可能にする。酵母における使用のための、適当なプロモーターおよびターミネーターは、糖分解酵素遺伝子（たとえばKawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを含む。
【０１６０】
また米国特許第4,990,446号、第5,063,154号、第5,139,936号、および第4,661,454号も参照のこと。ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、スキゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）、クルイベロミケス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミケス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスティラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（ Pichia methanolica ）、ピキア・ギルレルモンディー（Pichia guillermondii）、およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を含めた他の酵母のためのトランスフォーメーション系は、この技術において周知である。
【０１６１】
たとえば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132 : 3459 - 65、1986およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照のこと。コウジカビ属の細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用されてよい。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）をトランスフォームする方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号によって開示されている。アカパンカビ属をトランスフォームする方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号により開示されている。
【０１６２】
組換えタンパク質の産生のための宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、WIPO公開、WO97/17450、WO97/17451、WO98/02536、およびWO98/02565に開示されている。Ｐ．メタノリカのトランスフォームに用いるためのDNA分子は、一般に二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろうが、好ましくはトランスフォーメーションに先立ち直鎖化される。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド産生用には、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、 Ｐ．メタノリカのアルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）などのＰ．メタノリカの遺伝子であることが好ましい。
【０１６３】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、 ギ酸デヒドロゲナーゼ（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のそれを含む。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するため、両端に宿主DNA配列が隣接された、プラスミドの全発現セグメントを有することが好ましい。ピキア・メタノリカでの使用に好ましい選択可能なマーカーは、Ｐ．メタノリカADE2遺伝子であり、それはアデニンの非存在下にade2宿主細胞の成育を可能にするホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC;EC4.1.1.21）をコードする。
【０１６４】
メタノールの使用を最小限化することが望ましい大規模の産業用の工程用には、双方のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失されている宿主細胞を用いることが好ましい。分泌タンパク質の製造用には、液胞型プロテアーゼ遺伝子（PEP4およびPRB1）が欠如した宿主細胞が好ましい。興味のポリペプチドをコードしているDNAを含んでいるプラスミドの、Ｐ．メタノリカ細胞への導入を促進するため、電気穿孔が用いられる。2.5〜4.5kV／cm、好ましくは約3.75kV／cmの電界強度と、１〜40ミリセカンド、最も好ましくは約20ミリセカンドの時定数（τ）とを有する、指数関数的に減退していくパルス電界を用いた電気穿孔により、Ｐ．メタノリカ細胞をトランスフォームすることが好ましい。
【０１６５】
また大腸菌、バチルス属、および他の属の細菌の株を含めた原核性の宿主細胞も、本発明の範囲内の有用な宿主細胞である。これらの宿主細胞をトランスフォームし、かつそこにクローン化された外来性DNA配列を発現する技術は、この技術分野において周知である（Sambrookら、同書参照のこと）。大腸菌などの細菌においてzacrp3ポリペプチドを発現させる場合、当該ポリペプチドは細胞質内に、典型的には不溶性の顆粒として保持されるか、または細菌の分泌配列により細胞周辺腔に指向されてよい。前者の場合には、細胞は溶解され、顆粒は回収され、たとえばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性される。
【０１６６】
次いで、変性されたポリペプチドは、尿素と還元および酸化されたグルタチオンとの溶液に対する透析、およびそれに続く緩衝生理食塩水に対する透析によるといった、変性剤の希釈により再生され、二量化されることが可能である。後者の場合には、細胞周辺腔の内容物を放出するべく、細胞を（たとえば超音波処理または浸透圧ショックにより）破壊すること、および当該タンパク質を回収することにより、当該ポリペプチドが可溶性ならびに機能性の形状にて細胞周辺腔より回収され、それにより変性ならびに再生の必要性を除去することができる。
【０１６７】
トランスフォームされるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養素と、選択された宿主細胞の増殖に必要な他の成分とを含んでいる培養液中にて、通常の方法に従って培養される。合成培地ならびに自然培地を含む、種々の適当な培地は当該技術において周知であり、一般的に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、およびミネラルを含む。また培地は、必要に応じて増殖因子または血清を含んでもよい。一般的に増殖培地は、たとえば、薬物選択か、または発現ベクター上にて運ばれるかまたは宿主細胞内へ同時トランスフェクトされる、選択可能なマーカーによって補足される必須栄養素の欠乏により、外来性に添加されたDNAを含んでいる細胞を選択するであろう。
【０１６８】
発現されたzacrp3ポリペプチド（またはキメラzacrp3ポリペプチド）は、分画法および／または通常の精製法および培地を用いて精製されることが可能である。硫酸アンモニウム沈殿法および、酸またはカオトロープ抽出法が、試料の分画用に用いられてよい。代表的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、および逆相高性能液体クロマトグラフィーを含んでよい。適当なクロマトグラフィー用の媒質は、誘導デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製シリカ、その他を含む。PEI、DEAE、QAE、およびＱ誘導体が好ましい。
【０１６９】
代表的なクロマトグラフィー用媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基を用いて誘導された、フェニルセファロース（Phenyl-Sepharose）FF（ファルマシア）、トヨパール（Toyopearl）ブチル650（Toso Haas、ペンシルベニア州、モントゴメリービル）、オクチルセファロース（Octyl-Sepharose）（ファルマシア）などの媒質か；またはアンバークロム（Amberchrom）（Toso Haas）CG71（Toso Haas）およびその他のポリアクリル樹脂を含む。適当な固形支持体は、ガラスビーズ、シリカを主成分とする樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、およびその他の、それらが使用される条件下で不溶性であるものを含む。
【０１７０】
このような支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、および／または炭水化物部分による、タンパク質の付着を可能にする反応基を用いて修飾されてよい。カップリング化学の実例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、SH活性化、ヒドラジド活性化、およびカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。
【０１７１】
これらの、および他の固形媒質は、この技術において周知でありかつ広く用いられており、また商業的な供給者から入手可能である。受容体ポリペプチドの支持媒質への結合は、この技術において周知である。一つの特別の方法の選択は、日常の設計の問題であり、選ばれた支持体の性質によってある程度決定される。たとえば、Affinity Chromatography : Principles & Methods（アフィニティクロマトグラフィー：原理と方法）、ファルマシアLKBバイオテクノロジー、スウェーデン、ウプサラ、1988参照のこと。
【０１７２】
本発明のポリペプチドは、それらの構造または結合特性の開発により単離されることが可能である。たとえば、固定化金属イオン吸着（FMAC）クロマトグラフィーは、ヒスチジンに富むタンパク質か、またはHisタグを有するタンパク質を精製するべく用いられることが可能である。手短に言えば、ゲルはまず２価の金属イオンで満たされてキレートを形成する（Sulkowski、Trends in Biochem. 3 : 1 - 7、1985）。ヒスチジンに富むタンパク質は、用いられた金属イオンに依存して、異なる親和性を以ってこのマトリックスに吸着され、また競合的な溶出、pHの低下、または強力なキレート剤の使用により溶出されるであろう。
【０１７３】
他の精製法は、レクチンアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによる、グリコシル化されたタンパク質の精製を含む（Methds in Enzymol. 182巻、「Guide to Protein Purification（タンパク質精製入門）」Deutscher、（編）、アカデミックプレス、サンディエゴ、1990、529 - 39頁）。以下の実施例の部分において非常に詳細に議論されているように、精製を促進するべく、本発明のさらなる好ましい態様の範囲内において、興味のポリペプチドとアフィニテータグ（たとえば、マルトース結合タンパク質、FLAG、Gli-Glu、免疫グロブリンドメイン）との融合物が構築されてよい。
【０１７４】
タンパク質再生（および任意で再酸化）の手法が、都合よく用いられてよい。タンパク質は80％純度まで、さらに好ましくは＞90％純度まで、さらになお好ましくは＞95％まで精製することが好ましく、また特に好ましくは薬剤学的に純粋な状態であって、すなわち高分子、特に他のタンパク質および核酸を汚染するものについては99.9％純度より高く、かつ感染性および発熱性の薬剤を含まない。好ましくは、精製されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を含まない。
【０１７５】
またzacrp3ポリペプチドまたはそのフラグメントは、この技術において周知の方法により化学合成を通して調製されてよい。かかるzacrp3ポリペプチドは単量体かまたは多量体でよく；グリコシル化されるかまたはグリコシル化されず；ペジレート（pegylate)されるかまたはペジレートされず；および最初のメチオニンアミノ酸残基を含むか、または含まなくてもよい。
【０１７６】
zacrp3結合ポリペプチドのようなリガンド結合ポリペプチドは、リガンドの精製にも使用可能である。当該ポリペプチドは、アガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカを主成分とする樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下に安定である同様な物質などの、固形支持体上に固定される。ポリペプチドを固形支持体に結合する方法は、この技術において周知であり、アミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシ活性化、SH活性化、およびヒドラジド活性化を含む。結果として生じる媒質は、一般にカラムの形状に形成され、リガンドを含んでいる液体は当該カラムを１回またはそれより多く通され、リガンドがリガンド結合ポリペプチドに結合するようにする。次いでリガンドは、リガンドー受容体結合を崩壊させるための、塩類濃度、カオトロピック剤（グアニジンHCl）、またはpHにおける変化を用いて溶出される。
【０１７７】
リガンド結合受容体（または抗体、補体／抗補体対の一員）か、またはその結合フラグメント、および市販の生物測定器具（BIAcore^TM、ファルマシア・ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いた検定系が都合よく用いられてよい。かかる受容体、抗体、補体／抗補体ペアのメンバーまたはフラグメントは、受容体チップの表面上に固定される。この器具の使用は、Karlsson、J. Immunol. Methods 145 : 229 - 40、1991およびCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234 : 554 - 63、1993により開示されている。
【０１７８】
受容体、抗体、メンバーまたはフラグメントは、アミンまたはSH化学を用いて、フローセル内のゴールドフィルムに結合されたデキストランファイバーに共有結合により結合される。検査試料は当該セルを通過する。もしリガンド、エピトープ、または補体／抗補体ペアの対立するメンバーが試料中に存在すれば、それは固定された受容体、抗体またはメンバーに結合し、各々媒質の屈折率に変化を引き起こし、それがゴールドフィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出されるであろう。この系はオンおよびオフ速度の測定を可能にし、それにより結合親和性が算定されることが可能であり、さらに結合の数量評価を可能にする。
【０１７９】
またリガンド結合ポリペプチドは、この技術において周知の他の検定系の中で使用されることが可能である。かかる系は、結合親和性の測定のためのスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51 : 660 - 72、1949参照のこと）、および熱量計分析（Cunninghamら、Science 253 : 545- 48、1991；Cunninghamら、Science 245 : 821 - 25、1991）を含む。
【０１８０】
また本発明は抗zacrp3抗体も提供する。zacrp3に対する抗体は、たとえば、zacrp3発現ベクターの産物か、または天然の供給源から単離されたzacrp3を抗原として用いて取得されることが可能である。特に有用な抗zacrp3抗体は、zacrp3と「特異的に結合する」。抗体は、もし当該抗体が、10⁶M^-1かそれより大きい、好ましくは107M^-1かそれより大きい、さらに好ましくは10⁸M^-1かそれより大きい、および最も好ましくは10⁹M^-1かそれより大きい結合親和性（Ka）を以ってzacrp3ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合すれば、特異的に結合しているとみなされる。抗体の結合親和性は、たとえばスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51 : 660、1949）により、当業者にによって容易に測定されることができる。適当な抗体は、zacrp3と特定のドメインにおいて結合する抗体を含む。
【０１８１】
抗zacrp3抗体は、抗zacrp3エピトープをもつペプチドおよびポリペプチドを用いて産生されることが可能である。抗原性のエピトープをもつ本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号２に含まれている、少なくとも９個の、好ましくは15から約30個までの間のアミノ酸を含む。しかしながら、30から50個のアミノ酸を含んでいる本発明のアミノ酸配列の、より大きい部分を含んでいるペプチドまたはポリペプチドか、または本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配列を含めたどの長さまでのものもまた、zacrp3と結合する抗体の誘導に有用である。
【０１８２】
エピトープをもつペプチドのアミノ酸配列は、水溶性の溶媒において実質的な可溶性を提供するべく選択されることが望ましい（すなわち、当該配列は相対的に親水性の残基を含むとともに、疎水性の残基は好ましくは避けられる）。親水性のペプチドは、当業者により疎水性プロットから予測されることが可能であり、たとえば、HoppおよびWoods（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3824 - 8、1981）およびKyteおよびDoolittle（J. Mol. Biol. 157 : 105 - 142、1982）を参照のこと。さらに、プロリン残基を含んでいるアミノ酸配列も、抗体産生にとって望ましくてよい。
【０１８３】
組換えzacrp3タンパク質に対しての、あるいは天然の供給源から単離されたzacrp3に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製されることが可能である。たとえば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Immunochemical Protocols（免疫化学的プロトコール）（Manson編）、1 - 5頁（ヒュマナ（Humana）・プレス 1992）、およびWilliamsら、「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of secific polyclonal antibodies（プラスミドベクターを用いた大腸菌における外来性タンパク質の発現）」DNA Cloning （DNAクローニング）2 : Expression Systems（発現系）、第２版、Gloverら（共編）、15頁（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス1995）参照のこと。
【０１８４】
zacrp3ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）か、完全または不完全フロイントアジュバントなどの、アジュバントの使用を通して増大されることが可能である。免疫化にとって有用なポリペプチドも、zacrp3またはその一部分と、免疫グロブリンポリペプチドかまたはマルトース結合タンパク質との融合物などの、融合ポリペプチドを含む。ポリペプチド免疫原は完全長の分子か、またはその一部であってよい。もしポリペプチド部分が「ハプテン様」であれば、免疫化用にはかかる部分は高分子担体（キーホールリンペットヘモシニアン(KLH）、ウシ血清アルブミン(BSA）または破傷風トキソイド）などの）に対し、都合よく結合または連結されてよい。
【０１８５】
ポリクローナル抗体は、典型的にはウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギ、またはヒツジといった動物において高められるが、類人猿からも得られてよい。診断ならびに治療に有用な抗体をヒヒにおいて高めるための一般的な技術は、たとえばGoldenbergmら、国際特許公開 WO91/11465、およびLosmanら、Int. J. Cancer 46 : 310、1990に見い出されてよい。また抗体は、トランスジェニックヒツジ、ウシ、ヤギ、またはブタといったトランスジェニック動物においても高められることが可能であり、また酵母および真菌においても、哺乳類および昆虫細胞におけるように修正された形状において発現されることが可能である。
【０１８６】
別法として、モノクローナル抗zacrp3抗体が生成されてよい。特定の抗原に対する齧歯動物のモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により取得されてよい（たとえば、Kohlerら、Nature 256 : 495（1975）、Coliganら、（共編）、Current Protocols in Immunology（免疫学における現在のプロトコール）、第１巻、2.5.1 - 2.6.7頁（ジョン・ウィリー＆サンズ1991）、Picksleyら、「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli（大腸菌において発現されたタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生）」DNA Cloning （DNAクローニング）2 : Expression Systems（発現系）、第２版、Gloverら（共編）、93頁（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス1995）を参照のこと）。
【０１８７】
手短に言えば、モノクローナル抗体は、zacrp3遺伝子産物を含んで成る組成物をマウスに注射することと、血清試料を取ることにより抗体産生の存在を確かめることと、Ｂリンパ球を得るべく脾臓を取り除くことと、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生じることと、当該ハイブリドーマをクローニングすることと、抗原に対して抗体を産生する陽性クローニングを選択することと、抗原に対して抗体を産生するクローンを培養すること、および当該ハイブリドーマ培養物から抗体を単離すること、により取得されることが可能である。
【０１８８】
さらに、本発明の抗zacrp3抗体は、ヒトのモノクローナル抗体から由来してもよい。ヒトのモノクローナル抗体は、抗原の攻撃に反応して特異的なヒト抗体を産生するべく工作されているトランスジェニックマウスから取得される。この技術においては、ヒトのＨおよびＬ鎖の遺伝子座のエレメントが、内在性のH鎖およびＬ鎖の遺伝子座のターゲットされた破壊を含む胚性幹細胞に由来するマウスの系統に導入される。当該トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、当該マウスはヒト抗体を分泌するハイブリドーマを製造するべく用いられることが可能である。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、たとえば、Greenら、Nature Genet. 7 : 13、1994、Lonbergら、Nature 368 : 856、1994、およびTaylorら、Int. Immun. 6 : 579、1994、により記述されている。
【０１８９】
モノクローナル抗体は、充分に確立された種々の技術により、ハイブリドーマ培養物より単離および精製されることが可能である。かかる単離技術は、プロテインＡセファロース、 サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを用いたアフィニティクロマトグラフィーを含む（たとえば、Coligan、2.7.1 - 2.7.12頁および2.9.1 - 2.9.3頁；Bainesら、「Purification of Immunoglobulin G（IgG）（免疫グロブリンGの精製）」、Methods in Molecular Biology、第10巻、79 - 104頁（ザ・ヒュマナ・プレス社1992）参照のこと）。
【０１９０】
特別の用途のためには、抗zacrp3抗体のフラグメントを調製することが望ましい。かかる抗体フラグメントは、たとえば当該抗体のタンパク質分解性加水分解により取得されることが可能である。抗体フラグメントは、全抗体のペプシンまたはパパイン消化により、通常の方法によって取得されることが可能である。一つの例証として、抗体フラグメントはペプシンを用いた抗体の酵素的切断により産生されることができ、F(ab´)₂と表示される5Sのフラグメントを供給する。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されることが可能であり、１価の3.5Sfab´フラグメントを産生する。
【０１９１】
任意で、当該切断反応はジスルヒド結合の切断の結果として生じるSH基のための阻害基を用いて行なわれることが可能である。別法として、ペプシンを用いた酵素的切断は２つの１価のFabフラグメントと、一つのFcフラグメントとを直接産生する。これらの方法は、たとえばGoldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら、Arch Biochem. Biophys. 89 : 230、1960、Porter、Biochem. J. 73 : 119、1959、Edelmanら、Methods in Enzymology 第１巻、422頁（アカデミック・プレス1967）、およびColigan（同書）に述べられている。
【０１９２】
また、１価のＬ−Ｈ鎖フラグメントを形成するためのＨ鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝的技術などの、他の抗体切断法も、当該フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に対して結合する限り使用されてよい。
たとえば、FvフラグメントはＶ_HおよびＶ_L鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA69 : 2659、1972に述べられているように、非共有結合性である。別法として、可変鎖は分子間のジスルフィド結合により結合されるか、またはグルタールアルデヒドなどの化学薬品により架橋されることが可能である（たとえば、Sadhu、Crit. Rev. Biotech. 12 : 437、1992参照）。
【０１９３】
FvフラグメントはＶ_HおよびＶ_L鎖を含んでよく、それらはペプチドリンカーによって連結される。このような単鎖の抗原結合性タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドによって連結されている、Ｖ_HおよびＶ_LドメインをコードしているDNAを含んでいる構造遺伝子を構築することにより調製される。当該構造遺伝子は発現ベクター内に挿入され、それは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、二つのＶドメインを架橋しているリンカーペプチドをもつ一本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法は、たとえば、Whitlowら、Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2 : 97、1991により記述されており、またBirdら、Science 242 : 423、1988、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Packら、Bio/Technology 11 : 1271、1993、およびSandhu、同書、も参照のこと。
【０１９４】
一つの実例として、scFvは、リンパ球をzacrp3ペプチドに対してインヴィヴォにおいて暴露すること、およびファージまたは同様のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーを選択することにより（たとえば、固定化または標識されたzacrp3タンパク質またはペプチドの使用を通して）、取得されることが可能である。潜在性のzacrp3ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）か、または大腸菌などの細菌上にディスプレイされた、ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより取得されることが可能である。
【０１９５】
当該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成を通すというような、いくつかの方法で取得されることが可能である。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーは、リガンドまたは受容体、生体または合成高分子、あるいは、有機または無機物質といった、タンパク質またはポリヌクレオチドであることが可能な既知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーンするべく用いられることが可能である。
【０１９６】
かかるランダムペプチドディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングするための方法は、当該技術において周知であり（Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、米国特許第5,403,484号、Ladnerら、米国特許第5,571,698号、およびKeyら、Phage Display of Peptides and Proteins（ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ）（アカデミック・プレス社1996）、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは、たとえばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）、インヴィトロジェン（Invitrogen）社（カリフォルニア州、サンディエゴ）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州、ベバリー）、およびファルマシアLKBバイオテクノロジー社（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、zacrp3に結合するタンパク質を同定するべく、本文において開示されたzacrp3配列を用いてスクリーニングされることが可能である。
【０１９７】
抗体フラグメントのもう一つの形状は、一つの相補性決定領域(CDR）をコードしているペプチドである。CDRペプチド（「最小の認識単位」）は、興味の抗体のCDRをコードしている遺伝子を構築することによって取得されることが可能である。かかる遺伝子は、たとえば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するべく、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることにより調製される（たとえば、Larrickら、Methods : A Companion to Methods in Enzymology（方法：酵素学の方法への入門書）2 : 106、1991）、Courtenay-Luck、「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies（モノクローナル抗体の遺伝操作）」、Monoclonal Antibodies : Production, Engineering and Clinical Application（モノクローナル抗体：産生、工学、および臨床応用）、Riterら、（共編）、166頁（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス1995）、およびWard ら、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies（抗体の遺伝操作と発現）」、Monoclonal Antibodies : Princeples and Applications（モノクローナル抗体：原理と応用）、Birchら、（共編）、137頁（ワイリ・リス（Wiley-Liss）社）参照のこと）。
【０１９８】
別法として、抗zacrp3抗体は、「人化」モノクローナル抗体から由来してよい。人化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンＨおよびＬ可変領域からの、マウスの相補性決定領域を、ヒトの可変ドメインへ転移することによって生成される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基が、マウスの相対物のフレーム枠領域において置換される。人化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用は、マウスの定常領域の免疫原性と結び付いた潜在性の問題を取り除く。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための全般的な技術は、たとえば、Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3833、1989に述べられている。
【０１９９】
人化モノクローナル抗体を産生するための技術は、たとえば、Jonesら、Nature 321 : 522、1986、Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 : 4285、1992、Sandhu、Crit. Rev. Biotech. 12 : 437、1992、Singerら、J. Immun. 150 : 2844、1993、Sudhir（編）、Antibody Engineering Protocols（抗体工学プロトコール）（ヒュマナ・プレス社1995)、Kelley、「 Engineering Therapeutic Antibodies（治療用抗体のエンジニアリング）」、Protein Engineering : Principles and Practice（タンパク質工学：原理と実践）、Clelandら（共編）、399 - 434頁（ジョン・ウィリー＆サンズ社1996）、およびQueenらによる、米国特許第5,693,762号（1997）に記述されている。
【０２００】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗zacrp3抗体または抗体フラグメントを用いた、標準的な技術による動物の免疫化によって調製されてよい。たとえば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera（ポリクローナル抗血清の産生）」Methods In Molecular Biology : Immunochemical Protocols（分子生物学の方法：免疫化学プロトコール）、Manson（編）、1 - 12頁（ヒュマナ・プレス1992）参照のこと。また、Coligan（同書）、2.4.1 - 2.4.7頁も参照のこと。
【０２０１】
別法として、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、抗zacrp3抗体または抗体フラグメントを免疫原として用い、前文に述べた技術を用いて調製されることが可能である。もう一つの別法として、人化抗イディオタイプ抗体、または類人猿抗イディオタイプ抗体が、上記の技術を用いて調製されることが可能である。抗イディオタイプ抗体を産生する方法は、たとえば、Irieによる米国特許第5,208,146号、Greeneら、米国特許第5,637,677号、およびVarthakaviおよびMinocha、J. Gen. Virol. 77 : 1875、1996により記述されている。
【０２０２】
潜在性のzacrp3ポリペプチド結合ドメイン、「結合ドメイン」を有するポリペプチドをコードしている遺伝子は、ファージ上（ファージディスプレイ）か、または大腸菌などの細菌上にディスプレイされたランダムまたは定方向ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって取得されることが可能である。当該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発、およびランダムポリペプチド合成といった、いくつかの方法において取得されることが可能である。別法として、連結式の（constrained）ファージディスプレイライブラリーも製造されることが可能である。
【０２０３】
このようなペプチドディスプレイライブラリーは、リガンドまたは受容体、生体または合成高分子、あるいは、有機または無機物質といった、タンパク質またはポリヌクレオチドであることが可能な既知の標的と相互作用するペプチドについてスクリーンするべく用いられることが可能である。かかるペプチドディスプレイライブラリーを作成およびスクリーニングするための技術は、当該技術において周知である（Ladnerら、米国特許第5,223,409号、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、米国特許第5,403,484号、Ladnerら、米国特許第5,571,698号）、またペプチドディスプレイライブラリーおよびかかるライブラリーをスクリーニングするためのキットは、たとえばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）、インヴィトロジェン（Invitrogen）社（カリフォルニア州、サンディエゴ）、ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）社（マサチューセッツ州、ベバリー）、およびファルマシアLKBバイオテクノロジー社（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）から市販されている。
【０２０４】
ペプチドディスプレイライブラリーは、zacrp3に結合するタンパク質を同定するべく、本文において開示されたzacrp3配列を用いてスクリーニングされることが可能である。zacrp3ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合タンパク質」は、本質的には抗体と同様に用いられることが可能である。
【０２０５】
