JP3743525B2

JP3743525B2 - Site-directed mutagenesis method

Info

Publication number: JP3743525B2
Application number: JP06348495A
Authority: JP
Inventors: 保橋本; 敏樹水野
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1994-03-02
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2006-02-08
Anticipated expiration: 2021-02-08
Also published as: JPH07289262A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子工学において使用される部位特異的変異導入（Site-Specific Mutagenesis)を、より一層簡素化するための方法及びそれに使用するベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子工学の分野においては、遺伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、有用な物質を単にそのまま大量に取得するための方法としても成功する例は少ない。部位特異的変異導入法によって、最大の発現量を得るためにフレームを合わせ、またアミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近のＤＮＡ配列を変える操作は、最低限必要な技術である。また、クローニング発現させた蛋白質をより有用なものにするため、部位特異的変異導入法を用いて、アミノ酸を削除、変換し、その物質の特異性を変化させ、その物質が酵素である場合なら、最適ｐＨ、安定性、基質特異性、Ｋｍ値等を操作する技術は必須である。更に、蛋白質工学研究分野の手法としても、部位特異的変異導入法を用いてＤＮＡレベルでの変異導入、削除は、研究をより迅速、正確に行う技術として重要である。
【０００３】
部位特異的変異導入の典型的な操作（ギャップトデュプレックス法）は次の項目から成っている。
（１）まず、ファージ由来の１本鎖と２本鎖で存在できるベクターであってアンバーコドンを含むベクターに目的の変異を導入したいＤＮＡをクローニングする。
（２）クローンの一本鎖ＤＮＡをファージ感染により調製する。
（３）この１本鎖ＤＮＡと、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベクターを直鎖状にしたものとを、変性後ハイブリダイズさせて、目標ＤＮＡの部分が一本鎖でベクターの部分が２本鎖になっているＤＮＡ（ギャップトデュプレックスＤＮＡ）を形成させる。
（４）次に導入したい変異のとおりに化学合成したオリゴヌクレオチド（変異プライマー）をハイブリダイズさせて、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応によりギャップを埋め、目的の変異点以外は完全に相補的な２本鎖ＤＮＡを調製する。
（５）このＤＮＡを、mutSの宿主大腸菌（ＤＮＡの修復能力を欠損している株）にトランスフェクションし、親ＤＮＡを持つファージクローンと変異ＤＮＡを持つファージクローンを成育させる。
（６）更に、 sup°の宿主大腸菌にトランスフェクションし、目的の変異ＤＮＡを持つファージクローンを選択する。
しかしながら、この方法はファージ感染による１本鎖ＤＮＡの調製や、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベクターの調製が必要であり、操作が煩雑である。更に、ファージベクターを使用するので、大きなＤＮＡ断片、例えば５kb以上の長さのＤＮＡは挿入されにくく、また、ファージ特有の複製過程で変異が起こりやすい欠点が指摘されている。
特開平１−２５２２９１号公報には、これらの課題を解決するためのベクターとして、プラスミド／ファージ融合ベクターが記載されている。これは、アンバーコドンを含むアンピシリン耐性遺伝子とバクテリオファージＭ１３由来のインタージェニックリージョンを含んだ約３．２kbの融合ベクターである。このベクターは、比較的大きなサイズの遺伝子が挿入できる利点があり、更に、複製時に変異が生じる不安定性が認められない。しかし、このベクターを用いて部位特異的変異導入を行う場合でもやはりヘルパーファージを感染させて１本鎖ＤＮＡを調製しなければならず、また、外来ＤＮＡの挿入されていない直鎖状２本鎖ＤＮＡの調製も必要であり、操作が煩雑である。更に、このベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含むので以下のような問題も有している。すなわち、アンピシリン耐性は該遺伝子がコードするβ−ラクタマーゼによるアンピシリンの不活化によってもたらされるが、この酵素は分泌性タンパク質であるので、過剰量の菌体をプレートにまくと、分泌されて漏れだしたβ−ラクタマーゼのためにその部分のアンピシリンが不活化され、アンピシリン感受性の菌も生育してしまう。したがって、１枚のプレートにまくことができる菌体量が限られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、操作がより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用いるためのベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、下記工程を含む部位特異的変異導入方法であって、
（１）部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖ＤＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを形成させる工程、
（２）上記（１）工程で得られた１本鎖ＤＮＡに変異プライマー及び選択プライマーをハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により前記プライマーの間を埋め、前記１本鎖ＤＮＡから２本鎖ＤＮＡを調製する工程、ここで前記選択プライマーは、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドンを含む配列（選択配列）に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させる変異を持つプライマーであり、
（３）上記（２）で得られたＤＮＡで、ｍｕｔＳの宿主大腸菌を形質転換し、クローンを得る工程及び
（４）上記（３）のクローンから得られたＤＮＡで、ｓｕｐ^。の宿主大腸菌を形質転換し、目的の変異ＤＮＡを持つクローンを選択する、
ことを特徴とする。
本発明の第２の発明は上記第１の発明の部位特異的変異導入方法に用いるためのベクターに関し、上記第１の発明の方法に用いるためのベクターであって、図３に示される構造を有するｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９及び図４中に示される構造を有するベクターであって、マルチクローニングサイトがそれぞれｐＫＦ３９６、ｐＫＦ３９７、ｐＫＦ３９８、ｐＫＦ３９９と同じものであるｐＫＦ２９６、ｐＫＦ２９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９から選択されるベクターであることを特徴とする。
なお、上記引用した図４中で、「ａｇｐ−３」はカナマイシン耐性遺伝子を意味し、「ａｍ」で示される２つのアンバーコドンは、当該カナマイシン耐性遺伝子中に存在する。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のベクターは、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子を含む。クロラムフェニコール耐性は、該遺伝子がコードするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼによるクロラムフェニコールの不活化によってもたらされる。また、カナマイシン耐性は、該遺伝子がコードするアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼによるカナマイシンの不活化によってもたらされる。これらの酵素は菌体内酵素なので、従来のアンピシリン耐性のような問題はなく１枚のプレートにより多くの菌体をまくことができる。特に、カナマイシン耐性遺伝子をもつベクターは、他の薬剤耐性遺伝子を持つベクターに比べて各薬剤存在下で培養した菌体からのベクターの収率が高いので、特に好ましい。本発明のベクターは、その他の配列、例えば適当なクローニングサイトを含んでいてもよい。
なお、本発明のベクターは部位特異的変異導入に好適であるが、一般的なクローニングベクターとしても効果的な使い方がある。すなわち、一般に、あるクローニングベクターにクローニングされているＤＮＡ断片を別のベクターに移しかえる際には、元のベクター由来のバックグラウンドを除くために、ＤＮＡ断片を精製するか、別のベクターとして薬剤耐性が元のベクターとは異なるベクターを選択して、元のベクター由来のクローンを除去する。しかし、本発明のベクターの適当なクローニングサイトにＤＮＡ断片をクローニングしておけば、このベクターと同じ薬剤耐性（クロラムフェニコール耐性又はカナマイシン耐性）をもつ他のベクターに再クローニングする場合でも、supE宿主菌から sup°宿主菌へと菌株を変えるだけで元のベクター由来のバックグラウンドを容易に除去することができる。
【０００７】
本発明の方法による部位特異的変異導入は、例えば以下の工程によって行うことができる。
（１）本発明のベクターに標的となるＤＮＡを挿入する。
（２）（１）で調製したＤＮＡ挿入ベクター、変異プライマー、及び選択プライマーを、選択プライマーが過剰の状態で混合して熱変性を行いこれらをハイブリダイズさせる。
（３）ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により、変異プライマーと選択プライマーとの間を埋め、目的の変異点及び選択配列中の変異点以外は完全に相補的な二本鎖ＤＮＡを調製する。
（４）このＤＮＡで、mutSの宿主大腸菌を形質転換し、親ＤＮＡを持つクローンと変異ＤＮＡを持つクローンを成育させる。
（５）更に、 sup°の宿主大腸菌を形質転換し、クロラムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養を行い、アンバー変異が復帰してクロラムフェニコール耐性又はカナマイシン耐性を獲得した、すなわち目的の変異ＤＮＡを持つクローンを選択する。
【０００８】
なお、本明細書中において、選択配列とは、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドンを含む配列をいう。また、選択プライマーとは、選択配列に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させる変異を持つプライマーをいう。
【０００９】
本発明においては１本鎖ＤＮＡを熱変性によって形成させるので、従来のようなファージ感染による１本鎖ＤＮＡの調製といった複雑な操作を必要としない。その結果、操作が簡略化され、かかる日数も１日少なくてすむ。熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡは、従来のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させるのに用いてもよく、前述の例のように選択プライマーと変異プライマーをハイブリダイズさせて用いてもよい。熱変性の方法としては、１本鎖ＤＮＡが形成される方法であれば何でもよいが、例えば、９０〜１００℃で数分間処理したのち、氷上で急冷すればよい。
【００１０】