zacrp3タンパク質またはペプチドに対して特異的に結合する抗体および／または結合タンパク質を検出するべく、当業者には周知の種々の検定が利用されることが可能である。代表的な検定は、Antibodies : A Laboratory Manual、Harlow およびLane（共編）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1988に述べられている。かかるアッセイの代表的な実例は：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、エライサ（ELISA）、ドットブロット法、ウェスタンブロット分析法、阻害または競合部分析法、およびサンドウィッチ分析法を含む。さらに、抗体は野性型対突然変異型のzacrp3タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、スクリーンされることが可能である。
【０２０６】
zacrp3に対する抗体および結合タンパク質は、zacrp3を発現する細胞をターゲティングするため；親和精製によりzacrp3を単離するため；zacrp3ポリペプチドの循環レベルを測定するための診断用の分析のため；基礎病理または疾患のマーカーとして、可溶性のzacrp3を検出または定量するため；FACSを用いた分析法において；発現ライブラリーのスクリーニングのため；抗イディオタイプ抗体の生成のため；および精子形成または、インヴィトロおよびインヴィヴォでの同様な活性についてについての、zacrp3ポリペプチドの修飾を阻止するための中和抗体またはアンタゴニストとして使用されてよい。
【０２０７】
適当な直接タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光標識、化学発光標識、磁気粒子、およびその他を含み；間接タグまたは標識は、ビオチン−アビジンまたは中間体としての他の補体／抗補体の利用法を特色としてよい。さらに、zacrp3またはそのフラグメントに対する抗体は、インヴィトロにおいて、変性したzacrp3またはそのフラグメントを検出するべく、検定、たとえばウェスタンブロットか、または当該技術において周知の他の検定において使用されてよい。
【０２０８】
また本文の抗体またはポリペプチドは、薬剤、毒素、放射性核種、その他に対し、直接または間接的に結合されることも可能であり、このような結合体はインヴィヴォにおける診断または治療用の適用に用いられる。たとえば、本発明のポリペプチドまたは抗体は、対応する抗相補性分子（たとえば、各々受容体または抗原）を発現する組織または器官を、同定または治療するべく用いられることが可能である。さらに具体的には、zacrp3ポリペプチドまたは抗zacrp3抗体か、それらの生物活性フラグメントまたは部分は、検出可能なまたは細胞毒性分子に対して結合され、抗相補性分子を発現する細胞、組織、または器官を有する哺乳類に対して送達されることが可能である。
【０２０９】
本発明のさらなる観点は、前文に開示されたzacrp3ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法を提供しており、当該アゴニストまたはアンタゴニストは、本文においてさらに議論される有用性の高い特性を有してよい。一つの態様においては、zacrp3ポリペプチドアゴニストに対して反応性の細胞を提供することと、当該細胞を検査化合物の存在下に培養して、細胞の反応をzacrp3ポリペプチドの存在下に培養された細胞と比較すること、および、それに対する細胞の反応が同じタイプのものである検査化合物を選択することを含む、zacrp3ポリペプチドアゴニストの同定法が提供される。
【０２１０】
もう一つの態様においては、zacrp3ポリペプチドに対して反応性の細胞を提供することと、当該細胞の第１の部分をzacrp3の存在下に培養することと、当該細胞の第２の部分をzacrp3および検査化合物の存在下に培養すること、および細胞の第１の部分に比較して、第２の部分の細胞の細胞性反応の減少を検出することを含む、zacrp3ポリペプチドのアゴニストの同定法が提供される。試料は、本文において開示された検定に加えて、zacrp3活性の阻害について、受容体結合かまたはzacrp3依存性の細胞反応についての刺激／阻害を測定するべく設計された検定法の、多様性の範囲内で検査されることが可能である。
【０２１１】
たとえば、zacrp3反応性の細胞系は、zacrp3刺激性細胞経路に対して反応性のリポーター遺伝子構築物を用いてトランスフェクトされることが可能である。このタイプのリポーター遺伝子構築物は当該技術において周知であり、一般的に、ルシフェラーゼなどの検定可能なタンパク質をコードしている遺伝子に対して操作可能に結合されたzacrp3−DNA反応エレメントを含むであろう。DNA反応エレメントは、サイクリックAMP反応エレエレメント(CRE）、ホルモン反応エレメント(HRE）、インスリン反応エレメント(IRE）（Nasrinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5273 - 7、1990）、および血清反応エレメント（SRE）（Shawら、Cell 56 : 563 - 72、1989）を含むことが可能であるが、これに制限されない。
【０２１２】
サイクリックAMP反応エレエレメントは、Roestlerら、J. Biol. Chem. 263（13）: 9063 - 6、1988およびHabener、Molec. Endocrinol. 4（8）: 1087 - 94、1990において総説されている。ホルモン反応エレメントは、Beato、Cell 56 : 335 - 44 ; 1989に総説されている。候補化合物、溶液、混合物、または抽出物は、リポーター遺伝子の発現についてのzacrp3による刺激の減少によって立証されるような、標的細胞に対するzacrp3の活性を阻害する能力について検査される。このタイプの検定は、細胞表面の受容体に対するzacrp3の結合を直接阻止する化合物、ならびに受容体−リガンド結合に続く細胞経路における過程を阻止する化合物を検出するであろう。
【０２１３】
別法として、化合物または他の試料は、検出可能な標識（たとえば、¹²⁵Ｉ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、FITC、その他）をタグづけされたzacrp3を用いて、受容体に対するzacrp3の結合についての直接的な阻止について検査されることが可能である。この検定の範囲内では、検査試料の、受容体に対する標識されたzacrp3の結合を阻害する能力は阻害性の活性を暗示するものであって、それは２次検査を通して確認されることが可能である。結合検定において使用される受容体は、細胞の受容体か、または単離され、固定された受容体であってもよい。
【０２１４】
脂肪細胞の補体に関連した他のタンパク質に対する相同性に基づき、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニスト、またはアンタゴニストは、哺乳類におけるエネルギー均衡を調整するべく、あるいは損傷から内皮細胞を保護するべく、使用されることが可能である。ネルギー均衡の調整に関しては、zacrp3ポリペプチドは細胞の代謝反応を調整する。かかる代謝反応は、脂肪生成、グルコース生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコースの取り込み、タンパク質合成、熱発生、酸素利用、その他を含む。
【０２１５】
またzacrp3ポリペプチドは、交感神経または副交感神経系と結び付いた組織におけるポリペプチドの発現によって示されるような、神経伝達物質としてまたは神経伝達のモジュレーターとしての用途も見い出してよい。この点については、zacrp3ポリペプチドは、たとえば脳その他における２−デオキシ−グルコースの取り込みによって説明されるような、栄養素の取り込みの調節における効用を見い出してもよい。
【０２１６】
当該技術において周知であるか、または本文において開示された他の方法の中で、哺乳類のエネルギー平衡は、以下の一つまたはそれより多い代謝機能を監視することによって評価されてよい：脂肪生成、グルコース生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコースの取り込み、タンパク質合成、熱発生、酸素利用、またはその他。これらの代謝機能は、以下にさらに充分に説明されているように、当該技術分野の普通の技術の者が周知の技術（検定または動物モデル）によって監視される。たとえば、インスリンのグルコース調節効果は、主として肝臓、骨格筋、および脂肪組織内に及ぼされる。
【０２１７】
インスリンはこれらの３つの組織においてその細胞受容体に結合して、たとえば、結果としてグルコース産生の阻害とグルコース利用の刺激とを生じる組織特異的な活動を開始する。肝臓においては、インスリンはグルコースの取り込みを刺激し、かつグルコース生成およびグリコーゲン生成を阻害する。骨格筋および脂肪組織においては、インスリンはグルコースの取り込み、貯蔵、および利用を刺激するべく作用する。前文において列挙された代謝機能のすべてを監視するための、技術の認められた方法が存在する。したがって、当該技術分野の普通の技術の者は、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト、およびアンタゴニストを、代謝調節機能について評価することができる。代表的な調節技術は以下に説明されている。
【０２１８】
脂肪生成、糖新生およびグリコーゲン分解は哺乳動物エネルギー収支の相互に関係のある構成部分であり、それは、たとえば、ob/obマウスまたはdb/dbマウスを使っている既知技術よって評価することができる。ob/obマウスは、ob（肥満）遺伝子座の不活性化突然変異に関してホモ接合である近交系マウスである。そのようなob/obマウスは、摂食亢進性で、かつ低代謝性であり、循環するOBタンパク質の生成を欠いていると思われる。
【０２１９】
dB/dBマウスは、db（糖尿）遺伝子座の不活性化突然変異に関してホモ接合である近交系マウスである。db/dbマウスは、db/dbマウスが糖尿病性の表現型をも示すことを除いて、ob/obマウスに似た表現型を示す。そのようなdb/dbマウスは、循環するOBタンパク質の作用に抵抗すると信じられている。また、これらのパラメータを評価する種々の試験管内の方法は、本技術において知られている。
【０２２０】
たとえば、インシュリン促進脂質生合成は、トリグリセライドへの¹⁴Ｃ-酢酸塩の導入（Mackallら、J.Biol.Chem. 251：6462〜4、1976年）またはトリグリセライド蓄積（Kletzienら、Mol.Pharmacol. 41:393〜8、1992年）を測定することよってモニターすることができる。
【０２２１】
グルコースの取込みは、たとえば、インシュリン促進グルコース輸送のための分析法で評価することができる。トランスフェクションしていない、分化したL6筋管（G418の不在のまま保持された）を、１ｇ／ｌグルコース、0.5または1.0％ BSA、20mM Hepesおよび２mMグルタミンを含むDMEMに入れる。培養の２〜５時間後、培地を、0.5または1.0％のBSA、20mM Hepes、１mM ピルビン酸塩および２mM グルタミンを含む新鮮なグルコースフリーのDMEMと置換する。適切な濃度のインシュリンまたはIGF-1、または試験物質の希釈シリーズを添加し、20〜30分間細胞をインキュベートする。³Ｈまたは¹⁴Ｃ標識デオキシグルコースを、＝50 1 Ｍ 最終濃度まで添加し、細胞を約10〜30分間インキュベートする。
【０２２２】
その後、細胞を冷たい緩衝液（例えばPBS）ですばやくすすぎ、ついで適当な溶解剤（たとえば、１％ SDS または 1N-NaOH）で溶解させる。ついで、シンチレーションカウンターで細胞溶解物の計数を出す。細胞に関連した放射活性は、サイトカラシンｂ（グルコース輸送のインヒビター）の存在下で細胞をインキュベートすることよって測定される非特異性結合を減じた後にグルコース輸送の尺度として受け取られる。他の方法には、たとえば、Manchesterら（Am.J.Physiol.266（Endocrinol.Metab.29）：E326〜E333、1994年（インシュリン促進グルコース輸送））によって記述されている方法が含まれる。
【０２２３】
タンパク質合成は、たとえば、³⁵Ｓ−メチオニンを入れた試験細胞および、³⁵Ｓ−メチオニンとタンパク質合成の推定モジュレーターとを入れた試験細胞のインキュベーションの後に、³⁵Ｓ−メチオニン標識タンパク質の沈降を比較することによって評価することができる。
【０２２４】
熱発生は、“The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides”（W.ColmersおよびC.Wahlestedt編集、Humana Press、オタワ、1993年 ）457〜509頁におけるB.Stanley；C.Billingtonら（Am.J.Physiol.260:R321、1991年）；N.Zarjevskiら（Endocrinology:1753、1993年）；C.Billingtonら（Am.J.Physiol.266:R1765、1994年）；Hellerら（Am.J.Physiol. 252（4 パート2）：R661〜7、1987年）；およびHellerら（Am.J.Physiol. 245:R32l〜8、1983年）によって記述されているようにして、評価することができる。また、代謝速度（いろいろな技術よって測定することができる）は、熱発生の間接的な測定である。
【０２２５】
酸素利用能は、Hellerら（Pflugers Arch、369：55〜9（1977年））によって述べられるように評価することができる。この方法にも、視床下部温度および代謝熱生成の分析が含まれた。酸素利用能および体温調節は、Haskellら（J.Appl.Physiol. 51：948〜54（1981年））によって記述されているように、ヒトにおいても評価された。
【０２２６】
神経刺激伝達機能は、脳における２−デオキシグルコース取込みをモニターすることよって評価することができる。このパラメータは、本技術において通常の技能を持つ人に知られている技術（動物モデルのアッセイ）、たとえば、オートラジオグラフィーによってモニターされる。有用なモニタリング技術は、たとえば、Kilduffら（J.Neurosci.10:2463〜75、1990年）によって記述されていて、関連技術は、Gerberら、Circulation 94:651〜8、1996年およびFallavollitaら、Circulation 95：1900〜9、1997年に記載された「冬眠している心臓」を評価するのに用いられた。
【０２２７】
さらに、zacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合アゴニストまたはそのアンタゴニストは、抗菌用として治療上有用であることができる。たとえば、補体成分C1qは、バクテリアおよびウイルスのような感染因子に対する宿主防御において役割を果たす。C1qは、特殊化したいくつかの機能を示すと知られている。たとえば、C1qは、結合性抗体またはＣ反応性タンパク質（CRP）との相互作用を通して補体カスケードを誘発する。
【０２２８】
また、C1qは、特定のバクテリア、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌内毒素のリピドＡ成分および特定の細胞内小器官のメンブレンと直接的に相互反応する。C1qリセプターに結合しているC1qは、ファゴサイトーシスを促進すると考えられる。C1qは、また宿主防御システムの抗体形成面を強化するようである。たとえば、Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.2（11）：933〜41（1993年）、参照。このように、可溶なC1q様分子は、感染因子の細胞溶解または食菌作用を促進する抗菌剤として有用であろう。
【０２２９】
zacrp3 ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体と同様にZacrp3 フラグメントは、本技術において知られている手順にしたがって、それらの抗菌性状に関して評価することができる。たとえば、Barsumら、Eur.Respir.J.8(5)：709〜14（1995年）；Sandovsky-Losicaら、J.Med.Vet.Mycol.（英国）28(4)：279〜87（1990年）；Mehenteeら、J.Gen.Microbiol.（英国）135（パート８）：2181〜8（1989年）；SegalおよびSavage、J.Med.Vet.Mycol.24:477〜9（l986年）および類似文献、参照。
【０２３０】
必要ならば、この点に関してのzacrp3のパフォーマンスは、プロリンの豊富なタンパク質、リソチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼまたは類似物のような、この点に関しては機能的であると知られているタンパク質と比較することができる。さらに、zacrp3 フラグメント、ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体は、相乗効果を確認するために一つ以上の抗菌剤と組合せて評価することができる。本技術における通常の技能の人は、zacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストおよび抗体の抗菌性状が同様に評価されうることを認めるであろう。
【０２３１】
神経伝達物質または神経刺激伝達モジュレーターとして、zacrp3 ポリペプチド、融合タンパク、アゴニスト、アンタゴニストまたは抗体と同様に、本発明のzacrp3 ポリペプチドフラグメントもまた、カルシウムイオン濃度、筋収縮、ホルモン分泌、DNA合成（または細胞成長）、イノシトールリン酸ターンオーバー、アラキドン酸塩放出、ホスホリパーゼＣ活性化、胃内容排出、ヒト好中性の活性化（またはADCC能力）、スーパーオキシドアニオン生産および類似のことを調節することができる。これらの性状の評価は、ここで述べられる方法などの、既知の方法よって行うことができる。
【０２３２】
細胞内のカルシウム濃度に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45;341〜52、1993年）などによって記述される方法のような 、本技術において知られている方法よって評価することができる。筋収縮に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、SmitsおよびLebebvre（J.Auton.Pharmacol. 14：383〜92、1994年）、Belioliら（J.Vet.Pharmacol.Therap. 17：379〜83、1994年）、Maggiら（Regulatory Peptides 53：259〜74、1994年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３３】
ホルモン分泌に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Henriksenら（J.Recep.Sig.Transd.Res.15（1〜4）：529〜41、1995年）などによって記述されているプロラクチン放出のための方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。DNA合成または細胞成長に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Petides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３４】
イノシトールリン酸ターンオーバーに対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45：341〜52、1953年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３５】
また、アラキドン酸塩放出に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することできる。ホスホリパーゼＣ活性化に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Dobrzanskiら（Regulatory Peptides 45:341〜52、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３６】
胃内容排出に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Vargaら（Eur.J.Pharmacol. 286:109〜112、1995年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。ヒト好中球活性化およびADCC能力に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Wozniakら（Immunology 78:629〜34、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。スーパーオキシドアニオン生成に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Wozniakら（Immunology 78:629〜34、1993年）などによって記述されている方法のような、本技術において知られている方法よって評価することができる。
【０２３７】
コラーゲンは、血小板凝集の有力な誘起剤である。これは、血管の傷から回復しつつある患者に危険を引き起こす。コラーゲン起因性血小板凝集のインヒビターは、コラーゲン被覆の表面への血小板の結合をブロックすることおよび関連するコラーゲン起因性血小板凝集を減らすことのために有用である。C1qは、補体経路の構成分であって、組織損傷を引き起こす有毒な酸素種の生成を誘発するとともに、防御機構を刺激することが判明した（Tenner、BehringInst.Mitt.93:241〜53、1993年）。C1q結合部位は、血小板の上にある。
【０２３８】
免疫結合パートナーから独立しているC1qは、血小板附着または形態変化を阻害しないで、血小板凝集を阻害することが判明した。C1qのアミノ末端領域は、コラーゲンと相同性を共有している（PeerschkeおよびGhebrehiwet、J.Immunol.145:2984〜88、1990年）。C1qおよび補体経路の阻害は、SubaおよびCsako、J.Imnunol. 117：304〜9（1976年）において記載されているような、ここに開示されているまたは本技術において知られている方法を使用することによって測定することができる。
【０２３９】
コラーゲンによって媒介される血小板の附着、活性化および凝集に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、血小板凝集アッセイ（Chiangら、Thrombosis Res.37:605〜12、1985年）および血小板附着アッセイ（PeerschkeおよびGhebrehiwet、J.Immunol.144;221〜25、1990年）のような、ここに開示されているまたは本技術において知られている方法を使用することによって評価することができる。コラーゲンへの血小板附着のためのアッセイおよびコラーゲン誘発血小板凝集の阻害は、Kellerら、J.Biol.Chem.268:5450〜6、1993年；WaxmanおよびConnolly、J.Biol.Chem.268:5445〜9、1993年；Noeske-Jungblutら、J.Biol.Chem.269:5050〜3、1994年またはDeckmynら、Blood 85:712〜9、1995年に記載されている方法を用いて測定することができる。
【０２４０】
大動脈輪の血管拡張に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの影響は、Daintyら（J.Pharmacol.100:767、1990年）およびRheeら（Neurotox.l6:179、1995年）の方法にしたがって測定することができる。
【０２４１】
虚血および再潅流損傷に対するzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストの影響を評価することのために、種々の試験管内および生体内モデルが利用できる。たとえば、Shandelyaら、Circulation 88:2812〜26、1993年；Weismanら、Science 249:146〜151、1991年；Buerkeら、Circulation 91;393〜402、1995年；Horstickら、Circulation 95:70l〜8、1997年、およびBurkeら、J.Phar.Exp.Therp.286:429〜38、1998年、参照。生体外のハムスター血小板凝集アッセイは、Deckmynら（同上）よって記述されている。ハムスターおよびヒヒの出血時間は、Deckmynら（同上）よって記述されているモデルを用いて、zacrp3 ポリペプチドの注射の後に、測定することができる。
【０２４２】
本発明のタンパク質の投与に応じての血栓の発生は、Deckmynら（同上）によって提供されるハムスター大腿静脈血栓症モデルを用いて測ることができる。zacrp3の投与に続く流動条件下の血小板附着の変化は、Harsfalviら、Blood 85:705〜11、1995年に記載されている方法を用いて測定することができる。
補体阻害および創傷治癒は、zacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストであることができ、単独でまたはコラーゲン誘発血小板活性化および凝集の他の既知インヒビター（たとえば、palldipin、moubatinまたはcalin）と組合せて分析され。
【０２４３】
Zacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、たとえば、ブタの真皮層の治癒（Lynchら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7696〜700、1987年）および遺伝的に糖尿病をもつマウスのフルシックネス皮膚創傷（Greenhalghら、Am.J.Pathol.136:1235〜46、1990年）において記述される方法のような、ここに記載したまたは本技術において知られている方法を用いることによって、評価することができる。本発明のポリペプチドは、単独でまたは、上に記載したような他の既知の補体阻害剤との組合せにおいて分析することができる。
【０２４４】
放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物クロモソームの高解像度の連続マップを作成することのために開発された体細胞遺伝学的技術である（Coxら、Science 250:245〜50、1990年）。遺伝子の配列についての部分的な、または完全な知識は、染色体の放射線ハイブリッドマッピングパネルを用いた用途に適したPCRプライマーの設計を可能にする。Stanford G3 RhパネルおよびGeneBridge 4RNパネル（Research Genetics,Inc．アラバマ州ハンツヴィル）のような、全てのヒトゲノムをカバーする市販の放射線ハイブリッドマッピングパネルが利用できる。
【０２４５】
これらのパネルは、関心領域の範囲における、遺伝子、配列標識部位（STSs）ならびに非多型および多型マーカーの急速な、PCRをベースとした、染色体上の位置確認および配列を可能にする。これは、新しく発見された関心の遺伝子および以前にマップされたマーカーの間に正比例した物理的距離を確立することを含む。遺伝子の位置についての正確な知識は、以下のことを含めて、多くの方面で有用である：１） 配列が既存のコンティグの部分であるかどうかを決定し、YAC-、SAC-またはcDNAクローンのような種々の形態における、更なる周囲の遺伝子配列を得ること、２）同じ染色体の範囲へのリンケージを示す遺伝性病気のための可能な候補遺伝子を提供すること、そして、３）特定の遺伝子がどんな機能を持ちうるかを決定することを助ける点において有益でありうるマウスのような、モデル生物を相互参照することのために。
【０２４６】
結果は、LODスコア 15.58をもち、かつ、マーカーから０ cR＿10000離れたところに、ヒト５番染色体のフレームワークマーカーSHGC-56588へのZacrp3のリンケージを示した。周辺のマーカーの使用は、総LDBヒト５番染色体の地図上の5p12領域にZacrp3を位置付ける。本発明は、また、診断用途に利用される 試薬を提供する。たとえば、zacrp3遺伝子、zacrp3のDNAまたはRNAを含んでいるプローブ、またはそのサブシーケンスは、zacrp3遺伝子が５番染色体の上に存在するかどうか、あるいは、突然変異が起こったかどうか、を決定するのに使用することができる。
【０２４７】
zacrp3遺伝子座の検出可能な染色体異常には、これらに限定されないが、異数性、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限サイト変化および再配列が含まれる。これらの異常は、上流プロモーターおよび制御領域を含む、暗号配列の範囲内で、イントロンの範囲内で、あるいは、隣接配列の範囲内で、起こることができるし、暗号配列内の物理的な変化または遺伝子の現量における変化としての範囲内で表われうる。
【０２４８】
一般に、これらの診断方法は、次のステップから成る：（ａ）患者から遺伝の試料を得ること；（ｂ）最初の反応生成物を生成させるために、ポリヌクレオチドが相補性のポリヌクレオチド配列に融合するような条件下で上記のようなポリヌクレオチドプローブまたはプライマーと遺伝子試料をインキュベートすること；および（iii）最初の反応生成物を対照反応生成物と比較すること。最初の反応生成物および対照生成物の間の相違は、患者における遺伝子異常を示唆する。本発明の範囲内での利用のための遺伝子試料は、ゲノムDNA、cDNAおよびRNAを含む。
【０２４９】
ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、RNAまたはDNAであることができるし、配列番号：１の一部、配列番号：１の補体またはそのRNA相当物から成る。この点に関する適当な分析方法には、本技術の中の人々に知られている分子の遺伝学的技術、たとえば、制限断片長多型性（RFLP）分析、PCR技術を用いる短時間縦列反復(STR）分析、ライゲーション連鎖反応（Barany、PCR Methods and Applications 1:5〜16、1991年）、リボヌクレアーゼ保護分析法、および、本技術において知られている他の遺伝子結合解析技術（Sambrookら、同上；Ausubelら、同上;Marian、Chest 108:255〜65、1995年）が含まれる。
【０２５０】
リボヌクレアーゼ保護分析法（たとえば、Ausubelら、同上、第４章）は、患者のRNA試料へのRNAプローブのハイブリダイゼーションから成り、その後、反応生成物（RNA-RNAハイブリッド）はRNアーゼにさらされる。リボゾームリボ核酸のハイブリッド形成領域は、消化作用から保護されている。PCR分析法の範囲内で、患者の遺伝子試料は一対のポリヌクレオチドプライマーとともにインキュベートされ、プライマー間の領域は増幅され、回復される。回復された生成物の大きさまたは量の変化は、患者における突然変異を示唆する。使用することができるPCRをベースとしたもう一つの技術は、一本鎖配座多型（SSCP）分析（Hayashi、PCR Methods and Applications 1:34〜8、1991年）である。
【０２５１】
Zacrp3 ポリペプチドは、哺乳動物のエネルギー効率の分析に使うことができる。血清または組織試料で見つけられるZacrp3 ポリペプチドは、食物を貯蔵する哺乳動物の能力を示しており、より高い能力を持つ哺乳動物ほど 肥満症への傾向がある。さらに特定すれば、本発明は、
前記抗体がzacrp3 ポリペプチドのエピトープに結合している固体担体に付着した抗体に、おそらくzacrp3ポリペプチドを含んでいる試料をさらすこと；
【０２５２】
結合していない不純物を除去するために、前記の固定した抗体-ポリペプチドを洗浄すること；
第二抗体が検出可能な標識と関係している、zacrp3 ポリペプチドの第二エピトープに向けられた第二抗体に、固定された抗体ポリペプチドをさらすこと；および、
検出可能な標識を検出すること、を含むzacrp3 ポリペプチドを検出する方法を意図する。検査試料中のzacrp3 ポリペプチドの濃度は、哺乳動物のエネルギー効率を示すと思われる。
【０２５３】
この知見は、哺乳動物の栄養分析を助けることができる。場合によっては、この知見は、エネルギー不十分な組織を確認することおよび／または目標とすることにおいて有用でありうる。
【０２５４】
本発明の更なる一面は、インシュリンを研究する方法を提供する。本発明のそのような方法は、zacrp3 ポリペプチド、単クローン抗体、アゴニストまたはそのアンタゴニスト±インシュリンを含んでいる培地で、脂肪細胞をインキュベートすること、および、脂肪細胞タンパク質の分泌または分化における変化を観察すること、から成る。
【０２５５】
抗菌保護剤は、直接的にも働くことができるが、間接的にも働くことができる。メンブレン関連または作用の細孔形成性メカニズムを通して働くそのような薬剤は、迷惑を及ぼす微生物に直接付着する。抗菌剤はまた、酵素のメカニズムを通して働き、微生物の保護物質またはそれらの細胞壁／メンブレを破壊する。微生物増殖または作用を抑制すること、あるいは、上で述べたどちらかの機構によって微生物全体を崩壊させる抗菌剤は、抗菌作用に影響されやすい微生物による細胞培養の汚染を防ぐための方法において有用である。そのような技術は、効果的な量の前記zacrp3 ポリペプチド、またはアゴニストかそのアンタゴニストの存在下で細胞を培養することを含む。
【０２５６】
また、zacrp3 ポリペプチドまたはそのアゴニストが、細菌性、ウイルス性または菌類の感染のような外因性微生物感染の試験管内実験での細胞培養試薬として使用しうる。そのような部分は、感染の生体内動物モデルでも使用することができる。
本発明は、哺乳動物細胞の新陳代謝を研究する方法をも提供する。本発明のそのような方法は、研究すべき細胞、たとえば、 ヒト血管内皮細胞、±zacrp3 ポリペプチド、モノクローナル抗体、アゴニストまたはそのアンタゴニスト、をインキュベートすること、および脂肪生成、糖新生、グリコーゲン分解、脂質生合成、グルコース取込み、またはその類似のことの変化を観察することから成る。
【０２５７】
本発明の更なる一面は、二量体化またはオリゴマー化を研究する方法を提供する。本発明のそのような方法は、単独またはコラーゲン様ドメインをもつ他のポリペプチドとの組合せにおいてコラーゲン様ドメインを含む、zacrp3 ポリペプチドまたはフラグメントまたはその融合タンパク質をインキュベートすること、およびコラーゲン様ドメイン間で作られる会合を観察することから成る。そのような会合は、HPLC、円二色性などによって示される。
【０２５８】
本発明のZacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、付着し、活性化する 血小板の数および血小板会合物の大きさを減らすことによって、哺乳動物の脈管系内での血流を促進する方法において使用することができる。そのような目的に使われて、Zacrp3は、哺乳動物の急性血管損傷の、前、間、または、後に投与することができる。血管損傷は、これらに限定されないが、血管移植の血管形成術、冠状動脈バイパス移植、微小血管の回復または吻合を含む血管の再構成のせいでありうる。
【０２５９】
外傷、発作または動脈瘤のための血管損傷も、考慮される。他の好ましい方法では、血管損傷は、プラーク破裂、脈管系の劣化、糖尿と関連する合併症およびアテローム性動脈硬化による。冠状動脈でのプラーク破裂は、心臓麻痺を誘発して、大脳動脈でのそれは卒中を誘発する。そのような方法におけるzacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの使用は、播種性血管内凝固(DIC）およびSIDのような、免疫システムと関連する脈管系の全システム疾病を改善するためにも有用である。その上、活性を抑制する補体は、細動脈硬化症のような非脈管系免疫病を治療するために有用である。
【０２６０】
限局性虚血心筋中のC1qの存在と冠状動脈閉塞症および再潅流に続く白血球の蓄積の間には、相関が見出された。組織損傷に続く細胞の構成分の放出は、心筋障害の主要原因でありうる毒性酸素生成物を結果する補体活性化を誘発する（Rossenら、Circ.Res.62:572〜84、1998年およびTenner、同上）。補体経路をブロックすることが再潅流損傷から虚血心筋を保護することが判明した（Buerkeら、J.Pharm.Exp.Therp.286:429〜38、1998年）。補体阻害およびC1q結合活性を持っているタンパク質は、そのような目的のために有用であろう。
【０２６１】
zacrp3のような脂肪細胞補体関連タンパク質同族体の、コラーゲンおよびC1qの結合能力は、血小板の附着、活性化または凝集、ならびに毒性酸素生成物の放出に導く炎症性プロセスの活性化を抑える損傷を受けた膠原組織をいやすために有用である。補体活性、血栓症の活性および免疫活性化のようなプロセスに対して、露出した組織を不活性にすることによって、虚血および再潅流の有害な影響が減少する。特に、そのような外傷には、トラウマ性外傷虚血、腸絞扼および血流量のプリおよびポスト確立に関連する外傷が含まれる。そのようなポリペプチドは、偶発的または外科手術誘発性の血管傷害とともに、卒中または経皮経管血管形成術のような、心肺バイパスの虚血およびrecesitation、心筋梗塞ならびにポストトラウマ血管痙攣の治療において有用である。
【０２６２】
その上、そのようなコラーゲン結合およびC1q結合ポリペプチドは、補体活性化、血栓形成活性または免疫活性化に対して材料の表面を不活性にするために、補綴生体材料および外科装置を和らげるために有用である。そのような材料には、これらに限定されないが、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメント被覆生体材料、ゼラチン被覆生体材料、フィブリン被覆生体材料、フィブロネクチン被覆生体材料、ヘパリン被覆生体材料、コラーゲンおよびゲル被覆ステント、動脈の移植、合成心臓弁、人工臓器または、１×10⁸より大きい割合でzsig37を結合する血液にさらされる、あらゆる補綴物用品が含まれる。そのような材料を被覆することは、本技術において知られている方法を使用してなされうる。たとえば、Rubens、米国特許第5,272、074号、参照。
【０２６３】
補体およびC1qは、炎症において役割を果たす。補体活性化は、免疫グロブリンへのC1qの結合によって始められる（Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.12:933〜41、1993年；WardおよびGhetie、Therap.Immunol.2:77〜94、1995年）。C1qおよび補体のインヒビターは、抗炎症薬として有用である。そのような適用は、感染を防ぐためになされうる。その上、そのようなインヒビターは、補体活性化およびC1qへの免疫複合体の結合によって媒介された炎症に苦しんでいる人に投与することとができる。C1qおよび補体のインヒビターは、傷の修復をもたらす方法において有用であり、損なわれた創傷治癒を克服することによって創傷治癒における進行を促進する。創傷治癒の進行には、たとえば、炎症、繊維芽細胞加入、創傷退縮および感染の減少ような要素が含まれる。
【０２６４】
コラーゲンに結合する腫瘍細胞の能力は、腫瘍の転移の一因となりうる。コラーゲン結合のインヒビターは、腫瘍の接着相互作用および転移による広がりをもたらすために有用である（Noeske-Jungbultら、米国特許第5,723,312号）。
【０２６５】
さらに、zacrp3ポリペプチド、フラグメント、融合アゴニストまたはそのアンタゴニストは、抗菌的適用に対して治療上有用であることができる。たとえば、補体成分C1qは、バクテリアおよびウイルスのような感染因子に対する宿主防御において役割を果たす。C1qは、特殊化したいくつかの機能を示すと知られている。たとえば、C1qは、結合性抗体またはＣ反応性タンパク質(CRP）との相互作用を通して補体カスケードを誘発する。また、C1qは、特定のバクテリア、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌内毒素のリピドＡ構成部分および特定の細胞内小器官のメンブレンと直接的に相互作用する。C1qリセプターに結合しているC1qは、食菌作用を促進すると思われる。C1qは、宿主防御システムの抗体形成面を強化するようでもある。 たとえば、Johnston、Pediatr.Infect.Dis.J.12(ll)：933〜4l、1993年を参照。このように、可溶なC1q様分子は、抗菌因子として有用でありえて、感染因子の細胞溶解または食菌作用を促進する。
【０２６６】
プラスの電荷を帯びた、 細胞外の、ヘリックス、C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容器のコラーゲンドメインは、配位子結合において役割を演じていることが確定し、ポリアニオンに対する広い結合特異性を持っていることが示された（Actonら、J.Biol.Chem.268:3530〜37、1993年）。リゾリン脂質成育因子（リゾホスファチジン酸、LPA）および他の分裂促進のアニオンは、損害を受けた組織の部位に局所化し、傷の修復を助ける。LPAは、血小板の活性化およびマトリックス会合体の増加機構を含む多くの生体影響を発揮する。LPAは、他の血液凝固因子と相乗作用を示し、創傷治癒を媒介すると考えられる。
【０２６７】
C1qおよびマクロファージスカベンジャー受容器のようなタンパク質のコラーゲンドメインは、LPAのような酸性リン脂質を結合すると知られている。zacrp3 ポリペプチド、フラグメント、融合、アゴニストまたはアンタゴニストの、LPAのような分裂促進のアニオンとの相互作用は、本技術において知られている分析法（たとえば、Actonら、同上、参照）を用いて測定することができる。本発明のポリペプチドおよび抗体による炎症性プロセスの阻害は、創傷部位で感染を防ぐことにおいても有用である 。
【０２６８】
医薬品利用については、本発明のタンパク質は、非経口的、経口的、鼻からの、直腸への、局所的、経皮的投与などのために、調剤上許容できる基剤とともに処方することができる 。好ましい具体例では、投与は血管損傷のサイトで、あるいは、その近くでなされる。一般に、医薬品製剤は、調剤上許容できる賦形剤（例えば塩類溶液、緩衝食塩水、デキストロースの５％水溶液または類似物）と組合せて、zacrp3タンパク質を含有する。製剤は、さらに、１種以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上へのタンパク質の損失を防ぐアルブミン、などを含むことができる。
【０２６９】
製剤の方法は、本技術でよく知られており、たとえば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Gennaro編、Mack Publishing Co．ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995年に開示されている。治療の用量は、一般に、認められた基準にしたがって、治療されるべき容態の性質および重篤度、患者体質、その他を考慮に入れて、臨床医によって決定されるであろう。用量の決定は、本技術の通常の技能レベル内にある。
【０２７０】
ここで使われるように、zsig37 ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの「調剤上の効果的な量」は、望まれる生物学的な結果を誘導するのに十分な量である。結果は、病気の症候、症状または原因の緩和であり、あるいは、生物学的システムのなんらかの望ましい変化である。たとえば、zacrp3 ポリペプチドの効果的量は、臨床医または他の資格のある立会人よって気づかれるような、症状の自覚的な軽減、あるいは客観的に確認可能な改良を提供する量である。zacrp3 ポリペプチドのそのような効果的量は、たとえば、C1qを含む、コラーゲンで活性化された血小板の活性化および補体経路の阻害、患者の血管内の局所的な血流量の増加および／または、虚血および再潅流の有害な影響の減少をもたらす。
【０２７１】
zacrp3ポリペプチドの効果的量は、治療すべき病気または症状に従い大きく異なってよい。投与されるポリペプチドの量および製剤でのその濃度は、選ばれた賦形剤、投与の経路、特定のポリペプチドの効力、患者の臨床状態、副作用および製剤中の化合物の安定度に依存する。このように、臨床医は、当該の患者との、または類似した患者との臨床的経験に依存して、投与される製剤の量とともに製剤中の適切な濃度を含む適切な製剤を使用する。
【０２７２】
そのような量は、ある程度、治療されるべき特定の容態、年齢、体重および患者の全般的な健康、ならびに本技術に熟練した人には明白な他の因子に依存する。一般的に、用量は、患者の0.01〜100mg/kgの範囲にある。バルーンカテーテルのような適用法では、典型的用量範囲は、患者の0.05〜5mg/kgである。特定の化合物のための用量は、実験動物の研究と組合せた試験管内または生体外の研究から決定される。試験管内で、または生体外で効果的であると判明した化合物の濃度は、動物実験のためのガイダンスを提供し、そこでは、用量は、作用点において同程度の濃度を提供するように計算される。
【０２７３】
zacrp3 ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、zacrp3活性を増やすか、抑制するのが望まれる、遺伝子治療適用の範囲内で有用である。哺乳動物が突然変異したか欠失したzacrp3遺伝子を持つ場合、zacrp3遺伝子を、哺乳動物の細胞に導入することができる。１つの具体例では、zacrp3ポリペプチドをコードしている遺伝子は、生体内でウイルスベクターに入れて導入される。そのようなベクターには、たとえば、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルス（HSV））パピローマウイルス、Epstein Barrウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、などのような弱毒化または欠損DNAウイルスが含まれる。
【０２７４】
完全に、あるいは、ほとんど完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞への導入の後、伝染力がない。欠損ウイルスのベクターの利用は、ベクターが他の細胞を感染させうるという懸念なしで、特定の、限られた領域の細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例には、これらに限定されないが、欠損単純疱疹ウイルス１（HSV1）ベクター（Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.2:320〜30、1991年）；Stratford-Perricaudetら（J.Clin.Invest.90:626〜30、1992年）によって記述されたベクターのような、弱毒化アデノウイルスベクター；および、欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Samulskiら、J.Virol.61:3096〜101、1987年；Samulskiら、J.Virol.63:3822〜8、1989年）が含まれる。
【０２７５】
もう一つの具体例では、zacrp3遺伝子は、たとえば、Andersonら（米国特許第5,399,346号；Mannら、Cell 33:153、1983年；Teminら、米国特許第4,650,764号；Teminら、米国特許第4,980,289号；Markowitzら、J.Virol.62:l120、1988年；Teminら、米国特許第5,124,263号；WIPO公表WO 95/07358；および、Kuoら、Blood 82:845、1993年、に記載されているような、レトロウイルスのベクターに導入されうる。
【０２７６】
あるいは、ベクターは、リポソームを使用する生体内リポフェクションよって導入することができる。合成陽イオン脂質を、マーカーをコードしている遺伝子の生体内トランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いることができる（Feignerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413〜7、1987年；Mackeyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027〜31、1988年）。外部性遺伝子を生体内の特定の器官に導入するためのリポフェクションの利用は、いくつかの実際的な利点を持つ。
【０２７７】
特定細胞へのリポソームの分子ターゲッティングは、利点の１つの領域を表す。より詳しくは、特定細胞にトランスフェクションを向けることは、利点の１つの領域を表す。たとえば、特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、特に、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような、細胞の異質性をもつ組織において有利である。脂質は、ターゲッティングの目的のために、化学的に他の分子に結びつけることができる。目標とされたペプチド（たとえば、ホルモンまたは神経伝達物質）、抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結びつけることができる。
【０２７８】
身体から標的細胞を除去すること、ベクターを裸のDNAプラスミドに導入すること、ついで、変換された細胞を身体に再インプラントすることが可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、本技術において知られている方法、たとえば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の利用またはDNAベクター輸送体の利用によって、望ましい宿主細胞に導入することができる。たとえば、Wuら、J.Biol.Chem.267:963〜7、1992年；Wuら、J.Biol.Chem.263:l4621〜4、1988年、参照。
【０２７９】
アンチセンスの手法は、生体内の細胞増殖を抑制するためのような、zacrp3遺伝子転写を抑制するのに用いることができる。zacrp3をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、配列番号：１に述べられているポリヌクレオチド）のセグメントに補足的である ポリヌクレオチドは、zacrp3をコードしているｍRNAに結合し、そのようなｍRNAの翻訳を抑制するように設計されている。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養あるいは患者におけるzacrp3ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を抑制するのに用いられる。
【０２８０】
zacrp3遺伝子を発現するために設計されたトランスジェニックのマウス、および、「ノックアウトマウス」（Snouwaertら、Science 257:l083、1992年）と呼ばれる、zacrp3遺伝子機能の完全な欠如を示すマウスも生成させることができる（Lowellら、Nature 366:740〜42、l993年）。これらのマウスは、zacrp3遺伝子および生体内のシステムでそれによってコードしたタンパク質の研究に使用することができる。
【０２８１】
本発明を、以下の非制限的な例によってさらに説明する。
例１．Zacrp3 の染色体の帰属および配置
Zacrp3は、スタンフォードG3放射線ハイブリッドマッピングパネル（Research Genetics,Inc. アラバマ州ハンツヴィル）の市販の版を用いることにより、ヒト５番染色体にマップされた。スタンフォードG3 RHパネルは、全ヒトゲノムの83個の放射線ハイブリッドクローンの各々からのPCR可能なDNA、プラス２個のコントロールDNA（RMドナーおよびA3レシピエント）を含む。公的に利用できるWWWサーバー（http://shgc-www. stanford.edu）は、マーカーの染色体の位置確認を許可している。
【０２８２】
スタンフォードG3 RHパネルによるzacrp3のマッピングについては、20μｌの反応液を、96ウェルのミクロタイタープレート（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）中に入れ、RoboCycler Gradient96の温熱サイクラー（Stratagene）中で使用した。85個のPCR反応液の各々は、２μｌの10X KlenTaq PCR反応緩衝液（Clontech Laboratories,Inc.カリフォルニア州パロアルト）、1.6μｌのdNTPミックス（それぞれ2.5mM、PERKIN-ELMER、カリフォルニア州フォスターシティー）、１μｌのセンスプライマー、ZC 21,913（配列番号：13）、１μ１のアンチセンスプライマー、ZC 21,914（配列番号：14）、２μｌの RediLoad（Research Genetics,Inc.）、0.4μｌ 50X Advantage KlenTaq DNAポリメラーゼミックス（Clontech Laboratories,Inc.）、25ngの個々のハイブリッドクローンまたは対照品由来のDNA、および総体積20μｌにするためのddH₂Oから構成された。
【０２８３】
反応液は、等量の鉱油で覆い、封じた。PCRサイクラー条件は、次の通りであった：94℃での初期１サイクル５分間の変性、94℃での45秒の変性の35サイクル、62℃での45秒のアニーリングおよび72℃での１分15秒間の延長、さらに72℃で７分間の最終１回の延長。反応液は、２％のアガロースゲル（Life Technologies、メリーランド州ゲイタースバーグ）上での電気泳動によって分離した。
【０２８４】
結果は、15.58のLODスコアおよびマーカーからの０ cR＿10000の距離にヒト５番染色体フレームワークマーカーSHGC-56588へのZacrp3のリンケージを示した。周辺マーカーの利用によって、LDBヒト５番染色体の総合マップ（The Genetic Location Database、Southhamptonの大学、WWWサーバー：http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/）の上の5p12領域にZacrp3の位置が定まる 。
【０２８５】
例２．Zacrp3 のバキュロウイルス発現
昆虫細胞で、カルボキシ末端のGlu-Glu標識を持っているヒトzacrp3ポリペプチドを発現する発現ベクターpzacrp3ceeを調製した。
Ａ． pzacrp3cee の構築
zacrp3（配列番号：１）の配列および、５’および３’末端にそれぞれ、BamHIおよびXba1制限サイトをコードしているポリヌクレオチド配列を含む766bpフラグメントは、プライマーZC23377（配列番号：15）を使ってzacrp3 cDNAを含むプラスミドからのPCR増幅によって生成した。
【０２８６】
PCR反応条件は、次の通りであった：94℃、４分間の１サイクル、続いて、94℃、45秒間、50℃45秒間、および72℃２分間の25サイクル；72℃10分間の１サイクル、続いて、４℃浸漬。フラグメントは、ゲル電気泳動（１％ Seaplaque／１％ NuSieve）によって視覚化した。バンドを切り取り、２mMのMgCl₂の入った0.5％アガロースに希釈し、65℃で溶かし、BamHI/Xba1で消化されたバキュロウイルス発現ドナーベクター（pZBV32L）に連結した。pZBV32Lベクターは、pFastBacl^TM（Life Technologies）発現ベクターの変種である。
【０２８７】
ここで、多面体促進因子が削除されて、後の活性化塩基性タンパク質促進因子と置換され、そして、終止シグナルと同様にGlu-Glu標識（配列番号：17）のための暗号配列が多重クローン領域の３’末端に挿入される。制限酵素で消化させたzacrp3挿入物約11ナノグラムおよび対応するベクター約23ngを16℃で一夜連結させた。ライゲーションミックスをTE（10mMのトリス-HC1、pH 7.5および1mMのEDTA）中で３倍に希釈し、希釈したライゲーションミックスの４fmolを、メーカーの指示にしたがい、42℃の水槽中での45秒間のヒートショックでDH5αライブラリー効率コンピテント細胞（Life Technologies）に変換した。
【０２８８】
変換したDNAおよび細胞を、SOC培地（２％のBacto Tryptone、0.5％のBacto酵母エキス、10 ml 1M NaC1、1.5mM KC1、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、および20mM グルコース）450μｌ中に希釈し、100μｇ／mlのアンピシリンを含むLBプレートの上で平板培養した。クローンは制限酵素消化物によって分析し、ポジティブクローンの１μｌを、メーカーの指示に従い、42℃の水槽中、45秒間のヒートショックによって20μｌのDH10Bac最大効率コンピテント細胞（GIBC0-BRL、メリーランド州ゲイタースバーグ）に変換した。
【０２８９】
それから、変換された細胞は、SOC培地（２％ Bacto Tryptone、0.5％ Bacto酵母エキス、1M NaCl 10ml、1.5mM KC1、10mM MgCl₂、10 mM MgSO₄、および20mM グルコース）980μｌ中で希釈し、37℃、４時間振とうインキュベーター中で増殖させ、50μｇ／mlのカナマイシン、７μｇ／mlのゲンタミシン、10μｇ／mlのテトラサイクリン、IPTGおよびBluo Galを含むルリア寒天平板上で平板培養した。平板培養した細胞は、37℃で48時間培養した。プラスミド（「bacmid」と呼ぶ）に組み込まれたドナー挿入物をコードしているzacrp3ceeを持っている細胞を確認するのにカラー選抜を用いた。
【０２９０】
それらのコロニー（白色であった）を、分析のために選んだ。Bacmid DNAを、メーカーの指示にしたがい、QiaVac Miniprep8システム（Qiagen）を使用してポジティブコロニーから分離した。プライマーZC447（配列番号：18）およびZC976（配列番号：19）を使用するPCRによるbacmid中の転移性因子へのプライマーを使用することによってDNAを増殖させて、正しい挿入物のためにクローンをスクリーニングした。PCR反応の条件は、次の通りであった：94℃45秒間、50℃45秒間および72℃５分間の35サイクル、72℃10分間の１サイクル、続いて、４℃での浸漬。PCR生成物は、挿入サイズをチェックするために１％のアガロースゲルの上で走らせた。スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Sf9）細胞をトランスフェクションさせるのに正しい挿入物を持つ生成物が用いられた。
【０２９１】
Ｂ. トランスフェクション
Sf9細胞を、35mmのプレートにつき５×10⁶個の細胞の割合で播種し、27℃で１時間付着するに任せた。５マイクロリットルのbacmid DNAを、Sf-900 II SFM（Life Technologies）100μｌで希釈した。６μｌのCellFECTIN試薬（Life Technologies）は、SF-900 II SFM 100μｌで希釈した。bacmid DNAおよび脂質溶液を穏やかに混ぜて、室温で30〜45分間培養した。細胞の１プレートからの培地を吸引し、細胞を新しいSF-900II SFM培地の２mlで１回洗浄した。脂質-DNA混合液にSF-900のII SFMの800マイクロリットルを加えた。洗浄液培地を吸引し、DNA-脂質ミックスを細胞に添加した。細胞は、27℃で４〜５時間培養した。DNA-脂質ミックスを吸引し、Sf-900 II培地の２mlを各プレートに加えた。プレートは、27℃、90％の湿度で96時間培養し、その後、ウイルスを採取した。
【０２９２】
Ｃ. 一次増幅
Sf9細胞は、125mlのシェークフラスコ中Sf-900 II SFM 50ml中で、おおよそ0.41〜0.52×10⁵細胞／mlの密度まで増殖させた。ついで、それらに、上記のウイルス原液150μｌを感染させて、27℃で３日間インキュベートし、その後、本技術において知られている標準的な方法にしたがってウイルスを採取した。
【０２９３】
例３．バキュロウイルス発現 Glu-Glu 付き zacro3 ポリペプチドの精製
特に明記しない限り、全ての操作は、４℃で行った。プロテアーゼインヒビターの混合液を、Ｃ末端にGlu-Glu（EE）を付けたzacrp3バキュロウイルス感染Sf9細胞からの調整培地の２リットルの試料に加え、2.5mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA、Sigma Chemical Co．ミズーリ州セントルイス）、0.001mM ロイペプチン（Boehringer-Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）、0.001mM ペプスタチン（Boehringer-Mannheim）および0.4 mM Pefabloc（Boehringer-Mannheim）という最終濃度にした。
【０２９４】
試料は、細胞断片を除去するために、Beckman Avanti J251遠心機（Beckman Instruments）のBeckmanのJLA-10.5ローター（Beckman Instruments)に入れて、４℃で30分間、10,000rpmで遠心分離した。下記のように調製されたanti-EEセファロースの50.0ml試料を、上清画分に加え、混合液はWheaton（ニュージャージー州Millville）のローラー培養装置の上で、４℃で18.0時間穏やかに振とうした。
【０２９５】
混合液を、5.0×20.0cmのEcono-Column（Bio-Rad Laboratories）へ注ぎ、ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の30カラム体積で洗った。留まらなかった通過画分は、捨てた。溶出液の280nmの吸光度が0.05未満になると、カラムを通過する流れはゼロになり、アンチEEセファロースゲルを、0.2mg/mlのEEペプチド（AnaSpec、カリフォルニア州サンホゼ）を含んでいるPBSの2.0カラム体積で洗った。使ったペプチドは、配列Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp（配列番号：20）を持つ。４℃での1.0時間後、流れが再開され、溶出したタンパク質を集めた。この画分を、ペプチド溶出液と名付けた。アンチEEセファロースゲルは、0.1Ｍ グリシン（pH2.5）の2.0カラム体積で洗い、グリシン洗浄液は別に集めた。
【０２９６】
10X PBSの少量の添加によってグリシン溶出画分のpHを7.0に調整して、４℃で保存した。ペプチド溶出液は、メーカーの指示にしたがって、分子量5,000でカットオフする膜濃縮装置（Millipore）を用いることにより、5.0 mlに濃縮した。濃縮されたペプチド溶出液は、BioCad Sprint HPLC（PerSeptive BioSystems）を使用して、1.0ml/mmの流量でPBS中で 平衡化した1.5×50cmのSephadex G-50（Pharmacia）カラム上でクロマトグラフィーによってフリーのペプチドから分離した。２ml画分を集め、280nmの吸光度をモニターした。280nmで吸収し、カラムの空隙体積の近くで溶出する材料の最初のピークを集めた。この材料は、精製されたzacrp3CEEに相当し、明瞭な分子量の２本の主要なバンドからなっていた。
【０２９７】
アンチ EE セファロースの調製
タンパク質G-Sepharose（Pharmacia）の100mlベッド体積を、500mlのナルゲン（Nalgene）0.45ミクロン濾過装置を用いて、0.02％アジ化ナトリウムを含むPBSの100mlで洗った。ゲルは、200mMのトリエタノールアミン、pH8.2（TEA、Sigma）の6.0倍量で洗い、900mgの抗体を含んでいるEE抗体溶液の等量を添加した。４℃での一夜のインキュベーションの後、結合していない抗体は、先に述べたように、200mMのTEAの５倍量で洗うことによって除去した。
【０２９８】
樹脂は、２倍量のTEA中に再懸濁し、適当な容器へ移し、そして、dimethylpimilimidate-2 HCl(Pierce）をTEAに溶かして、最終濃度36mg/mlのゲルに加えた。ゲルは、室温で45分間ゆすり、先に述べたようにろ過装置を使って液体を除去した 。ゲルの非特異性部位は、200mM TEA中20mMエタノールアミンの５倍量で、室温で10分間インキュベートすることによってブロックした。ついで、ゲルは、0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBSの５倍量で洗い、４℃でこの溶液中に保存した。
【０２９９】
例４．接着分子アッセイ
TNF（腫瘍壊死因子）のような炎症性サイトカインによる刺激で、ヒト微小血管の骨髄細胞（TRBMEC）は、Ｅ−セレクチン（内皮の白血球接着分子）、V-CAM（血管の細胞接着分子）およびI-CAM（細胞間接着分子）を含む、細胞表面接着分子を発現する。
【０３００】
細胞表面接着分子の発現へのzacrp3の効果は、Ouchiら（Circulation 100:2473〜7、1999年）にしたがった、細胞に基づくELISAで、微小血管の骨髄細胞（TRBMEC）を用いて決定した。手短に言うと、TRBMEC細胞を、96ウェルの平底プレート（Costar、カリフォルニア州Pleasanton）中で、融合するまで増殖させた。野生型コントロール培地およびバキュロウイルス発現したzacrp3培地は、テスト（Centricon Centrifugal Filtrationユニット 5,000Kカットオフ、Millipore Corp．マサチューセッツ州ベッドフォード）の前に、メーカーの指示にしたがって10倍に濃縮した。
【０３０１】
各ウェルに、90μｌのzacrp3含有培地またはコントロール培地を添加し、そのプレートを、37℃、５％ CO₂で一夜インキュベートした。翌日、試料の半分に、TNFa（10ng/ml、R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）の10μｌを入れ、基本的形質発現を測定する、他の試料は未処置のままであった。ついで、プレートを、37℃、５％のCO₂で４時間インキュベートした。
【０３０２】
インキュベーションの後、培地は、プレートから除去し、50μｌアンチヒトVCAM抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌ、アンチヒトICAM-1モノクローナル抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌ、またはアンチヒトＥ−セレクチン抗体（原液１mg/mlの１：1000希釈、R&D Systems）50μｌを、３個のウェルに添加し、ついで該プレートを37℃、５％CO₂で１時間インキュベートした。
【０３０３】
抗体溶液を除去し、該プレートを、温RPMI＋５％FB中で３回洗浄した。最後の洗浄液に続いて、0.05％のグルタールアルデヒド溶液（PBS中で50％グルタールアルデヒドの１：1000）100μ１／ウェルを添加し、該プレートを、室温で10分間インキュベートした。プレートは、PBSで３回洗浄し、二次抗体（ヤギαマウスIgG全分子HRP複合体、Sigma Chemical Co．ミズーリ州セントルイス）の50μｌ／ウェルを全ウェルに添加した。プレートは、37℃で１時間インキュベートした。
【０３０４】
ついで、プレートを、洗浄緩衝液（PBS＋0.05％Tween 20）で５回洗い、TMB溶液（60mM 酢酸ナトリウム（pH5.0）10mlおよび1.2％ H₂O₂ 100μｌ中に、テトラメチルベンジジン（Sigma）4mg/mlを含むDMSO溶液100μｌ）100μｌ／ウェルを各ウェルに添加した。プレートは、室温で15〜20分間発展するに任せ、その時点で、1MH₂S0₄100μｌ／ウェルを添加することによって、反応を止めた。プレートは、655nmを対照波長として、450nmで読んだ。
【０３０５】
Zacrp3は、ICAM-1発現の上に影響を示さなかった。Zacrp3は、VCAM-l発現の上には影響を示した。最大のTNF反応と比較して、zacrp3で処理した細胞は、約50％の阻害を示した。Zacrp3も、より少ないけれども、影響、Ｅ−セレクチン発現の10％の阻害を示した。
VCAM-1発現は、TRBMEC細胞の直接的アデノウイルス感染症に続いて測定された。手短に言えば、TRBMEC細胞は、アデノウイルス含有zacrp3または親からのアデノウイルス株で直接感染した。ウイルスは、種々の感染多重度（moi 500、1,000および5,000）で添加された。細胞を、37℃、５％のCO2で43時間インキュベートした。感染に続いて、アデノウイルス感染細胞は、TNFαｘ（１ng/ml）による４時間の攻撃を受けた。VCAM発現は、先に述べたようにして測定した。VCAM-1発現の阻害は、moi5000で約13％、moi1000での約５％であり、moi500では、影響は認められなかった。
【０３０６】
アデノウイルスで条件づけた培地は、メーカーの指示にしたがって10倍に濃縮し（Centricon遠心分離機濾過装置5,000 Kのカットオフ、Millipore Corp．マサチューセッツ州ベッドフォード）、その後、56℃で30分の熱失活を行った。濃縮された熱失活試料は、先に述べたように分析した。VCAM-lおよびＥ−セレクチンについては、阻害は100％であった。IL-lまたはLPSが接着分子発現を誘発するために用いられたとき、類似した結果が認められた。ICAM-1については、阻害はほとんどベースラインまで減少した。実験は、zacrp3熱失活したアデノウイルスで条件づけた培地の種々の濃度で繰り返した。５倍濃縮で完全な阻害、2.5倍で50％の阻害が見られ、0.5倍では阻害は認められなかった。
Ouchiら（同上）ならびにCybulskyおよびGimbrone（Science 251:788〜91、1991年）によるTHP-l単核細胞接着分析法は、上のVCAM-1に関して認められたと同じ結果を示した。
【図面の簡単な説明】
図は本発明のzacrp3ポリペプチドと、ヒトACRP30（ACR3）（配列番号３；Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286-9, 1996)と、ヒトC1qC（配列番号４；Seller et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991）とを並列に配列して示す。並列配列は既定値設定のクラスタルクス（Clustalx）並列配列ツールを用いて実施した：ブロッサム・シリーズ重量マトリックス、ギャップ・オープニングペナルティ：10.0、ギャップ・エクステンションペナルティ：0.05。
【配列表】

[0001]
(Technical field)
Energy balance (including energy metabolism, nutritional status, lipid storage, etc.) is an important criterion for health. This energy homeostasis requires food intake and carbohydrate and lipid metabolism to produce the energy necessary for voluntary and involuntary functions. Protein metabolism can produce energy, but preferably leads to muscle formation or repair. In other results, the lack of energy homeostasis leads to adipocyte over- or under-formation.
[0002]
Lipid formation and storage is controlled by insulin. For example, insulin facilitates the transport of glucose into the cell, where it is metabolized to α-glycerophosphate and used for esterification of fatty acids to allow its storage as triglycerides. In addition, adipocytes express certain transport proteins that increase the transport of free fatty acids into the adipocytes.
[0003]
Adipocytes also secrete several proteins believed to be involved in the constant control of glucose and lipid metabolism. These additional adipocyte secreted proteins include adipsin, complement factors C3 and B, tumor necrosis factor α, ob gene product and Acrp30. Evidence also suggests the existence of an insulin-regulated secretory pathway in adipocytes. Scherer et al., J. Biol. Chem. 270 (45): 26746-9, 1995. Excess or undersecretion of these parts, partially impacted by excess or under formation of adipocyte tissue, leads to pathologies directly or indirectly associated with obesity or anorexia.
[0004]
Acrp30 is a 247 amino acid polypeptide expressed exclusively by adipocytes. Acrp30 polypeptides are composed of an amino-terminal signal sequence, a 27-amino acid chain of unknown homology, 22 complete Gly-Xaa-Pro or incomplete Gly-Xaa-Xaa collagen repeats, and a carboxy-terminal globular domain. See: Scherer et al., Above, and International Patent Application No. WO96 / 39429. The ubiquitous human serum protein Acrp30 regulated by insulin has structural similarity in its carboxy-terminal globular domain, particularly to the complement factor C1q and the hibernating Siberian chipmunk summer serum protein (Hib27). Acrp30 expression is induced more than 100 times during adipocyte differentiation. Acrp30 is suggested for use in adjusting energy balance and in identifying adipocytes in test samples.
[0005]
Another protein that appears to be produced exclusively in adipocytes is apM1, as described, for example, in Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-9 (1996). The 4517 bp clone had a 244 amino acid open reading frame and a long 3 'untranslated region. The protein comprises a signal sequence, an amino-terminal non-collagenous sequence, 22 collagen repeats (Gly-Xaa-Pro or Gly-Xaa-Xaa), and a carboxy-terminal region with homology to collagen X, collagen VIII and complement proteins C1q was included.
[0006]
Complement factor C1q consists of six copies of three related polypeptides (A, B and C chains), each polypeptide being approximately 225 amino acids long with a proximal amino-terminal collagen domain and a carboxy-terminal globular region. is there. The six triple helix regions are formed by the collagen domains of the six A, six B and six C chains and form six stalks with the central region. The globular head is formed by the association of the A, B and C chain globular carboxy-terminal domains. C1q is therefore composed of six spherical heads joined to the central fibril region via six collagen-like stalks. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991. This configuration is often called a bouquet. Acrp30 has a similar bouquet structure formed from a single type of polypeptide chain.