本発明は、熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡから選択プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを調製する工程も含む。この工程は、従来のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させる工程を経ないので、クローンされていない直鎖状２本鎖ＤＮＡを調製する必要がなく、選択プライマーとなるオリゴヌクレオチドを準備するだけでよい。選択プライマーの長さは特に限定されないが、２０mer 程度が一般的である。選択プライマーを選ぶ位置としては、選択配列中のアンバーコドンとのミスマッチが選択プライマーの配列の真ん中から５′個になるように選ぶ方がよい。
（５）の工程においては、クロラムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養した菌体からいったんＤＮＡを抽出して、再度 sup°の宿主大腸菌に形質転換すれば、更に高い効率で部位特異的変異導入を行うことができる。
【００１１】
図１に、本発明による部位特異的変異導入の典型的な流れを示す。図中、Cm^R、Cm^Sはそれぞれクロラムフェニコール耐性、クロラムフェニコール感受性を、Km^R、Km^Sはそれぞれカナマイシン耐性、カナマイシン感受性を表す。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１部位特異的変異導入用ベクターの構築
（１）クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターの構築
pHSG1337〔ジーン（Gene) 、第６１巻、第６３〜７４頁（１９８７）に記載〕のクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat-1)内にあるPvuII サイトを消失させ、かつその部分にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の配列番号１に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。このプライマーは、本来はＣである４番目と１３番目の塩基をＴに変えてあり、その結果、グルタミンコドン（ＣＡＧ）に代わってアンバーコドン（ＴＡＧ）が出現するようになっている。
０．５μｇのpHSG1337（約０．６pmol) と６０pmolの上記プライマーを４０μｌのＢＡ緩衝液（２０mM トリス−塩酸ｐＨ７．５、１０mM ＭｇＣｌ₂、５０mM ＮａＣｌ）に溶解し、９５℃で３分間インキュベートした後氷中で急冷した。次に、６μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液（１００mM トリス−塩酸ｐＨ７．５、５mM ｄＮＴＰ、１０mM ＡＴＰ、２０mM ジチオスレイトール）、２０単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１５００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、蒸留水で６０μｌにした後２５℃で２時間インキュベートした。反応液を、エタノール沈殿したのち乾燥し５０μｌのPvuII 緩衝液（１０mM トリス−塩酸ｐＨ７．５、７mM ＭｇＣｌ₂、７mM ２−メルカプトエタノール、６０mM ＮａＣｌ）に溶解して、１０単位のPvuII を加え、３７℃で２時間反応させた。反応液１０μｌを大腸菌ＢＭＨ７１−１８株（supE、mutS) にトランスフォームし、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３mlを加え、３７℃で一晩培養した。
培養液１mlからプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法で回収し、エタノール沈殿、乾燥し、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０mM トリス−塩酸ｐＨ７．５、１mMＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液４μｌをPvuII 緩衝液５０μｌに溶解したのち１０単位のPvuII を加えて、３７℃で２時間反応させた。反応液１０μｌを、大腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフォームし、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＳ寒天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩培養した。
生育したコロニーを適当量個別に拾い培養し、それぞれプラスミドを回収、PvuII で処理し、切断されないプラスミドpHSG1337am2 が得られた。
【００１４】
一方、pHSG396 、pHSG397 、pHSG398 、pHSG399 （いずれも宝酒造社製）それぞれ０．５μｇを、AccIII、ApaLI 、NcoIで処理し、1133bp（pHSG398 及びpHSG399 から）、1144bp（pHSG396 及びpHSG397 から）の ApaLI−NcoIフラグメントを回収した。次に、２μｇのpHSG1337am2 をApaLI 、NcoIで処理し、1095bpのフラグメントを回収し、４等分し、上記 pHSG396〜399 由来のフラグメントとライゲーションし、pKF396、pKF397、pKF398、pKF399を得た。図２にこれらのプラスミドの構築図を示す。更に図３にpKF396〜399 の構造を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、（Δａ）はアデニン残基欠失を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示す。すなわち、これらのベクターは２箇所のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat-１_am2)を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく（２２２８bp又は２２３９bp）、大きなサイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つので、目的に応じて使い分けることができる。
【００１５】
（２）カナマイシン耐性遺伝子を含むベクターの構築
プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）をHindIII 、SmaIで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、カナマイシン耐性遺伝子を保持し、かつマルチクローニングサイト内のHindIII −SmaI領域（３０ｂｐ）を欠失させたプラスミドｐ１５１４を構築した。
次に、配列表の配列番号２、３、４に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し、実施例１−（１）と同様にしてｐ１５１４のカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ）内にあるHindIII 、SmaI、ClaIの各サイトを消失させた。更にカナマイシン耐性遺伝子にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の配列番号５に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し、ジーン、第１５２巻、第２７１〜２７５頁（１９９５）に記載の方法に従いプラスミドＤＮＡにニックを入れ、アンバー変異が導入されたカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）をもつプラスミドｐ２９９−５を構築した。
次に、前出のジーンに記載のプラスミドｐＫＦ１６ｃをAseIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、更にBglIで処理してマルチクローニングサイトを含む３３８ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐ２９９−５をNspIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、更にBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９３１ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記ｐＫＦ１６ｃ由来の３３８ｂｐのＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐ１５２９を構築した。次に、ｐ１５２９をDsaIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とした後に連結反応を行い６１ｂｐのDsaI−DsaI領域を欠失させて、プラスミドｐＫＦ２９６を構築した。
一方、前出のジーンに記載のプラスミドｐＫＦ１７ｃ、ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃをNdeIとBglIで処理し、マルチクローニングサイトを含む２２９ｂｐ（ｐＫＦ１７ｃ）、２１７ｂｐ（ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＫＦ２９６をNdeIとBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９８３ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記２２９ｂｐ又は２１７ｂｐのｐＫＦ１７ｃ〜ｐＫＦ１９ｃ由来のＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＫＦ２９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９をそれぞれ構築した。図４にｐＫＦ２９６〜２９９の構築図を示す。図中のＭＣＳはマルチクローニングサイトを表す。なお、ｐＫＦ２９６〜２９９はそれぞれ実施例１−（１）のｐＫＦ３９６〜３９９と同じマルチクローニングサイトをもっている。
すなわち、これらのベクターは２箇所のアンバーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく（２２１６bp又は２２０４bp）、大きなサイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つので、目的に応じて使い分けることができる。
【００１６】
実施例２
実施例１−（１）で作製したベクターpKF399のlacZ′遺伝子のディレーションミューテーションの導入を行い、その効率を数値化した。lacZ′遺伝子はlacZα−ペプチドをコードしており、この遺伝子をlacZΔＭ１５の遺伝子型を持つ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼ活性を生ずる。したがって、lacZ′遺伝子がそのままであればIPTGとX-gal の存在下で生育コロニーは青くなり、ミューテーションが入ると生育コロニーは白くなり、これらの青コロニーと白コロニーの数を比較することにより部位特異的変異導入の効率を数値化できる。
クロラムフェニコール耐性遺伝子内のダブルアンバー変異を復帰させる選択プライマー（CQ2)として、配列表の配列番号６に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、pKF399ではCQ2 の４番目と１３番目のＣに対応する塩基がＴであるのでストップコドンになる（図３参照）。
lacZ′遺伝子にディレーションミューテーションを導入する変異プライマー（dZ) として、配列表の配列番号７に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、dZは１０番目のＣと１１番目のＴの間にあるＡを欠落するように合成した（図３参照）。
次に、下記の表１に示すサンプルを調製した。
【００１７】
【表１】