[0007]
C1q has been shown to stimulate defense mechanisms and to induce the generation of toxic oxygen species that can cause tissue damage (Tenner, Behring Inst. Mitt. 93: 241-53, 1993). A C1q binding site is found on platelets. In addition, complement and C1q play a role in inflammation. Complement activation is initiated by the binding of C1q to the immunoglobulin.
C1q and complement pathway inhibitors would be useful for anti-inflammatory applications, complement activation and thrombotic activity inhibition.
The present invention provides such polypeptides that can be used for these uses and other uses that will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
[0008]
(Disclosure of the Invention)
In one aspect, the invention provides an isolated polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence is at least 75% identical to residues 51-246 of SEQ ID NO: 2, wherein the sequence comprises: collagen domain An isolated comprising a carboxyl-terminal C1q domain comprising a Gly-Xaa-Xaa or Gly-Xaa-Pro repeat (where Xaa is any amino acid) and 10 beta chains to form A polypeptide is provided. In one embodiment, the amino acid sequence of the polypeptide is at least 90% identical to residues 23-246 of SEQ ID NO: 2.
[0009]
In other embodiments, the collagen domain consists of 15 Gly-Xaa-Xaa repeats and 6 Gly-Xaa-Pro repeats. In another embodiment, the carboxyl terminal C1q domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10. In other embodiments, the carboxyl terminal C1q domain is amino acid residues 119-123, 140-142, 148-151, 155-158, 161-173, 175-182, 190-197, 200-212 of SEQ ID NO: 2, 217-222 and 236-241. In other embodiments, the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. In another embodiment, the polypeptide specifically binds to an antibody that specifically binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0010]
In yet other embodiments, the polypeptide comprises residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the collagen domain consists of amino acid residues 51-113 of SEQ ID NO: 2. In yet other embodiments, the C1q domain consists of amino acid residues 114 to 246 of SEQ ID NO: 2. In other embodiments, the polypeptide is covalently linked at the amino or carboxyl terminus to a moiety selected from the group consisting of an affinity label, a toxin, a radionucleotide, an enzyme, and a fluorophore.
[0011]
Further provided is an isolated polypeptide comprising:
a) Gly-Xaa-Xaa and Gly-, which are polypeptides comprising an amino acid residue sequence that matches at least 80% of amino acid residues 51 to 113 of SEQ ID NO: 2, and forms a collagen domain A polypeptide comprising a repeat of Xaa-Pro;
[0012]
b) a polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence is at least 80% identical to amino acid residue 114 to amino acid residue 246 of SEQ ID NO: 2, comprising the sequence of SEQ ID NO: 5;
c) Gly-Xaa-Xaa and Gly-, which are polypeptides comprising an amino acid residue sequence that matches at least 80% of amino acid residue 51 to amino acid residue 246 of SEQ ID NO: 2, and forms a collagen domain. A polypeptide comprising a repeat of Xaa-Pro, comprising the sequence of SEQ ID NO: 5;
An isolated polypeptide selected from the group consisting of:
[0013]
In another aspect, a fusion protein comprising a first portion and a second portion joined by peptide bonds, wherein the first portion is
a) a polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence is at least 75% identical to amino acid residues 51 to 246 of SEQ ID NO: 2;
b) a polypeptide comprising the amino acid residue sequence shown in SEQ ID NO: 2 from amino acid residue 1 to amino acid residue 246;
c) a portion of the zacrp3 polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising a collagen-like domain or a portion of a collagen-like domain that can be dimerized or oligomerized;
d) a C1q domain or a portion of a zacrp3 polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising an active portion of a C1q domain; or
[0014]
e) a fusion protein comprising a polypeptide selected from the group consisting of a zacrp3 polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising a collagen-like domain and a C1q domain, wherein the second part comprises another polypeptide Is provided.
[0015]
In one aspect, the first portion is
a) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residue 51 to amino acid residue 113 of SEQ ID NO: 2;
b) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residue 114 to amino acid residue 246 of SEQ ID NO: 2;
c) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residues 51 to 246 of SEQ ID NO: 2;
Selected from the group consisting of
The present invention also provides the above polypeptides combined with a pharmaceutically acceptable vehicle.
[0016]
In another aspect, the present invention provides an antibody or antibody fragment that specifically binds to the polypeptide described above. In one embodiment, the antibody is
a) a polyclonal antibody;
b) mouse monoclonal antibody;
c) a humanized antibody derived from b) above; and d) a human monoclonal antibody. In other embodiments, the antibody fragment is selected from the group consisting of F (ab ′), F (ab), Fab ′, Fab, Fv, scFv, and minimal recognition units. In another aspect, provided are anti-idiotype antibodies that specifically bind to the antibody.
[0017]
In another aspect, the invention is an isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence is at least 75% identical to residues 51-246 of SEQ ID NO: 2, Gly-Xaa-Xaa or Gly-Xaa-Pro repeats where the sequence forms a collagen domain (where Xaa is any amino acid); and a carboxyl terminal C1q domain comprising 10 beta chains; An isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising it is provided.
[0018]
In one embodiment, the amino acid sequence of the polypeptide is at least 90% identical to residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. In other embodiments, the collagen domain consists of 15 Gly-Xaa-Xaa repeats and 6 Gly-Xaa-Pro repeats. In other embodiments, the carboxyl-terminal C1q domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 5. In other embodiments, the carboxyl terminal C1q domain is amino acid residues 119-123, 140-142, 148-151, 155-158, 161-173, 175-182, 190-197, 200-212 of SEQ ID NO: 2, 217-222 and 236-241.
[0019]
In other embodiments, the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. In yet another embodiment, the polypeptide specifically binds to an antibody that specifically binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In other embodiments, the polypeptide comprises residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the collagen domain consists of amino acid residues 51-113 of SEQ ID NO: 2. In yet another embodiment, the carboxyl terminal C1q domain consists of amino acid sequence 114-246 of SEQ ID NO: 2.
[0020]
Further provided is an isolated polynucleotide comprising:
a) the nucleotide sequence of nucleotide 1 to nucleotide 1696 of SEQ ID NO: 1;
b) the nucleotide sequence of nucleotide 69 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1;
c) the nucleotide sequence from nucleotide 135 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1;
d) the nucleotide sequence of nucleotide 219 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1;
[0021]
e) the nucleotide sequence of nucleotide 408 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1;
f) the nucleotide sequence from nucleotide 69 to nucleotide 407 of SEQ ID NO: 1;
g) a nucleotide sequence of nucleotide 135 to nucleotide 407 of SEQ ID NO: 1;
h) the nucleotide sequence of nucleotide 219 to nucleotide 407 of SEQ ID NO: 1;
[0022]
i) a polynucleotide encoding a polypeptide, the polypeptide comprising a sequence of amino acid residues that is at least 75% identical to a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues 51 to 113 of SEQ ID NO: 2;
j) a polynucleotide encoding a polypeptide comprising a sequence of amino acid residues that matches at least 75% of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of residues 114 to 246 of SEQ ID NO: 2;
k) a polynucleotide encoding a polypeptide, the polypeptide comprising a sequence of amino acid residues that is at least 75% identical to a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues 51 to 246 of SEQ ID NO: 2;
[0023]
1) a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of a sequence of amino acid residues that is at least 75% identical to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of residues 23 to 113 of SEQ ID NO: 2;
m) a polynucleotide which remains hybridized to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the complement of SEQ ID NO: 1 after stringent wash conditions;
n) a nucleotide sequence complementary to a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k), l) or m) above; and
o) An isolated polynucleotide selected from the group consisting of the degenerate nucleotide sequences of i), j), k) or l) above.
[0024]
Further provided is an isolated polynucleotide encoding a fusion protein comprising a first portion and a second portion joined by peptide bonds, wherein the first portion is
a) a polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence is at least 75% identical to amino acid residues 51 to 246 of SEQ ID NO: 2;
b) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residues 1 to 246 of SEQ ID NO: 2;
c) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residues 23 to 246 of SEQ ID NO: 2;
d) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residues 23 to 113 of SEQ ID NO: 2;
[0025]
e) a polypeptide comprising the sequence of amino acid residues 1-113 of SEQ ID NO: 2;
f) a portion of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising a collagen-like domain or a portion of a collagen-like domain that can be dimerized or oligomerized;
g) a portion of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising the C1q domain; or
h) a portion of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 comprising a collagen-like domain and a C1q domain; and
An isolated polynucleotide that encodes a fusion protein in which the second portion comprises another polypeptide.
[0026]
Further provided is an isolated polynucleotide consisting of the sequence of nucleotide 1 to nucleotide 738 of SEQ ID NO: 10.
In another aspect, the present invention provides an expression vector comprising the following operably linked elements: a transcription promoter; a DNA segment encoding the above polypeptide; and a transcription terminator. In one embodiment, the DNA segment encodes a polypeptide that matches at least 90% amino acid sequence with residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. In other embodiments, the collagen domain consists of 15 Gly-Xaa-Xaa repeats and 6 Gly-Xaa-Pro repeats. In another embodiment, the carboxyl terminal C1q domain comprises the sequence of SEQ ID NO: 10.
[0027]
In other embodiments, the carboxyl terminal C1q domain comprises amino acid residues 119-123, 140-142, 148-151, 155-158, 161-173, 175-182, 190-197, 200-212 of SEQ ID NO: 2, 217-222 and 236-241. In other embodiments, the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. In yet another embodiment, the polypeptide specifically binds to an antibody that specifically binds to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0028]
In yet other embodiments, the DNA segment encodes a polypeptide comprising residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the collagen domain consists of amino acid residues 51 to 113 of SEQ ID NO: 2. In yet other embodiments, the C1q domain consists of amino acid residues 114 to 246 of SEQ ID NO: 2. In yet other embodiments, the DNA segment encodes a polypeptide covalently linked to the affinity tag at the amino or carboxyl terminus. In other embodiments, the DNA segment further encodes a secretory signal sequence operably linked to the polypeptide. In a related embodiment, the secretory signal sequence comprises residues 1-22 of SEQ ID NO: 2.
[0029]
In another aspect, the present invention provides a cultured cell into which the above expression vector has been introduced, which expresses the polypeptide encoded by the DNA segment.
In another aspect, the present invention comprises culturing a cell into which the above expression vector has been introduced, whereby the cell expresses the polypeptide encoded by the DNA segment, and then recovers the expression polypeptide. A method for producing a polypeptide comprising:
(Best Mode for Carrying Out the Invention)
Before describing the present invention in detail, it will be helpful in understanding them to define the following terms:
As used herein, the term “affinity tag” is attached to a polypeptide for purification or detection of the polypeptide or provides a site at which the polypeptide is conjugated to a substrate. Means peptide segment. In principle, peptides or proteins that can utilize antibodies or other specific binding reagents can be used as affinity labels.
[0030]
Affinity labels include polyhistidine, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathione S transferase (Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988), Substance P, Flag peptide (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988; available from Eastman Kodak, New Haven, Connecticut) ), Streptavidin binding peptides, or other antigenic epitopes or binding domains. General reference: Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. DNAs encoding affinity tags can be obtained from commercial suppliers (eg, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
[0031]
The term “allelic variant” means two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic variation occurs naturally through mutation, resulting in phenotypic polymorphism within the population. The genetic mutation may be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode a polypeptide having an altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to mean a protein encoded by an allelic variant of a gene.
[0032]
The terms “amino terminus” and “carboxyl terminus” are used herein to indicate positions on polypeptides and proteins. Where the context allows, these terms are used to refer to specific sequences or portions of a polypeptide or protein to indicate proximity or related positions. For example, a sequence located at the carboxyl terminus relative to a reference sequence on a protein is located adjacent to the carboxyl terminus of the reference sequence, but not necessarily at the carboxyl terminus of the entire protein.
[0033]
The term “complement / anti-complement pair” means non-identical moieties that form a stable pair of non-covalent associations under appropriate conditions. For example, biotin and avidin (or streptavidin) are one of the prototypes of complement / anti-complement pairs. Other exemplary complement / anti-complement pairs are receptor / ligand pairs, antibody / antigen (or hapten or epitope) pairs, sense / antisense polynucleotide pairs, and the like. If you want to continue dissociating the complement / anti-complement pair, set the binding affinity of the complement / anti-complement pair to <10⁹M^-1And
[0034]
The term “complement of a polynucleotide molecule” means that the polynucleotide molecule has a complementary base sequence that has the opposite orientation relative to the reference sequence. For example, the 5'ATGCACGGG 3 'sequence is complementary to 5'CCCGTGCAT3'.
[0035]
The term “contig” means that the same or complementary sequence of a polynucleotide has a continuous strand overlapping with another polynucleotide. Overlapping and contiguous sequences refers to “overlapping” certain strand lengths of a polynucleotide sequence, the overlap being the entire or partial strand of the polynucleotide. For example, representative contigs of the polynucleotide sequence 5'-ATGGCTTAGCTT-3 'are 5'-TAGCTTgagtct-3' and 3'-gtcgacTACCGA-5 '.
[0036]
The term “degenerate nucleotide sequence” means a sequence of nucleotides that includes one or more degenerate codons (as compared to a reference polynucleotide molecule that encodes a polypeptide). Degenerate codons contain different triplet nucleotides, but encode the same amino acid residue (ie, GAU and GAC triplets each encode Asp).
[0037]
The term “expression vector” refers to a linear or circular DNA molecule comprising a segment encoding a polypeptide of interest, said segment being operably linked to a further segment prepared for its transcription. Molecule. Such additional segments include promoter and terminator sequences and may optionally include one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain elements of both.
[0038]
The term “isolated” when applied to a polynucleotide is one in which the polynucleotide is derived from the natural genetic environment, does not contain other foreign or unwanted coding sequences, and is genetically engineered. Means that it is in a shape suitable for use in a protein production system. Such isolated molecules are molecules that are isolated from their natural environment and include cDNA and genomic clones. The isolated molecules of the present invention do not contain other genes that were initially associated, but may contain 5 'and 3' untranslated regions such as naturally occurring promoters and terminators. Confirmation of the meeting area is obvious to those skilled in the art (see, eg, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).
[0039]
An “isolated” polypeptide or protein is a polypeptide or protein that is found outside the natural environment, eg, away from blood or animal tissue. A suitable form of isolated polypeptide is substantially free of other polypeptides, particularly other polypeptides of animal origin. Preferred is to provide a polypeptide in high purity form, ie greater than 95% purity, more preferably greater than 99% purity. As used herein, the term “isolated” does not exclude the presence of the same polypeptide, dimer or glycosylated or derivatized form of the physically replaceable form. .
[0040]
The term “operably linked” when referring to a DNA segment is arranged such that transcription begins at the promoter and proceeds through the coding segment to the terminator so that the segment functions in accordance with its intended purpose. Means that
The term “ortholog” means that a polypeptide or protein obtained from one species is a functional counterpart of a polypeptide or protein from a different species. Sequence differences between orthologs are the result of speciation.
“Paralog” means that proteins produced by living organisms are different but structurally related. Paralogs are believed to arise through gene duplication. For example, α-globin, β-globin, and myoglobin are paralogs of each other.
[0041]
The term “polynucleotide” refers to a single-stranded or double-stranded polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides that reads from the 5 ′ end to the 3 ′ end. Polynucleotides include RNA and DNA, and may be isolated from natural sources, synthesized in vitro, or prepared by combining natural and synthetic molecules. The size of a polynucleotide is expressed in base pairs (abbreviated “bp”), in nucleotides (“nt”), or in kilobases (“kb”). If the situation allows, the latter two terms can describe a polynucleotide that is single-stranded or double-stranded.
[0042]
When this term is applied to a double-stranded molecule, it will be used to mean the total chain length and will be understood to be equivalent to the term “base pair”. Those skilled in the art will recognize that the two strands of a double-stranded polynucleotide can differ slightly in their length and that the ends can stagger as a result of enzymatic cleavage; Not all nucleotides of a double-stranded polynucleotide are paired. Such unpaired ends generally do not exceed 20 nt in length.
[0043]
A “polypeptide” is a polymer of amino acid residues joined by peptide bonds, whether natural or synthetic. Polypeptides having less than about 10 amino acid residues are generally referred to as “peptides”.
[0044]
As used herein, “probe and / or primer” is RNA or DNA. The DNA may be cDNA or genomic DNA. Polynucleotide probes and primers are single or double stranded DNA or RNA and are generally synthetic oligonucleotides, but may be generated from cloned cDNA or genomic sequences or their complements. Analytical probes are generally at least 20 nucleotides in length, although somewhat shorter probes (14-17 nucleotides) may be used. The PCR primer has a chain length of at least 5 nucleotides, preferably 15 or more nt, more preferably 20 to 30 nt.
[0045]
When analyzing a small region of a gene, a short polynucleotide may be used. For mass gene analysis, the polynucleotide probe may contain one or more total exons. Probes can be labeled to produce a detectable signal with enzymes, biotin, radionuclides, fluorophores, chemiluminescent bodies, paramagnetic particles, etc., but these are available from many sources such as molecular probe inks ( Molecular Probes, Inc .; Eugene, Oregon), and Amersham Corp .; Arlington Heights, Illinois, etc., are commercially available and can be used with techniques well known in the art.
[0046]
The term “promoter” refers to that portion of a gene that contains a DNA sequence to which RNA polymerase binds and initiates transcription. Promoter sequences are common, but not always, and are found in the 5 'non-coding region of the gene.
[0047]
The term “receptor” refers to a cell associated protein that binds to a biologically active molecule (ie, a ligand) and mediates the action of the ligand on the cell. Membrane-bound receptors are characterized by a complex domain structure comprising an extracellular ligand binding domain and an intracellular effector domain that is generally involved in signal transduction. Binding of the ligand to the receptor results in a conformational change in the receptor that causes interaction between the effector domain and other molecular functions within the cell. This interaction further changes the cellular metabolism.
[0048]
Metabolic events involved in receptor-ligand interactions include gene transcription, phosphorylation, dephosphorylation, increased cyclic AMP production, cellular calcium mobilization, membrane lipid mobilization, cell adhesion, inositol lipid hydrolysis and phospholipids Includes hydrolysis. Most nuclear receptors also have a complex domain structure comprising an amino terminus, a transactivation domain, a DNA binding domain and a ligand binding domain. In general, receptors are membrane-bound, cytosolic or nuclear, monomeric (eg, thyroid stimulating hormone receptor, β-adrenergic receptor) or multimers (eg, PDGF receptor, growth hormone receptor, IL- 3 receptors, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, erythropoietin receptor and IL-6 receptor).
[0049]
The term “secretory signal sequence” encodes a polypeptide (secretory peptide) that, as a component of a larger polypeptide, directs that larger polypeptide through the secretory pathway of the cell that synthesizes that larger polypeptide. Means DNA sequence. Larger peptides are generally cleaved to remove the secreted peptide while passing through the secretory pathway.
[0050]
A “soluble receptor” is a receptor polypeptide that is not bound to the cell membrane. Soluble receptors are most commonly ligand-bound receptor polypeptides that lack a permeable membrane and a cytoplasmic domain. The soluble receptor comprises an additional amino acid residue, such as an affinity tag with a site that allows purification of the polypeptide or attaches the polypeptide to a substrate, or an immunoglobulin constant region region sequence. Many cell surface receptors have naturally occurring soluble counterparts that are either produced proteolytically or translated from a second splice mRNA. A receptor polypeptide is said to be substantially free from the permeable membrane and the intracellular polypeptide segment if it lacks a sufficient portion of these segments that are respectively provided for membrane anchoring or signaling.
[0051]
The term “splice variant” as used herein refers to a second form of RNA transcribed from a gene. Splice variants naturally arise from the use of a second splice site within a transcribed RNA molecule or, although less commonly, between separately transcribed RNA molecules, several from the same gene. Of mRNA may be transcribed. Splice variants may encode polypeptides having altered amino acid sequence. The term splice variant as used herein also refers to a protein encoded by a splice variant of mRNA transcribed from a gene.
[0052]
Molecular weights and chain lengths measured by inaccurate analytical methods (eg gel electrophoresis) will be understood as approximate values. When such a numerical value is expressed as “about” X or “approximately” X, it will be understood that the displayed value of X has an accuracy of ± 10%.
The present invention is based in part on the discovery of a novel DNA sequence encoding a polypeptide having homology to the adipocyte complement related protein (Acrp30). The novel DNA sequence is a polypeptide having an amino-terminal signal sequence, a heterologous flanking N-terminal region, a collagen domain consisting of 21 Gly-Xaa-Xaa or Gly-Xaa-Pro repeats, and a carboxy-terminal globular C1q domain And the subsequent long 3 ′ untranslated region.
[0053]
The general polypeptide structure described above is shared by Acrp30 and C1qC. Other homologous regions found in the carboxy-terminal globular C1q of the aligned proteins are identified here as useful primers to search for other family members. Acrp30 and C1qC are identified, for example, in searches using primers. The intrachain disulfide bond may include a cysteine at residues 39, 42 and 43 of SEQ ID NO: 2.
[0054]
The novel zacrp3 polypeptide of the present invention was initially identified by searching the ACRP30 homologue EST database and confirmed by a signal sequence, a collagen-like domain and a C1q domain. Polypeptides corresponding to ESTs meeting these search criteria were compared with known sequences to identify proteins with homology to ACRP30. Aggregated EST clusters were discovered and expected to be secreted proteins. To identify the corresponding cDNA, a clone that appeared to contain the entire coding sequence was used for sequencing. The resulting 1696 bp sequence is disclosed in SEQ ID NO: 1.
[0055]
Comparison of the initially derived EST sequence with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 indicated the presence of two frameshifts and a non-spliced intron. As shown in the figure, the novel polypeptide encoded by this full-length cDNA enables confirmation of homologue association with the adipocyte complement-related protein Acrp30 (SEQ ID NO: 3) and complement component C1qC (SEQ ID NO: 4). did. Zacrp3 shares 27.5% and 25.7% identity at the amino acid level with ACRP30 and C1qC, respectively. C1qC and ACRP30 share 32.4% identity. In the C1q domain, zacrp3 shares 26.3% and 26% identity at the amino acid level when compared to human ACRP30 and C1qC, respectively. C1qC and ACRP30 share 38.2% identity across this region.
[0056]
The entire sequence of zacrp3 polypeptide was obtained from a single clone believed to contain it, but the clone was obtained from a chest wall parenchyma library. This message was also found in a library of connective tissue, digestive, skeletal, respiratory and nervous systems, and urinary tract tissue using electronic search.
[0057]
The nucleotide sequence of zacrp3 is set forth in SEQ ID NO: 1, and its deduced amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2. As outlined above, the zacrp3 polypeptide contains a signal sequence ranging from amino acid 1 (Met) to amino acid residue 22 (Cys). Thus, the mature polypeptide ranges from amino acid 23 (Gln) to amino acid 246 (Lys). Within the mature polypeptide, an N-terminal region of unknown homology is found within amino acid residues 23 (Gln) and 50 (Arg) of SEQ ID NO: 2. In addition, a collagen-like domain is found between amino acids 51 (Gly) and 113 (Pro).
[0058]
In the collagen-like domain, 6 complete Gly-Xaa-Pro and 15 incomplete Gly-Xaa-Xaa repeats are observed. Acrp30 contains 22 complete or incomplete repeats. The proline residues found in amino acid residues 56, 59, 62 and 113 of SEQ ID NO: 2 in this domain may be hydroxylated. The zacrp3 polypeptide also contains a carboxy terminal C1q domain in the region of about amino acids 114 (Pro) to 246 (Lys). There is a significant amount of conserved structures that allow proper folding within the C1q domain.
[0059]
Fragrance found in all C1q domains including protein (FX (5)-[ND] -X (4)-[FYWL] -X (6) -FX (5) -GXYXFX- [FY] (SEQ ID NO: 5)) The sex motif is found between residues 169 and 199 of SEQ ID NO: 2. X represents any amino acid residue, and the numerical value in parentheses () indicates the number of amino acid residues. The group limits the choice of amino acid residues to that particular position: the zacrp3 polypeptides, human C1qC and Acrp30 appear to be homologous in the collagen domain and in the C1q domain, but in the N-terminal part of the mature polypeptide Not.
[0060]
Another aspect of the invention encompasses fragments of zacrp3 polypeptide. A suitable fragment is a collagen-like domain of zacrp3 polypeptide from amino acid 1 (Met), 23 (Gln) or 51 (Gly) to amino acid 1113 (Pro) of SEQ ID NO: 2, a collagen-like domain or collagen that can be dimerized or oligomerized Includes a fragment that includes a portion of a zacrp3 polypeptide that includes a portion of a like domain.
[0061]
As used herein, the term “collagen” or “collagen-like domain” refers to a series of repetitive triplet amino acid sequences, where “repeat” or “collagen repeat” refers to Gly-Xaa-Pro or Gly-Xaa-Xaa (Xaa Is any amino acid residue). Such a domain can contain as many as 21 or more collagen repeats. Fragments or proteins containing such collagen-like domains can form homomeric constructs (dimers or oligomers of the same fragment or protein). In addition, such fragments or proteins containing such collagen-like domains can form heterozygous constructs, usually trimers.
[0062]
These fragments are particularly useful for studies of collagen dimerization or oligomerization, or for the formation of fusion proteins as described in more detail below. Polynucleotides encoding such fragments are also encompassed by the present invention,
(A) a polynucleotide molecule comprising the sequence from nucleotide 1, 69, 135 or 219 to nucleotide 407 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
[0063]
(B) a polynucleotide molecule encoding a zacrp3 polypeptide fragment that matches at least 80% of the sequence from amino acid residue 51 (Gly) to amino acid residue 113 (Pro) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a molecule complementary to (a) or (b); and
(D) Includes the group consisting of degenerate nucleotide sequences encoding fragments of zacrp3 polypeptide collagen-like domains.
[0064]
Other suitable fragments include globular C1q domain of zacrp3 polypeptide ranging from amino acids 114 (Pro) to 246 (Lys) of SEQ ID NO: 2, C1q domain, or a portion of zacrp3 polypeptide comprising the active portion of C1q domain To do. Other C1q domain-containing proteins include C1qA, B and C (Seller et al., Ibid., Reid, ibid., And Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69, 1982), chipmunk hibernation-related plasma Proteins HP-20, HP-25 and HP-27 (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 and Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992) Human pre-seleberin (precerebellin; Urade et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1069-73, 1991), human endothelial cell multimerin (multimerin; Hayward et al., J. Biol. Chem. 270: 18246-51, 1995) and vertebrate collagen types VIII and X (Muragaki et al., Eur. J. Biochem. 197: 615-22, 1991).
[0065]
The spherical C1q domain of ACRP30 has been confirmed to have a 10β chain “jelly roll” topology (Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8: 335-8, 1998) that exhibits significant homology to the TNF family. The zacrp3 sequence represented by number 2 contains all 10β-chains of this structure (amino acid residues 119-123, 140-142, 148-151, 155-158, 161-173, 175- of SEQ ID NO: 2). 182, 190-197, 200-212, 217-222 and 236-241). These chains are named “A”, “A ′”, “B”, “B ′”, “C”, “D”, “E”, “F”, “G” and “H”, respectively. Yes.
[0066]
Zacrp3 has two receptor binding loops at amino acid residues 111-139 and 170-182, and the others are similar. The core receptor binding region is predicted to include amino acid residues 124-150 and 181-197 of SEQ ID NO: 2. Amino acid residues 161 (Gly), 163 (Tyr), 212 (Leu) and 237 (Phe) appear to be conserved across the superfamily including CD40, TNFα, ACRP30 and zacrp3.
[0067]
These fragments are particularly useful for the study or regulation of energy balance or neurotransmission, especially diet or stress related neurotransmission. Such fragments may also have antimicrobial activity. Homology with the TNF protein suggests that such fragments would be useful for obesity-related insulin resistance, immune regulation, inflammatory response, apoptosis and osteoclast maturation.
[0068]
Polynucleotides encoding such fragments are also encompassed by the present invention,
(A) a polynucleotide molecule comprising the sequence of nucleotide 408 to nucleotide 806 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(B) a polynucleotide molecule encoding a zacrp3 polypeptide fragment that matches at least 80% of the sequence from amino acid residue 114 (Pro) to amino acid residue 246 (Lys) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(C) a molecule complementary to (a) or (b); and
(D) a degenerate nucleotide sequence encoding a fragment of the zacrp3 polypeptide C1q domain;
A group consisting of
[0069]
Other zacrp3 polypeptide fragments of the invention include both collagen-like and C1q domains ranging from amino acid residues 51 (Gly) to 806 (Lys) of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide encoding such a fragment is also encompassed by the present invention, (a) a polynucleotide molecule comprising the sequence of nucleotides 291 to 806 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; (b) the amino acid of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide molecule encoding a zacrp3 polypeptide fragment that matches at least 80% of the sequence from amino acid residue 41 (Gly) to amino acid residue 246 (Lys); complementary to (c) (a) or (b) And (d) a group consisting of degenerate nucleotide sequences encoding a collagen-like domain-C1q domain fragment of a zacrp3 polypeptide.
[0070]
Highly conserved amino acids, particularly amino acids in the carboxy-terminal C1q domain of zacrp3 polypeptides, can be used as a means of identifying new family members. For example, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used to amplify sequences encoding conserved motifs from RNA obtained from a variety of tissue sources. In particular, highly degenerate primers and their complements designed from conserved sequences are useful for this purpose. In particular, the following primers are useful for this purpose:
[0071]
Amino acid residues 215 to 221 of SEQ ID NO: 2
GGN GAN SAR GTN TGG YT (SEQ ID NO: 6)
Amino acid residues 160-165 of SEQ ID NO: 2
SN GNN NTN TAY TWY TTY R (SEQ ID NO: 7)
Amino acid residues 237 to 242 of SEQ ID NO: 2
TTY DSN GGN TTY YTN HT (SEQ ID NO: 8)
Amino acid residues 147 to 153 of SEQ ID NO: 2
Y TWY RAY RBN WBN WSN GG (SEQ ID NO: 9)
Also included are probes corresponding to the complements of the polynucleotides described above.
[0072]
The invention also provides polynucleotide molecules, including DNA and RNA molecules that encode the zacrp3 polypeptides described herein. One skilled in the art will readily recognize that these polynucleotide molecules allow for considerable sequence changes in view of the degeneracy of the genetic code. SEQ ID NO: 10 is a degenerate DNA sequence that encompasses all DNA encoding the zacrp3 polypeptide of SEQ ID NO: 2. One skilled in the art will recognize that the degenerate sequence of SEQ ID NO: 10 also provides all RNA sequences encoding SEQ ID NO: 2 by replacing T with U.
[0073]
Thus, a zacrp3 polypeptide-encoding polynucleotide comprising nucleotide 1 to nucleotide 738 of SEQ ID NO: 10 and RNA thereof are expected according to the present invention. Table 1 shows the one letter code used in SEQ ID NO: 10 to indicate the position of the degenerate nucleotide. The “analysis” section is the nucleotide indicated by the code letter. The “complement” section indicates the complementary nucleotide code. For example, the code Y indicates C or T, its complement R indicates A or G, A is complementary to T, and G is complementary to C.
[0074]
[Table 1]

[0075]
[Table 2]

[0076]
One of ordinary skill in the art will recognize that some ambiguity has been introduced in the determination of all possible codons encoding each amino acid, degenerate codons. For example, a degenerate codon for serine (WSN) can encode arginine (AGR) in some situations, and a degenerate codon for arginine (MGN) can encode serine (AGY) in some situations. be able to. A similar relationship exists between codons encoding phenylanlanine and leucine. Thus, some polypeptides encompassed by a degenerate sequence may encode a mutated amino acid sequence, but one of ordinary skill in the art will take this by referring to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Mutant sequences can be easily identified. Mutant sequences can be easily tested for functionality as described herein.
[0077]
One of ordinary skill in the art will also appreciate that different species can exhibit “preferential codon usage”. Generally, Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas et al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13: 355-64, 1981; See Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. As used herein, the term “preferred codon usage” or “preferred codon” is a technical term that refers to the most frequently used protein translation codon in certain types of cells, and thus Prefer one or a small number of representatives of the possible codons encoding each amino acid (see Table 2).
[0078]
For example, the amino acid threonine (Thr) may be encoded by ACA, ACC, ACG, or ACT, but ACC is the most commonly used codon in mammalian cells; other types such as insect cells, yeast In viruses, or bacteria, different Thr codons may be preferred. Preferred codons for a particular species can be introduced into the polynucleotides of the invention by various methods well known in the art.
[0079]
Introduction of preferred codons into recombinant DNA can enhance production of the protein, for example, by making the translation of the protein in a particular cell type or type more efficient. Thus, the degenerate codon sequence disclosed in SEQ ID NO: 10 serves as a template for optimizing the expression of polynucleotides in various cell types and types commonly used in the art and disclosed herein. . Sequences containing preferred codons can be tested and optimized for expression in various types and further tested for functionality as disclosed herein.
[0080]
The present invention further provides mutated polypeptides and nucleic acid molecules that are representative of counterparts from other classes (orthologs). These species include, but are not limited to, mammals, birds, amphibians, reptiles, fish, insects, and other vertebrates and invertebrates. Of particular interest are zacrp3 polypeptides from other mammalian species, including mice, pigs, sheep, cows, dogs, cats, horses, and other primate polypeptides. The mouse zacrp2 homologue (SEQ ID NO: 12) has been identified. The polynucleotide sequence encoding this mouse zacrp2 polypeptide is disclosed in SEQ ID NO: 11.
[0081]
Orthologs of human zacrp3 can be cloned using the information and compositions provided by the present invention in combination with conventional cloning techniques. For example, a cDNA can be cloned using mRNA obtained from a tissue or cell type that expresses zacrp3 as disclosed herein. Appropriate sources of mRNA can be identified by probing Northern blots with probes designed from the sequences disclosed herein. A library is then created from the positive tissue or cellular mRNA.
[0082]
The cDNA encoding zacrp3 can then be used in a variety of ways, such as probing with human complete or partial cDNA or with one or more sets of degenerate probes based on the disclosed sequences. It can be isolated by methods. The cDNA can also be cloned using the polymerase chain reaction with primers designed from the representative human zacrp3 sequences disclosed herein. Within additional methods, a cDNA library can be used to transform or transfect host cells, and expression of the cDNA of interest is detected using an antibody against the zacrp3 polypeptide. It is possible. Similar techniques can also be used to isolate genomic clones.
[0083]
One skilled in the art will understand that the sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 represents one allele of human zacrp3 and that allelic variation and alternative splicing are expected to occur. Allele variations of this sequence can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals by standard methods. The allelic variant of the polypeptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and comprising the silent mutation and the mutation that results in a change in the amino acid sequence is the allelic variant of SEQ ID NO: 2. Is within the scope of the present invention.
[0084]
CDNA molecules generated from alternatively spliced mRNA and retaining the properties of a zacrp3 polypeptide are included within the scope of the present invention, as are polypeptides encoded by such cDNA and mRNA. is there. Allelic and splice variants of these sequences can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals or tissues by standard methods well known in the art. .
[0085]
Within the preferred embodiments of the present invention, an isolated nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions It is possible to hybridize with a molecule. Generally, stringent conditions are defined as the thermal melting point (T) for a particular sequence at a defined ionic strength and pH._m) About 5 ° C. T_mIs the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe (under a defined ionic strength and pH).
[0086]
Pairs of nucleic acid molecules such as DNA-DNA, RNA-RNA, and DNA-RNA can hybridize if the nucleotide sequences have some degree of complementarity. While hybrids can tolerate mismatched base pairs in a double helix, the stability of the hybrid is affected by the degree of mispairing. Unjustified hybrid T_mDecreases by 1 ° C. for each 1-1.5% base pair mismatch. Changing the stringency of the hybridization conditions allows control over the degree of mismatches that may be present in the hybrid. The degree of stringency increases as the hybridization temperature increases and as the ionic strength of the hybridization buffer decreases.
[0087]
Stringent hybridization conditions include hybrid T_mAbout 5-25 ° C lower temperature and up to 1M Na⁺And a hybridization buffer. The higher degree of stringency at the lower temperature is the hybrid T for every 1% formamide in the buffer._mCan be achieved by the addition of formamide, which lowers by about 1 ° C. Generally, such stringent conditions include a temperature of 20-70 ° C. and a hybridization buffer containing up to 6 × SSC and 0-50% formamide. A higher degree of stringency can be performed with a buffer having up to 4 times SSC and 0 to 50% formamide at a temperature of 40 to 70 ° C.
[0088]
High stringency conditions typically include a temperature of 42-70 ° C. with a hybridization buffer having up to 1 × SSC and 0-50% formamide. Different degrees of stringency can be used throughout hybridization and washing to achieve maximal specific binding to the target sequence. Typically, washing following hybridization is performed at an increased stringency to remove unhybridized polynucleotide probes from the hybridized complex.
[0089]
The above conditions are intended to serve as indicators, and it is well possible within the competence of a person skilled in the art to adapt these conditions for use with a particular polypeptide hybrid. T for a specific target sequence_mIs the temperature (under defined conditions) at which 50% of the target sequence will hybridize to a perfectly matched probe sequence. T_mConditions that affect the polynucleotide probe size and base pair content, ionic strength of the hybridization solution, and the presence of destabilizing agents in the hybridization solution.
[0090]
T_mMany equations for calculating are well known in the art and are specific for DNA, RNA, and DNA-RNA hybrids, and polynucleotide probe sequences of varying lengths (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning ( Molecular cloning): A Labolatory Manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al. (Co-edition), Current Protocols in Molecular Biology Recent protocols (John Wiley and Sons 1987); Berger and Kimmel (co-edition) Guide to Molecular Clonig Techniques (Academic Press, 1987); and Wetmur Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)).
[0091]
Sequence analysis software, such as OLIGO 6.0 (LSR; Longlake, MN) and Prmer Primer 4.0 (Primer Biosoft International; Palo Alto, CA), and sites on the Internet, to analyze a given sequence and T based on user-defined criteria_mIs an available means for calculating Such a program can also analyze a given sequence under defined conditions and identify appropriate probe sequences.
[0092]
Typically, hybridization of longer polynucleotide sequences,> 50 base pairs, was calculated as T_mIt is carried out at a temperature lower by about 20-25 ° C. For smaller probes <50 base pairs, hybridization is typically T_mOr 5 to 10 ° C lower. This allows the maximum rate of hybridization for DNA-DNA and DNA-RNA hybrids.
[0093]
The length of the polynucleotide sequence affects the rate of hybridization as well as the stability. Smaller probe sequences of <50 base pairs quickly reach equilibrium with complementary sequences, but may form less stable hybrids. Incubation times from minutes to hours can be used. Longer probes reach equilibrium more slowly, but form more stable complexes even at lower temperatures. Incubation can last overnight or longer. In general, the incubation takes place over a period equal to the estimated cot time up to 3 times. The cot time is the time required for a polynucleotide sequence to recombine and can be calculated for a particular sequence by methods well known in the art.
[0094]
The base pair composition of the polynucleotide sequence will affect the thermal stability of the hybrid complex, thereby affecting the choice of hybridization temperature as well as the ionic strength of the hybridization buffer. In an aqueous solution containing sodium chloride, the AT pair is more unstable than the GC pair. Therefore, the higher the GC content, the more stable the hybrid. Even the distribution of G and C residues within the sequence contributes positively to the stability of the hybrid.
[0095]
Furthermore, the T of a given sequence_mTo change the base pair composition can be manipulated. For example, T_m5-methyldeoxycytidine can be substituted for deoxycytidine and 5-bromodeoxyuridine can be substituted for thymidine while T_m7-deazz-2'-deoxyguanosine can be substituted for guanosine to reduce its dependence on guanosine.
[0096]
The ionic strength of the hybridization buffer also affects the stability of the hybrid. Hybridization buffers are generally blockers such as Denhardt's solution (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), denatured salmon sperm DNA, tRNA, milk powder (BLOTTO) heparin or SDS, and SSC (1x SSC: 0.15 M sodium chloride, 15 mM sodium citrate) or SSPE (1x SSPE: 1.8 M NaCl, 10 mM NaH₂PO_Four, 1 mM EDTA, pH 7.7)⁺Including the source of By reducing the ionic concentration of the buffer, the stability of the hybrid is increased.
[0097]
Typically, the hybridization buffer is between 10 mM and 1 M Na.⁺including. The addition of a destabilizing or denaturing agent, such as formamide, tetralkyl ammonium salt, guanidinium cation, or thiocyanate cation, to the hybridization solution may result in a hybrid T_mWill change. Typically, formamide is used at concentrations up to 50% in order to make incubation more convenient and at lower temperatures. Formamide also acts to reduce non-specific background when RNA probes are used.
[0098]
As one example, a nucleic acid molecule encoding a mutant zacrp3 polypeptide includes a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (or its complement), 50% formamide, 5x SSC (1x SSC: 0.15 M sodium chloride, 15 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 times Denhardt's solution (100 times Denhardt's solution: 2% (w / v) Ficoll 400, 2% (w / v) polyvinyl Hybridize overnight at 42 ° C. in a solution containing polylodon and 2% (w / v bovine serum albumin), 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured and sheared salmon sperm DNA. Can be done.
[0099]
Those skilled in the art can devise variations of these hybridization conditions. For example, the hybridization mixture can be incubated at a higher or lower temperature, such as about 65 ° C. in a solution without formamide. In addition, premixed hybridization solutions (eg, EXPRESSHYB hybridization solutions from Clontech Laboratories) are commercially available and can be hybridized according to the manufacturer's instructions.
[0100]
Following hybridization, the nucleic acid molecules can be washed under stringent conditions or under highly stringent conditions to remove non-hybridized nucleic acids. Typical stringent wash conditions include washing in a solution of 0.5-2x SSC using 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). That is, a nucleic acid molecule encoding a mutant zacrp3 polypeptide is hybridized with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (or its complement) under stringent wash conditions, and the stringency of the wash is 0.5x with 0.5% SSC using 0.1% SDS at 55 ° C, or xx SSC with 0.1% SDS at 65 ° C, 0.5x with 0.1% SDS at 50-65 ° C Equal to 2x SSC. A person skilled in the art can easily devise equivalent conditions, for example, by replacing SSC in the cleaning solution with SSPE.
[0101]
Typical highly stringent wash conditions include washing at 50-60 ° C. in a solution of 0.1-0.2 × SSC using 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). In other words, a nucleic acid molecule encoding a mutant zacrp3 polypeptide is hybridized with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (or its complement) under highly stringent wash conditions and the wash The stringency of 0.1% SSC with 0.1% SDS at 50 ° C or 0.2x SSC with 0.1% SDS at 65 ° C is used for 0.1% SDS at 50-65 ° C. Equal to 0.1x to 0.2x SSC.
[0102]
The present invention also provides an isolated zacrp3 polypeptide having a sequence identity substantially similar to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof. The term “substantially similar sequence identity” means in the text at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% relative to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an ortholog thereof. Or it is used to mean a polypeptide having a sequence identity greater than 95%. The invention also includes an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or greater than 95% sequence identity to the sequence of amino acid residues 51-246 of SEQ ID NO: 2. Polypeptides are also included. The invention further includes nucleic acid molecules that encode such polypeptides. A measure of percent identity is described below.
[0103]
The present invention can also be identified using two criteria: a measure of similarity between the encoded polypeptide and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a hybridization assay as described in the preamble. Also included are zacrp3 mutant nucleic acids. Such a zacrp3 variant is
(1) Hybridizes with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (or its complement) under stringent washing conditions, and the stringency of washing was 0.1% SDS at 50 to 65 ° C. Equal to 0.5x ~ 2xSSC, and
(2) a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or greater than 95% sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 2.
[0104]
Alternatively, the zacrp3 mutant is
(1) Hybridizes with a nucleic acid molecule (or its complement) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under highly stringent washing conditions, and uses 0.1% SDS at a washing stringency of 50 to 65 ° C. Equal to 0.1x ~ 0.2xSSC
(2) characterized as a nucleic acid molecule that encodes a polypeptide having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or greater than 95% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is possible.
[0105]
The percent sequence identity is measured by conventional methods. See, for example, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603, 1986, and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992. Briefly, the two amino acid sequences are the Henikoff and Henikoff (as shown in Gap Opening Penalty 10, Gap Extension Penalty 1, and Table 3 (amino acids are indicated by the standard one letter code)). I) the “BLOUSUM62” scoring matrix is used to optimize the alignment score. The percent identity is then calculated: [total number of identical pairs] / [longer sequence length plus the number of gaps introduced into the longer sequence to align the two sequences]) ( 100).
[0106]
[Table 3]

[0107]
Those skilled in the art recognize that there are many established algorithms for aligning two amino acid sequences. Pearson and Lipman's “FASTA” homology search algorithm tests the level of identity shared by the amino acid sequence disclosed herein and the amino acid sequence of the putative variant zacrp3 This is a protein alignment method suitable for this purpose. The FASTA algorithm is described by Person and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, and Person, Meth. Enzymol. 183: 63, 1990.
[0108]
In short, FASTA first begins with a suspicious sequence that has either the highest density of identity (if the ktup variable is 1) or a pair of identities (if the ktup variable is 2). By identifying regions shared by SEQ ID NO: 2) and test sequences, sequence similarity is characterized without considering conservative amino acid substitutions, insertions, or deletions. The 10 regions with the highest density of identity are then re-scored by comparing the similarity of all paired amino acids using an amino acid substitution matrix, and the ends of the regions are “crunched”, Include only those residues that contribute to the highest score.
[0109]
If there are several regions with a score greater than the “cut-off” value (calculated by a pre-determined formula based on the length of the sequence and the ktup value), the first cropped region is examined, It is determined whether the regions can be combined to form an adjacent alignment with a gap. Finally, the highest scoring region of the two amino acid sequences is the Needleman-Wunsch-Sellers algorithm (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48) that takes into account amino acid insertions and deletions. : 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974).
[0110]
Typical parameters for FASTA analysis are: ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1, and substitution matrix = BLOSUM62. These parameters can be introduced into the FASTA program by modifying the scoring matrix file (“SMATRIX”) as described in Appendix 2 of Person, Meth. Enzymol. 183: 63, 1990. It is.
FASTA can also be used to determine the sequence identity of nucleic acid molecules using ratios such as those disclosed in the preamble. For nucleotide sequence comparisons, ktup values between 1 and 6 are possible, preferably in the range of 4-6.
[0111]
The invention includes nucleic acid molecules that encode a polypeptide having one or more “conservative amino acid substitutions” relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Conservative amino acid substitutions can be based on the chemical nature of the amino acid. That is, it contains a substitution of one or more amino acids of SEQ ID NO: 2 and the alkyl amino acid replaces one alkyl amino acid of the zacrp3 amino acid sequence or the aromatic amino acid is one aromatic of the zacrp3 amino acid sequence An amino acid is substituted, a sulfur-containing amino acid is substituted for one sulfur-containing amino acid in the zacrp3 amino acid sequence, a hydroxy-containing amino acid is substituted for one hydroxy-containing amino acid in the zacrp3 amino acid sequence, or an acidic amino acid is a zacrp3 amino acid A single amino acid in the sequence is substituted, a basic amino acid is substituted for one basic amino acid in the zacrp3 amino acid sequence, or a 2-base 1-carboxylic acid amino acid is one 2-base 1-carboxylic acid in the zacrp3 amino acid sequence Mutants with amino acid substitutions can be obtained.
[0112]
Among the common amino acids, for example, “conservative amino acid substitutions” are described by substitutions between amino acids in each of the following groups: (1) Glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine, ( 2) phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, (3) serine and threonine, (4) aspartic acid and glutamic acid, (5) glutamine and asparagine, and (6) lysine, arginine, and histidine.
[0113]
The BLOUSM62 table is an amino acid substitution matrix derived from approximately 2,000 local multiple alignments of protein sequence segments, representing highly conserved regions of more than 500 related proteins (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992). Thus, the BLOUSM62 substitution frequency can be used to define conservative amino acid substitutions that may be introduced into the amino acid sequences of the present invention. While it is possible to design amino acid substitutions based solely on chemistry (as discussed in the previous sentence), the term “conservative amino acid substitution” is preferably represented by a BLOUSUM62 value greater than −1 Refers to substitution.
[0114]
For example, an amino acid substitution is conservative if the amino acid substitution is characterized by a BLOUSUM62 value of 0, 1, 2, or 3. According to this system, preferred conservative amino acid substitutions are characterized by a BLOUSUM62 value of at least 1 (eg, 1, 2, or 3), but more preferred conservative amino acid substitutions are at least 2 (eg, 2 or 3). ) Is characterized by BLOUSUM62 value.
[0115]
Conservative amino acid changes in the zacrp3 gene can be introduced by substituting nucleotides for the nucleotides listed in SEQ ID NO: 1. Such “conservative amino acid” variants can be obtained, for example, by oligonucleotide-specific mutagenesis, linker scanning mutagenesis, mutagenesis using the polymerase chain reaction, and others (Ausubel (1995) 8 -Pages 10-8-22; and McPherson (eds.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). The ability of such variants to regulate energy balance or promote other properties of wild type proteins can be measured using standard methods, such as the assays described herein. Alternatively, variant zacrp3 polypeptides can be identified by their ability to specifically bind anti-zacrp3 antibodies.
[0116]
The protein of the present invention can also contain non-natural amino acid residues. Non-natural amino acids include trans-3-methylproline, 2,4-methanoproline, cis-4-hydroxyproline, trans-4-hydroxyproline, N-methyl-glycine, allo-threonine, methylthreonine, hydroxyethyl Cysteine, hydroxyethyl homocysteine, nitroglutamine, homoglutamine, pipecolic acid, thiazolidinecarboxylic acid, dehydroproline, 3- and 4-methylproline, 3,3-dimethylproline, tert-leucine, norvaline, 2-azaphenylalanine, 3 -Azaphenylalanine, 4-azaphenylalanine, and 4-fluorophenylalanine are included without limitation. Several methods are well known in the art for incorporating non-naturally occurring amino acid residues into proteins.
[0117]
For example, an in vitro system can be used in which a nonsense mutation is suppressed using a chemically aminoacylated suppressor tRNA. Methods for synthesizing amino acids and aminoacylated tRNAs are well known in the art. Transcription and translation of plasmids containing nonsense mutations is typically performed in a cell-free system comprising an S30 extract of E. coli and commercially available enzymes and other reagents. The protein is purified by chromatography. For example, Robertson et al., J. Amer. Chem. Soc. 113: 2722, 1991, Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991, Chung et al., Science 259: 806, 1993, and Chung et al., Proc. Natl. Acad. See Sci. USA 90: 10145, 1993.
[0118]
In the second method, translation is carried out in Xenopus oocytes by microinjection of mutated mRNA with chemically aminoacylated suppressor tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991, 1996). In the third method, E. coli cells are in the absence of the natural amino acid to be replaced (eg, phenylalanine) and the desired non-naturally occurring amino acid (eg, 2-azaphenylalanine, 3-azaphenylalanine, 4 -Azaphenylalanine or 4-fluorophenylalanine).
[0119]
Non-naturally occurring amino acids are incorporated into the protein at their natural counterparts. See Koide et al., Biochem. 33: 7470, 1994. Naturally occurring amino acid residues can be changed to non-naturally occurring types by in vitro chemical modification. Chemical modifications can be combined with site-directed mutagenesis to further expand the scope of substitution (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395, 1993)).
A limited number of non-conservative amino acids, amino acids that are not encoded by the genetic code, non-naturally occurring amino acids, and non-natural amino acids may be substituted for zacrp3 amino acid residues.
[0120]
Using well-known methods such as mutagenesis and screening disclosed by Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53, 1988) or Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152, 1989) Thus, numerous amino acid substitutions can be made and tested. In short, these authors simultaneously randomize two or more positions in one polypeptide, select a functional polypeptide, and then sequence the mutagenized polypeptide. Discloses a method for determining the range of permissible substitutions at each position. Other methods that can be used include phage display (eg, Lowman et al., Biochem. 30: 10832, 1991, Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409, Huse, International Publication No. WO92 / 06204, and site-directed mutagenesis ( Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986, and Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
[0121]
Variants of the disclosed zacrp3 nucleotide and polypeptide sequences are also disclosed by Stemmer, Nature 370: 389, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747, 1994, and International Publication No. WO97 / 20078 It can also be generated via DNA shuffling. In short, mutant DNA molecules are generated by in vitro homologous recombination by random fragmentation of the parent DNA followed by reconstruction using PCR, resulting in randomly introduced point mutations. Arise.
[0122]
This technique can be modified by using a group of parental DNA molecules, such as allelic variants or DNA molecules from different species, introducing additional variability into the process. Selection or screening for the desired activity, followed by additional mutagenesis and assay, selects for the desired mutation and, at the same time, selects for the undesired changes, thereby rapidly “evolving” the sequence. I will provide a.
[0123]
Mutagenesis methods such as those disclosed herein can be combined with automated high-throughput screening methods to detect the activity of cloned and mutagenized polypeptides in host cells. . Mutagenized DNA molecules encoding biologically active polypeptides or polypeptides that bind anti-zacrp3 antibodies can be recovered from host cells and rapidly sequenced using state-of-the-art equipment It is. These methods allow a rapid determination as to the importance of individual amino acid residues in the polypeptide of interest and can be applied to polypeptides with unknown structures.
[0124]
Important amino acids in the polypeptides of the invention can be identified by methods well known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science 244: 1081, 1989). , Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498, 1991, Coombs and Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering”, Proteins: Analysis and Design ( Protein: Analysis and Design), Angeletti (eds.), Pp. 259-311 (Academic Press 1998)).
[0125]
In the latter technique, a single alanine mutation is introduced into every residue in the molecule, and the resulting mutant molecule identifies amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. In order to do so, it is tested for biological activity as disclosed below. See also Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699, 1996. The important amino acids can also be inferred from homology analysis using zacrp3.
[0126]
The location of the receptor binding domain of zacrp3 is a physical analysis, as measured by techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling, with mutations about the putative contact site amino acids It can be identified by the method. See, for example, de Vos et al., Science 255: 306, 1992, Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899, 1992, and Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 509, 1992. Furthermore, zacrp3 labeled with biotin or FITC can be used for expression cloning of the zacrp3 receptor.
[0127]
The invention also provides a polypeptide fragment or peptide comprising a portion having an epitope of a zacrp3 polypeptide disclosed herein. Such a fragment or peptide may comprise an “immunogenic epitope”, which is the part of a protein that elicits an antibody response when the entire protein is used as an immunogen. Peptides with immunogenic epitopes can be identified by standard methods (see, eg, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998, 1983).
[0128]
In contrast, a polypeptide fragment or peptide may contain an “antigenic epitope”, which is a region of a protein molecule to which an antibody can specifically bind. Some epitopes consist of a linear or continuous stretch of amino acids, and the antigenicity of such epitopes is not destroyed by denaturing agents. It is well known in the art that relatively short synthetic epitopes that can mimic protein epitopes can be used to stimulate the production of antibodies against the protein (eg, Sutcliffe et al., Science 219: 660, 1983). Accordingly, peptides and polypeptides having an antigenic epitope of the invention are useful for raising antibodies that bind to the polypeptides disclosed herein.
[0129]
Peptides and polypeptides having antigenic epitopes preferably comprise at least 4 to 10 amino acids, at least 10 to 15 amino acids, or about 15 to 30 amino acids of SEQ ID NO: 2. Peptides as well as polypeptides with such epitopes can be produced by fragmentation of zacrp3 polypeptides or by chemical peptide synthesis as disclosed herein. In addition, epitopes can be selected by phage display of random peptide libraries (eg, Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5: 268, 1993, and Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616, 1996).
[0130]
Methods for identifying epitopes and generating antibodies from small peptides containing epitopes are described, for example, by Mole, “Epitope Mapping, Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (eds.), 105 − 16 (The Human Press 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies”, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application (monoclonal) Antibodies: production, engineering, and clinical applications), Ritter and Ladyman (co-edition), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), and Coligan et al. (Co-edition) Current Protocols in Immunology. 9.3.1.-9.3.5. And 9.4.1-9.4.11 (John Wikley & Sons 1997) It is described in.
[0131]
Regardless of the specific nucleotide sequence of the mutant zacrp3 gene, the gene is characterized by its energy balancing activity, or by other activities of wild-type proteins, or by its ability to specifically bind to anti-zacrp3 antibodies Is encoded. More specifically, the mutant zacrp3 gene exhibits at least 50% and preferably more than 70, 80, or 90% activity of the polypeptide encoded by the human zacrp3 gene disclosed herein.
[0132]
For any zacrp3 polypeptide, including variants and fusion proteins, one of ordinary skill in the art will encode the variant using the information shown in Tables 1 and 2 above. Fully degenerate polynucleotide sequences can be readily generated. In addition, one skilled in the art can invent zacrp3 variants using standard software based on the nucleotide and amino acid sequences described herein. Accordingly, the present invention includes a computer readable medium encoded with a data structure that provides at least one of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 10.
[0133]
Suitable shapes for computer readable media include magnetic media and optically readable media. Examples of magnetic media include hard or fixed drives, random access memory (RAM) chips, floppy disks, digital linear tape (DLT), disk caches, and ZIP disks. Optically readable media include compact discs (eg, CD-read only memory (ROM), CD-rewritable (RW), and CD-recordable), and digital versatile (generic) ) / Video disc (DVD) (eg, DVD-ROM, DVD-RAM, and DVD + RW).
[0134]
The present invention also provides zacrp3 fusion proteins. For example, the fusion protein of the present invention is
(1) (a) A sequence of amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 2 from amino acid residue 1 (Met), 23 (Gln), or 51 (Gly) to amino acid residue 246 (Lys) A polynucleotide molecule comprising:
(B) a polypeptide molecule ranging from amino acid 51 (Gky) to amino acid 113 (Pro) of SEQ ID NO: 2, a collagen-like domain, or a portion of the collagen-like domain that can be dimerized or oligomerized A portion of a zacrp3 polypeptide comprising;
[0135]
(C) a polypeptide molecule spanning amino acids 114 (Pro) to 246 (Lys) of SEQ ID NO: 2, a Clq domain, or a portion of a zacrp3 polypeptide comprising an active portion of a Clq domain; or
(D) a polypeptide molecule selected from the group consisting of a polypeptide molecule ranging from amino acids 51 (Gly) to 246 (Lys), a portion of a zacrp3 polypeptide comprising a collagen-like domain and a Clq domain; and
(2) another polypeptide,
including.
[0136]
Another polypeptide may be an alternative or additional Clq domain, an alternative or additional collagen-like domain, a signal peptide to facilitate secretion of the fusion protein, or others. The globular domain of a zacrp3 polypeptide, fragment, or fusion may have one similar role.