【００１８】
それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにした。次に、それぞれの溶液を１００℃で３分間インキュベートし、氷中にて急冷した。次に、それぞれの溶液に７μｌの滅菌蒸留水、３μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液、０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１７５単位）、０．５μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（２単位）を加え、２５℃で２時間インキュベートした。
反応終了した各溶液それぞれ５μｌに大腸菌ＢＭＨ７１−１８株コンピテントセル５０μｌを加え、０℃で３０分間、４２℃で２分間、次いで０℃で２分間インキュベートした後、ＬＳ培地１mlを加え、３７℃で１時間インキュベートした。更にＬＳ培地２mlと１．５mg／mlのクロラムフェニコール溶液３０μｌを加え３７℃で一晩振とう培養した。
培養後、培養液１mlより煮沸法（ただしフェノール処理、クロロホルム処理、及びRNase 処理は行わない）にて粗プラスミドＤＮＡを調製し、１００μｌの滅菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶液５μｌを５０μｌの大腸菌ＴＨ３α株（supE、lacZΔＭ１５）又は大腸菌ＯＭ２７９株（ sup°、lacZΔＭ１５）コンピテントセルにトランスフォームしてＬＳ培地１ml加え、３７℃で１時間インキュベートした。この溶液に１５μｇ／mlのクロラムフェニコールとX-gal を含む寒天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
それぞれのコロニー数をカウントし、部位特異的変異導入の効率を計算した。なお、大腸菌ＴＨ３α株はsupEなので、アンバーコドン（ＴＡＧ）がグルタミンコドン（ＣＡＧ）に復帰してもしなくても菌は生育する。一方、大腸菌ＯＭ２７９株は sup°なので、アンバーコドンがグルタミンコドンに復帰したもののみが、生育する。また、lacZ′部分にディレーションが入るとコロニーは白く、入らないとコロニーは青くなる。結果を以下の表２及び表３に示す。
【００１９】
【表２】

【００２０】
【表３】

【００２１】
すなわち、No. ４の条件で約７９％の効率で、部位特異的変異ミュータントが得られた。
このように、従来のギャップトデュプレックス法だとファージプラスミド若しくはヘルパーファージの感染により１本鎖ＤＮＡの調製を必要とするため、全工程に少なくとも３日を必要としたが、本方法では２日で高い効率で部位特異的変異ミュータントを得ることができた。
【００２２】
実施例３
１９９２年、エルセビアサイエンス（Elsevier Science) 出版発行、T.O.ヨシダ（Yoshida)ら、モレキュラーアプローチズトゥザスタディアンドトリートメントオブヒューマンディズィーズ（Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Disease) 、第８章、第５１〜５５頁に記載のヒトATIII cDNA（約１．５kbp)をpKF396のHindIII/XbaIサイトに挿入したプラスミドp396ATを作製し、ヒトATIII 遺伝子に部位特異的変異を導入しヒトATIII 分子異常症のＤＮＡを作製することを試みた。図５にプラスミドp396ATの構造を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示す。ヒトATIII 分子異常症は、野生型のArg406がMet に変わり、コドンＡＧＧがＡＴＧになっているため、制限酵素StuIの認識配列ＡＧＧＣＣＴが消失する。よって、部位特異的変異が導入されているかの確認は、StuIで切断されるかされないかで行える。
ポイントミューテーションを導入する変異プライマー（Kyt)として、配列表の配列番号８に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製した。すなわち、１０番目のＧがＴに変わるように合成した。次に下記の表４に示すサンプルを調製した。
【００２３】
【表４】

【００２４】
それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにしたのち、実施例２と同様の手順で変異導入を行った。ＴＨ３α株とＯＭ２７９株のコロニー数を下記表５に示す。
【００２５】
【表５】