[0137]
A zacrp3 polypeptide spanning amino acid 1 (Met) to amino acid 246 (Lys); a mature zacrp3 polypeptide spanning amino acid 23 (Gln) to amino acid 246 (Lys); or a secretory leader fragment thereof, amino acid 1 (Met ) To amino acid 22 (Cys) may be used in studies of protein secretion from cells. In a preferred embodiment for this aspect of the invention, the mature polypeptide is formed as a fusion protein with a putative secretory signal sequence; a plasmid having a regulatory region capable of directing expression of the fusion protein Introduced into the test cell; in addition, the secretion of the mature protein is monitored. Monitoring may be performed by techniques well known in the art such as HPLC.
[0138]
The polypeptides of the present invention, including full-length proteins, fragments thereof, and fusion proteins, can be produced in genetically engineered host cells according to conventional techniques. Suitable host cells are of the cell type that can be transformed or transfected with exogenous DNA and grown in culture, such as bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells. Contains cells. Eukaryotic cells, particularly cultured cells of multicellular organisms, are preferred. Techniques for manipulating cloned DNA and for introducing exogenous DNA into various host cells are disclosed by Sambrook et al., Ibid, and Ausubel et al., Ibid.
[0139]
In general, the DNA sequence encoding the zacrp3 polypeptide of the invention will be relative to other genetic elements necessary for its expression, typically including a transcriptional promoter and terminator in one expression vector. Are operably coupled. The vector also usually contains one or more selectable markers and one or more origins of replication, but one skilled in the art will know that in some systems the selectable markers are provided on separate vectors. It will be appreciated that exogenous DNA replication may be provided by integration into the genome of the host cell. The selection of promoters, terminators, selectable markers, vectors, and other elements is a matter of routine design within the level of ordinary skill in the art. Many such elements are described in the literature and are obtained through commercial suppliers.
[0140]
To direct the zacrp3 polypeptide into the secretory pathway of the host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, signal sequence, prepro sequence, or presequence) is provided in the expression vector. The secretory signal sequence may be that of a zacrp3 polypeptide, or may be derived from another secreted protein (eg, t-PA) or synthesized de novo. The secretory signal sequence is joined to the DNA sequence of the zacrp3 polypeptide in the correct reading frame.
[0141]
In general, the secretory signal sequence is placed 5 ′ of the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, although certain signal sequences may be placed anywhere within the DNA sequence of interest (eg, Welch et al., US Pat. 5,037,743; see Holland et al., US Pat. No. 5,413,830). Conversely, the signal sequence portion of the zacrp3 polypeptide (amino acid residues 1 to 22 of SEQ ID NO: 2) may be used to direct secretion of an alternative protein by similar methods.
[0142]
Secretory signal sequences included in the polypeptides of the invention can be used to direct other polypeptides into the secretory pathway. The present invention has the necessary means for such fusion polypeptides. A secretory signal sequence derived from amino acid residues 1-22 of SEQ ID NO: 2 is a signal operably linked to another polypeptide using methods well known in the art and disclosed herein. A fusion polypeptide can be made.
[0143]
The secretory signal sequence contained in the fusion polypeptide of the present invention is preferably fused at the amino terminus to an additional peptide so as to direct the additional peptide into the secretory pathway. Such constructs have many uses well known in the art. For example, these novel secretory signal sequence fusion constructs can direct the secretion of an active component of a protein that is not normally secreted, such as a receptor. Such fusions may be used in vivo or in vitro to direct the peptide through the secretory pathway.
[0144]
Cultured mammalian cells are suitable hosts within the scope of the present invention. Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include calcium phosphate mediated transfection (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-5, 1982), DEAE-dextran-mediated transfection (Ausubel et al., Ibid.), And liposome-mediated transfection (Hawley-Nelson) Et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, and viral vectors (Miller and Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996. )including.
[0145]
Production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is disclosed, for example, in Levinson et al., US Pat. No. 4,713,339; Hagen et al., US Pat. No. 4,784,950; Palmiter et al., US Pat. No. 4,579,821; and Ringold, US Pat. No. 4,656,134. Has been. Suitable cultured mammalian cells include COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), BHK (ATCC CRL 1632), BHK570 (ATCC CRL 10314), 293 (ATCC CRL 1573); Graham et al., J Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) and Chinese hamster ovary (eg CHO-K1; ATCC CCL 61) cell lines.
[0146]
Further suitable cell lines are well known in the art and are available from public depositories such as the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. In general, strong transcription promoters are preferred, such as promoters from SV-40 or cytomegalovirus. See, for example, US Pat. No. 4,956,288. Other suitable promoters include the metallothionein gene (US Pat. Nos. 4,579,821 and 4,601,978), and the adenovirus major late promoter.
[0147]
In general, drug selection is used to select cultured mammalian cells into which foreign DNA has been inserted. Such cells are commonly referred to as “transfectants”. A cell that has been cultured in the presence of a selective agent and is capable of passing the gene of interest to its progeny is called a “stable transfectant”. A preferred selectable marker is a gene encoding resistance to the antibiotic neomycin. Selection is performed in the presence of a neomycin type drug such as G-418 or others. The selection system may also be used for a process called “amplification” that enhances the expression level of the gene of interest. Amplification is performed by culturing the transfectants in the presence of a low level of a selective agent and then increasing the amount of the selective agent to select cells that produce high levels of the introduced gene product. It is.
[0148]
A preferred amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate. Other drug resistance genes (eg, hygromycin resistance, multidrug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used. Alternative markers that introduce another phenotype, such as green fluorescent proteins or cell surface proteins such as CD4, CD8, class I MHC, and placental alkaline phosphatase, can be translocated by means such as FACS sorting or magnetic bead separation. It can be used to sort the infected cells from the untransfected cells.
[0149]
Other higher eukaryotic cells can also be used as hosts, including plant cells, insect cells, and avian cells. The use of Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells is reviewed by Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Insect transformation and production of exogenous polypeptides therein are disclosed by Guarino et al., US Pat. No. 5,162,222 and WIPO publication WO94 / 06463.
[0150]
Insect cells can be infected by recombinant baculoviruses, generally derived from autographer nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). King and Possee, “The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide”, London, Chapman &Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. Viral Expression Vectors: Laboratory Manual), New York, Oxford University Press, 1994; and Richardson, CD, Ed., Baculovirus Expression Protocols: Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ See, Humana Press, 1995.
[0151]
A second method for producing recombinant zacrp3 baculovirus utilizes a transposon-based system described by Luccuou (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). This system using transfer vectors is a Bac-to-Bac^TMSold in Kits (Life Technologies, Rockville, Maryland). This system is a transfer containing a Tn7 transposon to move DNA encoding the zacrp3 polypeptide into a baculovirus genome maintained in E. coli as a large plasmid called "Bacmid". Vector, pFastBac1^TM(Life Technologies) is used.
[0152]
pFastBac1^TMThe transfer vector utilizes the AcNPV polyhedrin promoter to drive expression of the gene of interest, in this case zacrp3. However, pFastBac1^TMCan be modified to a considerable extent. The polyhedrin promoter can be removed and replaced with a baculovirus basic protein promoter (Pcor, p6.9, or MP promoter), but it is expressed early in baculovirus infection and is a secreted protein Has been shown to be favorable for the expression of. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; and Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Che. 270 : See 1543-9, 1995.
[0153]
In such transfer vector constructs, a short or long type of basic protein promoter may be used. In addition, transfer vectors can be constructed that replace the natural zacrp3 secretion signal sequence with an insect protein-derived secretion signal sequence. For example, ecdysteroid glucosyltransferase (EGT), honeybee melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA), or baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) replaces the natural zacrp3 secretion signal sequence Thus, it can be used in a construct.
[0154]
In addition, transfer vectors can be expressed by epitope tags at the C- or N-terminus of the expressed zacrp3 polypeptide, such as the Glu-Glu epitope tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985 In-frame fusion with DNA encoding). Using techniques well known in the art, the transfer vector containing zacrp3 is transformed into E. coli and screened for a bacmid containing a fragmented lacZ gene that is indicative of a recombinant baculovirus.
[0155]
Bacmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated using common techniques and used to transfect Spodoptera frugiperda cells, such as Sf9 cells. A recombinant virus expressing zacrp3 is substantially produced. Recombinant virus stocks are made by this technique () commonly used methods.
[0156]
Recombinant viruses are used to infect host cells, typically cell lines derived from fall armyworm, Spodoptera frugiperda. See generally Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, 1994. Another suitable cell line is High FiveO from Trochoplusia ni (US Pat. No. 5,300,435).^TMCell line (invitrogen). A commercially available serum-free medium is used to grow and maintain the cells.
[0157]
A suitable medium is Sf900 II for Sf9 cells.^TM(Life Technologies) or ESF 921^TM(Expression Systems); and EX-cellO405 for T.ni cells^TM(JRH Biosciences, Kansas, Lenexa) or Express FiveO^TM(Life Technologies). Cells are about 2-5x10^Five1-2x10 from cell seeding density⁶At this point, the recombinant virus stock is added at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1-10, more typically approximately 3. The methods used are generally described in commercially available laboratory manuals (King and Possee, ibid .; O'Reilly et al., Ibid .; Richardson, ibid.). Subsequent purification of the zacrp3 polypeptide from the supernatant can be performed using the methods described herein.
[0158]
Fungal cells, including yeast cells, can also be used within the scope of the present invention. Particularly interesting yeast types in this regard include Saccaromyces cerevisiae and Pichia methanolica. S. using exogenous DNA. Methods for transforming cerevisiae cells and further producing recombinant polypeptides therefrom include, for example, Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311; Kawasaki et al., US Pat. No. 4,931,373; Brake, US Pat. No. 4,870,008; Welch et al., U.S. Pat. No. 5,037,743; and Murrayt et al., U.S. Pat. No. 4,845,075.
[0159]
Transformed cells are selected by a phenotype determined by a selectable marker, generally drug resistance or the ability to grow in the absence of a particular nutrient (eg, leucine). A preferred vector system for use in Saccharomyces cerevisiae is the POT1 vector system disclosed by Kawasaki et al. (US Pat. No. 4,931,373), in which transformed cells are selected by growth in glucose-containing medium. Enable. Suitable promoters and terminators for use in yeast include glycolytic enzyme genes (see, for example, Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311; Kingsman et al., US Pat. No. 4,615,974; and Bitter, US Pat. No. 4,977,092) and alcohol dehydrogenases Including those from genes.
[0160]
See also U.S. Pat. Nos. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936, and 4,661,454. Hansenula polymorpha, Schizosaccaromyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustirago pori mays Transformation systems for other yeasts, including Pichia methanolica, Pichia guillermondii, and Candida maltosa are well known in the art.
[0161]
See, for example, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 and Cregg, US Pat. No. 4,882,279. Aspergillus cells may be utilized according to the method of McKnight et al., US Pat. No. 4,935,349. A method for transforming Acremonium chrysogenum is disclosed by Sumino et al., US Pat. No. 5,162,228. A method for transforming the genus Red-knot is disclosed by Lambowitz, US Pat. No. 4,486,533.
[0162]
The use of Pichia methanolica as a host for the production of recombinant proteins is disclosed in WIPO publications WO97 / 17450, WO97 / 17451, WO98 / 02536, and WO98 / 02565. P. DNA molecules for use in methanolica transformation will generally be prepared as double stranded circular plasmids, but are preferably linearized prior to transformation. P. For polypeptide production in methanolica, the promoter and terminator in the plasmid is P. such as methanolica alcohol utilization gene (AUG1 or AUG2) A methanolica gene is preferred.
[0163]
Other useful promoters include those of the dihydroxyacetone synthase (DHAS), formate dehydrogenase (FMD), and catalase (CAT) genes. In order to facilitate the integration of DNA into the host chromosome, it is preferred to have the entire expression segment of the plasmid, flanked by host DNA sequences at both ends. A preferred selectable marker for use in Pichia methanolica is P. a. The methanolica ADE2 gene, which encodes phosphoribosyl-5-aminoimidazole carboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) that allows the growth of ade2 host cells in the absence of adenine.
[0164]
For large-scale industrial processes where it is desirable to minimize the use of methanol, it is preferable to use host cells in which both methanol utilization genes (AUG1 and AUG2) are deleted. For the production of secreted proteins, host cells lacking vacuolar protease genes (PEP4 and PRB1) are preferred. A plasmid containing the DNA encoding the polypeptide of interest, p. Electroporation is used to facilitate introduction into methanolica cells. Decreasing exponentially with an electric field strength of 2.5 to 4.5 kV / cm, preferably about 3.75 kV / cm, and a time constant (τ) of 1 to 40 milliseconds, most preferably about 20 milliseconds By electroporation using a pulsed electric field, P.P. Preferably, the methanolica cells are transformed.
[0165]
Prokaryotic host cells, including E. coli, Bacillus, and bacterial strains of other genera are also useful host cells within the scope of the present invention. Techniques for transforming these host cells and expressing the foreign DNA sequences cloned therein are well known in the art (see Sambrook et al., Ibid). When expressing a zacrp3 polypeptide in bacteria such as E. coli, the polypeptide may be retained in the cytoplasm, typically as insoluble granules, or directed to the periplasmic space by bacterial secretion sequences. In the former case, the cells are lysed and the granules are recovered and denatured using eg guanidine isothiocyanate or urea.
[0166]
The denatured polypeptide can then be regenerated and dimerized by dilution of the denaturant, such as by dialysis against a solution of urea and reduced and oxidized glutathione, followed by dialysis against buffered saline. It is. In the latter case, the polypeptide is soluble and functional by destroying the cells (eg, by sonication or osmotic shock) and recovering the protein to release the contents of the periplasmic space. Is recovered from the periplasmic space in a sex form, thereby eliminating the need for degeneration as well as regeneration.
[0167]
Transformed or transfected host cells are cultured according to conventional methods in a culture medium containing nutrients and other components necessary for the growth of the selected host cells. Various suitable media, including synthetic media and natural media, are well known in the art and generally include a carbon source, a nitrogen source, essential amino acids, vitamins, and minerals. The medium may contain a growth factor or serum as necessary. Generally, the growth medium is made exogenous by, for example, drug selection or lack of essential nutrients supplemented by a selectable marker that is carried on an expression vector or cotransfected into a host cell. Cells that contain the added DNA will be selected.
[0168]
The expressed zacrp3 polypeptide (or chimeric zacrp3 polypeptide) can be purified using fractionation methods and / or conventional purification methods and media. Ammonium sulfate precipitation and acid or chaotrope extraction methods may be used for sample fractionation. Exemplary purification steps may include hydroxyapatite, size exclusion, FPLC, and reverse phase high performance liquid chromatography. Suitable chromatographic media include derivatized dextran, agarose, cellulose, polyacrylamide, specialty silica, and the like. PEI, DEAE, QAE, and Q derivatives are preferred.
[0169]
Typical chromatographic media are Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), derived using phenyl, butyl, or octyl groups. ), Medium such as Octyl-Sepharose (Pharmacia); or Amberchrom (Toso Haas) CG71 (Toso Haas) and other polyacrylic resins. Suitable solid supports include glass beads, silica-based resins, cellulose resins, agarose beads, cross-linked agarose beads, polystyrene beads, cross-linked polyacrylamide resins, and other, insoluble under the conditions in which they are used. Including some.
[0170]
Such supports may be modified with reactive groups that allow attachment of proteins by amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups, hydroxyl groups, and / or carbohydrate moieties. Examples of coupling chemistry include carboxyl and amino derivatives for cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxide activation, SH activation, hydrazide activation, and carbodiimide coupling chemistry.
[0171]
These and other solid media are well known and widely used in the art and are available from commercial suppliers. The binding of receptor polypeptides to support media is well known in the art. The choice of one particular method is a matter of routine design and is determined in part by the nature of the chosen support. See, for example, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Sweden, Uppsala, 1988.
[0172]
The polypeptides of the present invention can be isolated by developing their structure or binding properties. For example, immobilized metal ion adsorption (FMAC) chromatography can be used to purify proteins that are rich in histidine or that have a His tag. In short, the gel is first filled with divalent metal ions to form a chelate (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Histidine-rich proteins are adsorbed to this matrix with different affinities, depending on the metal ion used, and are eluted by competitive elution, pH reduction, or the use of strong chelating agents Will.
[0173]
Other purification methods include purification of glycosylated proteins by lectin affinity chromatography and ion exchange chromatography (Methds in Enzymol. Volume 182, “Guide to Protein Purification” Deutscher, ed.). Academic Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). As discussed in greater detail in the Examples section below, within a further preferred embodiment of the invention to facilitate purification, the polypeptide of interest and an affinity tag (e.g., maltose binding protein, Fusions with FLAG, Gli-Glu, immunoglobulin domains) may be constructed.
[0174]
Protein regeneration (and optionally reoxidation) techniques may be conveniently used. It is preferred that the protein is purified to 80% purity, more preferably> 90% purity, still more preferably> 95%, and particularly preferably pharmaceutically pure, ie macromolecules, in particular Those that contaminate other proteins and nucleic acids are greater than 99.9% pure and do not contain infectious and pyrogenic agents. Preferably, the purified protein is substantially free of other proteins, particularly other proteins of animal origin.
[0175]
Zacrp3 polypeptides or fragments thereof may also be prepared through chemical synthesis by methods well known in the art. Such a zacrp3 polypeptide may be monomeric or multimeric; glycosylated or non-glycosylated; pegylate or not PEGylated; and contains the first methionine amino acid residue, or It does not have to be included.
[0176]
Ligand binding polypeptides, such as zacrp3 binding polypeptides, can also be used for ligand purification. The polypeptide is on a solid support, such as agarose beads, cross-linked agarose, glass, cellulose resin, silica-based resin, polystyrene, cross-linked polyacrylamide, or similar materials that are stable under the conditions of use. Fixed. Methods for attaching polypeptides to solid supports are well known in the art and include amine chemistry, cyanogen bromide activation, N-hydroxysuccinimide activation, epoxy activation, SH activation, and hydrazide activation. The resulting medium is generally formed in the shape of a column, and the liquid containing the ligand is passed through the column one or more times to allow the ligand to bind to the ligand binding polypeptide. The ligand is then eluted using changes in salt concentration, chaotropic agent (guanidine HCl), or pH to disrupt ligand-receptor binding.
[0177]
Ligand-binding receptors (or antibodies, members of complement / anti-complement pairs), or binding fragments thereof, and commercially available biometric instruments (BIAcore^TM, Piscataway, Pharmacia, NJ) may be conveniently used. Such receptor, antibody, member or fragment of a complement / anti-complement pair is immobilized on the surface of the receptor chip. The use of this instrument is disclosed by Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 and Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993.
[0178]
Receptors, antibodies, members or fragments are covalently attached to dextran fibers attached to a gold film in the flow cell using amine or SH chemistry. The test sample passes through the cell. If an opposing member of a ligand, epitope, or complement / anti-complement pair is present in the sample, it binds to a fixed receptor, antibody or member, causing a change in the refractive index of each medium, Will be detected as a change in the surface plasmon resonance of the gold film. This system allows for the measurement of on and off rates, whereby the binding affinity can be calculated and further allows the quantitative evaluation of binding.
[0179]
Ligand binding polypeptides can also be used in other assay systems well known in the art. Such systems include Scatchard analysis (see Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) and calorimetric analysis (Cunningham et al., Science 253: 545) for the measurement of binding affinity. -48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
[0180]
The present invention also provides anti-zacrp3 antibodies. Antibodies against zacrp3 can be obtained, for example, using the product of a zacrp3 expression vector or zacrp3 isolated from a natural source as an antigen. Particularly useful anti-zacrp3 antibodies “bind specifically” with zacrp3. The antibody is⁶M^-1Or larger, preferably 107M^-1Or larger, more preferably 10⁸M^-1Or larger, and most preferably 10⁹M^-1Binding to a zacrp3 polypeptide, peptide or epitope with a binding affinity (Ka) of greater than that is considered to be specifically bound. The binding affinity of an antibody can be readily determined by those skilled in the art, for example, by Scatchard analysis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949). Suitable antibodies include antibodies that bind to zacrp3 in specific domains.
[0181]
Anti-zacrp3 antibodies can be produced using peptides and polypeptides having anti-zacrp3 epitopes. Peptides and polypeptides of the invention having an antigenic epitope comprise at least 9, preferably between 15 and about 30 amino acids contained in SEQ ID NO: 2. However, a peptide or polypeptide containing a larger portion of an amino acid sequence of the invention containing 30 to 50 amino acids or any length including the complete amino acid sequence of the polypeptide of the invention Are also useful for inducing antibodies that bind zacrp3.
[0182]
The amino acid sequence of the epitope-bearing peptide should be selected to provide substantial solubility in a water-soluble solvent (ie, the sequence contains relatively hydrophilic residues and hydrophobic residues). Groups are preferably avoided). Hydrophilic peptides can be predicted from the hydrophobicity plots by those skilled in the art, for example, Hopp and Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-8, 1981) and Kyte and Doolittle ( J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982). In addition, amino acid sequences containing proline residues may be desirable for antibody production.
[0183]
Polyclonal antibodies against recombinant zacrp3 protein or against zacrp3 isolated from natural sources can be prepared using methods well known to those skilled in the art. For example, Green et al., “Production of Polyclonal Antisera”, Immunochemical Protocols (Manson), pages 1-5 (Humana Press 1992), and Williams et al., “ Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of secific polyclonal antibodies ”DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd edition Glover et al. (Co-edition), page 15 (Oxford University Press 1995).
[0184]
The immunogenicity of a zacrp3 polypeptide can be increased through the use of an adjuvant, such as alum (aluminum hydroxide) or complete or incomplete Freund's adjuvant. Polypeptides useful for immunization also include fusion polypeptides, such as fusions of zacrp3 or a portion thereof with an immunoglobulin polypeptide or maltose binding protein. The polypeptide immunogen may be a full-length molecule or a part thereof. If the polypeptide portion is “hapten-like”, such portion for immunization is on a polymeric carrier (such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) or tetanus toxoid)). On the other hand, it may be conveniently combined or linked.
[0185]
Polyclonal antibodies are typically raised in animals such as horses, cows, dogs, chickens, rats, mice, rabbits, hamsters, guinea pigs, goats, or sheep, but may also be obtained from apes. General techniques for raising antibodies useful in diagnosis and therapy in baboons can be found, for example, in Goldenbergm et al., International Patent Publication WO 91/11465, and Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Antibodies can also be raised in transgenic animals such as transgenic sheep, cows, goats, or pigs, and also expressed in yeast and fungi in a modified form as in mammalian and insect cells. It is possible.
[0186]
Alternatively, monoclonal anti-zacrp3 antibodies may be generated. Rodent monoclonal antibodies against specific antigens may be obtained by methods well known to those skilled in the art (eg, Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), Coligan et al. (Co-edition), Current Protocols in Immunology). Current Protocols in Science), Vol. 1, 2.5.1-2.6.7 (John Willy & Sons 1991), Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli. Production of monoclonal antibodies against ") DNA Cloning 2: See Expression Systems, 2nd edition, Glover et al. (Co-edition), page 93 (Oxford University Press 1995)).
[0187]
Briefly, a monoclonal antibody confirms the presence of antibody production by injecting a mouse with a composition comprising the zacrp3 gene product, taking a serum sample, and removing the spleen to obtain B lymphocytes. Producing hybridomas by fusing B lymphocytes with myeloma cells, cloning the hybridomas, selecting positive cloning that produces antibodies against the antigen, and producing antibodies against the antigen Can be obtained by culturing clones to be isolated and isolating antibodies from the hybridoma culture.
[0188]
Furthermore, the anti-zacrp3 antibody of the present invention may be derived from a human monoclonal antibody. Human monoclonal antibodies are obtained from transgenic mice that have been engineered to produce specific human antibodies in response to antigenic attack. In this technique, elements of human heavy and light chain loci are introduced into mouse strains derived from embryonic stem cells that contain targeted disruption of endogenous heavy and light chain loci. The transgenic mice can synthesize human antibodies specific for human antigens, and the mice can be used to produce hybridomas that secrete human antibodies. Methods for obtaining human antibodies from transgenic mice are described, for example, by Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994, Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994, and Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994. It is described by.
[0189]
Monoclonal antibodies can be isolated and purified from hybridoma cultures by a variety of well-established techniques. Such isolation techniques include affinity chromatography using protein A sepharose, size exclusion chromatography, and ion exchange chromatography (eg, Coligan, pages 2.7.1-2.12 and 2.9.1-2.9.3). Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pp. 79-104 (The Humana Press 1992)).
[0190]
For special applications, it is desirable to prepare fragments of anti-zacrp3 antibodies. Such antibody fragments can be obtained, for example, by proteolytic hydrolysis of the antibody. Antibody fragments can be obtained by conventional methods by pepsin or papain digestion of whole antibodies. As one illustration, antibody fragments can be produced by enzymatic cleavage of antibodies with pepsin, F (ab ′)₂Supply the 5S fragment that is displayed. This fragment can be further cleaved using a thiol reducing agent, producing a monovalent 3.5 Sfab 'fragment.
[0191]
Optionally, the cleavage reaction can be performed with an inhibitory group for the SH group that results from cleavage of the disulfide bond. Alternatively, enzymatic cleavage with pepsin produces two monovalent Fab fragments and one Fc fragment directly. These methods are described, for example, by Goldenberg, US Pat. No. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman et al., Methods in Enzymology Volume 1, 422 (Academic Press 1967) and Coligan (ibid).
[0192]
Other antibody cleavage methods, such as heavy chain separation to form monovalent L-H chain fragments, further fragment cleavage, or other enzymatic, chemical, or genetic techniques may also be used. May be used as long as it binds to an antigen recognized by the intact antibody.
For example, Fv fragment is V_HAnd V_LIncludes chain association. This meeting is non-covalent as described in Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternatively, the variable chains can be linked by intermolecular disulfide bonds or cross-linked by chemicals such as glutaraldehyde (eg, Sadhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992).
[0193]
Fv fragment is V_HAnd V_LChains may be included and they are connected by a peptide linker. Such a single chain antigen binding protein (scFv) is linked by an oligonucleotide, V_HAnd V_LIt is prepared by constructing a structural gene containing DNA encoding the domain. The structural gene is inserted into an expression vector, which is then introduced into a host cell such as E. coli. A recombinant host cell synthesizes a single polypeptide chain with a linker peptide bridging two V domains. Methods for producing scFv are described, for example, by Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97, 1991, and Bird et al., Science 242: 423, 1988, Ladner et al., US Pat. No. 4,946,778. See also, Pack et al., Bio / Technology 11: 1271, 1993, and Sandhu, ibid.
[0194]
As one illustration, scFv can be obtained by exposing lymphocytes in vivo to zacrp3 peptides and selecting antibody display libraries on phage or similar vectors (eg, immobilized or labeled zacrp3 protein or Through the use of peptides). Genes encoding polypeptides with latent zacrp3 polypeptide binding domains are obtained by screening random peptide libraries displayed on phage (phage display) or on bacteria such as E. coli. Is possible.
[0195]
The nucleotide sequence encoding the polypeptide can be obtained in several ways, such as through random mutagenesis and random polynucleotide synthesis. Such random peptide display libraries screen for peptides that interact with known targets, which can be proteins or polynucleotides, such as ligands or receptors, biological or synthetic macromolecules, or organic or inorganic substances. Can be used as needed.
[0196]
Methods for generating and screening such random peptide display libraries are well known in the art (Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409, Ladner et al., US Pat. No. 4,946,778, Ladner et al., US Pat. No. 5,403,484, Ladner et al., US Pat. No. 5,571,698, and Key et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), and random peptide display libraries and for screening such libraries Kits include, for example, Clontech (Palo Alto, Calif.), Invitrogen (San Diego, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) , And commercially available from Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. (Piscataway, NJ) Random peptide display libraries should be screened using the zacrp3 sequences disclosed herein to identify proteins that bind zacrp3 Is possible.
[0197]
Another form of antibody fragment is a peptide encoding one complementarity determining region (CDR). CDR peptides ("minimal recognition units") can be obtained by constructing a gene encoding the CDR of the antibody of interest. Such genes are prepared, for example, by using the polymerase chain reaction to synthesize variable regions from RNA of antibody-producing cells (eg, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology). 2: 106, 1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application (monoclonal antibodies: production, engineering, and clinical) Applications), Riter et al. (Co-edition), p. 166 (Cambridge University Press 1995), and Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, Monoclonal Antibodies: Princeples and Applications (monoclonal) Antibody: Principles and Applications), Birch et al. (Co-edition), p. 137 (Wiley-Liss). .
[0198]
Alternatively, the anti-zacrp3 antibody may be derived from a “humanized” monoclonal antibody. Humanized monoclonal antibodies are produced by transferring mouse complementarity-determining regions from mouse immunoglobulin H and L variable regions to human variable domains. The typical residues of a human antibody are then replaced in the frame region of the mouse counterpart. The use of antibody components derived from humanized monoclonal antibodies removes the potential problem associated with the immunogenicity of the mouse constant region. General techniques for cloning mouse immunoglobulin variable domains are described, for example, in Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989.
[0199]
Techniques for producing humanized monoclonal antibodies are described, for example, in Jones et al., Nature 321: 522, 1986, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. : 437, 1992, Singer et al., J. Immun. 150: 2844, 1993, Sudhir (eds.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies Engineering ”, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (Co-edition), pages 399-434 (John Willy & Sons 1996), and Queen et al., US Pat. No. 5,693,762 1997).