【００２６】
サンプルNo. ６のＯＭ２７９株のコロニーを無作為に７個拾い、１５μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＳ培地２mlで、３７℃一晩振とう培養した。培養後、培養液１mlより、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、適当量を制限酵素StuI、HindIII 、StuI／HindIII 、PvuII で切断処理を行い、部位特異的変異導入の有無を確認した。その結果、6 個のプラスミドについて部位特異的変異が導入されていた。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によって、遺伝子工学の分野で有用なより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用いるためのベクターが提供された。
【００２８】
【配列表】
【００２９】
配列番号：１
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３０】
配列番号：２
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３１】
配列番号：３
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３２】
配列番号：４
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３３】
配列番号：５
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３４】
配列番号：６
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３５】
配列番号：７
配列の長さ：24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【００３６】
配列番号：８
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による部位特異的変異導入の典型的な流れを示す図である。
【図２】pKF396〜pKF399の構築過程を示す図である。
【図３】pKF396〜pKF399の構造を示す図である。
【図４】pKF296〜pKF299の構築過程を示す図である。
【図５】p396AT6 の構造を示す図である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a method for further simplifying site-specific mutagenesis used in genetic engineering and a vector used therefor.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in the field of genetic engineering, there are few examples that succeed as a method for simply obtaining a large amount of a useful substance as it is, only by cloning and expressing a gene. In order to obtain the maximum expression level by the site-directed mutagenesis method, the operation of changing the DNA sequence in the vicinity of the start codon without changing the amino acid sequence is the minimum necessary technique. In order to make the cloned protein more useful, use site-directed mutagenesis to delete and convert amino acids, change the specificity of the substance, and if the substance is an enzyme. Techniques for manipulating optimal pH, stability, substrate specificity, Km value, etc. are essential. Furthermore, as a technique in the field of protein engineering research, mutation introduction and deletion at the DNA level using site-directed mutagenesis is an important technique for conducting research more quickly and accurately.
[0003]
A typical procedure for site-directed mutagenesis (gapped duplex method) consists of the following items.
(1) First, a DNA to be introduced with the desired mutation is cloned into a vector that can exist in single-stranded and double-stranded form derived from phage and contains an amber codon.
(2) A single-stranded DNA of a clone is prepared by phage infection.
(3) This single-stranded DNA and a linearized double-stranded vector into which no foreign DNA has been inserted are hybridized after denaturation so that the target DNA portion is a single-stranded portion of the vector. Forms a double-stranded DNA (gapped duplex DNA).
(4) Hybridize chemically synthesized oligonucleotides (mutation primers) according to the mutation to be introduced next, fill the gap by polymerase reaction and ligase reaction, and completely complementary double strands except for the target mutation point DNA is prepared.
(5) This DNA is transfected into mutS host E. coli (a strain lacking the ability to repair DNA), and a phage clone having a parent DNA and a phage clone having a mutant DNA are grown.
(6) Furthermore, sup ° host E. coli is transfected, and a phage clone having the target mutant DNA is selected.
However, this method requires preparation of single-stranded DNA by phage infection and preparation of a double-stranded vector into which no foreign DNA has been inserted, and the operation is complicated. Furthermore, since a phage vector is used, it has been pointed out that a large DNA fragment, for example, a DNA having a length of 5 kb or more is not easily inserted, and that a mutation is likely to occur in a replication process peculiar to a phage.
JP-A-1-252291 describes a plasmid / phage fusion vector as a vector for solving these problems. This is an about 3.2 kb fusion vector containing an ampicillin resistance gene containing an amber codon and an intergenic region derived from bacteriophage M13. This vector has the advantage that a gene of a relatively large size can be inserted, and further, there is no instability in which mutation occurs during replication. However, even when site-directed mutagenesis is carried out using this vector, it is still necessary to prepare a single-stranded DNA by infecting a helper phage, and a linear double-stranded chain into which no foreign DNA is inserted. Preparation of DNA is also necessary, and the operation is complicated. Furthermore, since this vector contains an ampicillin resistance gene, it also has the following problems. In other words, ampicillin resistance is brought about by inactivation of ampicillin by β-lactamase encoded by the gene, but since this enzyme is a secreted protein, it was secreted and leaked when an excessive amount of cells were plated. β-lactamase inactivates that portion of ampicillin, and ampicillin-sensitive bacteria also grow. Therefore, the amount of cells that can be spread on one plate is limited.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a site-directed mutagenesis method that is easier to operate, and a vector for use therein.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In summary, the first invention of the present invention relates to a site-directed mutagenesis method, which is a site-specific mutagenesis method comprising the following steps:
(1) a step of forming a single-stranded DNA by heat-denaturing a double-stranded DNA vector into which a DNA fragment that is a target of site-specific mutation is inserted;
(2) The single-stranded DNA obtained in the step (1) is hybridized with a mutation primer and a selection primer, and the space between the primers is filled by a polymerase reaction and a ligase reaction. Wherein the selection primer has a sequence complementary to a sequence (selection sequence) containing one or more amber codons in a drug resistance gene and has a mutation that reverses the amber mutation And
(3) Transforming mutS host E. coli with the DNA obtained in (2) above to obtain a clone, and (4) DNA obtained from the clone in (3) above ^. Transform the host E. coli and select the clone with the desired mutant DNA,
It is characterized by that.
The second invention of the present invention relates to a vector for use in the site-directed mutagenesis method of the first invention, which is a vector for use in the method of the first invention, and has the structure shown in FIG. PKF396, pKF397, pKF398, pKF399, and vectors having the structure shown in FIG. 4, wherein the multiple cloning sites are the same as pKF396, pKF397, pKF398, pKF399, respectively, and selected from pKF296, pKF297, pKF299, and pKF299 It is characterized by being a vector.
In FIG. 4 referred to above , “agp-3” means a kanamycin resistance gene, and two amber codons indicated by “am” are present in the kanamycin resistance gene.
[0006]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The vector of the present invention contains a chloramphenicol resistance gene or a kanamycin resistance gene containing one or more amber codons. Chloramphenicol resistance is brought about by inactivation of chloramphenicol by the chloramphenicol acetyltransferase encoded by the gene. Kanamycin resistance is also brought about by inactivation of kanamycin by the aminoglycoside 3′-phosphotransferase encoded by the gene. Since these enzymes are intracellular enzymes, there is no problem such as conventional ampicillin resistance, and many bacterial cells can be spread on one plate. In particular, a vector having a kanamycin resistance gene is particularly preferable because the yield of the vector from cells cultured in the presence of each drug is higher than that of a vector having another drug resistance gene. The vector of the present invention may contain other sequences such as an appropriate cloning site.
Although the vector of the present invention is suitable for site-directed mutagenesis, it can be effectively used as a general cloning vector. That is, generally, when transferring a DNA fragment cloned in one cloning vector to another vector, the DNA fragment is purified to remove the background derived from the original vector, or drug resistant as another vector. Select a vector that differs from the original vector to remove clones from the original vector. However, if the DNA fragment is cloned at an appropriate cloning site of the vector of the present invention, even when recloning into another vector having the same drug resistance (chloramphenicol resistance or kanamycin resistance) as this vector, supE The background derived from the original vector can be easily removed simply by changing the strain from the host strain to the sup ° host strain.
[0007]
Site-directed mutagenesis by the method of the present invention can be performed, for example, by the following steps.
(1) A target DNA is inserted into the vector of the present invention.
(2) The DNA insertion vector prepared in (1), the mutation primer, and the selection primer are mixed in an excess state of the selection primer, and heat-denatured to hybridize them.
(3) The polymerase primer and the ligase reaction are used to fill the gap between the mutation primer and the selection primer, and a double-stranded DNA that is completely complementary except for the target mutation point and the mutation point in the selection sequence is prepared.
(4) A mutS host Escherichia coli is transformed with this DNA, and a clone having a parent DNA and a clone having a mutant DNA are grown.
(5) Furthermore, sup ° host E. coli was transformed and cultured in the presence of chloramphenicol or kanamycin, and the amber mutation was restored to acquire chloramphenicol resistance or kanamycin resistance. Select clones with DNA.
[0008]
In the present specification, the selection sequence refers to a sequence containing one or more amber codons in a drug resistance gene. The selection primer is a primer having a sequence complementary to the selection sequence and having a mutation that reverses the amber mutation.
[0009]
In the present invention, since single-stranded DNA is formed by heat denaturation, a complicated operation such as conventional preparation of single-stranded DNA by phage infection is not required. As a result, the operation is simplified and the number of days required is reduced by one day. The single-stranded DNA resulting from heat denaturation may be used to form a gapped duplex DNA as in the prior art, or may be used by hybridizing a selection primer and a mutation primer as in the above example. . The heat denaturation method may be any method as long as a single-stranded DNA is formed. For example, the treatment may be performed at 90 to 100 ° C. for several minutes and then rapidly cooled on ice.
[0010]
The present invention also includes a step of preparing double-stranded DNA from single-stranded DNA resulting from heat denaturation using a selection primer. Since this step does not go through a conventional step of forming a gapped duplex DNA, it is not necessary to prepare a non-cloned linear double-stranded DNA, only by preparing an oligonucleotide as a selection primer. Good. The length of the selection primer is not particularly limited, but is generally about 20 mer. As a position for selecting the selection primer, it is preferable to select it so that the mismatch with the amber codon in the selection sequence is 5 'from the middle of the selection primer sequence.
In step (5), once DNA is extracted from cells cultured in the presence of chloramphenicol or kanamycin and transformed again into sup ° host E. coli, site-directed mutagenesis can be achieved with higher efficiency. It can be performed.
[0011]
FIG. 1 shows a typical flow of site-directed mutagenesis according to the present invention. In the figure, Cm ^R and Cm ^S represent chloramphenicol resistance and chloramphenicol sensitivity, respectively, and Km ^R and Km ^S represent kanamycin resistance and kanamycin sensitivity, respectively.
[0012]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to an Example.
[0013]
Example 1 Construction of a site-directed mutagenesis vector (1) Construction of a vector containing a chloramphenicol resistance gene
The PvuII site in the chloramphenicol resistance gene (cat-1) of pHSG1337 (described in Gene, Vol. 61, pp. 63-74 (1987)) is eliminated, and an amber mutation is made in that part. In order to introduce two sites, a 5 ′ terminal phosphorylated oligonucleotide primer shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was prepared. In this primer, the fourth and thirteenth bases, which are originally C, are changed to T, and as a result, an amber codon (TAG) appears instead of a glutamine codon (CAG).
0.5 μg of pHSG1337 (about 0.6 pmol) and 60 pmol of the above primer were dissolved in 40 μl of BA buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl ₂ , 50 mM NaCl) and incubated at 95 ° C. for 3 minutes. After that, it was rapidly cooled in ice. Next, 6 μl of 10 × T4PL buffer (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM dNTP, 10 mM ATP, 20 mM dithiothreitol), 20 units of T4 DNA polymerase, 1500 units of T4 DNA ligase are added, and distilled water is added. After making 60 μl, it was incubated at 25 ° C. for 2 hours. The reaction solution was ethanol precipitated, dried, dissolved in 50 μl of PvuII buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 7 mM MgCl ₂ , 7 mM 2-mercaptoethanol, 60 mM NaCl), and 10 units of PvuII was added. The reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. 10 μl of the reaction solution was transformed into E. coli BMH71-18 strain (supE, mutS), 3 ml of LB medium containing 15 μg / ml chloramphenicol was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. overnight.
The plasmid was recovered from 1 ml of the culture solution by alkali-SDS method, ethanol precipitated, dried, and dissolved in 20 μl of TE buffer (10 mM Tris-hydrochloric acid pH 7.5, 1 mM EDTA). After dissolving 4 μl of this solution in 50 μl of PvuII buffer, 10 units of PvuII was added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. 10 μl of the reaction solution was transformed into E. coli BMH71-18, plated with an appropriate amount on an LS agar medium containing 15 μg / ml chloramphenicol, and cultured at 37 ° C. overnight.
An appropriate amount of the grown colonies were picked and cultured individually, and the respective plasmids were collected and treated with PvuII to obtain an uncut plasmid pHSG1337am2.
[0014]
On the other hand, 0.5 μg each of pHSG396, pHSG397, pHSG398 and pHSG399 (all manufactured by Takara Shuzo) were treated with AccIII, ApaLI and NcoI, and ApaLI-NcoI of 1133 bp (from pHSG398 and pHSG399) and 1144 bp (from pHSG396 and pHSG397) The fragment was recovered. Next, 2 μg of pHSG1337am2 was treated with ApaLI and NcoI, and a 1095 bp fragment was recovered, divided into 4 equal parts, and ligated with the fragments derived from pHSG396 to 399 to obtain pKF396, pKF397, pKF398, and pKF399. FIG. 2 shows the construction of these plasmids. Further, FIG. 3 shows the structure of pKF396-399. In the figure, the lowercase letter of each primer indicates the mutation site, (Δa) indicates the deletion of the adenine residue, and (PvuII) indicates the PvuII site that appears when both of the two amber codons are restored to the glutamine codon. In other words, these vectors have a chloramphenicol resistance gene (cat-1 _am2 ) containing two amber codons and a multicloning site in the lacZ 'region. Therefore, if supE host fungus is used, IPTG and X-gal can be obtained. The presence or absence of insertion of foreign DNA can be easily discriminated with the included plate. In addition, since it has the same replication origin as the pUC vector, it has a large number of copies. Furthermore, these vectors have the advantage that a small size (2228 bp or 2239 bp) and a large size (5 kb or more) can be inserted. Since these vectors have different multi-cloning sites, they can be used properly according to the purpose.
[0015]
(2) Construction of a vector containing a kanamycin resistance gene Plasmid pHSG299 (Takara Shuzo) is partially digested with HindIII and SmaI, made blunt with T4 DNA polymerase, ligated with T4 DNA ligase, retaining the kanamycin resistance gene, and Plasmid p1514 from which the HindIII-SmaI region (30 bp) in the multicloning site was deleted was constructed.
Next, 5′-terminal phosphorylated oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 in the sequence listing were prepared, and HindIII contained in the kanamycin resistance gene (agr) of p1514 in the same manner as in Example 1- (1), SmaI and ClaI sites disappeared. Furthermore, in order to introduce two amber mutations into the kanamycin resistance gene, a 5 ′ terminal phosphorylated oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 5 of the sequence listing was prepared, and described in Gene, vol. 152, pages 271 to 275 (1995). The plasmid p299-5 having the kanamycin resistance gene (agr-3) into which the amber mutation was introduced was constructed by nicking the plasmid DNA according to the above method.
Next, the plasmid pKF16c described in the above gene was treated with AseI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and further treated with BglI to recover a 338 bp DNA fragment containing a multiple cloning site. Next, p299-5 was treated with NspI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, further treated with BglI, and a 1931 bp DNA fragment containing the kanamycin resistance gene was recovered and ligated with the pKF16c-derived 338 bp DNA fragment. Plasmid p1529 was constructed. Next, p1529 was treated with DsaI, made blunt with T4 DNA polymerase, and then ligated to delete the 61 bp DsaI-DsaI region to construct plasmid pKF296.
On the other hand, plasmids pKF17c, pKF18c, and pKF19c described in the above gene were treated with NdeI and BglI, and DNA fragments of 229 bp (pKF17c) and 217 bp (pKF18c, pKF19c) containing multiple cloning sites were recovered. Next, pKF296 was treated with NdeI and BglI, and a 1983 bp DNA fragment containing the kanamycin resistance gene was recovered and ligated with the above 229 bp or 217 bp DNA fragments derived from pKF17c to pKF19c to construct plasmids pKF297, pKF298, and pKF299, respectively. did. FIG. 4 shows a construction diagram of pKF296-299. MCS in the figure represents a multiple cloning site. PKF296-299 has the same multiple cloning site as pKF396-399 of Example 1- (1).
That is, these vectors have a kanamycin resistance gene (agr-3) containing two amber codons and a multicloning site in the lacZ ′ region. The presence or absence of foreign DNA can be easily determined. In addition, since it has the same replication origin as the pUC vector, it has a large number of copies. Furthermore, these vectors have the advantage that a small size (2216 bp or 2204 bp) and a large size (5 kb or more) can be inserted. Since these vectors have different multi-cloning sites, they can be used properly according to the purpose.
[0016]
Example 2
A delation mutation of the lacZ ′ gene of the vector pKF399 prepared in Example 1- (1) was introduced, and the efficiency was quantified. The lacZ 'gene encodes a lacZα-peptide, and when this gene is introduced into a host bacterium having the lacZΔM15 genotype, β-galactosidase activity is produced. Therefore, if the lacZ ′ gene is left as it is, the growing colonies will turn blue in the presence of IPTG and X-gal, and the growth colonies will turn white when a mutation is entered. By comparing the number of these blue colonies with the number of white colonies, The efficiency of site-directed mutagenesis can be quantified.
As a selection primer (CQ2) that reverts the double amber mutation in the chloramphenicol resistance gene, a 5 ′ terminal phosphorylated oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing was prepared. That is, in pKF399, the bases corresponding to the fourth and thirteenth Cs of CQ2 are T, so that it becomes a stop codon (see FIG. 3).
As a mutation primer (dZ) for introducing a dilation mutation into the lacZ ′ gene, a 5 ′ terminal phosphorylated oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing was prepared. That is, dZ was synthesized so as to lack A between the 10th C and the 11th T (see FIG. 3).
Next, samples shown in Table 1 below were prepared.
[0017]
[Table 1]