[0200]
Polyclonal anti-idiotype antibodies may be prepared by immunization of animals with standard techniques using anti-zacrp3 antibodies or antibody fragments. For example, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), Pages 1-12 (Humana Press) 1992). See also Coligan (ibid), pages 2.4.1-2.4.7.
[0201]
Alternatively, monoclonal anti-idiotype antibodies can be prepared using the techniques described above, using anti-zacrp3 antibodies or antibody fragments as the immunogen. As another alternative, humanized anti-idiotype antibodies, or ape anti-idiotype antibodies can be prepared using the techniques described above. Methods for producing anti-idiotype antibodies are described, for example, by Irie, US Pat. No. 5,208,146, Greene et al., US Pat. No. 5,637,677, and Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875, 1996. .
[0202]
A gene encoding a polypeptide having a latent zacrp3 polypeptide binding domain, “binding domain”, is a random or directed peptide library displayed on phage (phage display) or on bacteria such as E. coli Can be obtained by screening. Nucleotide sequences encoding such polypeptides can be obtained in several ways, such as random mutagenesis and random polypeptide synthesis. Alternatively, a constrained phage display library can be produced.
[0203]
Such peptide display libraries are intended to screen for peptides that interact with known targets that can be proteins or polynucleotides, such as ligands or receptors, biological or synthetic macromolecules, or organic or inorganic substances. Can be used. Techniques for generating and screening such peptide display libraries are well known in the art (Ladner et al., US Pat. No. 5,223,409, Ladner et al., US Pat. No. 4,946,778, Ladner et al., US Pat. No. 5,403,484, Ladner Et al., US Pat. No. 5,571,698), and peptide display libraries and kits for screening such libraries are described in, for example, Clontech (Palo Alto, Calif.), Invitrogen (San Diego, Calif.). ), New England Biolabs (Beverly, Mass.), And Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ).
[0204]
Peptide display libraries can be screened using the zacrp3 sequences disclosed herein to identify proteins that bind to zacrp3. These “binding proteins” that interact with the zacrp3 polypeptide can be used in essentially the same way as antibodies.
[0205]
Various assays well known to those skilled in the art can be utilized to detect antibodies and / or binding proteins that specifically bind to zacrp3 protein or peptide. A representative test is described in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (co-edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Representative examples of such assays include: simultaneous immunoelectrophoresis, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, ELISA, dot blotting, Western blot analysis, inhibition or competitor analysis, and sandwich analysis. In addition, antibodies can be screened for binding to wild-type versus mutant-type zacrp3 protein or polypeptide.
[0206]
Antibodies and binding proteins to zacrp3 to target cells that express zacrp3; to isolate zacrp3 by affinity purification; for diagnostic analysis to measure circulating levels of zacrp3 polypeptide; basic pathology or disease To detect or quantify soluble zacrp3 as a marker of; in FACS analysis; for screening expression libraries; for generation of anti-idiotypic antibodies; and for spermatogenesis or in vitro and in vivo May be used as neutralizing antibodies or antagonists to prevent modification of zacrp3 polypeptides for specific activity.
[0207]
Suitable direct tags or labels include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent labels, chemiluminescent labels, magnetic particles, and others; indirect tags or labels as biotin-avidin or intermediates Other complement / anti-complement usage may be featured. Furthermore, antibodies to zacrp3 or fragments thereof may be used in vitro, in assays such as Western blots, or other assays well known in the art, to detect denatured zacrp3 or fragments thereof.
[0208]
The antibodies or polypeptides herein can also be conjugated directly or indirectly to drugs, toxins, radionuclides, etc., and such conjugates are used for in vivo diagnostic or therapeutic applications. It is done. For example, a polypeptide or antibody of the invention can be used to identify or treat a tissue or organ that expresses a corresponding anti-complementary molecule (eg, a receptor or antigen, respectively). More specifically, a zacrp3 polypeptide or anti-zacrp3 antibody, or biologically active fragment or portion thereof, is conjugated to a detectable or cytotoxic molecule, a cell, tissue, or organ that expresses an anti-complementary molecule Can be delivered to mammals having.
[0209]
A further aspect of the invention provides a method for identifying an agonist or antagonist of a zacrp3 polypeptide disclosed in the preamble, wherein the agonist or antagonist has the highly useful properties discussed further herein. You can do it. In one embodiment, providing a cell reactive to a zacrp3 polypeptide agonist, culturing the cell in the presence of a test compound, and culturing the cell response in the presence of a zacrp3 polypeptide. Provided is a method of identifying a zacrp3 polypeptide agonist comprising comparing to a cell and selecting a test compound whose cellular response to it is of the same type.
[0210]
In another embodiment, providing a cell reactive to a zacrp3 polypeptide, culturing a first portion of the cell in the presence of zacrp3, and a second portion of the cell to zacrp3 And a method of identifying an agonist of a zacrp3 polypeptide comprising: culturing in the presence of a test compound; and detecting a decrease in the cellular response of the cell of the second part relative to the first part of the cell. Is provided. In addition to the assays disclosed herein, the sample covers a range of diversity of assays designed to measure receptor binding or stimulation / inhibition of zacrp3-dependent cellular responses for inhibition of zacrp3 activity Can be inspected within.
[0211]
For example, a zacrp3-responsive cell line can be transfected with a reporter gene construct that is reactive against the zacrp3-stimulated cell pathway. This type of reporter gene construct is well known in the art and will generally include a zacrp3-DNA response element operably linked to a gene encoding an assayable protein such as luciferase. . DNA response elements include cyclic AMP response element (CRE), hormone response element (HRE), insulin response element (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-7, 1990), And serum response element (SRE) (Shaw et al., Cell 56: 563-72, 1989), but is not limited to this.
[0212]
Cyclic AMP reaction elements are reviewed in Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (13): 9063-6, 1988 and Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94, 1990. Hormone response elements are reviewed in Beato, Cell 56: 335-44; 1989. Candidate compounds, solutions, mixtures, or extracts are tested for the ability to inhibit the activity of zacrp3 on target cells, as evidenced by a decrease in stimulation by zacrp3 for reporter gene expression. This type of assay will detect compounds that directly block zacrp3 binding to cell surface receptors, as well as compounds that block processes in the cellular pathway following receptor-ligand binding.
[0213]
Alternatively, the compound or other sample is detected with a detectable label (eg,¹²⁵Zacrp3 tagged with I, biotin, horseradish peroxidase, FITC, etc.) can be used to test for direct inhibition of zacrp3 binding to the receptor. Within the scope of this assay, the ability of the test sample to inhibit the binding of labeled zacrp3 to the receptor is indicative of inhibitory activity, which can be confirmed through a secondary test. . The receptor used in the binding assay may be a cellular receptor or an isolated and immobilized receptor.
[0214]
Based on homology to other proteins associated with adipocyte complement, zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists may be used to regulate energy balance in mammals or to protect endothelial cells from damage Can be used. With respect to regulating energy balance, zacrp3 polypeptides regulate cellular metabolic responses. Such metabolic reactions include adipogenesis, glucose production, glycogen production, lipogenesis, glucose uptake, protein synthesis, heat generation, oxygen utilization, and others.
[0215]
The zacrp3 polypeptide may also find use as a neurotransmitter or as a modulator of neurotransmission, as indicated by expression of the polypeptide in tissues associated with the sympathetic or parasympathetic nervous system. In this regard, zacrp3 polypeptides may find utility in regulating nutrient uptake, as explained, for example, by 2-deoxy-glucose uptake in the brain and others.
[0216]
Among other methods well known in the art or disclosed herein, mammalian energy balance may be assessed by monitoring one or more of the following metabolic functions: adipogenesis, Glucose production, glycogen production, lipogenesis, glucose uptake, protein synthesis, heat generation, oxygen utilization, or others. These metabolic functions are monitored by techniques well known to those skilled in the art (assays or animal models), as described more fully below. For example, the glucose-regulating effect of insulin is primarily exerted in the liver, skeletal muscle, and adipose tissue.
[0217]
Insulin binds to its cellular receptor in these three tissues and initiates tissue-specific activities that result, for example, in inhibiting glucose production and stimulating glucose utilization. In the liver, insulin stimulates glucose uptake and inhibits glucose production and glycogen production. In skeletal muscle and adipose tissue, insulin acts to stimulate glucose uptake, storage, and utilization. There are art-recognized methods for monitoring all of the metabolic functions listed in the preamble. Thus, one of ordinary skill in the art can evaluate zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists, and antagonists for metabolic regulatory function. Exemplary adjustment techniques are described below.
[0218]
Adipogenesis, gluconeogenesis and glycogenolysis are interrelated components of the mammalian energy budget, which can be assessed by known techniques using, for example, ob / ob mice or db / db mice. ob / ob mice are inbred mice that are homozygous for an inactivating mutation at the ob (obesity) locus. Such ob / ob mice appear to be hyperphagic and hypometabolic and lack the production of circulating OB protein.
[0219]
A dB / dB mouse is an inbred mouse that is homozygous for an inactivating mutation at the db (diabetes) locus. db / db mice show a phenotype similar to ob / ob mice, except that db / db mice also show a diabetic phenotype. Such db / db mice are believed to resist the action of circulating OB protein. Also, various in vitro methods for evaluating these parameters are known in the art.
[0220]
For example, insulin-stimulated lipid biosynthesis can lead to triglycerides¹⁴By measuring the introduction of C-acetate (Mackall et al., J. Biol. Chem. 251: 6462-4, 1976) or triglyceride accumulation (Kletzien et al., Mol. Pharmacol. 41: 393-8, 1992) Can be monitored.
[0221]
Glucose uptake can be assessed, for example, with analytical methods for insulin-stimulated glucose transport. Non-transfected, differentiated L6 myotubes (retained in the absence of G418) are placed in DMEM containing 1 g / l glucose, 0.5 or 1.0% BSA, 20 mM Hepes and 2 mM glutamine. After 2-5 hours of culture, the medium is replaced with fresh glucose-free DMEM containing 0.5 or 1.0% BSA, 20 mM Hepes, 1 mM pyruvate and 2 mM glutamine. Add the appropriate concentration of insulin or IGF-1, or a dilution series of the test substance and incubate the cells for 20-30 minutes.^ThreeH or¹⁴C-labeled deoxyglucose is added to = 50 1 M final concentration and the cells are incubated for about 10-30 minutes.
[0222]
The cells are then quickly rinsed with cold buffer (eg, PBS) and then lysed with a suitable lysing agent (eg, 1% SDS or 1N-NaOH). The cell lysate is then counted with a scintillation counter. Radioactivity associated with cells is taken as a measure of glucose transport after reducing non-specific binding measured by incubating the cells in the presence of cytochalasin b (an inhibitor of glucose transport). Other methods include, for example, those described by Manchester et al. (Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (insulin-enhanced glucose transport)).
[0223]
Protein synthesis is, for example,³⁵A test cell containing S-methionine; and³⁵After incubation of test cells with S-methionine and a putative modulator of protein synthesis,³⁵It can be evaluated by comparing the precipitation of S-methionine labeled protein.
[0224]
Thermogenesis is described in B. Stanley; C. Billington et al. (Am. J. Am. J., Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides) (edited by W. Colmers and C. Wahlestedt, Humana Press, Ottawa, 1993) pp. 457-509. Physiol. 260: R321, 1991); N. Zarjevski et al. (Endocrinology: 1753, 1993); C. Billington et al. (Am. J. Physiol. 266: R1765, 1994); Heller et al. (Am. J. Physiol 252 (4 part 2): R661-7, 1987); and Heller et al. (Am. J. Physiol. 245: R32l-8, 1983) can be evaluated. Also, metabolic rate (which can be measured by various techniques) is an indirect measure of heat generation.
[0225]
Oxygen availability can be assessed as described by Heller et al. (Pflugers Arch, 369: 55-9 (1977)). This method also included analysis of hypothalamic temperature and metabolic fever production. Oxygen availability and thermoregulation were also evaluated in humans, as described by Haskell et al. (J. Appl. Physiol. 51: 948-54 (1981)).
[0226]
Neural stimulation transmission function can be assessed by monitoring 2-deoxyglucose uptake in the brain. This parameter is monitored by techniques known to those with ordinary skill in the art (animal model assays), eg, autoradiography. Useful monitoring techniques are described, for example, by Kilduff et al. (J. Neurosci. 10: 2463-75, 1990), and related techniques include Gerber et al., Circulation 94: 651-8, 1996 and Fallavollita et al., Circulation 95: 1900-9, used to evaluate the “hibernating heart” described in 1997.
[0227]
Furthermore, zacrp3 polypeptides, fragments, fusion agonists or antagonists thereof can be therapeutically useful for antibacterial purposes. For example, the complement component C1q plays a role in host defense against infectious agents such as bacteria and viruses. C1q is known to exhibit several specialized functions. For example, C1q induces the complement cascade through interaction with binding antibodies or C-reactive protein (CRP).
[0228]
C1q also interacts directly with specific bacteria, RNA viruses, mycoplasma, uric acid crystals, lipid A components of bacterial endotoxins and specific organelle membranes. C1q binding to the C1q receptor is thought to promote phagocytosis. C1q also appears to enhance the antibody-forming aspects of the host defense system. See, for example, Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 2 (11): 933-41 (1993). Thus, soluble C1q-like molecules would be useful as antibacterial agents that promote cytolysis or phagocytosis of infectious agents.
[0229]
Zacrp3 fragments, as well as zacrp3 polypeptides, fusion proteins, agonists, antagonists or antibodies, can be evaluated for their antimicrobial properties according to procedures known in the art. For example, Barsum et al., Eur. Respir. J.8 (5): 709-14 (1995); Sandovsky-Losica et al., J. Med. Vet. Mycol. (UK) 28 (4): 279-87 (1990) Mehentee et al., J. Gen. Microbiol. (UK) 135 (Part 8): 2181-8 (1989); Segal and Savage, J. Med. Vet. Mycol. 24: 477-9 (l986) And similar references.
[0230]
If necessary, the performance of zacrp3 in this regard should be compared to proteins known to be functional in this regard, such as proline-rich proteins, lysozyme, histatin, lactoperoxidase or the like Can do. Furthermore, zacrp3 fragments, polypeptides, fusion proteins, agonists, antagonists or antibodies can be evaluated in combination with one or more antibacterial agents to confirm a synergistic effect. One of ordinary skill in the art will appreciate that the antimicrobial properties of zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, agonists, antagonists and antibodies can be assessed as well.
[0231]
As a neurotransmitter or neurostimulatory modulator, like a zacrp3 polypeptide, fusion protein, agonist, antagonist or antibody, a zacrp3 polypeptide fragment of the invention may also contain calcium ion concentration, muscle contraction, hormone secretion, DNA synthesis (or DNA synthesis (or Cell growth), inositol phosphate turnover, arachidonate release, phospholipase C activation, gastric emptying, human neutrophil activation (or ADCC ability), superoxide anion production and the like it can. These properties can be evaluated by known methods such as those described herein.
[0232]
The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, antibodies, agonists or antagonists on intracellular calcium concentration is determined in this technology, such as the method described by Dobrzanski et al. (Regulatory Peptides 45; 341-52, 1993). It can be evaluated by known methods. The effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on muscle contraction are described in Smiths and Lebebvre (J. Auton. Pharmacol. 14: 383-92, 1994), Belioli et al. (J. Vet. Pharmacol. Therap. 17 : 379-83, 1994), Maggi et al. (Regulatory Peptides 53: 259-74, 1994) and the like, and can be evaluated by methods known in the art.
[0233]
The effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on hormone secretion are described by Henriksen et al. (J. Recep. Sig. Transd. Res. 15 (1-4): 529-41, 1995) and others. It can be assessed by methods known in the art, such as methods for prolactin release. The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on DNA synthesis or cell growth is known in the art, such as the method described by Dobrzanski et al. (Regulatory Petides 45: 341-52, 1993). It can be evaluated by the methods that are used.
[0234]
The effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on inositol phosphate turnover are known in the art, such as the method described by Dobrzanski et al. (Regulatory Peptides 45: 341-52, 1953). It can be evaluated by the methods that are used.
[0235]
Also, the effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on arachidonic acid salt release can be achieved in this technology, such as the method described by Dobrzanski et al. (Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993). It can be evaluated by known methods. The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on phospholipase C activation is known in the art, such as the method described by Dobrzanski et al. (Regulatory Peptides 45: 341-52, 1993) and others. The method can be evaluated.
[0236]
The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on gastric emptying has been demonstrated in this technology, such as the method described by Varga et al. (Eur. J. Pharmacol. 286: 109-112, 1995) and others. Can be evaluated by methods known in the art. The effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on human neutrophil activation and ADCC ability are described in books such as those described by Wozniak et al. (Immunology 78: 629-34, 1993). It can be evaluated by methods known in the art. The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on superoxide anion production is known in the art, such as the method described by Wozniak et al. (Immunology 78: 629-34, 1993). It can be evaluated by a method.
[0237]
Collagen is a potent inducer of platelet aggregation. This poses a danger for patients recovering from vascular wounds. Inhibitors of collagen-induced platelet aggregation are useful for blocking the binding of platelets to the surface of a collagen coating and reducing the associated collagen-induced platelet aggregation. C1q is a component of the complement pathway that has been shown to stimulate the production of toxic oxygen species that cause tissue damage and stimulate defense mechanisms (Tenner, BehringInst. Mitt. 93: 241-53, 1993). The C1q binding site is on the platelets.
[0238]
C1q, independent of immune binding partners, was found to inhibit platelet aggregation without inhibiting platelet attachment or morphological changes. The amino terminal region of C1q shares homology with collagen (Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 145: 2984-88, 1990). Inhibition of the C1q and complement pathway can be achieved by methods disclosed herein or known in the art, as described in Suba and Csako, J. Immunol. 117: 304-9 (1976). It can be measured by using.
[0239]
The effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on collagen-mediated platelet attachment, activation and aggregation are described in the platelet aggregation assay (Chiang et al., Thrombosis Res. 37: 605-12, 1985) and platelets. It can be assessed by using methods disclosed herein or known in the art, such as an attachment assay (Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol. 144; 221-25, 1990). Assays for platelet attachment to collagen and inhibition of collagen-induced platelet aggregation are described in Keller et al., J. Biol. Chem. 268: 5450-6, 1993; Waxman and Connolly, J. Biol. Chem. 268: 5445- 9, 1993; Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269: 5050-3, 1994 or Deckmyn et al., Blood 85: 712-9, 1995. it can.
[0240]
The effect of zacrp3 polypeptides, fragments, fusions, agonists or antagonists on aortic ring vasodilation is the method of Dainty et al. (J. Pharmacol. 100: 767, 1990) and Rhee et al. (Neurotox.l6: 179, 1995). Can be measured according to
[0241]
A variety of in vitro and in vivo models are available for assessing the effects of zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists and antagonists on ischemia and reperfusion injury. For example, Shandelya et al., Circulation 88: 2812-26, 1993; Weisman et al., Science 249: 146-151, 1991; Buerke et al., Circulation 91; 393-402, 1995; Horstick et al., Circulation 95: 70l-8 1997, and Burke et al., J. Phar. Exp. Therp. 286: 429-38, 1998. In vitro hamster platelet aggregation assays have been described by Deckmyn et al. Hamster and baboon bleeding times can be measured after injection of zacrp3 polypeptide using the model described by Deckmyn et al.
[0242]
Thrombus development in response to administration of the protein of the present invention can be measured using the hamster femoral vein thrombosis model provided by Deckmyn et al. Changes in platelet adhesion under flow conditions following administration of zacrp3 can be measured using the method described in Harsfalvi et al., Blood 85: 705-11, 1995.
Complement inhibition and wound healing can be zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists or antagonists, alone or other known inhibitors of collagen-induced platelet activation and aggregation (eg, palldipin, moubatin or calin) and analyzed.
[0243]
Zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists or antagonists are, for example, porcine dermal layer healing (Lynch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7696-700, 1987) and genetically. Methods described herein or known in the art, such as those described in full-thickness skin wounds in mice with diabetes (Greenhalgh et al., Am. J. Pathol. 136: 1235-46, 1990) Can be evaluated. The polypeptides of the present invention can be analyzed alone or in combination with other known complement inhibitors as described above.
[0244]
Radiation hybrid mapping is a somatic genetic technique developed to create high-resolution continuous maps of mammalian chromosomes (Cox et al., Science 250: 245-50, 1990). Partial or complete knowledge of the gene sequence allows the design of PCR primers suitable for use with chromosomal radiation hybrid mapping panels. Commercially available radiation hybrid mapping panels covering all human genomes are available, such as the Stanford G3 Rh panel and the GeneBridge 4RN panel (Research Genetics, Inc. Huntsville, Alab.).
[0245]
These panels allow for rapid, PCR-based chromosomal localization and sequencing of genes, sequence tag sites (STSs) and non-polymorphic and polymorphic markers within the region of interest. This involves establishing a directly proportional physical distance between the newly discovered gene of interest and the previously mapped marker. Accurate knowledge about the location of a gene is useful in many ways, including: 1) Determine whether the sequence is part of an existing contig and YAC-, SAC- or cDNA clones Obtaining additional surrounding gene sequences in various forms such as 2) providing possible candidate genes for hereditary diseases exhibiting linkage to the same chromosomal range, and 3) specific For cross-referencing model organisms, such as mice, that can be beneficial in helping to determine what functions a gene can have.
[0246]
The results showed a linkage of Zacrp3 to the framework marker SHGC-56588 of human chromosome 5 at a LOD score of 15.58 and 0 cR — 10000 away from the marker. The use of surrounding markers positions Zaclp3 in the 5p12 region on the map of total LDB human chromosome 5. The present invention also provides a reagent used for diagnostic applications. For example, a zacrp3 gene, a probe containing zacrp3 DNA or RNA, or a subsequence thereof, can be used to determine whether the zacrp3 gene is present on chromosome 5 or whether a mutation has occurred. Can be used.
[0247]
Detectable chromosomal abnormalities at the zacrp3 locus include, but are not limited to, aneuploidy, gene copy number changes, insertions, deletions, restriction site changes and rearrangements. These abnormalities can occur within the coding sequence, including the upstream promoter and control region, within the intron, or within the flanking sequences, and can be a physical change within the coding sequence or It can appear within a range as a change in the current quantity of the gene.
[0248]
In general, these diagnostic methods consist of the following steps: (a) obtaining a genetic sample from the patient; (b) in order to generate a first reaction product, the polynucleotide is complementary to a complementary polynucleotide sequence. Incubating the gene sample with a polynucleotide probe or primer as described above under conditions that cause fusion; and (iii) comparing the initial reaction product to a control reaction product. Differences between the initial reaction product and the control product suggest a genetic abnormality in the patient. Genetic samples for use within the scope of the present invention include genomic DNA, cDNA and RNA.
[0249]
The polynucleotide probe or primer can be RNA or DNA and consists of a portion of SEQ ID NO: 1, the complement of SEQ ID NO: 1 or its RNA equivalent. Appropriate analytical methods in this regard include molecular genetic techniques known to those in the art, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, short tandem repeats using PCR techniques ( STR) analysis, ligation chain reaction (Barany, PCR Methods and Applications 1: 5-16, 1991), ribonuclease protection assay, and other gene binding analysis techniques known in the art (Sambrook et al., Ibid .; Ausubel et al., Ibid; Marian, Chest 108: 255-65, 1995).
[0250]
Ribonuclease protection assays (eg, Ausubel et al., Ibid., Chapter 4) consist of hybridization of an RNA probe to a patient RNA sample, after which the reaction product (RNA-RNA hybrid) is exposed to RNase. The hybridization region of ribosomal ribonucleic acid is protected from digestion. Within the scope of PCR analysis, a patient's gene sample is incubated with a pair of polynucleotide primers, and the region between the primers is amplified and restored. A change in the size or amount of product recovered suggests a mutation in the patient. Another PCR-based technique that can be used is single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis (Hayashi, PCR Methods and Applications 1: 34-8, 1991).
[0251]
Zacrp3 polypeptides can be used to analyze the energy efficiency of mammals. Zacrp3 polypeptides found in serum or tissue samples indicate a mammal's ability to store food, with mammals having a higher capacity being more prone to obesity. More specifically, the present invention provides:
Exposing the sample, possibly containing the zacrp3 polypeptide, to an antibody attached to a solid support wherein the antibody is bound to an epitope of the zacrp3 polypeptide;
[0252]
Washing the immobilized antibody-polypeptide to remove unbound impurities;
Exposing the immobilized antibody polypeptide to a second antibody directed to a second epitope of the zacrp3 polypeptide, wherein the second antibody is associated with a detectable label; and
A method for detecting a zacrp3 polypeptide comprising detecting a detectable label is contemplated. The concentration of zacrp3 polypeptide in the test sample appears to indicate the energy efficiency of the mammal.
[0253]
This finding can aid in nutritional analysis of mammals. In some cases, this finding may be useful in identifying and / or targeting under-energy tissues.
[0254]
A further aspect of the invention provides a method for studying insulin. Such a method of the present invention comprises incubating adipocytes in a medium containing zacrp3 polypeptide, monoclonal antibody, agonist or antagonist ± insulin and observing changes in adipocyte protein secretion or differentiation To do.
[0255]
Antimicrobial protective agents can work directly, but can also work indirectly. Such agents that work through a membrane-related or operative pore-forming mechanism adhere directly to annoying microorganisms. Antibacterial agents also work through enzymatic mechanisms to destroy microbial protective substances or their cell walls / membranes. Antibacterial agents that inhibit microbial growth or action, or disrupt whole microorganisms by either mechanism described above, are useful in methods to prevent contamination of cell culture by microorganisms that are susceptible to antibacterial action . Such techniques include culturing the cells in the presence of an effective amount of the zacrp3 polypeptide, or agonist or antagonist thereof.
[0256]
The zacrp3 polypeptide or agonist thereof can also be used as a cell culture reagent in in vitro experiments for exogenous microbial infections such as bacterial, viral or fungal infections. Such parts can also be used in in vivo animal models of infection.
The present invention also provides a method for studying the metabolism of mammalian cells. Such a method of the invention comprises incubating the cells to be studied, eg human vascular endothelial cells, ± zacrp3 polypeptide, monoclonal antibody, agonist or antagonist thereof, and adipogenesis, gluconeogenesis, glycogenolysis, lipids Consists of observing changes in biosynthesis, glucose uptake, or the like.
[0257]
A further aspect of the invention provides a method for studying dimerization or oligomerization. Such a method of the invention comprises incubating a zacrp3 polypeptide or fragment or fusion protein thereof comprising a collagen-like domain, alone or in combination with other polypeptides having a collagen-like domain, and between collagen-like domains. It consists of observing the meetings that are made. Such association is indicated by HPLC, circular dichroism and the like.
[0258]
The Zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists or antagonists of the present invention can be attached to and activated by reducing the number of platelets and the size of platelet aggregates, thereby reducing blood in the mammalian vasculature. It can be used in a method to promote flow. Used for such purposes, Zacrp3 can be administered before, during, or after acute vascular injury in mammals. Vascular damage can be due to vascular remodeling including, but not limited to, vascular graft angioplasty, coronary artery bypass grafting, microvascular recovery or anastomosis.
[0259]
Vascular damage due to trauma, stroke or aneurysm is also considered. In other preferred methods, the vascular injury is due to plaque rupture, vascular deterioration, complications associated with diabetes and atherosclerosis. Plaque rupture in the coronary arteries induces heart failure, which in the cerebral arteries induces stroke. The use of zacrp3 polypeptides, fragments, fusion proteins, antibodies, agonists or antagonists in such a method can eliminate all vascular system diseases associated with the immune system, such as disseminated intravascular coagulation (DIC) and SID. It is also useful for improvement. Moreover, complements that suppress activity are useful for treating non-vascular immune diseases such as arteriole sclerosis.
[0260]
A correlation was found between the presence of C1q in focal ischemic myocardium and leukocyte accumulation following coronary occlusion and reperfusion. Release of cellular constituents following tissue damage induces complement activation resulting in toxic oxygen products that can be a major cause of myocardial damage (Rossen et al., Circ. Res. 62: 572-84, 1998 And Tenner, ibid). Blocking the complement pathway was found to protect the ischemic myocardium from reperfusion injury (Buerke et al., J. Pharm. Exp. Therp. 286: 429-38, 1998). Proteins having complement inhibition and C1q binding activity would be useful for such purposes.
[0261]
Collagen and C1q binding capacity of adipocyte complement-related protein homologues such as zacrp3 prevents damage to suppress activation of inflammatory processes leading to platelet attachment, activation or aggregation, and release of toxic oxygen products Useful for healing received collagenous tissue. By inactivating exposed tissue against processes such as complement activity, thrombotic activity and immune activation, the deleterious effects of ischemia and reperfusion are reduced. In particular, such trauma includes trauma related to traumatic trauma ischemia, bowel strangulation and blood flow pre- and post-establishment. Such polypeptides are used in the treatment of cardiopulmonary bypass ischemia and recesitation, myocardial infarction and posttraumatic vasospasm, such as stroke or percutaneous transluminal angioplasty, as well as accidental or surgically induced vascular injury. Useful.