[0018]
Each volume was made up to 20 μl with distilled sterile water. Next, each solution was incubated at 100 ° C. for 3 minutes and rapidly cooled in ice. Next, 7 μl of sterile distilled water, 3 μl of 10 × T4PL buffer, 0.5 μl of T4 DNA ligase (175 units), 0.5 μl of T4 DNA polymerase (2 units) are added to each solution at 25 ° C. Incubated for 2 hours.
50 μl of E. coli BMH71-18 strain competent cells were added to 5 μl of each solution after completion of the reaction, and incubated at 0 ° C. for 30 minutes, 42 ° C. for 2 minutes, and then at 0 ° C. for 2 minutes. And incubated for 1 hour. Further, 2 ml of LS medium and 30 μl of a 1.5 mg / ml chloramphenicol solution were added and cultured with shaking at 37 ° C. overnight.
After culturing, crude plasmid DNA was prepared from 1 ml of the culture solution by boiling method (however, phenol treatment, chloroform treatment and RNase treatment were not performed) and dissolved in 100 μl of sterile distilled water. 5 μl of this DNA solution was transformed into 50 μl of E. coli TH3α strain (supE, lacZΔM15) or E. coli OM279 strain (sup °, lacZΔM15) competent cells, added with 1 ml of LS medium, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. An appropriate amount of this solution was plated on an agar medium containing 15 μg / ml chloramphenicol and X-gal and incubated at 37 ° C. overnight.
The number of each colony was counted and the efficiency of site-directed mutagenesis was calculated. Since the Escherichia coli TH3α strain is supE, the fungus grows whether or not the amber codon (TAG) returns to the glutamine codon (CAG). On the other hand, since the E. coli OM279 strain is sup °, only those in which the amber codon is restored to the glutamine codon grow. The colony is white when the lacZ 'part is dilated, and the colony is blue when it is not. The results are shown in Table 2 and Table 3 below.
[0019]
[Table 2]