[0262]
Moreover, such collagen-binding and C1q-binding polypeptides can soften prosthetic biomaterials and surgical devices to inactivate the surface of the material against complement activation, thrombus formation activity or immune activation Useful for. Such materials include, but are not limited to, collagen or collagen fragment coated biomaterials, gelatin coated biomaterials, fibrin coated biomaterials, fibronectin coated biomaterials, heparin coated biomaterials, collagen and gel coated stents, arterial implants , Synthetic heart valve, artificial organ or 1 × 10⁸Any prosthetic article that is exposed to blood that binds zsig37 to a greater percentage is included. Coating such materials can be done using methods known in the art. See, for example, Rubens, US Pat. No. 5,272,074.
[0263]
Complement and C1q play a role in inflammation. Complement activation is initiated by the binding of C1q to immunoglobulin (Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12: 933-41, 1993; Ward and Ghetie, Therap. Immunol. 2: 77-94, 1995). C1q and complement inhibitors are useful as anti-inflammatory agents. Such an application can be made to prevent infection. Moreover, such inhibitors can be administered to a person suffering from inflammation mediated by complement activation and binding of immune complexes to C1q. C1q and complement inhibitors are useful in methods that result in wound repair and promote progression in wound healing by overcoming impaired wound healing. The progress of wound healing includes factors such as inflammation, fibroblast recruitment, wound regression and reduced infection.
[0264]
The ability of tumor cells to bind to collagen can contribute to tumor metastasis. Inhibitors of collagen binding are useful to effect tumor adhesion interactions and spread by metastasis (Noeske-Jungbult et al., US Pat. No. 5,723,312).
[0265]
Furthermore, zacrp3 polypeptides, fragments, fusion agonists or antagonists thereof can be therapeutically useful for antibacterial applications. For example, the complement component C1q plays a role in host defense against infectious agents such as bacteria and viruses. C1q is known to exhibit several specialized functions. For example, C1q induces the complement cascade through interaction with binding antibodies or C-reactive protein (CRP). C1q also interacts directly with specific bacteria, RNA viruses, mycoplasma, uric acid crystals, lipid A component of bacterial endotoxins and specific organelle membranes. C1q binding to the C1q receptor appears to promote phagocytosis. C1q also seems to enhance the antibody-forming aspects of the host defense system. See, for example, Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12 (ll): 933-4l, 1993. Thus, soluble C1q-like molecules can be useful as antibacterial factors and promote cytolysis or phagocytosis of infectious agents.
[0266]
Positively charged, extracellular, helical, C1q and macrophage scavenger receptor collagen domains have been determined to play a role in ligand binding and have broad binding specificity for polyanions (Acton et al., J. Biol. Chem. 268: 3530-37, 1993). Lysophospholipid growth factor (lysophosphatidic acid, LPA) and other mitogenic anions are localized at the site of damaged tissue and help repair the wound. LPA exerts many biological effects, including platelet activation and the mechanism of increasing matrix aggregates. LPA is thought to synergize with other blood clotting factors and mediate wound healing.
[0267]
Collagen domains of proteins such as C1q and macrophage scavenger receptors are known to bind acidic phospholipids such as LPA. The interaction of a zacrp3 polypeptide, fragment, fusion, agonist or antagonist with a mitogenic anion, such as LPA, is measured using analytical methods known in the art (see, eg, Acton et al., ibid.). can do. Inhibition of inflammatory processes by the polypeptides and antibodies of the present invention is also useful in preventing infection at the wound site.
[0268]
For pharmaceutical use, the protein of the present invention can be formulated with a pharmaceutically acceptable base for parenteral, oral, nasal, rectal, topical, transdermal administration, etc. . In a preferred embodiment, administration is at or near the site of vascular injury. In general, pharmaceutical formulations contain zacrp3 protein in combination with pharmaceutically acceptable excipients (eg, saline, buffered saline, 5% aqueous dextrose or the like). The formulation can further include one or more excipients, preservatives, solubilizers, buffers, albumin that prevents loss of protein onto the vial surface, and the like.
[0269]
Methods of formulation are well known in the art and are described, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, edited by Gennaro, Mack Publishing Co. Easton, Pennsylvania, 19th edition, disclosed in 1995. The dose of treatment will generally be determined by the clinician according to accepted criteria, taking into account the nature and severity of the condition to be treated, the patient constitution, etc. Dosage determination is within the normal skill level of the present technology.
[0270]
As used herein, a “pharmaceutically effective amount” of a zsig37 polypeptide, fragment, fusion protein, agonist or antagonist is an amount sufficient to induce the desired biological result. The result is a symptom, symptom or cause alleviation of the disease, or some desirable change in the biological system. For example, an effective amount of a zacrp3 polypeptide is an amount that provides subjective relief of symptoms, or an objectively identifiable improvement, as noticed by a clinician or other qualified witness. Such effective amounts of zacrp3 polypeptide include, for example, activation of collagen-activated platelets and inhibition of complement pathways, including C1q, increased local blood flow in the patient's blood vessels, and / or Leading to a reduction in the detrimental effects of ischemia and reperfusion.
[0271]
The effective amount of zacrp3 polypeptide may vary widely depending on the disease or condition to be treated. The amount of polypeptide administered and its concentration in the formulation will depend on the excipient chosen, the route of administration, the potency of the particular polypeptide, the patient's clinical condition, side effects and the stability of the compound in the formulation. . Thus, depending on the clinical experience with the patient in question or with a similar patient, the clinician will use an appropriate formulation that includes the appropriate concentration in the formulation along with the amount of formulation administered.
[0272]
Such amount will depend to some extent on the particular condition to be treated, age, weight and general health of the patient, as well as other factors apparent to those skilled in the art. Generally, the dose is in the range of 0.01-100 mg / kg of the patient. For applications such as balloon catheters, the typical dose range is 0.05-5 mg / kg of the patient. The dose for a particular compound is determined from in vitro or in vitro studies combined with laboratory animal studies. The concentration of the compound found to be effective in vitro or in vitro provides guidance for animal studies, where the dose is calculated to provide a comparable concentration at the point of action. The
[0273]
Polynucleotides encoding zacrp3 polypeptides are useful within gene therapy applications where it is desired to increase or suppress zacrp3 activity. If the mammal has a mutated or deleted zacrp3 gene, the zacrp3 gene can be introduced into mammalian cells. In one embodiment, the gene encoding zacrp3 polypeptide is introduced into a viral vector in vivo. Such vectors include, for example, but are not limited to, attenuated or deficient such as herpes simplex virus (HSV) papillomavirus, Epstein Barr virus (EBV), adenovirus, adeno-associated virus (AAV), etc. Includes DNA viruses.
[0274]
A defective virus that completely or almost completely lacks the viral gene is preferred. The defective virus is not contagious after introduction into the cell. The use of defective viral vectors allows administration to a specific, limited area of cells without concern that the vector can infect other cells. Examples of specific vectors include, but are not limited to, defective herpes simplex virus 1 (HSV1) vector (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991); Stratford-Perricaudet et al. (J. Attenuated adenoviral vectors, such as those described by Clin. Invest. 90: 626-30, 1992); and defective adeno-associated viral vectors (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-101, 1987). Year; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-8, 1989).
[0275]
In another embodiment, the zacrp3 gene is, for example, Anderson et al. (US Pat. No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33: 153, 1983; Temin et al., US Pat. No. 4,650,764; Temin et al., US Pat. No. 4,980,289. Markowitz et al., J. Virol. 62: l120, 1988; Temin et al., US Pat. No. 5,124,263; WIPO publication WO 95/07358; and Kuo et al., Blood 82: 845, 1993. It can be introduced into retroviral vectors.
[0276]
Alternatively, the vector can be introduced by in vivo lipofection using liposomes. Synthetic cationic lipids can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of genes encoding markers (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988). The use of lipofection to introduce exogenous genes into specific organs in the body has several practical advantages.
[0277]
Molecular targeting of liposomes to specific cells represents one area of advantage. More specifically, directing transfection to specific cells represents one area of benefit. For example, directing transfection to specific cell types is particularly advantageous in tissues with cellular heterogeneity, such as pancreas, liver, kidney and brain. Lipids can be chemically linked to other molecules for targeting purposes. Targeted peptides (eg, hormones or neurotransmitters), proteins such as antibodies, or non-peptide molecules can be chemically linked to liposomes.
[0278]
It is possible to remove target cells from the body, introduce the vector into a naked DNA plasmid, and then re-implant the transformed cells into the body. Naked DNA vectors for gene therapy can be obtained by methods known in the art, such as transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, gene gun utilization or DNA It can be introduced into a desired host cell by utilizing a vector transporter. See, for example, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: l4621-4, 1988.
[0279]
Antisense techniques can be used to suppress zacrp3 gene transcription, such as to suppress cell growth in vivo. A polynucleotide that is complementary to a segment of a polynucleotide that encodes zacrp3 (eg, the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1) binds to an mRNA that encodes zacrp3, and Designed to suppress translation. Such antisense polynucleotides are used to suppress the expression of genes encoding zacrp3 polypeptides in cell culture or patients.
[0280]
Generating transgenic mice designed to express the zacrp3 gene and mice exhibiting a complete lack of zacrp3 gene function, referred to as “knockout mice” (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992) (Lowell et al., Nature 366: 740-42, l993). These mice can be used to study the zacrp3 gene and proteins encoded thereby in in vivo systems.
[0281]
The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.
Example 1.Zacrp3 Chromosome assignment and arrangement
Zacrp3 was mapped to human chromosome 5 by using a commercial version of the Stanford G3 radiation hybrid mapping panel (Research Genetics, Inc. Huntsville, Alab.). The Stanford G3 RH panel contains PCR-capable DNA from each of the 83 radiation hybrid clones of the entire human genome, plus two control DNAs (RM donor and A3 recipient). A publicly available WWW server (http://shgc-www.stanford.edu) permits the location of the marker chromosome.
[0282]
For mapping zacrp3 by the Stanford G3 RH panel, 20 μl of the reaction was placed in a 96-well microtiter plate (Stratagene, La Jolla, Calif.) And used in a RoboCycler Gradient 96 thermal cycler (Stratagene). Each of the 85 PCR reactions was 2 μl of 10 × KlenTaq PCR reaction buffer (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, Calif.), 1.6 μl of dNTP mix (2.5 mM, PERKIN-ELMER, Foster City, Calif.), 1 μl Sense primer, ZC 21,913 (SEQ ID NO: 13), 1 μl antisense primer, ZC 21,914 (SEQ ID NO: 14), 2 μl RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0.4 μl 50X Advantage KlenTaq DNA polymerase mix (Clontech Laboratories , Inc.), 25 ng of individual hybrid clones or control DNA, and ddH for a total volume of 20 μl₂Consists of O.
[0283]
The reaction was covered with an equal amount of mineral oil and sealed. PCR cycler conditions were as follows: initial cycle 1 cycle at 94 ° C for 5 minutes denaturation, 35 cycles of denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 45 ° C for 45 seconds and 1 at 72 ° C. Extend for 15 minutes per minute and then extend once at 72 ° C for 7 minutes. Reactions were separated by electrophoresis on a 2% agarose gel (Life Technologies, Gatorsburg, MD).
[0284]
The results showed an LOD score of 15.58 and a linkage of Zacrp3 to the human chromosome 5 framework marker SHGC-56588 at a distance of 0 cR — 10000 from the marker. By using peripheral markers, in the 5p12 region on the LDB human chromosome 5 general map (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/) The position of Zacrp3 is determined.
[0285]
Example 2.Zacrp3 Baculovirus expression
In insect cells, an expression vector pzacrp3cee was prepared that expresses a human zacrp3 polypeptide with a carboxy-terminal Glu-Glu tag.
A.pzacrp3cee Building
A 766 bp fragment containing the sequence of zacrp3 (SEQ ID NO: 1) and the polynucleotide sequence encoding the BamHI and Xba1 restriction sites at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively, was obtained using primer ZC23377 (SEQ ID NO: 15). It was generated by PCR amplification from a plasmid containing zacrp3 cDNA.
[0286]
The PCR reaction conditions were as follows: 94 ° C, 1 cycle for 4 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C, 45 seconds, 50 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes; 72 ° C for 10 minutes 1 Cycle followed by 4 ° C immersion. Fragments were visualized by gel electrophoresis (1% Seaplaque / 1% NuSieve). Cut the band, 2mM MgCl₂It was diluted with 0.5% agarose containing lysate, dissolved at 65 ° C., and ligated to a baculovirus expression donor vector (pZBV32L) digested with BamHI / Xba1. pZBV32L vector is pFastBacl^TM(Life Technologies) A variant of the expression vector.
[0287]
Here, the polyhedron facilitator is deleted, replaced with a later activated basic protein promoter, and the coding sequence for the Glu-Glu tag (SEQ ID NO: 17) as well as the termination signal is the multiple clone region Is inserted at the 3 'end. About 11 nanograms of zacrp3 insert digested with restriction enzymes and about 23 ng of the corresponding vector were ligated overnight at 16 ° C. The ligation mix was diluted 3-fold in TE (10 mM Tris-HC1, pH 7.5 and 1 mM EDTA) and 4 fmol of the diluted ligation mix was added for 45 seconds in a 42 ° C. water bath according to the manufacturer's instructions. The cells were converted into DH5α library efficient competent cells (Life Technologies) by heat shock.
[0288]
The converted DNA and cells were treated with SOC medium (2% Bacto Tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 10 ml 1M NaC1, 1.5 mM KC1, 10 mM MgCl.₂, 10 mM MgSO_Four, And 20 mM glucose) were diluted in 450 μl and plated on LB plates containing 100 μg / ml ampicillin. Clones were analyzed by restriction enzyme digests and 1 μl of positive clones were transferred to a 20 μl DH10Bac maximal efficiency competent cell (GIBC0-BRL, Gator, MD) by heat shock for 45 seconds in a 42 ° C. water bath according to the manufacturer's instructions. Converted to Sberg).
[0289]
The transformed cells were then transformed into SOC medium (2% Bacto Tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1M NaCl 10ml, 1.5mM KC1, 10mM MgCl₂, 10 mM MgSO_Four, And 20 mM glucose) diluted in 980 μl and grown in a shaking incubator at 37 ° C. for 4 hours, Luria agar containing 50 μg / ml kanamycin, 7 μg / ml gentamicin, 10 μg / ml tetracycline, IPTG and Bluo Gal Plated on a plate. Plated cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours. Color selection was used to identify cells with zacrp3cee encoding the donor insert integrated into the plasmid (referred to as “bacmid”).
[0290]
Those colonies (which were white) were picked for analysis. Bacmid DNA was isolated from positive colonies using the QiaVac Miniprep8 system (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Growing DNA by using primers to transposable elements in bacmid by PCR using primers ZC447 (SEQ ID NO: 18) and ZC976 (SEQ ID NO: 19) and screening clones for correct inserts did. The conditions for the PCR reaction were as follows: 35 cycles of 94 ° C. for 45 seconds, 50 ° C. for 45 seconds and 72 ° C. for 5 minutes, one cycle of 72 ° C. for 10 minutes, followed by immersion at 4 ° C. The PCR product was run on a 1% agarose gel to check the insert size. A product with the correct insert was used to transfect Spodoptera frugiperda (Sf9) cells.
[0291]
B.Transfection
Sf9 cells at 5 x 10 per 35mm plate⁶Cells were seeded at a rate of 1 cell and allowed to attach for 1 hour at 27 ° C. Five microliters of bacmid DNA was diluted with 100 μl of Sf-900 II SFM (Life Technologies). 6 μl of CellFECTIN reagent (Life Technologies) was diluted with 100 μl of SF-900 II SFM. The bacmid DNA and lipid solution were gently mixed and incubated at room temperature for 30-45 minutes. The medium from one plate of cells was aspirated and the cells were washed once with 2 ml of fresh SF-900II SFM medium. 800 microliters of SF-900 II SFM was added to the lipid-DNA mixture. Wash medium was aspirated and DNA-lipid mix was added to the cells. The cells were cultured at 27 ° C. for 4-5 hours. The DNA-lipid mix was aspirated and 2 ml of Sf-900 II medium was added to each plate. The plate was incubated at 27 ° C. and 90% humidity for 96 hours, after which the virus was harvested.
[0292]
C.Primary amplification
Sf9 cells are approximately 0.41-0.52 x 10 in 50 ml Sf-900 II SFM in a 125 ml shake flask.^FiveGrow to cell / ml density. They were then infected with 150 μl of the virus stock solution described above and incubated at 27 ° C. for 3 days, after which the virus was harvested according to standard methods known in the art.
[0293]
Example 3.Baculovirus expression Glu-Glu With zacro3 Purification of polypeptides
Unless otherwise stated, all operations were performed at 4 ° C. A mixture of protease inhibitors is added to a 2 liter sample of conditioned medium from zacrp3 baculovirus infected Sf9 cells with Glu-Glu (EE) at the C-terminus, and 2.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Sigma Chemical Co. Missouri). St. Louis, USA), 0.001 mM Leupeptin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM pepstatin (Boehringer-Mannheim) and 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim).
[0294]
Samples were placed in a Beckman JLA-10.5 rotor (Beckman Instruments) in a Beckman Avanti J251 centrifuge (Beckman Instruments) and centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. to remove cell fragments. A 50.0 ml sample of anti-EE Sepharose prepared as follows is added to the supernatant fraction, and the mixture is gently shaken for 18.0 hours at 4 ° C. on a roller incubator at Wheaton (Millville, NJ). did.
[0295]
The mixture was poured into a 5.0 × 20.0 cm Econo-Column (Bio-Rad Laboratories) and the gel was washed with 30 column volumes of phosphate buffered saline (PBS). The passing fraction that did not stay was discarded. When the 280 nm absorbance of the eluate is less than 0.05, the flow through the column is zero, and an anti-EE Sepharose gel is added to a 2.0 column of PBS containing 0.2 mg / ml EE peptide (AnaSpec, San Jose, CA). Washed by volume. The peptide used has the sequence Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp (SEQ ID NO: 20). After 1.0 hour at 4 ° C., flow resumed and the eluted protein was collected. This fraction was named peptide eluate. Anti-EE Sepharose gel was washed with 2.0 column volumes of 0.1 M glycine (pH 2.5) and the glycine wash was collected separately.
[0296]
The pH of the glycine elution fraction was adjusted to 7.0 by adding a small amount of 10X PBS and stored at 4 ° C. The peptide eluate was concentrated to 5.0 ml using a membrane concentrator (Millipore) with a molecular weight of 5,000 according to the manufacturer's instructions. The concentrated peptide eluate was chromatographed on a 1.5 x 50 cm Sephadex G-50 (Pharmacia) column equilibrated in PBS using a BioCad Sprint HPLC (PerSeptive BioSystems) at a flow rate of 1.0 ml / mm. Separated from free peptide. 2 ml fractions were collected and the absorbance at 280 nm was monitored. The first peak of material that collected at 280 nm and eluted near the void volume of the column was collected. This material corresponded to purified zacrp3CEE and consisted of two major bands of distinct molecular weight.
[0297]
Anti EE Sepharose preparation
A 100 ml bed volume of protein G-Sepharose (Pharmacia) was washed with 100 ml of PBS containing 0.02% sodium azide using a 500 ml Nalgene 0.45 micron filter. The gel was washed with 6.0 volumes of 200 mM triethanolamine, pH 8.2 (TEA, Sigma) and an equal volume of EE antibody solution containing 900 mg of antibody was added. After overnight incubation at 4 ° C., unbound antibody was removed by washing with 5 volumes of 200 mM TEA as described above.
[0298]
The resin was resuspended in 2 volumes of TEA, transferred to a suitable container, and dimethylpimilimidate-2 HCl (Pierce) was dissolved in TEA and added to a gel with a final concentration of 36 mg / ml. The gel was shaken for 45 minutes at room temperature and the liquid was removed using a filtration device as described above. Nonspecific sites on the gel were blocked by incubating for 10 minutes at room temperature with 5 volumes of 20 mM ethanolamine in 200 mM TEA. The gel was then washed with 5 volumes of PBS containing 0.02% sodium azide and stored in this solution at 4 ° C.
[0299]
Example 4.Adhesion molecule assay
Upon stimulation with inflammatory cytokines such as TNF (Tumor Necrosis Factor), human microvascular bone marrow cells (TRBMEC) become E-selectin (endothelial leukocyte adhesion molecule), V-CAM (vascular cell adhesion molecule) and I -Express cell surface adhesion molecules, including CAM (intercellular adhesion molecule).
[0300]
The effect of zacrp3 on the expression of cell surface adhesion molecules was determined using microvascular bone marrow cells (TRBMEC) in a cell-based ELISA according to Ouchi et al. (Circulation 100: 2473-7, 1999). Briefly, TRBMEC cells were grown to confluence in 96 well flat bottom plates (Costar, Pleasanton, Calif.). Wild-type control medium and baculovirus-expressed zacrp3 medium were concentrated 10-fold according to the manufacturer's instructions prior to testing (Centricon Centrifugal Filtration unit 5,000K cutoff, Millipore Corp. Bedford, Mass.).
[0301]
To each well, 90 μl of zacrp3-containing medium or control medium is added and the plate is incubated at 37 ° C., 5% CO 2.₂Incubated overnight. The next day, half of the sample was charged with 10 μl of TNFa (10 ng / ml, R & D Systems, Minneapolis, MN) and the other samples measuring basal expression remained untreated. The plate is then placed at 37 ° C, 5% CO.₂And incubated for 4 hours.
[0302]
After incubation, the medium is removed from the plate and 50 μl anti-human VCAM antibody (1: 1000 dilution of stock solution 1 mg / ml, R & D Systems) 50 μl, anti-human ICAM-1 monoclonal antibody (1: 1000 dilution of stock solution 1 mg / ml, R & D) Systems) 50 μl, or 50 μl of anti-human E-selectin antibody (1: 1000 dilution of stock solution 1 mg / ml, R & D Systems) was added to 3 wells, then the plate was incubated at 37 ° C., 5% CO₂And incubated for 1 hour.
[0303]
The antibody solution was removed and the plate was washed 3 times in warm RPMI + 5% FB. Following the last wash, 100 μl / well of 0.05% glutaraldehyde solution (1: 1000 of 50% glutaraldehyde in PBS) was added and the plates were incubated at room temperature for 10 minutes. The plate was washed 3 times with PBS and 50 μl / well of secondary antibody (goat α mouse IgG whole molecule HRP conjugate, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) was added to all wells. Plates were incubated for 1 hour at 37 ° C.
[0304]
The plate was then washed 5 times with wash buffer (PBS + 0.05% Tween 20), and 10 ml TMB solution (10 ml 60 mM sodium acetate pH 5.0 and 1.2% H).₂O₂ 100 μl of DMSO solution containing 4 mg / ml tetramethylbenzidine (Sigma) in 100 μl) was added to each well. The plate is allowed to develop for 15-20 minutes at room temperature, at which time 1MH₂S0_FourThe reaction was stopped by adding 100 μl / well. The plate was read at 450 nm with 655 nm as the control wavelength.
[0305]
Zacrp3 showed no effect on ICAM-1 expression. Zacrp3 showed an effect on VCAM-1 expression. Compared to the maximum TNF response, cells treated with zacrp3 showed about 50% inhibition. Zacrp3 also showed an effect, 10% inhibition of E-selectin expression, although less.
VCAM-1 expression was measured following direct adenovirus infection of TRBMEC cells. Briefly, TRBMEC cells were directly infected with adenovirus-containing zacrp3 or an adenovirus strain from the parent. Virus was added at various multiplicity of infection (moi 500, 1,000 and 5,000). Cells were incubated for 43 hours at 37 ° C., 5% CO 2. Following infection, adenovirus infected cells were challenged with TNFαx (1 ng / ml) for 4 hours. VCAM expression was measured as described above. Inhibition of VCAM-1 expression was about 13% at moi5000 and about 5% at moi1000, and no effect was observed at moi500.
[0306]
Media conditioned with adenovirus is concentrated 10-fold according to the manufacturer's instructions (Centricon centrifuge filtration device 5,000 K cutoff, Millipore Corp. Bedford, Mass.), Then heat at 56 ° C for 30 minutes Deactivated. The concentrated heat-inactivated sample was analyzed as described above. For VCAM-1 and E-selectin, the inhibition was 100%. Similar results were observed when IL-1 or LPS was used to induce adhesion molecule expression. For ICAM-1, inhibition was almost reduced to baseline. The experiment was repeated at various concentrations of medium conditioned with zacrp3 heat-inactivated adenovirus. Complete inhibition at 5 fold concentration, 50% inhibition at 2.5 fold, and inhibition at 0.5 fold were not observed.
The THP-1 mononuclear cell adhesion assay by Ouchi et al. (Id.) And Cybulsky and Gimbrone (Science 251: 788-91, 1991) showed the same results as observed for VCAM-1 above.
[Brief description of the drawings]
The figure shows the zacrp3 polypeptide of the present invention, human ACRP30 (ACR3) (SEQ ID NO: 3; Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 221: 286-9, 1996) and human C1qC (SEQ ID NO: 4; Seller et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991) are shown in parallel. Parallel alignment was performed using the default Clustalx parallel alignment tool: Blossom Series Weight Matrix, Gap Opening Penalty: 10.0, Gap Extension Penalty: 0.05.
[Sequence Listing]

Claims (28)

An isolated polypeptide comprising a sequence of amino acid residues whose amino acid sequence matches at least 90 % with amino acid residues 23 to 246 of SEQ ID NO: 2 and inhibits VCAM-1 expression on vascular endothelial cells polypeptide. The isolated polypeptide of claim 1, wherein the amino acid sequence of the polypeptide matches at least 95 % with amino acid residues 23 to 246 of SEQ ID NO: 2. 2. The isolated polypeptide of claim 1 , wherein the polypeptide comprises amino acid residues 23 to 246 of SEQ ID NO: 2 . The isolated polypeptide according to claim 1 or 2, wherein the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. Encoded by a polynucleotide that remains hybridized to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof after high stringency washing conditions, and on vascular endothelial cells VCAM-1 A polypeptide that inhibits the expression of. 6. The isolated poly of any one of claims 1-5, covalently linked at the amino or carboxyl terminus to a moiety selected from the group consisting of an affinity label, a toxin, a radionucleotide, an enzyme and a fluorophore. peptide. A fusion protein comprising a first part and a second part joined by peptide bonds, wherein the first part is the polypeptide of any one of claims 1 to 5, and the second part is A fusion protein comprising another polypeptide. 6. A polypeptide according to any one of claims 1 to 5 , in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle. 6. An antibody that specifically binds to the polypeptide of any one of Items 1 to 5, or an antibody fragment that binds similarly . The antibody is
a) a polyclonal antibody;
b) mouse monoclonal antibody;
c) a humanized antibody derived from b) above; and d) a human monoclonal antibody;
The antibody according to claim 9, which is selected from the group consisting of: The antibody fragment according to claim 9, wherein the antibody fragment is selected from the group consisting of F (ab '), F (ab), Fab', Fab, Fv, scFv, and minimal recognition units. An anti-idiotype antibody that specifically binds to the antibody of claim 9 . Amino acid sequence has been isolated encoding a polypeptide that inhibits the expression of VCAM-1 of at least 90% match on and vascular endothelial cells Ri name comprising the sequence of amino acid residues to residues 23-246 of SEQ ID NO: 2 Polynucleotide. The isolated polynucleotide of claim 13, the amino acid sequence of the polypeptide is at least 95% identical to amino acid residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. Wherein the polypeptide comprises amino acid residues 23-246 of SEQ ID NO: 2 The isolated polynucleotide of claim 13. 16. The isolated polynucleotide of any one of claims 13 to 15 , wherein the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. A polynucleotide that remains hybridized to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complement of SEQ ID NO: 1 after high stringency washing conditions, on vascular endothelial cells VCAM-1 Polynucleotides encoding polypeptides that inhibit the expression of An isolated polynucleotide comprising:
a) the nucleotide sequence of nucleotide 1 to nucleotide 1696 of SEQ ID NO: 1;
b) a nucleotide sequence from nucleotide 69 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1; and c) a nucleotide sequence from nucleotide 135 to nucleotide 806 of SEQ ID NO: 1;
An isolated polynucleotide selected from the group consisting of: An isolated polynucleotide encoding the fusion protein of claim 7. The following elements are operably linked :
Transcriptional promoter;
A DNA segment encoding the polypeptide of any one of claims 1 to 5 ; and a transcription terminator;
An expression vector comprising 21. The expression vector of claim 20 , wherein the DNA segment encodes a polypeptide that matches at least 95% amino acid sequence with residues 23-246 of SEQ ID NO: 2. The expression vector according to claim 20 or 21 , wherein the difference between the polypeptide and SEQ ID NO: 2 is due to a conservative amino acid substitution. The expression vector according to claim 21 , wherein the polypeptide comprises amino acid residues 23 to 246 of SEQ ID NO: 2 . 24. The expression vector according to any one of claims 20 to 23 , wherein the DNA segment encodes a polypeptide covalently linked to an affinity tag at the amino or carboxyl terminus. The expression vector according to any one of claims 20 to 24 , wherein the DNA segment further encodes a secretory signal sequence operably linked to the polypeptide. 26. The expression vector of claim 25 , wherein the secretory signal sequence comprises residues 1-22 of SEQ ID NO: 2. 27. A cultured cell into which the expression vector according to any one of claims 20 to 26 has been introduced, wherein the cell expresses the polypeptide encoded by the DNA segment. A cell into which the expression vector according to any one of claims 20 to 26 has been introduced is cultured, whereby the cell expresses the polypeptide encoded by the DNA segment, and then the expression polypeptide is recovered. A process for producing a polypeptide comprising:

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