[0020]
[Table 3]

[0021]
That is, a site-specific mutation mutant was obtained with an efficiency of about 79% under the condition of No. 4.
Thus, since the conventional gapted duplex method requires preparation of single-stranded DNA by infection with phage plasmids or helper phages, it requires at least 3 days for all steps. A site-specific mutation mutant could be obtained with high efficiency.
[0022]
Example 3
1992, published by Elsevier Science, TO Yoshida et al., Molecular Approaches to the Study and Treatment of Human Disease, Chapters 8, 51 A plasmid p396AT was prepared by inserting the human ATIII cDNA (about 1.5 kbp) described on page 55 into the HindIII / XbaI site of pKF396, and site-specific mutations were introduced into the human ATIII gene to obtain DNA for human ATIII molecular abnormality. I tried to make it. FIG. 5 shows the structure of plasmid p396AT. In the figure, the lower case letter of each primer indicates the mutation site, and (PvuII) indicates the PvuII site that appears when both of the two amber codons are restored to the glutamine codon. In human ATIII molecular abnormalities, the wild-type Arg406 is changed to Met and the codon AGG is ATG, so that the recognition sequence AGGCCT of the restriction enzyme StuI disappears. Therefore, confirmation of whether or not a site-specific mutation has been introduced can be made by whether or not it is cleaved by StuI.
As a mutation primer (Kyt) for introducing a point mutation, a 5′-terminal phosphorylated oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was prepared. That is, synthesis was performed so that the 10th G was changed to T. Next, samples shown in Table 4 below were prepared.
[0023]
[Table 4]

[0024]
After making the total volume 20 μl with distilled sterilized water, mutation was introduced in the same procedure as in Example 2. The number of colonies of the TH3α strain and the OM279 strain is shown in Table 5 below.
[0025]
[Table 5]

[0026]
Seven OM279 strain colonies of sample No. 6 were randomly picked and cultured in 2 ml of LS medium containing 15 μg / ml chloramphenicol with shaking at 37 ° C. overnight. After culturing, plasmid DNA was extracted from 1 ml of the culture solution by alkali-SDS method, and an appropriate amount was cleaved with restriction enzymes StuI, HindIII, StuI / HindIII, and PvuII to confirm the presence of site-specific mutagenesis. As a result, site-specific mutations were introduced into 6 plasmids.
[0027]
【The invention's effect】
According to the present invention, a simpler site-directed mutagenesis method useful in the field of genetic engineering and a vector for use in the method are provided.
[0028]
[Sequence Listing]
[0029]
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 20
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0030]
SEQ ID NO: 2
Sequence length: 24
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0031]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 24
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0032]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 24
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0033]
SEQ ID NO: 5
Sequence length: 33
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0034]
SEQ ID NO: 6
Sequence length: 20
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0035]
SEQ ID NO: 7
Sequence length: 24
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[0036]
SEQ ID NO: 8
Sequence length: 19
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA)
Array:

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a typical flow of site-directed mutagenesis according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the construction process of pKF396 to pKF399.
FIG. 3 is a diagram showing the structures of pKF396 to pKF399.
FIG. 4 is a diagram showing the construction process of pKF296 to pKF299.
FIG. 5 is a diagram showing the structure of p396AT6.

Claims

A site-directed mutagenesis method comprising the following steps ,
(1) a step of forming a single-stranded DNA by heat-denaturing a double-stranded DNA vector into which a DNA fragment that is a target of site-specific mutation is inserted;
(2) The single-stranded DNA obtained in the step (1) is hybridized with a mutation primer and a selection primer, and the space between the primers is filled by a polymerase reaction and a ligase reaction. Wherein the selection primer has a sequence complementary to a sequence (selection sequence) containing one or more amber codons in a drug resistance gene and has a mutation that reverses the amber mutation And
(3) transforming mutS host E. coli with the DNA obtained in (2) above to obtain a clone; and
(4) Sup with DNA obtained from the clone of (3) above ^. Transform the host E. coli and select the clone with the desired mutant DNA,
A site-specific mutagenesis method characterized by the above.

A vector for use in the method according to claim 1, wherein pKF396, pKF397, pKF398, pKF399 having the structure shown in the following (1), and a vector having the structure shown in the following (2) and (3) are used. there, PKF396 multicloning site, respectively, pKF397, pKF398, pKF399 the same as the pKF296, pKF297, pKF298, vector selected from pKF299 [Note that in (2) and (3), "agp-3 ' Means a kanamycin resistance gene, and two amber codons indicated by “am” are present in the kanamycin resistance gene. ].
(1)

(2)

(3)